第一篇：實驗二_____土壤中放線菌的分離

實驗講義5 土壤中枯草芽孢桿菌分離方法

取土樣時最好選取如花壇等地方的土樣，去掉表層5~10cm的土壤后取樣。

放入100ml三角瓶中，加入30ml水，常壓加熱至水沸騰后維持20min，取出，置28-37攝氏度培養(yǎng)24-48h，液面則產(chǎn)生黃白色皮膜。用接種環(huán)取皮膜適量于無菌水中分散，稀釋涂布于蔗糖豆芽汁瓊脂平皿，置28-37攝氏度培養(yǎng)24-48h，挑取典型菌落。

實驗6

土壤中放線菌的分離（實訓）

實驗?zāi)康模?掌握配制合成培養(yǎng)基的一般方法。

2掌握稀釋倒平板法從土壤中分離放線菌的基本原理和基本操作技術(shù)。3掌握平板劃線法從土壤中分離放線菌的基本原理和基本操作技術(shù)。4掌握涂布平板法從土壤中分離放線菌的基本原理和基本操作技術(shù)。

實驗材料：

藥品：可溶性淀粉、KNO3、NaCl、K2HPO4?3H2O、MgSO4?7H2O、FeSO4?7H2O、瓊脂。其他：高壓蒸汽滅菌鍋、扭力天平、藥匙、燒杯、量筒、玻璃棒、三角瓶、試管、牛皮紙、硫酸紙、線繩、無菌培養(yǎng)皿、鐵鍬、小鏟、酒精棉球、鑷子、玻璃鉛筆。

實驗原理：

高氏一號合成培養(yǎng)基是培養(yǎng)放線菌的培養(yǎng)基。這種培養(yǎng)基是采用化學成分完全了解的純試劑配制而成的培養(yǎng)基，高氏一號培養(yǎng)基：碳源為可溶性淀粉、氮源為KNO3、NaCl、K2HPO4?3H2O、MgSO4?7H2O 作為無機鹽，F(xiàn)eSO4?7H2O作為微生物的微量元素，提供鐵離子等組成。

放線菌是重要的抗生素產(chǎn)生菌，主要分布在土壤中，其數(shù)量僅次于細菌，一般在中性偏堿性、有機質(zhì)豐富、通氣性好的土壤中含量較多。由于土壤中的微生物是各種不同種類微生物的混合體，為了研究某種微生物，就必須把它們從這些混雜的微生物群體中分離出來，從而獲得某一菌株的純培養(yǎng)。分離放線菌常用稀釋倒平板法。根據(jù)放線菌的營養(yǎng)、酸堿度等條件要求，常選用合成培養(yǎng)基或有機氮培養(yǎng)基。如果培養(yǎng)基成分改變，或土壤預(yù)先處理（120℃熱處理1h），或加入某種抑制劑（如加數(shù)滴10%酚等），都可以使細菌，霉菌出現(xiàn)的數(shù)量大大減少，從而淘汰了其它雜菌。再通過稀釋法，使放線菌在固體培養(yǎng)基上形成單獨菌落，并可得到純菌株。

實驗步驟：

1.高氏一號合成培養(yǎng)基的制備

高氏一號瓊脂培養(yǎng)基（培養(yǎng)放線菌用）

可溶性淀粉20g，硝酸鉀1g,氯化鈉0.5g，K2HPO4 ?3H2O 0.5g，MgSO4?7H2O 0.5g，F(xiàn)eSO4?7H2O 0.01g，瓊脂20g，水1000ml，pH7.2～7.4。

配制時，先用冷水，將淀粉調(diào)成糊狀，倒入煮沸的水中，在火上加熱，邊攪拌邊加入其他成分，溶化后，補足水分至1000ml。112℃滅菌20分鐘。

2.土壤中放線菌的分離（1）待測樣液的制備

選定取樣點（最好是有機質(zhì)含量高的菜地），按對角交叉（五點法）取樣。先除去表層約2cm的土壤，將鏟子插入土中數(shù)次，然后取2～10cm處的土壤。盛土的容器應(yīng)是無菌的。將5點樣品約1kg充分混勻，除去碎石、植物殘根等，土樣取回后應(yīng)盡快投入實驗。

稱土樣1g于盛有99mL無菌水或無菌生理鹽水并裝有玻璃珠的三角瓶中，振蕩10～20min，使土樣中的菌體、芽孢或孢子均勻分散，此即為10-2濃度的菌懸液，靜置30s。另取裝有9ml無菌水的試管3支，編號10-

3、10-

4、10-5。用無菌吸管無菌操作取10-2濃度的土壤懸液1ml并加入編號10-3的無菌試管中，并吹吸吸管2~3次，使與9ml水混勻，即為10-3濃度的土壤稀釋液。依此類推，直到稀釋至10-5的試管中（每個稀釋度換1支無菌吸管）。稀釋過程需在無菌室或無菌操作條件下進行。（2）稀釋倒平板法分離土壤中放線菌

-5-4-5-4取2支1毫升移液管分別從10、10菌懸液中吸取1毫升菌懸液，分別注入編號10、10的培養(yǎng)皿內(nèi)。將溫度為45～50℃的高氏一號培養(yǎng)基倒入上述各培養(yǎng)皿內(nèi)，輕輕旋轉(zhuǎn)使菌懸液充分混合均勻，凝固后，將培養(yǎng)皿倒扣放置在溫暖處（28℃左右），每天觀察培養(yǎng)基表面有無微生物菌落。（3）涂布平板法分離土壤中放線菌

取2套無菌平皿，在皿底貼上標簽，注明土壤稀釋液的稀釋度（10-

4、10-5）、組別、姓名、操作日期等。每個稀釋度做一個培養(yǎng)皿。然后在每皿中倒入已溶化并冷至50℃左右的高氏一號培養(yǎng)基15~20ml左右，待冷凝成平板。

用無菌吸管從濃度最小稀釋液開始，每次吸取0.1ml加到一組相應(yīng)編號（10-5）的高氏一號平板上（每次吸取前，吸管要在液體內(nèi)吹吸幾次），再依次將10-4的土壤稀釋液加到相應(yīng)平板上。用無菌刮棒（從濃度小的稀釋液開始）將加入平板培養(yǎng)基上的土壤稀釋液在整個平板表面涂勻。（4）平板劃線法分離土壤中放線菌

取一培養(yǎng)皿置于實驗臺上，左手將培養(yǎng)皿打開稍許，向培養(yǎng)皿內(nèi)注入熔化的營養(yǎng)固體培養(yǎng)基10～12毫升，輕輕轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿，使其中的培養(yǎng)基分布均勻，平放桌上，使其凝成平板。然后在皿底用蠟筆劃分A、B、C、D幾個區(qū)。每組兩個平板培養(yǎng)基。

將培養(yǎng)皿底部用姆指和無名指固定成傾斜狀態(tài)，在火焰旁將培養(yǎng)皿稍微打開。在此同時，用環(huán)狀接種針在火焰旁取少許10-2濃度的土壤稀釋液，迅速送入培養(yǎng)皿內(nèi)，在平板培養(yǎng)基的一邊，作第1次平行劃線 6～7條，轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿約70°角，用燒過冷卻的接種針，通過第1次劃線部分作第2次平行劃線，然后再用同樣方法，作第3次平行劃線。劃線時，接種針應(yīng)與平板表面成30°角左右。不要使接種針碰到培養(yǎng)皿邊緣，也不要將培養(yǎng)基劃破。（5）培養(yǎng)

接種完畢，將平皿放入28℃恒溫箱培養(yǎng)7天，觀察平皿上放線菌（主要是鏈霉菌）菌落。（6）挑菌落

待三種方法的平板長出菌落后，鑒定微生物類群，并根據(jù)鏡檢結(jié)果，判斷是否已分離到了純菌種。如果菌種很純，則可轉(zhuǎn)移到斜面培養(yǎng)基上進一步培養(yǎng)。轉(zhuǎn)種至斜面，菌種用牛皮紙包好，置4℃冰箱中保存。

準備實驗內(nèi)容：

問曾老師借 無菌刮棒 打火機 酒精燈

無菌報紙包（1個）

99mL水/三角瓶（玻璃珠）

5支移液管 3支9mL水的試管

培養(yǎng)皿6套 槍頭（1mL/0.1mL）

高氏一號培養(yǎng)基500mL（150mL三角瓶2個，200mL試管）思考題：

1.檢查接種后培養(yǎng)物的生長情況和染菌情況。

2.觀察與記錄以下內(nèi)容。

大小

形狀

邊緣顏色

表面代謝物

種類 3.如何區(qū)分放線菌和真菌、細菌？

放線菌菌落小而緊密、干燥、不透明、難以挑取，當大量孢子覆蓋于菌落表面時，就形成表面為粉末狀或顆粒狀的典型放線菌菌落，由于基內(nèi)菌絲和孢子常有顏色，使得菌落的正反面呈現(xiàn)出不同的色澤。霉菌菌落的話應(yīng)該是比較大的，可能是大而疏松也可能大而緊密，其他一些跟放線菌都差不多，比如都是顏色多種多樣，與培養(yǎng)基緊密結(jié)合難于挑取。但在氣味上有很大差別，放線菌具有泥腥味，而霉菌具有霉味。還有一點就是放線菌菌落周圍瓊脂平面會有變形的現(xiàn)象。若稀釋平板的稀釋度不夠，放線菌會被抑制了或者菌落太小，而其他細菌的菌落又太多，不容易找到。

第二篇：土壤中放線菌的分離和純化實驗

土壤中放線菌的分離和純化實驗

一、實驗?zāi)康?/p>

1、制作MS培養(yǎng)基的方法，掌握母液的保存方法。

2、掌握培養(yǎng)基的滅菌方法。

掌握外植體的消毒和超凈工作臺的使用。

4、掌握放線菌的分離純化及染色的基本流程；

5、掌握高氏一號培養(yǎng)基的配制方法；

6、復(fù)習分離純化放線菌的基本操作技術(shù)、培養(yǎng)方學會使用高壓蒸汽滅菌鍋。

7、培養(yǎng)微生物實驗的設(shè)計思路和動手能力。

二、實驗材料

高壓蒸汽鍋、培養(yǎng)瓶、石斛的愈傷組織、超凈工作臺，酒精燈、酒精棉球、鑷子、電子天平、稱量紙、燒杯、量筒、顯微鏡、三角錐形瓶、無菌培養(yǎng)皿、接種環(huán)、酒精燈、分析天平；接種環(huán)、載玻片、蓋玻片、玻璃珠、移液槍、剪刀

三、實驗原理

植物組織培養(yǎng)即植物無菌培養(yǎng)技術(shù)，又稱離體培養(yǎng)，是根據(jù)植物細胞具有全能性的理論，利用植物體離體的器官(如根、莖、葉、莖尖、花、果實等）、組織（如形成層、表皮、皮層、髓部細胞、胚乳等）

第 1 頁 或細胞（如大孢子、小孢子、體細胞等）以及原生質(zhì)體,在無菌和適宜的人工培養(yǎng)基及溫度等人工條件下，能誘導出愈傷組織、不定芽、不定根，最后形成完整的植株的學科。

四、實驗步驟

1、配制MS培養(yǎng)基8L，稱取馬鈴薯1600g、香蕉400g、蔗糖240g、活性炭8半勺、瓊脂80g、配制 母液。

2、配制培養(yǎng)液時應(yīng)注意：

①在使用提前配制的母液時，應(yīng)在量取各種母液之前，輕輕搖動盛放母液的瓶子，如果發(fā)現(xiàn)瓶中有沉淀、懸浮物或被微生物污染，應(yīng)立即淘汰這種母液，重新進行配制；為防止母液被微生物污染，有機母液放在冰箱里4℃保存；

②用量筒或移液管量取培養(yǎng)基母液之前，必須用所量取的母液將量筒或移液管潤洗2次；

③量取母液時，最好將各種母液按將要量取的順序?qū)懺诩埳?，量?種，劃掉1種，以免出錯。溶化瓊脂 用粗天平分別稱取瓊脂9 g、蔗糖30 g，放入1 000 mL的搪瓷量杯中，再加入蒸餾水750 mL，用電爐加熱，邊加熱邊用玻璃棒攪拌，直到液體呈半透明狀。然后再將配好的混合培養(yǎng)液加入到煮沸的瓊脂中，最后加蒸餾水定容至1 000 mL，攪拌均勻。

需要注意的是，在加熱瓊脂，制備培養(yǎng)基的過程中，操作者千萬不能離開，否則沸騰的瓊脂外溢，就需要重新稱量、制備。此外，如果沒有搪瓷量杯，可用大燒杯代替。但要注意大燒杯底的外表面不能沾水，第 2 頁 否則加熱時燒杯容易炸裂，使溶液外溢，造成燙傷。調(diào)pH 用滴管吸取物質(zhì)的量濃度為1 mol/L的NaOH溶液，逐滴滴入溶化的培養(yǎng)基中，邊滴邊攪拌，并隨時用pH試紙測培養(yǎng)基的pH，一直調(diào)到培養(yǎng)基的pH為6（5.8~6.5）左右為止。培養(yǎng)基的分裝 溶化的培養(yǎng)基應(yīng)該趁熱分裝。分裝時，先將培養(yǎng)基倒入燒杯中，然后將燒杯中的培養(yǎng)基倒入錐形瓶（50 mL或100 mL）中。注意不要讓培養(yǎng)基沾到瓶口和瓶壁上。錐形瓶中培養(yǎng)基的量約為錐形瓶容量的1/5～1/4。每1 000 mL培養(yǎng)基，可分裝25～30瓶。培養(yǎng)基分裝完畢后，應(yīng)及時封蓋瓶口。用2塊硫酸紙（每塊大小約為9 cm×9 cm）中間夾1層薄牛皮紙封蓋瓶口，并用線繩捆扎。最后在錐形瓶外壁貼上標簽。

3、高壓滅菌 培養(yǎng)基的高壓滅菌包括以下幾個步驟。

第一，碼放錐形瓶。將裝有培養(yǎng)基的錐形瓶直立于金屬小筐中，再放入高壓蒸氣滅菌鍋內(nèi)。如果沒有金屬小筐，可以在兩層錐形瓶之間放一塊玻璃板隔開。

第二，放置其他需要滅菌的物品。將其他需要滅菌的物品也放入高壓蒸氣滅菌鍋內(nèi)，如裝有蒸餾水的錐形瓶、帶螺口蓋的玻璃瓶、燒杯、廣口瓶（以上物品都要用牛皮紙封口），用報紙包裹的培養(yǎng)皿、剪刀、解剖刀、鑷子、濾紙、鉛筆等。

第三，滅菌。待需要滅菌的物品碼放完畢，蓋上鍋蓋。在98 kPa、121 ℃下，滅菌20 min。滅菌后取出錐形瓶，讓其中的培養(yǎng)基自然冷卻凝固后再使用。

第 3 頁 4,、再在操凈工上進行消毒，先用紫外線照射30MIN，然后送風，關(guān)閉紫外燈，改 用日光燈，對手用酒精進行消毒，對培養(yǎng)基表面也要用酒精進行消毒。準備工作好了，就進行接種。并且要在酒精燈旁邊進行操作，避免污染。鑷子要在雙孔滅菌器上進行滅菌。

4、接種完成后要整理工作臺，并且把培養(yǎng)瓶拿到培養(yǎng)架上進行日光培養(yǎng)。

五、放線菌的提取步驟

5、（1）稱取土樣2.00g，在火焰旁加到一個盛有48ml無菌水并裝有玻璃珠的100ml錐形瓶中。振蕩20-30min，使樣品的菌體、芽孢或孢子均勻分散。靜止20-30s，標記為編號1。

6、（2）按照一定的梯度進行稀釋（該實驗采用10倍梯度）

①取3個各裝有9.5ml無菌水的25ml錐形瓶，分別按照順序標記好2、3、4.②在超凈工作臺上，用微量移液器從1號錐形瓶中移取0.5ml土壤懸液加到2號錐形瓶中，搖勻后，再用微量移液器從2號錐形瓶中移取0.5ml土壤懸液加到3號錐形瓶中，依此類推，7、分別將土壤懸液制成10-

1、10-

2、10-

3、10-

4、10-

5、10-

6、10-

7、10-

8、10-

9、10-10的土壤稀釋液。

六、稀釋涂布法分離土壤中放線菌

8、（1）倒平板

9、將配制好并且滅菌的高氏一號培養(yǎng)基加熱融化，待冷卻至55—60℃時，往高氏1號培養(yǎng)基中加入1ml的0.5%重鉻酸鉀, 然后分別倒平板。方法是在超凈工作臺，右手持盛培養(yǎng)基的三角燒瓶，置火焰旁

第 4 頁 邊，左手拿平皿并松動瓶塞，用手掌邊緣和小指、無名指夾住拔出。令三角瓶瓶口在火焰上滅菌，左手將培養(yǎng)皿蓋在火焰附近打開一縫，迅速倒入培養(yǎng)液約15ml，加蓋后輕輕搖動培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)基均勻分布，平置于桌面上，待冷凝后即成平板。共制備6個平板（一個稀釋度做3個平行樣品）。

10、（3）涂布平板

11、用1ml無菌吸管分別精確地吸取10-

4、10-

5、10-6的稀釋菌液1ml，對號放入編好號的無菌培養(yǎng)皿中，每一濃度對應(yīng)兩個平板。用無菌涂布棒（從濃度小液開始）將加入平板培養(yǎng)基上的土壤稀釋液在整個平板表面涂勻，涂完一個平板用酒精燈滅菌。

12、（4）倒置平板

13、將培養(yǎng)基平板倒置（防皿蓋的冷凝水下滴），置于28度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d14、15、5、放線菌的純化

16、（1）倒平板

同上

17、（2）平板劃線

18、將蘸有菌種的接種環(huán)在平板培養(yǎng)基上做以Z字行劃線，每劃完一次要充分燃燒接種環(huán)燒掉殘余微生物，再從上一次劃線處末點開始下一次劃線。劃線完畢后蓋上培養(yǎng)皿蓋，倒置與恒溫箱中培養(yǎng)。

6、放線菌的觀察玻璃紙法

19、將玻璃紙剪成培養(yǎng)皿大小，用舊報紙隔層疊好后滅菌。

第 5 頁 20、將高氏一號瓊脂培養(yǎng)基熔化后在火焰旁倒入無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，每皿倒15ml左右，待培養(yǎng)基凝固后，在無菌操作下用鑷子將無菌玻璃紙履蓋在瓊脂平板上即制成玻璃紙瓊脂平板培養(yǎng)基。

21、（3）用接種環(huán)挑取純化后的放線菌，在玻璃紙上劃線接種。

22、（4）將接種的玻璃紙瓊脂平板置28—30℃下培養(yǎng)。

23、（5）在培養(yǎng)至3天，5天，7天時，從溫室中取出平皿。在超凈工作臺上，打開培養(yǎng)皿，用無菌鑷子將玻璃紙與培養(yǎng)基分離，用無菌剪刀取小片玻璃紙置于載玻片上用顯微鏡觀察。

7、放線菌保藏

斜面低溫保藏法

長后，棉塞部分用油紙包扎好，移至 2—8 ℃的冰箱中保藏，保存 2—4 個月，移種一次。

將純化培養(yǎng)后的放線菌接種在適宜的固體斜面培養(yǎng)基上，待菌充分生

第 6 頁

第三篇：實驗2 土壤中稀有放線菌的分離--土壤樣品采集

實驗2 土壤中稀有放線菌的分離--土壤樣品采集 1 目的

1.1 了解微生物分離和純化的原理 1.2 掌握常用的分離純化微生物的方法 2 原理

從混雜微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過程稱為微生物分離與純化。其基本原理是選擇適合于待分離微生物的生長條件，如營養(yǎng)成分、酸堿度、溫度和氧等要求,或加入某種抑制劑造成只利于該微生物生長，而抑制其他微生物生長的環(huán)境，從而淘汰一些不需要的微生物。土壤是微生物生活的大本營，它所含微生物無論是數(shù)量還是種類都是極其豐富的。因此土壤是微生物多樣性的重要場所，是發(fā)掘微生物資源的重要基地，可以從中分離、純化得到許多有價值的菌株。本實驗將采用不同的培養(yǎng)基從土壤中分離不同類型的微生物。3 材料 3.1 培養(yǎng)基

淀粉瓊脂培養(yǎng)基(高氏I號培養(yǎng)基)，牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基，查氏瓊脂培養(yǎng)基。3.2 儀器或其它用具 取樣鏟、塑料袋、記號筆、1．布點：按照土壤類型和作物種植品種分布，按土壤肥力高、中、低分別采樣。一般150-300畝（不同地區(qū)可根據(jù)情況確定）采取一個耕層混合樣，采樣點以鋸齒型或蛇型分布，要做到盡量均勻和隨機。應(yīng)用土壤底圖確定采樣地塊和采樣點，并在圖上標出，確定調(diào)查采樣路線和方案。

2．采樣部位和深度：用取樣鏟，將表層5cm左右的浮土除去，取5～25cm處的土樣0.5-1kg，在采樣過程中，采取的混合樣一般都大于該重量，所以要去掉部分樣品，將所有采樣點的樣品攤在塑料布上，除去動植物殘體、石礫等雜質(zhì)，將大塊的樣品整碎，混勻，攤成園形，中間劃十字分成四份，然后對角線去掉兩份，若樣品還多，將樣品再混合均勻，再反復(fù)進行四分法，直至樣品最終重量要求0.5-1公斤（試驗用的樣品2公斤）為止。如下示意圖。一用取土器或鋤頭直接挖入耕層取樣。每個點切取的土塊寬度、厚度應(yīng)基本一致。裝入事先準備好的塑料袋內(nèi)扎好。北方土壤干燥，可在10～30cm處取樣。

3．采樣方法、數(shù)量：1)面積小，地勢平坦，肥力均勻的田塊，采用對角采樣法。2)面積中等，地勢平整，有些肥力差異的田塊采用棋盤式采樣法。3)面積大，地勢又不平坦，肥力不勻的田塊采用蛇型線采樣法。土樣由20個樣點組成。樣點分布范圍不少于3畝（各地可根據(jù)情況確定）。每個點的取土深度及重量應(yīng)均勻一致，土樣上層和下層的比例也要相同。采樣器應(yīng)垂直于地面，入土至規(guī)定的深度。采樣使用不銹鋼、木、竹或塑料器具。樣品處理、儲存等過程不要接觸金屬器具和橡膠制品，以防污染。每個混合樣品一般取1kg左右，如果采集樣品太多，可用“四分法”棄去多余土壤。

4．樣品編號和檔案紀錄：做好采樣記錄：土樣編號、采樣地點及經(jīng)緯度、土壤名稱、采樣深度、采樣日期、采樣人等。

第四篇：土壤中放線菌的采集、分離、培養(yǎng)、發(fā)酵及提取實驗報告

土壤中放線菌的采集、分離、培養(yǎng)、發(fā)酵及提取

實驗?zāi)康模?/p>

1、從土壤中分離產(chǎn)抗生素的放線菌

2、放線菌的培養(yǎng)

3、放線菌的發(fā)酵產(chǎn)生活性物質(zhì)

4、放線菌產(chǎn)生的活性物質(zhì)提取。實驗原理：

放線菌是一類呈菌絲狀生長，主要以孢子繁殖。放線菌與人類的生產(chǎn)和生活關(guān)系極為密切，目前廣泛應(yīng)用的抗生素約80%是各種放線菌所產(chǎn)生的。

許多臨床應(yīng)用的抗生素均由土壤中分離的放線菌產(chǎn)生。采用選擇培養(yǎng)基可分離土壤中的放線菌。產(chǎn)抗生素的放線菌經(jīng)液體培養(yǎng)后，其分泌的抗生素存在于離心所得的上清液中，可采用微生物的抑菌試驗進行檢測，從而篩選到所需的抗生素產(chǎn)生菌，并對其進一步培養(yǎng)，繁殖，發(fā)酵，最終提取我們所需的抗生素。實驗器材：

1、土壤

2、培養(yǎng)基：高氏一號培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基

3、其他：重鉻酸鉀、培養(yǎng)皿、牛津杯、接種環(huán)、酒精燈，無菌涂棒、三角錐瓶、高壓蒸汽滅菌鍋、天平、藥匙、燒杯、量筒、玻璃棒、試管、牛皮紙、線繩等。實驗步驟：

一、土壤放線菌株的采集

采集樣品：選定取樣點（最好是有機質(zhì)含量高的菜地），按對角交叉（五點法）取樣。先除去表層約2cm的土壤，將鏟子插入土中數(shù)次，然后取2～10cm處的土壤。將5點樣品約1kg充分混勻，除去碎石、植物殘根等。

樣品（土壤）處理：室溫風干

二、土壤中放線菌的分離、培養(yǎng)

1、配制淀粉培養(yǎng)基

淀粉瓊脂培養(yǎng)基（高氏培養(yǎng)基）

可溶性淀粉2g；硝酸鉀0.1g；磷酸氫二鉀0.05g；氯化鈉0.05g；硫酸鎂0.05g；硫酸亞鐵0.001g；瓊脂2g；水100ml.先把淀粉放在燒杯里，用5ml水調(diào)成糊狀后，倒入95ml水，攪勻后加入其他藥品，使它溶解。加熱到煮沸時加入瓊脂，不停攪拌，待瓊脂完全溶解后，補足失水。調(diào)整PH到7.2-7.4，分裝后滅菌，備用。

2、土壤懸液梯度稀釋

① 將5.0g土壤加入到50ml滅菌的生理鹽水中，震蕩10min制備土壤懸液。

② 用無菌吸管吸取1ml土壤懸液，加入到9ml滅菌的生理鹽水中10倍稀釋。

③ 按1：:1稀釋至10-

3、10-

4、10-5，將3塊滅菌平板分別標記10-

3、10-

4、10-5，稀釋過程應(yīng)在無菌條件下進行。

3、將高氏一號培養(yǎng)基加熱溶化，待冷至55-60℃時，加入3%的重鉻酸鉀數(shù)滴（大約100ml加0.3ml），混合均勻。分別吸取0.1ml稀釋液于滅菌平皿中，再加入10-15ml恒溫于55℃的含有重鉻酸鉀的淀粉瓊脂培養(yǎng)基中，輕輕旋轉(zhuǎn)混合均勻。

4、平皿倒置于培養(yǎng)箱28℃恒溫培養(yǎng)一周左右。

5、將平皿上的放線菌菌落跳去在淀粉瓊脂平皿上四區(qū)劃線進行分離純化，28℃恒溫培養(yǎng)一周左右，觀察放線菌菌落特征。

6、將純化好的菌落轉(zhuǎn)入到斜面，4℃條件下進行保存。

三、抗菌譜的測定

1、挑取一個放線菌的菌落接種到含有250ml淀粉液體培養(yǎng)基的三角瓶，28℃恒溫培養(yǎng)一周左右。

2、將2ml培養(yǎng)8h的大腸桿菌分別加到200ml滅菌的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中混合均勻，每培養(yǎng)皿中倒入20ml，凝固后待用。

3、在上面培養(yǎng)皿中均勻放入4個牛津杯，每個牛津杯中加入1ml放線菌發(fā)酵培養(yǎng)液。培養(yǎng)皿放入37℃培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)12h。

4、測量抑菌圈的大小。

四、發(fā)酵

1、配制種子培養(yǎng)基

蔗糖22.5g，黃豆粉12.5g，磷酸氫二鉀0.2g，氯化鈉1g，硫酸鈉0.1g，硫酸亞鐵0.01g，碳酸鈣2g，蒸餾水1000ml，PH值7.2,121℃滅菌20min。

2、配制發(fā)酵培養(yǎng)基

蔗糖45g，黃豆粉25g，磷酸氫二鉀0.2g，氯化鈉1g，硫酸鈉0.1g，硫酸亞鐵0.01g，碳酸鈣3g，蒸餾水1000ml，PH7.2。121℃滅菌20min。

3、種子液的制備

將試管斜面菌種轉(zhuǎn)管活化，28℃培養(yǎng)7天后，以接種取一環(huán)孢子轉(zhuǎn)入裝有50ml種子培養(yǎng)基的250ml三角搖瓶中，于28℃200r/min-1 培養(yǎng)4天。

4、發(fā)酵培養(yǎng)

以6%的接種量將種子液轉(zhuǎn)接入裝有50ml初始發(fā)酵培養(yǎng)基的250ml三角搖瓶中，于28℃200r/min-

1培養(yǎng)4天。

5、活性檢測

發(fā)酵液經(jīng)4000r/ min-1 離心15min，取上清，杯碟法測定抗菌活性（同三）。

五、提取

1、發(fā)酵液經(jīng)4000r/ min-1 離心15min，取上清，用乙酸乙酯以1:1的比例進行萃取。

2、活性檢測

將萃取液濃縮，杯碟法測定抗菌活性（同三）。

第五篇：藥用植物內(nèi)生放線菌的分離和生物學特性

藥用植物內(nèi)生放線菌的分離和生物學特性

摘要:【目的】探索藥用植物內(nèi)生環(huán)境可培養(yǎng)放線菌的分離、培養(yǎng)方法，總結(jié)藥用植物內(nèi)生放線菌的生物學特

性，探討其物種多樣性，挖掘新的微生物資源?！痉椒ā坎捎?10 種分離培養(yǎng)基對 37 個新鮮的藥用植物樣品

進行內(nèi)生放線菌的分離;通過比較，選擇適合植物內(nèi)生放線菌生長的培養(yǎng)條件;根據(jù)菌落形態(tài)和細胞特征觀 察結(jié)果，選擇其中 174 株菌測定 16S rRNA 基因序列，分析藥用植物內(nèi)生放線菌的多樣性;應(yīng)用 Biolog GEN III 微孔培養(yǎng)、API 50CH 以及 API ZYM 試劑條測試 27 株代表菌株的生理生 化特性?！窘Y(jié) 果】分 離 得到 940 株植物內(nèi)生菌，分屬于 47 個屬，30 個科，其中放線菌 600 余株，分屬于 34 個屬，共發(fā)現(xiàn)潛在的新分類單元有 個;本研究中藥用植物內(nèi)生放線菌的培養(yǎng)條件是:PYG 培養(yǎng)基、pH7.2、28℃ － 32℃;菌株間的生物學特性的

差異與菌株系統(tǒng)進化關(guān)系呈正相關(guān)關(guān)系;不同環(huán)境植物的內(nèi)生菌菌株的生物學特性差異較大，相同環(huán)境的不

同植物內(nèi)生菌的生物學特性差異較小?！窘Y(jié)論】藥用植物內(nèi)生放線菌物種豐富多樣;藥用植物內(nèi)生放線菌在 唯一碳源利用、發(fā)酵碳源產(chǎn)酸及酶學活性等生理生化特性方面沒有表現(xiàn)出和宿主植物的直接相關(guān)性，而是呈

現(xiàn)出和宿主植物的地理分布有一定的相關(guān)性。

關(guān)鍵詞:藥用植物，內(nèi)生放線菌，生物學特性，多樣性

中圖分類號:Q939 文獻標識碼:A 文章編號:0001-6209(2013)01-0015-09 藥用植物有著獨特的藥理活性，特別是在治療

一些疑難病癥上有著不可替代的作用。如茵陳主治

黃疸型肝炎、肝硬化、肝腹水等肝病;狼毒主治結(jié)核、氣喘等，還具有抗腫瘤的作用。藥用植物的有效成

分的提取和研究一直是國內(nèi)的熱門課題。1993 年，美國蒙大拿州立大學的 Stierle 研究小組首次從短葉

紫杉(Taxus breviforlia)中分離得到一株能合成抗癌

物 質(zhì) 紫 杉 醇 的 內(nèi) 生 真 菌 新 種 安 德 氏 紫 杉 霉 菌(Taxomyces andreanae)［1］，并證明內(nèi)生菌具有合成

與宿主植物相同或相似的活性成分的功能。由此掀

起了對藥用植物內(nèi)生菌研究的熱潮?！段⑸飳W通

報》編輯部的郝榮喬于 2009 年初對 2008 年的 點評中報道“植物內(nèi)生菌成為我國當前微生物研究

領(lǐng)域的熱點” ［2］

。的確，藥用植物內(nèi)生菌的研究和 有效開發(fā)對藥用植物資源、特別是瀕危植物資源的

保護具有重要的意義。

本研究選取采集自北京、貴州、云南和西藏等地 的藥用植物樣品 37 份，經(jīng)過表面消毒處理后，應(yīng)用

放線菌分離培養(yǎng)技術(shù)從中分離放線菌菌株;根據(jù)菌

株的 16S rRNA 基因序列信息以及系統(tǒng)進化關(guān)系，探討藥用植物內(nèi)生放線菌的物種多樣性;通過生理

生化實驗測定，揭示藥用植物內(nèi)生放線菌的生物學 杜慧竟等: 藥用植物內(nèi)生放線菌的分離和生物學特性． /微生物學報(2013)53(1)ordination analysis，NTSYSpc v． 2.02)進行分析，構(gòu)

建表型數(shù)值分類聚類圖，分析實驗菌株的生物學特 性。2 結(jié)果

2.1 菌種分離結(jié)果

從 37 份藥用植物中共分離、純化得到 940 株純

培養(yǎng)物(表 1)。從云南、貴州和西藏來源的植物樣

品中分離得到的放線菌的比例稍高于北京的植物樣

品;來源于植物根、莖、葉的菌株數(shù)量基本相當，沒有

明顯差異;和其它 9 種分離培養(yǎng)基相比較，丙酸鈉分

離培養(yǎng)基(M7)分離得到的放線菌數(shù)量占顯著優(yōu)勢。

表 1 藥用植物內(nèi)生菌分離結(jié)果統(tǒng)計

Table 1 The strains isolated from the medicinal plants Plant number Number of isolates Plant number Number of isolates Plant number Number of isolates Plant number Number of isolates P1 34 P11 6 P20 10 P29 64 P2 40 P12 18 P21 15 P30 2 P3 46 P13 10 P22 4 P31 8 P4 43 P14 1 P23 3 P32 44 P5 17 P15 8 P24 77 P33 45 P6 44 P16 15 P25 12 P34 31 P7 8 P17 14 P26 73 P35 34 P8 4 P18 1 P27 98 P36 12 P9 6 P19 12 P28 59 P37 3 P10 19

通過菌落形態(tài)以及菌株細胞顯微形態(tài)的初步觀

察結(jié)果以及菌株來源，選擇 174 株代表菌株進行

16S rRNA 基 因 序 列 測 定 和 比 對，結(jié) 果 顯 示，174 株

分離菌株隸屬于 30 個科、47 個屬，其中的放線菌 139 株，分屬于 34 個屬(圖 1)。以菌株的16S rRNA

基因序列與 NCBI 數(shù)據(jù)庫中有效描述菌種相似性 ＜

98.2% 作 為 操 作 分 類 單 元(taxanomic operational

units，OTU)的劃分 界 限 ［12 － 13］，其中有 22 株菌代表

了 7 個新的操作分類單元。

2.2 藥用植物內(nèi)生菌的生物學特性

為了比較研究藥用植物內(nèi)生放線菌的生物學特

性，選擇了 27 株分離菌株進行了生長溫度、pH 值、唯一碳源利用、利用碳源產(chǎn)酸以及酶學特性測試，其

中包含了 2 株藥用植物內(nèi)生細菌。來源于韓國菌種

保藏中心的 3 個典型培養(yǎng)物 KCTC 19272 T、KCTC 19469 T

和 KCTC 19037 T

(分離自不同土壤環(huán)境)同時 做了平行對照實驗(表 2)。起初，分離菌株在對應(yīng)的原始分離培養(yǎng)基和繼

代培養(yǎng)基 PYG 上生長良好，但是隨著傳代次數(shù)的增

加，部分內(nèi)生菌生長變?nèi)?，甚至無法繼續(xù)傳代，而 3 株來源于土壤樣品的對照菌的生長狀態(tài)則幾乎不受

傳代次數(shù)的影響。內(nèi)生菌菌株的溫度生長范圍是

10℃ － 37℃，在 28℃ － 32℃ 生長 較 好;多 數(shù) 菌 株 在

pH 6.0 － 10 范圍 內(nèi) 都 能 生長，在 pH 中 性 至 弱 堿 性 條件下生長最佳。

本實驗中 27 株植物內(nèi)生菌對碳源的利用呈現(xiàn)

以下趨勢:菌株對二糖和多糖類的利用率最高，接下

來依次是單糖，脂類，氨基酸及衍生物。27 株植物

內(nèi)生菌中，50% 以上的菌株都能利用以下底物作為

唯一碳源和能量來源:亞碲酸鉀，丁酸鈉，甘露醇，纖

維二糖，葡萄糖，麥芽糖，松二糖，甘油，果糖，海藻

糖，蔗糖，水 楊 苷，甘 露 糖 和 醋 酸。在 菌 株 I10A-01402 的分類學研究 時，用 來 源于 土壤 環(huán)境 的近源

菌 N． koreensis 19272 T，N． ginsengisegetis KCTC 19469 T，N． alkalitolerans KCTC 19037 T 作為參比進行

了 Biolog Gen Ⅲ 唯 一 碳 源，API 50CH 產(chǎn) 酸 和 API ZYM 酶學特性測定和比較分析。植物內(nèi) 生 菌 I10A-

01402 以及其 它 26 株 內(nèi) 生 菌 都 能 夠利用 Biolog 微

孔板中葡聚糖和 D-麥芽糖，但是，來源于土壤環(huán)境 的 N． koreensis 19272 T，N． ginsengisegetis KCTC 19469 T

和 N． alkalitolerans KCTC 19037 T

等 3 株類諾

卡氏菌屬的菌株都不能利用這兩種糖;I10A-01402

不能利用 N-乙酰類化合物，其它 26 株內(nèi)生菌也都

不能或很少利用此類化合物，而這 3 株土壤來源的

菌株則全部能利用 N-乙酰類化合物作為唯一碳源

和能量來源。27 株藥用植物內(nèi)生菌和 3 株土壤來

源的參比菌株同化 API 50 CH 中的碳源并產(chǎn)酸的情

況以及酶學特性上也表現(xiàn)出較大的差異。本實驗中 株藥用植物內(nèi)生細菌和 28 株 放線菌 相 比較，細菌

能夠更多地利用 Biolog GenⅢ中列舉的唯一碳源，并且同化 API 50 CH 中單個碳源并產(chǎn)酸實驗的陽性 率也高一些，但在 API ZYM 酶學特性測試結(jié)果中沒 有明顯差異。

16S rRNA 基因 序 列 相 似 性 越 高 的 菌 株 的部 分

生理生化特性也趨于相近。例如，草藥菌屬菌株

(Herbiconiux sp．)I10A-01569、草 藥 菌 屬 菌 株

(Herbiconiux sp．)I10A-02268、草 藥 菌 屬 菌 株(Herbiconiux sp．)I10A-02292、寒 冷 桿 菌 屬 菌 株 171 材料和方法 1.1 材料

1.1.1 植物樣品:玉竹、黃精、知母、蒙古黃芪、肥皂

草、藿香、薄荷、金銀花、仙鶴草、櫻桃、大葉玉竹、白

芷、紫蘇、噴瓜、金銀木(橘色果實)、紅色果實金銀

木、虎杖、薯蕷和穿龍薯蕷等 19 份植物樣品采集自

北京(編號 P1 － P19)，大狼毒、狼毒大戟、瑞香狼毒、橙黃瑞香、藏茵陳和云南重樓等 6 份采自云南(P22 － P27)，貴 州重 樓 和 三 七 采 自 貴 州(P28，P29)，綿

頭雪蓮(P20)、包葉雪蓮(P21)以及其余 8 份(P30 － P37)等共 10 份采自西藏。共計 37 份藥用植物樣 品。

1.1.2 培養(yǎng)基:(1)內(nèi)生菌分離培養(yǎng)基: 使用了 10 種分離培養(yǎng)基(M1 － M10)，其中 M1 － M8 培養(yǎng)基是

本實驗室在紅樹植物內(nèi)生放線菌研究中使用的 8 種

內(nèi)生放線菌分離培養(yǎng)基 ［3］，M9 和 M10 的組成如下: M9(g / L): 檸檬酸 0.12，檸檬 酸 鐵 銨 0.12，硝

酸鈉 1.5，磷 酸 氫 二 鉀 0.4，硫 酸 鎂 0.1g，碳 酸 鈣

0.05，碳酸鈉 0.2，瓊脂 12，pH 7.2。M10(g / L): 甘露聚糖 2.0，酪素水解物 0.3，硝

酸鉀 0.1，海洋微量鹽 微量，復(fù)合維生素 微量，瓊

脂 12，pH 7.2。

(2)菌種純化和繼代培養(yǎng)培養(yǎng)基(g/L): 蛋白 胨 3，酵母浸膏粉 5，甘油 10，甜菜堿 1.25，丙酮酸 鈉 1.25，復(fù)合維生素 微量，瓊脂 12，pH 7.2。

1.1.3 抑制劑:抑制真菌和革蘭氏陰性細菌的抑制

劑的種類和劑量參見文獻［3］。

1.1.4 菌 株: 參 比 菌 株 人 參 地 類 諾 卡 氏 菌

(Nocardioides ginsengisegetis)KCTC 19469 T，韓國類

諾卡氏菌(Nocardioides koreensis)KCTC 19272 T 和 耐

堿類 諾 卡 氏 菌(Nocardioides alkalitolerans)KCTC 19037 T

來源于韓國典型培養(yǎng)物保藏中心(KCTC);其它實驗菌均為本研究的分離菌株。

1.1.5 主要試劑:硫 代 硫 酸 鈉、次 氯 酸 鈉、碳 酸 鈉、萘啶酮酸、制霉菌素、重鉻酸鉀等化學試劑均為國產(chǎn)

分析純試劑;PCR 擴增相關(guān)試劑和引物測序均來源

于生工生物工程(北京)，Biolog GEN III 微孔板和基

礎(chǔ)培養(yǎng)液購于美國 BIOLOG 中國代理，API 50CH 和

ZYM 試劑條及相關(guān)試劑購于生物梅里埃公司。

1.2 菌種分離和保藏 具體方法參見文獻［3］。

1.3 菌種初步鑒定和多樣性分析 菌種初步鑒定參照徐麗華等主編的《放線菌系 統(tǒng)學》 ［4］

相關(guān)方法操作。根據(jù)菌落和菌絲形態(tài)初步 觀察排除重復(fù)菌株，選擇代表 性菌 株測 定 其 16S

rRNA 基 因 序 列，并 將 結(jié) 果 提 交 EzTaxon 網(wǎng) 站

(http:/ /004km.cnparative studies of nucleotide sequences． Journal of Molecular Evolution，1980，16: 111-120．

［8］ Kimura M． The Neutral Theory of Molecular Evolution．

Cambridge: Cambridge University Press，1983． ［9］ Saitou N，Nei M． The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees． Molecular Biology and Evolution，1987，4: 406-425． ［10］ Tamura K，Dudley J，Nei M，Kumar S． MEGA4: Molecular evolutionary genetics analysis(MEGA)software version 4.0． Molecular Biology and Evolution，2007，24: 1596-1599．

［11］ Chen HH，Li WJ，Zhang YQ，Wang D，Tang SK． Study on isolation and systematic taxonomy of strains of genus Nesterenkonia． Acta Microbiologica Sinica，2004，44(6): 811-815．(in Chinese)陳華紅，李文均，張玉琴，王棟，唐蜀昆． 涅斯捷連科 氏菌屬 菌 株 的 分 離 及 系 統(tǒng) 學 研 究． 微 生 物 學 報． 2004，44(6): 811-815．

［12］ Keswani J，Whitman WB． Relationship of 16S rRNA

sequence similarity to DNA hybridization in prokaryotes．

International Journal of Systematic and Evolutionary

Microbiology，2001，51(2): 667-678． ［13］ Stackebrandt E，Ebers J． Taxonomic parameters

revisited: tarnished gold standards． Microbiol Today，2006，33，152-155． ［14］ Indananda C，Matsumoto A，Inahashi Y，Takahashi Y，Duangmal K，Thamchaipenet A． Actinophytocola oryzae gen． nov．，sp． nov．，isolated from the roots of Thai

glutinous rice plants，a new member of the family

Pseudonocardiaceae． International Journal of Systematic

and Evolutionary Microbiology，2010，60(5): 1141-1146． ［15］ Behrendt U，Schumann P，Hamada M，Suzuki KI，Sprer C，Ulrich A． Reclassification of Leifsonia ginsengi

(Qiu et al． 2007)as Herbiconiux ginsengi gen． nov．，comb． nov． and description of Herbiconiux solani sp．

nov．，an actinobacterium associated with the

phyllosphere of Solanum tuberosum L． International

Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2011，61(3):1039-1047．

［16］ Tao TS，Yue YY，Chen WX，Chen WF． Proposal of Nakamurella gen． nov． as a substitute for the bacterial genus Microsphaera Yoshimi et al． 1996 and Nakamurellaceae fam． nov． as a substitute for the illegitimate bacterial family Microsphaeraceae Rainey et al． 1997． International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2004，54: 999-1000．

［17］ Cho KM，Hong SY，Lee SM，Kim YH，Kahng GG，Lim YP，Kim H，Yun HD． Endophytic bacterial communities in ginseng and their antifungal activity against pathogens．

Microbial Ecology，2007，54(2): 341-351． ［18］ Amann RI，Ludwig W，Scheidler KH． Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation． Microbiological Reviews，1995，59(1): 143-169．

［19］ Xu HS，Roberts N，Singleton FL，Singleton R，Attwell W，Grimes DJ，Colwell RR． Survival and viability of nonculturable Esherichia coli and Vibro cholerae in the estuarine and marine envoroment． Microbial Ecology，1982，8(4): 313-323．

杜慧竟等: 藥用植物內(nèi)生放線菌的分離和生物學特性． /微生物學報(2013)53(1)Isolation and physiological characteristics of endophytic actinobacteria from medicinal plants Huijing Du，Jing Su，Liyan Yu，Yuqin Zhang * Institute of Medicinal Biotechnology，Chinese Academy of Medical Sciences ＆ Peking Union Medical College，Beijing 100050，China Abstract:［Objective］ To isolate，incubate and characterize cultivable endophytic antinobacteria from medicinal plants，and analyze the diversity of the endophytic antinobacteria，then explore the novel microbial resources． ［Methods］ Ten media were used to isolate endophytic antinobacteria from 37 fresh medicinal plant tissue samples． The optimal cultivation

conditions for endophytic antinobacteria were determined by comparison． Based on the morphology of the colonies and cells

of the new isolates，we chose174 isolates to analyze their 16S rRNA gene sequences and the diversity of the medicinal

plant endophytic antinobacteria． The physiological characteristics of 27 representative strains were studied using Biolog

GEN III MicroPlates，API 50CH and API ZYM kits． ［Results］ In total 940 endophytics affiliated to 47 genera of 30

families were isolated，among which more than 600 actinobacteria belonged to 34 genera and 7 unknown taxa． Good growth

of the endophytic antinobacteria on PYG(peptone-yeast-glycerol)medium with pH 7.2 at 28 － 32℃ was observed．

Physiological characteristics differences of these isolates related to their phylogenetic relationships． Greater differences

were shown among the strains from the same host plants than those from different plants grown in the same area．

［Conclusion］There are great diverse endophytic actinobacteria inside the medicinal plants． No direct relationship of the

endophytic actinobacteria from medicinal plants with the host plants in the sole carbon source utilization，fermentation of

carbon sources to produce acid and the enzyme activities was found，while it seemed that the physiological characteristics of the isolates related to the geographical distribution of their host．

Keywords: medicinal plants，endophytic actinobacteria，physiological characteristics，diversity