第一篇：分子生物學(xué)講稿

碩士研究生公共選修課

分子生物學(xué)講稿

浙江大學(xué)生物技術(shù)研究所

胡東維

二零零三年八月修改

概

論

一、分子生物學(xué)的基本含義

分子生物學(xué)是從分子水平研究生命本質(zhì)為目的的一門新興邊緣學(xué)科，它以核酸和蛋白質(zhì)等生物大分子的結(jié)構(gòu)及其在遺傳信息和細(xì)胞信息傳遞中的作用為研究對(duì)象，是當(dāng)前生命科學(xué)中發(fā)展最快并正在與其它學(xué)科廣泛交叉與滲透的重要前沿領(lǐng)域。分子生物學(xué)的發(fā)展為人類認(rèn)識(shí)生命現(xiàn)象帶來了前所未有的機(jī)會(huì)，也為人類利用和改造生物創(chuàng)造了極為廣闊的前景。

所謂在分子水平上研究生命的本質(zhì)主要是指對(duì)遺傳、生殖、生長和發(fā)育等生命基本特征的分子機(jī)理的闡明，從而為利用和改造生物奠定理論基礎(chǔ)和提供新的手段。這里的分子水平指的是那些攜帶遺傳信息的核酸和在遺傳信息傳遞及細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞間通訊過程中發(fā)揮著重要作用的蛋白質(zhì)等生物大分子。這些生物大分子均具有較大的分子量，由簡(jiǎn)單的小分子核苷酸或氨基酸排列組合以蘊(yùn)藏各種信息，并且具有復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)以形成精確的相互作用系統(tǒng)，由此構(gòu)成生物的多樣化和生物個(gè)體精確的生長發(fā)育和代謝調(diào)節(jié)控制系統(tǒng)。闡明這些復(fù)雜的結(jié)構(gòu)及結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系是分子生物學(xué)的主要任務(wù)。

二、分子生物學(xué)的主要研究?jī)?nèi)容

1.核酸的分子生物學(xué)

核酸的分子生物學(xué)研究核酸的結(jié)構(gòu)及其功能。由于核酸的主要作用是攜帶和傳遞遺傳信息，因此分子遺傳學(xué)（molecular genetics）是其主要組成部分。由于50年代以來的迅速發(fā)展，該領(lǐng)域已形成了比較完整的理論體系和研究技術(shù)，是目前分子生物學(xué)內(nèi)容最豐富的一個(gè)領(lǐng)域。研究?jī)?nèi)容包括核酸/基因組的結(jié)構(gòu)、遺傳信息的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄與翻譯，核酸存儲(chǔ)的信息修復(fù)與突變，基因表達(dá)調(diào)控和基因工程技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用等。遺傳信息傳遞的中心法則（central dogma）是其理論體系的核心。

2.蛋白質(zhì)的分子生物學(xué)

蛋白質(zhì)的分子生物學(xué)研究執(zhí)行各種生命功能的主要大分子──蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能。盡管人類對(duì)蛋白質(zhì)的研究比對(duì)核酸研究的歷史要長得多，但由于其研究難度較大，與核酸分子生物學(xué)相比發(fā)展較慢。近年來雖然在認(rèn)識(shí)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)及 1 其與功能關(guān)系方面取得了一些進(jìn)展，但是對(duì)其基本規(guī)律的認(rèn)識(shí)尚缺乏突破性的進(jìn)展。

3.細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子生物學(xué)

細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子生物學(xué)研究細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞間信息傳遞的分子基礎(chǔ)。構(gòu)成生物體的每一個(gè)細(xì)胞的分裂與分化及其它各種功能的完成均依賴于外界環(huán)境所賦予的各種指示信號(hào)。在這些外源信號(hào)的刺激下，細(xì)胞可以將這些信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)橐幌盗械纳锘瘜W(xué)變化，例如蛋白質(zhì)構(gòu)象的轉(zhuǎn)變、蛋白質(zhì)分子的磷酸化以及蛋白與蛋白相互作用的變化等，從而使其增殖、分化及分泌狀態(tài)等發(fā)生改變以適應(yīng)內(nèi)外環(huán)境的需要。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究的目標(biāo)是闡明這些變化的分子機(jī)理，明確每一種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與傳遞的途徑及參與該途徑的所有分子的作用和調(diào)節(jié)方式以及認(rèn)識(shí)各種途徑間的網(wǎng)絡(luò)控制系統(tǒng)。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)理的研究在理論和技術(shù)方面與上述核酸及蛋白質(zhì)分子有著緊密的聯(lián)系，是當(dāng)前分子生物學(xué)發(fā)展最迅速的領(lǐng)域之一。

三、分子生物學(xué)發(fā)展簡(jiǎn)史

1．準(zhǔn)備和醞釀階段

19世紀(jì)后期到20世紀(jì)50年代初，是現(xiàn)代分子生物學(xué)誕生的準(zhǔn)備和醞釀階段。在這一階段產(chǎn)生了兩點(diǎn)對(duì)生命本質(zhì)的認(rèn)識(shí)上的重大突破：

確定了蛋白質(zhì)是生命的主要基礎(chǔ)物質(zhì)

19世紀(jì)末Buchner兄弟證明酵母無細(xì)胞提取液能使糖發(fā)酵產(chǎn)生酒精，第一次提出酶（enzyme）的名稱，酶是生物催化劑。20世紀(jì)20-40年代提純和結(jié)晶了一些酶（包括尿素酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、黃酶、細(xì)胞色素C、肌動(dòng)蛋白等），證明酶的本質(zhì)是蛋白質(zhì)。隨后陸續(xù)發(fā)現(xiàn)生命的許多基本現(xiàn)象（物質(zhì)代謝、能量代謝、消化、呼吸、運(yùn)動(dòng)等）都與酶和蛋白質(zhì)相聯(lián)系，可以用提純的酶或蛋白質(zhì)在體外實(shí)驗(yàn)中重復(fù)出來。在此期間對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的認(rèn)識(shí)也有較大的進(jìn)步。1902年Emil Fisher證明蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)是多肽；40年代末，Sanger創(chuàng)立二硝基氟苯（DNFB）法、Edman發(fā)展異硫氰酸苯酯法分析肽鏈N端氨基酸；1953年Sanger和Thompson完成了第一個(gè)

多肽分子--胰島素A鏈和B鏈的氨基全序列分析。由于結(jié)晶X-線衍射分析技術(shù)的發(fā)展，1950年P(guān)auling和Corey提出了α-角蛋白的α-螺旋結(jié)構(gòu)模型。所以在這階段對(duì)蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu)都有了認(rèn)識(shí)。確定了生物遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)是DNA

雖然1868年F.Miescher就發(fā)現(xiàn)了核素（nuclein），但是在此后的半個(gè)多世紀(jì)中并未引起重視。20世紀(jì)20-30年代已確認(rèn)自然界有DNA和RNA兩類核酸，并闡明了核苷酸的組成。由于當(dāng)時(shí)對(duì)核苷酸和堿基的定量分析不夠精確，得出DNA中A、G、C、T含量是大致相等的結(jié)果，因而曾長期認(rèn)為DNA結(jié)構(gòu)只是“四核苷酸”單位的重復(fù)，不具有多樣性，不能攜帶更多的信息，當(dāng)時(shí)對(duì)攜帶遺傳信息的侯選分子更多的是考慮蛋白質(zhì)。40年代以后實(shí)驗(yàn)的事實(shí)使人們對(duì)核酸的功能和結(jié)構(gòu)兩方面的認(rèn)識(shí)都有了長足的進(jìn)步。1944年O.T.Avery等證明了肺炎球菌轉(zhuǎn)化因子是DNA；1952年A.D.Hershey和M.Chase用DNA35S和32P分別標(biāo)記T2噬菌體的蛋白質(zhì)和核酸，感染大腸桿菌的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明了是遺傳物質(zhì)。在對(duì)DNA結(jié)構(gòu)的研究上，1949-52年S.Furbery等的X-線衍射分析闡明了核苷酸并非平面的空間構(gòu)像，提出了DNA是螺旋結(jié)構(gòu)；1948-1953年Chargaff等用新的層析和電泳技術(shù)分析組成DNA的堿基和核苷酸量，積累了大量的數(shù)據(jù)，提出了DNA堿基組成A=T、G=C的Chargaff規(guī)則，為堿基配對(duì)的DNA結(jié)構(gòu)認(rèn)識(shí)打下了基礎(chǔ)。2．現(xiàn)代分子生物學(xué)的建立和發(fā)展階段

這一階段是從50年代初到70年代初，以1953年Watson和Crick提出的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型作為現(xiàn)代分子生物學(xué)誕生的里程碑開創(chuàng)了分子遺傳學(xué)基本理論建立和發(fā)展的黃金時(shí)代。DNA雙螺旋發(fā)現(xiàn)的最深刻意義在于：確立了核酸作為信息分子的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ);提出了堿基配對(duì)是核酸復(fù)制、遺傳信息傳遞的基本方式；從而最后確定了核酸是遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)，為認(rèn)識(shí)核酸與蛋白質(zhì)的關(guān)系及其在生命中的作用打下了最重要的基礎(chǔ)。在此期間的主要進(jìn)展包括： 遺傳信息傳遞中心法則的建立

在發(fā)現(xiàn)DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)同時(shí)，Watson和Crick就提出DNA復(fù)制的可能模型。其后在1956年A.Kornbery首先發(fā)現(xiàn)DNA聚合酶；1958年Meselson及Stahl 用同位素標(biāo)記和超速離心分離實(shí)驗(yàn)為DNA半保留模型提出了證明；1968年Okazaki（岡畸）提出DNA不連續(xù)復(fù)制模型；1972年證實(shí)了DNA復(fù)制開始需要RNA作為引物；70年代初獲得DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶，并對(duì)真核DNA聚合酶特性做了分析研究；這些都逐漸完善了對(duì)DNA復(fù)制機(jī)理的認(rèn)識(shí)。

在研究DNA復(fù)制將遺傳信息傳給子代的同時(shí)，提出了RNA在遺傳信息傳到蛋白質(zhì)過程中起著中介作用的假說。1958年Weiss及Hurwitz等發(fā)現(xiàn)依賴于DNA的RNA聚合酶；1961年Hall和Spiege-lman用RNA-DNA雜交證明mRNA與DNA序列互補(bǔ)；逐步闡明了RNA轉(zhuǎn)錄合成的機(jī)理。

在此同時(shí)認(rèn)識(shí)到蛋白質(zhì)是接受RNA的遺傳信息而合成的。50年代初Zamecnik等在形態(tài)學(xué)和分離的亞細(xì)胞組分實(shí)驗(yàn)中已發(fā)現(xiàn)微粒體（microsome）是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成的部位；1957年Hoagland、Zamecnik及Stephenson等分離出tRNA并對(duì)它們?cè)诤铣傻鞍踪|(zhì)中轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸的功能提出了假設(shè)；1961年Brenner及Gross等觀察了在蛋白質(zhì)合成過程中mRNA與核糖體的結(jié)合；1965年Holley首次測(cè)出了酵母丙氨酸t(yī)RNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)；特別是在60年代Nirenberg、Ochoa以及Khorana等幾組科學(xué)家的共同努力破譯了RNA上編碼合成蛋白質(zhì)的遺傳密碼，隨后研究表明這套遺傳密碼在生物界具有通用性，從而認(rèn)識(shí)了蛋白質(zhì)翻譯合成的基本過程。

上述重要發(fā)現(xiàn)共同建立了以中心法則為基礎(chǔ)的分子遺傳學(xué)基本理論體系。1970年Temin和Baltimore又同時(shí)從雞肉瘤病毒顆粒中發(fā)現(xiàn)以RNA為模板合成DNA的反轉(zhuǎn)錄酶，又進(jìn)一步補(bǔ)充和完善了遺傳信息傳遞的中心法則。對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)

1956-58年Anfinsen和White根據(jù)對(duì)酶蛋白的變性和復(fù)性實(shí)驗(yàn)，提出蛋白質(zhì)的三維空間結(jié)構(gòu)是由其氨基酸序列來確定的。1958年Ingram證明正常的血紅蛋白與鐮刀狀細(xì)胞溶血癥病人的血紅蛋白之間，亞基的肽鏈上僅有一個(gè)氨基酸殘基的差別，使人們對(duì)蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)影響功能有了深刻的印象。與此同時(shí)，對(duì)蛋白質(zhì)研究的手段也有改進(jìn)，1969年Weber開始應(yīng)用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定蛋白質(zhì)分子量；60年代先后分析得血紅蛋白、核糖核酸酶A等一批蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)；1973年氨基酸序列自動(dòng)測(cè)定儀問世。中國科學(xué)家在1965年人工合成了牛胰島素；4 在1973年用1.8AX-線衍射分析法測(cè)定了牛胰島素的空間結(jié)構(gòu)，為認(rèn)識(shí)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)做出了重要貢獻(xiàn)。

3．初步認(rèn)識(shí)生命本質(zhì)并開始改造生命的深入發(fā)展階段

70年代后，以基因工程技術(shù)的出現(xiàn)作為新的里程碑，標(biāo)志著人類深入認(rèn)識(shí)生命本質(zhì)并能動(dòng)改造生命的新時(shí)期開始。其間的重大成就包括： 重組DNA技術(shù)的建立和發(fā)展

分子生物學(xué)理論和技術(shù)發(fā)展的積累使得基因工程技術(shù)的出現(xiàn)成為必然。1967-1970年R.Yuan和H.O.Smith等發(fā)現(xiàn)的限制性核酸內(nèi)切酶為基因工程提供了有力的工具； 1972年Berg等將SV-40病毒DNA與噬菌體P22DNA在體外重組成功，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，使本來在真核細(xì)胞中合成的蛋白質(zhì)能在細(xì)菌中合成，打破了種屬界限；1977年Boyer等首先將人工合成的生長激素釋放抑制因子14肽的基因重組入質(zhì)粒，成功地在大腸桿菌中合成得到這14肽；1978年Itakura（板倉）等使人生長激素191肽在大腸桿菌中表達(dá)成功；1979年美國基因技術(shù)公司用人工合成的人胰島素基因重組轉(zhuǎn)入大腸桿菌中合成人胰島素。至今我國已有人干擾素、人白介素

2、人集落刺激因子、重組人乙型肝炎疫苗、基因工程幼畜腹瀉疫苗等多種基因工程藥物和疫苗進(jìn)入生產(chǎn)或臨床試用，世界上還有幾百種基因工程藥物及其它基因工程產(chǎn)品在研制中，成為當(dāng)今農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥業(yè)發(fā)展的重要方向，將對(duì)醫(yī)學(xué)和工農(nóng)業(yè)發(fā)展作出新貢獻(xiàn)。

轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物和基因剔除動(dòng)植物的成功是基因工程技術(shù)發(fā)展的結(jié)果。1982年P(guān)almiter等將克隆的生長激素基因?qū)胄∈笫芫鸭?xì)胞核內(nèi)，培育得到比原小鼠個(gè)體大幾倍的“巨鼠”，激起了人們創(chuàng)造優(yōu)良品系家畜的熱情。我國水生生物研究所將生長激素基因轉(zhuǎn)入魚受精卵，得到的轉(zhuǎn)基因魚的生長顯著加快、個(gè)體增大；轉(zhuǎn)基因豬也正在研制中。用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物還能獲取治療人類疾病的重要蛋白質(zhì)，導(dǎo)入了凝血因子Ⅸ基因的轉(zhuǎn)基因綿羊分泌的乳汁中含有豐富的凝血因子Ⅸ，能有效地用于血友病的治療。在轉(zhuǎn)基因植物方面，1994年能比普通西紅柿保鮮時(shí)間更長的轉(zhuǎn)基因西紅柿投放市場(chǎng)，1996年轉(zhuǎn)基因玉米、轉(zhuǎn)基因大豆相繼投入商品生產(chǎn)，美國最早研制得到抗蟲棉花，我國科學(xué)家將自己發(fā)現(xiàn)的蛋白酶抑制劑基因轉(zhuǎn)入棉花獲得抗棉鈴蟲的棉花株。到1996年全世界已有250萬公頃土地種植轉(zhuǎn)基因植物。

基因診斷與基因治療是基因工程在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域發(fā)展的一個(gè)重要方面。1991年美國向一患先天性免疫缺陷?。ㄟz傳性腺苷脫氨酶ADA基因缺陷）的女孩體內(nèi)導(dǎo)入 重組的ADA基因，獲得成功。我國也在1994年用導(dǎo)入人凝血因子Ⅸ基因的方法成功治療了乙型血友病的患者。在我國用作基因診斷的試劑盒已有近百種之多?；蛟\斷和基因治療正在發(fā)展之中。

這時(shí)期基因工程的迅速進(jìn)步得益于許多分子生物學(xué)新技術(shù)的不斷涌現(xiàn)。包括：核酸的化學(xué)合成從手工發(fā)展到全自動(dòng)合成，1975-1977年Sanger、Maxam和Gilbert先后發(fā)明了三種DNA序列的快速測(cè)定法；90年代全自動(dòng)核酸序列測(cè)定儀的問世；1985年Cetus公司Mullis等發(fā)明的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）的特定核酸序列擴(kuò)增技術(shù)，更以其高靈敏度和特異性被廣泛應(yīng)用，對(duì)分子生物學(xué)的發(fā)展起到了重大的推動(dòng)作用。

基因組研究的發(fā)展

目前分子生物學(xué)已經(jīng)從研究單個(gè)基因發(fā)展到研究生物整個(gè)基因組的結(jié)構(gòu)與功能。1977年Sanger測(cè)定了ΦX174-DNA全部5375個(gè)核苷酸的序列；1978年Fiers等測(cè)出SV-40DNA全部5224對(duì)堿基序列；80年代λ噬菌體DNA全部48，502堿基對(duì)的序列全部測(cè)出；一些小的病毒包括乙型肝炎病毒、艾滋病毒等基因組的全序列也陸續(xù)被測(cè)定；1996年底許多科學(xué)家共同努力測(cè)出了大腸桿菌基因組DNA的全序列長4x106堿基對(duì)。測(cè)定一個(gè)生物基因組核酸的全序列無疑對(duì)理解這一生物的生命信息及其功能有極大的意義。1990年人類基因組計(jì)劃（Human Genome Project）開始實(shí)施，這是生命科學(xué)領(lǐng)域有史以來全球性最龐大的研究計(jì)劃。2002和2003年完成了水稻和人類全基因組。更多的基因組學(xué)研究工作正在鋪開。

此外。功能基因組學(xué)的研究正在生命各學(xué)科快速展開。單克隆抗體及基因工程抗體的建立和發(fā)展

1975年Kohler和Milstein首次用B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)制備出單克隆抗體以來，人們利用這一細(xì)胞工程技術(shù)研制出多種單克隆抗體，為許多疾病的診斷和治療提供了有效的手段。80年代以后隨著基因工程抗體技術(shù)而相繼出現(xiàn)的單域抗體、單鏈抗體、嵌合抗體、重構(gòu)抗體、雙功能抗體等為廣泛和有效的應(yīng)用單克隆抗體提供了廣闊的前景。基因表達(dá)調(diào)控機(jī)理

分子遺傳學(xué)基本理論建立者Jacob和Monod最早提出的操縱元學(xué)說打開了人類認(rèn)識(shí)基因表達(dá)6 調(diào)控的窗口，在分子遺傳學(xué)基本理論建立的60年代，人們主要認(rèn)識(shí)了原核生物基因表達(dá)調(diào)控的一些規(guī)律，70年代以后才逐漸認(rèn)識(shí)了真核基因組結(jié)構(gòu)和調(diào)控的復(fù)雜性。1977年最先發(fā)現(xiàn)猴SV40病毒和腺病毒中編碼蛋白質(zhì)的基因序列是不連續(xù)的，這種基因內(nèi)部的間隔區(qū)（內(nèi)含子）在真核基因組中是普遍存在的，揭開了認(rèn)識(shí)真核基因組結(jié)構(gòu)和調(diào)控的序幕。1981年Cech等發(fā)現(xiàn)四膜蟲rRNA的自我剪接，從而發(fā)現(xiàn)核酶（ribozyme）。80-90年代，使人們逐步認(rèn)識(shí)到真核基因的順式調(diào)控元件與反式轉(zhuǎn)錄因子、核酸與蛋白質(zhì)間的分子識(shí)別與相互作用是基因表達(dá)調(diào)控根本所在。

細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)理研究成為新的前沿領(lǐng)域

細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)理的研究可以追述至50年代。Sutherland1957年發(fā)現(xiàn)cAMP、1965年提出第二信使學(xué)說，是人們認(rèn)識(shí)受體介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的第一個(gè)里程碑。1977年Ross等用重組實(shí)驗(yàn)證實(shí)G蛋白的存在和功能，將G蛋白與腺苷環(huán)化酶的作用相聯(lián)系起來，深化了對(duì)G蛋白偶聯(lián)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的認(rèn)識(shí)。70年代中期以后，癌基因和抑癌基因的發(fā)現(xiàn)、蛋白酪氨酸激酶的發(fā)現(xiàn)及其結(jié)構(gòu)與功能的深入研究、各種受體蛋白基因的克隆和結(jié)構(gòu)功能的探索等，使近10年來細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究更有了長足的進(jìn)步。目前，對(duì)于某些細(xì)胞中的一些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑已經(jīng)有了初步的認(rèn)識(shí)，尤其是在免疫活性細(xì)胞對(duì)抗原的識(shí)別及其活化信號(hào)的傳遞途徑方面和細(xì)胞增殖控制方面等都形成了一些基本的概念，當(dāng)然要達(dá)到最終目標(biāo)還需相當(dāng)長時(shí)間的努力。

以上簡(jiǎn)要介紹了分子生物學(xué)的發(fā)展過程，可以看到在近半個(gè)世紀(jì)中它是生命科學(xué)范圍發(fā)展最為迅速的一個(gè)前沿領(lǐng)域，推動(dòng)著整個(gè)生命科學(xué)的發(fā)展。至今分子生物學(xué)仍在迅速發(fā)展中，新成果、新技術(shù)不斷涌現(xiàn)，這也從另一方面說明分子生物學(xué)發(fā)展還處在初級(jí)階段。分子生物學(xué)已建立的基本規(guī)律給人們認(rèn)識(shí)生命的本質(zhì)指出了光明的前景，但分子生物學(xué)的歷史還短，積累的資料還不夠，例如：在地球上千姿萬態(tài)的生物攜帶龐大的生命信息，迄今人類所了解的只是極少的一部分，還未認(rèn)識(shí)核酸、蛋白質(zhì)組成生命的許多基本規(guī)律；又如人類基因組DNA 3x109 bp的全序列，包括了3萬多個(gè)基因的一級(jí)結(jié)構(gòu)，但是要徹底搞清楚這些基因產(chǎn)物的功能、調(diào)控、基因間的相互關(guān)系和協(xié)調(diào)，要理解近90%不為蛋白質(zhì)編碼的序列的作用等等，都還要經(jīng)歷漫長的研究道路。

第二篇：分子生物學(xué)技術(shù)

生物實(shí)驗(yàn)室安全常識(shí)（廢液處理篇）生物谷

生物谷編者按：

我們的生物實(shí)驗(yàn)室存在多少危險(xiǎn)？

生物實(shí)驗(yàn)對(duì)我們操作人員造成了怎樣的危害？ 實(shí)驗(yàn)室工程菌外流對(duì)我們環(huán)境的影響有幾多？

這些平時(shí)并不引起我們注意的隱患也許會(huì)給我們自身健康，或者環(huán)境帶來長遠(yuǎn)的影響，因此生物通網(wǎng)站聯(lián)合《遺傳》、《中國生物工程雜志》、《生命世界》雜志開展2007賽默飛世爾中國生物實(shí)驗(yàn)室安全現(xiàn)狀調(diào)查活動(dòng)，提出警示，珍惜生命！此次活動(dòng)的現(xiàn)狀調(diào)查報(bào)告將發(fā)于相關(guān)部門，提出寶貴意見的讀者將有機(jī)會(huì)獲得精美禮品。

實(shí)驗(yàn)室的污染主要有生物性污染和化學(xué)污染兩種。如按形態(tài)分則可大致分為廢水、廢氣和固體污染物三種。其中生物污染包括生物廢棄物污染和生物細(xì)菌毒素污染，如血液、尿、糞便、各種電泳液、特種生物試劑等。而化學(xué)污染則包括有機(jī)物污染和無機(jī)物污染。除此以外，還有部分實(shí)驗(yàn)室存在放射性污染。在此次賽默飛世爾中國生物實(shí)驗(yàn)室安全調(diào)查活動(dòng)中，從現(xiàn)有調(diào)查結(jié)果中，我們驚訝的發(fā)現(xiàn)許多生物實(shí)驗(yàn)室存在嚴(yán)重的污染問題，而其中又以廢液廢品的處理為最，大部分實(shí)驗(yàn)室在進(jìn)行生物實(shí)驗(yàn)過程中產(chǎn)生的大量高濃度含有害微生物的培養(yǎng)液、培養(yǎng)基，未經(jīng)適當(dāng)?shù)臏缇幚矶苯油馀?，而且許多實(shí)驗(yàn)室的下水道與附近居民的下水道相通，污染物通過下水道形成交叉污染，最后流入河中或者滲入地下，時(shí)間長了將造成不可估量的危害。

由于目前雖然國家環(huán)保總局將各類實(shí)驗(yàn)室納入環(huán)保監(jiān)管范圍，但是許多實(shí)驗(yàn)室仍然處于監(jiān)控真空狀態(tài)，缺乏規(guī)章制度、缺乏實(shí)驗(yàn)室污染控制的經(jīng)費(fèi)投入、缺乏對(duì)實(shí)驗(yàn)室的監(jiān)管等各種原因?qū)е铝藢?shí)驗(yàn)室成為了污染源，對(duì)環(huán)境造成了威脅，這些種種都需要社會(huì)各界的共同關(guān)注。

生物實(shí)驗(yàn)室產(chǎn)生的廢液污染主要是化學(xué)性污染和生物性污染，另外還有放射性污染，化學(xué)性污染包括有機(jī)物污染和無機(jī)物污染。有機(jī)物污染主要是有機(jī)試劑污染和有機(jī)樣品污染。在大多數(shù)情況下，實(shí)驗(yàn)室中的有機(jī)試劑并不直接參與發(fā)生反應(yīng)，僅僅起溶劑作用，因此消耗的有機(jī)試劑以各種形式排放到周邊的環(huán)境中，排放總量大致就相當(dāng)于試劑的消耗量。日復(fù)一日，年復(fù)一年，排放量十分可觀。有機(jī)樣品污染包括一些劇毒的有機(jī)樣品，如農(nóng)藥、苯并(α)芘、黃曲霉毒素、亞硝胺等。無機(jī)物污染有強(qiáng)酸、強(qiáng)堿的污染，重金屬污染，氰化物污染等。其中汞、砷、鉛、鎘、鉻等重金屬的毒性不僅強(qiáng)，且有在人體中有蓄積性。

生物性污染包括生物廢棄物污染和生物細(xì)菌毒素污染。生物廢棄物有檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的標(biāo)本，如血液、尿、糞便、痰液和嘔吐物等；檢驗(yàn)用品，如實(shí)驗(yàn)器材、細(xì)菌培養(yǎng)基和細(xì)菌陽性標(biāo)本等。生物實(shí)驗(yàn)室的通風(fēng)設(shè)備設(shè)計(jì)不完善或?qū)嶒?yàn)過程個(gè)人安全保護(hù)漏洞，會(huì)使生物細(xì)菌毒素?cái)U(kuò)散傳播，帶來污染，甚至帶來嚴(yán)重不良后果。2003年非典流行肆虐后，許多生物實(shí)驗(yàn)室加強(qiáng)對(duì)SAS病毒的研究，之后報(bào)道的非典感染者，多是科研工作者在實(shí)驗(yàn)室研究時(shí)被感染的。在對(duì)這些污染處理的時(shí)候，需要注意以下幾個(gè)方面：

廢液的濃度超過規(guī)定的濃度時(shí)，必須進(jìn)行處理。但處理設(shè)施比較齊全時(shí)，往往把廢液的處理濃度限制放寬。? 最好先將廢液分別處理，如果是貯存后一并處理時(shí)，雖然其處理方法將有所不同，但原則上要將可以統(tǒng)一處理的各種化合物收集后進(jìn)行處理。? 處理含有絡(luò)離子、螯合物之類的廢液時(shí)，如果有干擾成份存在，要把含有這些成份的廢液另外收集。?

下面所列的廢液不能互相混合：

①過氧化物與有機(jī)物；②氰化物、硫化物、次氯酸鹽與酸；③鹽酸、氫氟酸等揮發(fā)性酸與不揮發(fā)性酸；④濃硫酸、磺酸、羥基酸、聚磷酸等酸類與其它的酸；⑤銨鹽、揮發(fā)性胺與堿。

要選擇沒有破損及不會(huì)被廢液腐蝕的容器進(jìn)行收集。將所收集的廢液的成份及含量，貼上明顯的標(biāo)簽，并置于安全的地點(diǎn)保存。特別是毒性大的廢液，尤要十分注意。? 對(duì)硫醇、胺等會(huì)發(fā)出臭味的廢液和會(huì)發(fā)生氰、磷化氫等有毒氣體的廢液，以及易燃性大的二硫化碳、乙醚之類廢液，要把它加以適當(dāng)?shù)奶幚恚乐剐孤?，并?yīng)盡快進(jìn)行處理。? 含有過氧化物、硝化甘油之類爆炸性物質(zhì)的廢液，要謹(jǐn)慎地操作，并應(yīng)盡快處理。? 含有放射性物質(zhì)的廢棄物，用另外的方法收集，并必須嚴(yán)格按照有關(guān)的規(guī)定，嚴(yán)防泄漏，謹(jǐn)慎地進(jìn)行處理。?

另外不同種類的廢液等污染也要進(jìn)行不同的處理：

一、化學(xué)類廢物

一般的有毒氣體可通過通風(fēng)櫥或通風(fēng)管道，經(jīng)空氣稀釋排出。大量的有毒氣體必須通過與氧充分燃燒或吸收處理后才能排放。廢液應(yīng)根據(jù)其化學(xué)特性選擇合適的容器和存放地點(diǎn)，通過密閉容器存放，不可混合貯存，容器標(biāo)簽必須標(biāo)明廢物種類、貯存時(shí)間，定期處理。一般廢液可通過酸堿中和、混凝沉淀、次氯酸鈉氧化處理后排放，有機(jī)溶劑廢液應(yīng)根據(jù)性質(zhì)進(jìn)行回收。

1.含汞廢液的處理

排放標(biāo)準(zhǔn)3：廢液中汞的最高容許排放濃度為0.05mg/L(以Hg計(jì))。

處理方法：①硫化物共沉淀法：先將含汞鹽的廢液的pH值調(diào)至8-10，然后加入過量的Na2S，使其生成HgS沉淀。再加入FeS04(共沉淀劑)，與過量的S2-生成FeS沉淀，將懸浮在水中難以沉淀的HgS微粒吸附共沉淀．然后靜置、分離，再經(jīng)離心、過濾，濾液的含汞量可降至0.05mg/L以下。[2] ②還原法：用銅屑、鐵屑、鋅粒、硼氫化鈉等作還原劑，可以直接回收金屬汞。2.含鎘廢液的處理 ①氫氧化物沉淀法：在含鎘的廢液中投加石灰，調(diào)節(jié)pH值至10.5以上，充分?jǐn)嚢韬蠓胖?，使鎘離子變?yōu)殡y溶的Cd(OH)2沉淀．分離沉淀，用雙硫腙分光光度法檢測(cè)濾液中的Cd離子后(降至0.1mg/L以下)，將濾液中和至pH值約為7，然后排放。

②離子交換法：利用Cd2+離子比水中其它離子與陽離子交換樹脂有更強(qiáng)的結(jié)合力，優(yōu)先交換． 3.含鉛廢液的處理 在廢液中加入消石灰，調(diào)節(jié)至pH值大于11，使廢液中的鉛生成Pb(OH)2沉淀．然后加入Al2(S04)3(凝聚劑)，將pH值降至7-8，則Pb(OH)2與Al(OH)3共沉淀，分離沉淀，達(dá)標(biāo)后，排放廢液。4.含砷廢液的處理

在含砷廢液中加入FeCl3，使Fe／As達(dá)到50，然后用消石灰將廢液的pH值控制在8-10。利用新生氫氧化物和砷的化合物共沉淀的吸附作用，除去廢液中的砷。放置一夜，分離沉淀，達(dá)標(biāo)后，排放廢液。

5.含酚廢液的處理

酚屬劇毒類細(xì)胞原漿毒物，處理方法：低濃度的含酚廢液可加入次氯酸鈉或漂白粉煮一下，使酚分解為二氧化碳和水。如果是高濃度的含酚廢液，可通過醋酸丁酯萃取，再加少量的氫氧化鈉溶液反萃取，經(jīng)調(diào)節(jié)pH值后進(jìn)行蒸餾回收．處理后的廢液排放。6.綜合廢液處理

用酸、堿調(diào)節(jié)廢液PH為3-

4、加入鐵粉，攪拌30min，然后用堿調(diào)節(jié)p H為9左右，繼續(xù)攪拌10min，加入硫酸鋁或堿式氯化鋁混凝劑、進(jìn)行混凝沉淀，上清液可直接排放，沉淀于廢渣方式處理。

二、生物類廢物

生物類廢物應(yīng)根據(jù)其病源特性、物理特性選擇合適的容器和地點(diǎn)，專人分類收集進(jìn)行消毒、燒毀處理，日產(chǎn)日清。

液體廢物一般可加漂白粉進(jìn)行氯化消毒處理。固體可燃性廢物分類收集、處理、一律及時(shí)焚燒。固體非可燃性廢物分類收集，可加漂白粉進(jìn)行氯化消毒處理。滿足消毒條件后作最終處置。

1.一次性使用的制品如手套、帽子、工作物、口罩等使用后放入污物袋內(nèi)集中燒毀。

2.可重復(fù)利用的玻璃器材如玻片、吸管、玻瓶等可以用1000-3000mg/L有效氯溶液浸泡2-6h．然后清洗重新使用，或者廢棄。3.盛標(biāo)本的玻璃、塑料、搪瓷容器可煮沸15min.或者用1000mg/L有效氯漂白粉澄清液浸泡2-6h，消毒后用洗滌劑及流水刷洗、瀝干；用于微生物培養(yǎng)的，用壓力蒸汽滅菌后使用。4.微生物檢驗(yàn)接種培養(yǎng)過的瓊脂平板應(yīng)壓力滅菌30min，趁熱將瓊脂倒棄處理。

5.尿、唾液、血液等生物樣品，加漂白粉攪拌后作用2-4h，倒入化糞池或廁所?；蛘哌M(jìn)行焚燒處理。

三、放射性廢棄物

一般實(shí)驗(yàn)室的放射性廢棄物為中低水平放射性廢棄物，將實(shí)驗(yàn)過程中產(chǎn)生的放射性廢物收集在專門的污物桶內(nèi)，桶的外部標(biāo)明醒目的標(biāo)志，根據(jù)放射性同位素的半衰期長短，分別采用貯存一定時(shí)間使其衰變和化學(xué)沉淀濃縮或焚燒后掩埋處理。

1.放射性同位素的半衰期短(如：碘131、磷32等)的廢棄物，用專門的容器密閉后，放置于專門的貯存室，放置十個(gè)半衰期后排放或者焚燒處理。

2.放射性同位素的半衰期較長(如：鐵

59、鉆60等)的廢棄物，液體可用蒸發(fā)、離子交換、混凝劑共沉淀等方法濃縮，裝入容器集中埋于放射性廢物坑內(nèi)。除了這些需要注意的事項(xiàng)以外，處理廢液等污染也需要一些安全可靠的產(chǎn)品，目前國際上公認(rèn)的安全廢液處理，回收等方面的產(chǎn)品來自賽默飛世兒公司，這在之前[駐外觀察員特稿]美國與加拿大生物實(shí)驗(yàn)室廢棄物處置 文中也可以看出來。這些廢液處理小器具包括：

把一個(gè)有用的目的DNA片段通過重組DNA技術(shù),送進(jìn)受體細(xì)胞中去進(jìn)行繁殖和表達(dá)的工具叫載體(Vector)。細(xì)菌質(zhì)粒是重組DNA技術(shù)中常用的載體。

質(zhì)粒(Plasmid)是一種染色體外的穩(wěn)定遺傳因子,大小從1-200kb不等,為雙鏈、閉環(huán)的DNA分子,并以超螺旋狀態(tài)存在于宿主細(xì)胞中。質(zhì)粒主要發(fā)現(xiàn)于細(xì)菌、放線菌和真菌細(xì)胞中，它具有自主復(fù)制和轉(zhuǎn)錄能力,能在子代細(xì)胞中保持恒定的拷貝數(shù),并表達(dá)所攜帶的遺傳信息。質(zhì)粒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄要依賴于宿主細(xì)胞編碼的某些酶和蛋白質(zhì)，如離開宿主細(xì)胞則不能存活,而宿主即使沒有它們也可以正常存活。質(zhì)粒的存在使宿主具有一些額外的特性,如對(duì)抗生素的抗性等。F質(zhì)粒(又稱F因子或性質(zhì)粒)、R質(zhì)粒(抗藥性因子)和Col質(zhì)粒(產(chǎn)大腸桿菌素因子)等都是常見的天然質(zhì)粒。

質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制一般有兩種類型:緊密控制型(Stringent control)和松馳控制型(Relaxed control)。前者只在細(xì)胞周期的一定階段進(jìn)行復(fù)制,當(dāng)染色體不復(fù)制時(shí),它也不能復(fù)制,通常每個(gè)細(xì)胞內(nèi)只含有1個(gè)或幾個(gè)質(zhì)粒分子,如F因子。后者的質(zhì)粒在整個(gè)細(xì)胞周期中隨時(shí)可以復(fù)制,在每個(gè)細(xì)胞中有許多拷貝,一般在20個(gè)以上,如Col E1質(zhì)粒。在使用蛋白質(zhì)合成抑制劑-氯霉素時(shí),細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成、染色體DNA復(fù)制和細(xì)胞分裂均受到抑制,緊密型質(zhì)粒復(fù)制停止,而松馳型質(zhì)粒繼續(xù)復(fù)制,質(zhì)?？截悢?shù)可由原來20多個(gè)擴(kuò)增至1000-3000個(gè),此時(shí)質(zhì)粒DNA占總DNA的含量可由原來的2%增加至40-50%。

利用同一復(fù)制系統(tǒng)的不同質(zhì)粒不能在同一宿主細(xì)胞中共同存在,當(dāng)兩種質(zhì)粒同時(shí)導(dǎo)入同一細(xì)胞時(shí),它們?cè)趶?fù)制及隨后分配到子細(xì)胞的過程中彼此競(jìng)爭(zhēng),在一些細(xì)胞中,一種質(zhì)粒占優(yōu)勢(shì),而在另一些細(xì)胞中另一種質(zhì)粒卻占上風(fēng)。當(dāng)細(xì)胞生長幾代后,占少數(shù)的質(zhì)粒將會(huì)丟失,因而在細(xì)胞后代中只有兩種質(zhì)粒的一種，這種現(xiàn)象稱質(zhì)粒的不相容性(Incompatibility)。但利用不同復(fù)制系統(tǒng)的質(zhì)粒則可以穩(wěn)定地共存于同一宿主細(xì)胞中。質(zhì)粒通常含有編碼某些酶的基因,其表型包括對(duì)抗生素的抗性,產(chǎn)生某些抗生素,降解復(fù)雜有機(jī)物,產(chǎn)生大腸桿菌素和腸毒素及某些限制性內(nèi)切酶與修飾酶等。

質(zhì)粒載體是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上為適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室操作而進(jìn)行人工構(gòu)建的。與天然質(zhì)粒相比,質(zhì)粒載體通常帶有一個(gè)或一個(gè)以上的選擇性標(biāo)記基因(如抗生素抗性基因)和一個(gè)人工合成的含有多個(gè)限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的多克隆位點(diǎn)序列,并去掉了大部分非必需序列,使分子量盡可能減少,以便于基因工程操作。大多質(zhì)粒載體帶有一些多用途的輔助序列,這些用途包括通過組織化學(xué)方法肉眼鑒定重組克隆、產(chǎn)生用于序列測(cè)定的單鏈DNA、體外轉(zhuǎn)錄外源DNA序列、鑒定片段的插入方向、外源基因的大量表達(dá)等。一個(gè)理想的克隆載體大致應(yīng)有下列一些特性：（1）分子量小、多拷貝、松馳控制型；（2）具有多種常用的限制性內(nèi)切酶的單切點(diǎn)；（3）能插入較大的外源DNA片段；（4）具有容易操作的檢測(cè)表型。常用的質(zhì)粒載體大小一般在1kb至10kb之間，如PBR322、PUC系列、PGEM系列和pBluescript（簡(jiǎn)稱pBS）等。

從細(xì)菌中分離質(zhì)粒DNA的方法都包括3個(gè)基本步驟:培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增；收集和裂解細(xì)胞;分離和純化質(zhì)粒DNA。采用溶菌酶可以破壞菌體細(xì)胞壁,十二烷基磺酸鈉(SDS)和Triton X-100可使細(xì)胞膜裂解。經(jīng)溶菌酶和SDS或Triton X-100處理后,細(xì)菌染色體DNA會(huì)纏繞附著在細(xì)胞碎片上,同時(shí)由于細(xì)菌染色體DNA比質(zhì)粒大得多,易受機(jī)械力和核酸酶等的作用而被切斷成不同大小的線性片段。當(dāng)用強(qiáng)熱或酸、堿處理時(shí)，細(xì)菌的線性染色體DNA變性,而共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(Covalently closed circular DNA，簡(jiǎn)稱cccDNA)的兩條鏈不會(huì)相互分開，當(dāng)外界條件恢復(fù)正常時(shí)，線狀染色體DNA片段難以復(fù)性,而是與變性的蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片纏繞在一起,而質(zhì)粒DNA雙鏈又恢復(fù)原狀,重新形成天然的超螺旋分子,并以溶解狀態(tài)存在于液相中。

在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi),共價(jià)閉環(huán)質(zhì)粒以超螺旋形式存在。在提取質(zhì)粒過程中，除了超螺旋DNA外，還會(huì)產(chǎn)生其它形式的質(zhì)粒DNA。如果質(zhì)粒DNA兩條鏈中有一條鏈發(fā)生一處或多處斷裂,分子就能旋轉(zhuǎn)而消除鏈的張力,形成松馳型的環(huán)狀分子,稱開環(huán)DNA(Open circular DNA, 簡(jiǎn)稱 ocDNA)；如果質(zhì)粒DNA的兩條鏈在同一處斷裂,則形成線狀DNA(Linear DNA)。當(dāng)提取的質(zhì)粒DNA電泳時(shí),同一質(zhì)粒DNA其超螺旋形式的泳動(dòng)速度要比開環(huán)和線狀分子的泳動(dòng)速度快。第二節(jié) 材料、設(shè)備及試劑

一、材料

含pBS的E.coli DH5α或JM系列菌株，1.5ml塑料離心管(又稱eppendorf管),離心管架。

二、設(shè)備

微量取液器(20μl,200μl,1000μl)，臺(tái)式高速離心機(jī)，恒溫振蕩搖床，高壓蒸汽消毒器(滅菌鍋)，渦旋振蕩器，電泳儀，瓊脂糖平板電泳裝置和 恒溫水浴鍋等。

三、試劑

1、LB液體培養(yǎng)基(Luria-Bertani)：稱取蛋白胨(Tryptone)10 g，酵母提取物(Yeast extract)5 g，NaCl 10 g，溶于800ml去離子水中，用NaOH調(diào)pH至7.5, 加去離子水至總體積1升,高壓下蒸氣滅菌20分鐘。

2、LB固體培養(yǎng)基：液體培養(yǎng)基中每升加12g瓊脂粉,高壓滅菌。

3、氨芐青霉素(Ampicillin, Amp)母液：配成 50mg/ml水溶液,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

4、溶菌酶溶液： 用10mmol/L Tris·Cl(pH8.0)溶液配制成10mg/ml,并分裝成小份(如1.5ml)保存于-20℃,每一小份一經(jīng)使用后便予丟棄。

5、3mol/l NaAc(pH5.2)： 50ml水中溶解40.81g NaAc·3H2 O,用冰醋酸調(diào)pH至5.2, 加水定容至100ml, 分裝后高壓滅菌,儲(chǔ)存于4℃冰箱。

6、溶液Ⅰ：50 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris.Cl(pH8.0)，10mmol/L EDTA(pH8.0)。溶液Ⅰ可成批配制,每瓶100ml,高壓滅菌15分鐘,儲(chǔ)存于4℃冰箱。

7、溶液Ⅱ：0.2 mol/L NaOH(臨用前用10mol/L NaOH母液稀釋)，1％ SDS。

8、溶液Ⅲ：5 mol/L KAc 60ml，冰醋酸 11.5ml，H2O 28.5ml，定容至100ml, 并高壓滅菌。溶液終濃度為: K+ 3mol/L, Acˉ 5mol/L。

9、RNA酶A母液：將RNA酶A溶于10mmol/L Tris·Cl(pH7.5), 15mmol/L NaCl中,配成10mg/ml的溶液,于100℃加熱15分鐘,使混有的DNA酶失活。冷卻后用1.5ml eppendorf管分裝成小份保存于-20℃。

10、飽和酚：市售酚中含有醌等氧化物,這些產(chǎn)物可引起磷酸二酯鍵的斷裂及導(dǎo)致RNA和DNA的交聯(lián),應(yīng)在160℃用冷凝管進(jìn)行重蒸。重蒸酚加入0.1％的8-羥基喹啉(作為抗氧化劑),并用等體積的0.5mol/L Tris·Cl(pH8.0)和0.1mol/L Tris·Cl(pH8.0)緩沖液反復(fù)抽提使之飽和并使其pH值達(dá)到7.6以上,因?yàn)樗嵝詶l件下DNA會(huì)分配于有機(jī)相。

11、氯仿:按氯仿:異戊醇＝24:1體積比加入異戊醇。氯仿可使蛋白變性并有助于液相與有機(jī)相的分開,異戊醇則可起消除抽提過程中出現(xiàn)的泡沫。

按體積/體積＝1:1混合上述飽和酚與氯仿即得酚/氯仿(1:1)。酚和氯仿均有很強(qiáng)的腐蝕性，操作時(shí)應(yīng)戴手套。

12、TE緩沖液：10 mmo/L Tris·Cl(pH8.0)，1 mmol/L EDTA(pH8.0)。高壓滅菌后儲(chǔ)存于4℃冰箱中。

13、STET：0.1 mol/L NaCl，10mmol/L Tris·Cl(pH8.0)，10 mmol/L EDTA(pH8.0)，5% Triton X-100。

14、STE：0.1mol/L NaCl，10mmol/L Tris·Cl(pH8.0)，1mmol/L EDTA(pH8.0)。

15、電泳所用試劑：（1）TBE 緩沖液(5×)：稱取 Tris 54g，硼酸27.5g，并加入 0.5M EDTA(pH8.0)20ml，定溶至1000ml。（2）上樣緩沖液(6×)：0.25% 溴酚藍(lán)，40%(w/v)蔗糖水溶液。第三節(jié) 操作步驟

一、細(xì)菌的培養(yǎng)和收集

將含有質(zhì)粒pBS的DH5α菌種接種在LB固體培養(yǎng)基(含50μg/ml Amp)中, 37℃培養(yǎng)12-24小時(shí)。用無菌牙簽挑取單菌落接種到5ml LB液體培養(yǎng)基(含50μg/ml Amp)中,37℃振蕩培養(yǎng)約12小時(shí)至對(duì)數(shù)生長后期。

二、質(zhì)粒DNA少量快速提取

質(zhì)粒DNA小量提取法對(duì)于從大量轉(zhuǎn)化子中制備少量部分純化的質(zhì)粒DNA十分有用。這些方法共同特點(diǎn)是簡(jiǎn)便、快速，能同時(shí)處理大量試樣,所得DNA有一定純度,可滿足限制酶切割、電泳分析的需要。

（一）、煮沸法

1、將1.5ml培養(yǎng)液倒入eppendorf管中,4℃下12000ｇ離心30秒。

2、棄上清，將管倒置于衛(wèi)生紙上幾分鐘，使液體流盡。

3、將菌體沉淀懸浮于120ml STET溶液中, 渦旋混勻。

4、加入10ml新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml), 渦旋振蕩3秒鐘。

5、將eppendorf管放入沸水浴中,50秒后立即取出。

6、用微量離心機(jī)4℃下12000g離心10分鐘。

7、用無菌牙簽從eppendorf管中去除細(xì)菌碎片。

8、取20ml進(jìn)行電泳檢查。

[注意] 1.對(duì)大腸桿菌可從固體培養(yǎng)基上挑取單個(gè)菌落直接進(jìn)行煮沸法提取質(zhì)粒DNA。

2.煮沸法中添加溶菌酶有一定限度,濃度高時(shí),細(xì)菌裂解效果反而不好。有時(shí)不同溶菌酶也能溶菌。

3.提取的質(zhì)粒DNA中會(huì)含有RNA,但RNA并不干擾進(jìn)一步實(shí)驗(yàn),如限制性內(nèi)切酶消化,亞克隆及連接反應(yīng)等。

（二）、堿法

1、取1.5ml培養(yǎng)液倒入1.5ml eppendorf管中,4℃下12000g離心30秒。

2、棄上清,將管倒置于衛(wèi)生紙上數(shù)分鐘,使液體流盡。

3、菌體沉淀重懸浮于100μl溶液Ⅰ中(需劇烈振蕩),室溫下放置5-10分鐘。

4、加入新配制的溶液Ⅱ200μl, 蓋緊管口，快速溫和顛倒eppendorf管數(shù)次,以混勻內(nèi)容物(千萬不要振蕩),冰浴5分鐘。

5、加入150μl預(yù)冷的溶液Ⅲ,蓋緊管口，并倒置離心管，溫和振蕩10秒,使沉淀混勻,冰浴中5-10分鐘,4℃下12000g離心5-10分鐘。

6、上清液移入干凈eppendorf管中,加入等體積的酚/氯仿(1:1),振蕩混勻,4℃下12000g離心5分鐘。

7、將水相移入干凈eppendorf管中,加入2倍體積的無水乙醇,振蕩混勻后置于-20℃冰箱中20分鐘，然后4℃下12000g離心10分鐘。

8、棄上清,將管口敞開倒置于衛(wèi)生紙上使所有液體流出,加入1ml 70％乙醇洗沉淀一次,4℃下12000g離心5-10分鐘。

9、吸除上清液,將管倒置于衛(wèi)生紙上使液體流盡,真空干燥10分鐘或室溫干燥。

10、將沉淀溶于20μl TE緩沖液(pH8.0，含20μg /ml RNaseA)中，儲(chǔ)于-20℃冰箱中。

[注意] 1.提取過程應(yīng)盡量保持低溫。

2.提取質(zhì)粒DNA過程中除去蛋白很重要,采用酚/氯仿去除蛋白效果較單獨(dú)用酚或氯仿好,要將蛋白盡量除干凈需多次抽提。

3.沉淀DNA通常使用冰乙醇,在低溫條件下放置時(shí)間稍長可使DNA沉淀完全。沉淀DNA也可用異丙醇(一般使用等體積),且沉淀完全,速度快,但常把鹽沉淀下來,所以多數(shù)還是用乙醇。

（三）、Wizard少量 DNA 純化系統(tǒng)

Promega公司的Wizard少量DNA純化系統(tǒng)可快速有效的抽提質(zhì)粒DNA,整個(gè)過程只需15分鐘。提取的質(zhì)?？芍苯佑糜贒NA測(cè)序、酶切分析和體外轉(zhuǎn)錄等。

該系統(tǒng)中所含試劑和柱子可以用于50次1-3ml質(zhì)粒培養(yǎng)液的分離和純化，試劑包括10ml細(xì)胞懸浮液，10ml細(xì)胞裂解液；10ml中和液，50ml Wizard少量DNA純化樹脂，50ml柱洗液（使用前加95%乙醇至120ml)和50支Wizard微型柱。

1、1-3ml過夜培養(yǎng)細(xì)胞液4℃下 12000g離心1-2分鐘。

2、去除上清液，菌體細(xì)胞懸浮于200μl 細(xì)胞懸浮液中,充分混合,并移入eppendorf管中。

3、加200μl 細(xì)胞裂解液, 顛倒離心管數(shù)次,直到溶液變清亮。

4、加200μl 中和液,顛倒離心管數(shù)次。5、4℃下12000g離心5分鐘，取上清液于新的eppendorf管中。

6、加1ml Wizard少量 DNA 純化樹脂,顛倒離心管數(shù)次以充分混勻。

7、取一次性注射器, 取出注塞,并使注射筒與Wizard微型柱連接,用移液槍將上述混合液加入注射筒中,并用注塞輕推,使混合物進(jìn)入微型柱。

8、將注射器與微型柱分開,取出注塞, 再將注射筒與微型柱相連,加入2ml柱洗液,并用注塞輕推，使柱洗液進(jìn)入微型柱。

9、取出微型柱置于eppendorf管中,離心2分鐘以除去微型柱中的柱洗液。

10、將微型柱放在一個(gè)新eppendorf管中，加50μl TE(或水)于微型柱中，靜止1分鐘后，4℃下12000g離心20秒。

11、丟棄微型柱，將eppendorf管中的質(zhì)粒DNA貯于4℃或-20℃冰箱。

[注意] 樹脂使用前應(yīng)充分混勻,如有結(jié)晶,可將樹脂用25-37℃水浴處理10分鐘。

三、質(zhì)粒DNA的大量提取和純化

在制作酶譜、測(cè)定序列、制備探針等實(shí)驗(yàn)中需要高純度、高濃度的質(zhì)粒DNA,為此需要大量提取質(zhì)粒DNA。大量提取的質(zhì)粒DNA一般需進(jìn)一步純化,常用柱層析法和氯化絕梯度離心法。

（一）、堿法

1、取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長后期的含pBS質(zhì)粒的細(xì)菌培養(yǎng)液250ml，4℃下5000g離心15分鐘,棄上清,將離心管倒置使上清液全部流盡。

2、將細(xì)菌沉淀重新懸浮于50ml用冰預(yù)冷的STE中（此步可省略）。

3、同步驟1方法離心以收集細(xì)菌細(xì)胞。

4、將細(xì)菌沉淀物重新懸浮于5ml溶液I中,充分懸浮菌體細(xì)胞。

5、加入12ml新配制的溶液II, 蓋緊瓶蓋,緩緩地顛倒離心管數(shù)次,以充分混勻內(nèi)容物,冰浴10分鐘。

6、加9ml用冰預(yù)冷的溶液III, 搖動(dòng)離心管數(shù)次以混勻內(nèi)容物,冰上放置15分鐘,此時(shí)應(yīng)形成白色絮狀沉淀。

7、4℃下5000g離心15分鐘。

8、取上清液,加入50ml RNA酶A(10mg/ml), 37℃水浴20分鐘。

9、加入等體積的飽和酚/氯仿,振蕩混勻,4℃下12000g離心10分鐘。

10、取上層水相, 加入等體積氯仿,振蕩混勻,4℃下12000g離心10分鐘。

11、取上層水相,加入1/5體積的4mol/L NaCl和10% PEG(分子量6000), 冰上放置60分鐘。12、4℃下12000g離心15分鐘, 沉淀用數(shù)ml 70%冰冷乙醇洗滌，4℃下12000g離心5分鐘。

13、真空抽干沉淀，溶于500ml TE或水中。

[注意] 1.提取過程中應(yīng)盡量保持低溫。

2.加入溶液II和溶液III后操作應(yīng)混和,切忌劇烈振蕩。

3.由于RNA酶A中常存在有DNA酶,利用RNA酶耐熱的特性,使用時(shí)應(yīng)先對(duì)該酶液進(jìn)行熱處理(80℃ 1小時(shí)),使DNA酶失活。

（二）、Wazard大量DNA純化系統(tǒng)

堿法大量提取DNA往往需要很長的時(shí)間.Promega公司的Wiazrd大量DNA純化系統(tǒng)既簡(jiǎn)單又快速,只需要離心和真空抽干,這個(gè)系統(tǒng)可以從500ml培養(yǎng)液中在3小時(shí)以內(nèi)獲得1mg以上的高質(zhì)量的質(zhì)粒DNA(200-20000bp)。該系統(tǒng)不需要酚和氯仿抽提,純化后的DNA溶于水或TE緩沖液中，不含任何鹽份，可以直接用于DNA序列分析和酶切反應(yīng)，也可以用于在核酸酶抑制劑（如RNasin）存在的條件下進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)等。

該系統(tǒng)中含有的試劑和柱子可以用于10次100-500ml質(zhì)粒培養(yǎng)液的分離和純化,試劑包括: 150ml 細(xì)胞懸浮液，150ml 細(xì)胞裂解液，150ml 中和液，100ml Wizard 大量DNA純化樹脂，125ml Wizard柱子洗脫溶液和10支 Wizard帶有存儲(chǔ)離心管的柱子。1、100-500ml細(xì)胞培養(yǎng)液置離心管中, 22-25℃下5000g離心10分鐘, 所得細(xì)胞沉淀充分懸浮于細(xì)胞懸浮液中。

2、加15ml細(xì)胞裂解溶液并輕輕混合,可以反復(fù)倒置混合,但不能用渦旋振蕩,細(xì)胞裂解完全時(shí),溶液會(huì)變清,這一步需要20分鐘。

3、加15ml中和溶液,立即反復(fù)倒置離心管數(shù)次，并使之混勻。

4、14000g,22-25℃離心15分鐘。

5、小心地將上清液吸出并移至一個(gè)新離心管中。

6、加0.5倍體積的異丙醇,混合均勻, 14000g 22-25℃下離心15分鐘。

7、棄上清,懸浮DNA沉淀于2ml TE緩沖液中。這一步中也許有的沉淀不能溶解。

8、加10ml Wizard大量DNA純化樹脂溶液, 并渦旋混合。

9、每一個(gè)樣品,使用一支Wizard大量柱子,柱子的頭插在真空器上(Promega產(chǎn)品,與此配套)。

10、將樹脂/DNA混合液轉(zhuǎn)入柱子中,真空抽取樹脂/DNA混合液。

11、將樹脂/DNA混合液抽干后,加13ml柱子洗脫溶液至離心管中, 對(duì)管底部的樹脂/DNA進(jìn)行洗脫(柱子一邊旋轉(zhuǎn)一邊加入洗脫液)，并加入柱子中。

12、真空抽干所加入的洗脫。

13、再加12ml柱子洗脫液進(jìn)柱子并抽干。

14、加入5ml 80％乙醇漂洗柱中的樹脂, 柱子真空抽干后將柱子放入用戶提供的離心管中,2500rpm(1300g)離心5分鐘。

15、取出柱子，真空抽干5分鐘,再將柱子放入系統(tǒng)中所提供的離心管中，2500rpm(1300g)離心5分鐘。

16、在柱子中加入1.5ml 65-70℃預(yù)熱過的滅菌重蒸水或TE,1分鐘后2500rpm(1300g)離心柱子/離心管5分鐘。

17、取出柱子,離心管中溶液即為提取的質(zhì)粒DNA,可以直接放在離心管中,蓋上蓋子，儲(chǔ)存在4℃或-20℃?zhèn)溆?。[注意] 1.在使用之前,系統(tǒng)所提供的柱子洗脫液按1:1加入125ml 95％乙醇。

2.純化樹脂必須混勻后再用.（三）、Sephrose 2B柱純化質(zhì)粒DNA

堿法提取的質(zhì)粒DNA即使用RNA酶處理,仍會(huì)含有少量RNA。當(dāng)有些試驗(yàn)需無RNA污染的DNA制品時(shí),則需進(jìn)行進(jìn)一步純化。一般常用Sepharose 2B或Sepharose 4B進(jìn)行純化,該方法具有快速,條件溫和,重復(fù)性好,載體物質(zhì)可以再利用等優(yōu)點(diǎn),因而已廣泛用于質(zhì)粒DNA純化。

1、將Sepharose 2B經(jīng)含0.1% SDS的TE（pH8.0）平衡后上柱。

2、將至多1ml的DNA溶液鋪在Sepharase 2B柱上。

3、待DNA溶液完全進(jìn)入柱內(nèi)后立即在柱的上部連接含有0.1% SDS的TE(pH8.0)貯液瓶。

4、以1ml流出液為1份進(jìn)行收集。

5、對(duì)每一管測(cè)定其OD260值,以確定哪些管中含有質(zhì)粒DNA。通常質(zhì)粒DNA在柱上流出的第一個(gè)峰中。

6、合并所有含質(zhì)粒的洗脫液,用等體積的酚/氯仿(1:1)抽提,4℃下12000g離心2分鐘,將上層水相轉(zhuǎn)入新管。

7、加入2倍體積的冰冷無水乙醇，-20℃下沉淀10分鐘,然后4℃下12000g離心10分鐘,棄去上清液。

8、沉淀加70%乙醇洗滌,4℃下12000g離心10分鐘,棄去上清液。

9、沉淀真空抽干,重新溶于TE或無菌水中。

[注意] 在裝柱過程中,要防止柱床中出現(xiàn)斷裂或氣泡現(xiàn)象,要使界面保持平整。對(duì)新裝成的柱,應(yīng)用含0.1% SDS的TE平衡, 以使柱內(nèi)的凝膠均勻。

思考題

1.質(zhì)粒的基本性質(zhì)有哪些？

2.質(zhì)粒載體與天然質(zhì)粒相比有哪些改進(jìn)？

3.在堿法提取質(zhì)粒DNA操作過程中應(yīng)注意哪些問題？ 第二章 DNA酶切及凝膠電泳 未知

第二章 DNA酶切及凝膠電泳 第一節(jié) 概 述

一.DNA的限制性內(nèi)切酶酶切分析

限制性內(nèi)切酶能特異地結(jié)合于一段被稱為限制性酶識(shí)別序列的DNA序列之內(nèi)或其附近的特異位點(diǎn)上,并切割雙鏈DNA。它可分為三類:Ⅰ類和Ⅲ類酶在同一蛋白質(zhì)分子中兼有切割和修飾(甲基化)作用且依賴于ATP的存在。Ⅰ類酶結(jié)合于識(shí)別位點(diǎn)并隨機(jī)的切割識(shí)別位點(diǎn)不遠(yuǎn)處的DNA，而Ⅲ類酶在識(shí)別位點(diǎn)上切割DNA分子,然后從底物上解離。Ⅱ類由兩種酶組成: 一種為限制性內(nèi)切核酸酶(限制酶),它切割某一特異的核苷酸序列;另一種為獨(dú)立的甲基化酶,它修飾同一識(shí)別序列。Ⅱ類中的限制性內(nèi)切酶在分子克隆中得到了廣泛應(yīng)用，它們是重組DNA的基礎(chǔ)。絕大多數(shù)Ⅱ類限制酶識(shí)別長度為4至6個(gè)核苷酸的回文對(duì)稱特異核苷酸序列(如EcoRⅠ識(shí)別六個(gè)核苷酸序列:5'-G↓AATTC-3'),有少數(shù)酶識(shí)別更長的序列或簡(jiǎn)并序列。Ⅱ類酶切割位點(diǎn)在識(shí)別序列中,有的在對(duì)稱軸處切割,產(chǎn)生平末端的DNA片段(如SmaⅠ:5'-CCC↓GGG-3');有的切割位點(diǎn)在對(duì)稱軸一側(cè),產(chǎn)生帶有單鏈突出末端的DNA片段稱粘性未端, 如EcoRⅠ切割識(shí)別序列后產(chǎn)生兩個(gè)互補(bǔ)的粘性末端。

5'…G↓AATTC…3' →5'… G AATTC…3'

3'…CTTAA↑G …5' →3'… CTTAA G…5'

DNA純度、緩沖液、溫度條件及限制性內(nèi)切酶本身都會(huì)影響限制性內(nèi)切酶的活性。大部分限制性內(nèi)切酶不受RNA或單鏈DNA的影響。當(dāng)微量的污染物進(jìn)入限制性內(nèi)切酶貯存液中時(shí),會(huì)影響其進(jìn)一步使用,因此在吸取限制性內(nèi)切酶時(shí),每次都要用新的吸管頭。如果采用兩種限制性內(nèi)切酶,必須要注意分別提供各自的最適鹽濃度。若兩者可用同一緩沖液,則可同時(shí)水解。若需要不同的鹽濃度,則低鹽濃度的限制性內(nèi)切酶必須首先使用,隨后調(diào)節(jié)鹽濃度,再用高鹽濃度的限制性內(nèi)切酶水解。也可在第一個(gè)酶切反應(yīng)完成后，用等體積酚/氯仿抽提，加0.1倍體積3mol/L NaAc和2倍體積無水乙醇，混勻后置-70℃低溫冰箱30分鐘，離心、干燥并重新溶于緩沖液后進(jìn)行第二個(gè)酶切反應(yīng)。

DNA限制性內(nèi)切酶酶切圖譜又稱DNA的物理圖譜，它由一系列位置確定的多種限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)組成，以直線或環(huán)狀圖式表示。在DNA序列分析、基因組的功能圖譜繪制、DNA的無性繁殖、基因文庫的構(gòu)建等工作中，建立限制性內(nèi)切酶圖譜都是不可缺少的環(huán)節(jié)，近年來發(fā)展起來的RFLP(限制性片段長度多態(tài)性)技術(shù)更是建立在它的基礎(chǔ)上。

構(gòu)建DNA限制性內(nèi)切酶圖譜有許多方法。通常結(jié)合使用多種限制性內(nèi)切酶，通過綜合分析多種酶單切及不同組合的多種酶同時(shí)切所得到的限制性片段大小來確定各種酶的酶切位點(diǎn)及其相對(duì)位置。酶切圖譜的使用價(jià)值依賴于它的準(zhǔn)確性和精確程度。

在酶切圖譜制作過程中，為了獲得條帶清晰的電泳圖譜，一般DNA用量約為0.5-1μg。限制性內(nèi)切酶的酶解反應(yīng)最適條件各不相同,各種酶有其相應(yīng)的酶切緩沖液和最適反應(yīng)溫度(大多數(shù)為37℃)。對(duì)質(zhì)粒DNA酶切反應(yīng)而言, 限制性內(nèi)切酶用量可按標(biāo)準(zhǔn)體系1μg DNA加1單位酶,消化1-2小時(shí)。但要完全酶解則必須增加酶的用量,一般增加2-3倍,甚至更多,反應(yīng)時(shí)間也要適當(dāng)延長。

二.凝膠電泳

瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳是分離鑒定和純化DNA片段的標(biāo)準(zhǔn)方法。該技術(shù)操作簡(jiǎn)便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度離心法）所無法分離的DNA片段。當(dāng)用低濃度的熒光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium bromide, EB)染色,在紫外光下至少可以檢出1-10ng的DNA條帶,從而可以確定DNA片段在凝膠中的位置。此外,還可以從電泳后的凝膠中回收特定的DNA條帶,用于以后的克隆操作。

瓊脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各種形狀、大小和孔隙度。瓊脂糖凝膠分離DNA片度大小范圍較廣,不同濃度瓊脂糖凝膠可分離長度從200bp至近50kb的DNA片段。瓊脂糖通常用水平裝置在強(qiáng)度和方向恒定的電場(chǎng)下電泳。聚丙烯酰胺分離小片段DNA(5-500bp)效果較好,其分辯力極高,甚至相差1bp的DNA片段就能分開。聚丙烯酰胺凝膠電泳很快,可容納相對(duì)大量的DNA,但制備和操作比瓊脂糖凝膠困難。聚丙烯酰胺凝膠采用垂直裝置進(jìn)行電泳。目前,一般實(shí)驗(yàn)室多用瓊脂糖水平平板凝膠電泳裝置進(jìn)行DNA電泳。

瓊脂糖主要在DNA制備電泳中作為一種固體支持基質(zhì),其密度取決于瓊脂糖的濃度。在電場(chǎng)中,在中性pH值下帶負(fù)電荷的DNA向陽極遷移,其遷移速率由下列多種因素決定:

1、DNA的分子大小:

線狀雙鏈DNA分子在一定濃度瓊脂糖凝膠中的遷移速率與DNA分子量對(duì)數(shù)成反比，分子越大則所受阻力越大，也越難于在凝膠孔隙中蠕行，因而遷移得越慢。

2、瓊脂糖濃度

一個(gè)給定大小的線狀DNA分子,其遷移速度在不同濃度的瓊脂糖凝膠中各不相同。DNA電泳遷移率的對(duì)數(shù)與凝膠濃度成線性關(guān)系。凝膠濃度的選擇取決于DNA分子的大小。分離小于0.5kb的DNA片段所需膠濃度是1.2-1.5%,分離大于10kb的DNA分子所需膠濃度為0.3-0.7%, DNA片段大小間于兩者之間則所需膠濃度為0.8-1.0%。

3、DNA分子的構(gòu)象

當(dāng)DNA分子處于不同構(gòu)象時(shí),它在電場(chǎng)中移動(dòng)距離不僅和分子量有關(guān),還和它本身構(gòu)象有關(guān)。相同分子量的線狀、開環(huán)和超螺旋DNA在瓊脂糖凝膠中移動(dòng)速度是不一樣的,超螺旋DNA移動(dòng)最快,而線狀雙鏈DNA移動(dòng)最慢。如在電泳鑒定質(zhì)粒純度時(shí)發(fā)現(xiàn)凝膠上有數(shù)條DNA帶難以確定是質(zhì)粒DNA不同構(gòu)象引起還是因?yàn)楹衅渌鸇NA引起時(shí),可從瓊脂糖凝膠上將DNA帶逐個(gè)回收,用同一種限制性內(nèi)切酶分別水解,然后電泳,如在凝膠上出現(xiàn)相同的DNA圖譜,則為同一種DNA。

4、電源電壓

在低電壓時(shí),線狀DNA片段的遷移速率與所加電壓成正比。但是隨著電場(chǎng)強(qiáng)度的增加，不同分子量的DNA片段的遷移率將以不同的幅度增長,片段越大,因場(chǎng)強(qiáng)升高引起的遷移率升高幅度也越大,因此電壓增加，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍將縮小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率達(dá)到最大,所加電壓不得超過5v/cm。

5、嵌入染料的存在

熒光染料溴化乙啶用于檢測(cè)瓊脂糖凝膠中的DNA,染料會(huì)嵌入到堆積的堿基對(duì)之間并拉長線狀和帶缺口的環(huán)狀DNA，使其剛性更強(qiáng),還會(huì)使線狀DNA遷移率降低15％。

6、離子強(qiáng)度影響

電泳緩沖液的組成及其離子強(qiáng)度影響DNA的電泳遷移率。在沒有離子存在時(shí)(如誤用蒸餾水配制凝膠),電導(dǎo)率最小,DNA幾乎不移動(dòng),在高離子強(qiáng)度的緩沖液中(如誤加10×電泳緩沖液),則電導(dǎo)很高并明顯產(chǎn)熱,嚴(yán)重時(shí)會(huì)引起凝膠熔化或DNA變性。

對(duì)于天然的雙鏈DNA,常用的幾種電泳緩沖液有TAE[含EDTA(pH8.0)和Tris-乙酸],TBE(Tris-硼酸和EDTA),TPE(Tris-磷酸和EDTA),一般配制成濃縮母液,儲(chǔ)于室溫。

第二節(jié) 材料、設(shè)備及試劑

一、材料

λDNA: 購買或自行提取純化;重組pBS質(zhì)料或pUC19質(zhì)粒;EcoRI酶及其酶切緩沖液: 購買成品;HindⅢ酶及其酶切緩沖液: 購買成品;瓊脂糖(Agarose): 進(jìn)口或國產(chǎn)的電泳用瓊脂糖均可。

二、設(shè)備

水平式電泳裝置,電泳儀,臺(tái)式高速離心機(jī), 恒溫水浴鍋, 微量移液槍, 微波爐或電爐,紫外透射儀, 照相支架, 照相機(jī)及其附件。

三、試劑1、5×TBE電泳緩沖液：配方見第一章。

2、6×電泳載樣緩沖液：0.25％ 溴粉藍(lán)，40％(w/v)蔗糖水溶液，貯存于 4℃。

3、溴化乙錠(EB)溶液母液:將EB配制成10mg/ml,用鋁箔或黑紙包裹容器,儲(chǔ)于室溫即可。第三節(jié) 操作步驟

一、DNA酶切反應(yīng)

1、將清潔干燥并經(jīng)滅菌的eppendorf管(最好0.5ml)編號(hào),用微量移液槍分別加入DNA 1μg和相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶反應(yīng)10×緩沖液2μl,再加入重蒸水使總體積為19μl,將管內(nèi)溶液混勻后加入1μl酶液,用手指輕彈管壁使溶液混勻,也可用微量離心機(jī)甩一下,使溶液集中在管底。此步操作是整個(gè)實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵,要防止錯(cuò)加，漏加。使用限制性內(nèi)切酶時(shí)應(yīng)盡量減少其離開冰箱的時(shí)間，以免活性降低。

2、混勻反應(yīng)體系后,將eppendorf管置于適當(dāng)?shù)闹С治锷希ㄈ绮逶谂菽芰习迳希?37℃水浴保溫2-3小時(shí),使酶切反應(yīng)完全。

3、每管加入2μl 0.1mol/L EDTA(pH8.0),混勻,以停止反應(yīng),置于冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

二、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)的制備

采用EcoRⅠ或HindⅢ酶解所得的λDNA片段來作為電泳時(shí)的分子量標(biāo)準(zhǔn)。λDNA為長度約50kb的雙鏈DNA分子,其商品溶液濃度為0.5mg/ml,酶解反應(yīng)操作如上述。HindIII切割 DNA后得到8個(gè)片段,長度分別為23.1, 9.4, 6.6, 4.4, 2.3, 2.0, 0.56和0.12kb。EcoRI切割lDNA后得到6個(gè)片段,長度分別為21.2, 7.4, 5.8, 5.6, 4.9和2.5kb。

三、瓊脂糖凝膠的制備

1、取5×TBE緩沖液20ml加水至200ml,配制成0.5×TBE稀釋緩沖液,待用。

2、膠液的制備：稱取0.4g瓊脂糖,置于200ml錐形瓶中,加入50ml 0.5×TBE稀釋緩沖液,放入微波爐里(或電爐上)加熱至瓊脂糖全部熔化,取出搖勻,此為0.8％瓊脂糖凝膠液。加熱過程中要不時(shí)搖動(dòng),使附于瓶壁上的瓊脂糖顆粒進(jìn)入溶液。加熱時(shí)應(yīng)蓋上封口膜,以減少水份蒸發(fā)。

3、膠板的制備：將有機(jī)玻璃膠槽兩端分別用橡皮膏(寬約1cm)緊密封住。將封好的膠槽置于水平支持物上,插上樣品梳子,注意觀察梳子齒下緣應(yīng)與膠槽底面保持1mm左右的間隙。

向冷卻至50-60℃的瓊脂糖膠液中加入溴化乙錠(EB)溶液使其終濃度為0.5μg /ml(也可不把EB加入凝膠中,而是電泳后再用0.5μg/ml的EB溶液浸泡染色)。用移液器吸取少量融化的瓊脂糖凝膠封橡皮膏內(nèi)側(cè),待瓊脂糖溶液凝固后將剩余的瓊脂糖小心地倒入膠槽內(nèi),使膠液形成均勻的膠層。倒膠時(shí)的溫度不可太低,否則凝固不均勻,速度也不可太快,否則容易出現(xiàn)氣泡。待膠完全凝固后撥出梳子,注意不要損傷梳底部的凝膠,然后向槽內(nèi)加入0.5×TBE稀釋緩沖液至液面恰好沒過膠板上表面。因邊緣效應(yīng)樣品槽附近會(huì)有一些隆起,阻礙緩沖液進(jìn)入樣品槽中,所以要注意保證樣品槽中應(yīng)注滿緩沖液。

4、加樣：取10μl酶解液與2μl 6×載樣液混勻,用微量移液槍小心加入樣品槽中。若DNA含量偏低,則可依上述比例增加上樣量,但總體積不可超過樣品槽容量。每加完一個(gè)樣品要更換tip頭,以防止互相污染,注意上樣時(shí)要小心操作,避免損壞凝膠或?qū)悠凡鄣撞磕z刺穿。

5、電泳：加完樣后,合上電泳槽蓋,立即接通電源。控制電壓保持在60-80V,電流在40mA以上。當(dāng)溴酚藍(lán)條帶移動(dòng)到距凝膠前沿約2cm時(shí),停止電泳。

6、染色：未加EB的膠板在電泳完畢后移入0.5μg/ml的EB溶液中,室溫下染色20-25分鐘。

7、觀察和拍照：在波長為254nm的長波長紫外燈下觀察染色后的或已加有EB的電泳膠板。DNA存在處顯示出肉眼可辨的桔紅色熒光條帶。紫光燈下觀察時(shí)應(yīng)戴上防護(hù)眼鏡或有機(jī)玻璃面罩,以免損傷眼睛。經(jīng)照相機(jī)鏡頭加上近攝鏡片和紅色濾光片后將相機(jī)固定于照相架上，采用全色膠片，光圈5.6,曝光時(shí)間10-120秒(根據(jù)熒光條帶的深淺選擇)。

8、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：在放大的電泳照片上,以樣品槽為起點(diǎn),用卡尺測(cè)量λDNA的EcoRⅠ和HindⅢ酶切片段的遷移距離,以厘米為單位。以核苷酸數(shù)的常用對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo),以遷移距離為橫坐標(biāo),在坐標(biāo)紙上繪出連結(jié)各點(diǎn)的平滑曲線,即為該電泳條件下DNA分子量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

9、DNA酶切片段大小的測(cè)定：在放大的電泳照片上,用卡尺量出DNA樣品各片段的遷移距離,根據(jù)此數(shù)值,在DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的對(duì)數(shù)值,進(jìn)一步計(jì)算出各片段的分子量大小(若用單對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙來繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,則可根據(jù)遷移距離直接查出DNA片段的大小)。反之,若已知DNA片段的大小亦可由標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出它預(yù)計(jì)的遷移距離。

10、DNA酶切片段排列順序的確定：根據(jù)單酶切,雙酶切和多酶切的電泳分析結(jié)果,對(duì)照DNA酶切片段大小的數(shù)據(jù)進(jìn)行邏輯推理,然后確定各酶切片段的排列順序和各酶切位點(diǎn)的相對(duì)位置。以環(huán)狀圖或直線圖表示,即成該DNA分子的限制性內(nèi)切酶圖譜。[注意] 1.酶切時(shí)所加的DNA溶液體積不能太大，否則DNA溶液中其他成分會(huì)干擾酶反應(yīng)。

2、酶活力通常用酶單位（U）表示，酶單位的定義是：在最適反應(yīng)條件下，1小時(shí)完全降解1mg lDNA的酶量為一個(gè)單位，但是許多實(shí)驗(yàn)制備的DNA不象lDNA那樣易于降解，需適當(dāng)增加酶的使用量。反應(yīng)液中加入過量的酶是不合適的，除考慮成本外，酶液中的微量雜質(zhì)可能干擾隨后的反應(yīng)。

3、市場(chǎng)銷售的酶一般濃度很大，為節(jié)約起見，使用時(shí)可事先用酶反應(yīng)緩沖液（1×）進(jìn)行稀釋。另外，酶通常保存在50%的甘油中，實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)將反應(yīng)液中甘油濃度控制在1/10之下，否則，酶活性將受影響。

4、觀察DNA離不開紫外透射儀,可是紫外光對(duì)DNA分子有切割作用。從膠上回收DNA時(shí),應(yīng)盡量縮短光照時(shí)間并采用長波長紫外燈(300-360nm）,以減少紫外光切割DNA。

5、EB是強(qiáng)誘變劑并有中等毒性,配制和使用時(shí)都應(yīng)戴手套,并且不要把EB灑到桌面或地面上。凡是沾污了EB的容器或物品必須經(jīng)專門處理后才能清洗或丟棄。

6、當(dāng)EB太多,膠染色過深,DNA帶看不清時(shí),可將膠放入蒸餾水沖泡,30分鐘后再觀察。思考題

1.如果一個(gè)DNA酶解液在電泳后發(fā)現(xiàn)DNA未被切動(dòng), 你認(rèn)為可能是什么原因？

2.瓊脂糖凝膠電泳中DNA分子遷移率受哪些因素的影響？ 第三章 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化 未知

第三章 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化 第一節(jié) 概 述

在自然條件下,很多質(zhì)粒都可通過細(xì)菌接合作用轉(zhuǎn)移到新的宿主內(nèi),但在人工構(gòu)建的質(zhì)粒載體中,一般缺乏此種轉(zhuǎn)移所必需的mob基因,因此不能自行完成從一個(gè)細(xì)胞到另一個(gè)細(xì)胞的接合轉(zhuǎn)移。如需將質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)移進(jìn)受體細(xì)菌，需誘導(dǎo)受體細(xì)菌產(chǎn)生一種短暫的感受態(tài)以攝取外源DNA。

轉(zhuǎn)化(Transformation)是將外源DNA分子引入受體細(xì)胞,使之獲得新的遺傳性狀的一種手段,它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究領(lǐng)域的基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)。

轉(zhuǎn)化過程所用的受體細(xì)胞一般是限制修飾系統(tǒng)缺陷的變異株，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變體(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA分子進(jìn)入體內(nèi)并穩(wěn)定地遺傳給后代。受體細(xì)胞經(jīng)過一些特殊方法(如電擊法,CaCl2 ,RbCl(KCl)等化學(xué)試劑法)的處理后,細(xì)胞膜的通透性發(fā)生了暫時(shí)性的改變,成為能允許外源DNA分子進(jìn)入的感受態(tài)細(xì)胞(Compenent cells)。進(jìn)入受體細(xì)胞的DNA分子通過復(fù)制,表達(dá)實(shí)現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移,使受體細(xì)胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。將經(jīng)過轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞在篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)，即可篩選出轉(zhuǎn)化子(Transformant,即帶有異源DNA分子的受體細(xì)胞)。目前常用的感受態(tài)細(xì)胞制備方法有CaCl2和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制備的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率較高,但CaCl2 法簡(jiǎn)便易行,且其轉(zhuǎn)化效率完全可以滿足一般實(shí)驗(yàn)的要求,制備出的感受態(tài)細(xì)胞暫時(shí)不用時(shí),可加入占總體積15％的無菌甘油于-70℃保存(半年),因此CaCl2法為使用更廣泛。為了提高轉(zhuǎn)化效率, 實(shí)驗(yàn)中要考慮以下幾個(gè)重要因素：

1.細(xì)胞生長狀態(tài)和密度: 不要用經(jīng)過多次轉(zhuǎn)接或儲(chǔ)于４℃的培養(yǎng)菌，最好從－70℃或-20℃甘油保存的菌種中直接轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細(xì)胞的菌液。細(xì)胞生長密度以剛進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期時(shí)為好，可通過監(jiān)測(cè)培養(yǎng)液的OD600 來控制。DH5α菌株的OD600 為0.5時(shí),細(xì)胞密度在5×107 個(gè)/ml左右(不同的菌株情況有所不同),這時(shí)比較合適。密度過高或不足均會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率。

2.質(zhì)粒的質(zhì)量和濃度: 用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA應(yīng)主要是超螺旋態(tài)DNA(cccDNA)。轉(zhuǎn)化效率與外源DNA的濃度在一定范圍內(nèi)成正比,但當(dāng)加入的外源DNA的量過多或體積過大時(shí),轉(zhuǎn)化效率就會(huì)降低。1ng的cccDNA即可使50μl 的感受態(tài)細(xì)胞達(dá)到飽和。一般情況下,DNA溶液的體積不應(yīng)超過感受態(tài)細(xì)胞體積的5％。

3.試劑的質(zhì)量: 所用的試劑,如CaCl2 等均需是最高純度的(GR.或AR.),并用超純水配制,最好分裝保存于干燥的冷暗處。

4.防止雜菌和雜DNA的污染：整個(gè)操作過程均應(yīng)在無菌條件下進(jìn)行, 所用器皿, 如離心管, tip頭等最好是新的,并經(jīng)高壓滅菌處理,所有的試劑都要滅菌,且注意防止被其它試劑、DNA酶或雜DNA所污染, 否則均會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率或雜DNA的轉(zhuǎn)入, 為以后的篩選、鑒定帶來不必要的麻煩。

本實(shí)驗(yàn)以E.coli DH5a菌株為受體細(xì)胞,并用CaCl2處理,使其處于感受態(tài),然后與pBS質(zhì)粒共保溫,實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化。由于pBS質(zhì)粒帶有氨芐青霉素抗性基因(Ampr)，可通過Amp抗性來篩選轉(zhuǎn)化子。如受體細(xì)胞沒有轉(zhuǎn)入pBS，則在含Amp的培養(yǎng)基上不能生長。能在Amp培養(yǎng)基上生長的受體細(xì)胞（轉(zhuǎn)化子）肯定已導(dǎo)入了pBS。轉(zhuǎn)化子擴(kuò)增后，可將轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒提取出，進(jìn)行電泳、酶切等進(jìn)一步鑒定。

本實(shí)驗(yàn)以E.coli DH5a菌株為受體細(xì)胞,并用CaCl2處理,使其處于感受態(tài),然后與pBS質(zhì)粒共保溫,實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化。由于pBS質(zhì)粒帶有氨芐青霉素抗性基因(Ampr)，可通過Amp抗性來篩選轉(zhuǎn)化子。如受體細(xì)胞沒有轉(zhuǎn)入pBS，則在含Amp的培養(yǎng)基上不能生長。能在Amp培養(yǎng)基上生長的受體細(xì)胞（轉(zhuǎn)化子）肯定已導(dǎo)入了pBS。轉(zhuǎn)化子擴(kuò)增后，可將轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒提取出，進(jìn)行電泳、酶切等進(jìn)一步鑒定。第二節(jié) 材料、設(shè)備及試劑

一.材料

E.coli DH5α菌株: Rˉ,Mˉ,Ampˉ；pBS質(zhì)粒DNA: 購買或?qū)嶒?yàn)室自制，eppendorf管。

二.設(shè)備

恒溫?fù)u床,電熱恒溫培養(yǎng)箱,臺(tái)式高速離心機(jī),無菌工作臺(tái),低溫冰箱, 恒溫水浴鍋, 制冰機(jī), 分光光度計(jì),微量移液槍。

三.試劑

1.LB固體和液體培養(yǎng)基：配方見第一章。

2.Amp母液：配方見第一章。

3.含Amp的LB固體培養(yǎng)基:將配好的LB固體培養(yǎng)基高壓滅菌后冷卻至60℃左右,加入Amp儲(chǔ)存液,使終濃度為50ug/ml,搖勻后鋪板。

4.麥康凱培養(yǎng)基(Maconkey Agar):取52g麥康凱瓊脂,加蒸餾水1000ml,微火煮沸至完全溶解,高壓滅菌，待冷至60℃左右加入Amp儲(chǔ)存液使終濃度為50ug/ml,然后搖勻后涂板。

5.0.05mol/L CaCl2溶液:稱取0.28g CaCl2(無水,分析純),溶于50ml重蒸水中,定容至100ml,高壓滅菌。

6.含15%甘油的0.05mol/L CaCl2: 稱取0.28g CaCl2(無水,分析純),溶于50ml重蒸水中,加入15ml甘油,定容至100ml,高壓滅菌。

第三節(jié) 操作步驟

一、受體菌的培養(yǎng)

從LB平板上挑取新活化的E.coli DH5α單菌落,接種于3-5ml LB液體培養(yǎng)基中,37℃下振蕩培養(yǎng)12小時(shí)左右,直至對(duì)數(shù)生長后期。將該菌懸液以1:100-1:50的比例接種于100ml LB液體培養(yǎng)基中,37℃振蕩培養(yǎng)2-3小時(shí)至OD600 ＝0.5左右。

二、感受態(tài)細(xì)胞的制備(CaCl2 法)

1、將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入離心管中,冰上放置10分鐘,然后于4℃下3000g離心10分鐘。

2、棄去上清,用預(yù)冷的0.05mol/L的CaCl2 溶液10ml輕輕懸浮細(xì)胞,冰上放置15-30分鐘后,4℃下3000g離心10分鐘。

3、棄去上清,加入4ml預(yù)冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2 溶液,輕輕懸浮細(xì)胞,冰上放置幾分鐘,即成感受態(tài)細(xì)胞懸液。

4、感受態(tài)細(xì)胞分裝成200μl的小份,貯存于-70℃可保存半年。

三、轉(zhuǎn)化

1、從-70℃冰箱中取200μl感受態(tài)細(xì)胞懸液,室溫下使其解凍,解凍后立即置冰上。

2、加入pBS質(zhì)粒DNA溶液(含量不超過50ng,體積不超過10μl),輕輕搖勻,冰上放置30分鐘后。3、42℃水浴中熱擊90秒或37℃水浴5分鐘,熱擊后迅速置于冰上冷卻3-5分鐘。

4、向管中加入1ml LB液體培養(yǎng)基(不含Amp),混勻后37℃振蕩培養(yǎng)1小時(shí),使細(xì)菌恢復(fù)正常生長狀態(tài),并表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性基因(Ampr)。

5、將上述菌液搖勻后取100μl 涂布于含Amp的篩選平板上,正面向上放置半小時(shí),待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后倒置培養(yǎng)皿,37℃培養(yǎng)16-24小時(shí)。

同時(shí)做兩個(gè)對(duì)照:

對(duì)照組1: 以同體積的無菌雙蒸水代替DNA溶液,其它操作與上面相同。此組正常情況下在含抗生素的LB平板上應(yīng)沒有菌落出現(xiàn)。

對(duì)照組2: 以同體積的無菌雙蒸水代替DNA溶液,但涂板時(shí)只取5μl 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此組正常情況下應(yīng)產(chǎn)生大量菌落。

四、計(jì)算轉(zhuǎn)化率

統(tǒng)計(jì)每個(gè)培養(yǎng)皿中的菌落數(shù)。

轉(zhuǎn)化后在含抗生素的平板上長出的菌落即為轉(zhuǎn)化子，根據(jù)此皿中的菌落數(shù)可計(jì)算出轉(zhuǎn)化子總數(shù)和轉(zhuǎn)化頻率，公式如下：

轉(zhuǎn)化子總數(shù)＝菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×轉(zhuǎn)化反應(yīng)原液總體積／涂板菌液體積

轉(zhuǎn)化頻率（轉(zhuǎn)化子數(shù)／每mg質(zhì)粒DNA）＝轉(zhuǎn)化子總數(shù)／質(zhì)粒DNA加入量(mg)

感受態(tài)細(xì)胞總數(shù)＝對(duì)照組２菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×菌液總體積／涂板菌液體積

感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率＝轉(zhuǎn)化子總數(shù)／感受態(tài)細(xì)胞總數(shù)

[注意] 本實(shí)驗(yàn)方法也適用于其它E.coli受體菌株的不同的質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化。但它們的轉(zhuǎn)化效率并不一定一樣。有的轉(zhuǎn)化效率高，需將轉(zhuǎn)化液進(jìn)行多梯度稀釋涂板才能得到單菌落平板,而有的轉(zhuǎn)化效率低,涂板時(shí)必須將菌液濃縮(如離心),才能較準(zhǔn)確的計(jì)算轉(zhuǎn)化率。

思考題

1.制備感受態(tài)細(xì)胞的原理是什么？

2.如果實(shí)驗(yàn)中對(duì)照組本不該長出菌落的平板上長出了一些菌落，你將如何解釋這種現(xiàn)象？

第四章 RNA的提取和cDNA合成 未知

第四章 RNA的提取和cDNA合成 第一節(jié) 概 述

從真核生物的組織或細(xì)胞中提取mRNA,通過酶促反應(yīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第一鏈和第二鏈,將雙鏈cDNA和載體連接,然后轉(zhuǎn)化擴(kuò)增, 即可獲得cDNA文庫,構(gòu)建的cDNA文庫可用于真核生物基因的結(jié)構(gòu)、表達(dá)和調(diào)控的分析;比較cDNA和相應(yīng)基因組DNA序列差異可確定內(nèi)含子存在和了解轉(zhuǎn)錄后加工等一系列問題。總之cDNA的合成和克隆已成為當(dāng)今真核分子生物學(xué)的基本手段。自70年代中葉首例cDNA克隆問世以來,已發(fā)展了許多種提高cDNA合成效率的方法,并大大改進(jìn)了載體系統(tǒng)，目前cDNA合成試劑已商品化。cDNA合成及克隆的基本步驟包括用反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA第一鏈,聚合酶合成cDNA第二鏈,加入合成接頭以及將雙鏈DNA克隆到于適當(dāng)載體(噬菌體或質(zhì)粒)。

一、RNA制備

模板mRNA的質(zhì)量直接影響到cDNA合成的效率。由于mRNA分子的結(jié)構(gòu)特點(diǎn),容易受RNA酶的攻擊反應(yīng)而降解,加上RNA酶極為穩(wěn)定且廣泛存在,因而在提取過程中要嚴(yán)格防止RNA酶的污染,并設(shè)法抑制其活性,這是本實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。所有的組織中均存在RNA酶,人的皮膚、手指、試劑、容器等均可能被污染，因此全部實(shí)驗(yàn)過程中均需戴手套操作并經(jīng)常更換（使用一次性手套）。所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中200℃烘烤2小時(shí)以上。凡是不能用高溫烘烤的材料如塑料容器等皆可用0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液處理,再用蒸餾水沖凈。DEPC是RNA酶的化學(xué)修飾劑,它和RNA酶的活性基團(tuán)組氨酸的咪唑環(huán)反應(yīng)而抑制酶活性。DEPC與氨水溶液混合會(huì)產(chǎn)生致癌物,因而使用時(shí)需小心。試驗(yàn)所用試劑也可用DEPC處理,加入DEPC至0.1%濃度,然后劇烈振蕩10分鐘,再煮沸15分鐘或高壓滅菌以消除殘存的DEPC,否則DEPC也能和腺嘌呤作用而破壞mRNA活性。但DEPC能與胺和巰基反應(yīng),因而含Tris和DTT的試劑不能用DEPC處理。Tris溶液可用DEPC處理的水配制然后高壓滅菌。配制的溶液如不能高壓滅菌,可用DEPC處理水配制,并盡可能用未曾開封的試劑。除DEPC外,也可用異硫氰酸胍、釩氧核苷酸復(fù)合物、RNA酶抑制蛋白等。此外,為了避免mRNA或cDNA吸附在玻璃或塑料器皿管壁上,所有器皿一律需經(jīng)硅烷化處理。

細(xì)胞內(nèi)總RNA制備方法很多,如異硫氰酸胍熱苯酚法等。許多公司有現(xiàn)成的總RNA提取試劑盒,可快速有效地提取到高質(zhì)量的總RNA。分離的總RNA可利用mRNA 3'末端含有多聚(A)+ 的特點(diǎn),當(dāng)RNA流經(jīng)oligo(dT)纖維素柱時(shí),在高鹽緩沖液作用下,mRNA被特異的吸附在oligo(dT)纖維素上,然后逐漸降低鹽濃度洗脫,在低鹽溶液或蒸餾水中,mRNA被洗下。經(jīng)過兩次oligo(dT)纖維素柱,可得到較純的mRNA。純化的mRNA在70%乙醇中-70℃可保存一年以上。

二、cDNA第一鏈的合成

所有合成cDNA第一鏈的方法都要用依賴于RNA的DNA聚合酶(反轉(zhuǎn)錄酶)來催化反應(yīng)。目前商品化反轉(zhuǎn)錄酶有從禽類成髓細(xì)胞瘤病毒純化到的禽類成髓細(xì)胞病毒(AMV)逆轉(zhuǎn)錄酶和從表達(dá)克隆化的Moloney鼠白血病病毒反轉(zhuǎn)錄酶基因的大腸桿菌中分離到的鼠白血病病毒(MLV)反轉(zhuǎn)錄酶。AMV反轉(zhuǎn)錄酶包括兩個(gè)具有若干種酶活性的多肽亞基,這些活性包括依賴于RNA的DNA合成,依賴于DNA的 DNA合成以及對(duì)DNA:RNA雜交體的RNA部分進(jìn)行內(nèi)切降解(RNA酶H活性)。MLV反轉(zhuǎn)錄酶只有單個(gè)多肽亞基,兼?zhèn)湟蕾囉赗NA和依賴于DNA的DNA合成活性,但降解RNA:DNA雜交體中的RNA的能力較弱,且對(duì)熱的穩(wěn)定性較AMV反轉(zhuǎn)錄酶差。MLV反轉(zhuǎn)錄酶能合成較長的cDNA(如大于2-3kb)。AMV反轉(zhuǎn)錄酶和MLV反轉(zhuǎn)錄酶利用RNA模板合成cDNA時(shí)的最適pH值,最適鹽濃度和最適溫室各不相同,所以合成第一鏈時(shí)相應(yīng)調(diào)整條件是非常重要。

AMV反轉(zhuǎn)錄酶和MLV反轉(zhuǎn)錄酶都必須有引物來起始DNA的合成。cDNA合成最常用的引物是與真核細(xì)胞mRNA分子3'端poly(A)結(jié)合的12-18核苷酸長的oligo(dT)。

三、cDNA第二鏈的合成

cDNA第二鏈的合成方法有以下幾種:

(1)自身引導(dǎo)法 合成的單鏈cDNA 3'端能夠形成一短的發(fā)夾結(jié)構(gòu),這就為第二鏈的合成提供了現(xiàn)成的引物,當(dāng)?shù)谝绘満铣煞磻?yīng)產(chǎn)物的DNA:RNA雜交鏈變性后利用大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ Klenow片段或反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA第二鏈,最后用對(duì)單鏈特異性的S1核酸酶消化該環(huán),即可進(jìn)一步克隆。但自身引導(dǎo)合成法較難控制反應(yīng)，而且用S1核酸酶切割發(fā)夾結(jié)構(gòu)時(shí)無一例外地將導(dǎo)致對(duì)應(yīng)于mRNA 5'端序列出現(xiàn)缺失和重排,因而該方法目前很少使用。

(2)置換合成法 該方法利用第一鏈在反轉(zhuǎn)錄酶作用下產(chǎn)生的cDNA:mRNA雜交鏈不用堿變性,而是在dNTP存在下,利用RNA酶H在雜交鏈的mRNA鏈上造成切口和缺口。從而產(chǎn)生一系列RNA引物,使之成為合成第二鏈的引物,在大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的作用下合成第二鏈。該反應(yīng)有3個(gè)主要優(yōu)點(diǎn):(1)非常有效;(2)直接利用第一鏈反應(yīng)產(chǎn)物,無須進(jìn)一步處理和純化;(3)不必使用S1核酸酶來切割雙鏈cDNA中的單鏈發(fā)夾環(huán)。目前合成cDNA常采用該方法。

四、cDNA的分子克隆

已經(jīng)制備好的雙鏈cDNA和一般DNA一樣,可以插入到質(zhì)?；蚴删w中,為此,首先必需連接上接頭(Linker),接頭可以是限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)片段,也可以利用末端轉(zhuǎn)移酶在載體和雙鏈cDNA的末端接上一段寡聚dG和dC或dT和dA尾巴,退火后形成重組質(zhì)粒,并轉(zhuǎn)化到宿主菌中進(jìn)行擴(kuò)增。合成的cDNA也可以經(jīng)PCR擴(kuò)增后再克隆入適當(dāng)載體。第二節(jié) 動(dòng)植物組織mRNA提取

一、材料

水稻葉片或小鼠肝組織。

二、設(shè)備

研缽，冷凍臺(tái)式高速離心機(jī)，低溫冰箱，冷凍真空干燥器，紫外檢測(cè)儀，電泳儀，電泳槽。

三、試劑

1、無RNA酶滅菌水：用將高溫烘烤的玻璃瓶（180℃ 2小時(shí)）裝蒸餾水，然后加入0.01%的DEPC（體積/體積），處理過夜后高壓滅菌。2、75%乙醇：用DEPC處理水配制75%乙醇，（用高溫滅菌器皿配制），然后裝入高溫烘烤的玻璃瓶中，存放于低溫冰箱。3、1×層析柱加樣緩沖液；20mmol/L Tris·Cl(pH7.6)，0.5mol/L NaCl，1mmol/L EDTA(pH8.0)，0.1% SDS。

4、洗脫緩沖液：10mmol/L Tris·Cl(pH7.6)，1mmol/L EDTA(pH8.0)，0.05% SDS。

四、操作步驟

（一）動(dòng)植物總RNA提取-Trizol法

Trizol法適用于人類、動(dòng)物、植物、微生物的組織或培養(yǎng)細(xì)菌，樣品量從幾十毫克至幾克。用Trizol法提取的總RNA絕無蛋白和DNA污染。RNA可直接用于Northern斑點(diǎn)分析，斑點(diǎn)雜交，Poly(A)+分離，體外翻譯，RNase封阻分析和分子克隆。

1、將組織在液N中磨成粉末后，再以50-100mg組織加入1ml Trizol液研磨，注意樣品總體積不能超過所用Trizol體積的10%。

2、研磨液室溫放置5分鐘，然后以每1mlTrizol液加入0.2ml的比例加入氯仿，蓋緊離心管，用手劇烈搖蕩離心管15秒。

3、取上層水相于一新的離心管，按每mlTrizol液加0.5ml異丙醇的比例加入異丙醇，室溫放置10分鐘，12000g離心10分鐘。

4、棄去上清液，按每ml Trizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇，渦旋混勻，4℃下7500g離心5分鐘。

5、小心棄去上清液，然后室溫或真空干燥5-10分鐘，注意不要干燥過分，否則會(huì)降低RNA的溶解度。然后將RNA溶于水中，必要時(shí)可55℃-60℃水溶 10分鐘。RNA可進(jìn)行mRNA分離，或貯存于70%乙醇并保存于-70℃。[注意]

1、整個(gè)操作要帶口罩及一次性手套，并盡可能在低溫下操作。

2、加氯仿前的勻漿液可在-70℃保存一個(gè)月以上，RNA沉淀在70%乙醇中可在4℃保存一周，-20℃保存一年。

（二）mRNA提取

由于mRNA末端含有多poly(A)+，當(dāng)總RNA流徑oligo(dT)纖維素時(shí)，在高鹽緩沖液作用下，mRNA被特異的吸附在oligo(dT)纖維素柱上，在低鹽濃度或蒸餾水中，mRNA可被洗下，經(jīng)過兩次oligo(dT)纖維素柱，可得到較純的mRNA。

1、用0.1mol/L NaOH懸浮0.5-1.0g oligo(dT)纖維素。

2、將懸浮液裝入滅菌的一次性層析柱中或裝入填有經(jīng)DEPC處理并經(jīng)高壓滅菌的玻璃棉的巴斯德吸管中，柱床體積為0.5-1.0ml，用3倍柱床體積的滅菌水沖洗柱床。

3、用1x柱層析加樣緩沖液沖洗柱床，直到流出液的pH值小于8.0。

4、將

（一）中提取的RNA液于65℃溫育5分鐘后迅速冷卻至室溫，加入等體積2x柱層析緩沖液，上樣，立即用滅菌試管收集洗出液，當(dāng)所有RNA溶液進(jìn)入柱床后，加入1倍柱床體積的1x層析柱加樣溶液。

5、測(cè)定每一管的OD260，當(dāng)洗出液中OD為0時(shí)，加入2-3倍柱床體積的滅菌洗脫緩沖液，以1/3至1/2柱床體積分管收集洗脫液。

6、測(cè)定OD260，合并含有RNA的洗脫組分。

7、加入1/10體積的3M NaAc(pH5.2)，2.5倍體積的冰冷乙醇，混勻，-20℃30分鐘。8、4℃下12000g離心15分鐘，小心棄去上清液，用70%乙醇洗 滌沉淀，4℃下12000g離心5分鐘。

9、小心棄去上清液，沉淀空氣干燥10分鐘，或真空干燥10分鐘。

10、用少量水溶解RNA液，即可用于cDNA合成（或保存在70%乙醇中并貯存于-70℃）。[注意]

1、mRNA在70%乙醇中-70℃可保存一年以上。

2、oligo(dT)纖維素柱用后可用0.3mol/l NaOH洗凈，然后用層析柱加樣緩沖液平衡，并加入0.02%疊氮鈉（NaN3)冰箱保存，重復(fù)使用。每次用前需用NaOH水層析柱加樣緩沖液依次淋洗柱床。第三節(jié) 植物病毒RNA提取

大多植物病毒RNA為單鏈RNA，并且其極性與mRNA極性相同，植物病毒RNA提取較為簡(jiǎn)單，一般使用酚氯仿即可獲得滿意結(jié)果。

一、材料

提純TMV病毒液（10mg/ml）。

二、設(shè)備

冷凍臺(tái)式離心機(jī)，低溫真空干燥儀，電泳儀，電泳槽。

三、試劑

TE-飽和酚:氯仿（1:1），氯仿，3M NaAc(pH5.2)，乙醇(100%和70%)，TE緩沖液，無RNA酶的雙菌水。

四、操作步驟

1、取一eppendorf管加入提純TMV（10mg/ml)400ml，再加入等體積酚/氯仿，蓋緊管蓋后用手充分振蕩1分鐘，4℃下12000g離心10分鐘。

2、吸取水相于一新eppendorf管，再用酚/氯仿抽提，直至水相和有機(jī)相交界面無蛋白為止。

3、吸取水相于新eppendorf心管，加入等體積氯仿，用手倒置離心管數(shù)十秒，4℃下12000g離心10分鐘。

4、取水相，加入1/10倍體積的3mol/L NaAc(pH5.2)，2.5倍體積的冰冷乙醇，混勻，-20℃30分鐘。5、4℃下12000g離心15分鐘，小心棄去上清液，用70%乙醇洗滌沉淀，4℃下12000g離心5分鐘。

6、小心棄去上清液，沉淀真空干燥5分鐘或空氣干燥10分鐘，并溶于無RNA酶的雙菌水或TE緩沖液中。

7、取10ml進(jìn)行電泳分析，另10ml用于cDNA合成。[注意]

1、整個(gè)操作應(yīng)盡可能在低溫下進(jìn)行。

2、由于病毒RNA鑲嵌于外殼蛋白里面，因此要充分剝?nèi)ゲ《就鈿さ鞍?，一般需要多次進(jìn)行酚/氯仿的抽提。第四節(jié) cDNA合成技術(shù)

一、Riboclone M-MLV(H-)cDNA合成技術(shù)

Promega公司的RibocloneR M-MLV(H-)cDNA合成系統(tǒng)采用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶的RNase H缺失突變株取代AMV反轉(zhuǎn)錄酶,使合成的cDNA更長。該系統(tǒng)的第一鏈合成使用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶,cDNA第二鏈合成采用置換合成法,采用RNaseH和DNA聚合酶Ⅰ進(jìn)行置換合成,最后用T4 DNA聚合酶切去單鏈末端,方法簡(jiǎn)便易行。該系統(tǒng)試劑包括：

20μg 特異性引物

200μl M-MLV第一鏈緩沖液(5×)，配方如下: 250mmol/L Tris·Cl pH8.3(37℃時(shí));375mmol/l KCl;

15mmol/L MgCl2;50mmol/L DTT;10mmol/L dATP, dCTP, dGTP, dTTP混合物(各2.5mmol/L)

2×625μ rRNasinR RNA酶抑制劑

10,000μ M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶, RNase H-

5μg 對(duì)照RNA

400μl M-MLV第二鏈緩沖液(10×)，配方如下：

400mmol/L Tris·Cl ,pH7.2;850mmol/L KCl;44mmol/L MgCl2;

30mmol/L DTT;0.5mg/ml BSA。

500μ RNase H

500μ DNA聚合酶Ⅰ

100μ T4 DNA聚合酶Ⅰ

2×1.25ml 不含核酸酶的水

以上所有試劑除對(duì)照RNA需在-70℃保存外,其余均可保存于-20℃,可以合成40μg mRNA。

（一）第一鏈合成 1.試劑

[α-32 P] dCTP(>400Ci/mmol)，EDTA(50mM和200mM)，TE-飽和酚:氯仿（1:1），7.5M NH4Ac，乙醇(100%和70%)，TE緩沖液。

2.操作步驟

(1)取一滅菌的無RNA酶的eppendorf管,加入RNA模板和適當(dāng)引物,每μg RNA使用0.5μg引物(如使用NotⅠ引物接頭,使用0.3μg),用H2 O調(diào)整體積至15μl, 70℃處理5分鐘,冷卻至室溫,離心使溶液集中在管底,再依次加入

5×第一鏈緩沖液 5μl

rRNasin RNA酶抑制劑 25U

M-MLV(H-)反轉(zhuǎn)錄酶 200U

H2 O 調(diào)至總體積25μl

(2)用手指輕彈管壁,吸取5μl至另一eppendorf管，加入2-5μCi [α-32 P] dCTP(>400Ci/mmol),用以第一鏈同位素?fù)饺敕派湫曰钚詼y(cè)定。

(3)37℃(隨機(jī)引物)或42℃(其它引物)溫浴1小時(shí)

(4)取出置于冰上

(5)摻入測(cè)定的eppendorf管加入95μl 50mM EDTA終止反應(yīng),并使總體積為100μl?？扇?0μl進(jìn)行電泳分析(先用苯酚抽提),另10μl進(jìn)行同位素?fù)饺敕派湫曰钚詼y(cè)定。

(6)第一鏈合成eppendorf管可直接用于第二鏈合成

注：以上25μl反應(yīng)總體積中所用RNA量為1μg,如合成5μg RNA,則可按比例擴(kuò)大反應(yīng)體積, 倒5μg RNA使用125μl總體積進(jìn)行合成。

（二）第二鏈合成

1、取第一鏈反應(yīng)液 20μl, 再依次加入

10×第二鏈緩沖液 20μl

DNA聚合酶Ⅰ 23μ

RNase H 0.8μ

H2O 加至終體積為100μl

2、輕輕混勻,如需進(jìn)行第二鏈同位素?fù)饺敕派湫曰钚詼y(cè)定,可取出10μl至另一eppendorf管,加入2-5μCi[α-32 P] dCTP。3、14℃溫浴2小時(shí)(如需合成長于3kb的cDNA, 則需延長至3-4小時(shí))。

4、摻入測(cè)定eppendorf管中加入90μl 50mM EDTA, 取10μl進(jìn)行同位素?fù)饺敕派湫詼y(cè)定,余下的可進(jìn)行電泳分析。

5、cDNA第二鏈合成離心管反應(yīng)液70℃處理10分鐘, 低速離心后置冰上。

6、加入2μ T4 DNA聚合酶, 37℃溫浴10分鐘。

7、加入10μl 200mmol/L EDTA終止反應(yīng)。

8、用等體積酚:氯仿抽提cDNA反應(yīng)液,離心2分鐘。

9、水相移至另一eppendorf管,加入0.5倍體積的7.5M醋酸銨(或0.1倍體積的1.5M醋酸鈉,pH5.2), 混勻后再加入2.5倍體積的冰冷乙醇(-20℃),-20℃放置30分鐘后離心5分鐘。

10、小心丟去上清液,加入0.5ml冰冷的70%乙醇,離心2分鐘。

11、小心移去上清液,干燥沉淀。

12、沉淀溶于10-20μl TE緩沖液。

（三）同位素?fù)饺敕派湫曰钚詼y(cè)定、計(jì)算和電泳分析

1.試劑

1mg/ml鮭魚精DNA，三氯乙酸(TCA, 5%和7%)，堿性瓊脂糖膠，堿性膠電泳緩沖液，（30mM NaOH，1mM EDTA），2×樣品緩沖液，（20mM NaOH，20% 甘油，0.025%溴酚藍(lán)）。

2.操作步驟

(1)各取一2(5)中和二(4)反應(yīng)液各3μl,點(diǎn)于玻璃纖維濾紙,室溫干燥, 這些樣品代表總放射性活性。

(2)同樣各取3μl中反應(yīng)液至含有100μl(1mg/ml)鮭魚精DNA中,混勻,加入0.5ml 5% TCA, 渦旋混合儀混合后置冰上5-30分鐘。

(3)用玻璃纖維濾紙過濾,用冰冷的5% TCA洗三次,每次用5ml TCA,再用5ml丙酮或乙醇漂洗, 這些樣品代表摻入放射性活性。

(4)分別測(cè)定總放射性活性強(qiáng)度和摻入放射性活性強(qiáng)度,可用蓋革計(jì)算器,也可用液閃計(jì)數(shù)。

3.第一鏈產(chǎn)量測(cè)定

第一鏈摻入率(%)= 摻入cpm/總cpm ×100%

摻入dNTP(nmol)=2nmol dNTP/μl ×反應(yīng)體積(μl)×(第一鏈摻入率)

設(shè)330為每mol dNTP的平均分子量

合成cDNA量(ng)=摻入dNTP(nmol)×330ng/nmol

mRNA向cDNA轉(zhuǎn)變率=合成cDNA量(ng)/ 模板RNA量(ng)×100%

例如總放射性活性強(qiáng)度為254,000cpm, 摻入放射性活性強(qiáng)度為3040cpm, 所用RNA摸板量為1μg,反應(yīng)體積為25μl, 則:

摻入率＝3040/254000×100%=1.2

摻入dNTP量=2nmol dNTP/μl×25×1.2%=0.6nmol

合成cDNA量=0.6nmol dNTP×330ng/nmol=198ng

mRNA向cDNA轉(zhuǎn)變率=198nm/1000ng×100%=19.8%

由于1000ng RNA中20%(5μl/25μl)用于摻入測(cè)定,而反應(yīng)體積占總體積80%,因而實(shí)際第一鏈cDNA合成量為0.8×198ng=158ng。

4.第二鏈產(chǎn)量計(jì)算

除需去除第一鏈摻入dNTP外,方法同第一鏈產(chǎn)量計(jì)算

第二鏈摻入率= 摻入放射性活性/ 總放射性活性??

摻入dNTP量(nnol)=[0.4nmol dNTP/μl×反應(yīng)體積(μl)－第一鏈摻入nmol]×第二鏈摻入率

第二鏈cDNA合成量(ng)=nmol dNTP×330ng/nmol

雙鏈cDNA轉(zhuǎn)變率=雙鏈cDNA合成量(ng)/ 單鏈cDNA合成量(ng)

例: 第二鏈摻入放射性活性強(qiáng)度為2780cmp, 總放射性活性強(qiáng)度為235000cpm.第二鏈摻入率=2780/235000×100%=1.18%

第二鏈合成dNTP量=[(0.4nmol/μl×100μl)－0.48nm]×1.18% =0.47nmol

合成第二鏈cDNA量(ng)=0.47nmol×330ng/nmol =155ng

雙鏈cDNA轉(zhuǎn)變率=155ng /158ng×100%=98%

一般cDNA第一鏈轉(zhuǎn)變率和雙鏈轉(zhuǎn)變率以12-50%和50-200%為好。

（四）電泳分析

通常合成的cDNA第一鏈和第二鏈長度為350-6000堿基,需進(jìn)行1.4%堿性瓊脂糖電泳。將第一鏈和第二鏈摻入測(cè)定管中的反應(yīng)液先用酚抽提,乙醇沉淀，方法見本章

（二）第二鏈合成中的9-12步，一般第一鏈和第二鏈上樣量相同。

1.標(biāo)準(zhǔn)分子量DNA參照物的同位素標(biāo)記

(1)通常使用λDNA/HindⅢ片段,用Klenow DNA聚合酶進(jìn)行32 P標(biāo)記

10×HindⅢ緩沖液 2.5μl

dATP 0.2mmol/L

dGTP 0.2mmol/L

[α-32 P]dCTP(400Ci/mmol)2μCi

λDNA/HindⅢ標(biāo)準(zhǔn)DNA 1μg

Klenow DNA聚合酶 1μ

加H2O 到總體積25μl

(2)室溫放置10分鐘, 加2.5μl 200mM EDTA終止反應(yīng), 加入2×樣品緩沖液,貯存于-20℃。

2.電泳分析

(1)用50mM NaCl, 1mM EDTA制備1.4%的堿性瓊脂糖電泳, 并置堿性電泳緩沖液中30分鐘。

(2)取樣品液, 用TE調(diào)整體積, 使第一鏈和第二鏈產(chǎn)率測(cè)定液的體積相同,加入等體積的2×樣品緩沖液(20mmol/L NaOH, 20%甘油，0.025%溴粉蘭）。

(3)加樣,電泳到染料距前沿線只剩膠長度的1/3處，電泳緩沖液為30mmol/L NaOH, 1mmol/L EDTA。

(4)將膠浸入7% TCA中,室溫放置30分鐘(直至染料由藍(lán)色變至黃色),取出置濾紙上,干燥數(shù)小時(shí)。

(5)用保鮮膜包裹干燥的膠,室溫壓X光片(用增感屏?xí)r-70℃壓片)。

二、其它c(diǎn)DNA合成技術(shù)

除Riboclone M-MLV(H-)cDNA合成技術(shù)外，Promega公司還提供有多個(gè)AMV合成試劑盒，不同試劑盒所提供的引物或引物一延接頭(Primpr-Adaptor)不同，有oligo(dT)15 引物、隨機(jī)引物、XbaⅠ引物-延接頭、NotⅠ引物-延接頭等，其余試劑一樣，這些系統(tǒng)包括：

20mg 引物

20ml 5×第一鏈緩沖液, 配方如下：

250mmol/L Tris·Cl,pH8.3(42℃);250mmol/L KCl;50mmol/L

MgCl2;2.5mmol/L 亞精胺(Spermidine);50mmol/L DTT;

20mmol/L dATP, dCTP,dGTP,dTTP(各5mmol/L)。

50ml 40mM焦碳酸鈉

625m rRNasin RNA酶抑制劑

600m AMV反轉(zhuǎn)錄酶

5mg 1.2kb對(duì)照RNA

200ml 10×第二鏈緩沖液，配方如下：

400mmol/L Tris·Cl,pH7.2;900mmol/L KCl;30mmol/L

MgCl2;30mmol/L DTT;0.5mg/ml BSA。

2m E.Coli RNaseH

500m E.ColiDNA PolymeraseⅠ

100m T4 DNA PolymeraseⅠ

1.5ml 不含核酸酶的水

以上所有試劑除對(duì)照RNA需在-70℃保存外，其余均可保存于-20℃，可以合成40mgmRNA。

（一）第一鏈合成

下面介紹的是25ml體積反應(yīng)系統(tǒng)，該系統(tǒng)可合成多至2mgmRNA，每增加1mg mRNA，需增加反應(yīng)體積10ml，如5mg mRNA需55ml反應(yīng)體積。

引物或引物-延接頭和反轉(zhuǎn)錄酶與mRNA的比例應(yīng)分別保持為0.5mg/mg（對(duì)NotⅠ引物-延接頭為0.3mg/mg）和15m/mg.1、試劑：

[a-32P]dCTP（>400ci/mmol)，EDTA(50mM和200mM)，TE飽和酶/氯仿，7.5mM NH4Ac，100%和70%乙醇，TE緩沖液(10mM Tris·Cl,pH8.0,1mm EDTA)。

2、操作步驟：

（1）取一滅菌的無RNA酶的eppendorf管加入的RNA樣品，及引物或引物-延接頭，用H2O調(diào)節(jié)0.5mg引物/mg mRNA（或0.3mg NotⅠ引物-延接頭/mg mRNA）的體積至15ml，70℃加熱5分鐘，待冷至室溫，離心數(shù)秒鐘使溶液集中在管底，然后依次加入：

5×第一鏈緩沖液 5ml

rRNasinR RNA酶抑制劑 25ml

40mM焦碳酸鈉2.5ml

AMV反轉(zhuǎn)錄酶 15m/mg RNA

加無水RNA酶水至總體積25ml

在加入焦碳酸鈉和AMV反轉(zhuǎn)錄酶前，需將反應(yīng)液42℃溫浴5分鐘，以阻止焦碳酸鈉沉淀。焦碳酸鈉主要用于抑止第一鏈形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。

（2）輕彈eppendorf管，取出5ml至另一加于2-5m[a-32P]dCTP c>400ci/mmol）（其體積不能超過1ml），用以第一鏈同位素?fù)饺敕派湫曰钚詼y(cè)定。

（3）42℃溫浴1小時(shí)。

（4）取出置冰上。

（5）摻入測(cè)定的eppendorf管加入50mM EDTA，終止反應(yīng)，并使總體積為100ml?？扇?0ml進(jìn)行電泳分析，另10ml進(jìn)行同位素?fù)饺霚y(cè)定。

（6）第一鏈合成離心管可直接用于第二鏈合成。

（二）第二鏈合成

第二鏈合成可在第一鏈合成反應(yīng)液中直接進(jìn)行。

1、第一鏈反應(yīng)液（20ml）中依次加入

10X 第二鏈緩沖液 10ml

E.Coli DNA polymeraseⅠ 23m

E.Coli RNaseH 0.8m

加無核酸酶水至總體積 100ml

余下步驟同本章第四節(jié)一

（二）2-12步及

（三）和

（四）。

思考題:

1.為什么mRNA提取是cDNA合成成敗的關(guān)鍵？

2.試比較自導(dǎo)引導(dǎo)法和置換合成法合成cDNA的優(yōu)缺點(diǎn)。第五章 重組質(zhì)粒的連接、轉(zhuǎn)化及篩選 未知

第五章 重組質(zhì)粒的連接、轉(zhuǎn)化及篩選

第一節(jié) 概 述

質(zhì)粒具有穩(wěn)定可靠和操作簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)。如果要克隆較小的DNA片段(＜10kb)且結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單,質(zhì)粒要比其它任何載體都要好。在質(zhì)粒載體上進(jìn)行克隆,從原理上說是很簡(jiǎn)單的，先用限制性內(nèi)切酶切割質(zhì)粒DNA和目的DNA片段, 然后體外使兩者相連接, 再用所得到重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)菌,即可完成。但在實(shí)際工作中, 如何區(qū)分插入有外源DNA的重組質(zhì)粒和無插入而自身環(huán)化的載體分子是較為困難的。通過調(diào)整連接反應(yīng)中外源DNA片段和載體DNA的濃度比例,可以將載體的自身環(huán)化限制在一定程度之下,也可以進(jìn)一步采取一些特殊的克隆策略,如載體去磷酸化等來最大限度的降低載體的自身環(huán)化,還可以利用遺傳學(xué)手段如α互補(bǔ)現(xiàn)象等來鑒別重組子和非重組子。

外源DNA片段和質(zhì)粒載體的連接反應(yīng)策略有以下幾種：

1、帶有非互補(bǔ)突出端的片段 用兩種不同的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行消化可以產(chǎn)生帶有非互補(bǔ)的粘性末端,這也是最容易克隆的DNA片段，一般情況下,常用質(zhì)粒載體均帶有多個(gè)不同限制酶的識(shí)別序列組成的多克隆位點(diǎn)，因而幾乎總能找到與外源DNA片段末端匹配的限制酶切位點(diǎn)的載體，從而將外源片段定向地克隆到載體上。也可在PCR擴(kuò)增時(shí)，在DNA片段兩端人為加上不同酶切位點(diǎn)以便與載體相連。

2、帶有相同的粘性末端 用相同的酶或同尾酶處理可得到這樣的末端。由于質(zhì)粒載體也必須用同一種酶消化，亦得到同樣的兩個(gè)相同粘性末端，因此在連接反應(yīng)中外源片段和質(zhì)粒載體DNA均可能發(fā)生自身環(huán)化或幾個(gè)分子串連形成寡聚物, 而且正反兩種連接方向都可能有。所以，必須仔細(xì)調(diào)整連接反應(yīng)中兩種DNA的濃度, 以便使正確的連接產(chǎn)物的數(shù)量達(dá)到最高水平。還可將載體DNA的5'磷酸基團(tuán)用堿性磷酸酯酶去掉, 最大限度地抑制質(zhì)粒DNA的自身環(huán)化。帶5'端磷酸的外源DNA片段可以有效地與去磷酸化的載體相連, 產(chǎn)生一個(gè)帶有兩個(gè)缺口的開環(huán)分子,在轉(zhuǎn)入E.coli受體菌后的擴(kuò)增過程中缺口可自動(dòng)修復(fù)。

3、帶有平末端 是由產(chǎn)生平末端的限制酶或核酸外切酶消化產(chǎn)生，或由DNA聚合酶補(bǔ)平所致。由于平端的連接效率比粘性末端要低得多，故在其連接反應(yīng)中，T4 DNA連接酶的濃度和外源DNA及載體DNA濃度均要高得多。通常還需加入低濃度的聚乙二醇(PEG 8000)以促進(jìn)DNA分子凝聚成聚集體的物質(zhì)以提高轉(zhuǎn)化效率。

特殊情況下，外源DNA分子的末端與所用的載體末端無法相互匹配,則可以在線狀質(zhì)粒載體末端或外源DNA片段末端接上合適的接頭(linker)或銜接頭(adapter)使其匹配, 也可以有控制的使用E.coli DNA聚合酶Ⅰ的klenow大片段部分填平3'凹端,使不相匹配的末端轉(zhuǎn)變?yōu)榛パa(bǔ)末端或轉(zhuǎn)為平末端后再進(jìn)行連接。

本實(shí)驗(yàn)所使用的載體質(zhì)粒DNA為pBS,轉(zhuǎn)化受體菌為E.coli DH5α菌株。由于pBS上帶有Ampr 和lacZ基因,故重組子的篩選采用Amp抗性篩選與α-互補(bǔ)現(xiàn)象篩選相結(jié)合的方法。

因pBS帶有Ampr 基因而外源片段上不帶該基因,故轉(zhuǎn)化受體菌后只有帶有pBS DNA的轉(zhuǎn)化子才能在含有Amp的LB平板上存活下來;而只帶有自身環(huán)化的外源片段的轉(zhuǎn)化子則不能存活。此為初步的抗性篩選。

pBS上帶有β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的調(diào)控序列和β-半乳糖苷酶N端146個(gè)氨基酸的編碼序列。這個(gè)編碼區(qū)中插入了一個(gè)多克隆位點(diǎn),但并沒有破壞lacZ的閱讀框架,不影響其正常功能。E.coli DH5α菌株帶有β-半乳糖苷酶C端部分序列的編碼信息。在各自獨(dú)立的情況下,pBS和DH5α編碼的β-半乳糖苷酶的片段都沒有酶活性。但在pBS和DH5α融為一體時(shí)可形成具有酶活性的蛋白質(zhì)。這種lacZ基因上缺失近操縱基因區(qū)段的突變體與帶有完整的近操縱基因區(qū)段的β-半乳糖苷酸陰性突變體之間實(shí)現(xiàn)互補(bǔ)的現(xiàn)象叫α-互補(bǔ)。由α-互補(bǔ)產(chǎn)生的Lac+ 細(xì)菌較易識(shí)別，它在生色底物X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)下存在下被IPTG(異丙基硫代-β-D-半乳糖苷)誘導(dǎo)形成藍(lán)色菌落。當(dāng)外源片段插入到pBS質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)上后會(huì)導(dǎo)致讀碼框架改變, 表達(dá)蛋白失活, 產(chǎn)生的氨基酸片段失去α-互補(bǔ)能力, 因此在同樣條件下含重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子在生色誘導(dǎo)培養(yǎng)基上只能形成白色菌落。在麥康凱培養(yǎng)基上，α-互補(bǔ)產(chǎn)生的Lac+細(xì)菌由于含β-半乳糖苷酶，能分解麥康凱培養(yǎng)基中的乳糖，產(chǎn)生乳酸，使pH下降，因而產(chǎn)生紅色菌落，而當(dāng)外源片段插入后，失去α-互補(bǔ)能力，因而不產(chǎn)生β-半乳糖苷酶，無法分解培養(yǎng)基中的乳糖，菌落呈白色。由此可將重組質(zhì)粒與自身環(huán)化的載體DNA分開。此為α-互補(bǔ)現(xiàn)象篩選。第二節(jié) 材料、設(shè)備及試劑

一、材料

外源DNA片段: 自行制備的帶限制性末端的DNA溶液,濃度已知;載體DNA: pBS質(zhì)粒(Ampr ,lacZ),自行提取純化,濃度已知;宿主菌: E.coli DH5α,或JM系列等具有α-互補(bǔ)能力的菌株。

二、設(shè)備

恒溫?fù)u床，臺(tái)式高速離心機(jī)，恒溫水浴鍋，瓊脂糖凝膠電泳裝置，電熱恒溫培養(yǎng)箱，電泳儀無菌，工作臺(tái)，微量移液槍，eppendorf管。

三、試劑

1、連接反應(yīng)緩沖液(10×)：0.5mol/L Tris·Cl(pH7.6)，100mol/L MgCl2，100mol/L 二硫蘇糖醇(DTT)(過濾滅菌），500μg/ml 牛血清清蛋白(組分V.Sigma 產(chǎn)品）（可用可不用），10mol/L ATP（過濾滅菌）。

2、T4 DNA連接酶(T4 DNA ligase)；購買成品。

3、X-gal儲(chǔ)液(20mg/ml): 用二甲基甲酰胺溶解X-gal配制成20mg/ml的儲(chǔ)液, 包以鋁箔或黑紙以防止受光照被破壞, 儲(chǔ)存于-20℃。

4、IPTG儲(chǔ)液(200mg/ml): 在800μl蒸餾水中溶解200mg IPTG后,用蒸餾水定容至1ml,用0.22μm濾膜過濾除菌，分裝于eppendorf管并儲(chǔ)于-20℃。

5、麥康凱選擇性培養(yǎng)基(Maconkey Agar)：取52g麥康凱瓊脂加蒸餾水1000ml，微火煮沸至完全浴解，高壓滅菌，待冷至60℃左右加入Amp儲(chǔ)存液使終濃度為50mg/ml，然后搖勻后涂板。

6、含X-gal和IPTG的篩選培養(yǎng)基：在事先制備好的含50μg/ml Amp的LB平板表面加40ml X-gal儲(chǔ)液和4μlIPTG儲(chǔ)液,用無菌玻棒將溶液涂勻,置于37℃下放置3-4小時(shí),使培養(yǎng)基表面的液體完全被吸收。

7、感受態(tài)細(xì)胞制備試劑: 見第三章。

8、煮沸法快速分離質(zhì)粒試劑: 見第一章。

9、質(zhì)粒酶及電泳試劑: 見第二章。第三節(jié) 操作步驟

一、連接反應(yīng)

1、取新的經(jīng)滅菌處理的0.5ml eppendorf管, 編號(hào)。

2、將0.1μg載體DNA轉(zhuǎn)移到無菌離心管中，加等摩爾量(可稍多)的外源DNA片段。

3、加蒸餾水至體積為8μl,于45℃保溫5分鐘,以使重新退火的粘端解鏈。將混和物冷卻至0℃。

4、加入10×T4 DNA ligase buffer 1μl, T4 DNA ligase 0.5μl, 混勻后用微量離心機(jī)將液體全部甩到管底,于16℃保溫8-24小時(shí)。

同時(shí)做二組對(duì)照反應(yīng)，其中對(duì)照組一只有質(zhì)粒載體無外源DNA；對(duì)照組二只有外源DNA片段沒有質(zhì)粒載體。

二、E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化

每組連接反應(yīng)混和物各取2μl轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞。具體方法見第三章。

三、重組質(zhì)粒的篩選

1、每組連接反應(yīng)轉(zhuǎn)化原液取100μl用無菌玻棒均勻涂布于篩選培養(yǎng)基上,37℃下培養(yǎng)半小時(shí)以上,直至液體被完全吸收。

2、倒置平板于37℃繼續(xù)培養(yǎng)12-16小時(shí),待出現(xiàn)明顯而又未相互重疊的單菌落時(shí)拿出平板。

3、放于4℃數(shù)小時(shí),使顯色完全（此步麥康凱培養(yǎng)基不做）。

不帶有pBS質(zhì)粒DNA的細(xì)胞,由于無Amp抗性,不能在含有Amp的篩選培養(yǎng)基上成活。帶有pBS載體的轉(zhuǎn)化子由于具有β-半乳糖苷酶活性,在麥康凱篩選培養(yǎng)基上呈現(xiàn)為紅色菌落。在X-gal和ITPG培養(yǎng)基上為藍(lán)色菌落。帶有重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子由于喪失了β-半乳糖苷酶活性,在麥康凱選擇性培養(yǎng)基和x-gal和ITPG培養(yǎng)基上均為白色菌落。

四、酶切鑒定重組質(zhì)粒

用無菌牙簽挑取白色單菌落接種于含Amp 50μg/ml的 5ml LB液體培養(yǎng)基中,37℃下振蕩培養(yǎng)12小時(shí)。使用煮沸法快速分離質(zhì)粒DNA直接電泳，同時(shí)以煮沸法抽提的pBS質(zhì)粒做對(duì)照，有插入片段的重組質(zhì)粒電泳時(shí)遷移率較pBS慢。再用與連接未端相對(duì)應(yīng)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)一步進(jìn)行酶切檢驗(yàn)。還可用雜交法篩選重組質(zhì)粒。

[注意]

1、DNA連接酶用量與DNA片段的性質(zhì)有關(guān)，連接平齊末端，必須加大酶量，一般使用連接粘性末端酶量的10-100倍。

2、在連接帶有粘性末端的DNA片段時(shí)，DNA濃度一般為2-10mg/ml，在連接平齊末端時(shí)，需加入DNA濃度至100-200mg/ml。

3、連接反應(yīng)后，反應(yīng)液在0℃儲(chǔ)存數(shù)天，-80℃儲(chǔ)存2個(gè)月，但是在-20℃冰凍保存將會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率。

4、粘性末端形成的氫鍵在低溫下更加穩(wěn)定，所以盡管T4 DNA連接酶的最適反應(yīng)溫度為37℃，在連接粘性末端時(shí)，反應(yīng)溫度以10-16℃為好，平齊末端則以15-20℃為好。

5、在連接反應(yīng)中，如不對(duì)載體分子進(jìn)行去5'磷酸基處理，便用過量的外源DNA片段（2-5倍），這將有助于減少載體的自身環(huán)化，增加外源DNA和載體連接的機(jī)會(huì)。

6、麥康凱選擇性瓊脂組成的平板，在含有適當(dāng)抗生素時(shí)，攜有載體DNA的轉(zhuǎn)化子為淡紅色菌落，而攜有帶插入片段的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子為白色菌落。該產(chǎn)品篩選效果同藍(lán)白斑篩選，且價(jià)格低廉。但需及時(shí)挑取白色菌落，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間延長，白色菌落會(huì)逐漸變成微紅色，影響挑選。

7、X-gal是5-溴-4-氯-3-吲哚-b-D-半乳糖（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside)以半乳糖苷酶（b-galactosidase)水解后生成的吲哚衍生物顯藍(lán)色。IPTG是異丙基硫代半乳糖苷（Isopropylthiogalactoside)，為非生理性的誘導(dǎo)物，它可以誘導(dǎo)lacZ的表達(dá)。

8、在含有X-gal和IPTG的篩選培養(yǎng)基上，攜帶載體DNA的轉(zhuǎn)化子為藍(lán)色菌落，而攜帶插入片段的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子為白色菌落，平板如在37℃培養(yǎng)后放于冰箱3-4小時(shí)可使顯色反應(yīng)充分，藍(lán)色菌落明顯。

思考題

1.在用質(zhì)粒載體進(jìn)行外源DNA片段克隆時(shí)主要應(yīng)考慮哪些因素？

2.利用α－互補(bǔ)現(xiàn)象篩選帶有插入片段的重組克隆的原理是什么？ 第六章 基因組DNA的提取 未知

第六章 基因組DNA的提取 第一節(jié) 概 述

基因組DNA的提取通常用于構(gòu)建基因組文庫、Southern雜交(包括RFLP)及PCR分離基因等。利用基因組DNA較長的特性,可以將其與細(xì)胞器或質(zhì)粒等小分子DNA分離。加入一定量的異丙醇或乙醇，基因組的大分子DNA即沉淀形成纖維狀絮團(tuán)飄浮其中, 可用玻棒將其取出，而小分子DNA則只形成顆粒狀沉淀附于壁上及底部, 從而達(dá)到提取的目的。在提取過程中,染色體會(huì)發(fā)生機(jī)械斷裂,產(chǎn)生大小不同的片段,因此分離基因組DNA時(shí)應(yīng)盡量在溫和的條件下操作,如盡量減少酚/氯仿抽提、混勻過程要輕緩, 以保證得到較長的DNA。一般來說,構(gòu)建基因組文庫, 初始DNA長度必須在100kb以上,否則酶切后兩邊都帶合適末端的有效片段很少。而進(jìn)行RFLP和PCR分析, DNA長度可短至50kb, 在該長度以上,可保證酶切后產(chǎn)生RFLP片段(20kb以下),并可保證包含PCR所擴(kuò)增的片段(一般2kb以下)。

不同生物（植物、動(dòng)物、微生物）的基因組DNA的提取方法有所不同;不同種類或同一種類的不同組織因其細(xì)胞結(jié)構(gòu)及所含的成分不同，分離方法也有差異。在提取某種特殊組織的DNA時(shí)必須參照文獻(xiàn)和經(jīng)驗(yàn)建立相應(yīng)的提取方法, 以獲得可用的DNA大分子。尤其是組織中的多糖和酶類物質(zhì)對(duì)隨后的酶切、PCR反應(yīng)等有較強(qiáng)的抑制作用,因此用富含這類物質(zhì)的材料提取基因組DNA時(shí), 應(yīng)考慮除去多糖和酚類物質(zhì)。

本實(shí)驗(yàn)以水稻幼苗(禾本科)、李(蘋果)葉子、動(dòng)物肌肉組織和大腸桿菌培養(yǎng)物為材料,學(xué)習(xí)基因組DNA提取的一般方法。第二節(jié) 從植物組織提取基因組DNA

一、材料

水稻幼苗或其它禾本科植物，李（蘋果）幼嫩葉子。

二、設(shè)備

移液器，冷凍高速離心機(jī)，臺(tái)式高速離心機(jī)，水浴鍋，陶瓷研缽，50ml離心管（有蓋）及5ml和1.5ml離心管，彎成鉤狀的小玻棒。

三、試劑

1、提取緩沖液Ⅰ：100mmol/L Tris·Cl, pH8.0, 20mmol/L EDTA, 500mmol/L NaCl, 1.5% SDS。

2、提取緩沖液Ⅱ：18.6g葡萄糖，6.9g二乙基二硫代碳酸鈉，6.0gPVP，240ul巰基乙醇，加水至300ml。

3、80:4:16/氯仿:戊醇:乙醇

4、RnaseA母液：配方見第一章。

5、其它試劑：液氮、異丙醇、TE緩沖液，無水乙醇、70%乙醇、3mol/L NaAc。

四、操作步驟：

（一）水稻幼苗或其它禾木科植物基因組DNA提取

1.在50ml離心管中加入20ml提取緩沖液Ⅰ, 60℃水浴預(yù)熱。

2.水稻幼苗或葉子5-10g, 剪碎, 在研缽中加液氮磨成粉狀后立即倒入預(yù)熱的離心管中, 劇烈搖動(dòng)混勻, 60℃水浴保溫30-60分鐘(時(shí)間長,DNA產(chǎn)量高), 不時(shí)搖動(dòng)。

3.加入20ml氯仿/戊醇/乙醇溶液, 顛倒混勻(需帶手套, 防止損傷皮膚)，室溫下靜置5-10分鐘, 使水相和有機(jī)相分層(必要時(shí)可重新混勻)。

4.室溫下5000rpm離心5分鐘。

5.仔細(xì)移取上清液至另一50ml離心管,加入1倍體積異丙醇,混勻,室溫下放置片刻即出現(xiàn)絮狀DNA沉淀。

6.在1.5ml eppendorf中加入1ml TE。用鉤狀玻璃棒撈出DNA絮團(tuán),在干凈吸水紙上吸干,轉(zhuǎn)入含TE的離心管中,DNA很快溶解于TE。

7.如DNA不形成絮狀沉淀,則可用5000rpm離心5分鐘, 再將沉淀移入TE管中。這樣收集的沉淀,往往難溶解于TE,可在60℃水浴放置15分鐘以上，以幫助溶解。

8.將DNA溶液3000rpm離心5分鐘, 上清液倒入干凈的5ml離心管。

9.加入5μl RNaseA(10μg/μl), 37℃ 10分鐘, 除去RNA(RNA對(duì)DNA的操作、分析一般無影響，可省略該步驟）。

10.加入1/10體積的3mol/L NaAc及2×體積的冰乙醇,混勻,-20℃放置20分鐘左右,DNA形成絮狀沉淀。

11.用玻棒撈出DNA沉淀,70%乙醇漂洗,再在干凈吸水紙上吸干。

12.將DNA重溶解于1ml TE,-20貯存。

13.取2μl DNA樣品在0.7% Agarose膠上電泳, 檢測(cè)DNA的分子大小。同時(shí)取15μl稀釋20倍, 測(cè)定OD260/OD280, 檢測(cè)DNA含量及質(zhì)量。

[注意] 5g樣品可保證獲得500μg DNA, 足供RFLP、PCR等分析之用。

（二）.從李(蘋果)葉子提取基因組DNA

1.取3-5克嫩葉, 液氮磨成粉狀。

2.加入提取緩沖液Ⅱ10ml, 再研磨至溶漿狀。10000rpm, 10min。

3.去上清液,沉淀加提取液Ⅰ20ml, 混勻。65℃, 30-60min, 常搖動(dòng)。

4.同本節(jié)

（一）中步驟3-13操作。第三節(jié) 從動(dòng)物組織提取基因組DNA

一、材料

哺乳動(dòng)物新鮮組織。

二、設(shè)備

移液管、高速冷凍離心機(jī)、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋。

三、試劑

1、分離緩沖液：10mmol/L Tris·Cl pH7.4, 10mmol/L NaCl, 25mmol/L EDTA。

2、其它試劑：10% SDS，蛋白酶 K(20mg/ml或粉劑)，乙醚，酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)，無水乙醇及70%乙醇，5mol/L NaCl，3mol/L NaAc，TE。

四、操作步驟:

1.切取組織5g左右,剔除結(jié)締組織,吸水紙吸干血液,剪碎放入研缽(越細(xì)越好)。

2.倒入液氮,磨成粉末,加10ml分離緩沖液。

3.加1ml 10% SDS, 混勻,此時(shí)樣品變得很粘稠。

4.加50ul或1mg 蛋白酶 K, 37℃保溫1-2小時(shí), 直到組織完全解體。

5.加1ml 5mol/L NaCl, 混勻,5000rpm離心數(shù)秒鐘。

6.取上清液于新離心管，用等體積酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)抽提。待分層后,3000rpm離心 5分鐘。

7.取上層水相至干凈離心管, 加2倍體積乙醚抽提(在通風(fēng)情況下操作)。

8.移去上層乙醚,保留下層水相。

9.加1/10 體積3mol/L NaAc, 及2倍體積無水乙醇顛倒混合沉淀DNA。室溫下靜止10-20分鐘，DNA沉淀形成白色絮狀物。

10.用玻棒鉤出DNA沉淀,70%乙醇中漂洗后,在吸水紙上吸干,溶解于1ml TE中,-20℃保存。

11.如果DNA溶液中有不溶解顆粒,可在5000rpm短暫離心,取上清;如要除去其中的RNA,可加5μl RNaseA(10μg/μl), 37℃保溫30分鐘, 用酚抽提后, 按步驟9-10重沉淀DNA。第四節(jié) 細(xì)菌基因組DNA的制備

一、材料

細(xì)菌培養(yǎng)物。

二、設(shè)備

移液管, 高速冷凍離心機(jī), 臺(tái)式離心機(jī)，水浴鍋。

三、試劑

1、CTAB/NaCl溶液：4.1g NaCl溶解于80ml H2 O,緩慢加入10g CTAB,加水至100ml。

2、其它試劑：氯仿:異戊醇(24:1)，酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)，異丙醇，70% 乙醇，TE，10% SDS，蛋白酶 K(20mg/ml或粉劑)，5mol/L NaCl。

四、操作步驟：

1.100ml 細(xì)菌過夜培養(yǎng)液, 5000rpm離心10分鐘, 去上清液。

2.加9.5ml TE懸浮沉淀, 并加0.5ml 10% SDS, 50μl 20mg/ml(或1mg干粉)蛋白酶 K, 混勻, 37℃保溫1小時(shí)。

3.加1.5ml 5mol/L NaCl, 混勻。

4.加1.5ml CTAB/NaCl溶液, 混勻, 65℃保溫20分鐘。

5.用等體積酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)抽提, 5000rpm離心10分鐘, 將上清液移至干凈離心管。

6.用等體積氯仿:異戊醇(24:1)抽提, 取上清液移至干凈管中。

7.加1倍體積異丙醇, 顛倒混合, 室溫下靜止10分鐘，沉淀DNA。

8.用玻棒撈出DNA沉淀, 70%乙醇漂洗后, 吸干,溶解于1ml TE,-20℃保存。如DNA沉淀無法撈出,可5000rpm離心, 使DNA沉淀。

9.如要除去其中的RNA, 可以按本章第三節(jié)中操作步驟處理。

第五節(jié) 基因組DNA的檢測(cè)

上述方法得到的DNA一般可以用作Southern, RFLP、PCR等分析。由于所用材料的不同,得到的DNA產(chǎn)量及質(zhì)量均不同,有時(shí)DNA中含有酚類和多糖類物質(zhì),會(huì)影響酶切和PCR的效果。所以獲得基因組DNA后,均需檢測(cè)DNA的產(chǎn)量和質(zhì)量。

1.DNA溶液稀釋20-30倍后,測(cè)定OD260 /OD280 比值, 明確DNA的含量和質(zhì)量。

2.取2-5μl 在0.7% agarose膠上電泳, 檢測(cè)DNA的分子大小。

3.取2μg DNA, 用10單位(U)HindⅢ酶切過夜, 0.7% agarose膠上電泳, 檢測(cè)能否完全酶解(做RFLP, DNA必須完全酶解)。

如果DNA中所含雜質(zhì)多, 不能完全酶切, 或小分子DNA多, 影響接續(xù)的分析和操作,可以用下列方法處理：

（1）選用幼嫩植物組織，可減少淀粉類的含量。

（2）酚:氯仿抽提, 去除蛋白質(zhì)和多糖。

（3）Sepharose柱過濾, 去除酚類、多糖和小分子DNA。

（4）CsCl梯度離心, 去除雜質(zhì), 分離大片段DNA(可用作文庫構(gòu)建)。思考題:

1.為什么構(gòu)建DNA文庫時(shí),一定要用大分子DNA？

2.如何檢測(cè)和保證DNA的質(zhì)量？ 第七章 RFLP和RAPD技術(shù) 未知

第七章 RFLP和RAPD技術(shù) 第一節(jié) 概 述

DNA分子水平上的多態(tài)性檢測(cè)技術(shù)是進(jìn)行基因組研究的基礎(chǔ)。RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism,限制片段長度多態(tài)性)已被廣泛用于基因組遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位以及生物進(jìn)化和分類的研究。RFLP是根據(jù)不同品種（個(gè)體）基因組的限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)堿基發(fā)生突變，或酶切位點(diǎn)之間發(fā)生了堿基的插入、缺失，導(dǎo)致酶切片段大小發(fā)生了變化，這種變化可以通過特定探針雜交進(jìn)行檢測(cè)，從而可比較不同品種（個(gè)體）的DNA水平的差異（即多態(tài)性），多個(gè)探針的比較可以確立生物的進(jìn)化和分類關(guān)系。所用的探針為來源于同種或不同種基因組DNA的克隆，位于染色體的不同位點(diǎn)，從而可以作為一種分子標(biāo)記(Mark)，構(gòu)建分子圖譜。當(dāng)某個(gè)性狀（基因）與某個(gè)（些）分子標(biāo)記協(xié)同分離時(shí)，表明這個(gè)性狀（基因）與分子標(biāo)記連鎖。分子標(biāo)記與性狀之間交換值的大小，即表示目標(biāo)基因與分子標(biāo)記之間的距離，從而可將基因定位于分子圖譜上。分子標(biāo)記克隆在質(zhì)粒上，可以繁殖及保存。不同限制性內(nèi)切酶切割基因組DNA后，所切的片段類型不一樣，因此，限制性內(nèi)切酶與分子標(biāo)記組成不同組合進(jìn)行研究。常用的限制性內(nèi)切酶一般是HindⅢ，BamHⅠ,EcoRⅠ,EcoRV,XbaⅠ,而分子標(biāo)記則有幾個(gè)甚至上千個(gè)。分子標(biāo)記越多，則所構(gòu)建的圖譜就越飽和。構(gòu)建飽和圖譜是RFLP研究的主要目標(biāo)之一。

運(yùn)用隨機(jī)引物擴(kuò)增尋找多態(tài)性DNA片段可作為分子標(biāo)記。這種方法即為RAPD(Random amplified polymorphic DNA，隨機(jī)擴(kuò)增的多態(tài)性DNA)。盡管RAPD技術(shù)誕生的時(shí)間很短, 但由于其獨(dú)特的檢測(cè)DNA多態(tài)性的方式以及快速、簡(jiǎn)便的特點(diǎn),使這個(gè)技術(shù)已滲透于基因組研究的各個(gè)方面。該RAPD技術(shù)建立于PCR技術(shù)基礎(chǔ)上,它是利用一系列(通常數(shù)百個(gè))不同的隨機(jī)排列堿基順序的寡聚核苷酸單鏈(通常為10聚體)為引物,對(duì)所研究基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增.聚丙烯酰胺或瓊脂糖電泳分離,經(jīng)EB染色或放射性自顯影來檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物DNA片段的多態(tài)性,這些擴(kuò)增產(chǎn)物DNA片段的多態(tài)性反映了基因組相應(yīng)區(qū)域的DNA多態(tài)性。RAPD所用的一系列引物DNA序列各不相同,但對(duì)于任一特異的引物,它同基因組DNA序列有其特異的結(jié)合位點(diǎn).這些特異的結(jié)合位點(diǎn)在基因組某些區(qū)域內(nèi)的分布如符合PCR擴(kuò)增反應(yīng)的條件,即引物在模板的兩條鏈上有互補(bǔ)位置,且引物3'端相距在一定的長度范圍之內(nèi),就可擴(kuò)增出DNA片段.因此如果基因組在這些區(qū)域發(fā)生DNA片段插入、缺失或堿基突變就可能導(dǎo)致這些特定結(jié)合位點(diǎn)分布發(fā)生相應(yīng)的變化,而使PCR產(chǎn)物增加、缺少或發(fā)生分子量的改變。通過對(duì)PCR產(chǎn)物檢測(cè)即可檢出基因組DNA的多態(tài)性。分析時(shí)可用的引物數(shù)很大,雖然對(duì)每一個(gè)引物而言其檢測(cè)基因組DNA多態(tài)性的區(qū)域是有限的,但是利用一系列引物則可以使檢測(cè)區(qū)域幾乎覆蓋整個(gè)基因組。因此RAPD可以對(duì)整個(gè)基因組DNA進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè)。另外，RAPD片段克隆后可作為RFLP的分子標(biāo)記進(jìn)行作圖分析。

本實(shí)驗(yàn)將學(xué)習(xí)RFLP的酶切,電泳和膜的制作以及RAPD技術(shù)。探針標(biāo)記及雜交檢測(cè)方法請(qǐng)另詳見分子雜交技術(shù)。第二節(jié) RFLP技術(shù)

一、材料

基因組DNA(大于50kb,分別來自不同的材料)。

二、設(shè)備

電泳儀及電泳槽，照相用塑料盆5只，玻璃或塑料板(比膠塊略大)4塊，吸水紙若干，尼龍膜(依膠大小而定)，濾紙，eppendorf管(0.5ml)若干。

三、試劑：

1、限制性內(nèi)切酶(BamHⅠ, EcoRⅠ, HindⅢ, XbaⅠ)及10×酶切緩沖液。

2、5×TBE電泳緩沖液：配方見第一章。

3、變性液：0.5mol/L NaOH，1.5mol/L NaCl。

4、中和液：1mol/LTris·Cl, pH7.5/1.5mol/L NaCl。

5、10×SSC：配方見第九章。

6、其它試劑：0.4mol/L NaOH，0.2mol/L Tris·Cl, pH7.5/2×SSC，ddH2O，Agarose 0.8%，0.25mol/L HCl。

四.操作步驟

1.基因組DNA的酶解

(1)大片斷DNA的提取詳見基因組DNA提取實(shí)驗(yàn),要求提取的DNA分子量大于50kb, 沒有降解。

(2)在50μl反應(yīng)體系中,進(jìn)行酶切反應(yīng):

5μg基因組DNA

5μl 10×酶切緩沖液

20單位（U）限制酶(任意一種)

加ddH2 O, 至50μl

(3)輕微振蕩, 離心,37℃反應(yīng)過夜。

(4)取5μl反應(yīng)液,0.8％瓊脂糖電泳觀察酶切是否徹底，這時(shí)不應(yīng)有大于30kb的明顯亮帶出現(xiàn)。

[注意] 未酶切的DNA要防止發(fā)生降解, 酶切反應(yīng)一定要徹底。

2.Southern轉(zhuǎn)移

（1）酶解的DNA經(jīng)0.8％瓊脂糖凝膠電泳(可18V過夜)后EB染色觀察。

（2）將凝膠塊浸沒于0.25mol/L HCl中脫嘌呤, 10分鐘。

（3）取出膠塊, 蒸餾水漂洗, 轉(zhuǎn)至變性液變性45分鐘。經(jīng)蒸餾水漂洗后轉(zhuǎn)至中和液中和30分鐘。

（4）預(yù)先將尼龍膜,濾紙浸入水中,再浸入10×SSC中,將一玻璃板架于盆中鋪一層濾紙(橋)然后將膠塊反轉(zhuǎn)放置,蓋上尼龍膜,上覆二層濾紙,再加蓋吸水紙,壓上半公斤重物, 以10×SSC鹽溶液吸印,維持18-24小時(shí)。也可用電轉(zhuǎn)移或真空轉(zhuǎn)移。

（5）取下尼龍膜, 0.4mol/L NaOH 30秒, 迅速轉(zhuǎn)至0.2mol/L Tris·Cl,pH7.5/2×SSC,溶液中, 5分鐘。

（6）將膜夾于2層濾紙內(nèi), 80℃真空干燥2小時(shí)。

（7）探針的制備和雜交見第九章分子雜交部分。[注意]

1、步驟（2）中脫嘌呤時(shí)間不能過長。

2、除步驟（1）、（4）、（5）外, 其余均在搖床上進(jìn)行操作。

3、步驟（4）中,當(dāng)尼龍膜覆于膠上時(shí), 絕對(duì)防止膠與膜之間有氣泡發(fā)生, 加蓋濾時(shí)也不應(yīng)有氣泡發(fā)生。

4、有時(shí)用一種限制性內(nèi)切酶不能發(fā)現(xiàn)RFLP的差異，這時(shí)應(yīng)該試用另一種酶。

第三節(jié) RAPD技術(shù)

一、材料

不同來源的DNA(50ng/ul)。

二、設(shè)備

PCR儀，PCR管或硅化的0.5ml eppendorf管，電泳裝置。

三、試劑

1、隨機(jī)引物(10mer)(5umol/L)：購買成品。

2、Taq酶：購買成品。3、10xPCR 緩沖液：配方見第八章。

4、MgCl2 ：25mmol/L。

5、dNTP：每種2.5mmol/L。

四、操作步驟：

1.在25ul反應(yīng)體系中,加入

模板DNA 1ul(50ng)

隨機(jī)引物 1ul(約5pmol)

10xPCR Buffer 2.5ul

MgCl2 2ul

dNTP 2ul

Taq酶 1單位（U）

加ddH2O 至 25ul

混勻稍離心, 加一滴礦物油。

2.在加熱至90℃以上的PCR儀中預(yù)變性94℃ 2分鐘, 然后循環(huán): 94℃ 1分鐘，36℃ 1分鐘，72℃ 1分鐘，共40輪循環(huán)。

3.循環(huán)結(jié)束后, 72℃ 10分鐘，4℃保存。

4.取PCR產(chǎn)物15ul加3ul上樣緩沖液(6x)于2% 瓊脂糖膠上電泳, 穩(wěn)壓50-100Ｖ（電壓低帶型整齊，分辨率高）。

5.電泳結(jié)束，觀察、拍照。

[注意]

1、電泳時(shí)一般RAPD帶有5-15條, 大小0.1-2.0kb。

2、特異性的DNA帶可以克隆作為一個(gè)新的分子標(biāo)記應(yīng)用。思考題

1.DNA酶切反應(yīng)不徹底會(huì)有何結(jié)果? DNA發(fā)生降解有何影響？

2.Southern轉(zhuǎn)移中脫嘌呤時(shí)間為何不能太長？

3.隨機(jī)引物擴(kuò)增,為什么會(huì)產(chǎn)生DNA雙鏈產(chǎn)物? 第八章 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增和擴(kuò)增產(chǎn)物克隆 未知

第八章 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增和擴(kuò)增產(chǎn)物克隆 第一節(jié) 概 述

PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶鏈反應(yīng))是一種選擇性體外擴(kuò)增DNA或RNA的方法.它包括三個(gè)基本步驟:(1)變性(Denature):目的雙鏈DNA片段在94℃下解鏈;(2)退火(Anneal):兩種寡核苷酸引物在適當(dāng)溫度(50℃左右)下與模板上的目的序列通過氫鍵配對(duì);(3)延伸(Extension):在Taq DNA聚合酶合成DNA的最適溫度下,以目的DNA為模板進(jìn)行合成.由這三個(gè)基本步驟組成一輪循環(huán),理論上每一輪循環(huán)將使目的DNA擴(kuò)增一倍（圖4）,這些經(jīng)合成產(chǎn)生的DNA又可作為下一輪循環(huán)的模板,所以經(jīng)25-35輪循環(huán)就可使DNA擴(kuò)增達(dá)106 倍。

一、PCR反應(yīng)中的主要成份

1.引物：PCR反應(yīng)產(chǎn)物的特異性由一對(duì)上下游引物所決定。引物的好壞往往是PCR成敗的關(guān)鍵。引物設(shè)計(jì)和選擇目的DNA序列區(qū)域時(shí)可遵循下列原則：(1)引物長度約為16-30bp，太短會(huì)降低退火溫度影響引物與模板配對(duì)，從而使非特異性增高。太長則比較浪費(fèi),且難以合成。(2)引物中G+C含量通常為40%-60%,可按下式粗略估計(jì)引物的解鏈溫度 Tm＝4(G+C)+2(A+T).(3)四種堿基應(yīng)隨機(jī)分布，在3'端不存在連續(xù)3個(gè)G或C,因這樣易導(dǎo)致錯(cuò)誤引發(fā)。(4)引物3'端最好與目的序列閱讀框架中密碼子第一或第二位核苷酸對(duì)應(yīng), 以減少由于密碼子擺動(dòng)產(chǎn)生的不配對(duì)。(5)在引物內(nèi), 尤其在3'端應(yīng)不存在二級(jí)結(jié)構(gòu)。(6)兩引物之間尤其在3'端不能互補(bǔ), 以防出現(xiàn)引物二聚體, 減少產(chǎn)量。兩引物間最好不存在4個(gè)連續(xù)堿基的同源性或互補(bǔ)性。(7)引物5'端對(duì)擴(kuò)增特異性影響不大, 可在引物設(shè)計(jì)時(shí)加上限制酶位點(diǎn)、核糖 體結(jié)合位點(diǎn)、起始密碼子、缺失或插入突變位點(diǎn)以及標(biāo)記生物素、熒光素、地高辛等.通常應(yīng)在5'端限制酶位點(diǎn)外再加1-2個(gè)保護(hù)堿基。(8)引物不與模板結(jié)合位點(diǎn)以外的序列互補(bǔ)。所擴(kuò)增產(chǎn)物本身無穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu), 以免產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增,影響產(chǎn)量。(9)簡(jiǎn)并引物應(yīng)選用簡(jiǎn)并程度低的密碼子, 例如選用只有一種密碼子的Met, 3'端應(yīng)不存在簡(jiǎn)并性。否則可能由于產(chǎn)量低而看不見擴(kuò)增產(chǎn)物。

一般PCR反應(yīng)中的引物終濃度為0.2-1.0μmol/L。引物過多會(huì)產(chǎn)生錯(cuò)誤引導(dǎo)或產(chǎn)生引物二聚體, 過低則降低產(chǎn)量。利用紫外分光光度計(jì), 可精確計(jì)算引物濃度, 在1cm光程比色杯中,260nm下,引物濃度可按下式計(jì)算： X mol/L＝ OD260/ A(16000)+C(70000)+G(12000)+T(9600)X: 引物摩爾濃度,A、C、G、T: 引物中4種不同堿基個(gè)數(shù)。

2.4種三磷酸脫氧核苷酸(dNTP)：dNTP應(yīng)用NaOH 將pH調(diào)至7.0,并用分光光度計(jì)測(cè)定其準(zhǔn)確濃度.dNTP原液可配成5-10mmol/L并分裝,-20℃貯存。一般反應(yīng)中每種dNTP的終濃度為20-200μmol/L。理論上4 種 dNTP各20μmol/L,足以在100μl反應(yīng)中合成2.6μg的DNA。當(dāng)dNTP終濃度大于50mmol/L時(shí)可抑制Taq DNA聚合酶的活性.4種dNTP的濃度應(yīng)該相等,以減少合成中由于某種dNTP的不足出現(xiàn)的錯(cuò)誤摻入。

3.Mg2+：Mg2+濃度對(duì)Taq DNA聚合酶影響很大,它可影響酶的活性和真實(shí)性,影響引物退火和解鏈溫度, 影響產(chǎn)物的特異性以及引物二聚體的形成等。通常Mg2+ 濃度范圍為0.5-2mmol/L.對(duì)于一種新的PCR反應(yīng),可以用0.1-5mmol/L的遞增濃度的Mg2+ 進(jìn)行預(yù)備實(shí)驗(yàn),選出最適的Mg2+濃度。在PCR反應(yīng)混合物中, 應(yīng)盡量減少有高濃度的帶負(fù)電荷的基團(tuán), 例如磷酸基團(tuán)或EDTA等可能影響Mg2+ 離子濃度的物質(zhì),以保證最適Mg2+ 濃度。

第三篇：分子生物學(xué)

分子生物技術(shù)在微生物鑒定中的應(yīng)用

摘要：微生物多樣性是生物多樣性的重要組成部分。由于微生物和 動(dòng)、植物 相比, 存在著多種顯著差異。而傳統(tǒng)的基于微生物培養(yǎng)與純種分離的技術(shù)具有很大的局限性，分子生物學(xué)及其有關(guān)技術(shù)的長足進(jìn)展及其在為生物中的使用, 使微生物的研究進(jìn)入了分子的階段。

關(guān)鍵詞：16SrDNA PCR 溫度梯度電泳 變性梯度凝膠電泳 微生物包括了從原核到真核的不同類群的生物: 細(xì)菌、放線菌、原生動(dòng)物、真菌、部分藻類和病毒, 是生物多樣性的重要組成部分。此外, 微生物多樣性與其他生物類群相比有許多獨(dú)特之處, 包括: 1)生存環(huán)境多樣;2)生長、繁殖速度多樣;3)營養(yǎng)、代謝類型多樣;4)生活方式多樣。因而, 微生物多樣性的研究無論對(duì)于生態(tài)系統(tǒng)功能的完整理解, 還是對(duì)于微生物資源的利用和開發(fā)都具有特殊重要的意義[1]。微生物作為生態(tài)系統(tǒng)中極重要的一員, 對(duì)動(dòng)植物的生長，生態(tài)系統(tǒng)中的能流和物質(zhì)循環(huán)及環(huán)境污染物的降解和解毒等方面起著重要作用并且與人的生活健康息息相關(guān)。隨著微生物的不斷發(fā)現(xiàn)及研究，傳統(tǒng)微生物技術(shù)越來越不能滿足其發(fā)展的需要，最主要的不足是丟失了微生物的多樣性, 許多報(bào)道都指出, 在自然環(huán)境中有相當(dāng)多的菌種(約90%-99%)用傳統(tǒng)方法無法培養(yǎng)出來[2].這對(duì)于微生物基因組學(xué)研究來說是很不利的.，導(dǎo)致研究的片面性并且效率低下。而分子生物學(xué)技術(shù)則避開了傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)分離的環(huán)節(jié), 而是采取直接從樣品中抽取所含微生物總DNA, 然后通過16S rDNA, PCR, RAPD, DGGE

和RFLP 等多種分子生物學(xué)研究手段, 對(duì)直接提取的總DNA進(jìn)行分析, 了解其中所包含的微生物DNA 的種類和含量, 以研究樣品中微生物的實(shí)際組成, 同時(shí)可以利用直接提取得到的總DNA 建立基因文庫, 并從中篩選有用的基因。由于是直接從樣品中提取總DNA, 中間沒有任何篩選性的過程, 因此, 所得DNA 能夠準(zhǔn)確地反映樣品中微生物的實(shí)際情況, 避免了傳統(tǒng)培養(yǎng)方法不能真實(shí)反映微生態(tài)實(shí)際情況的缺點(diǎn), 也不會(huì)丟失樣品中存在的任何微生物,同時(shí), 這種方法能夠很容易、大批量地取得同一環(huán)境下乃至不同環(huán)境下的不同微生物的同源基因, 為微生物比較基因組學(xué)研究開辟了道路.此外, 用直接提取的總DNA 構(gòu)建的基因文庫, 包含了大量以前因?yàn)闊o法培養(yǎng)而不能獲得的微生物基因, 從這些文庫中發(fā)現(xiàn)全新的具有巨大應(yīng)用價(jià)值的抗生素類、酶類及其他生物活性物質(zhì)的基因應(yīng)該是非常有潛力的。1．16SrRNA比較測(cè)序

16SrDNA是編碼原核生物16SrRNA的基因，長度約1500bp，存在于所有的原核生物的基因組中，由多個(gè)保守區(qū)和與之相間的多個(gè)可變區(qū)組成。保守區(qū)為所有細(xì)菌共有，細(xì)菌之間無顯著差異；可變區(qū)在不同細(xì)菌之間存在一定程度的差異，具有細(xì)菌屬或種特異[3]。2.PCR近年來,對(duì)環(huán)境樣品總DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增, 推動(dòng)了利用分子標(biāo)記技術(shù)研究微生物的多樣性。PCR技術(shù)是美國letus公司人類遺傳研究室的科學(xué)家與1983年發(fā)明的一種在體外快速擴(kuò)增特異基因或DNA 序列的方法, 其目的是將極微量DNA大量擴(kuò)增。該技術(shù)模仿生物體內(nèi)DNA 的復(fù)制過程,首先使DNA 變性, 兩條鏈解開;然后使引物模板退火, 二者堿基配對(duì);耐高溫的Taq DNA 聚合酶以4種dNTP為底物, 在引物的引導(dǎo)下合成與模板鏈互補(bǔ)的DNA 新鏈[4]。PCR 技術(shù)可在體外快速擴(kuò)增DNA, 具有快速、簡(jiǎn)便、靈敏度高的特點(diǎn)。當(dāng)然常規(guī) PCR技術(shù)也存在很多的問題，如出現(xiàn)假陽性、形成引物二聚體、傳統(tǒng)的PCR技術(shù)一次擴(kuò)增只能檢測(cè)一種微生物、RNA病毒的PCR檢測(cè)操作繁瑣，中間污染環(huán)節(jié)多，易出現(xiàn)假陽性或假陰性結(jié)果等.為了彌補(bǔ)上面這些不足，一些新的PCR技術(shù)逐漸衍生出來并被用于實(shí)踐，如熱啟動(dòng)PCR、巢式PCR、逆轉(zhuǎn)錄PCR、多重PCR、通用引物PCR、PCR單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析、隨機(jī)引物DNA 多態(tài)性擴(kuò)增（RAPD）、限制性長度多態(tài)性分析（RFLP）、實(shí)時(shí)熒光PCR（real-time PCR）等[5]。3.電泳分離及其顯示方法

除過我們熟知的瓊脂糖凝膠電泳并用溴乙錠(EB)染色方法和聚丙烯酰氨凝膠電泳(PAGE 分離)銀染方法外, 還有一些通過特殊的電泳分離技術(shù)而建立的分子標(biāo)記, 如變性梯度凝膠電泳(DGGE), 可分離長度相同但是序列不同的DNA 片段的混合物。對(duì)于特異性引物PCR 擴(kuò)增的環(huán)境微生物的16SrRNA 基因, 一般的電泳很難將序列不同的片段分開。DGGE膠在聚丙烯酰氨膠中添加了線性梯度的變性劑, 可以形成從低到高的線性梯度, 在一定溫度下, 同一濃度的變性劑中, 不同序列的產(chǎn)物，其部分解鏈程度不同。DNA 解鏈程度不同決定其電泳的遷移率, 結(jié)果不同的產(chǎn)物在凝膠上分離開。在變性條件適當(dāng)?shù)那闆r下, 該技術(shù)能分辨一個(gè)堿基對(duì)。DGGE 技術(shù)在微生物群落結(jié)構(gòu) 的研究、微生物種群的動(dòng)態(tài)分析、富集培養(yǎng)以及分離物的分析、16SDNA 同源性的分析中得到廣泛應(yīng)用[6]。

溫度梯度電泳(TGGE)是利用不同構(gòu)象的分子具有不同的變 性溫度來進(jìn)行分離, 最先應(yīng)用于DNA /RNA 的分子構(gòu)象分析和序列變異分析, 是一種新出現(xiàn)的檢測(cè)點(diǎn)突變的電泳技術(shù), 其最大特點(diǎn)上具有高分辨能力。單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)也是根據(jù)不同的結(jié)構(gòu)對(duì)DNA在凝膠中遷移速率影響很大, 結(jié)果不同序列的DNA 片段在凝膠上得以高分辨率的分離。基因芯片可分為cDNA 芯片、寡核苷酸芯片及基因組芯片。在一定條件下, 載體上的核酸分子可以與來自樣品的序列互補(bǔ)的核酸片段雜交。如果把樣品中的核酸片段進(jìn)行標(biāo)記, 在專用的芯片閱讀儀上就可以檢測(cè)到雜交信號(hào)[7]。

分子生物學(xué)技術(shù)在環(huán)境微生物研究中的應(yīng)用中rRNA 技術(shù)提供了一種擺脫傳統(tǒng)的純種培養(yǎng)方法而鑒定環(huán)境微生的途徑,并已被廣泛應(yīng)用于微生物的各個(gè)領(lǐng)域。雖然當(dāng)前,標(biāo)準(zhǔn)rRNA 技術(shù)的靈敏度還難以檢測(cè)到低豐度的(低于1/ 1 000)在群落中僅占很小比例的微生物種類, 從而使之在微生物生態(tài)以及環(huán)境學(xué)上的應(yīng)用受到很大的限制。然而, rRNA 技術(shù)與其它的分子技術(shù)以及特別是與傳統(tǒng)的純種培養(yǎng)方法相結(jié)合, 具備分析微生物多樣性的巨大潛力。隨著這些新的分子方法的不斷改進(jìn)以及rRNA 數(shù)據(jù)庫中序列信息的不斷增加, 我們能探知更多的未知的微生物世界。

參考文獻(xiàn)：

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第四篇：分子生物學(xué)課件整理

注：根據(jù)課件內(nèi)容簡(jiǎn)單整理，為了方便大家理解，內(nèi)容較多;如果僅僅為了考試，可以根據(jù)自己的需要進(jìn)行內(nèi)容的刪減。Lecture 1.Introduction

1.What is Molecular Biology? Molecular biology seeks to explain the relationships between the structure and function of biological molecules and how these relationships contribute to the operation and control of biochemical processes.Molecular biology is the study of genes and their activities at the molecular level, including transcription, translation, DNA

（一）基因的概念的產(chǎn)生和發(fā)展

2、Morgan 基因的物質(zhì)載體是染色體

3、G.Beadle & R.Tatum

基因是決定蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的遺傳物質(zhì)單位

5、O.Avery

基因的化學(xué)本質(zhì)是DNA

6、Jacob & Monod

基因是在特定的遺傳調(diào)控系統(tǒng)的調(diào)節(jié)下和控制下表達(dá)其功能的遺傳物質(zhì)單位

7、現(xiàn)代的基因概念

基因是核酸分子中儲(chǔ)存遺傳信息的遺傳單位，是指儲(chǔ)存有功能的蛋白replication, recombination and translocation.分子生物學(xué)的研究?jī)?nèi)容

Major content of molecular biology ◆ Structure and Function of nucleic acid ★conformation and function of DNA ★conformation and function of RNA ◎mRNA ◎tRNA◎rRNA ◎ ribozyme ◎antisence RNA ◎ microRNA ◎ RNA interfrence 人們開發(fā)出：RNAi、RNAa、ncRNA、SiRNA、microRNA、Antisene RNA、SatellileRNA、TelomereRNA、lincRNA、InCRNA、PiRNA、qiRNA、endoSiRNA等等，其他還有RNA結(jié)合蛋白(RNPs)、RNA酶等成百上千種RNA相關(guān)的新成員，組成了一個(gè)龐大的RNA新世界

這些RNA不僅在基因-蛋白質(zhì)的合成中發(fā)揮重要作用，它更調(diào)節(jié)和管理著—基因的轉(zhuǎn)錄、表達(dá)、表型等幾乎所有的功能。

在細(xì)胞增殖、分化、生長、凋亡、生殖、發(fā)育、遺傳、損傷、修復(fù)、炎癥、感染、防治等一切生命活動(dòng)中發(fā)揮著重要作用；

RNA還是生命起源的“先驅(qū)’’，近年來研究證明，RNA比DNA更古老，它是地球上最早出現(xiàn)的生命形式；它可以攜帶遺傳信息，能自我復(fù)制，自我進(jìn)化，自我編譯，又具有催化分子功能------,以后才有了DNA和蛋白質(zhì)，才有了今天的生物世界。

RNA更是人類生命健康的維護(hù)者，它不僅調(diào)節(jié)和管理著人類的一切生命活動(dòng)，而且它還是防治許多重大的疾病和開發(fā)新藥物的靶分子和預(yù)警分子，并可直接和間接的發(fā)揮防治疾病的作用。

◆Functional Genomics ◎As the Human Genome Project has mostly determined the genetic sequence, the next step is functional genomics, which will reveal each gene's functions and controls ◎ Human Genome Diversity Project ◎ Environmental Genome Project ◎Pharmacogenomics ◎Comparative Genomics

Artificial life 人工生命是通過人工模擬生命系統(tǒng),來研究生命的領(lǐng)域。人工生命的概念，包括兩個(gè)方面內(nèi)容

1.屬于計(jì)算機(jī)科學(xué)領(lǐng)域的虛擬生命系統(tǒng)，涉及計(jì)算機(jī)軟件工程與人工智能技術(shù)，以及

2.基因工程技術(shù)人工改造生物的工程生物系統(tǒng)，涉及合成生物學(xué)技術(shù)。

分子生物學(xué)與醫(yī)學(xué)

◆人體發(fā)育調(diào)控和人體功能調(diào)控的分子生物學(xué)基礎(chǔ) ◎發(fā)育、分化與衰老的分子生物學(xué)基礎(chǔ) ◎細(xì)胞增殖調(diào)控的分子生物學(xué)基礎(chǔ)

◎神經(jīng)、內(nèi)分泌和免疫調(diào)控的分子生物學(xué)基礎(chǔ)

◆ 基因與疾病 ◎疾病的分子機(jī)理

致病基因的克隆

復(fù)雜疾病的分子基礎(chǔ) ◎基因診斷 ◎基因治療

Lecture 2 structure and function of gene 第一節(jié) 基因的概念及其發(fā)展 一 基因（gene）

質(zhì)多肽鏈或RNA序列信息所必需的全部核苷酸序列

二、基因組（genomic）The genome is the entirety of an organism's hereditary information.It is encoded either in DNA or, for many types of virus, in RNA.The genome includes both the genes and the non-coding sequences of the DNA

細(xì)胞或生物體中，一套完整單倍體的遺傳物質(zhì)的總和。

人類基因組包含24條染色體以及線粒體上的全部的遺傳物質(zhì)。

第二節(jié) 真核生物基因組

一、基因分類

1、結(jié)構(gòu)基因（strutual gene）可被轉(zhuǎn)錄形成mRNA并進(jìn)而翻譯位多肽鏈，構(gòu)成各種結(jié)構(gòu)蛋白的基因

2、調(diào)節(jié)基因（regulatory gene）可調(diào)節(jié)、控制結(jié)構(gòu)基因表達(dá)的基因。其突變可能會(huì)影響一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)基因的功能，導(dǎo)致一個(gè)（或多個(gè)）蛋白質(zhì)的改變。

3、rRNA基因和tRNA基因

二、基因的結(jié)構(gòu)

enhancer pr omoter e xon 5UTR, 3UTR intron

（一）編碼區(qū)、外顯子（exon）

2、內(nèi)含子（intron）★GT—AG規(guī)則：

內(nèi)含子多是以GT開始，并以AG結(jié)尾

★一個(gè)基因的內(nèi)含子可以是另一個(gè)基因的外顯子?！锿怙@子的數(shù)量是描述基因結(jié)構(gòu)特征的重要指標(biāo)。三、調(diào)控元件（acting elements）

（二）前導(dǎo)區(qū)：

位于編碼區(qū)的上游，相當(dāng)于mRNA5端的非編碼區(qū)

（三）調(diào)節(jié)區(qū)：

包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子等基因編碼區(qū)的兩側(cè)，也稱側(cè)翼序列

◎順式調(diào)控元件（cis-acting elements）：與結(jié)構(gòu)基因表達(dá)調(diào)控相關(guān)。能夠被基因調(diào)控蛋白特異性識(shí)別和結(jié)合的DNA序列。◎反式調(diào)控元件（trans-acting elements）:一些可以通過結(jié)合順式元件而調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄活性的蛋白因子。

（一）啟動(dòng)子（promoter）

啟動(dòng)子是DNA分子可以與RNA聚合酶特異結(jié)合的部位，也就是使轉(zhuǎn)錄開始的部位。在基因表達(dá)的調(diào)控中，轉(zhuǎn)錄的起始是個(gè)關(guān)鍵。常常某個(gè)基因是否應(yīng)當(dāng)表達(dá)決定于在特定的啟動(dòng)子起始過程。2 啟動(dòng)子的類型

(1)一類是RNA聚合酶可以直接識(shí)別的啟動(dòng)子 這類啟動(dòng)子應(yīng)當(dāng)總是能被轉(zhuǎn)錄。

但實(shí)際上也不都如此，外來蛋白質(zhì)可對(duì)其有影響，即該蛋白質(zhì)可直接阻斷啟動(dòng)子，也可間接作用于鄰近的DNA結(jié)構(gòu)，使聚合酶不能和啟動(dòng)子結(jié)合(2)另一類啟動(dòng)子在和聚合酶結(jié)合時(shí)需要有蛋白質(zhì)輔助因子的存在。這種蛋白質(zhì)因子能夠識(shí)別與該啟動(dòng)子順序相鄰或甚至重疊的DNA順序。3 啟動(dòng)子的共同順序

⑴ 真核生物基因啟動(dòng)子 位于RNA合成開始位點(diǎn)的上游大約10bp和35bp處有兩個(gè)共同的順序，稱為-10和-35序列。這兩個(gè)序列的共同順序如下，-35區(qū)“AATGTGTGGAAT”，-10區(qū)“TTGACATATATT”。

-10序列又稱為Pribnow盒(原核生物)。是RNA聚合酶所結(jié)合和作用必需的順序

⑵真核生物基因啟動(dòng)子

▲TATA box（Goldberg-Hogness box）：

位于-35bp處，序列為TATA（A/T）A（T/A）是RNA聚合酶Ⅱ的結(jié)合部位

▲CAAT盒：在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游70-80bp處

保守的共同順序：GCCTCAATCT。RNA聚合酶Ⅱ可以識(shí)別這一順序。⑶啟動(dòng)子中的－10和-35序列是RNA聚合酶所結(jié)合和作用必需的順序 [1]RNA聚合酶能和-35和-10序列中的堿基和DNA主 鏈中的磷酸基相接觸;[2]離開共同順序較遠(yuǎn)的啟動(dòng)子的活性亦較弱;[3]最重要的是，破壞啟動(dòng)子功能的突變中有75%都是改變了共同順序中的堿基，其余25%亦為離共同順序較近的。-35和-10序列相距約20bp，即大致是雙螺旋繞兩圈的長度。因?yàn)檫@兩個(gè)結(jié)合區(qū)是在DNA分子的同一側(cè)面，沉默子的作用機(jī)理

沉默子介導(dǎo)產(chǎn)生的沉默是一種狀態(tài)的變化,在此過程中,產(chǎn)生類似于異染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)阻止轉(zhuǎn)錄因子與DNA的相互作用,使轉(zhuǎn)錄被抑制,沉默子作為異染色質(zhì)形成中的失活中心參與沉默狀態(tài)的建立和擴(kuò)散

沉默子含阻遏蛋白結(jié)合序列，阻遏蛋白與其結(jié)合后阻遏基因的轉(zhuǎn)錄。直接阻遏(direct repression)沉默子結(jié)合蛋白與轉(zhuǎn)錄復(fù)合物中的成員結(jié)合后將其固定，使基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄復(fù)合物無法形成而喪失活性

競(jìng)爭(zhēng)(competition)在一些基因中沉默子與增強(qiáng)子等正調(diào)控元件相鄰或相重疊，阻遏蛋白結(jié)合后阻止激活蛋白與鄰近正調(diào)控元件的結(jié)合從而阻遏轉(zhuǎn)錄

淬滅

沉默子與增強(qiáng)子相鄰，阻遏蛋白與沉默子結(jié)合后,雖不影響激活蛋白與DNA的結(jié)合能力,卻通過蛋白之間的相互作用阻止激活蛋白與轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的正確接觸來抑制其活性 可見此酶是結(jié)合在雙螺旋的一面?？梢韵胂?，它能“感覺到每個(gè)結(jié)合區(qū)的溝底中堿基所產(chǎn)生的特異形狀?！?/p>

（三）增強(qiáng)子（enhancer)★位于結(jié)構(gòu)基因附近，能夠增強(qiáng)該基因轉(zhuǎn)錄活性的一段DNA順序稱為增強(qiáng)子(enhancer)。

★增強(qiáng)子是另一類順式作用的DNA片段，可使基因轉(zhuǎn)錄的速率大大提高。

增強(qiáng)子的類型

①組織和細(xì)胞專一性增強(qiáng)子

許多增強(qiáng)子的增強(qiáng)效應(yīng)有很高的組織細(xì)胞專一性，只有在特定的轉(zhuǎn)錄因子(蛋白質(zhì))參與下，才能發(fā)揮其功能。②誘導(dǎo)性增強(qiáng)子

這種增強(qiáng)子的活性通常要有特定的啟動(dòng)子參與。

例如，金屬硫蛋白基因可以在多種組織細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄，又可受類固醇激素、鋅、鎘和生長因子等的誘導(dǎo)而提高轉(zhuǎn)錄水平。

增強(qiáng)子的特點(diǎn)

①增強(qiáng)子可提高同一條DNA鏈上基因轉(zhuǎn)錄效率，可以遠(yuǎn)距離作用，通常距離l～4kb，個(gè)別情況下離開所調(diào)控的基因30kb仍能發(fā)揮作用，而且在基因的上游或下游都能起作用。

②增強(qiáng)子作用與其序列的正反方向無關(guān)，將增強(qiáng)子方向倒置依然能起作用。而將啟動(dòng)子倒置就不能起作用，可見增強(qiáng)子與啟動(dòng)子是很不相同的。③增強(qiáng)子要有啟動(dòng)子才能發(fā)揮作用，沒有啟動(dòng)子存在，增強(qiáng)子不能表現(xiàn)其活性。但增強(qiáng)子對(duì)啟動(dòng)子沒有嚴(yán)格的專一性，同一增強(qiáng)子可以影響不同類型啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄。

④增強(qiáng)子必須與特定的蛋白質(zhì)因子結(jié)合后才能發(fā)揮增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄的作用。增強(qiáng)子一般具有組織或細(xì)胞特異性，許多增強(qiáng)子只在某些細(xì)胞或組織中表現(xiàn)活性，是由這些細(xì)胞或組織中具有的特異性蛋白質(zhì)因子所決定的。

例如，人類胰島素基因5’端上游約250個(gè)核苷酸處有一組織特異性增強(qiáng)子。在胰島素p細(xì)胞中有一種特異性蛋白因子，可以作用于這個(gè)區(qū)域，以增強(qiáng)胰島素基因的轉(zhuǎn)錄。在其他組織細(xì)胞中沒有這種蛋白因子，所以也就沒有此作用。

⑤大多為重復(fù)序列，一般長約50bp，適合與某些蛋白因子結(jié)合。其內(nèi)部常含有一個(gè)核心序列，即(G)TGGA／TA／TA／T(G)，是產(chǎn)生增強(qiáng)效應(yīng)時(shí)所必需的。

⑥許多增強(qiáng)子還受外部信號(hào)的調(diào)控，如金屬硫蛋白的基因啟動(dòng)區(qū)上游所帶的增強(qiáng)子，就可以對(duì)環(huán)境中的鋅、鎘濃度做出反應(yīng)。

增強(qiáng)子的作用機(jī)理

①增強(qiáng)子中有Z-DNA結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)的雙鏈間距離大于B-DNA，與蛋白質(zhì)的親和力更高一些，有利于轉(zhuǎn)錄。

②增強(qiáng)子中有DNA水解酶容易切斷的部位，可與一些轉(zhuǎn)錄因子蛋白形成復(fù)合物，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄。

③增強(qiáng)子可與核基質(zhì)結(jié)合形成結(jié)構(gòu)體，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄。

3．沉默子（Silencer）

Silencers are control regions of DNA that, like enhancers, may be located thousands of base pairs away from the gene they control.However, when transcription factors bind to them, expression of the gene they control is repressed.沉默子的特點(diǎn)

(1)可以在遠(yuǎn)距離作用于啟動(dòng)子

(2)對(duì)基因的阻遏作用沒有方向的限制，即無論其位于啟動(dòng)子的上游或下游均可阻遏啟動(dòng)子的表達(dá)

某些沉默子中含有骨架結(jié)合位點(diǎn)保守序列

沉默子與蛋白結(jié)合,通過蛋白之間的相互作用形成DNA環(huán)后與啟動(dòng)子作用，破壞起始復(fù)合物而抑制轉(zhuǎn)錄;

或者產(chǎn)生的DNA環(huán)發(fā)生了組蛋白的修飾和拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的變化,這種變化使關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子不能正確結(jié)合從而阻止轉(zhuǎn)錄

也可能沉默子和核基質(zhì)相互作用將轉(zhuǎn)錄單元固定于缺乏轉(zhuǎn)錄因子的亞顯微結(jié)構(gòu)

4.絕緣子(insulator)

絕緣子(insulator)長約幾百個(gè)核苷酸對(duì)，是通常位于啟動(dòng)子同正調(diào)控元件(增強(qiáng)子)或負(fù)調(diào)控因子(為異染色質(zhì))之間的一種調(diào)控序列。

絕緣子本身對(duì)基因的表達(dá)既沒有正效應(yīng)，也沒有負(fù)效應(yīng)，其作用只是不讓其他調(diào)控元件對(duì)基因的活化效應(yīng)或失活效應(yīng)發(fā)生作用。絕緣子的功能

①有序地裝置龐大的染色體DNA以及確保其中上萬種基因每一種都能在時(shí)空上正確無誤地表達(dá)。

絕緣子在這里起著關(guān)鍵的阻斷作用,保護(hù)啟動(dòng)子的功能不受其它異常增強(qiáng)子或其它激發(fā)信號(hào)的有害影響

②防止基因免受鄰近沉默信號(hào)的作用。這類沉默信號(hào)系來自細(xì)胞核的內(nèi)環(huán)境中遍布的大量致密染色質(zhì)的“擴(kuò)張”或“溢出”。

絕緣子的這種功能可以維持染色質(zhì)區(qū)域的分界以及保護(hù)基因座位的獨(dú)立性。

絕緣子的作用原理

①結(jié)構(gòu)域邊界模型(Domain boundary model,)

絕緣子能使它所限定的染色質(zhì)區(qū)域發(fā)生折疊成環(huán),促使該區(qū)域內(nèi)各種調(diào)節(jié)元件彼此相互作用,同時(shí)也阻止了不同區(qū)域調(diào)節(jié)元件之間互相影響。染色質(zhì)形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)域能對(duì)抗附近致密染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的擴(kuò)展。這樣一來,絕緣子能防止位置效應(yīng)也能得到合理的解釋。②“跟蹤”模型(“Tracking” model):

結(jié)合在增強(qiáng)子元件上的轉(zhuǎn)錄因子沿DNA鏈向它的目標(biāo)啟動(dòng)子追逐。此時(shí)絕緣子的特異結(jié)合蛋白在中途阻擋轉(zhuǎn)錄因子,使其不能抵達(dá)啟動(dòng)子區(qū)域。③轉(zhuǎn)錄誘捕模型(Transcription decoy model)

在絕緣子與其特異結(jié)合蛋白結(jié)合所形成的復(fù)合物可成為捕捉增強(qiáng)子的籠子,將增強(qiáng)子復(fù)合物吸引到其中而使之失去功能。

四、基因家族（gene family）

（一）基因家族的概念

1、基因家族：核苷酸序列或編碼產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)具有一定程度同源性的一組基因。由同一祖先基因進(jìn)化而來。

2、假基因（pseudogene）

在多基因家族中，某些成員并不能表達(dá)出有功能的產(chǎn)物，這些基因稱為假基因。

假基因與有功能的基因同源，原來可能也是有功能的基因，但由于缺失，倒位或點(diǎn)突變等，使這一基因失去活性，成為無功能基因。

與相應(yīng)的正?；蛳啾龋倩蛲鄙僬；虻膬?nèi)含子，兩側(cè)有順向重復(fù)序列。

人們推測(cè)，假基因的來源之一，可能是基因經(jīng)過轉(zhuǎn)錄后生成的RNA前體通過剪接失去內(nèi)含子形成mRNA，如果mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)cDNA，再整合到染色體DNA中去，便有可能成為假基因，因此該假基因是沒有內(nèi)含子的，在這個(gè)過程中，可能同時(shí)會(huì)發(fā)生缺失，倒位或點(diǎn)突變等變化，從而使假基因不能表達(dá)。

（二）、基因家族大致可分為兩類

1、一類是基因家族成簇地分布在某一條染色體上，它們可同時(shí)發(fā)揮作

用，合成某些蛋白質(zhì)，如組蛋白基因家族就成簇地集中在第7號(hào)染色體長臂3區(qū)2帶到3區(qū)6帶區(qū)域內(nèi)；

2、另一類是一個(gè)基因家族的不同成員成簇地分布 在不同的染色體上，這些不同成員編碼一組功能上緊密相關(guān)的蛋白質(zhì)，如珠蛋白基因家族

五、重復(fù)序列：高度重復(fù)序列 中度重復(fù)順序 單拷貝順序

（一）高度重復(fù)序列

高度重復(fù)序列在基因組中重復(fù)頻率高，可達(dá)百萬(106)以上，因此復(fù)性速度很快。

在基因組中所占比例隨種屬而異，約占10-60％，在人基因組中約占20％。

高度重復(fù)順序又按其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)分為三種。

1、倒位（反向）重復(fù)序列（inverted repeats）

反向重復(fù)序列由兩個(gè)相同順序的互補(bǔ)拷貝在同一DNA鏈上反向排列而成。約占人基因組的5％。

2、衛(wèi)星DNA

衛(wèi)星DNA(satelliteDNA)是另一類高度重復(fù)序列，這類重復(fù)順序的重復(fù)單位一般由2-10bp組成，成串排列。由于這類序列的堿基組成不同于其他部份，可用等密度梯度離心法將其與主體DNA分開，因而稱為衛(wèi)星DNA或隨體DNA。在人細(xì)胞組中衛(wèi)星DNA約占5-6％?！齑笮l(wèi)星DNA（macrosatellite DNA）§小衛(wèi)星DNA（minisatellite DNA）

§微衛(wèi)星DNA（microsatellite DNA）

3、較復(fù)雜的重復(fù)單位組成的重復(fù)順序

這種重復(fù)順序?yàn)殪`長類所獨(dú)有。用限制性內(nèi)切酶HindⅢ消化非洲綠猴DNA，可以得到重復(fù)單位為172bp的高度重復(fù)順序，這種順序大部份由交替變化的嘌呤和嘧啶組成。有人把這類稱為α衛(wèi)星DNA。而人的α衛(wèi)星DNA更為復(fù)雜，含有多順序家族。

4、高度重復(fù)順序的功能

⑴參與復(fù)制水平的調(diào)節(jié)反向序列常存在于DNA復(fù)制起點(diǎn)區(qū)的附近。另外，許多反向重復(fù)序列是一些蛋白質(zhì)（包括酶）和DNA的結(jié)合位點(diǎn)。

⑵參與基因表達(dá)調(diào)控DNA的重復(fù)順序可以轉(zhuǎn)錄到核內(nèi)不均一RNA分子中，而有些反向重復(fù)順序可以形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，這對(duì)穩(wěn)定RNA分子，免遭分解有重要作用

⑶參與轉(zhuǎn)位作用幾乎所有轉(zhuǎn)位因子的末端都包括反向重復(fù)順序，長度由幾個(gè)bp到1400bp。由于這種順序可以形成回文結(jié)構(gòu)，因此在轉(zhuǎn)位作用中即能連接非同源的基因，又可以被參與轉(zhuǎn)位的特異酶所識(shí)別。

⑷與進(jìn)化有關(guān) 不同種屬的高度重復(fù)順序的核苷酸序列不同，具有種屬特異性，但相近種屬又有相似性。如人的α衛(wèi)星DNA長度僅差1個(gè)堿基（前者為171bp，后者為172bp），而且堿基序列有65％是相同的，這表明它們來自共同的祖先。在進(jìn)化中某些特殊區(qū)段保守的，而其他區(qū)域的堿基序列則累積著變化。

⑸同一種屬中不同個(gè)體的高度重復(fù)順序的重復(fù)次數(shù)不一樣，這可以作為每一個(gè)體的特征，即DNA指紋。

（二）中度重復(fù)順序

中度重復(fù)序列大致指在真核基因組中重復(fù)數(shù)十至數(shù)萬（<105）次的重復(fù)順序。其復(fù)性速度快于單拷貝順序，但慢于高度重復(fù)順序。少數(shù)在基因組中成串排列在一個(gè)區(qū)域，大多數(shù)與單拷貝基因間隔排列。依據(jù)重復(fù)順序的長度，中度重復(fù)順序可分為兩種類型。（1）短分散片段

（short interspersed repeated segments, SINES）這類重復(fù)順序的平均長度約為300bp（〈500bp），它們與平均長度約為1000bp的單拷貝順序間隔排列?？截悢?shù)可達(dá)10萬左右。如Alu家族，Hinf

家族等屬于這種類型的中度重復(fù)序列（2）長分散片段

（Long interspersed repeated segments, LINES）

這類重復(fù)順序的長度大于1000bp，平均長度為3500-5000bp，它們與平均長度為13000bp（個(gè)別長幾萬bp）的單拷貝順序間隔排列。

也有的實(shí)驗(yàn)顯示人基因組中所有LINES之間的平均距離為2.2kb,拷貝數(shù)一般在1萬左右，如KpnⅠ家族等。

中度重復(fù)順序在基因組中所占比例在不同種屬之間差異很大，一般約占10-40％，在人約為12％。這些順序大多不編碼蛋白質(zhì)。這些非編碼的中度重復(fù)順序的功能可能類似于高度重復(fù)順序。

在結(jié)構(gòu)基因之間，基因簇中，以及內(nèi)含子內(nèi)都可以見到這些短的和長的中度重復(fù)順序。如HLA基因，rRNA基因，tRNA基因,組蛋白基因,免疫球蛋白基因等。

中度重復(fù)順序一般具有種屬特異性；在適當(dāng)?shù)那闆r下，可以應(yīng)用它們作為探針區(qū)分不同種哺乳動(dòng)物細(xì)胞的DNA。下面介紹幾種典型的中度重復(fù)順序。

Alu家族是哺乳動(dòng)物包括人基因組中含量最豐富的一種中度重復(fù)順序家族，在單倍體人基因組中重復(fù)達(dá)30萬-50萬次，約占人基因組的3-6％。Alu家族每個(gè)成員的長度約300bp，由于每個(gè)單位長度中有一個(gè)限制性內(nèi)切酶Alu的切點(diǎn)（AG↓CT）從而將其切成長130和170bp的兩段，因而定名為Alu序列（或Alu家族）。

Alu序列分散在整個(gè)人體或其他哺乳動(dòng)物基因組中，在間隔DNA，內(nèi)含子中都發(fā)現(xiàn)有Alu序列，平均每5kbDNA就有一個(gè)Alu順序。

KpnⅠ家族是中度重復(fù)順序中僅次于Alu家族的第二大家族。用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ消化人類及其它靈長類動(dòng)物的DNA，在電泳譜上可以看到4個(gè)不同長度的片段，分別為1.2,1.5,1.8和1.9kb，這就是所謂的KpnⅠ家族。

KpnⅠ家族成員順序比Alu家族更長（如人KpnⅠ順序長6.4kb），而且更加不均一，呈散在分布，屬于中度重復(fù)順序的長分散片段型。

盡管不同長度類型的KpnⅠ家族（稱為亞類，subfamily）之間同源性比較小，不能互相雜交，但它們的3'端有廣泛的同源性。KpnⅠ家族的拷貝數(shù)約為3000￣4800個(gè)，占人體基因組的1％,與散在分布的Alu家族相似，KpnⅠ家族中至少有一部份也是通過KpnⅠ順序的RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的cDNA拷貝的重新插入到人基因組DNA中而產(chǎn)生的。

Hinf家族：

這一家族以319bp長度的串聯(lián)重復(fù)存在于人體基因組中。用限制性內(nèi)切酶HinfⅠ消化人體DNA，可以分離到這一片段。Hinf家族在單位基因組內(nèi)約有50 100個(gè)拷貝，分散在不同的區(qū)域。319bp單位可以再分成兩個(gè)亞單位，分別為172bp和147bp,它們之間有70%的同源性。

rRNA基因：在原核生物如大腸桿菌基因組中，rRNA基因一共是七套；在真核生物中rRNA基因的重復(fù)次數(shù)更多。在真核生物基因組中18S和28S,rRNA基因是在同一轉(zhuǎn)錄單位中，低等的真核生物如酵母中，5SrRNA也和18S,28SrRNA在同一轉(zhuǎn)錄單位中；

而在高等生物中，5SrRNA是單獨(dú)轉(zhuǎn)錄的，而且其在基因組中的重復(fù)次數(shù)高于18S和28S基因。和一般的中度重復(fù)順序不一樣，各重復(fù)單位中的rRNA基因都是相同的。

rRNA基因通常集中成簇存在，而不是分散于基因組中，這樣的區(qū)域稱為rDNA，如染色體的核仁組織區(qū)（nucleolus organizer region）即為rDNA區(qū)。

（三）單拷貝順序

單拷貝順序在單倍體基因組中只出現(xiàn)一次或數(shù)次，因而復(fù)性速度很慢。單拷貝順序在基因組中占50-80％，如人基因組中，大約有60-65％的順序?qū)儆谶@一類。單拷貝順序中儲(chǔ)存了巨大的遺傳信息，編碼各種不同功能的蛋白質(zhì)。

六、真核生物基因組的特點(diǎn)

1.真核生物基因組DNA與蛋白質(zhì)結(jié)合形成染色體，儲(chǔ)存于細(xì)胞核內(nèi)，除配子細(xì)胞外，體細(xì)胞內(nèi)的基因的基因組是雙份的（即雙倍體,diploid），即有兩份同源的基因組。

2.真核細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為單順反子。一個(gè)結(jié)構(gòu)基因經(jīng)過轉(zhuǎn)錄和翻譯生成一個(gè)mRNA分子和一條多肽鏈。

3.存在重復(fù)序列，重復(fù)次數(shù)可達(dá)百萬次以上。4.基因組中不編碼的區(qū)域多于編碼區(qū)域。

5.大部分基因含有內(nèi)含子，因此，基因是不連續(xù)的。

6.基因組遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于原核生物的基因組，具有許多復(fù)制起點(diǎn)，而每個(gè)復(fù)制子的長度較小

重疊基因有以下幾種情況

（1）一個(gè)基因完全在另一個(gè)基因里面。如基因Ａ和Ｂ是兩個(gè)不同基因，而Ｂ包含在基因Ａ內(nèi)。同樣，基因Ｅ在基因Ｄ內(nèi)。（2）部分重疊。（3）兩個(gè)基因只有一個(gè)堿基重疊。

八、原核生物基因組的結(jié)構(gòu)和功能

（1）基因組通常僅由一條環(huán)狀雙鏈DNA 分子組成。

（2）具有操縱子結(jié)構(gòu)，即數(shù)個(gè)功能相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因串聯(lián)在一起，受同一個(gè)調(diào)節(jié)區(qū)的調(diào)節(jié)。數(shù)個(gè)操縱子還可以由一個(gè)共同的調(diào)節(jié)基因（regulatorygene）即調(diào)節(jié)子（regulon）所調(diào)控。

（3）在大多數(shù)情況下，結(jié)構(gòu)基因在細(xì)菌基因組中都是單拷貝，但是編碼rRNA的基因rDNA往往是多拷貝的,這樣可能有利于核糖體的快速組裝，便于在急需蛋白質(zhì)合成時(shí)細(xì)胞可以在短時(shí)間內(nèi)有大量核糖體生成。

（4）和病毒的基因組相似，不編碼的DNA部份所占比例比真核細(xì)胞基因組少得多。

（5）具有編碼同工酶的同基因（isogene）例如，在大腸桿菌基因組中有兩個(gè)編碼分支酸（chorismicacid）變位酶的基因，兩個(gè)編碼乙酰乳酸（acetolactate）合成酶的基因。

（6）和病毒基因組不同的是，在細(xì)菌基因組中編碼順序一般不會(huì)重疊，即不會(huì)出現(xiàn)基因重疊現(xiàn)象。

（7）在DNA分子中具有各種功能的識(shí)別區(qū)域如復(fù)制起始區(qū)OriC，復(fù)制終止區(qū)TerC,轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)區(qū)和終止區(qū)等。這些區(qū)域往往具有特殊的順序，并且含有反向重復(fù)順序。

（8）在基因或操縱子的終末往往具有特殊的終止順序,它可使轉(zhuǎn)錄終止和RNA聚合酶從DNA鏈上脫落。

例如大腸桿菌色氨酸操縱子后尾含有40bp的GC豐富區(qū)，其后緊跟AT豐富區(qū)，這就是轉(zhuǎn)錄終止子的結(jié)構(gòu)。

終止子有強(qiáng)、弱之分，強(qiáng)終止子含有反向重復(fù)順序，可形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，其后面為polyT結(jié)構(gòu)，這樣的終止子無需終止蛋白參與即可以使轉(zhuǎn)錄終止。而弱終止子盡管也有反向重復(fù)序列，但無polyT結(jié)構(gòu)，需要有終止蛋白參與才能使轉(zhuǎn)錄終止。

Lecture 3 DNA replication 第一節(jié) DNA的復(fù)制

一、DNA復(fù)制的基本特點(diǎn)

（一）復(fù)制的起始點(diǎn)和方向

★復(fù)制起始點(diǎn)：復(fù)制是從DNA分子上的特定部位開始的，這一部位叫做復(fù)制起始點(diǎn)(origin of replication)常用ori或o表示

★復(fù)制子： replicon DNA復(fù)制從起始點(diǎn)開始直到終點(diǎn)為止，每個(gè)這樣的DNA單位稱為復(fù)制子或復(fù)制單元

★復(fù)制叉：在復(fù)制開始時(shí)，復(fù)制起始點(diǎn)出呈現(xiàn)一叉形結(jié)構(gòu)，稱為復(fù)制叉（replication fork）

1、復(fù)制起始點(diǎn)：

DNA復(fù)制起始點(diǎn)有結(jié)構(gòu)上的特殊性。這些特殊的結(jié)構(gòu)對(duì)于在DNA復(fù)制起始過程中參與的酶和許多蛋白質(zhì)分子的識(shí)別和結(jié)合都是必須的?！齑竽c桿菌染色體DNA復(fù)制起始點(diǎn)Oric由422個(gè)核苷酸組成，是一系列對(duì)稱排列的反向重復(fù)序列，即回文結(jié)構(gòu)(palindrome)，其中有9個(gè)核苷酸或13個(gè)核苷酸組成的保守序列，這些部位是大腸桿菌中DnaA蛋白識(shí)別的位置

2、DNA復(fù)制的方向

(1)定點(diǎn)開始雙向復(fù)制：這是原核生物和真核生物DNA復(fù)制最主要的形式，從一個(gè)特定位點(diǎn)解鏈，沿著兩個(gè)相反的方向各生長出兩條鏈，形成一個(gè)復(fù)制泡。

(2)定點(diǎn)開始單向復(fù)制：質(zhì)粒colE1是個(gè)典型的例子，復(fù)制從一個(gè)起始點(diǎn)開始，以同一方向生長出兩條鏈，形成一個(gè)復(fù)制

(3)兩點(diǎn)開始單向復(fù)制：腺病毒DNA的復(fù)制是從兩個(gè)起點(diǎn)開始的，形成兩個(gè)復(fù)制叉，各以一個(gè)單一方向復(fù)制出一條新鏈。

二、復(fù)制的基本方式

(一)DNA的半保留復(fù)制(semiconservative replication)

（二）半不連續(xù)復(fù)制 前導(dǎo)鏈(leading strand)：在以3′→5′方向的母鏈為模板時(shí)，復(fù)制合成出一條5′→3′方向的前導(dǎo)鏈，前導(dǎo)鏈的前進(jìn)方向與復(fù)制叉打開方向是一致的，因此前導(dǎo)鏈的合成是連續(xù)進(jìn)行的 隨從鏈(lagging strand)：另一條母鏈DNA是5′→3′方向，它作為模板時(shí)，復(fù)制合成許多條5′→3′方向的短鏈，叫做隨從鏈，隨從鏈的前進(jìn)方向是與復(fù)制叉的打開方向相反的。

隨從鏈只能先以片段的形式合成，這些片段就叫做崗崎片段(Okazaki fragments)，原核生物崗崎片段含有1000-2000核苷酸，真核生物一般10000核苷酸。最后再將多個(gè)崗崎片段連接成一條完整的鏈。

由于前導(dǎo)鏈的合成是連續(xù)進(jìn)行的，而隨從鏈的合成是不連續(xù)進(jìn)行的，所以從總體上看DNA的復(fù)制是半不連續(xù)復(fù)制

三、復(fù)制過程

（一）DNA復(fù)制的起始階段

1、DNA復(fù)制起始引發(fā)體的形成及所參與的酶和蛋白質(zhì)

⑴解鏈酶(helicase)：解鏈酶的作用就是打開DNA雙鏈之間的氫鍵。

大腸桿菌中DnaB蛋白就有解鏈酶活性，與隨從鏈的模板DNA結(jié)合，沿5′→3′方向移動(dòng)，還有一種叫做Rep蛋白和前導(dǎo)鏈的模板DNA結(jié)合沿3′→5′方向移動(dòng)。

⑵.單鏈結(jié)合蛋白：(single strand binding proteins, SSBP)

它與解開的單鏈DNA結(jié)合，使其穩(wěn)定不會(huì)再度螺旋化并且避免核酸內(nèi)切酶對(duì)單鏈DNA的水解，保證了單鏈DNA做為模板時(shí)的伸展?fàn)顟B(tài)，SSBP可以重復(fù)利用。

⑶ 引發(fā)體的形成

DNA復(fù)制起始的關(guān)健步驟是前導(dǎo)鏈DNA的合成，一旦前導(dǎo)鏈DNA的聚合作用開始，隨從鏈DNA的合成也隨著開始。由于前導(dǎo)鏈的合成是連續(xù)進(jìn)行的，所以它的起始相對(duì)簡(jiǎn)單，而隨從鏈的合成是不連續(xù)進(jìn)行的，所以引發(fā)階段比較復(fù)雜。大腸桿菌的引發(fā)前體由Dna B.Dna C和單鏈結(jié)合蛋白組成。★引物酶(primase)它是一種特殊的RNA聚合酶，可催化短片段RNA的合成。這種短RNA片段一般十幾個(gè)至數(shù)十個(gè)核苷酸不等，它們?cè)贒NA復(fù)制起始處做為引物。RNA引物的3′OH末端提供了由DNA聚合酶催化形成DNA分子第一個(gè)磷酸二酯鍵的位置

★引發(fā)體(primosome)高度解鏈的模板DNA與多種蛋白質(zhì)因子形成的引發(fā)前體促進(jìn)引物酶結(jié)合上來，共同形成引發(fā)體，引發(fā)體主要在DNA隨從鏈上開始，它連續(xù)地與引物酶結(jié)合并解離，從而在不同部位引導(dǎo)引物酶催化合成RNA引物，在引物RNA的3′OH末端接下去合成DNA片段，這就是隨從鏈不連續(xù)合成的開始。

（二）DNA復(fù)制的延長階段以及參與的酶和蛋白質(zhì)分子

1、DNA的聚合反應(yīng)和DNA聚合酶

★DNA聚合酶Ⅰ（DNA polymerse Ⅰ）：

DNA polⅠ是由一條多肽鏈組成，分子量為109KD。酶分子中含有一個(gè)Zn++，是聚合活性必須的。

(1)DNA聚合酶Ⅰ的5′→3′聚合活性 這是DNA聚合酶最主要的活性，按模板DNA上的核苷酸順序，將互補(bǔ)的dNTP逐個(gè)加到引物RNA3′-OH末端，并促進(jìn)3′-OH與dNTP的5′-OH形成磷酸二酯鍵，酶的專一性表現(xiàn)為新進(jìn)入的dNTP必須與模板DNA堿基配對(duì)時(shí)才有催化作用。

(2)DNA聚合酶Ⅰ的3′→5′外切核酸酶活性

這種酶活性的主要功能是從3′→5′方向識(shí)別并切除DNA生長鏈末端與模板DNA不配對(duì)而游離的核苷酸，這種功能稱為校對(duì)功能，這是保證其聚合作用的正確性不可缺少的，因此對(duì)于DNA復(fù)制中極高的保真性是至關(guān)重要的。

(3)DNA聚合酶Ⅰ的5′→3′外切核酸酶活性

這種酶活性是從DNA鏈的5′端向3′末端水解已配對(duì)的核苷酸，本質(zhì)是切斷磷酸二酯鍵，每次能切除10個(gè)核苷酸。因此，這種酶活性在DNA損傷的修復(fù)中可能起重要作用，對(duì)完成的DNA片段去除5′端的RNA引物也是必須的。

DNA polⅠ并不是DNA復(fù)制過程中的主要酶，它的作用主要與DNA損傷后的修復(fù)有關(guān)。

DNA聚合酶Ⅱ(DNA polⅡ）

分子量為120KD，每個(gè)細(xì)胞約有100個(gè)酶分子，但活性只有DNA polⅠ的5%，它具有5′→3′聚合活性和3′→5′外切活性，而沒有5′→3′外切活性，它的作用可能與DNA損傷修復(fù)有關(guān)。DNA聚合酶Ⅲ(DNA polⅢ）

這是在DNA復(fù)制過程中起主要作用的聚合酶，它是由一個(gè)多亞基組成的蛋白質(zhì)分子，其分子量＞600kDa整個(gè)酶分子形成一個(gè)不對(duì)稱的二聚體 DNA聚合酶Ⅲ全酶并不是單獨(dú)起作用的，而是與引發(fā)體，解鏈酶等構(gòu)成一個(gè)復(fù)制體。由于復(fù)制體的存在，先導(dǎo)鏈和隨從鏈可以同時(shí)復(fù)制。DNA polⅢ是由多亞基組成的不對(duì)稱二聚體，它可能同時(shí)負(fù)責(zé)先導(dǎo)鏈和隨從鏈的復(fù)制

2、與超螺旋松馳有關(guān)的酶

拓?fù)洚悩?gòu)酶(topoisomerase)是一類改變DNA拓?fù)湫再|(zhì)的酶。

在體外可催化DNA的各種拓?fù)洚悩?gòu)化反應(yīng)，而在生物體內(nèi)它們可能參與了DNA的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄。

在DNA復(fù)制時(shí)，復(fù)制叉行進(jìn)的前方DNA分子部分產(chǎn)生有正超螺旋，拓?fù)涿缚伤神Y超螺旋，有利于復(fù)制叉的前進(jìn)及DNA的合成。

DNA復(fù)制完成后，拓?fù)涿赣挚蓪NA分子引入超螺旋，使DNA纏繞、折疊，壓縮以形成染色質(zhì)。

DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶有Ⅰ型和Ⅱ型，它們廣泛存在于原核生物及真核生物中。

拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ(TopoⅠ)的主要作用

將環(huán)狀雙鏈DNA的一條鏈切開一個(gè)口，切口處鏈的末端繞螺旋軸按照松馳超螺旋的方向轉(zhuǎn)動(dòng)，然后再將切口封起來。這就使DNA復(fù)制叉移動(dòng)時(shí)所引起的前方DNA正超螺旋得到緩解，利于DNA復(fù)制叉繼續(xù)向前打開。

對(duì)環(huán)狀單鏈DNA還有打結(jié)或解結(jié)作用，對(duì)環(huán)狀雙鏈DNA的環(huán)連或解連以及使環(huán)狀單鏈DNA形成環(huán)狀雙鏈DNA都有作用

拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ(TopoⅡ)的主要作用

是在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)的，曾被稱為旋轉(zhuǎn)酶(gyrase)，它們作用特點(diǎn)是切開環(huán)狀雙鏈DNA的兩條鏈，分子中的部分經(jīng)切口穿過而旋轉(zhuǎn)，然后封閉切口。還可使DNA分子從超螺旋狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)樗神Y狀態(tài)，此反應(yīng)不需要ATP參與。DNA復(fù)制完成后，TopoⅡ在ATP參與下，DNA分子從松馳狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)樨?fù)超螺旋。

催化的拓?fù)洚悩?gòu)化反應(yīng)還有環(huán)連或解環(huán)連，以及打結(jié)或解結(jié)。

DNA連接酶(DNA ligase)作用：消耗ATP，將隨從鏈中相鄰的兩個(gè)DNA片段連接起來

催化同一模板DNA鏈上的兩個(gè)相鄰DNA片段的3＇端與5＇端間形成磷酸二酯鍵，把相鄰的兩段DNA連成完整的鏈

（三）DNA復(fù)制的終止階段

DNA在復(fù)制過程中，合成出的前導(dǎo)鏈為一條連續(xù)的長鏈。隨從鏈則是由合成出許多相鄰的片段，在連接酶的催化下，連接成為一條長鏈。連接作用是在連接酶催化下進(jìn)行的。

DNA復(fù)制的過程 延長:

DNA-pol Ⅲ(DDDP-Ⅲ)的5? → 3?的聚合活性使核苷酸之間生成3?，5?磷酸二酯鍵

模板 以DNA單鏈為模板

底物 dNTP（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）

引物 以小片段RNA為引物，在 RNA引物的 3?-OH末端上開始逐個(gè)添加dNTP

按堿基配對(duì)原則（A = T G ≡ C）按5? → 3? 方向

第二節(jié) 真核生物DNA復(fù)制的特點(diǎn) 1.復(fù)制起始點(diǎn)及方向

與原核生物不同，真核生物DNA復(fù)制有許多起始點(diǎn)，例如酵母S.cerevisiae的17號(hào)染色體約有400個(gè)起始點(diǎn)，因此，雖然真核生物DNA復(fù)制的速度(60核苷酸/每秒鐘)比原核生物DNA復(fù)制的速度(E.coli 1700核苷酸/每秒鐘)慢得多，但復(fù)制完全部基因組DNA也只要幾分鐘的時(shí)間。2.在真核生物DNA復(fù)制叉處，需要兩種不同的酶。DNA聚合酶α(polα)和DNA聚合酶δ(polδ)

polα和引物酶緊密結(jié)合，在DNA模板上先合成RNA引物，再由polα延長DNA鏈，這種活性還要復(fù)制因子C參與。

同時(shí)結(jié)合在引物模板上的PCNA，此時(shí)釋放了polα，然后由polδ結(jié)合到生長鏈3′末端，并與PCNA結(jié)合，繼續(xù)合成前導(dǎo)鏈。

而隨從鏈的合成靠polα緊密與引物酶結(jié)合并在復(fù)制因子C幫助下，合成崗崎片段

3、末端復(fù)制與端粒酶 端區(qū)(telomeres)由于真核生物染色體是線性DNA，它的兩端叫做端區(qū)(telomeres)，端區(qū)是由重復(fù)的寡核苷酸序列構(gòu)成的。

由于隨從鏈?zhǔn)且砸环N不連續(xù)的形式合成崗崎片段，所以不能完成線性染色體末端的復(fù)制，如果這個(gè)問題不解決，真核生物在細(xì)胞分裂時(shí)DNA復(fù)制將產(chǎn)生5′末端隱縮，使DNA縮短。端粒酶(telomerase)由蛋白質(zhì)和RNA兩部分組成的，它以自身的RNA為模板，在隨從鏈模板DNA的3′OH末端延長DNA，再以這種延長的DNA為模板，繼續(xù)合成隨從鏈。第三節(jié) DNA損傷與修復(fù)

一、DNA的損傷

(一)DNA損傷的原因 1.DNA分子的自發(fā)性損傷

2.物理因素引起的DNA損傷

3.化學(xué)因素引起的DNA損傷 1.DNA分子的自發(fā)性損傷(1)DNA復(fù)制中的錯(cuò)誤

堿基配對(duì)的錯(cuò)誤頻率約為10-1－10-2 在DNA復(fù)制酶的作用下堿基錯(cuò)誤配對(duì)頻率降到約10-5－10-6 DNA聚合酶還會(huì)暫停催化作用，以其3′－5′外切核酸酶的活性切除錯(cuò)誤接上的核苷酸，然后再繼續(xù)正確的復(fù)制但校正后的錯(cuò)配率仍約在10-10左右.(2)DNA的自發(fā)性化學(xué)變化

a.堿基的異構(gòu)互變

DNA中的4種堿基各自的異構(gòu)體間都可以自發(fā)地相互變化(例如烯醇式與酮式堿基間的互變)，這種變化就會(huì)使堿基配對(duì)間的氫鍵改變，可使腺嘌呤能配上胞嘧啶、胸腺嘧啶能配上鳥嘌呤等，如果這些配對(duì)發(fā)生在DNA復(fù)制時(shí)，就會(huì)造成子代DNA序列與親代DNA不同的錯(cuò)誤性損傷 b.堿基的脫氨基作用

堿基的環(huán)外氨基有時(shí)會(huì)自發(fā)脫落，從而胞嘧啶會(huì)變成尿嘧啶、腺嘌呤會(huì)變成次黃嘌呤(H)、鳥嘌呤會(huì)變成黃嘌呤(X)等，遇到復(fù)制時(shí)，U與A配對(duì)、H和X都與C配對(duì)就會(huì)導(dǎo)致子代DNA序列的錯(cuò)誤變化。胞嘧啶自發(fā)脫氨基的頻率約為每個(gè)細(xì)胞每天190個(gè)。c.脫嘌呤與脫嘧啶

自發(fā)的水解可使嘌呤和嘧啶從DNA鏈的核糖磷酸骨架上脫落下來。一個(gè)哺乳類細(xì)胞在37℃條件下，20h內(nèi)DNA鏈上自發(fā)脫落的嘌呤約1000個(gè)、嘧啶約500個(gè) 估計(jì)一個(gè)長壽命不復(fù)制繁殖的哺乳類細(xì)胞(如神經(jīng)細(xì)胞)在整個(gè)生活期間自發(fā)脫嘌呤數(shù)約為108，約占細(xì)胞DNA中總嘌呤數(shù)的3%。d.堿基修飾與鏈斷裂

細(xì)胞呼吸的副產(chǎn)物O2、H2O2等會(huì)造成DNA損傷，能產(chǎn)生胸腺嘧啶乙二醇、羥甲基尿嘧啶等堿基修飾物，還可能引起DNA單鏈斷裂等損傷，每個(gè)哺乳類細(xì)胞每天DNA單鏈斷裂發(fā)生的頻率約為5萬次。此外，體內(nèi)還可以發(fā)生DNA的甲基化，結(jié)構(gòu)的其他變化等，這些損傷的積累可能導(dǎo)致老化。

2.物理因素引起的DNA損傷

(1)紫外線引起的DNA損傷

DNA分子損傷最早就是從研究紫外線的效應(yīng)開始的。當(dāng)DNA受到最易被其吸收波長(～260nm)的紫外線照射時(shí)，主要是使同一條DNA鏈上相鄰的嘧啶以共價(jià)鍵連成二聚體，相鄰的兩個(gè)T、或兩個(gè)C、或C與T間都可以環(huán)丁基環(huán)(cyclobutane ring)連成二聚體，其中最容易形成的是TT二聚體

(2)電離輻射引起的DNA損傷

電離輻射損傷DNA有直接和間接的效應(yīng)，直接效應(yīng)是DNA直接吸收射線能量而遭損傷，間接效應(yīng)是指DNA周圍其他分子(主要是水分子)吸收射線能量產(chǎn)生具有很高反應(yīng)活性的自由基進(jìn)而損傷DNA。電離輻射可導(dǎo)致DNA分子的多種變化： a.堿基變化

主要是由OH－自由基引起，包括DNA鏈上的堿基氧化修飾、過氧化物的形成、堿基環(huán)的破壞和脫落等。一般嘧啶比嘌呤更敏感。b.脫氧核糖變化

脫氧核糖上的每個(gè)碳原子和羥基上的氫都能與OH－反應(yīng)，導(dǎo)致脫氧核糖分解，最后會(huì)引起DNA鏈斷裂。c.DNA鏈斷裂

單鏈斷裂:DNA雙鏈中一條鏈斷裂稱單鏈斷裂(single strand broken)雙鏈斷裂:DNA雙鏈在同一處或相近處斷裂稱為雙鏈斷裂(doublestrand broken)。

雖然單鏈斷裂發(fā)生頻率為雙鏈斷裂的10-20倍，但還比較容易修復(fù)；對(duì)單倍體細(xì)胞來說(如細(xì)菌)一次雙鏈斷裂就是致死事件。

d.交聯(lián) 同一條DNA鏈上或兩條DNA鏈上的堿基間可以共價(jià)鍵結(jié)合 DNA與蛋白質(zhì)之間也會(huì)以共價(jià)鍵相連，組蛋白、染色質(zhì)中的非組蛋白、調(diào)控蛋白、與復(fù)制和轉(zhuǎn)錄有關(guān)的酶都會(huì)與DNA共價(jià)鍵連接。這些交聯(lián)是細(xì)胞受電離輻射后在顯微鏡下看到的染色體畸變的分子基礎(chǔ)，會(huì)影響細(xì)胞的功能和DNA復(fù)制。

3.化學(xué)因素引起的DNA損傷(1)烷化劑對(duì)DNA的損傷

烷化劑是一類親電子的化合物，很容易與生物體中大分子的親核位點(diǎn)起反應(yīng)。烷化劑的作用可使DNA發(fā)生各種類型的損傷： a.堿基烷基化

烷化劑很容易將烷基加到DNA鏈中嘌呤或嘧啶的N或O上，其中鳥嘌呤的N7和腺嘌呤的N3最容易受攻擊，烷基化的嘌呤堿基配對(duì)會(huì)發(fā)生變化，例如鳥嘌呤N7被烷化后就不再與胞嘧啶配對(duì)，而改與胸腺嘧啶配對(duì)，結(jié)果會(huì)使G－C轉(zhuǎn)變成A－T。b.堿基脫落

烷化鳥嘌呤的糖苷鍵不穩(wěn)定，容易脫落形成DNA上無堿基的位點(diǎn)，復(fù)制時(shí)可以插入任何核苷酸，造成序列的改變。c.斷鏈

DNA鏈的磷酸二酯鍵上的氧也容易被烷化，結(jié)果形成不穩(wěn)定的磷酸三酯鍵，易在糖與磷酸間發(fā)生水解，使DNA鏈斷裂。d.交聯(lián)

烷化劑有兩類

單功能基烷化劑，如甲基甲烷碘酸，只能使一個(gè)位點(diǎn)烷基化；

雙功能基烷化劑，化學(xué)武器如氮芥、硫芥等，一些抗癌藥物如環(huán)磷酰胺、苯丁酸氮芥、絲裂霉素等，某些致癌物如二乙基亞硝胺等均屬此類，其兩個(gè)功能基可同時(shí)使兩處烷基化，結(jié)果就能造成DNA鏈內(nèi)、DNA鏈間，以及DNA與蛋白質(zhì)間的交聯(lián)。

(2)堿基類似物、修飾劑對(duì)DNA的損傷 人工可以合成一些堿基類似物用作促突變劑或抗癌藥物，如5－溴尿嘧啶(5－BU)、5－氟尿嘧啶(5－FU)、2－氨基腺嘌呤(2－AP)等。由于其結(jié)構(gòu)與正常的堿基相似，進(jìn)入細(xì)胞能替代正常的堿基參入到DNA鏈中而干擾DNA復(fù)制合成，例如5－BU結(jié)構(gòu)與胸腺嘧啶十分相近，在酮式結(jié)構(gòu)時(shí)與A配對(duì)，卻又更容易成為烯醇式結(jié)構(gòu)與G配對(duì)，在DNA復(fù)制時(shí)導(dǎo)致A－T轉(zhuǎn)換為G－C。(二)DNA損傷的后果

1.點(diǎn)突變(point mutation)

指DNA上單一堿基的變異。嘌呤替代嘌呤(A與G之間的相互替代)、嘧啶替代嘧啶(C與T之間的替代)稱為轉(zhuǎn)換(transition)；嘌呤變嘧啶或嘧啶變嘌呤則稱為顛換(transvertion)。2.缺失(deletion)

指DNA鏈上一個(gè)或一段核苷酸的消失。3.插入(insertion)

指一個(gè)或一段核苷酸插入到DNA鏈中。在為蛋白質(zhì)編碼的序列中如缺失及插入的核苷酸數(shù)不是3的整倍數(shù)，則發(fā)生讀框移動(dòng)(reading frame shift)，使其后所譯讀的氨基酸序列全部混亂，稱為移碼突變 4.倒位或轉(zhuǎn)位(transposition)

指DNA鏈重組使其中一段核苷酸鏈方向倒置、或從一處遷移到另一處。 5.雙鏈斷裂

已如前述，對(duì)單倍體細(xì)胞一個(gè)雙鏈斷裂就是致死性事件。突變或誘變對(duì)生物可能產(chǎn)生4種后果 ①致死性；

②喪失某些功能；

③改變基因型而不改變表現(xiàn)型

④發(fā)生了有利于物種生存的結(jié)果，使生物進(jìn)化。

二、DNA修復(fù)(一)回復(fù)修復(fù)

1.光修復(fù)

這是最早發(fā)現(xiàn)的DNA修復(fù)方式。

修復(fù)是由細(xì)菌中的DNA光解酶(photolyase)完成，此酶能特異性識(shí)別紫外線造成的核酸鏈上相鄰嘧啶共價(jià)結(jié)合的二聚體，并與其結(jié)合，這步反應(yīng)不需要光；結(jié)合后如受300－600nm波長的光照射，則此酶就被激活，將二聚體分解為兩個(gè)正常的嘧啶單體，然后酶從DNA鏈上釋放，DNA恢復(fù)正常結(jié)構(gòu)。后來發(fā)現(xiàn)類似的修復(fù)酶廣泛存在于動(dòng)植物中，人體細(xì)胞中也有發(fā)現(xiàn)。2.單鏈斷裂的重接

DNA單鏈斷裂是常見的損傷，其中一部分可僅由DNA連接酶(ligase)參與而完全修復(fù)。此酶在各類生物各種細(xì)胞中都普遍存在，修復(fù)反應(yīng)容易進(jìn)行。但雙鏈斷裂幾乎不能修復(fù)。3.堿基的直接插入

DNA鏈上嘌呤的脫落造成無嘌呤位點(diǎn)，能被DNA嘌呤插入酶(insertase)識(shí)別結(jié)合，在K＋存在的條件下，催化游離嘌呤或脫氧嘌呤核苷插入生成糖苷鍵，且催化插入的堿基有高度專一性、與另一條鏈上的堿基嚴(yán)格配對(duì)，㈡ 轉(zhuǎn)錄模板

對(duì)于不同的基因來說，其轉(zhuǎn)錄信息可以存在于兩條不同的DNA鏈上。能夠轉(zhuǎn)錄RNA的那條DNA鏈稱為有意義鏈(模板鏈）而與之互補(bǔ)的另一條DNA鏈稱為反意義鏈（編碼鏈）。使DNA完全恢復(fù)。4.烷基的轉(zhuǎn)移

在細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)有一種O6甲基鳥嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶，能直接將甲基從DNA鏈鳥嘌呤O6位上的甲基移到蛋白質(zhì)的半胱氨酸殘基上而修復(fù)損傷的DNA。這個(gè)酶的修復(fù)能力并不很強(qiáng)，但在低劑量烷化劑作用下能誘導(dǎo)出此酶的修復(fù)活性。

(二)切除修復(fù)(excision repair)①首先由核酸酶識(shí)別DNA的損傷位點(diǎn)，在損傷部位的5′側(cè)切開磷酸二酯鍵。不同的DNA損傷需要不同的特殊核酸內(nèi)切酶來識(shí)別和切割。②由5′→3′核酸外切酶將有損傷的DNA片段切除。

③在DNA聚合酶的催化下，以完整的互補(bǔ)鏈為模板，按5′→3′方向DNA鏈，填補(bǔ)已切除的空隙

④由DNA連接酶將新合成的DNA片段與原來的DNA斷鏈連接起來。這樣完成的修復(fù)能使DNA恢復(fù)原來的結(jié)構(gòu)。

（三)重組修復(fù)(recombinational repair)受損傷的DNA鏈復(fù)制時(shí)，產(chǎn)生的子代DNA在損傷的對(duì)應(yīng)部位出現(xiàn)缺口。另一條母鏈DNA與有缺口的子鏈DNA進(jìn)行重組交換，將母鏈DNA上相應(yīng)的片段填補(bǔ)子鏈缺口處，而母鏈DNA出現(xiàn)缺口 以另一條子鏈DNA為模板，經(jīng)DNA聚合酶催化合成一新DNA片段填補(bǔ)母鏈DNA的缺口，最后由DNA連接酶連接，完成修補(bǔ)。

重組修復(fù)不能完全去除損傷，損傷的DNA段落仍然保留在親代DNA鏈上，只是重組修復(fù)后合成的DNA分子是不帶有損傷的，但經(jīng)多次復(fù)制后，損傷就被“沖淡”了，在子代細(xì)胞中只有一個(gè)細(xì)胞是帶有損傷DNA的。

(四)SOS修復(fù)

SOS修復(fù)是指DNA受到嚴(yán)重?fù)p傷、細(xì)胞處于危急狀態(tài)時(shí)所誘導(dǎo)的一種DNA修復(fù)方式，修復(fù)結(jié)果只是能維持基因組的完整性，提高細(xì)胞的生成率，但留下的錯(cuò)誤較多，故又稱為易誤修復(fù)(error prone repair)，使細(xì)胞有較高的突變率。

Lecture 3 The expression of genetic information 轉(zhuǎn)錄（transcription): 在RNA聚合酶的催化下，以一段DNA鏈為模板合成RNA，從而將DNA所攜帶的遺傳信息傳遞給RNA的過程稱為轉(zhuǎn)錄。

經(jīng)轉(zhuǎn)錄生成的RNA有多種，主要的是rRNA，tRNA，mRNA，snRNA和HnRNA。

第一節(jié) 轉(zhuǎn)錄

一、轉(zhuǎn)錄與復(fù)制的比較

（一）轉(zhuǎn)錄與復(fù)制的相同點(diǎn)

1、均以DNA為模板

2、合成方向是5--3 `

3、服從堿基配對(duì)原則

4、均需要依賴DNA的聚合酶

二、轉(zhuǎn)錄作用及其特點(diǎn) ㈠不對(duì)稱轉(zhuǎn)錄

㈡真核細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物都是各種RNA的前體，既無活性，亦物功能，必須在細(xì)胞核內(nèi)加工，形成由活性的RNA后，由核運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)中才能執(zhí)行翻譯功能

三、原核生物RNA的生物合成

㈠ RNA聚合酶（RNA polymerase）

這是一種不同于引物酶的依賴DNA的RNA聚合酶。

該酶在單鏈DNA模板以及四種核糖核苷酸存在的條件下，不需要引物，即可從5'→3'聚合RNA。

原核生物中的RNA聚合酶全酶由五個(gè)亞基構(gòu)成，即α2ββ‘σ。σ亞基與轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的識(shí)別有關(guān)，而在轉(zhuǎn)錄合成開始后被釋放，余下的部分（α2ββ'）被稱為核心酶，與RNA鏈的聚合有關(guān)。

㈢轉(zhuǎn)錄過程 1.起始階段

⑴σ因子的識(shí)別作用

① RNA鏈的起始通常是在RNA聚合酶所結(jié)合DNA區(qū)域的一端，在解開的雙鏈部分，離-10開始

②處第一個(gè)核苷酸通常是pppA或pppG,較少為pppC，但偶而亦可為pppU。大約12或13個(gè)堿基處 ③σ因子的解離

RNA鏈的延伸階段開始后，σ因子即從核心酶-DNA-新生RNA復(fù)合體上解離下來，并可再用于和新的核心酶結(jié)合 延長階段

⑴ RNA聚合酶在延伸新生RNA鏈時(shí)繼續(xù)使DNA螺旋解鏈，以便暴露出模板鏈，RNA鏈的生長點(diǎn)是大約12bp長的RNA-DNA雜交區(qū) 在RNA鏈離開模板時(shí)，此雜交區(qū)即復(fù)原，同時(shí)兩條DNA鏈即又重復(fù)螺旋化。終止階段

細(xì)菌DNA中有轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)，稱為終止子(terminator)終止子的作用是在DNA模板的特異位點(diǎn)處終止RNA的合成。

在終止子處，RNA聚合酶停止其聚合作用，將新生RNA鏈釋出，并離開模板DNA。在某些位點(diǎn)處，終止需要一種輔助蛋白質(zhì)，即ρ因子，但在其他位點(diǎn)處，核心酶本身即可終止轉(zhuǎn)錄。

不依賴ρ因子的終止子有兩個(gè)特征:

DNA順序有雙重對(duì)稱(dyad)，位于RNA3‘端之前15-20核苷酸處；

DNA模板鏈中有一串約6個(gè)A，轉(zhuǎn)錄為RNA3'端的U。雙重對(duì)稱的意義在于其轉(zhuǎn)錄本能形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。

依賴ρ的終止子沒有不依賴ρ的終止子特有的多聚dA序列，并且也不是都能形成穩(wěn)定的發(fā)夾。

ρ因子的作用機(jī)制，但有幾種可能性

ρ因子在RNA的存在下能水解ATP，說明它能與新生RNA鏈結(jié)合，并可能應(yīng)用ATP放出的能量將RNA鏈從酶和模板中釋出。ρ因子可能與RNA聚合酶結(jié)合。

編碼ρ因子的基因rho發(fā)生突變時(shí)產(chǎn)生的某些ρ蛋白質(zhì)僅能在RNA聚合酶的β亞基也發(fā)生相應(yīng)突變時(shí)才能有RNA合成的活性。

已知RNA聚合酶本身能識(shí)別DNA模板中依賴ρ的終止順序，而ρ因子是在以后才發(fā)揮作用而釋出RNA的。即使是在沒有ρ時(shí)，RNA聚合酶也在依賴ρ的終止子處暫停，不過以后仍繼續(xù)向前進(jìn)。

四、真核生物的轉(zhuǎn)錄作用 ㈠ 真核細(xì)胞中的RNA聚合酶

真核生物中的RNA聚合酶可按其對(duì)α-鵝膏蕈堿敏感性而分為三種，它們均由10～12個(gè)大小不同的亞基所組成，結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜，其功能也不同

㈡ RNA聚合酶Ⅰ

合成RNA的活性最顯著。它位于核仁中，負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄編碼rRNA的基因(稱rRNA)，而細(xì)胞內(nèi)絕大部分RNA是rRNA。

聚合酶Ⅰ不被雙環(huán)八肽──α-鵝膏蕈堿抑制。RNA聚合酶Ⅱ

它位于核漿中，負(fù)責(zé)核內(nèi)不勻一RNA(hnRNA)的合成。而hnRNA是mRNA的前體。它是最直接和遺傳調(diào)節(jié)相關(guān)的酶。

RNA聚合酶Ⅱ的活性均可被低濃度的α-鵝膏蕈堿所迅速抑制 ㈢RNA聚合酶Ⅲ

負(fù)責(zé)合成tRNA和許多小的核內(nèi)RNAs。對(duì)α-鵝膏蕈堿的反應(yīng)則不盡相同

在動(dòng)物細(xì)胞中聚合酶Ⅲ可被高濃度α-鵝膏蕈堿所抑制 在酵母和昆蟲細(xì)胞中則不會(huì)被抑制。㈣常用的轉(zhuǎn)錄抑制劑

★轉(zhuǎn)錄單位

真核生物的一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位就是一個(gè)基因，由一個(gè)結(jié)構(gòu)基因和相應(yīng)的順式調(diào)控元件組成。

一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位只有一個(gè)結(jié)構(gòu)基因。㈤轉(zhuǎn)錄因子

真核生物在轉(zhuǎn)錄時(shí)往往需要多種蛋白質(zhì)因子的協(xié)助。一般可將這些轉(zhuǎn)錄所需的蛋白質(zhì)分為三大類(1)RNA聚合酶的亞基，它們是轉(zhuǎn)錄必須的，但并不對(duì)某一啟動(dòng)子有特異性。(2)某些轉(zhuǎn)錄因子能與RNA聚合酶結(jié)合形成起始復(fù)合物，但不組成游離聚合酶的成分。

這些因子可能是所有啟動(dòng)子起始轉(zhuǎn)錄所必須的。亦可能僅是轉(zhuǎn)錄終止所必須的。

在這一類因子中，要嚴(yán)格區(qū)分開哪些是RNA聚合酶的亞基，哪些僅是輔助因子，是很困難的。

(3)某些轉(zhuǎn)錄因子僅與其靶啟動(dòng)子中的特異順序結(jié)合。

如果這些順序存在于啟動(dòng)子中，則這些順序因子是一般轉(zhuǎn)錄機(jī)構(gòu)的一部分。如果這些順序僅存在于某些種類的啟動(dòng)子中，則識(shí)別這些順序的因子也只是在這些特異啟動(dòng)子上起始轉(zhuǎn)錄必須的。

起始階段

RNA聚合酶Ⅱ的轉(zhuǎn)錄起始

RNA聚合酶Ⅱ的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是hnRNA 真核生物的轉(zhuǎn)錄起始較為復(fù)雜。目前已知RNA聚合酶Ⅱ至少有六種不同的蛋白因子參與轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的形成。這些蛋白因子被稱為轉(zhuǎn)錄因子（transcriptional factor, TF)。包括 TFⅡA，TFⅡB，TFⅡD，TFⅡE，TFⅡF，TFⅡ-I。終止階段

RNA轉(zhuǎn)錄合成的終止機(jī)制有兩種：

1．自動(dòng)終止：模板DNA鏈在接近轉(zhuǎn)錄終止點(diǎn)處存在相連的富含GC和AT的區(qū)域，使RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物形成寡聚U及發(fā)夾形的二級(jí)結(jié)構(gòu)，引起RNA聚合酶變構(gòu)及移動(dòng)停止，導(dǎo)致RNA轉(zhuǎn)錄的終止。2．依賴輔助因子的終止：由終止因子(ρ因子)識(shí)別特異的終止信號(hào)，并促使RNA的釋放。

真核生物RNA轉(zhuǎn)錄后的加工修飾

一、mRNA的轉(zhuǎn)錄后加工 1．加帽(adding cap)：

即在mRNA的5'-端加上m7GTP的結(jié)構(gòu)。此過程發(fā)生在細(xì)胞核內(nèi)，即HnRNA即可進(jìn)行加帽。加工過程首先是在磷酸酶的作用下，將5'-端的磷酸基水解，然后再加上鳥苷三磷酸，形成GpppN的結(jié)構(gòu)，再對(duì)G進(jìn)行甲基化。

2．加尾(adding tail)：

這一過程也是細(xì)胞核內(nèi)完成，首先由核酸外切酶切去3'-端一些過剩的核苷酸，然后再加入polyA。polyA結(jié)構(gòu)與mRNA的半壽期有關(guān)。3．剪接（splicing)：

真核生物中的結(jié)構(gòu)基因基本上都是斷裂基因。結(jié)構(gòu)基因中能夠指導(dǎo)多肽鏈合成的編碼順序被稱為外顯子，而不能指導(dǎo)多肽鏈合成的非編碼順序就被稱為內(nèi)含子。

第二節(jié) 翻譯

翻譯（translation）

蛋白質(zhì)的生物合成過程，就是將DNA傳遞給mRNA的遺傳信息，再具體的解譯為蛋白質(zhì)中氨基酸排列順序的過程，這一過程被稱為翻譯 蛋白質(zhì)合成體系

① mRNA：作為蛋白質(zhì)生物合成的模板，決定多肽鏈中氨基酸的排列順序； ② tRNA：搬運(yùn)氨基酸的工具；

③ 核蛋白體：蛋白體生物合成的場(chǎng)所； ④ 酶及其他蛋白質(zhì)因子； ⑤ 供能物質(zhì)及無機(jī)離子。

一、mRNA

作為指導(dǎo)蛋白質(zhì)生物合成的模板。mRNA中每三個(gè)相鄰的核苷酸組成三聯(lián)體，代表一個(gè)氨基酸的信息，此三聯(lián)體就稱為密碼(coden)。共有64種不同的密碼。

遺傳密碼具有以下特點(diǎn)：

① 連續(xù)性； ② 簡(jiǎn)并性； ③ 通用性；（但在線粒體或葉綠體中特殊）④ 方向性，即解讀方向?yàn)?′→ 3′； ⑤ 擺動(dòng)性；

⑥ 起始密碼：AUG；終止密碼：UAA、UAG、UGA。

二、tRNA

在氨基酸t(yī)RNA合成酶催化下，特定的tRNA可與相應(yīng)的 氨基酸結(jié)合，生成氨基酸t(yī)RNA，從而攜帶氨基酸參與蛋白質(zhì)的生物合成。tRNA反密碼環(huán)中部的三個(gè)核苷酸構(gòu)成三聯(lián)體，可以識(shí)別mRNA上相應(yīng)的密碼，此三聯(lián)體就稱為反密碼(anticoden)。

反密碼對(duì)密碼的識(shí)別，通常也是根據(jù)堿基互補(bǔ)原則，即A—U，G—C配對(duì)。但反密碼的第一個(gè)核苷酸與第三核苷酸之間的配對(duì)，并不嚴(yán)格遵循堿基互補(bǔ)原則。如反密碼第一個(gè)核苷酸為Ⅰ，則可與A、U或C配對(duì)，如為U，則可與A或G配對(duì)，這種配對(duì)稱為不穩(wěn)定配對(duì)。

三、rRNA和核蛋白體

原核生物中的核蛋白體大小為70S，可分為30S小亞基和50S大亞基。小亞基：由16SrRNA和21種蛋白質(zhì)構(gòu)成。大亞基：由5SrRNA，23SRNA和35種蛋白質(zhì)構(gòu)成。

真核生物中的核蛋白體大小為80S，也分為40S小亞基和60S大亞基。小亞基：由18SrRNA和30多種蛋白質(zhì)構(gòu)成。大亞基：則由5S rRNA，28S rRNA和50多種蛋白質(zhì)構(gòu)成

蛋白質(zhì)生物合成過程包括三大步驟： ①氨基酸的活化與搬運(yùn)；

②活化氨基酸在核蛋白體上的縮合； ③多肽鏈合成后的加工修飾。

一、氨基酸的活化與搬運(yùn)

氨基酸的活化以及活化氨基酸與tRNA的結(jié)合，均由氨基酰tRNA合成酶催化完成。其反應(yīng)過程為：

（一）起動(dòng)階段

1．40S起動(dòng)復(fù)合物的形成：

在起動(dòng)因子的促進(jìn)下，40S小亞基與mRNA的起動(dòng)部位，起動(dòng)tRNA

（fmet-tRNAfmet），和GTP結(jié)合，形成復(fù)合體。

原核mRNA的起動(dòng)部位由一段富含嘌呤的特殊核苷酸順序組成，稱為SD序列（核蛋白體結(jié)合位點(diǎn)，RBS），可被核蛋白體小亞基辨認(rèn)結(jié)合。真核生物中的mRNA具有帽子結(jié)構(gòu)，已知需一種特殊的帽子結(jié)合蛋白（CBP）以識(shí)別此結(jié)構(gòu)。

2．80S起動(dòng)前復(fù)合體的形成：IF3從40S起動(dòng)復(fù)合體上脫落，60S大亞基與復(fù)合體結(jié)合，形成80S起動(dòng)前復(fù)合

（二）肽鏈延長階段

1．進(jìn)位：與mRNA下一個(gè)密碼相對(duì)應(yīng)的氨基酰tRNA進(jìn)入核蛋白體的受位。此步驟需GTP，Mg2+，和EF參與。2．成肽：

在轉(zhuǎn)肽酶的催化下，將給位上的tRNA所攜帶的甲酰蛋氨?；螂孽；D(zhuǎn)移到受位上的氨基酰tRNA上，與其α-氨基縮合形成肽鍵。此步驟需Mg2+，1973年S.Cohen 也成功的進(jìn)行了另一個(gè)體外重組實(shí)驗(yàn)，他將編碼有卡那霉素抗性基因的大腸桿菌R6-5質(zhì)粒DNA與編碼有四環(huán)素抗性基因的另一種大腸桿菌質(zhì)粒pSC101 DNA混合后加入內(nèi)切酶EcoRI對(duì)DNA進(jìn)行切割，再用T4連接酶將它們連接成重組分子，用這種連接后的重組DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，某些轉(zhuǎn)化菌落表現(xiàn)出了既抗卡那霉素又抗四環(huán)素的雙重抗性特征。

以上兩個(gè)實(shí)驗(yàn)帶給人們的啟示：

DNA是可以在體外進(jìn)行切割和拼接的

利用細(xì)菌細(xì)胞可以快速的復(fù)制DNA并能夠合成蛋白質(zhì)。這兩個(gè)實(shí)驗(yàn)也標(biāo)致著基因工程技術(shù)的誕生 K+。給位上已失去蛋氨?；螂孽；膖RNA 3．移位：

核蛋白體向mRNA的3'-端滑動(dòng)相當(dāng)于一個(gè)密碼的距離，同時(shí)使肽?；鵷RNA從受體移到給位。此步驟需EF（EFG）、GTP和Mg2+參與。此時(shí)，核蛋白體的受位留空，與下一個(gè)密碼相對(duì)應(yīng)的氨基酰tRNA即可再進(jìn)入，重復(fù)以上循環(huán)過程，使多肽鏈不斷延長。

（三）肽鏈終止階段

核蛋白體沿mRNA鏈滑動(dòng)，不斷使多肽鏈延長，直到終止信號(hào)進(jìn)入受位。1．識(shí)別：RF識(shí)別終止密碼，進(jìn)入核蛋白體的受位。

2．水解：RF使轉(zhuǎn)肽酶變?yōu)樗饷福嚯逆溑ctRNA之間的酯鍵被水解，多肽鏈釋放。

3．解離：通過水解GTP，使核蛋白體與mRNA分離，tRNA、RF脫落，核蛋白體解離為大、小亞基。

分子生物學(xué)研究的對(duì)象 蛋白質(zhì)和核酸

對(duì)核酸、蛋白質(zhì)的研究積累為分子生物學(xué)技術(shù)的成熟打下了重要性的基礎(chǔ)。

70年代初是分子生物學(xué)成熟標(biāo)致的重要時(shí)期，因?yàn)檎Q生了分子生物學(xué)應(yīng)用的一個(gè)重要學(xué)科——基因工程。

80年代誕生的PCR技術(shù)將復(fù)雜的分子生物學(xué)技術(shù)簡(jiǎn)單化了，便得更加容易推廣和應(yīng)用。使得分子生物學(xué)技術(shù)一下普及到了一般的實(shí)驗(yàn)室。PCR技術(shù)，又稱為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，它利用一對(duì)特異性的引物和耐高溫的DNA聚合酶，在短短的2-3小時(shí)內(nèi)將一段DNA擴(kuò)增到1000萬倍，對(duì)實(shí)驗(yàn)室的條件的要求也降到最低點(diǎn)。

1990年開始的“人類基因組計(jì)劃”將分子生物學(xué)帶入到一個(gè)高通量的發(fā)展時(shí)代。生命科學(xué)進(jìn)入到了基因組和后基因組時(shí)代。

基因工程genetic engineering

1.基因工程誕生的理論基礎(chǔ)

基因工程的誕生依賴于在此之前生命科學(xué)基礎(chǔ)理論的發(fā)展成就，概括起來主要包括三個(gè)方面：

⑴ 40年代確定了遺傳物質(zhì)是DNA，它是遺傳信息的載體。

⑵ 50年代發(fā)現(xiàn)DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)并揭示了半保留復(fù)制的機(jī)理，揭示了基因的自我復(fù)制和表達(dá)的機(jī)理。

⑶ 50年代末至60年代初，相繼提出了“中心法則”和操縱子學(xué)說，并成功破譯了遺傳密碼，從而闡明了遺傳信息的流向和表達(dá)問題。2．工具酶的發(fā)現(xiàn)為基因工程的誕生奠定了技術(shù)的基礎(chǔ)： 3．基因工程的誕生

1972年H.Boyer 和 P.Berg 第一次完成了DNA的體外重組實(shí)驗(yàn)，用E.coRI在體外對(duì)SV40的DNA和λ噬菌體的DNA進(jìn)行了消化，然后用T4連接酶將消化后的DNA片段進(jìn)行了連接，結(jié)果獲得了重組的雜種DNA分子。

基因工程所使用的名稱：

重組DNA技術(shù)(recombinant DNA technique)遺傳工程(genetic engineering)基因工程(gene engineering)基因操作(gene manipulation)基因克隆(gene cloning)

分子克隆(molecular cloning)基因工程的基本內(nèi)容：

1．將兩種不同來源的DNA－－即目的DNA和載體DNA提取純化。2．用限制性內(nèi)切酶處理DNA。

3．用連接酶將切開的不同源的DNA連接到一起，構(gòu)成重組DNA。4．將重組DNA轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中。

5．通過大量的培養(yǎng)細(xì)菌，以達(dá)到擴(kuò)增目的基因或表達(dá)蛋白的目的。

基因工程的目的： 進(jìn)行分子克隆

表達(dá)重組基因所編碼的蛋白質(zhì)

工具酶

一、限制酶(restriction enzyme)

?

全稱限制性核酸內(nèi)切酶、簡(jiǎn)稱限制酶或內(nèi)切酶。

1． 限制酶的分類

限制酶有三種：I型、II型、III型。2.限制酶的命名

一般的限制酶通常由四個(gè)拉丁文字母組成第1個(gè)字母代表產(chǎn)生該酶的細(xì)菌的屬名，第2、3個(gè)字母代表產(chǎn)生該酶的細(xì)菌種名

第4個(gè)字母代表產(chǎn)生該酶的菌株號(hào)。

3.限制酶的識(shí)別和切割位點(diǎn)

根據(jù)Ⅱ型酶種類割雙鏈DNA產(chǎn)生3種不同的切口： ⑴產(chǎn)生平末端

⑵產(chǎn)生5’端突出的粘性末端 ⑶產(chǎn)生3’端突出的粘性末端 6.限制酶使用的條件 ⑴ 緩沖系統(tǒng)：

50mmol/L tris.Cl 10mmol/L Mg++ 1mmol/L DTT NaCl ⑵ 反應(yīng)體積

⑶ 反應(yīng)溫度和時(shí)間 ⑷ 限制酶的商業(yè)化 7.限制酶的商業(yè)化

試劑公司的名稱： Promaga公司 安瑪西亞公司

大連保生物公司 北京賽百勝公司 北京華美公司

購買酶時(shí)的注意事項(xiàng)：價(jià)格因素 供貨時(shí)間 運(yùn)輸方式

酶的保存

修飾酶

⒈逆轉(zhuǎn)錄酶種類：

禽類成骨細(xì)胞性白血病病毒(AMV)逆轉(zhuǎn)錄酶

小鼠白血病病毒(MMLV)逆轉(zhuǎn)錄酶 ⒉ T4DNA連接酶

從噬菌體中提取，用于DNA的連接 ⒊ 堿性磷酸酶

可將DNA或RNA5’的磷酸去除，可用于制止不希望發(fā)生的連接反應(yīng)進(jìn)行。⒋末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶

用于將已標(biāo)記好的單核苷酸加到DAN的3’端上，起到標(biāo)記的作用；有時(shí)也可用于DNA片段的同聚尾的形成。

載體(vector)在基因工程中的作用: 將外源DNA插入其中，并一同轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中，能夠穩(wěn)定的保存下來，完成外源DNA克隆和表達(dá)的功能。載體所必需的條件

1必須有自身的復(fù)制子，并能攜帶重組DNA一起復(fù)制。2載體分子上必須有限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)即多克隆位點(diǎn)。3載體必須具有可供選擇的標(biāo)置，便于重組分子的篩選。

4載體分子盡量小，便于能插入較大的外源DNA，最好是高考貝。5表達(dá)載體必須具備能在宿主細(xì)胞中表達(dá)的能力。

一、常用的克隆載體

㈠質(zhì)粒plasmid 1．質(zhì)粒的一般特點(diǎn)

? 細(xì)菌質(zhì)粒是一些雙鏈閉環(huán)的DNA分子，這些質(zhì)粒都是獨(dú)立于染色體之外進(jìn)行復(fù)制和遺傳的輔助性遺傳單位。通常，質(zhì)粒含編碼某些基因的酶，這些酶在一定環(huán)境下對(duì)宿主細(xì)胞有利。由質(zhì)粒產(chǎn)生的表型對(duì)抗生素的抗性、產(chǎn)抗生素、降解復(fù)雜有機(jī)化合物，以及產(chǎn)生大腸桿菌素，及限制酶、修飾酶等。

? 質(zhì)粒都帶有獨(dú)立的復(fù)制子，能獨(dú)立的自我復(fù)制。但在復(fù)制時(shí)必須依賴宿細(xì)菌的酶。

?

質(zhì)粒的不親和性(不相容性)

質(zhì)粒的三種狀態(tài)

松馳型和嚴(yán)緊型 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移性

多數(shù)質(zhì)粒在自然條件下可以通過細(xì)菌結(jié)合的作用轉(zhuǎn)移到新的宿細(xì)胞中。然而，由于質(zhì)粒缺少一種轉(zhuǎn)移所必須的mob基因，因此不能獨(dú)立的從一個(gè)細(xì)菌到另一個(gè)細(xì)菌的接合轉(zhuǎn)移。選擇標(biāo)記

質(zhì)粒載體的發(fā)展經(jīng)歷了三個(gè)階段：

第一階段：將選擇標(biāo)記引入含有復(fù)制子的質(zhì)粒中。

最早用作克隆載體的質(zhì)粒子有多種局限性：復(fù)制效率低；帶有不適合的選擇標(biāo)記；酶切位點(diǎn)少且不集中等，pBR322是早期最為成功的將所有理想的特性囊括于一身的質(zhì)粒載體。第二階段：高效型載體的發(fā)展

發(fā)展的趨勢(shì)是調(diào)整載體的結(jié)構(gòu)，提高載體的效率，減少載體的長度，擴(kuò)充載體的容納外源DNA的能力。這期間質(zhì)粒的代表是：pUC19等。第三階段：引入多種用途的輔助序列

這些用途包括通過組織化學(xué)檢測(cè)方法肉眼鑒定重組克隆，產(chǎn)生用于序列分析的單鏈DNA，外源蛋白的大量表達(dá)等用途的質(zhì)粒載體。

㈡λ噬菌體

1．λ噬菌體分子生物學(xué)

λ噬菌體的基因組是一長度50kb的雙鏈DNA，其末端為長12bp的天然互補(bǔ)單鏈（粘端）。當(dāng)它進(jìn)入宿細(xì)胞后其粘端會(huì)配對(duì)結(jié)合成環(huán)形，它在侵入宿細(xì)胞后可以兩種方式進(jìn)行復(fù)制：

裂解性生長 溶源性生長

2．λ噬菌體作為載體所具有的特征

不利因素：野生型λ噬菌體有一個(gè)龐大的基因組，其DNA可分為頭部、中央部分和尾部三個(gè)部分。其基因組由頭部（由7個(gè)基因組成）、尾部（由11個(gè)基因組成）、重組基因（5個(gè)基因和一個(gè)識(shí)別位點(diǎn)）、正調(diào)控基因（2個(gè)基因）、負(fù)調(diào)控基因（5個(gè)基因）、DNA合成基因（2個(gè)基因）、裂解基因（2個(gè)基因）、轉(zhuǎn)錄調(diào)控及識(shí)別位點(diǎn)組成。在沒有改造的情況下，λ噬菌體無法插入較大的外源DNA片段，無較集中的酶切位點(diǎn)和好的識(shí)別標(biāo)置。3．λ噬菌體載體的改造：

在λ噬菌體DNA的中央部分（約占30%）是其生長的非必須區(qū)，當(dāng)外源基因取代該區(qū)或該區(qū)缺失時(shí)，對(duì)噬菌體的生長不會(huì)造成影響。此外，外源基因不超過其本身的10倍數(shù)時(shí)，均可被包裝為成熟顆粒，具有噬菌體活性。

目前使用的λ噬菌體載體都經(jīng)過了改造，在其中加上了較集中的酶切位點(diǎn)、還加上了細(xì)菌的啟動(dòng)子，這不僅使其具有擴(kuò)增外源DNA的能力，還使它能夠表達(dá)外源基因的產(chǎn)物。

λ噬菌體的用途： λ噬菌體主要用于cDNA文庫的構(gòu)建。㈢粘性質(zhì)粒

粘性質(zhì)粒是一種將λ噬菌體和質(zhì)粒兩種載體結(jié)合起來形成的一種人工載體。它具有如下特征：

⑴含有質(zhì)粒的抗藥性標(biāo)記，如Ampr基因。

⑵載體帶有噬菌體的cos區(qū)，所以對(duì)其進(jìn)行體包裝是必不可少的。

⑶具有多克隆位點(diǎn)。

⑷形體本身的體積很小，但容量大，可插入40kb大小的DNA片段。

⑸一般非重組的載體體積小，而無法進(jìn)行體外包裝，因而無法轉(zhuǎn)染細(xì)菌，只有包裝了的重組體才能進(jìn)入細(xì)菌，有利于篩選。㈣M13噬菌體

M13噬菌體是一種大腸桿菌的噬菌體它在轉(zhuǎn)染大腸桿菌后進(jìn)行一段時(shí)間的復(fù)制后開始進(jìn)行不對(duì)稱復(fù)制，而形成大量的單鏈DNA，而后將這些單鏈DNA進(jìn)行包裝病毒顆粒后釋放到細(xì)菌外，利用這一特點(diǎn)，可大量克隆單鏈的DNA分子用于制備核酸探針和DNA測(cè)序的材料。㈤大容量測(cè)序用載體

在基因組學(xué)的研究中，需要將基因組的DNA片段切割成較的片段進(jìn)行測(cè)序，以此來提高測(cè)序的速度。但我們前面提到的載體一般都無法滿足這一需要，為了達(dá)到這一目的，人們開發(fā)出了酵母人工染色體(YAC)和細(xì)菌人工染色體(BAC)，前者可容納100萬個(gè)堿基的DNA片段，后者可容納30萬個(gè)堿基的DNA片段。

載體的表達(dá)

用于目的基因的表達(dá)?？煞譃榇竽c桿菌表達(dá)載體和哺乳動(dòng)物表達(dá)載體。㈠大腸桿菌表達(dá)載體

一般具備有細(xì)菌轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子，可人為的進(jìn)行操縱，如多數(shù)質(zhì)粒載

體中都帶有乳糖操縱子的啟動(dòng)子，能在乳糖存在的情況進(jìn)行誘表達(dá)。㈡哺乳動(dòng)物表達(dá)載體

多數(shù)是一些真核細(xì)胞病毒經(jīng)過改造而成形的。

重組DNA技術(shù)的基本過程

一、目的基因的制備 ㈠傳統(tǒng)的辦法 1.制備基因組DNA 將整個(gè)一個(gè)物種的基因組提取出來后用于基因工程的操作。常用于建立基因文庫。

2.制備cDNA文庫,并從中篩選目的基因

將一個(gè)物種或細(xì)胞中的全部RNA提取出來再從中提取mRNA，利用逆轉(zhuǎn)錄酶將其合成為cDNA，再將其重組于載體后，轉(zhuǎn)錄到大腸桿菌后形成cDNA文庫。

㈡制備用于表達(dá)的基因片段 ⒈直接用限制性酶切取

⒉用PCR技術(shù)體外擴(kuò)增目的基因 ⒊化學(xué)合成

㈢利用生物信息學(xué)的技術(shù)和原理來選擇目的片段

是現(xiàn)在最普遍使用及最為方便的手段

二、載體的選擇和制備

載體均是商品，根據(jù)實(shí)驗(yàn)的目的來選擇合適的載體，如分子克隆、表達(dá)、測(cè)序或長期保存目的基因等。即可以購買，也可以索求

三、DNA分子體外重組 基因工程的策略

?確定重組實(shí)驗(yàn)的目的——是獲得目的基因，還是獲得表達(dá)產(chǎn)物。

?根據(jù)經(jīng)濟(jì)情況選擇合適的用品——包括質(zhì)粒（可以買成品，也可以向人索取質(zhì)粒自己提?。⒚傅倪x擇等。

?制定周密的實(shí)驗(yàn)計(jì)劃，基因工程的實(shí)驗(yàn)周期都比較長，如計(jì)劃不周，將造成時(shí)間和經(jīng)濟(jì)上的損失。

?酶切位點(diǎn)的選擇 選擇合適的連接方式

四、將外源重組DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞

㈠轉(zhuǎn)化：主要指將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入宿主細(xì)菌的過程。通常是先將細(xì)菌細(xì)胞制備成感受態(tài)的菌，然后再進(jìn)行轉(zhuǎn)化。

轉(zhuǎn)化常用的方法有兩種：化學(xué)轉(zhuǎn)化和電轉(zhuǎn)移

㈡轉(zhuǎn)染：主要指將噬菌體和病毒轉(zhuǎn)入細(xì)胞的過程。

五、目的基因的篩選和鑒定

篩選和鑒定的方式有許多種，要仿照最初的實(shí)驗(yàn)方案來確定。常用的方式有：

用抗生素選擇培養(yǎng)基來篩選

用藍(lán)白斑選擇培養(yǎng)基來篩選

根據(jù)酶切方案來篩選

直接提取質(zhì)粒來篩選

提取質(zhì)粒和酶相結(jié)合來篩選

分子雜交 DNA測(cè)序

在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

1.基因工程用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)類藥物

治療糖尿病的胰島素，是一種 51 個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)1982 年美國 EliLilly 公司推出基因工程制造的人胰島素，商品名為(Humulin)。干擾素用于治療肝炎等病毒感染性疾病，有良好療效。升發(fā)酵液中所得的干擾素相當(dāng)于過去從 1000 升人血中所得。生產(chǎn)成本也大為降低。

目前用基因工程生產(chǎn)的蛋白質(zhì)藥物已達(dá)數(shù)十種，許多以前本不可能大量生產(chǎn)的生長因子，凝血因子等蛋白質(zhì)藥物，現(xiàn)在用基因工程辦法便可能大量生產(chǎn)。

正在開發(fā)的350種生物技術(shù)藥物中，1/3以上用于腫瘤，其中有30種用于黑素瘤，20種用于結(jié)直腸癌，13種用于乳腺癌，13種用于前列腺癌。

正在開發(fā)的疫苗有77種，用于預(yù)防或治療HIV感染、AIDS、結(jié)直腸癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、多發(fā)性硬化、中風(fēng)。

正在開發(fā)的生物技術(shù)藥物中，有29種用于HIV感染、AIDS和AIDS相關(guān)疾??；19種用于自身免疫性疾病，其中11種用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、3種用于狼瘡；8種用于血液疾病，其中4種用于血友病，一種用于鐮形細(xì)胞性貧血。

2.基因工程用于疫苗生產(chǎn)

常用的制備疫苗的方法，一種是弱毒活疫苗，一種是死疫苗。兩種疫苗各有自身的弱點(diǎn)?；钜呙珉[含著感染的危險(xiǎn)性。死疫苗免疫活性不高，需加

大注射量或多次接種。

利用基因工程制備重組疫苗，可以克服上述缺點(diǎn)，亞基疫苗指只含有病原物的一個(gè)或幾個(gè)抗原成分，不含病原物遺傳信息。重組亞基疫苗就是用基因工程方法，把編碼抗原蛋白質(zhì)的基因重組到載體上去，再送入細(xì)菌細(xì)胞或其他細(xì)胞中區(qū)大量生產(chǎn)。這樣得到的重組疫苗往往效價(jià)很高，但決無感染毒性等危險(xiǎn)。

在酵母中表達(dá)乙型肝炎表面抗原 HBsAg 產(chǎn)量可達(dá)每升 2.5mg，已于 1984 年問世。

基因工程生產(chǎn)疫苗有良好的發(fā)展前景。3.基因工程用于基因治療

人體基因的缺失，導(dǎo)致一些遺傳疾病，應(yīng)用基因工程技術(shù)使缺失的基因歸還人體，達(dá)到治療的目的，已成為基因工程在醫(yī)學(xué)方面應(yīng)用的又一重要內(nèi)容。

分子生物學(xué)常用技術(shù)

核酸的分子雜交Nucleic acid hybridization 分子雜交的原理：

DNA具有變性的特點(diǎn) 變性的DNA還能復(fù)性

分子雜交的概念 用已知的DNA序列制成探針，來檢測(cè)末知的樣本DNA。

核酸分子雜交的基本過程:

首先要確定檢測(cè)的目標(biāo)，即檢測(cè)的目的核酸片段，這個(gè)片段的序列必須是已知的。

根據(jù)此設(shè)計(jì)一個(gè)探針（與檢測(cè)目的核酸互補(bǔ)的序列），并對(duì)其進(jìn)行合成和標(biāo)記。

再通過雜交實(shí)驗(yàn)來完成探針對(duì)目的核酸的檢測(cè)。

分子雜交的形式：

液相雜交 固相雜交 固相雜交的一般過程

1.首先設(shè)計(jì)、合成探針。2.收集標(biāo)本，并提取核酸。

3.將提好的核酸樣本點(diǎn)到固相支持物上。4.封閉。

5.通過變性和復(fù)性完成雜交。6.漂洗

7.放射自顯影

核酸分子雜交技術(shù)的演變

斑點(diǎn)雜交 southern blot northern blot 原位雜交 芯片技術(shù)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) Polymerase chain reaction(PCR)PCR技術(shù)的形成及發(fā)展

PCR的實(shí)現(xiàn) 1985年美國PE-Cetus公司人類遺傳研究室的Mullis 等發(fā)明了具有劃時(shí)代意義的聚合酶鏈反應(yīng)。其原理類似于DNA的體內(nèi)復(fù)制，只是在試管中給DNA的體外合成提供一種合適的條件——摸板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合適的緩沖體系，DNA變性、復(fù)性及延伸的溫度與時(shí)間, 合成DNA的原料。

PCR的改進(jìn)與完善

Mullis最初使用的 DNA聚合酶是大腸桿菌 DNA 聚合酶 I 的Klenow片段，其缺點(diǎn)是：①Klenow酶不耐高溫，90℃會(huì)變性失活，每次循環(huán)都要重新加。②引物鏈延伸反應(yīng)在37℃下進(jìn)行，容易發(fā)生模板和引物之間的堿基錯(cuò)配，其PCR產(chǎn)物特異性較差，合成的DNA片段不均一。此種以Klenow酶催化的PCR技術(shù)雖較傳統(tǒng)的基因擴(kuò)增具備許多突出的優(yōu)點(diǎn)，但由于Klenow酶不耐熱，在DNA模板進(jìn)行熱變性時(shí)，會(huì)導(dǎo)致此酶鈍化，每加入一次酶只能完成一個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)周期，給PCR技術(shù)操作程序添了不少困難。這使得PCR技術(shù)在一段時(shí)間內(nèi)沒能引起生物醫(yī)學(xué)界的足夠重視

1988年Saiki 等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌(thermus aquaticus)中提取到一種耐熱DNA聚合酶。此酶具有以下特點(diǎn)：①耐高溫，在70℃下反應(yīng)2h后其殘留活性大于原來的90%，在93℃下反應(yīng)2h后其殘留活性是原來的60%，在95℃下反應(yīng)2h后其殘留活性是原來的40%。②在熱變性時(shí)不會(huì)被鈍化，不必在每次擴(kuò)增反應(yīng)后再加新酶。③大大提高了擴(kuò)增片段特異性和擴(kuò)增效率，增加了擴(kuò)增長度(2.0Kb)。由于提高了擴(kuò)增的特異性和效率，因而其靈敏性也大大提高。為與大腸桿菌多聚酶I Klenow片段區(qū)別，將此酶命名為Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase)。此酶的發(fā)現(xiàn)為PCR技術(shù)的廣泛應(yīng)用打下了基礎(chǔ)。PCR 技術(shù)的實(shí)驗(yàn)原理

模擬細(xì)胞內(nèi)DNA合成的過程

利用了DNA變性、復(fù)性和能進(jìn)行雜交的特點(diǎn)，在引物存在的條件下DNA聚合酶開始對(duì)DNA進(jìn)行體外合成。

通過全自動(dòng)的熱循環(huán)儀來完成 PCR的基本原理 PCR反應(yīng)條件 PCR過程 PCR的特點(diǎn)

PCR反應(yīng)的基本條件

模板的制備: 模板是進(jìn)行DNA體外擴(kuò)增的依據(jù)，它的來源于不同的材料。PCR對(duì)模板的質(zhì)量要求很高，但對(duì)它量的要求不高。

制備模板的材料：

新鮮材料：人或動(dòng)物的血液及組織中提取；

從少量材料：痰、尿液、腹腔液等;法醫(yī)學(xué)的材料：血斑、精斑等；

考古材料

從以往保存的材料，如石蠟切片的蠟塊中。

提取的原理和方法：（略）

引物的設(shè)計(jì)：

引物的設(shè)計(jì)首先要依據(jù)你已知的序列來設(shè)計(jì)。即你要擴(kuò)增的目的DNA片段。這些資料可以從文獻(xiàn)上查找或從互聯(lián)網(wǎng)上來檢索。

實(shí)際做的過程中，引物也可借助于別人已經(jīng)發(fā)表的引物來。但從經(jīng)驗(yàn)上說，別人公開發(fā)表的引物常常含有一定的錯(cuò)誤。所以要進(jìn)行核查。

設(shè)計(jì)引物應(yīng)遵循以下原則：

①引物長度： 15-30bp，常用為20bp左右。

②引物擴(kuò)增跨度： 以200-500bp為宜，特定條件下可擴(kuò)增長至10kb的片段。

③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC最好隨機(jī)分布，避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補(bǔ)，特別是3'端的互補(bǔ)，否則會(huì)形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶。

⑤引物-3’端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì)，以避免因末端堿基不配對(duì)而導(dǎo)致PCR失敗。

⑥引物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn)，被擴(kuò)增的靶序列最好有適宜的酶切位點(diǎn)，這對(duì)酶切分析或分子克隆很有好處。

⑦引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。引物量： 每條引物的濃度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物 量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好，引物濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增，且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會(huì)。

PCR所用試劑： DNA聚合酶

buffer:包括兩種，一種是含Mg++，一種是不含Mg++。dNTPs 純凈水

自己要準(zhǔn)備的模板DNA的制備和引物的設(shè)計(jì)與合成。PCR的操作過程

設(shè)定一個(gè)加樣配方： 標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系：

10×擴(kuò)增緩沖液 5ul

4種dNTP混合物

各200umol/L

引物

各10～100pmol

模板DNA

0.1～2ug

Taq DNA聚合酶 2.5u

Mg2+

1.5mmol/L

加雙或三蒸水至 50ul

加樣：

單樣本加樣

多樣本加樣

加樣的順序 PCR反應(yīng)條件的設(shè)定：

預(yù)就性溫度： 94℃，5分

變性溫度： 94℃，30秒

退火溫度： 需要摸條件

延伸溫度： 72℃，30秒

總延伸溫度： 72℃，15分

PCR結(jié)果的鑒定

通過凝膠電泳的方式來進(jìn)行。

RT-PCR(reverse transcription-PCR)RT－PCR技術(shù)的應(yīng)用

用于制備基因工程的目的基因片段。

用于表達(dá)譜的檢測(cè)。PCR技術(shù)的應(yīng)用

PCR的初衷是為特異性的擴(kuò)增某段DNA

現(xiàn)在PCR在醫(yī)學(xué)研究中主要是用于基因診斷，常用于：

對(duì)遺傳病的突變基因進(jìn)行診斷

對(duì)病原體的基因診斷

通過PCR結(jié)合限制酶切的診斷 SSCP技術(shù)進(jìn)行點(diǎn)突變的診斷 RT-PCR進(jìn)行結(jié)構(gòu)基因的擴(kuò)增及定量表達(dá) 熒光定量PCR技術(shù)

PCR結(jié)合多態(tài)性分析

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性分析有2種情況：

限制片段多態(tài)性分析(A)、(B)重復(fù)序列多態(tài)性分析(A)、(C)SSCP技術(shù)進(jìn)行點(diǎn)突變的診斷 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)

電泳技術(shù)electrophoresis technology 核酸的凝膠電泳

一、基本原理

1．核酸分子在水溶液中呈多聚陰離子。加上電場(chǎng)，它們會(huì)向正電極的方向遷移。2．在一定的電場(chǎng)強(qiáng)度下，DNA分子的遷移速度取決于核酸分子本身的大小和構(gòu)型。

3．電泳環(huán)境的影響：緩沖液的組成和離子強(qiáng)度直接影響遷移速度。

當(dāng)電泳緩沖液中無離子時(shí)，溶液導(dǎo)電性極小，電泳速度慢。當(dāng)電泳緩沖液中離子濃度極強(qiáng)時(shí)，則導(dǎo)電性極高，并易產(chǎn)熱。

pH值也影響遷移率，溶液的pH遠(yuǎn)離樣品的等電點(diǎn)時(shí)，樣品顆粒的電離程度大，相應(yīng)的電泳速率就大。凝膠的濃度的不同對(duì)同樣大小顆粒的電泳速

率也不相同，因此，不同濃度的凝膠分辨DNA分子大小的能力也不同。

表：瓊脂糖及聚丙烯酰胺凝膠分辨DNA片段的能力

凝膠類型及結(jié)構(gòu) 分離DNA片段的大小范圍(bp)0.3%瓊脂糖 50 000-1 000 0.7%瓊脂糖 20 000-1 000 1.4%瓊脂糖 6 000-300 4.0%聚丙烯酰胺 1 000-100 10.0%聚丙烯酰胺 500-25 20.0%聚丙烯酰 50-1

4．凝膠電泳的目的：

可將大小不等的DNA片段和蛋白分子進(jìn)行分離，并通過標(biāo)準(zhǔn)分子量基本原理：

maker鑒定其大小。

對(duì)所要的目的分子進(jìn)行純化提取。

二、瓊脂糖凝膠電泳 Agarose Gel Electrophoresis 瓊脂糖是從海藻中提取出的長鏈狀多聚糖，當(dāng)它被加熱到90℃時(shí)可被溶解成半透明的液體，這時(shí)便于澆板并在冷卻后固化成凝膠。其凝固點(diǎn)這40-45℃。

瓊脂糖電泳的優(yōu)點(diǎn)：操作方便，并可用來鑒定和純化特定的DNA分子。

用低溶點(diǎn)瓊脂糖來分離并純化DNA。

瓊脂糖電泳的不足之處：它的分辨范圍在0.3-50kb之間，對(duì)一些分辨更小DNA分子的實(shí)驗(yàn)將無法進(jìn)行。

瓊脂糖電泳結(jié)果的顯示：

利用核酸與溴化乙錠吸附性強(qiáng)的特點(diǎn)，用溴化乙錠來顯色。

三、聚丙烯酰胺凝膠電泳

(polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE)電泳材料：

丙烯酰胺

CH2═CH─C—NH2 ║ O N,N?ˉ-亞甲雙丙烯酰胺

H H │ │ CH2═CH─C—N—CH2—N—CH═CH2 ║ O 兩種丙烯酰胺在促凝劑存在的條件下可以凝集成膠。

PAGE的優(yōu)點(diǎn)和不足：優(yōu)點(diǎn)是分辨率高，不足是操作復(fù)雜，成本高。PAGE的凝膠可用溴化乙錠染色，也可以銀染，后者的分辨率高。

四、SDS-變性聚丙烯酰胺凝膠電泳

(SOS-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)

SDS-PAGE專門用于蛋白質(zhì)電泳。

基本原理：在蛋白質(zhì)電泳前，先將其變性成線結(jié)構(gòu)，并使其表面都吸附上帶負(fù)電荷的活性分子-----SDS。

蛋白質(zhì)印跡技術(shù)

Western blotWestern blot 技術(shù)是借鑒了Southern blot 技術(shù)的原理而設(shè)計(jì)。它也是在凝膠電泳后通過轉(zhuǎn)移電泳將電泳分離物移到固相支持物上再進(jìn)行進(jìn)一步的分析。

與Southern blot不同的是，它用來雜交的不是探針，而是特異性的物體。

Western blot的基本過程

先通過SDS-PAGE將樣本中的蛋白質(zhì)分離

通過轉(zhuǎn)移電泳將凝膠上的樣本移到硝酸纖維膜上 封閉硝酸纖維膜

用一抗來特異性的識(shí)別目標(biāo)蛋白 用酶標(biāo)二抗來識(shí)別一抗 顯色

DNA序列分析

Sanger雙脫氧終止法(手工測(cè)序)基本原理：

DNA在復(fù)制時(shí)，需要兩個(gè)單核苷酸之間脫去一分子水后形成磷酸二酯鍵。如果在其中加入雙脫氧的單核苷酸，將中止DAN的復(fù)制。通過自動(dòng)化的DNA測(cè)序儀來進(jìn)行測(cè)序

二、基因組的大規(guī)模的測(cè)序列 新一代測(cè)技術(shù)的出現(xiàn)

第二代測(cè)序技術(shù)的核心思想是邊合成邊測(cè)序（Sequencing by Synthesis)，即通過捕捉新合成的末端的標(biāo)記來確定DNA的序列，現(xiàn)有的技術(shù)平臺(tái)主要包括Roche/454 FLX、Illumina/Solexa Genome Analyzer和Applied Biosystems SOLID system。

酶聯(lián)免疫吸附分析Enzyme-linked immunosorbentassay(ELISA)

通過免疫學(xué)技術(shù)(抗原、抗體反應(yīng))對(duì)樣本中的目標(biāo)蛋白質(zhì)進(jìn)行特異性的定性或定量分析。被檢測(cè)的蛋白質(zhì)即可能是抗原，也可以是抗體?；具^程：

1.將抗體或抗原結(jié)合到固相支持物上

2.用特異性的抗原或抗體(被酶標(biāo)記)對(duì)其進(jìn)行免疫識(shí)別。3.通過酶標(biāo)儀來檢測(cè)結(jié)果

ELISA常用的方法有：

雙抗體夾心法

間接法

一、轉(zhuǎn)基因技術(shù) 1.轉(zhuǎn)基因技術(shù)的概念

轉(zhuǎn)基因技術(shù)指的是將一個(gè)物種的特定基因通過人工的方法轉(zhuǎn)入到另一種生物的細(xì)胞中，并使它獲得了轉(zhuǎn)入基因的特性。

2.轉(zhuǎn)基因技術(shù)的類型

轉(zhuǎn)基因技術(shù)可分多個(gè)層次：

廣義的講，最基本的轉(zhuǎn)基因技術(shù)就是基因工程，即將高等生物的基因通過體外重組后，轉(zhuǎn)化入細(xì)菌或酵母細(xì)胞。

真正意義上的轉(zhuǎn)基因技術(shù)是指轉(zhuǎn)基因植物和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。它們多是將外源基因注入生殖細(xì)胞或受精卵子中，并讓外源基因整合到其基因組中，并使其在胚胎及發(fā)育成熟的個(gè)體中獲得表達(dá)，形成具有新特性的個(gè)體。

三、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物 transgenic animal

1．轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的簡(jiǎn)史

1980年，J.W.Gordon等人首次報(bào)道用顯微注射的方法向小鼠胚胎注射純化的DNA，開辟了轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究的先河。

1982年，R.D.Palmiter等又報(bào)道用轉(zhuǎn)移生長激素基因的方法，獲得了7只轉(zhuǎn)基因鼠，其中1只比一般小鼠大一倍，被稱為巨鼠，引起極大的轟動(dòng)。相繼有轉(zhuǎn)基因豬、魚、兔和羊等問世。

2．轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究概況

⑴轉(zhuǎn)基因動(dòng)物在培育新品種中的應(yīng)用

在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物歷史上，培育高效益的家畜、家禽和水生動(dòng)物新品種曾經(jīng)是研究工作的主流。受“巨鼠”的影響，人們期望能通過轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的研究，獲得快速生長、節(jié)約飼料、產(chǎn)毛多、產(chǎn)蛋多和抗病的動(dòng)物新品種。

主要是將生長激素和類胰島激素的基因轉(zhuǎn)入動(dòng)物體內(nèi)，并且取得了良好的增長效果，但也表現(xiàn)出一系列病理性副作用，關(guān)節(jié)炎和胃病尤其明顯。但轉(zhuǎn)基因魚是一個(gè)例外。

⑵動(dòng)物生物反應(yīng)器(animal bioreactor)用動(dòng)物乳腺生產(chǎn)醫(yī)用蛋白質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)：

動(dòng)物乳腺是一個(gè)自我封閉的系統(tǒng)，它表達(dá)的蛋白質(zhì)絕大多數(shù)不會(huì)回到血液循環(huán)系統(tǒng)中去，可以避免大量表達(dá)的外源蛋白質(zhì)對(duì)動(dòng)物的健康造成危害。

乳腺組織是一種有效的蛋白質(zhì)合成器，一頭奶牛一年可產(chǎn)乳蛋白250-300千克，一只羊一年可產(chǎn)乳蛋白25-30千克。如果把百分之一的乳蛋白代換為醫(yī)用蛋白質(zhì)，產(chǎn)量十分可觀。

乳腺組織可以對(duì)人體蛋白質(zhì)進(jìn)行正確的修飾和后加工，產(chǎn)品活性接近天然產(chǎn)品。

在動(dòng)物乳腺表達(dá)的外源基因可以遺傳，一旦獲得成功，可以用常規(guī)畜牧技術(shù)繁殖產(chǎn)生群體。

我國轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究的領(lǐng)軍人物

——中國工程院院士曾溢滔教授

⑶抗病育種

將具有抗病能力的基因?qū)雱?dòng)物，使其具有較理想的抗病能力。目前已做的工作有：

抗豬瘟育種：

抗流感基因工程育種：1989年Young將INF基因質(zhì)粒導(dǎo)入小鼠受精卵，獲得表達(dá)，獲得抗病轉(zhuǎn)基因小鼠。

抗腫瘤動(dòng)物模型：美國首先培育出易發(fā)乳腺癌的轉(zhuǎn)基因小鼠，為研究癌誘發(fā)和抗腫瘤藥物的篩選提供了研究的模型。迄今已培育出許多與癌基因有關(guān)的轉(zhuǎn)基因小鼠。⑷基因治療

⑸組織器官移植：

將人的標(biāo)志基因移入豬，使其器官上具有了人的抗原標(biāo)志，減小了排異反應(yīng)。

3.轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的技術(shù)路線 ⑴經(jīng)典的技術(shù)路線

先從已交配的供體動(dòng)物的輸卵管中采取受精卵；

顯微注射法向受精卵的雄性核導(dǎo)入人工構(gòu)建的藥物蛋白基因；

經(jīng)外科手術(shù)把已導(dǎo)入外源基因的受精卵移入同步發(fā)情的受體母羊輸卵管內(nèi)；

讓受精卵在“養(yǎng)母”體發(fā)育至分娩出生；

用分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)出生小羊是否已整合了導(dǎo)入的外源基因。

該法的缺點(diǎn)：實(shí)驗(yàn)周期長，注射的外源基因整合率低。

⑵整合胚胎移植技術(shù)路線

該技術(shù)是對(duì)前種方法的改進(jìn)。它利用了生殖技術(shù)中的體外受精技術(shù)，使精子和卵子在體外受精；然后找到一個(gè)最佳時(shí)機(jī)向體外受精的細(xì)胞顯微注射藥物蛋白基因。然后在體對(duì)胚胎體進(jìn)行整合的鑒定。從中挑選有目的基因整合的胚胎進(jìn)行移植。采用經(jīng)陰道的非手術(shù)胚胎移植法，減少了對(duì)受精卵的損傷。

⑶核移植（克隆）技術(shù)路線

利用克隆技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)。即在進(jìn)行克隆之前，先目的基因注射到將進(jìn)行移植的核中，在按克隆技術(shù)進(jìn)行操作。其成功率比經(jīng)典技術(shù)路線高2.5倍。

⑷整合卵受精技術(shù)路線

即在受精之前先將藥物蛋白基因注射進(jìn)入卵細(xì)胞，經(jīng)檢測(cè)已經(jīng)完成整合后，再進(jìn)行體外受精和胚胎移植。

基因組學(xué)(genomics)功能基因組學(xué)(functional genomics)蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)Genome這個(gè)述語是德國遺傳學(xué)家Winkler在1920年創(chuàng)造的。它的含義是指一個(gè)細(xì)胞中所含有的全套遺傳信息。也是泛指一個(gè)物種中所含的全部的遺傳信息。

基因組學(xué)(genomics)主要是研究一個(gè)物種的基因組的組成，包括DNA堿基的排列順序，基因的分布情況。

人類基因組計(jì)劃簡(jiǎn)介(human genome project, HGP)HGP簡(jiǎn)介

人類基因組計(jì)劃是由美國科學(xué)家于1985年率先提出、于1990年正式啟動(dòng)的。美國、英國、法國、德國、日本和我國科學(xué)家共同參與了這一價(jià)值達(dá)30億美元的人類基因組計(jì)劃。這一計(jì)劃旨在為30多億個(gè)堿基對(duì)構(gòu)成的人類基因組精確測(cè)序，發(fā)現(xiàn)所有人類基因并搞清其在染色體上的位置，破譯人類全部遺傳信息。

基因組(Genome):基因組就是一個(gè)物種中所有基因的整體組成 人類基因組有兩層意義： ——遺傳物質(zhì) ——遺傳信息

從整體水平研究基因的存在、基因的結(jié)構(gòu)與功能、基因之間的相互關(guān)系

人類基因組計(jì)劃的目標(biāo)：

1.測(cè)定人類基因組中32億個(gè)單核苷酸（堿基）的排列順序。

2.確定各個(gè)基因和功能元件在序列中的位置，也就通常說的基因定位。3.確定出與疾病相關(guān)的基因及找出有治療和藥用價(jià)值的基因。4.繪制出一個(gè)完整的人類基因圖譜。

HGP是如何進(jìn)行的： 1.基因組測(cè)序概觀

基因組的測(cè)序的基本過程：

①選擇物種

②從細(xì)胞中提取DNA ③把經(jīng)純化的DNA隨機(jī)切割成大小合適的重疊片段

④指導(dǎo)DNA片段插入到載體中，并克隆

⑤測(cè)出第一DNA片段的堿基順序

⑥確定片段間的重疊，把序列組裝成最終的基因序列 敲碎基因組，分析研究?jī)?nèi)容所處的染色體位置

2.DNA的測(cè)序方法

在發(fā)明自動(dòng)測(cè)序技術(shù)之前，人們用手工進(jìn)行測(cè)序，最常用的方法是末端終止法（后面專門介紹）。

手工測(cè)序是通過凝膠電泳的手段將DNA片段進(jìn)行分離，然后在膠上“讀出”堿基的排列順序。這就決定了被測(cè)序的DNA片段不可能太大，而且效率很低，在20世紀(jì)80年代時(shí)，一天只能完成500bp片段的測(cè)序工作。

3.自動(dòng)化測(cè)序

1985年Leroy Hood, Lioyd Smith, Mike Hunkapiller發(fā)明了第一臺(tái)自動(dòng)測(cè)序儀，每天能測(cè)15 000個(gè)bp，1998年Hunkapiller領(lǐng)導(dǎo)的小組發(fā)明了一種新的測(cè)序列儀——ABI 3700G型DNA分析儀，每天可測(cè)多達(dá)400 000bp。測(cè)序的自動(dòng)化推動(dòng)了HGP的神速發(fā)展，研究人員僅用15個(gè)月的時(shí)間就完成了人類基因序列的90%。

技術(shù)的改進(jìn)促進(jìn)了測(cè)序的發(fā)展，每18個(gè)月全世界的測(cè)序總量翻一番，而測(cè)序成本則減少一半。從20世紀(jì)80年代末期到2001年，測(cè)序成本從10美元降到10美分。

4.測(cè)序用載體的改進(jìn)

在進(jìn)行基因組測(cè)序時(shí)，先要將提取的基因組DNA用限制性內(nèi)切酶切成大小不等的片段，并使每個(gè)片段之間能夠出現(xiàn)部分的重疊，然后需將這些片段放入載體大量克隆后才能完成測(cè)序的需要。

分子生物學(xué)中常用的載體是質(zhì)粒，它一般能攜帶較小的DNA片段。但在HGP的測(cè)序中需要能攜帶更大片段的載體，人工染色體載體的出現(xiàn)解決了這一困難?，F(xiàn)在用的人工染色體分為細(xì)菌人工染色體(bacterial artificial chromosome BAC)或酵母人工染色體(yeast artificial chromosome YAC)。BAC能攜帶300 000bp的DNA，YAC能攜帶1 000 000bp 的DNA，但不夠穩(wěn)定。

5.組裝基因組的拼圖游戲

基因測(cè)序后，要將一個(gè)個(gè)小的DNA片段拼裝起來就象一個(gè)游戲，但是一個(gè)十困難的工作。一個(gè)原因是人的基因組過于龐大，32億個(gè)堿基對(duì)被切成小片段也要有上千萬個(gè)片段，把它們從頭到尾找到一起本身就是很困難的工作。加上人的基因組中存在著大量的重復(fù)順序，約占人基因組的一半以上，這樣在拼接時(shí)很容易把一個(gè)區(qū)誤認(rèn)為另一個(gè)區(qū)域，因此在基因組測(cè)序和拼圖中常常會(huì)出現(xiàn)空洞和錯(cuò)誤。要彌補(bǔ)這些空洞和錯(cuò)誤，基因組的工作草圖的每一個(gè)堿基至少被測(cè)4-5次，人類基因組的最終目標(biāo)是產(chǎn)生完全的序列，沒有空隙，準(zhǔn)確率要達(dá)到99.99%。

6.目前進(jìn)行基因組計(jì)劃的兩種策略： 霰彈法測(cè)序：

先將人的基因組制備成各級(jí)小片段，并且小片段間有重疊的關(guān)系 然后對(duì)每個(gè)小片段進(jìn)行測(cè)序 通過重疊的關(guān)系將相互聯(lián)系著的小片段拼接成較大片段 當(dāng)拼到比較大的片段時(shí)，就可用于構(gòu)建圖譜 最終全部基因的序列。

全基因組霰彈法測(cè)序：

將基因組分割成小片段 然后對(duì)小片段進(jìn)行隨機(jī)的測(cè)序

通過計(jì)算機(jī)的程序?qū)⑺羞@些小片段組裝成連續(xù)的大片段，最終得到全基因組序列。

模式生物體的研究

通過對(duì)進(jìn)化不同階段的生物體基因組序列的比較，發(fā)現(xiàn)基因組結(jié)構(gòu)組成和功能調(diào)節(jié)的規(guī)律。

人類基因組計(jì)劃的完成示標(biāo)志著生命基礎(chǔ)科學(xué)的研究進(jìn)入到后基因組時(shí)代。

HGP對(duì)人類的重要意義

1、HGP對(duì)人類疾病基因研究的貢獻(xiàn)

人類疾病相關(guān)的基因是人類基因組中結(jié)構(gòu)和功能完整性至關(guān)重要的信息。對(duì)于單基因病，采用“定位克隆”和“定位候選克隆”的全新思路，導(dǎo)致了亨廷頓舞蹈病、遺傳性結(jié)腸癌和乳腺癌等一大批單基因遺傳病致病基因的發(fā)現(xiàn)，為這些疾病的基因診斷和基因治療奠定了基礎(chǔ)。對(duì)于心血管疾病、腫瘤、糖尿病、神經(jīng)精神類疾?。ɡ夏晷园V呆、精神分裂癥）、自身免疫性疾病等多基因疾病是目前疾病基因研究的重點(diǎn)。健康相關(guān)研究是HGP的重要組成部分，1997年相繼提出：“腫瘤基因組解剖計(jì)劃”“環(huán)境基因組學(xué)計(jì)劃”。

2、HGP對(duì)醫(yī)學(xué)的貢獻(xiàn)

基因診斷、基因治療和基于基因組知識(shí)的治療、基于基因組信息的疾病預(yù)防、疾病易感基因的識(shí)別、風(fēng)險(xiǎn)人群生活方式、環(huán)境因子的干預(yù)

3、HGP對(duì)生物技術(shù)的貢獻(xiàn)

（1）基因工程藥物：分泌蛋白（多肽激素，生長因子，趨化因子，凝血和抗凝血因子等）及其受體。

（2）診斷和研究試劑產(chǎn)業(yè)：基因和抗體試劑盒、診斷和研究用生物芯片、疾病和篩藥模型。

（3）對(duì)細(xì)胞、胚胎、組織工程的推動(dòng)：胚胎和成年期干細(xì)胞、克隆技術(shù)、器官再造。

4、HGP對(duì)制藥工業(yè)的貢獻(xiàn)

篩選藥物的靶點(diǎn)：與組合化學(xué)和天然化合物分離技術(shù)結(jié)合，建立高通量的受體、酶結(jié)合試驗(yàn)為基礎(chǔ)的藥物設(shè)計(jì)：基因蛋白產(chǎn)物的高級(jí)結(jié)構(gòu)分析、預(yù)測(cè)、模擬—藥物作用“口袋”

個(gè)體化的藥物治療：藥物基因組學(xué)。

5、HGP對(duì)社會(huì)經(jīng)濟(jì)的重要影響

生物產(chǎn)業(yè)與信息產(chǎn)業(yè)是一個(gè)國家的兩大經(jīng)濟(jì)支柱；發(fā)現(xiàn)新功能基因的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益；轉(zhuǎn)基因食品；轉(zhuǎn)基因藥物（如減肥藥，增高藥）

6、HGP對(duì)生物進(jìn)化研究的影響

生物的進(jìn)化史，都刻寫在各基因組的“天書”上；草履蟲是人的親戚發(fā)現(xiàn)了大約一百四十萬個(gè)單核苷酸多態(tài)性，并進(jìn)行了精確的定位，初步確定了30多種致病基因。隨著進(jìn)一步分析，我們不僅可以確定遺傳病、腫瘤、心血管病、糖尿病等危害人類生命健康最嚴(yán)重疾病的致病基因，尋找出個(gè)體化的防治藥物和方法，同時(shí)對(duì)進(jìn)一步了解人類的進(jìn)化產(chǎn)生重大的作用。

9、蛋白組的復(fù)雜性

人類基因組編碼的全套蛋白質(zhì)（蛋白質(zhì)組）比無脊椎動(dòng)物編碼的蛋白質(zhì)組更復(fù)雜。人類和其他脊椎動(dòng)物重排了已有蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域，形成了新的結(jié)構(gòu)。也就是說人類的進(jìn)化和特征不僅靠產(chǎn)生全新的蛋白質(zhì)，更重要的是要靠重排和擴(kuò)展已有的蛋白質(zhì)，以實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)種類和功能的多樣性。有人推測(cè)一個(gè)基因平均可以編碼2-10種蛋白質(zhì)，以適應(yīng)人類復(fù)雜的功能 ——13億年；人是由300～400萬年前的一種猴子進(jìn)化來的；人類第一次“走出非洲”——200萬年的古猿；人類的“夏娃”來自于非洲，距今20萬年——第二次“走出非洲”？

7、HGP帶來的負(fù)面作用 侏羅紀(jì)公園不只是科幻故事 種族選擇性滅絕性生物武器 基因?qū)＠麘?zhàn)

基因資源的掠奪戰(zhàn) 基因與個(gè)人隱私。

人類基因組帶給我們的新發(fā)現(xiàn)

1、基礎(chǔ)數(shù)據(jù)

全部人類基因組約有2.91Gbp，約有39000多個(gè)基因；平均的基因大小有27kbp；其中G+C含量偏低，僅占38%，而2號(hào)染色體中G+C的含量最多；到目前仍有9%的堿基對(duì)序列未被確定，19號(hào)染色體是含基因最豐富的染色體，而13號(hào)染色體含基因量最少等等（具體信息可參見cmbi 特別報(bào)道：生命科學(xué)的重大進(jìn)展）。

2、基因的分布情況

目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)和定位了26000多個(gè)功能基因，其中尚有42%的基因尚不知道功能，在已知基因中酶占10.28%，核酸酶占7.5%，信號(hào)傳導(dǎo)占12.2%，轉(zhuǎn)錄因子占6.0%，信號(hào)分子占1.2%，受體分子占5.3%，選擇性調(diào)節(jié)分子占3.2%，等。發(fā)現(xiàn)并了解這些功能基因的作用對(duì)于基因功能和新藥的篩選都具有重要的意義。

3、基因數(shù)量少得驚人：

一些研究人員曾經(jīng)預(yù)測(cè)人類約有14萬個(gè)基因，但Celera公司將人類基因總數(shù)定在2.6383萬到3.9114萬個(gè)之間，不超過40,000，只是線蟲或果蠅基因數(shù)量的兩倍，人有而鼠沒有的基因只有300個(gè)。如此少的基因數(shù)目，而能產(chǎn)生如此復(fù)雜的功能，說明基因組的大小和基因的數(shù)量在生命進(jìn)化上可能不具有特別重大的意義，也說明人類的基因較其他生物體更'有效'，人類某些基因的功能和控制蛋白質(zhì)產(chǎn)生的能力與其他生物的不同。這將對(duì)我們目前的許多觀念產(chǎn)生重大的挑戰(zhàn)，它為后基因組時(shí)代中生物醫(yī)學(xué)的發(fā)展提供新的非凡的機(jī)遇。但由于基因剪切，EST數(shù)據(jù)庫的重復(fù)以及一些技術(shù)和方法上的誤差，將來亦可能人類的基因數(shù)會(huì)多于4萬。

4、不同各族間DNA的差異

人類單核苷酸多態(tài)性的比例約為1/1250bp，不同人群僅有140萬個(gè)核苷酸差異，人與人之間99.99％的基因密碼是相同的。并且發(fā)現(xiàn)，來自不同人種的人比來自同一人種的人在基因上更為相似。在整個(gè)基因組序列中，人與人之間的變異僅為萬分之一，從而說明人類不同“種屬”之間并沒有本質(zhì)上的區(qū)別。

5、人類基因組中存在大片“荒漠”。

在染色體上有基因成簇密集分布的區(qū)域，有大片的區(qū)域只有“無用DNA” ——不包含或含有極少基因的成分。基因組上大約有1／4的區(qū)域沒有基因的片段。在所有的DNA中，只有1%-1.5%DNA能編碼蛋白，在人類基因組中98%以上序列都是所謂的“無用DNA”，分布著300多萬個(gè)長片斷重復(fù)序列。這些重復(fù)的“無用”序列，決不是無用的，它一定蘊(yùn)含著人類基因的新功能和奧秘，包含著人類演化和差異的信息。經(jīng)典分子生物學(xué)認(rèn)為一個(gè)基因只能表達(dá)一種蛋白質(zhì)，而人體中存在著非常復(fù)雜繁多的蛋白質(zhì)，提示一個(gè)基因可以編碼多種蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)比基因具有更為重要的意義

6、男女性別間基因的差異

男性的基因突變率是女性的兩倍，而且大部分人類遺傳疾病是在Y染色體上進(jìn)行的。所以，可能男性在人類的遺傳中起著更重要的作用。

7、外來基因

人類基因組中大約有200多個(gè)基因是來自于插入人類祖先基因組的細(xì)菌基因。這種插入基因在無脊椎動(dòng)物是很罕見的，說明是在人類進(jìn)化晚期才插入我們基因組的。可能是在我們?nèi)祟惖拿庖叻烙到y(tǒng)建立起來前，寄生于機(jī)體中的細(xì)菌在共生過程中發(fā)生了與人類基因組的基因交換。

8、新的遺傳標(biāo)記

蛋白質(zhì)組學(xué)(Proteomics)

proteome一詞于1994年提出，源于proteins和genome,意思是proteins expressed by a genome。研究細(xì)胞、組織或生物體蛋白質(zhì)組成及其變化規(guī)律的科學(xué)

蛋白質(zhì)組的廣義含義：

指某種細(xì)胞或組織中基因組所表達(dá)的所有的蛋白質(zhì)。但與基因組不同的是，蛋白質(zhì)組是一個(gè)動(dòng)態(tài)的概念，因此有人用功能蛋白質(zhì)組的概念，指的是細(xì)胞在一定階段或與某一生理現(xiàn)象相關(guān)的所有蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組的狹義含義：

可以指不同類型細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的變化，如正常細(xì)胞和異常細(xì)胞之間、細(xì)胞用藥或不用藥之間的蛋白質(zhì)水平差異、不同組織細(xì)胞間的蛋白質(zhì)類型的差異。

蛋白質(zhì)組研究的意義和背景

蛋白組學(xué)可從另一方面來進(jìn)行探索。即找到蛋白再來找其基因。

蛋白研究的困難性

蛋白質(zhì)與核酸相比，結(jié)構(gòu)更復(fù)雜

前者與后者殘基的比為20:4；后者能在體外進(jìn)行合成、前者則不能；后者結(jié)構(gòu)和組成的差異不大、前者有著復(fù)雜的翻譯后修飾如磷酸化、甲基化等內(nèi)容。

蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)易被破壞

核酸在變性后能夠復(fù)性，并且結(jié)構(gòu)不被破壞(這一點(diǎn)正是人們所利用的)。

蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)一旦變性則很難恢復(fù)。

蛋白質(zhì)組研究主要分兩個(gè)步驟

蛋白質(zhì)組分離技術(shù) 蛋白質(zhì)組分析技術(shù) 蛋白質(zhì)的分離

將各種蛋白進(jìn)行分離是進(jìn)行后續(xù)分析的基礎(chǔ)。分離的越細(xì)、分辨率越高將會(huì)為分析創(chuàng)造更好的條件。常用的蛋白質(zhì)分離手段有：

親和層析 分子篩 離子交換

毛細(xì)管電泳 一向電泳 雙向電泳

雙向電泳技術(shù) 樣品的制備

等電聚焦電泳(1向)SDS-PAGE電泳(2向)掃描保留圖象

強(qiáng)大的分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析 選定目標(biāo)蛋白 切膠 后續(xù)分析 對(duì)膠的染色 圖象的采集 圖象分析和處理

切膠收集目標(biāo)蛋白

基因診斷

(Gene Diagnosis)基因診斷是以DNA或RNA為實(shí)驗(yàn)材料，通過對(duì)某種特異堿基序列的檢出來確定某種疾病的發(fā)生或某種病原體的存在。

基因診斷要達(dá)到的目的 對(duì)已知突變基因的檢出

臨床應(yīng)用和基礎(chǔ)研究

對(duì)一些未知基因突變的篩選和分析。

對(duì)一些基因表達(dá)水平高低與某些疾病相關(guān)性的研究 對(duì)病原體基因的檢出?；蛟\斷早期的方法

分子雜交(hybridization)限制片段長度多態(tài)性的研究

(restriction fragment length polymorphism RFLP)分子雜交應(yīng)用于基因診斷的基本原理

根據(jù)被檢測(cè)目標(biāo)設(shè)計(jì)一個(gè)核酸探針，再用探針對(duì)來檢測(cè)具體的樣本，從而達(dá)到診斷的目的。

在實(shí)際應(yīng)用中，常用southern blot的方法來進(jìn)行突變基因的篩查。

PCR技術(shù)進(jìn)行基因診斷的幾種基本設(shè)計(jì)：

1.根據(jù)突變位點(diǎn)來設(shè)計(jì)特異性的引物。通過有無擴(kuò)增片段來進(jìn)行定性的。

2.通過基因片段長度的多態(tài)性來進(jìn)行鑒定。3.PCR結(jié)合限制片段長度多態(tài)性來進(jìn)行鑒定。

4.通過PCR-SSCP來進(jìn)行鑒定。

5.通過設(shè)計(jì)特異性的引物來診斷病原體的特異性基因。

基因診斷的應(yīng)用 多態(tài)性分析

對(duì)遺傳病突變基因的診斷

已知突變位點(diǎn)的診斷

未知突變位點(diǎn)的篩查和定位 基因異常表達(dá)的診斷（定量表達(dá)）外源DNA的檢測(cè)

腫瘤標(biāo)記物的確定和診斷 在法醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

DNA多態(tài)性

序列多態(tài)性(SNPs – 單堿基多態(tài)性)同源染色體 5-GGTTTACACCTAA-同源染色體 5-GTTTTAAACCGAA-

長度多態(tài)性(VNTR-可變的串聯(lián)重復(fù)順序)同源染色體 5-AATCAATCAATC-

同源染色體 5-AATCAATCAATCAATCAATC-

核心序列較長者（如大于8bp）常稱為小衛(wèi)星DNA，或稱可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列（VNTR）核心序列較短者（如2-5bp）常稱為微衛(wèi)星DNA，或稱短串聯(lián)重復(fù)序列（STR）

微衛(wèi)星多態(tài)性 單堿基多態(tài)性

遺傳信息變異是所有基因組的共同特征。不同個(gè)體、群體在疾病易感性、對(duì)環(huán)境理、化、生、致病因子反應(yīng)性和其他性狀上的差別，都與基因組序列中的變異有關(guān)，這些變異最常見的形式是單核苷酸多態(tài)性（SNP）。

人類基因組中SNP的數(shù)目約為3百萬－1千萬。人類遺傳多態(tài)性的意義 與性狀相關(guān)；

與疾病相關(guān)，可用于預(yù)測(cè)發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)； 個(gè)體醫(yī)學(xué)發(fā)展的基礎(chǔ)；

可作為遺傳標(biāo)志，用于疾病連鎖診斷； 作為個(gè)人身份識(shí)別標(biāo)識(shí)用于法醫(yī)學(xué)。

遺傳性狀

遺傳多態(tài)性在身份識(shí)別方面的應(yīng)用

公安司法系統(tǒng)——罪犯及受害人的身份識(shí)別及親子鑒定； 部隊(duì) —— 傷亡士兵的身份識(shí)別；

保安 —— 個(gè)人DNA身份證，用于人員識(shí)別；

何為RFLP? 限制性片段長度多態(tài)性

(Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP)

何為DNA指紋？用一種或幾種限制性內(nèi)切酶切割基因組DNA，用探針雜交并放射自顯影。

中國人群的遺傳學(xué)關(guān)系

主要成果：證實(shí)中國人群可分為南、北兩大組，兩者之間有明顯的基因融匯；提出了東亞人群可能起源于東南亞、而東亞現(xiàn)代智人與其他各大洲現(xiàn)代人群都起源于10－20萬年前“走出非洲”的群體的觀點(diǎn)。

基因治療Gene Therapy

依靠遺傳物質(zhì)來治療疾病，包括糾正人自身基因的結(jié)構(gòu)或功能上錯(cuò)亂、阻止病變的進(jìn)展，殺滅病變的細(xì)胞，或抑制外源原體遺傳物質(zhì)的復(fù)制，從而達(dá)到治病的目的。這就是基因治療的含義?；蚬こ膛c基因治療有相似的一面：

二者都需將“目的基因”（基因治療也可稱為治療基因）分離和純化；都需要將選擇合適的載體，并將“目的基因”與載體在體進(jìn)行重組；都需要將重組體導(dǎo)入受體（靶）細(xì)胞?；蚬こ膛c基因治療有不同的一面：

基因工程的主要目的是將重組體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，并使得外源基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)、純化，最終獲得重組蛋白。

基因治療的主要目的是將具有治療價(jià)值的基因形成的重組體導(dǎo)入體細(xì)胞直接表達(dá)，并無需對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化。

基因工程的全部過程都在體外操作；而基因治療需將外源基因?qū)塍w細(xì)胞中，因此技術(shù)上具有很大難度，而且對(duì)其有效性和安全性方面提出了

苛刻的要求

基因治療有兩種途徑：

ex vivo in vivo ex vivo ：

將含有外源基因的載體在體外導(dǎo)入人體細(xì)胞或異體細(xì)胞（也稱基因工程化細(xì)胞），經(jīng)體外細(xì)胞擴(kuò)增后，輸回人體。這種方法易于操作，并易于解決安全性的問題，但不易于工程化生產(chǎn)。in vivo途徑

將外源的治療基因裝配于合適的真核細(xì)胞表達(dá)載體，直接導(dǎo)入人體內(nèi)，這種方式的導(dǎo)入有利于在規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)。但是，這種方式導(dǎo)入治療基因及其載體必須證明其安全性，而且導(dǎo)入體內(nèi)后需能進(jìn)入靶細(xì)胞，有效地表達(dá)并達(dá)到治療的目的。因此，在技術(shù)上要求很高，其難度明顯高于前者。

致病基因的確定(定位)近日，來自國際上六個(gè)國家的科學(xué)家展開合作，通過分析全球不同人群之間的遺傳基因信息，初步繪制出首張人類DNA序列中變異基因片段的遺傳圖譜“HapMap”。這張圖譜對(duì)于基因治療來講，意義非凡。

所謂“HapMap計(jì)劃”，是由加拿大、中國、日本、尼日利亞、英國和美國共同資助并聯(lián)合展開的基因研究項(xiàng)目，全名為“國際人類基因組單體型圖計(jì)劃”(簡(jiǎn)稱“HapMap計(jì)劃”)，項(xiàng)目旨在建立一個(gè)幫助研究者發(fā)現(xiàn)人類疾病及其對(duì)藥物反應(yīng)相關(guān)基因的公眾資源。

反義技術(shù) 又稱反義寡核苷酸（antisense oligodeoxynucleotides）技術(shù)，是指利用人工合成的反義RNA和反義DNA來阻斷基因的轉(zhuǎn)錄或復(fù)制，控制細(xì)胞生長在中間階段,使編碼蛋白質(zhì)的基因能轉(zhuǎn)錄為mRNA，因而不能翻譯成相應(yīng)的蛋白質(zhì)，以達(dá)治療某一疾病的目的、用反義RNA已對(duì)某些癌癥進(jìn)行臨床試驗(yàn)。這類反義技術(shù)只能認(rèn)為是一種從基因水平進(jìn)行治療的技術(shù)，它們以不同方式，在DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯水平發(fā)揮作用。由于它們的分子量低，故而有潛力進(jìn)入靶細(xì)胞，但其臨床穩(wěn)定性、毒性、細(xì)胞通透性等各方面都需要進(jìn)一步研究。

藥物靶向治療（drugs targeting）此法機(jī)理可概括為病毒導(dǎo)向酶的藥物前體治療（virus directed enzyeme prodrug therapy,vdept），即用反轉(zhuǎn)錄病毒載體的外源基因轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi).該基因編碼一種酶，此酶可將一種無害的藥物前體轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞毒素復(fù)合物。帶有這一基因的病毒載體只在特殊組織或腫瘤細(xì)胞中而不在正常細(xì)胞中表達(dá)

第五篇：分子生物學(xué)論文

分子生物學(xué)論文

姓名：

專業(yè)：藥學(xué)

班級(jí)：11級(jí)藥學(xué)三班 學(xué)號(hào)：

基因工程抗體治療白血病的研究進(jìn)展

【摘要】目前采用基因工程藥物治療白血病逐漸成為熱點(diǎn)。研究表明白血病在獲得緩解后用基因工程藥物治療即可提高療效，又可減輕化療藥物的毒副反應(yīng)，并可望達(dá)到治愈白血病的目的。

【關(guān)鍵詞】白血??；基因工程抗體；研究進(jìn)展

引文

白血病是一類造血干細(xì)胞的克隆性疾病，在骨髓和其他造血組織中白血病細(xì)胞大量增生積聚，并浸潤其他器官和組織，而使正常造血受抑制。在兒童至35歲以下青壯年人群中因患惡性腫瘤致死的以白血病為首，故可稱為“第一殺手” [1]。治療白血病通常采用細(xì)胞毒藥物，雖然能使大部分患者病狀緩解和生存期延長，但治愈率仍很低?；蚬こ碳夹g(shù)的發(fā)展為降低單克隆抗體的免疫源性提供了一個(gè)有力的手段。目前嵌合抗體、人源化抗體和全人抗體三種人源抗體很好地克服了HAMA反應(yīng)的缺陷。2 正文

Campath一1H是在體內(nèi)外對(duì)大部分正常和惡性淋巴細(xì)胞都有溶解殺傷作用的人源化CD52抗體，但對(duì)造血干細(xì)胞沒有殺傷作用。起初，Campath一1H主要集中在對(duì)非霍奇金淋巴瘤(NHL)的臨床試驗(yàn)中，但由于Campath一1H對(duì)血循環(huán)中的淋巴細(xì)胞有強(qiáng)力的清除作用，現(xiàn)已經(jīng)將其應(yīng)用到CLL、T— PLL疾病中。

氟達(dá)拉濱等嘌呤類似物在各種慢性淋巴細(xì)胞白血病的治療中獲得較高的緩解率，但完全根除疾病的報(bào)道很少。將Campath一1H給予預(yù)先接受氟達(dá)拉濱治療的CLL患者，來清除微小殘留病變(MRD)，從而提高完全緩解率和持續(xù)時(shí)間，這可以使難治性CLL患者的總生存率(overall survival，OS)得到改善。Galimbeai[2] 等對(duì)8名CLL患者在氟達(dá)拉濱治療后給予Campath一1H治療。在Campath一1H治療后，5例患者獲得分子學(xué)緩解(62．5％)，其中4例在治療結(jié)束后一個(gè)月內(nèi)獲得。OR(overall response)率為72％，CR率為43％，因此Campath一1H對(duì)CLL的治療作用是顯著的。

另外，Keating[3]等 2002年對(duì)76例先前治療過的T—PLL患者給予Campath—IH治療的安全性和功效進(jìn)行了回顧性的分析。接受Campath一1H治療的患者，其OR率為51％，CR為39．5％，CR中位持續(xù)時(shí)間8．7個(gè)月，0s率為7．5個(gè)月(CR者14．8個(gè)月)。作者認(rèn)為Campath一1H是補(bǔ)救T—PLL一線治療失敗__的較好藥物。

在造血干細(xì)胞移植中，Campath一1H還能有效地清除供者的T淋巴細(xì)胞而不影響采集的干細(xì)胞的數(shù)目和功能，成為預(yù)防異基因移植中預(yù)防移植物抗宿主病(GVHD)較為理想的藥物。

隨著減輕強(qiáng)度的預(yù)處理(RIC)方案的發(fā)展，出現(xiàn)了“非清髓性”造血干細(xì)胞移植。這種方案主要是靠免疫活性細(xì)胞作用，目的是使供體干細(xì)胞既易于植入，又最終起到根除腫瘤的作用。通常是包括氟達(dá)拉濱等藥物的聯(lián)合應(yīng)用，但仍然有較高的慢性GVHD的發(fā)生和死亡率。而Campath一1H能有效地清除供受者的T淋巴細(xì)胞，從而減少了排斥反應(yīng)和GVHD的發(fā)生，為“非清髓性”移植提供了一種較為理想的免疫抑制效應(yīng)。Faulkner[4] 等報(bào)道了65例接受BEAM+Campath一1H預(yù)處理方案進(jìn)行異基因移植的患者，包括CLL、PLL，中位年齡為45．6歲。其中Campath—IH每天用10mg。11例發(fā)生了急性GVHD(I一Ⅱ)，9例發(fā)生了慢性GVHD。55例獲得了反應(yīng)，其中41例為CR，6例復(fù)發(fā)。2年Os率為68．1％，無事件生存率(EFS)為57．7％。結(jié)果2年移植相關(guān)死亡率(TRM)為13．3％。3 結(jié)語

基因工程藥物治療白血病首先可以有效的避免治愈白血病過程中由于腫瘤的微小殘留病變(MRD)不能被徹底清除而引起的疾病復(fù)發(fā)；其次是避免單純化療帶來的毒副反應(yīng)而引起機(jī)體的損傷以及機(jī)體對(duì)化療藥物的耐受性。因此用基因工程藥物治療白血病的方法成為了國內(nèi)外科學(xué)家研究熱點(diǎn)。我國與國外相比，雖起步較晚，但也獲得了較大的發(fā)展，取得了一定的科研成果。例如，已經(jīng)研制成功和正在研制的基因工程產(chǎn)品就有幾十種，有些已經(jīng)投產(chǎn)并開始使用，女ⅡIFN一、rhIL一

2、rhG—CSF、rhGM—CSF等?？傊?，基因工程藥物治療前景是十分誘人的，還有待于科研工作者的繼續(xù)努力，讓它為人類的健康作出更大的貢獻(xiàn)。

【參考獻(xiàn)文】

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[2]Galimberti S，Cervetti G，Cecconi N，et a1．Quantitative molecular e．valuation of minimal residual disease in patients with chronic lym—phocytic leukemia：efficacy of in vivo purging by alemtuzumab(campath一1H)[J]．J Immunother，2004，27(5)：389—393．

[3]Keating MJ，Cazin B，Coutre S，et a1．Campatb一1H treatment of T—cell prolymphocytie leukemia in patients for whom at I east oneprior chemotherapy regimen has failed[J]．J Clin Oncol，2002，20(1)：205—213． [4] Faulkner RD，Craddock C，Byrne JI，et a1．BEAM—alemtuzumabreduced intensity allogeneic stem cell transplantation for lympho—proliferative diseases；GVHD，toxicity，and survival in 65patients[J]．Blood，2004，103(2)：428-434．