第一篇：稠油四組分分離學生實驗講義

實驗一

（二）柱層析法分離稠油中的四組份

實驗?zāi)康模?/p>

1、了解復雜物質(zhì)的柱層析分離分析方法；

2、掌握柱層析分離稠油四組分的操作；

3、復習過濾、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)等操作步驟。實驗意義：

稠油是一種成分復雜的非常規(guī)烴類資源，按照極性可分為飽和烴、芳香烴、膠質(zhì)和瀝青質(zhì)四個組分。對稠油的研究首先要將其分成上述四個組分，再通過各種檢測手段（IR、EL、GCMS、HNMR等）進行分析。

柱層析技術(shù)又稱柱色譜技術(shù)，是根據(jù)樣品混合物中各組分在固定相和流動相中分配系數(shù)不同，經(jīng)多次反復分配平衡后，最終將組分分離的方法。

本實驗通過稠油四組分柱層析方法分離，使學生掌握使用柱層析分離稠油四組分的實驗方法和操作。實驗儀器與試劑：

儀器：旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、循環(huán)水式真空泵、索氏提取器、冷凝管、電熱套、超聲波清洗器、分析天平、25mL小燒杯、250mL平底燒瓶、滴管、玻璃棒、分離柱、洗耳球、長頸漏斗、11cm定性濾紙

試劑：中性三氧化二鋁（100~200目）、正己烷、二氯甲烷、三氯甲烷、甲醇（以上均為AR）、石英砂

實驗步驟：

一、分離前準備

1、活化氧化鋁

取中性氧化鋁（100-200目）若干于瓷坩堝中，置于馬弗爐，400-450℃煅燒6h；取出后放至干燥器中泠卻至室溫，加入1%（按氧化鋁質(zhì)量計）的蒸餾水，劇烈搖晃10min至混合均勻，干燥器中過夜備用。

2、溶解油樣

取0.5g-0.6g油樣于250mL平底燒瓶中，用80mL正己烷溶解，蓋好蓋子超聲15min，靜置十分鐘。

3、準備四個250ml平底燒瓶貼上標簽稱重備用。

二、過濾與抽提

1、過濾油樣

將濾紙折為菊花狀，過濾之前準備好的油樣。

2、抽提組分

將濾紙放入索氏抽提器，濾液中加入正己烷至液面高于電熱套加熱邊緣；打開電熱套至沸騰，抽提至抽提器中液體澄清為止，得到三組分溶液；取一燒瓶加入氯仿90ml，打開電熱套至沸騰，抽提至抽提器中液體澄清為止，得到瀝青質(zhì)溶液。

三、柱層析分離三組分

1、填裝柱子

層析柱中填充約20cm高活化好的氧化鋁，敲打柱子5min至填充的氧化鋁變實，鋪上一層石英砂防止被沖開。

2、柱層析分離三組分

先倒入少量正己烷排出柱子中空氣；至液面余約1cm時，緩慢倒入三組分溶液，并用少量正己烷將燒瓶中殘留溶液洗凈；少量多次倒入總量70mL正己烷，淋洗得飽和烴；接著少量多次倒入正己烷+二氯甲烷（30+30）混合液60mL，淋洗得芳香烴；最后少量多次倒入甲醇+二氯甲烷（30+30）混合液60mL，淋洗得膠質(zhì)。

四、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，揮干稱重

1、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)

對分出的四組分溶液進行減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，溫度為40-45℃，蒸發(fā)至燒瓶中無液體為止。

2、稱重

旋蒸后的重量減去燒瓶重量，計算出四組份的粗重及各組分所占百分比。數(shù)據(jù)處理：

某一組分% =（某一組分質(zhì)量/四組份總質(zhì)量）X 100% 問題思考：

1、稠油四組分的極性大小如何排列，依據(jù)是什么？

2、如柱子填充不實，對分離效果有何影響？

3、淋洗時為何每次加液要待液面余約1cm時？

4、實驗過程中還有哪些操作會影響分離效果？

第二篇：實驗一 萃取分離

實驗一 萃取分離

計劃學時：2學時

一、實驗的目

（1）了解萃取分離的基本原理，乳化及破乳化。（2）熟練掌握分液漏斗的選擇及各項操作。

二、基本原理

萃取是利用物質(zhì)在兩種不互溶（或微溶）溶劑中溶解度或分配比的不同來達到分離、提取或純化目的一種操作。

例：將含有有機化合物的水溶液用有機溶劑萃取時，有機化合物就在兩液相之間進行分配。在一定溫度下，此有機化合物在有機相中和在水相中的濃度之比為一常數(shù)，即所謂“分配定律”。

三、實驗步驟

本實驗以乙醚從醋酸水溶液中萃取醋酸為例來說明實驗步驟。1.一次萃取法

①用移液管準確量取10ml冰醋酸與水的混合液放入分液漏斗中，用30ml乙醚萃取。②用右手食指將漏斗上端玻塞頂住，用大拇指及食指中指握住漏斗，轉(zhuǎn)動左手的食指和中指蜷握在活塞柄上，使正當過程中，玻塞和活塞均夾緊，上下輕輕正當分液漏斗，每隔幾秒針放氣。

③將分液漏斗置于鐵圈，當溶液分成兩層后，小心旋開活塞，放出下層水溶液于50ml三角燒瓶內(nèi)。

2.多次萃取法

①準確量取10ml冰乙酸與水的混合液于分液漏斗中，用10ml乙醚如上法萃取，分去乙醚溶液。

②將水溶液再用10ml乙醚萃取，分出乙醚溶液。③將第二次剩余水溶液再用10ml乙醚萃取，如此共三次。

比較萃取效果。

四、操作要點和說明

在實驗中用得最多的是水溶液中物質(zhì)的萃取，最常使用的萃取器皿為分液漏斗。

1、在使用分液漏斗前必須仔細檢查：玻璃塞和活塞是否緊密配套。然后在活塞孔兩邊輕輕地抹上一層凡士林，插上活塞旋轉(zhuǎn)一下，再看是否漏水。

2、將漏斗放于固定在鐵架上的鐵圈中，關(guān)好活塞，將要萃取的水溶液和萃取劑（一般為溶液體積的1／3）依次從上口倒入漏斗中，塞緊塞子。

3、取下分液漏斗，用右手撐頂住漏斗頂塞并握漏斗，左手握住漏斗活塞處，大拇指壓緊活塞，把漏斗放平，旋轉(zhuǎn)振搖，振搖幾次后，將漏斗的上口向下傾斜，下部的支管指向斜上方（朝無人處），左手仍握在活塞支管處，用拇指和食指旋開活塞放氣（釋放漏斗內(nèi)的壓力），如此重復幾次，將漏斗放回鐵圈中靜置，待兩層液體完全分開后，打開上面的玻璃塞，再將活塞緩緩旋開，下層液體自活塞放出，然后將上層液體從分液漏斗的上口倒出（切記?。⑺芤旱够胤植┒?，再用新的萃取劑萃取。如此重復3－5次。

注意

（1）分液時一定要盡可能分離干凈，有時在兩相間可能出現(xiàn)一些絮狀物，也應(yīng)同時放去（下層）。

（2）要弄清哪一層是水溶液。若搞不清，可任取一層的少量液體，置于試管中，并滴少量自來水，若分為兩層，說明該液體為有機相，若加水后不分層則是水溶液。

（3）在萃取時，可利用“鹽析效應(yīng)”，即在水溶液中加入一定量的電解質(zhì)（如氯化鈉），以降低有機物在水中的溶解度，提高萃取效果。水洗操作時，不加水而加飽和食鹽水也是這個道理。

（4）在萃取時，特別是當溶液呈堿性時，常常會產(chǎn)生乳化現(xiàn)象。這樣很難將它們完全分離，所以要進行破乳，可加些酸。

4、萃取溶劑的選擇要根據(jù)被萃取物質(zhì)在此溶劑中的溶解度而定，同時要易于和溶質(zhì)分離開。所以最好用低沸點的溶劑。一般水溶性較小的物質(zhì)可用石油醚萃取。水溶性大的物質(zhì)可用苯或乙醚；水溶性極大的物質(zhì)可用乙酸乙酯。

5、分液漏斗使用后，應(yīng)用水沖洗干凈，玻璃塞和活塞用薄紙包裹后塞回去。

五、思考題

1、影響萃取法的萃取效率因素有哪些？怎樣才能選擇好溶劑？

2、使用分液漏斗的目的何在？使用分液漏斗時要注意哪些事項？

3、乙醚作為一種常用的萃取劑，其優(yōu)缺點是什么？

第三篇：分子生物學實驗講義

實驗 質(zhì)粒DNA的堿裂解法提取與純化

一、實驗原理

細菌質(zhì)粒是一類雙鏈、閉環(huán)的DNA，大小范圍從1kb至200kb以上不等。各種質(zhì)粒都是存在于細胞質(zhì)中、獨立于細胞染色體之外的自主復制的遺傳成份，通常情況下可持續(xù)穩(wěn)定地處于染色體外的游離狀態(tài)，但在一定條件下也會可逆地整合到寄主染色體上，隨著染色體的復制而復制，并通過細胞分裂傳遞到后代。

質(zhì)粒已成為目前最常用的基因克隆的載體分子，重要的條件是可獲得大量純化的質(zhì)粒DNA分子。目前已有許多方法可用于質(zhì)粒DNA的提取，本實驗采用堿裂解法提取質(zhì)粒DNA。堿裂解法是一種應(yīng)用最為廣泛的制備質(zhì)粒DNA的方法，其基本原理為：當菌體在NaOH和SDS溶液中裂解時，蛋白質(zhì)與DNA發(fā)生變性，當加入中和液后，質(zhì)粒DNA分子能夠迅速復性，呈溶解狀態(tài)，離心時留在上清中；蛋白質(zhì)與染色體DNA不變性而呈絮狀，離心時可沉淀下來。

純化質(zhì)粒DNA的方法通常是利用了質(zhì)粒DNA相對較小及共價閉環(huán)兩個性質(zhì)。例如，氯化銫-溴化乙錠梯度平衡離心、離子交換層析、凝膠過濾層析、聚乙二醇分級沉淀等方法，但這些方法相對昂貴或費時。對于小量制備的質(zhì)粒DNA，經(jīng)過苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等簡單步驟去除殘余蛋白質(zhì)和RNA，所得純化的質(zhì)粒DNA已可滿足細菌轉(zhuǎn)化、DNA片段的分離和酶切、常規(guī)亞克隆及探針標記等要求，故在分子生物學實驗室中常用。

二、實驗試劑

1、溶液Ⅰ： 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0）。1M Tris-HCl(pH 8.0）12.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。在10 lbf/in2高壓滅菌15min，貯存于4℃。

2、溶液Ⅱ：0.2N NaOH，1% SDS。2N NaOH 1ml，10%SDS 1ml，加ddH2O至10ml。使用前臨時配置。

3、溶液Ⅲ：醋酸鉀（KAc）緩沖液，pH 4.8。5M KAc 300ml，冰醋酸 57.5ml，加ddH2O至500ml。4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

4、TE：10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA(pH 8.0)。1M Tris-HCl（pH 8.0）1ml，0.5M EDTA（pH 8.0）0.2ml，加ddH2O至100ml。15 lbf/in2高壓濕熱滅菌20min，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

5、苯酚/氯仿/異戊醇（25：24：1）

6、乙醇（無水乙醇、70%乙醇）7、5×TBE：Tris 堿54g，硼酸27.5g，EDTA-Na2·2H2O 4.65g，加ddH2O 至1000ml。15 lbf/in2高壓濕熱滅菌20min，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

8、溴化乙錠（EB）：10mg/ml

9、RNase A（RNA酶A）：不含DNA酶(DNase-free)RNase A的10mg/ml，TE配制，沸水加熱15min，分裝后貯存于-20℃。

10、6×loading buffer（上樣緩沖液）：0.25%溴酚藍，0.25%二甲苯青FF，40%（W/V）蔗糖水溶液。11、1% 瓊脂糖凝膠：稱取1g瓊脂糖于三角燒瓶中，加100ml 0.5×TBE，微波爐加熱至完全溶化，冷卻至60℃左右，加EB母液（10mg/ml）至終濃度0.5μg/ml（注意：EB為強誘變劑，操作時帶手套），輕輕搖勻。緩緩倒入架有梳子的電泳膠板中，勿使有氣泡，靜置冷卻30min以上，輕輕拔出梳子，放入電泳槽中（電泳緩沖液0.5×TBE），即可上樣。

三、實驗操作

1、挑取LB固體培養(yǎng)基上生長的單菌落，接種于2.0ml LB（含相應(yīng)抗生素）液體培養(yǎng)基中，37℃、250g振蕩培養(yǎng)過夜（約12-14hr）。

2、取1.0ml培養(yǎng)物入微量離心管中，室溫離心8000g×1min，棄上清，將離心管倒置，使液體盡可能流盡。

3、將細菌沉淀重懸于100μl預(yù)冷的溶液Ⅰ中，劇烈振蕩，使菌體分散混勻。

4、加200μl新鮮配制的溶液Ⅱ，顛倒數(shù)次混勻（不要劇烈振蕩），并將離心管放置于冰上2-3min，使細胞膜裂解（溶液Ⅱ為裂解液，故離心管中菌液逐漸變清）。

5、加入150μl預(yù)冷的溶液Ⅲ，將管溫和顛倒數(shù)次混勻，見白色絮狀沉淀，可在冰上放置3-5min。溶液Ⅲ為中和溶液，此時質(zhì)粒DNA復性，染色體和蛋白質(zhì)不可逆變性，形成不可溶復合物，同時K+使SDS-蛋白復合物沉淀,4℃離心8000g × 10min, 小心移出上清于一新微量離心管中。

6、加入450μl的苯酚/氯仿/異戊醇，振蕩混勻，4℃離心8000g × 10min。

7、小心移出上清于一新微量離心管中，加入2.0倍體積（1ml）預(yù)冷的無水乙醇，混勻，室溫放置５min，4℃離心12000g×10min，棄上清。

8、加入1ml預(yù)冷的70%乙醇洗滌沉淀1次，4℃離心8000g×7min，棄上清，將沉淀在室溫下晾干或吹干（不能過于干燥，造成溶解困難）。

9、沉淀溶于20μl TE（含RNase A 20μg/ml），-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

四、質(zhì)粒DNA的電泳檢測

觀察瓊脂凝膠中DNA的最簡單方法是利用熒光染料溴化乙錠進行染色。該物質(zhì)含有一個可以嵌入DNA的堆積堿基之間的一個平面基團，這個基團的固定位置及其與堿基的密切接近，導致染料與DNA結(jié)合并呈現(xiàn)熒光，其熒光產(chǎn)率比游離染料溶液有所增加。DNA吸收254nm處的紫外輻射并傳遞給染料，而被結(jié)合的染料本身則在302nm和366nm有光吸收。這兩種情況下，被吸收的能量可在可見光譜紅橙區(qū)的590nm處重新發(fā)射出來。因此，當凝膠中含有游離溴化乙錠時即可以檢測到少量的DNA。

取制備的質(zhì)粒DNA 1-2μl，加適當loading buffer混勻上樣,采用 1-5V/cm的電壓，使DNA分子從負極向正極移動至合適位置，取出凝膠置紫外燈下檢測，攝片。

五、注意事項

本裂解法小量制備質(zhì)粒 DNA重復性好，一般無麻煩。若所提取質(zhì)粒 DNA不能被限制性內(nèi)切酶切割，可通過酚/氯仿再次抽提，以清除雜質(zhì)來解決問題。

六、習題：

1、什么是質(zhì)粒？質(zhì)粒有什么主要用途？

2、分子生物學實驗中用的質(zhì)粒是由野生型改建而來的，它必須具備哪三個基本要素？

3、制備的質(zhì)粒DNA在瓊脂糖凝膠上通常以三種形式條帶存在，它們分別是什么？

實驗 瓊脂糖凝膠電泳實驗

一、實驗?zāi)康?/p>

（1）學習瓊脂糖凝膠電泳的基本原理；

（2）掌握使用水平式電泳儀的方法；

二、實驗原理

瓊脂糖凝膠電泳是基因工程實驗室中分離鑒定核酸的常規(guī)方法。核酸是兩性電解質(zhì)，其等電點為pH2-2.5，在常規(guī)的電泳緩沖液中（pH約8.5），核酸分子帶負電荷，在電場中向正極移動。核酸分子在瓊脂糖凝膠中泳動時，具有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)，但主要為分子篩效應(yīng)。因此，核酸分子的遷移率由下列幾種因素決定：

（1）DNA的分子大小。線狀雙鏈DNA分子在一定濃度瓊脂糖凝膠中的遷移速率與DNA分子量對數(shù)成反比，分子越大則所受阻力越大，也越難于在凝膠孔隙中移動，因而遷移得越慢。

（2）DNA分子的構(gòu)象。當DNA分子處于不同構(gòu)象時,它在電場中移動距離不僅和分子量有關(guān),還和它本身構(gòu)象有關(guān)。相同分子量的線狀、開環(huán)和超螺旋質(zhì)粒DNA在瓊脂糖凝膠中移動的速度是不一樣的，超螺旋DNA移動得最快，而開環(huán)狀DNA移動最慢。如在電泳鑒定質(zhì)粒純度時發(fā)現(xiàn)凝膠上有數(shù)條DNA帶難以確定是質(zhì)粒DNA不同構(gòu)象引起還是因為含有其他DNA引起時，可從瓊脂糖凝膠上將DNA帶逐個回收，用同一種限制性內(nèi)切酶分別水解，然后電泳，如在凝膠上出現(xiàn)相同的DNA圖譜，則為同一種DNA。

（3）電源電壓。在低電壓時，線狀DNA片段的遷移速率與所加電壓成正比。但是隨著電場強度的增加，不同分子量的DNA片段的遷移率將以不同的幅度增長，片段越大，因場強升高引起的遷移率升高幅度也越大，因此電壓增加，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍將縮小。要使大于2kb 的DNA 片段的分辨率達到最大，所加電壓不得超過5v/cm。

（4）離子強度影響。電泳緩沖液的組成及其離子強度影響DNA的電泳遷移率。在沒有離子存在時（如誤用蒸餾水配制凝膠），電導率最小，DNA幾乎不移動；在高離子強度的緩沖液中（如誤加10×電泳緩沖液），則電導很高并明顯產(chǎn)熱，嚴重時會引起凝膠熔化或DNA變性。

溴化乙啶(Ethidium bromide, EB)（1）能插入DNA分子中形成復合物，在波長為254nm紫外光照射下EB能發(fā)射熒光，而且熒光的強度正比于核酸的含量，如將已知濃度的標準樣品作電泳對照，就可估算出待測樣品的濃度。由于溴化乙啶有致癌的嫌疑，所以現(xiàn)在也開發(fā)出了安全的染料，如Sybergreen。

常規(guī)的水平式瓊脂糖凝膠電泳適合于DNA和RNA的分離鑒定；但經(jīng)甲醛進行變性處理的瓊脂糖電泳更適用于RNA的分離鑒定和Northern 雜交，因為變性后的RNA是單鏈，其泳動速度與相同大小的DNA分子量一樣，因而可以進行RNA分子大小的測定，而且染色后條帶更為銳利，也更牢固結(jié)合于硝酸纖維素膜上，與放射性或非放射性標記的探針發(fā)生高效雜交。

三、試劑與器材

（一）材料

電泳儀、水平電泳槽、樣品梳子、瓊脂糖等

（二）試劑 1、50*TAE(1000mL)：242g Tris, 57.1mL 冰醋酸，18.6g EDTA。

2、EB溶液：100mL水中加入1g溴化乙啶，磁力攪拌數(shù)小時以確保其完全溶解，分裝，室溫避光保存。

3、DNA加樣緩沖液：0.25%溴酚藍，0.25%二甲苯青，50%甘油（w/v）。

4、DNA分子量標準

四、操作方法

常規(guī)的水平式瓊脂糖電泳：

制備瓊脂糖凝膠：按照被分離DNA分子的大小，決定凝膠中瓊脂糖的百分含量；一般情況下，可參考下表：

瓊脂糖的含量（%）分離線狀DNA分子的有效范圍（Kb）

0.3 60-5

0.6 20-1

0.7 10-0.8

0.9 7-0.5

1.2 6-0.4

1.5 4-0.2

2.0 3-0.1

1、制備瓊脂糖凝膠：稱取瓊脂糖，加入1x電泳緩沖液，待水合數(shù)分鐘后，置微波爐中將瓊脂糖融化均勻。在加熱過程中要不時搖動,使附于瓶壁上的瓊脂糖顆粒進入溶液；加熱時應(yīng)蓋上封口膜,以減少水份蒸發(fā)。

2、膠板的制備：將膠槽置于制膠板上,插上樣品梳子,注意觀察梳子齒下緣應(yīng)與膠槽底面保持1mm左右的間隙，待膠溶液冷卻至50℃左右時，加入最終濃度為0.5微克/毫升的EB(也可不把EB加入凝膠中,而是電泳后再用0.5μg/ml的EB溶液浸泡染色15分鐘)，搖勻，輕輕倒入電泳制膠板上，除掉氣泡；待凝膠冷卻凝固后，垂直輕拔梳子；將凝膠放入電泳槽內(nèi)，加入1x電泳緩沖液，使電泳緩沖液液面剛高出瓊脂糖凝膠面；

3、加樣：點樣板或薄膜上混合DNA樣品和上樣緩沖液，上樣緩沖液的最終稀釋倍數(shù)應(yīng)不小于1X。用10 μL微量移液器分別將樣品加入膠板的樣品小槽內(nèi)，每加完一個樣品，應(yīng)更換一個加樣頭，以防污染，加樣時勿碰壞樣品孔周圍的凝膠面。（注意：加樣前要先記下加樣的順序和點樣量）。

4、電泳：加樣后的凝膠板立即通電進行電泳，DNA的遷移速度與電壓成正比，最高電壓不超過5V/cm。當瓊脂糖濃度低于0.5%，電泳溫度不能太高。樣品由負極（黑色）向正極（紅色）方向移動。電壓升高，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍降低。當溴酚藍移動到距離膠板中央時，停止電泳。

5、觀察和拍照：電泳完畢，取出凝膠。在波長為254nm的紫外燈下觀察染色后（2）的或已加有EB的電泳膠板。DNA存在處顯示出肉眼可辨的桔紅色熒光條帶。于凝膠成像系統(tǒng)中拍照并保存之。

五、注意事項

1、EB是強誘變劑并有中等毒性，易揮發(fā)，配制和使用時都應(yīng)戴手套，并且不要把EB灑到桌面或地面上。凡是沾污了EB的容器或物品必須經(jīng)專門處理后才能清洗或丟棄。簡單處理方法為：加入大量的水進行稀釋（達到0.5mg/mL以下），然后加入0.2倍體積新鮮配制的5%次磷酸（由50%次磷酸配制而成）和0.12倍體積新鮮配制的0.5mol/L 的亞硝酸鈉，混勻，放置1天后，加入過量的1mol/L碳酸氫鈉。如此處理后的EB的誘變活性可降至原來的1/200左右。

2、由于EB會嵌入到堆積的堿基對之間并拉長線狀和帶缺口的環(huán)狀DNA，使DNA遷移率降低。因此，如果要準確地測定DNA的分子量，應(yīng)該采用跑完電泳后再用0.5μg/ml的EB溶液浸泡染色的方法。

六、實驗報告要求與思考題

1、附上電泳結(jié)果的圖片并進行正確的標注（如下圖）

M：1Kb DNA ladder；1：質(zhì)粒DNA

2、瓊脂糖凝膠電泳中DNA分子遷移率受哪些因素的影響？

3、如果樣品電泳后很久都沒有跑出點樣孔，你認為有哪幾方面的原因？

4、為什么分子生物學實施時要擔心EB？

5、瓊脂糖凝膠電泳時膠中DNA是靠什么發(fā)出熒光的？為什么？

電泳流程圖：

實驗 PCR擴增eGFP基因

一、PCR技術(shù)的基本原理

PCR類似于DNA的天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火--延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：

①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準備；

②模板DNA與引物的退火(復性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合；

③引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復制鏈重復循環(huán)變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。(Plateau)。到達平臺期所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。

PCR 技術(shù)應(yīng)用廣泛，不可能有這樣一套條件滿足所有的實驗，但本實驗所介紹的方法可適應(yīng)于大多數(shù)DNA 擴增反應(yīng)，即使有的不適應(yīng)，至少也確定了一個共同的起點，在此基礎(chǔ)上可以作多種變化。不過下列因素在實驗應(yīng)用時應(yīng)予以特別注意，以求取得滿意結(jié)果。

1、模板：單、雙鏈DNA 和RNA都可以作為PCR樣品，若起始材料是RNA，須先通過逆轉(zhuǎn)錄得取第一條cDNA。雖然PCR 可以僅用極微量的樣品，但為了保證反應(yīng)的特異性，一般宜用ng 量級的克隆DNA，ug 級的染色體DNA，待擴增樣品質(zhì)量要求較低，但不能混合有任何蛋白酶、核酸酶，Taq DNA聚合酶的抑制劑以及能結(jié)合DNA 的蛋白質(zhì)。

2、引物：引物是決定PCR 結(jié)果的關(guān)鍵，下列原則有助于引物的合理設(shè)計。（1）盡可能選擇堿基隨機分布，GC 含量類似于被擴增片段的引物，盡量避免具有多聚嘌呤、多聚嘧啶或其它異常序列的引物。（2）避免具有明顯二級結(jié)構(gòu)（尤其是在引物3'—末端）的序列。

3、防止引物間的互補，特別要注意避免具有3'末端重疊的序列。

4、引物的長度約為20個堿基，較長引物較好，但成本增加，短引物則特異性降低。

5、引物濃度不宜偏高，過高易形成二聚體解鏈；然后冷卻至37—55℃，使引物與模板退

二、實驗試劑

（一）儀器與器皿

PRC 擴增儀，瓊脂糖凝膠電泳設(shè)備，微量取樣器，一次性eppendorf管，凝膠成像儀

（二）試劑與材料

1、瓊脂糖凝膠電泳試劑

1）電泳緩沖液：Tris—乙酸0.04mol/L PH8.0 0.002mol/L EDTA

2）加樣緩沖液：0.25%溴酚蘭40% w/v蔗糖

3）溴化乙錠溶液：0.05mg/ml溴化乙錠/水

4）瓊脂糖

2、TaqDNA 多聚酶3、5′反應(yīng)緩沖液：

125mmol/L Tris-HCl pH8.2；10mmol/L MgCl2；0.5mg/ml gelatin；125mmol/L(NH4)2SO4； Formamide 25%

4、混合dNTP 液(dATP dGTP dTTP dCTP各2.5 mmol/L)

5、DNA 模板

6、引物 1（10μmol/L）

7、引物 2（10μmol/L）

8、無菌水

三、實驗步驟

1、按順序在200μl 指形管中加入以下試劑與樣品：（因購入的試劑批次不同，加樣時有所差別，以預(yù)實驗結(jié)果為準。

1）ddH2O 37μl

2）10*Buffer 5μl(含有MgCL2)

3）dNTP ２μl

4）引物1(上游)２μl

5）引物2（下游）２μl

6）模板 1μl（pEGFP質(zhì)粒）

7）TaqDNA聚合酶１μl（2.5U）總體積共50μl

2、在PCR 擴增儀上按以下反應(yīng)條件編入程序：（以下為參考值，因擴增的DNA片段不同，各類PCR 擴增儀程序設(shè)定各不相同，編程過程視擴增的DNA 片段的要求及儀器而定參數(shù)。）

1)預(yù)變性 94℃ 3 分種

2)循環(huán)條件（30 次）

變性 94℃ 30 秒

復性 55℃ 30 秒

延伸 72℃ 1分

3)延長延伸 72℃ 7 分鐘

編完反應(yīng)程序，置反應(yīng)管于PCR擴增儀的反應(yīng)孔中，開動機器，擴增循環(huán)反應(yīng)開始。

3、PCR 擴增完畢，配1.5%瓊脂糖凝膠，電泳觀察結(jié)果。

4、凝膠成像儀或紫外燈下觀察實驗結(jié)果，是否已擴增到實驗設(shè)計的DNA片段

四、習題

1、PCR反應(yīng)液中主要成分是哪些？在PCR反應(yīng)過程中各起什么作用？

2、為什么在PCR反應(yīng)過程中，使用三個不同的溫度變化？

3、用PCR擴增目的基因，要想得到特異性產(chǎn)物需注意哪些事項？

實驗 從動物組織（豬肝）中提取DNA

一、實驗內(nèi)容

采用SDS裂解和蛋白酶K消化法從豬肝中提取DNA，并進行瓊脂糖凝膠電泳分析。目的

(1)掌握SDS裂解法從豬肝中的原理和方法；(2)鞏固DNA的瓊脂糖凝膠電泳分析實驗。

二、實驗原理

DNA是一切生物細胞的重要組成成分，主要存在于細胞核中。通過研磨和SDS作用破碎細胞；苯酚和氯仿可使蛋白質(zhì)變性，用其混合液（酚：氯仿：異戊醇）重復抽提，使蛋白質(zhì)變性，然后離心除去變性蛋白質(zhì)；RNase降解RNA，從而得到純凈的DNA分子。

三、實驗材料

新鮮豬肝

TES 緩沖液 ： pH8.0 Tris-HCl 10 mmoL/L , EDTA 1mmoL/ L , SDS 0.1 mmoL/ L

四、實驗步驟

1、剪取約0.5g肝臟組織，放入到研缽中磨碎；

2、向研缽中再加入1 ml TES輕輕研磨，將TES與破碎的組織混勻；

3、吸取535 μl組織勻漿液于2 ml EP管中，再加入60 μl SDS（10%），5.0 μl蛋白酶K，充分混勻后，于56°C保溫1 h，每30分鐘輕搖1次；

4、放置到室溫，加入等體積飽和酚（600μl），顛倒混勻，11000 rpm，離心10 min，吸取400 μl水相，并轉(zhuǎn)移至一個新的1.5 ml離心管中；

5、加入2倍體積（1000 μl）的無水乙醇和1/10倍體積（40 μl）3 M 醋酸鈉沉淀DNA，12000 rpm離心10 min，棄乙醇；

6、加入適量TE溶解DNA和RNAse A（具體依DNA的多少而定），并利用0.7%的瓊 脂溏進行電泳分析。

五、注意事項

1、在將豬肝剪碎前要將豬肝清洗干凈，除去脂肪及系膜成分。

2、抽提每一步用力要柔和，防止機械剪切力對DNA的損傷。

3、取上層清液時，注意不要吸起中間的蛋白質(zhì)層。

4、乙醇漂洗去乙醇時，不要蕩起DNA。

5、離心后，不要晃動離心管，拿管要穩(wěn)。

6、在乙醇沉淀后，經(jīng)離心要觀察留在EP管中的小白點，其主要成分就是DNA，在以后的實驗中都要細心觀察，防止因?qū)⑿“c丟失。

六、習題

1、為了獲得高質(zhì)量的肝臟DNA，在實驗過程中應(yīng)注意什么。

2、結(jié)合本人操作體會，總結(jié)在提取過程中如何避免大分子DNA的降解。

3、核酸提取中，去除蛋白質(zhì)的方法有哪些？ 實驗 限制性內(nèi)切酶切割DNA

一、實驗?zāi)康?/p>

1． 通過對DNA的酶切，學會設(shè)計構(gòu)建體外重組DNA分子； 2． 根據(jù)目的基因合理選擇載體與限制性內(nèi)切酶； 3． 掌握DNA的酶切技術(shù)。

二、實驗原理

限制性內(nèi)切酶是從細菌中分離出來的一種能在特異位點切割DNA分子的核酸內(nèi)切酶，目前已從多種細菌中分離出超過400種，識別各自不同的核苷酸順序，這一順序大多為具有一對稱中心的回文序列，如從大腸桿菌中分離的 EcoR I識別?GAATTC? 切割后產(chǎn)生?CTTAAG?、?G 和

AATTC?的末端，?CTTAAG?該末端由于有一段小的能互補配對的單鏈突出，故稱為粘性末端。切割后的末端為3’-OH和5’-磷酸基團，即?G-OH和?CTTAA-P。

有的限制性酶識別四堿基對的順序，如 San3A識別?GATC ?；有的識別六

堿基對，如上述的ECOR I。識別四堿基對的內(nèi)切酶由于識別順序在DNA出現(xiàn)的頻率更高（四堿基酶為44=256，六堿基酶為46＝4096），因而可將DNA切割成更小的片段，而識別八堿基對的Not I?GCGGCCGC?、?CGCCGGCG? 則識別和切割位點更少（48＝65536），但堿基并不以均等的概率出現(xiàn)，因而切割后產(chǎn)生的片段變化范圍很大。

＋

限制性內(nèi)切酶作用的溫度一般為37℃，反應(yīng)體系中以Mg2為唯一的輔助因子，且要求pH緩沖在7.5左右。

商品酶都保存在50％的甘油溶液中，-20℃貯存，活性通常較高，5u/μl（每單位即最適條件下1小時內(nèi)完全酶解1μg DNA的酶量）。

三、實驗材料

待酶切的DNA樣品

四、實驗儀器、器皿及試劑

1、儀器：可調(diào)微量加樣器、恒溫水浴箱、電泳儀、電泳槽、紫外檢測燈

2、器皿：Eppendorf管、Tip、試管架

3、試劑：標準DNA(Marker)

EcoRI限制性內(nèi)切酶

10×buffer：50mmol/l NaCl

10mmol/l Tris-HCl(pH7.5)

10mmol/l MgCl2

lmmol/l

DTT（二硫蘇糖醇）

五、實驗步驟

1、將DNA樣品8.5μl(質(zhì)粒pEGFP, 1μg)

2、加入1μl 10×buffer，酶解buffer由廠家提供。

3、加入1u（0.5μl）的限制性內(nèi)切酶EcoRI（限制性酶很昂貴，從-20℃取出要置于冰上，吸取要新的Tip頭，以免污染雜質(zhì)，吸完后盡快放回冰箱）。

4、混勻反應(yīng)液后，稍離心使液體聚集，置37℃溫育１小時。

5、進行電泳檢查酶切結(jié)果，100V 25分鐘。

6、紫外燈下觀察消化效果。

六、注意事項

1、分子生物學實驗大多為微量操作，DNA樣品與限制性內(nèi)切酶的用量都極少，必須嚴格注意吸樣量的準確性以保證酶切效果最佳?，F(xiàn)介紹三種微量取樣方法：

(1)吸樣時，將Tip尖剛剛接觸到液面時，輕輕吸取。此法可吸取0.2~0.5μl的樣品，注意不要將Tip尖全部插入溶液，這樣Tip壁上會沾上很多的樣品，導致吸樣不準。

(2)用1cm長的塑料毛細管代替Tip吸樣，此法也可吸取0.2~0.5μl的樣量。

(3)目前也有細長Tip出售，專門用于吸取微量樣品。

2、限制性內(nèi)切酶價格比較貴，因此要注意不使其污染而導致浪費。這就要求每次吸酶時要用新的無菌Tip。另一個造成限制性內(nèi)切酶浪費的因素就是限制性內(nèi)切酶的失活。因此，要注意加樣次序，即各項試劑加好后，最后才加酶，并要在冰上操作，且操作要盡可能快，以使限制性內(nèi)切酶拿出冰箱的時間盡可能短。

若用同一酶消化很多樣品時，可先計算出所需酶量（可稍多計一點），取出此量的酶與1×緩沖液混合，然后再分裝至各個反應(yīng)管內(nèi)。這樣可節(jié)約用酶且縮短操作過程、減少污染機會。

3、開啟Eppendorf管時，手不要接觸到管蓋內(nèi)面，以防雜酶污染。

4、樣品在37℃與65℃保溫時，要注意將Eppendorf管蓋嚴，以防水進入管內(nèi)造成實驗失敗。

5、無實驗必要應(yīng)盡量避免長時間酶消化樣品。因長時間消化，限制酶溶液中可能存在的雜酶會影響試驗結(jié)果。

七、習題

1、限制性核酸內(nèi)切酶天然存在于什么生物體內(nèi)？

2、什么是細菌的限制-修飾系統(tǒng)？限制-修飾系統(tǒng)對細菌有什么用途？

3、限制性內(nèi)切酶有幾類？這幾類限制性內(nèi)切酶各有什么特點？可作為工具酶的限制性內(nèi)切酶是哪一類？為什么？

4、限制性內(nèi)切酶的識別序列有什么特點？稱為什么序列？

5、酶通常在什么溫度中保存？為什么酶在該溫度下保存不會結(jié)凍？酶最后工作的時候其甘油濃度必須低于多少？ 6、1個單位（1 U）的限制性內(nèi)切酶代表什么意思？

實驗 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化

一、實驗?zāi)康?/p>

掌握熱激法或電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞及轉(zhuǎn)化子的鑒定方法。實驗材料：質(zhì)粒DNA；大腸桿菌感受態(tài)細胞。

二、實驗原理

質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化是指將質(zhì)?；蛞运鼮檩d體構(gòu)建的重組子導入細菌的過程。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞中，實現(xiàn)重組克隆的增殖，便于后續(xù)分子操作?？梢圆捎枚喾N方法篩選和鑒定目的克隆。

（1）熱激法：大腸桿菌在0℃ CaCl2低滲溶液中，菌細胞膨脹成球形，轉(zhuǎn)化混合物中的DNA形成抗DNase的羥基－鈣磷酸復合物粘附于細胞表面，經(jīng)42℃短時間熱沖擊處理，促進細胞吸收DNA復合物，在豐富培養(yǎng)基上生長數(shù)小時后，球狀細胞復原并分裂增殖。在被轉(zhuǎn)化的細胞中，重組子基因得到表達，在選擇性培養(yǎng)基平板上可挑選所需的轉(zhuǎn)化子。

（2）電轉(zhuǎn)化法：外加于細胞膜上的電場造成細胞膜的不穩(wěn)定，形成電穿孔，不僅有利于離子和水進入細菌細胞，也有利于孔DNA等大分子進入。同時DNA在電場中形成的極性對于它運輸進細胞也是非常重要的。

三、實驗步驟

1、制備選擇性培養(yǎng)基平板：在融化的250ml LB固體培養(yǎng)基中（冷卻止55攝氏度以下）加入Amp至終濃度50μg/ml，混勻后倒入滅菌培養(yǎng)皿中；

2、取出1管制備好的感受態(tài)細胞，放在冰上融化；

3、每100μl感受態(tài)細胞加入約20ng質(zhì)粒DNA，輕輕混勻，在冰上放置30分鐘；

4、熱擊：將離心管放置42℃水浴，熱擊90秒，注意：勿搖動離心管；

5、冰鎮(zhèn)：快速將離心管轉(zhuǎn)移至冰浴，放置1－2分鐘；

6、復蘇：每管加400 μl LB培養(yǎng)基，在37℃搖床溫和搖動溫育45分鐘，使細菌復蘇；

7、布皿：取適當體積均勻涂布于含有、抗生素（Amp）的LB平板；

8、培養(yǎng)：倒置培養(yǎng)皿，于37℃培養(yǎng)12－16小時即可觀察到白色的菌落，即為轉(zhuǎn)化子。

四、結(jié)果與分析

計算轉(zhuǎn)化效率

菌落數(shù)/DNA質(zhì)量（μg）*稀釋倍數(shù)

五、習題

1、制備感受態(tài)細胞的關(guān)鍵是什么？

2、如果DNA轉(zhuǎn)化后，沒有得到轉(zhuǎn)化子或者轉(zhuǎn)化子很少，分析原因。

3、如何提高轉(zhuǎn)化效率？

第四篇：實驗四：細菌的接種、培養(yǎng)和分離技術(shù)

實驗四：細菌的接種、培養(yǎng)和分離技術(shù)

一、實驗?zāi)康呐c要求：

（1）掌握從環(huán)境（土壤、水體、活性污泥等）中分離培養(yǎng)細菌的方法，從而獲得若干種細菌純培養(yǎng)技能

（2）掌握細菌純種分離的方法：稀釋平板分離法和平板劃線法。

（3）掌握幾種接種技術(shù)：斜面接種技術(shù)、穿刺接種、稀釋平板涂布法等。

二、實驗原理

在土壤、水、空氣或人及動、植物體中，不同種類的微生物絕大多數(shù)都是混雜生活在一起，當我們希望獲得某一種微生物時，就必須從混雜的微生物類群中分離它，以得到只含有這一種微生物的純培養(yǎng)，這種獲得純培養(yǎng)的方法稱為微生物的分離與純化。

為了獲得某種微生物的純培養(yǎng)。一般是根據(jù)該微生物對營養(yǎng)、酸堿度、氧等條件要求不同，而供給它適宜的培養(yǎng)條件，或加入某種抑制劑造成只利于此菌生長，而抑制其他菌生長的環(huán)境，從而淘汰其他一些不需要的微生物，再用稀釋涂布平板法或稀釋混合平板法或平板劃線分離法等分離、純化該微生物，直至得到純菌株。

三、實驗器材

1、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基

2、盛9ml無菌水的試管，盛90m1無菌水并帶有玻璃珠的三角燒瓶，1ml和5ml無菌 吸管，無菌培養(yǎng)皿；

3、接種環(huán)，土樣，酒精燈等。

四、操作步驟

1、倒平板 將加熱融化的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基倒平板，并標明培養(yǎng)基的名稱。

2、貼標簽 接種前在試管上貼上標簽，注明菌名、接種日期、接種人姓名等。貼在距試管口徑2-3厘米的位置。

3、點燃酒精燈。

4、接種

取接種環(huán) 右手拿接種環(huán)(如握鋼筆一樣)、在火焰上將環(huán)端燒紅滅菌，然后將有可能伸入試管的其余部分，均用火燒過滅菌。

環(huán)冷卻 將灼燒過的接種環(huán)伸入菌種管，先使環(huán)接觸邊壁，使其冷卻。

取菌種 待環(huán)冷卻后輕輕沾取經(jīng)稀釋10倍的土壤懸液-環(huán)，然后將接種環(huán)移出菌種管，注意不要使環(huán)的部分碰到管壁，取出后不可使環(huán)通過火焰。

接種 在火焰旁迅速將沾有菌種的接種環(huán)在平板上劃線。劃線的方法很多，但無論哪種方法劃線，其目的都是通過劃線將樣品在平板上進行稀釋，使形成單個菌落。常用的劃線方法有下列二種：

⑴用接種環(huán)以無菌操作挑取土壤懸液一環(huán)，先在平板培養(yǎng)基的一邊作第一次平行劃線3-4條，再轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿約70°角，并將接種環(huán)上剩余物燒掉，待冷卻后通過第一次劃線部分作第二次平行劃線，再用同法通過第二次平行劃線部分作第三次平行劃線和通過第三次平行劃線部分作第四次平行劃線(圖A)。劃線完畢后，蓋上皿蓋，倒置于溫室培養(yǎng)。

⑵將挑取有樣品的接種環(huán)在平板培養(yǎng)基上作連續(xù)劃線(圖B)。劃線完畢后，蓋上皿蓋，倒置溫室培養(yǎng)。

環(huán)滅菌 將接種環(huán)燒紅滅菌。

5、挑菌 將培養(yǎng)后長出的單個菌落分別挑取接種到上述三種培養(yǎng)基的斜面上，分別置25℃和28℃溫室中培養(yǎng)，待菌苔長出后，檢查菌苔是否單純，也可用顯微鏡涂片染色檢查是否是單一的微生物，若有其他雜菌混雜，就要再一次進行分離、純化，直到獲得純培養(yǎng)。

四、注意事項

1、實驗操作過程中無菌操作。

第五篇：實驗四

電 子 科 技 大 學

實

驗

報

告

學生姓名：

學 號：

指導教師： 實驗地點：

實驗時間：

一、實驗室名稱：

Linux環(huán)境高級編程實驗室

二、實驗項目名稱：

插件框架實驗

三、實驗學時：

4學時

四、實驗?zāi)康模?/p>

需要說明為什么要進行本次實驗

五、實驗內(nèi)容：

PPT上的4個版本程序，以及綜合練習

六、實驗步驟：

PPT上的4個版本程序，以及綜合練習

七、總結(jié)及心得體會：

八、對本實驗過程及方法、手段的改進建議：

報告評分：

指導教師簽字：