第一篇：細(xì)胞克隆培養(yǎng)論文

細(xì)胞克隆培養(yǎng)論文

摘要：隨著生命科學(xué)時代的帶來，基因研究已經(jīng)取得了巨大的進(jìn)展，克隆技術(shù)特別是人的克隆技術(shù)作為基因研究的重要組成部分，引起了社會各界的廣泛關(guān)注?？寺“瑒游铩⒅参锏确矫?，動物克隆在畜牧業(yè)生產(chǎn)、醫(yī)藥生產(chǎn)、疾病治療、生物學(xué)基礎(chǔ)理論研究、以及動物轉(zhuǎn)基因工程等諸多領(lǐng)域蘊(yùn)藏著巨大的應(yīng)用潛力。通過科學(xué)研究者的努力，哺乳動物的克隆技術(shù)在農(nóng)業(yè)和生物制藥等方面取得了進(jìn)步，展示了克隆技術(shù)的應(yīng)用價值和發(fā)展前景。

關(guān)鍵詞：動物克隆技術(shù)

1、克隆技術(shù)含義: “克隆”，即無性細(xì)胞繁殖系，又稱為一個細(xì)胞株或細(xì)胞系，細(xì)胞株與細(xì)胞系沒有本質(zhì)的區(qū)別。也可以理解為復(fù)制，拷貝，就是從原型中產(chǎn)生出同樣的復(fù)制品，它的外表及遺傳基因與原型完全相同，但大多行為思想不同。無性繁殖的手段有很多種，包括孤雌生殖，胚胎切割和細(xì)胞核移植等等。而產(chǎn)生克隆動物的方法則稱為動物克隆技術(shù)。

在《中國大百科全書·生物學(xué)者》中，對“克隆”的解釋是：克隆又稱無性繁殖細(xì)胞系和無性繁殖系，是一個細(xì)胞或個體以無性繁殖重復(fù)分裂或繁殖所產(chǎn)生的一群細(xì)胞或一群個體，在不發(fā)生突變的情況下，具有完全相同的遺傳結(jié)構(gòu)?？寺〖夹g(shù)同整個生物界的進(jìn)程一樣，是由低級到高級，有簡單的復(fù)雜不斷發(fā)展和進(jìn)步的。它由單個細(xì)胞獲得2個以上細(xì)胞、生物體，發(fā)展到生物體內(nèi)的生物大分子的自我復(fù)制，在DNA復(fù)制酶的作用下，復(fù)制生成倆個一模一樣的DNA分子。

2、動物克隆的進(jìn)程：

1938年，國外就有人提出提出成年動物的細(xì)胞核入卵子法克隆哺乳動物的設(shè)想。

1978年，我國著名科學(xué)家童第周成功地進(jìn)行看了克隆黑斑蛙的實(shí)驗(yàn)，他將黑斑蛙的紅細(xì)胞核移入到事先去除了核的黑斑蛙卵中，這種換核卵發(fā)育成了黑斑蛙的蝌蚪。

1996年，用成年哺乳動物體細(xì)胞克隆出的哺乳動物個體克隆羊多莉出世，開創(chuàng)了體細(xì)胞繁殖哺乳動物的成功先例。

2003年，克隆馬出世，是世界上首例哺乳動物生下自己的克隆體。

2003年8月，中國科學(xué)家在世界上首次采用克隆技術(shù)培育出含人免DNA混合物胚胎。

2003年9月，沃斯宣布他已克隆出了含人，牛DNA的混合胚胎。

2008年1月7日，2頭具有綠色熒光遺傳特征的小豬在哈爾濱誕生。

3、動物克隆技術(shù)的應(yīng)用：

動物克隆近幾年取得的一些突破性進(jìn)展，為動物發(fā)育過程中基因表達(dá)的調(diào)控及發(fā)育生物學(xué)，遺產(chǎn)學(xué)等相關(guān)學(xué)科的發(fā)展必將產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。雖然目前這種方法尚不成熟，但它已顯示出誘人的應(yīng)用前景。

動物克隆技術(shù)將首先應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域。利用體細(xì)胞供體經(jīng)核移植生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物，可望降低生產(chǎn)成本。到目前為止，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物的方法仍主要是1985年Hammer等建立的原核顯微注射法。但是，這種方法只能使大約5%的動物攜帶外源基因外源基因整合動物基因組是個隨機(jī)的過程，這導(dǎo)致外源基因在許多轉(zhuǎn)基因動物系中的表達(dá)量不夠高，而且因整合進(jìn)生殖細(xì)胞的幾率低難以遺傳給下一代。Schnieke等發(fā)現(xiàn)，利用體細(xì)胞克隆技術(shù)生產(chǎn)含人凝血因子IX的轉(zhuǎn)基因羊比原核顯微注射法要有效得多。其中，兩者最顯著的差異是體細(xì)胞克隆的中的受體母羊全都攜帶外源基因，而原核顯微注射法會產(chǎn)生許多不帶外源基因的羊羔。這是由于，原核微注射法中所用胚胎在體外培養(yǎng)的時間較短，在此期間被檢測為陽性的轉(zhuǎn)基因可能會在以后的發(fā)育過程中丟失。用作核移植供體的細(xì)胞在體外培養(yǎng)的時間則較長，有較多的檢測機(jī)會。另外，顯微注射法制備的轉(zhuǎn)基因動物的性別只有等到動物出世后才能得知，而核移植可以通過鑒別核供體的核型而預(yù)先得知轉(zhuǎn)基因動物的性別，可選擇性的制備雌性的轉(zhuǎn)基因動物，有利于在母乳中表達(dá)外源基因。

克隆技術(shù)除了可以生產(chǎn)各種醫(yī)用人體蛋白外，對人類的細(xì)胞和組織治療也大有好處。利用克隆技術(shù)，可以用患者本人細(xì)胞培養(yǎng)出新組織，用來治療糖尿病、帕金森氏病、神經(jīng)損傷等多種疾病。用這種方法培養(yǎng)出的組織具有與患者正常組織完全相同的基因構(gòu)成，因此不會產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)。但是這些都涉及到克隆人這個敏感話題，目前克隆人在許多國家是法律禁止的。隨著人類胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的完善。目前已有兩家美國公司開始研究利用克隆技術(shù)培育人胚胎，希望大批量生產(chǎn)治療疾病的干細(xì)胞。事實(shí)上，幾年前人們就曾把人胎兒神經(jīng)組織用來治療帕金森氏癥?？紤]到倫理上的原因，人們也可以用克隆動物的胚胎干細(xì)胞作異源移植，以解決人類移植器官供求矛盾。

動物克隆技術(shù)還有助于加速動物育種的進(jìn)程。利用優(yōu)良動物品種的體細(xì)胞作核供體克隆動物，可以避免自然條件下選種所受到的動物生育周期和生育效率的限制，從而大大縮短了育種年限，提高育種效率。動物克隆技術(shù)用于拯救瀕危動物也受到廣泛的關(guān)注。中國科學(xué)院動物研究所陳大元研究員提出用動物克隆技術(shù)拯救大熊貓的計(jì)劃，在國內(nèi)外均引起一定的反響。

4、動物克隆技術(shù)的不足及未來發(fā)展方向

動物克隆技術(shù)然取得了一定的進(jìn)展，在生物醫(yī)藥領(lǐng)域也得到了初步的應(yīng)用。但是，該技術(shù)目前還很不完善。存活率低是當(dāng)今核移植技術(shù)的最大缺陷。它突出表現(xiàn)為：孕期流產(chǎn)率高，圍產(chǎn)期死亡率高，新生兒體重較重及產(chǎn)生后對環(huán)境的適應(yīng)性較差。以成體細(xì)胞核作核供體問題更為嚴(yán)重。最近，Shiels等報(bào)道克隆羊的端粒較同年羊短。Renard等報(bào)道，體細(xì)胞核移植可能影響克隆動物免疫系統(tǒng)的正常發(fā)育。他們用胚胎細(xì)胞克隆牛的耳細(xì)胞通過核移植克隆出一頭牛。牛犢看起來很健康，但出生一個半月后，它體內(nèi)的淋巴細(xì)胞和紅血球急劇減少，不久就死于貧血。尸體解剖發(fā)現(xiàn)，該牛犢脾臟、胸腺和淋巴結(jié)等淋巴組織都沒有得到正常發(fā)育。

導(dǎo)致動物克隆存活率低和異常發(fā)育的原因很多，缺乏基礎(chǔ)理論支持是其中之一。動物克隆技術(shù)的不斷完善，還需要分子遺傳學(xué)、細(xì)胞學(xué)、發(fā)育生物學(xué)等相關(guān)基礎(chǔ)學(xué)科的進(jìn)一步研究和發(fā)展。迄今為止，人們雖然在動物克隆過程中已經(jīng)積累不少數(shù)據(jù)，但一些很基本的問題任亟需解決。

動物克隆技術(shù)條件的優(yōu)化還沒有解決。如核供體和卵細(xì)胞的選材、核質(zhì)比的選擇、重組胚胎的激活方式、是否需要做連續(xù)核移植等。

綜上所述，動物克隆研究已在理論基礎(chǔ)、技術(shù)優(yōu)化及實(shí)際應(yīng)用等方面取得很大的進(jìn)步。但該技術(shù)目前還很不完善，相關(guān)理論研究還很薄弱，人們要提高動物克隆的成功率還需不懈的努力。另外克隆動物與正常胚胎的發(fā)育有何異同，也值得深入研究。這些問題的解決將有助于人們對動物胚胎發(fā)育過程中分子機(jī)制的認(rèn)識。

5、結(jié)束語

要緊跟世界科技發(fā)展的潮流，充分利用克隆技術(shù)為人類帶來巨大的利益，又要嚴(yán)格控制可能造成混亂的克隆人出現(xiàn)。

參考文獻(xiàn)：

《生命倫理學(xué)》、《生命的化學(xué)》 學(xué)院：呼和浩特職業(yè)學(xué)院

專業(yè)：生物技術(shù)及應(yīng)用 年級：12級

姓名：郝媛 學(xué)號：12305060023

第二篇：克隆論文

動物克隆技術(shù)及其面臨的問題

摘要：隨著生命科學(xué)時代的到來，基因研究已經(jīng)取得了巨大的進(jìn)展，克隆技術(shù)特別是人的克隆技術(shù)作為基因研究的重要組成部分，愈來愈引起社會各界的廣泛關(guān)注?？寺〖夹g(shù)作為人類的創(chuàng)造性活動，有其產(chǎn)生和存在的合理性?？寺“@動物、植物克隆等方面，動物克隆技術(shù)在畜牧業(yè)生產(chǎn)、醫(yī)藥生產(chǎn)和疾病治療、生物學(xué)基礎(chǔ)理論研究、野生珍稀瀕危動物的拯救和保護(hù),以及動物轉(zhuǎn)基因工程等諸多領(lǐng)域蘊(yùn)藏巨大的應(yīng)用潛力。通過科學(xué)研究者近十年的努力,哺乳動物的克隆技術(shù)在農(nóng)業(yè)和生物制藥等方面取得了劃時代的進(jìn)步,展示了克隆技術(shù)的巨大應(yīng)用價值和廣闊的發(fā)展前景。但克隆技術(shù)目前仍存在一些問題,如克隆技術(shù)對社會的影響。人類克隆技術(shù)的進(jìn)步為人類帶來的利益是巨大的,因而它的發(fā)展是難以阻止的。應(yīng)對人類克隆技術(shù)帶來的巨大挑戰(zhàn),生命倫理學(xué)不僅要隨著技術(shù)的進(jìn)步提出新的實(shí)踐規(guī)范,同時也要做好道德哲學(xué)革命的準(zhǔn)備。在技術(shù)進(jìn)步和倫理發(fā)展互動的視野中,“能做”與“該做”的問題實(shí)際上是一個“該怎么做”的問題。禁止生殖性克隆,發(fā)展治療性克隆是當(dāng)前最正確的一種選擇。

關(guān)鍵詞：動物克隆技術(shù)；

Abstract: With the era of life sciences, genetic research has made great progress, cloning technology, especially human cloning technology as an important component of genetic research, more and more aroused extensive attention.Cloning of human creative activity, as has its emergence and existence of the reasonable.Clone containing the animal, plant cloning two aspects of animal cloning technology in animal production, pharmaceutical production and disease treatment, biological basis of theoretical research, rare and endangered wildlife rescue and protection of animals and animal genetic engineering and other fields which possesses a large potential applications.Through the efforts of scientific researchers in recent years, mammalian cloning technology in agriculture and bio-pharmaceutical and other epoch-making progress has been made, demonstrating the tremendous value of cloning technology and broad prospects for development.But cloning technology is still some problems, such as the impact of cloning technology on society.The progress of human cloning for human benefits are enormous, and so its development is difficult to prevent.Response to the enormous human cloning challenges, bioethics not only with advances in technology make the new practice norms, but also good preparation for the revolution of moral philosophy.Technological advances and ethical development in the interactive field of vision, “can do” and “to do” question is actually a “how to do” issue.Ban on reproductive cloning, the development of therapeutic cloning is the most correct option.Keywords: animal cloning technology;influence

1、克隆技術(shù)：

“克隆”(clone)，即無性繁殖系(asexual reproduction)。無性繁殖的手段有多種，包括孤雌生殖、卵裂球的分離與培養(yǎng)、胚胎切割和細(xì)胞核移植等。而產(chǎn)生克隆動物的方法則稱之為動物克隆技術(shù)。

在《中國大百科全書·生物學(xué)卷》中，對“克隆”的解釋是:克隆又稱無性繁殖細(xì)胞系和無性繁殖系,是一個細(xì)胞或個體以無性方式重復(fù)分裂或繁殖所產(chǎn)生的一群細(xì)胞或一群個體,在不發(fā)生突變的情況下,具有完全相同的遺傳結(jié)構(gòu)。同整個生物界的進(jìn)程一樣,克隆技術(shù)也是由低級到高級、由簡單到復(fù)雜不斷發(fā)展和進(jìn)步的。它由單個細(xì)胞獲得2個以上細(xì)胞、細(xì)胞群或生物體,發(fā)展到生物體內(nèi)部的生物大分子的自我復(fù)制,在DNA復(fù)制酶的作用下,DNA分子可以復(fù)制生成兩個一模一樣的DNA分子。所以,克隆技術(shù)從細(xì)胞到分子、從植物到動物不斷向前發(fā)展,特別是高等哺乳動物的克隆成功,標(biāo)志著生命高科技水平已經(jīng)進(jìn)入一個嶄新的階段。

動物克隆技術(shù)是通過顯微操作技術(shù)把細(xì)胞核(供體)移人去除遺傳物質(zhì)的成熟卵母細(xì)胞(受體)中，細(xì)胞核在移人的細(xì)胞質(zhì)的支持下，發(fā)生發(fā)育程序重編(reprogramming)，形成重組胚，使得核質(zhì)重組體與正常受精卵一樣，經(jīng)細(xì)胞分裂、分化、并在母體內(nèi)發(fā)育成一個新的動物個體稱為細(xì)胞核移植技術(shù)。在高等哺乳動物中，細(xì)胞核移植技術(shù)是生產(chǎn)克隆動物最為有效的克隆技術(shù)，因此，動物克隆技術(shù)實(shí)際上是指細(xì)胞核移植技術(shù)。

2、動物克隆技術(shù)的進(jìn)程：

1938年,國外就有人提出用成年動物的細(xì)胞核植入卵子法克隆哺乳動物的設(shè)想。

1960年和1962年,英國牛津大學(xué)的科學(xué)家先后用非洲一種有爪的蟾蜍(非洲蟾蜍)進(jìn)行克隆實(shí)驗(yàn)。

1978年,我國著名科學(xué)家童第周成功地進(jìn)行了克隆黑斑蛙的實(shí)驗(yàn),他將黑斑蛙的紅細(xì)胞核移入了事先去除了核的黑斑蛙的卵中,這種換核卵發(fā)育成了黑斑蛙的蝌蚪。

1979年春,中國科學(xué)院武漢水生物研究所的科學(xué)家,用鯽魚囊胚期的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),最后走卵孵出魚苗。在成功克隆出了鯽魚后,他們進(jìn)行了用鯉魚胚胎細(xì)胞

核取代鯽魚卵細(xì)胞核的的實(shí)驗(yàn),最終培育出了長有“胡須”的“鯉鯽魚”。

兩棲類動物和魚類克隆成功后,科學(xué)家們開始了克隆哺乳動物的實(shí)驗(yàn)研究。美國和瑞典的科學(xué)家率先從灰色小鼠的胚胎細(xì)胞中取出細(xì)胞核,取代黑色小鼠受精卵細(xì)胞核,在試管中培養(yǎng)，然后再植入白色小鼠的子宮內(nèi),經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn),最終白色小鼠生下3只小灰鼠。

1984年,斯蒂思·威拉德森用胚胎細(xì)胞克隆出了一只羊,這是第一例得到證實(shí)的克隆哺乳動物。

1996年,第一例用成年哺乳動物體細(xì)胞克隆出的哺乳動物個體-克隆羊多莉出世,開創(chuàng)了體細(xì)胞繁殖哺乳動物的成功先例。

2003年5月28日,世界上第一例真正的自體克隆動物—不用代孕母親母體自身繁育自己的體細(xì)胞克隆體的克隆動物誕生,這匹健康克隆馬的出世,是世界上首例哺乳動物生下自己的克隆體。

2003年8月,中國科學(xué)家在世界上首次采用克隆技術(shù)培育出含人、兔DNA混合物胚胎。

2003年9月,美國克隆技術(shù)專家扎沃斯宣布他已克隆出了含人、牛DNA的混合胚胎。人與動物DNA混合胚胎的培育成功,為克服人類細(xì)胞染色體在克隆的“核移植”過程中常會出現(xiàn)的破壞和紊亂現(xiàn)象邁出了重要的一步。據(jù)提前出版的美國《連線》雜志披露,美國先進(jìn)細(xì)胞技術(shù)公司的蘭扎等人在不久前成功克隆了含16個細(xì)胞的人類早期胚胎,可以植入子宮繁殖后代。

3、克隆的應(yīng)用：

動物克隆技術(shù)已展示出廣闊的應(yīng)用前景,概括起來大致有以下四個方面:(1)動物克隆技術(shù)用于畜牡業(yè)生產(chǎn);(2)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物;(3)生產(chǎn)人胚胎干細(xì)胞用于細(xì)胞和組織替代療法;(4)復(fù)制瀕危的動物物種,保存和傳播動物物種資源。（5）克隆技術(shù)與轉(zhuǎn)基因技術(shù)結(jié)合（6）神克隆菌。

3.1動物克隆技術(shù)用于畜牡業(yè)生產(chǎn)：

利用優(yōu)良動物品種的體細(xì)胞作核供體克隆動物，大大縮短育、種年限，加速動物育種的進(jìn)程。在動物雜種優(yōu)勢利用方面，可增強(qiáng)選育的種畜性狀穩(wěn)定，提高育種效率。

3.2生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物：

轉(zhuǎn)基因動物研究是動物生物工程領(lǐng)域中最誘人和最有發(fā)展前景的課題之一,轉(zhuǎn)基因動物可作為醫(yī)用器官移植的供體、生物反應(yīng)器,以及用于家畜遺傳改良,創(chuàng)建疾病實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷取ｓw細(xì)胞克隆的成功為轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)掀起一場新的革命,動物體細(xì)胞克隆技術(shù)為迅速放大轉(zhuǎn)基因動物所產(chǎn)生的種質(zhì)創(chuàng)新效果提供了技術(shù)可能。當(dāng)今動物克隆技術(shù)最重要的應(yīng)用方向之一,就是高附加值轉(zhuǎn)基因克隆動物的研究開發(fā)。

3.3生產(chǎn)人胚胎干細(xì)胞用于細(xì)胞和組織替代療法：

在體細(xì)胞克隆動物成功率低的情況下,利用ES細(xì)胞(embryonic stem cells)進(jìn)行克隆可以增加成功率，因?yàn)镋S是具有形成所有成年細(xì)胞類型潛力的全能干細(xì)胞?？茖W(xué)家們一直試圖誘導(dǎo)各種干細(xì)胞定向分化為特定的組織類型,來替代那些受損的體內(nèi)組織,比如把產(chǎn)生胰島素的細(xì)胞植入糖尿病患者體內(nèi)。因此Wakayama等用小鼠ES系細(xì)胞作核供體獲得核移植小鼠, Mueller等用長期培養(yǎng)的PGCS(primordial germ cells)克隆獲得一頭公牛,Iwasaki等用牛ES細(xì)胞和四倍體胚胎聚合的嵌合體獲得小牛, Amano等用小鼠ES細(xì)胞作核供體獲得后代。通過克隆動物的胚胎干細(xì)胞作異源移植,可以解決人類移植器官供求矛盾。利用克隆技術(shù)對人類細(xì)胞和組織進(jìn)行治療。用ES細(xì)胞定向分化作為種子細(xì)胞,將解決所用胚胎和卵母細(xì)胞來源困難和倫理問題?，F(xiàn)已從小鼠體細(xì)胞克隆胚胎中獲得了35株ES細(xì)胞系,這為獲得ES細(xì)胞提供了可行的辦法。這種核移植法的最終目的是用于干細(xì)胞治療,而非得到克隆個體,科學(xué)家們稱之為“治療克隆”。

3.4復(fù)制瀕危的動物物種,保存和傳播動物物種資源：

克隆技術(shù)在搶救瀕危珍稀物種、保護(hù)生物多樣性方面可發(fā)揮重要作用。以瀕危稀有動物的體細(xì)胞為供核細(xì)胞進(jìn)行種間核移植，可以解決對瀕危稀有動物卵母細(xì)胞成熟不夠、卵母細(xì)胞數(shù)量不足等問題。陳大元等,Lanza等和Vogel等在這些領(lǐng)域做出了艱苦卓絕的工作，受到廣泛的關(guān)注。

3.5克隆技術(shù)與轉(zhuǎn)基因技術(shù)結(jié)合：

體細(xì)胞核移植技術(shù)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)的結(jié)合將對解決人類器官移植來源、醫(yī)藥生產(chǎn)和疾病治療、生物學(xué)基礎(chǔ)理論研究等具有非常重要的意義。目前,用基因打靶技術(shù)篩選出陽性細(xì)胞作供核體進(jìn)行核移植,得到轉(zhuǎn)基因動物。核移植可以通過鑒

別核供體的核型而預(yù)先得知轉(zhuǎn)基因動物的性別,可選擇性地制備雌性的轉(zhuǎn)基因動物,有利于在母乳中表達(dá)外源基因。Schnieke等獲得了表達(dá)治療人血友病的凝血因子IX轉(zhuǎn)基因克隆綿羊“波利”(Polly), Cibelli等獲得染色體上整合了外源基因β-半乳糖苷酶的轉(zhuǎn)基因牛, Baguisi等獲得了轉(zhuǎn)基因山羊, McCreath等成功獲得了第一只定點(diǎn)整合外源基因的克隆綿羊, Lai等研究成功敲除α-1,3-半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶基因的克隆豬,成勇等獲得了轉(zhuǎn)基因山羊,龔國春等成功獲得了轉(zhuǎn)基因牛囊胚和轉(zhuǎn)基因克隆牛等。

3.6神克隆菌：

寄生菌(神克隆菌)是一種“以菌吃菌”來解決循環(huán)水的腐漿問題。造紙閉路循環(huán)系統(tǒng),水體富營養(yǎng)化程度高,微生物生長易產(chǎn)生腐漿、陰離子垃圾及管道腐蝕等問題。本項(xiàng)目從大自然中分離出有害致病菌的天敵噬菌蛭弧菌,利用分子生物學(xué)手段與方法進(jìn)行“基因鑒定”,培育出適應(yīng)造紙水環(huán)境的寄生菌(噬菌蛭弧菌),再同紅平紅球菌、硅酸鹽芽孢桿菌等非寄生菌進(jìn)行復(fù)配成復(fù)合微生態(tài)制劑-神克隆菌。至今在國內(nèi)外未見有將噬菌蛭弧菌應(yīng)用到造紙領(lǐng)域。

神克隆菌是以寄生菌和非寄生菌復(fù)配的復(fù)合微生態(tài)制劑,該菌既能防治造紙腐漿,又能凈化水質(zhì)。神克隆菌中的噬菌蛭弧菌具有噬菌體的作用機(jī)制,能吞噬多種有害細(xì)菌,替代常規(guī)化學(xué)消毒劑防止腐漿、減少管道壁粘泥的作用,又有常規(guī)活菌對循環(huán)水進(jìn)行生態(tài)修復(fù)的功能。如圖

1、圖2。而現(xiàn)有微生態(tài)制劑為非寄生性活菌,只能分解有機(jī)物,不能吞噬有害細(xì)菌,并易產(chǎn)生腐漿。

圖1神克隆菌

圖2神克隆菌吞噬大腸桿菌

4、克隆技術(shù)面臨的問題：

盡管動物克隆技術(shù)有著廣泛的應(yīng)用前景,但離產(chǎn)業(yè)化尚有很大距離。動物克隆技術(shù)作為一個新興的研究領(lǐng)域,雖然在理論和技術(shù)上都還不完善，同時他還對社會有著一定的影響。在技術(shù)上面動物克隆技術(shù)有著：（1）克隆效率太低,克隆動物早衰嚴(yán)重；（2）端粒問題；（3）重新編程的問題；（4）基因印跡機(jī)理不清；（5）克隆技術(shù)條件。還有就是社會倫理上存在的問題也是相當(dāng)嚴(yán)重的。

4.1克隆效率太低,克隆動物早衰嚴(yán)重：

克隆動物健康問題很多,世界各地的克隆動物流產(chǎn)、夭折、畸形現(xiàn)象都非常嚴(yán)重。核移植總體效率低,一般僅為1%~6%。這可能與供體核移入受體胞質(zhì)后的重塑有關(guān)。供體核發(fā)生去甲基化、去乙酰化等多種變化,在核重塑過程中基因表達(dá)異常都可能導(dǎo)致克隆效率降低。這說明應(yīng)進(jìn)一步明確供核基因組的甲基化和乙酰化與核移植胚胎發(fā)育的作用機(jī)制。

克隆動物效率低與核移植胚胎細(xì)胞內(nèi)的染色體異常、胚胎細(xì)胞凋亡、胚胎早期死亡、流產(chǎn)、胎盤發(fā)育異常有關(guān)。重組胚胎的形態(tài)、發(fā)育潛能與胚胎細(xì)胞凋亡,囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)之間,內(nèi)細(xì)胞團(tuán)同滋養(yǎng)層細(xì)胞之間的關(guān)系與細(xì)胞數(shù)量的比例之間關(guān)系及發(fā)育機(jī)制需進(jìn)一步深入研究。染色體異常與核移植胚胎的妊娠失敗和克隆動物的先天性畸形之間的關(guān)系尚不清楚。

克隆動物早衰、存活率低現(xiàn)象是當(dāng)今核移植技術(shù)的最大缺陷。而以成年體細(xì)胞核作核供體問題尤為嚴(yán)重。它突出表現(xiàn)為:孕期流產(chǎn)率高,圍產(chǎn)期死亡率高,新生仔畜體重較重及出生后對環(huán)境適應(yīng)性較差,出生后發(fā)病率高和畸形率高。這可能與核移植技術(shù)程序有關(guān),對細(xì)胞膜和細(xì)胞超顯微結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了機(jī)械和電擊損傷以及一些物質(zhì)對細(xì)胞產(chǎn)生的化學(xué)毒害作用,這些機(jī)理需進(jìn)一步研究。

4.2端粒問題：

在正常生理?xiàng)l件下的體細(xì)胞隨著分裂次數(shù)的增加,端粒會逐漸縮短?？寺⊙颉岸嗬颉奔?xì)胞端粒較短,可能影響其壽命。據(jù)Shiels等報(bào)道克隆羊端粒較同年羊的短。Tian等報(bào)道以牛胎兒成纖維細(xì)胞作供體的核移植后代端粒比對照組長。Miyashita等報(bào)道克隆個體間端粒長度差異顯著。Xu等的研究表明克隆動物端粒長度可以恢復(fù)。Lanza等報(bào)道體細(xì)胞克隆牛實(shí)驗(yàn)過程逆轉(zhuǎn)了供體母牛體細(xì)胞的老化,端粒長度反而增加,克隆牛壽命延長。Kubota等指出,克隆胚胎流產(chǎn)不是端粒長短造成的。這一系列的研究結(jié)果表明,克隆后代端粒長度有差別。端粒長度可能不是造成克隆動物高死亡率的原因。在胚胎發(fā)育過程中的端粒機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究。

4.3重新編程的問題：

重新編程的機(jī)制不明,缺乏基礎(chǔ)理論支撐。有些學(xué)者認(rèn)為卵母細(xì)胞內(nèi)有重編程因子存在,也有學(xué)者認(rèn)為, MPF(maturation promoting factor)和有絲分裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated proteinkinase, MAPK)的活性與重編程沒有直接調(diào)控關(guān)系。重編程程度尚不足以支持著床后胚胎的發(fā)育,需進(jìn)一步探索核移植后重編程對克隆成功的影響因素。

最近的研究表明,重編程可能在核移植后的早期就已經(jīng)啟動,隨著胚胎發(fā)育逐步深入會造成發(fā)育阻斷或抑制,對不同階段胚胎發(fā)育所需的最佳環(huán)境培養(yǎng)的深入研究有助于闡明重編程機(jī)制。研究表明核移植后細(xì)胞核激活與早期胚胎原核發(fā)育類似,但基因組重新編程的機(jī)制詳細(xì)信息尚不清楚。其中, MPF、核膜破裂(nuclear envelope breakdown, NEBD)和早熟染色體凝集(prematurechromosome condensation, PCC)在基因組重編過程中的作用還需明確。

4.4基因印跡機(jī)理不清：

基因印跡(imprinting)是同源染色體上基因表達(dá)活性不同的遺傳現(xiàn)象?；蛴≯E現(xiàn)象在哺乳動物的發(fā)育過程中普遍存在,它與胚胎的生長發(fā)育和胎盤功能等都有關(guān)系。有研究表明被檢測的核移植胚胎基因表達(dá)不正常,也有報(bào)道核移植胚胎均有幾百個非印跡基因表達(dá)異常。印跡基因異常表達(dá)是造成克隆動物不正常的原因。由此看來,合子前不完全重新編程影響著印跡基因和大多數(shù)非印跡基因的表達(dá),從而導(dǎo)致克隆動物異常?；蛴≯E對核移植后基因組重新編程的影響不明確。基因印跡與動物克隆技術(shù)的成功及關(guān)系值得深入研究。克隆動物種屬及其細(xì)胞的差異,不同種屬動物的克隆難易不同,其中的原因目前人們還不清楚。

4.5克隆技術(shù)條件：

動物克隆研究已在理論基礎(chǔ)、技術(shù)優(yōu)化及實(shí)際應(yīng)用等方面取得很大進(jìn)展,但該技術(shù)目前還很不完善,克隆機(jī)理性的相關(guān)理論研究還很薄弱。另外,克隆胚胎與正常胚胎發(fā)育有何異同;胚胎細(xì)胞超顯微結(jié)構(gòu)及其功能等;線粒體與核移植胚胎發(fā)育的關(guān)系;細(xì)胞核移植的克隆動物在發(fā)育生物學(xué)中的一些基礎(chǔ)問題,如細(xì)胞核質(zhì)關(guān)系、細(xì)胞核發(fā)育全能性和多能性等,對這些問題的深入研究,將有助于加深人們對動物胚胎發(fā)育過程中分子機(jī)制的認(rèn)識。動物克隆技術(shù)的不斷完善,還需要分子遺傳學(xué)、細(xì)胞學(xué)、發(fā)育生物學(xué)等相關(guān)基礎(chǔ)學(xué)科的進(jìn)一步研究和發(fā)展。因此,要提高動物克隆的成功率尚需不懈的努力。

4.6社會倫理：

克隆技術(shù)的迅速發(fā)展得益于人體胚胎干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)，利用這種細(xì)胞有可能在體外培育出與提供細(xì)胞的病人遺傳特征完全相同的細(xì)胞、組織或器官，例如骨髓、腦細(xì)胞、心肌，甚至肝、腎等，它們可被用于治療白血病、帕金森氏癥、心臟病和器官衰竭等疾病，這將同時解決器官移植中的排異反應(yīng)和供體器官嚴(yán)重缺乏難題。正確運(yùn)用克隆技術(shù)，可以為人類帶來許多好處，如可終止癌癥的擴(kuò)散，檢測胎兒的遺傳缺陷，治療神經(jīng)系統(tǒng)的損傷，可以發(fā)展治療習(xí)慣性流產(chǎn)的方法及新的避孕技術(shù)，提高妊娠成功率，可以得到更多的用于治療的干細(xì)胞，為制造能移植于人體的動物器官開辟了前景，促進(jìn)了遺傳學(xué)的發(fā)展等?？寺〖夹g(shù)被濫用則可產(chǎn)生可怕的后果，如克隆技術(shù)能減少遺傳變異，通過克隆產(chǎn)生的個體具有同樣的遺傳基因和同樣的疾病敏感性，一種疾病就可以毀滅整個由克隆產(chǎn)生的群體，干擾了自然進(jìn)化過程，而生物多樣性正是自然可持續(xù)發(fā)展的基礎(chǔ)。克隆技術(shù)還可導(dǎo)致

對后代遺傳性狀的人工控制，科學(xué)家將通過更改胚胎的遺傳基因，改變某個個體眼睛的顏色，對某種疾病的耐受性等，這是很多倫理學(xué)家所不能接受的，人類需要建立相應(yīng)的社會倫理體系。目前克隆技術(shù)引起爭論的核心是能否允許對發(fā)育初期的人類胚胎進(jìn)行遺傳操作，進(jìn)行克隆人研究等?？寺〖夹g(shù)確實(shí)可能與歷史上的原子能技術(shù)等一樣，既能造福人類，也可禍害無窮。但“技術(shù)恐懼”的實(shí)質(zhì)，是對錯誤運(yùn)用技術(shù)的人的恐懼，而不是對技術(shù)本身的恐懼。某項(xiàng)科技進(jìn)步最終是否真正有益于人類，關(guān)鍵在于人類如何對待和應(yīng)用它。對于克隆技術(shù)，善良的人們可以利用它來為人類服務(wù)，為人類造福，而邪惡的人們卻能用它來危害人類的生存。因此，在研究克隆技術(shù)時必須遵循人類的共同法則，制訂科學(xué)的克隆計(jì)劃，采取相應(yīng)的研究對策，避免克隆技術(shù)的負(fù)效應(yīng)。

5、結(jié)束語：

人類克隆技術(shù)的發(fā)展是一把雙刃劍,如果發(fā)展得當(dāng),可給人類和社會帶來利益和福祉,發(fā)展不得當(dāng),也有可能給人類帶來災(zāi)難和混亂。發(fā)展治療性克隆、禁止生殖性克隆是眼下既符合技術(shù)發(fā)展趨勢也適應(yīng)了科技倫理在保守和開放之間形成張力的需要。但是我們不能為此而產(chǎn)生絲毫松懈,以為克隆人不會出現(xiàn)了,那就大錯特錯了。治療性克隆和生殖性克隆從技術(shù)上講沒有什么大的不同,前者的發(fā)展同時也意味著后者的進(jìn)步。這種做法的著眼點(diǎn)是要緊跟世界科技發(fā)展的潮流,充分利用克隆技術(shù)為人類帶來的巨大利益,又要嚴(yán)格控制可能造成混亂的克隆人出現(xiàn)。但同時也必須做好各方面包括倫理學(xué)和道德哲學(xué)的工作,準(zhǔn)備應(yīng)對克隆人的出現(xiàn)。

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第三篇：細(xì)胞轉(zhuǎn)染及克隆篩選

篩選之前確定G418濃度： 1，由于每種細(xì)胞對G418的敏感性不同，而且不同的廠家生產(chǎn)的G418有效成分的比重不同，一般1g的粉劑中有效的G418含量大約為0.722g。

2，G418 是新霉素的類似物，兩者都是通過抑制核糖體的功能和蛋白質(zhì)的合成而殺死細(xì)胞的。但是新霉素對真核細(xì)胞無作用而G418對細(xì)菌和真核細(xì)胞都起作用。neo就是編碼3‘磷酸轉(zhuǎn)移酶的基因，它表達(dá)的蛋白能夠分解新霉素和G418。在進(jìn)行轉(zhuǎn)染時細(xì)胞膜受到影響，抗生素可能對細(xì)胞產(chǎn)生較大影響，加上G418有殺菌作用，所以有人主張轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)染時不加其它抗生素。

3，匯合度對G418篩選結(jié)果的影響很大，一般篩選時匯合度不宜超過50% 4，G418的活性不盡相同，所以在篩選之前，一定要確定G418的最佳篩選濃度。具體如下：將細(xì)胞稀釋到1000個細(xì)胞/ml，在100ug/ml~1mg/ml的 G418濃度范圍內(nèi)進(jìn)行篩選，選擇出在10~14天內(nèi)使細(xì)胞全部死亡的最低G418濃度來進(jìn)行下一步的篩選試驗(yàn)。一個具體試驗(yàn)：3*106個細(xì)胞電轉(zhuǎn)后，分別接種1/4000，1/1000，1/300細(xì)胞到24孔板中，48h后加藥篩選，此時1/300細(xì)胞孔內(nèi)大約50%匯合度。理論上1/4000孔內(nèi)應(yīng)有4%的匯合度。篩選9天后，觀察1/4000孔內(nèi)有兩三個克隆，按比例1/300孔內(nèi)應(yīng)該有幾十個克隆，事實(shí)上，它們幾乎全死光了，只有幾個克隆。加藥時間和維持濃度

1，由于基因轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)之后要一段時間才能表達(dá)出蛋白質(zhì)。所以篩選不能太早；但是也不能太晚，因?yàn)檗D(zhuǎn)染了外源基因的細(xì)胞代謝負(fù)荷較大，增值較慢，時間長了就會被沒有外源基因轉(zhuǎn)入的細(xì)胞所淹沒，最終導(dǎo)致篩選不出陽性克隆，一般要在轉(zhuǎn)染24小時之后才開始加G418篩選。隨著細(xì)胞的代謝G418的濃度和活性都回下降，所以每3~5天都要更換一次含有G418的篩選液。這時藥物濃度可以降至200ug/ml。

2，加抗生素的時機(jī)，主要是考慮插入到細(xì)胞基因組的抗性基因是否已經(jīng)得到表達(dá)。一般是轉(zhuǎn)染48小時后加入抗生素。挑出單克隆后就可以用維持濃度，一般是篩選濃度的1/2。關(guān)于維持濃度，有人說細(xì)胞會出現(xiàn)對抗生素的抗性，應(yīng)不斷提高其濃度。而且，如果你要挑選到幾個陽性克隆中較高表達(dá)的克隆的話，可以調(diào)整抗生素的濃度。當(dāng)然，抗性基因高表達(dá)，目的基因不一定就跟著高表達(dá)。

篩選時的培養(yǎng)液

加藥篩選約6天左右，細(xì)胞會大量死亡，孔中只剩下的細(xì)胞寥寥無幾。這時會出現(xiàn)兩個問題： 1，死亡的細(xì)胞會裂解釋放出有害物質(zhì)，導(dǎo)致那些有neo表達(dá)的陽性細(xì)胞死亡，即非選擇性死亡，因此要及時換液，孔中細(xì)胞數(shù)目很少，細(xì)胞之間的信號會變得很弱，也會導(dǎo)致陽性細(xì)胞的狀態(tài)不佳甚至死亡。這個時候需要一種特殊的培養(yǎng)液：假如你要轉(zhuǎn)染3T3細(xì)胞，在3T3 細(xì)胞匯合度達(dá)到80%的時候，換液，培養(yǎng)過夜之后收集培養(yǎng)液，通過濾器消毒，和新鮮的培養(yǎng)液按1：1混合備用。再轉(zhuǎn)染后篩選過程中就可以應(yīng)用這種培養(yǎng)基。3，適當(dāng)增加血清濃度。

篩選時出現(xiàn)的問題及其解決辦法：

1，問題1。做hela細(xì)胞的篩選，現(xiàn)在已經(jīng)篩選3周，在6孔板中已經(jīng)長出一些細(xì)胞簇，想把它挑到96孔板中，就用2ul胰酶消化，在消化過程中，胰酶擴(kuò)散，細(xì)胞已經(jīng)四散開，和周圍的其它細(xì)胞簇融合在一起（我的細(xì)胞簇離的很近），就是說幾個細(xì)胞簇被胰酶融合在一起，那樣根本沒有辦法做下去了，該怎么辦？

a、可以減少胰酶量；胰酶在加入之前要用37度溫箱預(yù)熱，并且PBS潤洗細(xì)胞層，以減少可能殘存的血清的影響；

b、加入胰酶后，稍過幾秒鐘就可以吸走消化液了，不用吸干凈，然后放到37度溫箱中繼續(xù)作用1MIN，這時，消化酶可以繼續(xù)作用的，又可避免胰酶擴(kuò)散；

c、顯微鏡下觀察細(xì)胞完全松散開，就可以在你感興趣的局部加培養(yǎng)基，并吸走你的可隆了呀

d、具體消化的時間，你注意摸索一下，如果 步驟2中顯微鏡下見細(xì)胞尚未完全松散開，可以再重復(fù)的，直到松散開，能夠被吸走為止。

我的建議：

1、在100mm dish中挑克隆，細(xì)胞分的稀一點(diǎn)。

2、把細(xì)胞全部消化下來，在96孔板中逐步稀釋獲得單克隆

2，問題2。篩選成功的概率：只要有抗性加壓篩選，挑選到的機(jī)率還是比較大的。一般能挑到穩(wěn)定表達(dá)的概率我認(rèn)為大概有70－80％，但是想挑到表

達(dá)量高且能穩(wěn)定表達(dá)的，不大容易。這個可能是在染色體上，合適的整合位點(diǎn)太少的緣故。

3，問題3。細(xì)胞形態(tài)的改變：穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后陽性克隆均出現(xiàn)不同程度的細(xì)胞形態(tài)的改變。想請教各位有經(jīng)驗(yàn)的高手，你們做穩(wěn)定轉(zhuǎn)染時有此發(fā)現(xiàn)嗎？我的也是，而且好象還有好幾種不同類型的細(xì)胞。不過，我轉(zhuǎn)的是一種抑癌基因。

4，問題4。單克隆化的時機(jī)和個數(shù)：加藥篩選時, 一般等到確認(rèn)的轉(zhuǎn)染細(xì)胞長到70%以上時,再做有限稀釋法, 以克隆出陽性細(xì)胞, 同時要保持適當(dāng)?shù)乃幬餄舛?以防突變和污染。若細(xì)胞長好了,如有40%以上,就可以有限稀釋了一般，篩選5，6個克隆就有需要的克隆，但保險(xiǎn)起見，篩10個吧。

5，從單克隆化時開始，就要加大營養(yǎng)，清和生長因子。單克隆化的操作方法；

1.方法1。單克隆細(xì)胞的培養(yǎng)就是這樣的,我現(xiàn)在作了15個96孔板的單克隆,總共才得到大約50株單克隆在做時候應(yīng)保證每個孔中的細(xì)胞是一個,因此,我一般在200毫升的培養(yǎng)液中加入小于96個的細(xì)胞,這樣平均到每個孔中因該可以由滿意的結(jié)果你所說的現(xiàn)象我也遇到過,我也百思不得其解,只好做多一點(diǎn)的96孔板來補(bǔ)充。培養(yǎng)SPC-A1（人肺癌細(xì)胞），轉(zhuǎn)染了EGFP，然后進(jìn)行了G418抗性篩選和96孔板單克隆篩選，最終獲得了成功將我的實(shí)驗(yàn)步驟寫出來，希望對你有所幫助。

2.方法2。實(shí)驗(yàn)步驟大致為：預(yù)先對96孔板除第一排之外的所有孔加含15%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液，0.1ml/孔，并放于細(xì)胞培養(yǎng)箱中溫育，然后胰酶消化穩(wěn)定表達(dá)GFP的細(xì)胞，細(xì)胞液稀釋至密度為1000cell/ml的單細(xì)胞懸浮液，上述細(xì)胞液接種于96孔板的第一排，0.2ml /孔，從中吸取0.1ml細(xì)胞溶液接種于第二排，混合后，從第二排中吸取0.1ml接種于第三排……，一直到第八排，最后一排都丟棄0.1ml細(xì)胞液，操作示意圖見下圖。一般來說，每一列都會有某個孔中只有1~2個細(xì)胞。

3.方法3。我的改進(jìn)之處：我在顯微鏡下觀察，標(biāo)記孔中小于10個細(xì)胞的孔，然后在顯微鏡下用記號筆在皿底把單個熒光細(xì)胞圈住，然后在操凈臺里用滅過菌底牙簽將圈外的細(xì)胞戳死，這樣留在孔中的就是單克隆了，通過這樣的，我一共獲得了6株單克隆。但需注意的是：時間不能超過30min，否則細(xì)胞極容易死亡。解決操作時間長的方法：拿一個96板，在里面隨便種一些細(xì)胞，然后用牙簽練習(xí)，我練了5～6次后非常熟練了

培養(yǎng)液：最好是含15％的胎牛血清，加大營養(yǎng)，有利于細(xì)胞生長；另外一種方法是對還沒有變黃的細(xì)胞液進(jìn)行過濾，過濾后的培養(yǎng)含有很多生長因子，可以作為單克隆的培養(yǎng)液。然后先在顯微鏡下把要挑的單克隆初看一遍，算一下大概要挑幾個，然后在96孔板內(nèi)先加好培養(yǎng)基，再將6孔板內(nèi)的培養(yǎng)基吸出，加入少量的胰酶，大概能蓋住板底即可，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，在有些變圓時，即用10ul槍在顯微鏡下直接吸克隆，放入事先準(zhǔn)備好的加了培養(yǎng)基的96孔板內(nèi)，先吸大的克隆，在胰酶完全起到作用使細(xì)胞松散擴(kuò)散開了時，已經(jīng)吸了將近十個克隆了，動作快一些時能吸十幾個克隆，我做過幾次了效果很好，沒有出現(xiàn)污染。（在要進(jìn)行操作時，用酒精將手好好擦擦，將顯微鏡用新潔爾滅也擦一下，一般不會有什么問題），你可以試試，只要小心一些就行了。

5.方法5。關(guān)于穩(wěn)轉(zhuǎn)的方法，好像園子里很多xdjm都用的是有限稀釋法來作，但是我們實(shí)驗(yàn)室基本上都不用九十六孔做有限稀釋來作單克隆的，一般的做法都是這樣： 1。3.5cm皿鋪細(xì)胞，長到大概80％以上的時候作轉(zhuǎn)染。

2。轉(zhuǎn)染后一天消化，傳到一個大皿（1：6）或者兩個大皿（1：12）。3。再過一天后加入帶G418的培養(yǎng)基。

4。依據(jù)細(xì)胞不同，大概從加入G418的第三天到第八天之間細(xì)胞開始出現(xiàn)大量死亡，活下來的細(xì)胞就形成單克隆。

5，單克隆長到相對較大的集落后，于顯微鏡下用200ul槍挑取細(xì)胞集落，一般挑上48個，種在兩塊24孔板上。

6。于24孔板上繼續(xù)培養(yǎng)，約4、5天后即可消化傳代，取部分作收蛋白western之用，根據(jù)western結(jié)果確定真陽性。

我們基本上都是這樣pick stable的，除非一些對細(xì)胞生長抑止作用強(qiáng)大或者apoptosis的inducer之類的基因比較難挑到stable外，一般還都能挑到 stable。當(dāng)然，轉(zhuǎn)染效率不能太低，超過50％就相對比較容易了，10％以上的可能最后形成的細(xì)胞集落就少，而且真陽性也較少。對于那些轉(zhuǎn)染效率很低的細(xì)胞，我會連續(xù)轉(zhuǎn)染三次（中間如果細(xì)胞長滿了就傳代），好像比較有效。

除非是類似帶GFP這樣能直接觀察到是否真陽性的基因，我們才用有限稀釋法來作，要不好像也太麻煩了吧？耗時也多

單克隆化后細(xì)胞特點(diǎn)和處理：

1.單克隆后細(xì)胞生活習(xí)性改變：考慮質(zhì)粒的表達(dá)對細(xì)胞的生長有一定的影響，查文獻(xiàn)確認(rèn)一下。

2.單克隆后的培養(yǎng)需要多加些血清，再傳代時保證板子不影響細(xì)胞貼壁，避免出現(xiàn)傳代后細(xì)胞浮起來后死亡的現(xiàn)象。

3.篩選成單克隆后，不加藥培養(yǎng)2代，再加藥繼續(xù)篩選兩代，此時如果不出現(xiàn)死亡細(xì)胞則可以認(rèn)為是穩(wěn)定細(xì)胞系。復(fù)蘇后加G418傳代2次，然后按部就班。

4.過一段時間再篩選時，G418的濃度有人認(rèn)為需要比穩(wěn)轉(zhuǎn)時小寫，此外，加藥后對蛋白質(zhì)的表達(dá)，細(xì)胞形態(tài)有影響，因此做功能時要停藥培養(yǎng)合適時間后再做。5.穩(wěn)轉(zhuǎn)PA317細(xì)胞后再此篩選（需要隔一段時間再加壓篩一次），細(xì)胞也是死的厲害，不過還是可以篩到，不過需要用合適的濃度。可以在細(xì)胞傳幾代后，分出一小部分，不加G418培養(yǎng)一段時間，然后再加你維持細(xì)胞的抗性的G418濃度培養(yǎng)一天看細(xì)胞會不會死亡，如果死亡，說明外源基因還沒有丟失。

6.有人這樣做的：轉(zhuǎn)染加藥一段時間后，板子上出現(xiàn)了幾個克隆，如果有幾十個克隆，然后挑其中七八個克隆到24孔板里繼續(xù)加藥篩選，等24孔長滿后再轉(zhuǎn)到6孔板繼續(xù)加藥篩選，6孔板里長差不多滿后，每孔消化下來大概一半做WB鑒定目的基因表達(dá)，剩一半留著繼續(xù)加藥培養(yǎng)，等WB結(jié)果出來有陽性的孔就保留下來，陰性的丟掉。

單克隆化后鑒定：

1.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞，通過PCR鑒定，發(fā)現(xiàn)目的基因并不上調(diào)，瞬時轉(zhuǎn)染表達(dá)是增高的。原因：瞬轉(zhuǎn)是在強(qiáng)啟動子下,穩(wěn)轉(zhuǎn)時你得到的細(xì)胞株可能失去了此啟動子,或者是改變了細(xì)胞的生理特性!用WB和瞬轉(zhuǎn)對照鑒定一下。

2.轉(zhuǎn)染后質(zhì)粒整合到基因組是隨機(jī)的，一般兩月后（傳代10代以上）還表達(dá)你想要蛋白的單克隆可以認(rèn)為是整合了質(zhì)粒的。

第四篇：細(xì)胞研究論文

骨缺損(尤其是大型骨缺損)的治療，由局部傷情復(fù)雜和缺乏理想的修復(fù)材料，一直是困擾臨床醫(yī)生和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)工作者的一大難題，而尋找一種盡可能達(dá)到或接近自體骨移植效果的理想的骨替代材料更是無數(shù)學(xué)者熱切探索、孜孜以求的目標(biāo)。近年來日趨活躍的骨組織工程(bone tissue engineering)技術(shù)為這一課題的研究帶來了新的亮點(diǎn)和希望。目前動物實(shí)驗(yàn)已能從骨膜、骨髓等定向性骨祖細(xì)胞(determined osteogenic precursor cells, DOpC)密集處分離培養(yǎng)出成骨細(xì)胞，經(jīng)體外擴(kuò)增并與載體結(jié)合，回植體內(nèi)骨缺損處取得骨缺損修復(fù)的成功［1］。與此同時，基于對患者易接受性、可操作性和更簡單易行性等方面的考慮，研究者又開始把目光投向誘導(dǎo)性骨祖細(xì)胞(inducible osteogenic precursor cells, IOpC)。其中，在體內(nèi)分布廣泛、數(shù)量巨大、部位表淺、取材方便、培養(yǎng)傳代易行、分裂增殖迅速的成纖維細(xì)胞首先成為了研究的焦點(diǎn)。由于目前許多相關(guān)研究尚處于實(shí)驗(yàn)階段，為此，本文著重就成纖維細(xì)胞的生物學(xué)特性及其成骨作用等作一綜述。

1　成纖維細(xì)胞的來源及其生物學(xué)特性

成纖維細(xì)胞(fibroblast)是結(jié)締組織中最常見的細(xì)胞，由胚胎時期的間充質(zhì)細(xì)胞(mesenchymal cell)分化而來。在結(jié)締組織中，成纖維細(xì)胞還以其成熟狀態(tài)—纖維細(xì)胞(fibrocyte)的形式存在，二者在一定條件下可以互相轉(zhuǎn)變。

不同類型的結(jié)締組織含成纖維細(xì)胞的數(shù)量不同。通常，疏松結(jié)締組織中成纖維細(xì)胞的數(shù)量比同樣體積的致密結(jié)締組織中所含成纖維細(xì)胞的數(shù)量要少，故分離培養(yǎng)成纖維細(xì)胞多以真皮等致密結(jié)締組織為取材部位［2，3］。

成纖維細(xì)胞形態(tài)多樣，常見的有梭形、大多角形和扁平星形等，其形態(tài)尚可依細(xì)胞的功能變化及其附著處的物理性狀不同而發(fā)生改變。成纖維細(xì)胞胞體較大，胞質(zhì)弱嗜堿性，胞核較大呈橢圓形，染色質(zhì)疏松著色淺，核仁明顯。電鏡下，其胞質(zhì)可見豐富的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、游離核糖體和發(fā)達(dá)的高爾基復(fù)合體，表明它具有合成和分泌蛋白質(zhì)的功能。成纖維細(xì)胞尚可合成和分泌膠原纖維、彈性纖維、網(wǎng)狀纖維及有機(jī)基質(zhì)。它合成的前膠原蛋白分子經(jīng)內(nèi)切酶作用，聚合和重排，可形成與成骨細(xì)胞合成分泌的膠原原纖維一樣具有64nm(640?)周期橫紋的膠原原纖維，膠原原纖維經(jīng)互相粘合形成膠原纖維。經(jīng)檢測，這兩種細(xì)胞合成分泌的膠原纖維均是Ⅰ型膠原纖維，在形態(tài)和生化結(jié)構(gòu)上完全相同［4,5］。

處于成熟期或稱靜止?fàn)顟B(tài)的成纖維細(xì)胞，胞體變小，呈長梭形，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體均不發(fā)達(dá)，被稱為纖維細(xì)胞。在外傷等因素刺激下，部分纖維細(xì)胞可重新轉(zhuǎn)變?yōu)橛字傻某衫w維細(xì)胞，其功能活動也得以恢復(fù)，參與組織損傷后的修復(fù)。另外，在結(jié)締組織中，仍保留著少量具有分化潛能的間充質(zhì)細(xì)胞，它們在創(chuàng)傷修復(fù)等情況下可增殖分化為成纖維細(xì)胞。

2　成纖維細(xì)胞在一般創(chuàng)傷修復(fù)中的表現(xiàn)

各種創(chuàng)傷均會造成不同程度的細(xì)胞變性、壞死和組織缺損，必須通過細(xì)胞增生和細(xì)胞間基質(zhì)的形成來進(jìn)行組織修復(fù)。在此修復(fù)過程中，成纖維細(xì)胞起著十分重要的作用。以傷口愈合過程為例，成纖維細(xì)胞通過有絲分裂大量增殖，并從4～5天或6天開始合成和分泌大量的膠原纖維和基質(zhì)成分，與新生毛細(xì)血管等共同形成肉芽組織，填補(bǔ)傷口組織缺損，為表皮細(xì)胞的覆蓋創(chuàng)造條件。在傷口愈合中，成纖維細(xì)胞主要來源于真皮乳頭層的局部成纖維細(xì)胞和未分化的間充質(zhì)細(xì)胞，以及血管周圍的成纖維細(xì)胞和周細(xì)胞。內(nèi)臟損傷時，參與修復(fù)過程的成纖維細(xì)胞多來自間質(zhì)和包膜，以及粘膜下或漿膜下層的結(jié)締組織。有人認(rèn)為創(chuàng)傷愈合過程中傷處聚集的大量成纖維細(xì)胞，一方面是由成纖維細(xì)胞通過分裂增殖而來，另一方面，更多地是由鄰近的間充質(zhì)細(xì)胞、纖維細(xì)胞和毛細(xì)血管周細(xì)胞等演變或游走到傷處。在創(chuàng)傷修復(fù)的后期，成纖維細(xì)胞通過分泌膠原酶參與修復(fù)后組織的改建。在某些病理?xiàng)l件下，以成纖維細(xì)胞為主要細(xì)胞成分的肉芽組織或增生組織塊還可以在非骨組織內(nèi)發(fā)生鈣化，引起異位骨化(ectopic ossification)。但對于異位骨化的參與細(xì)胞及其機(jī)制尚不十分清楚，未分化間充質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和毛細(xì)血管周細(xì)胞等可劃歸為誘導(dǎo)性骨祖細(xì)胞的細(xì)胞都有可能參與這一過程［6，8］。

3　成纖維細(xì)胞在骨創(chuàng)傷修復(fù)過程中的表現(xiàn)

最簡單和常見的骨創(chuàng)傷即是骨折，其愈合過程須經(jīng)過炎性反應(yīng)、清掃、纖維骨痂和骨性骨痂4個階段［4］。不同階段參與的細(xì)胞主體不同。成纖維細(xì)胞從骨折第3天起就出現(xiàn)于骨折局部血腫中［6］，骨折后5天即在機(jī)化血腫及骨折斷端的間隙及其周圍大量存在，是參與纖維骨痂階段的主要細(xì)胞成分［4，5］。在此階段成纖維細(xì)胞一方面大量分裂增殖，一方面又合成和分泌大量Ⅰ型膠原，使肉芽組織逐步變成疏松的結(jié)締組織，將骨斷端包圍起來，形成接合兩骨折斷端的巨大的纖維骨痂。然而，這種由無數(shù)成纖維細(xì)胞和豐富的肉芽組織為主體構(gòu)成的纖維結(jié)締組織卻不會演變?yōu)樵谄渌M織創(chuàng)傷修復(fù)時常見的瘢痕組織，而是通過鈣鹽結(jié)晶在其內(nèi)部不斷沉積，逐漸演變?yōu)楣切怨丘?，使骨折局部的修?fù)達(dá)到骨性愈合，恢復(fù)骨組織的結(jié)構(gòu)。此時，骨折愈合部只有骨組織而不再存在成纖維細(xì)胞［4，5，9～11］。

4　成纖維細(xì)胞的成骨作用

成纖維細(xì)胞在骨折愈合過程中不同于其它組織創(chuàng)傷修復(fù)的表現(xiàn)，以及在某些病理?xiàng)l件下可以參與異位骨化［6，7］，使人們對成纖維細(xì)胞的分化能力、鈣化骨化能力以及在成骨過程中其成骨能力如何發(fā)揮、細(xì)胞演變的最終歸宿如何等等問題產(chǎn)生了濃厚的興趣。對成纖維細(xì)胞成骨能力的研究也正是開始于對骨折愈合過程中成纖維細(xì)胞表現(xiàn)的觀察。

對骨折局部骨形成區(qū)的電鏡觀察顯示，除了成骨細(xì)胞在此發(fā)揮成骨作用外，成纖維細(xì)胞確實(shí)也存在著類似的成骨表現(xiàn)［4，5，9～13］。例如，在其線粒體內(nèi)可清晰見到鈣鹽顆粒，部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)可見成熟的膠原纖維，分泌到其四周的膠原纖維內(nèi)可見高密度的鈣鹽結(jié)晶沉積。不僅如此，成纖維細(xì)胞還能象成骨細(xì)胞一樣產(chǎn)生基質(zhì)小泡并引起小泡內(nèi)的鈣鹽沉積。鈣化的基質(zhì)小泡形成叢毛球狀的鈣球，鈣球隨后合并、融合為骨組織。以上種種現(xiàn)象表明，成纖維細(xì)胞與成骨細(xì)胞一樣具備提供鈣鹽沉積及骨形成所必需的條件。在從纖維性骨痂到骨性骨痂的演變過程中，成纖維細(xì)胞也隨之演變?yōu)楣羌?xì)胞，與成骨細(xì)胞的歸宿相一致。但二者在演變過程中的表現(xiàn)又不盡相同，主要有以下幾點(diǎn)可資鑒別［9，13］：①成纖維細(xì)胞及其細(xì)胞核均呈不規(guī)則的橢圓形或長方形，而成骨細(xì)胞及其細(xì)胞核則為邊緣比較光整的橢圓形；②成纖維細(xì)胞均單獨(dú)存在，細(xì)胞之間有眾多的膠原纖維相隔，成骨細(xì)胞則以連續(xù)排列的形式出現(xiàn)；③成纖維細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)溶酶體少見，而成骨細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)則常有溶酶體可見；④成纖維細(xì)胞四周的骨組織都由叢毛球狀鈣球或針狀鈣鹽結(jié)晶組成，成骨細(xì)胞則都有一面緊貼比較成熟與致密的骨組織；⑤成骨細(xì)胞是一個一個地被骨組織(類骨質(zhì))包圍變?yōu)楣羌?xì)胞，而成纖維細(xì)胞則可以是兩個或兩個以上同時被骨組織包圍在一個陷窩內(nèi)，然后再隨著細(xì)胞之間基質(zhì)的鈣化而分隔為各占一個骨陷窩。

對成纖維細(xì)胞的成骨作用，有學(xué)者認(rèn)為這是成纖維細(xì)胞的固有特性在骨折這一特定情況下得以表達(dá)的結(jié)果［9，11］。骨折局部活的和失活的骨組織及軟骨組織，以及骨基質(zhì)中的某些大分子都有可能誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞表達(dá)其成骨作用進(jìn)而演變?yōu)楣羌?xì)胞［14，15］。較早在骨基質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein, BMp)即對成纖維細(xì)胞有一定的誘導(dǎo)作用。對骨折愈合中BMp作用的研究［16，17］，表明創(chuàng)傷使內(nèi)源性BMp呈階段性合成與釋放，并誘導(dǎo)周圍軟組織中的間充質(zhì)細(xì)胞或/和成纖維細(xì)胞等向成骨方向轉(zhuǎn)化。應(yīng)用pAp法發(fā)現(xiàn)［16］，骨折后第3、5天局部纖維肉芽組織中的成纖維細(xì)胞樣間充質(zhì)細(xì)胞內(nèi)以及第14天新生骨小梁間纖維組織中的成纖維細(xì)胞樣間充質(zhì)細(xì)胞內(nèi)，都與成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和骨基質(zhì)一樣存在BMp，表明這些成纖維細(xì)胞樣間充質(zhì)細(xì)胞已被誘導(dǎo)為可合成分泌BMp、具有成骨作用的細(xì)胞。而Sampath［15］從牛骨基質(zhì)中分離提純得到的成骨素對成纖維細(xì)胞的骨誘導(dǎo)能力更是超過了BMp和當(dāng)時已知的其它骨生長因子。

成纖維細(xì)胞在其成骨作用得以表達(dá)后，可能通過兩種方式成骨：①膜內(nèi)成骨；②在環(huán)繞軟骨的纖維層內(nèi)成骨。開始分泌膠原纖維后，參與成骨的成纖維細(xì)胞只有兩個歸宿［4，5，9，13］：①變性、死亡、碎裂直至消失，這種演變發(fā)生早、范圍廣，故從纖維性骨痂形成開始，就逐漸有基質(zhì)成分發(fā)生鈣化，進(jìn)而轉(zhuǎn)變?yōu)楣腔|(zhì)；②演變?yōu)楣羌?xì)胞，這一過程出現(xiàn)較晚，并穿插在前一過程之中，故在形成骨組織的細(xì)胞成分的同時，還使豐富的纖維骨痂演變?yōu)楣切怨丘?，形成骨組織。但這種由成纖維細(xì)胞演變成的骨細(xì)胞，其結(jié)局如何、其生物學(xué)特性與由成骨細(xì)胞演化而來的骨細(xì)胞是否相同仍不清楚。例如，骨細(xì)胞從骨陷窩脫離后，可恢復(fù)為功能活躍的成骨細(xì)胞，再次參與骨組織的形成；而由成纖維細(xì)胞演變成的骨細(xì)胞在脫離骨陷窩后，是成為成骨細(xì)胞還是恢復(fù)為成纖維細(xì)胞、此時是否還具備成骨作用等一系列問題尚缺乏研究。

5　成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)的生物學(xué)特性［18］

成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)一開始并不涉及成骨作用，而主要是用于研究細(xì)胞的老化、各種外來因子對細(xì)胞的損傷、細(xì)胞在體外條件下的惡性轉(zhuǎn)化、以及某些先天性代謝異常、酶缺陷等。由于皮膚成纖維細(xì)胞易于獲取，又易于在體外生長，故目前皮膚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)已在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)研究中得到較廣泛的運(yùn)用，其分離培養(yǎng)技術(shù)已相對成熟，對其體外生長規(guī)律也有了較全面的認(rèn)識。

成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)可用酶消化法或組織塊法，其中組織塊法又因其操作簡便、條件易于控制而應(yīng)用更為普遍。通常，以酶消化法獲得的成纖維細(xì)胞懸液在接種后5～10min即可見細(xì)胞以偽足初期附著，與底物形成一些接觸點(diǎn)；然后細(xì)胞逐漸呈放射狀伸展，胞體的中心部分亦隨之變扁平；最快者大約在接種后30min，細(xì)胞貼附底物即較為完全，呈現(xiàn)成纖維細(xì)胞的形態(tài)。采用組織塊法則大約在接種后2～3天［2，3］到1周左右，在接種的皮膚組織塊周圍長出細(xì)胞。待細(xì)胞融合成片，鋪滿培養(yǎng)容器底壁大部分時即可進(jìn)行傳代。一般都采用胰蛋白酶(trypsin)，將成纖維細(xì)胞從底壁消化下來后分瓶作傳代培養(yǎng)。成纖維細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下能保持良好的分裂增殖能力。細(xì)胞分裂時變?yōu)榍蛐?；分裂后又平鋪在附著物的表面成為有突起的扁平?xì)胞。體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞，其生命期限與物種等因素有關(guān)。例如：人胚成纖維細(xì)胞約可培養(yǎng)50代；恒河猴皮膚成纖維細(xì)胞能傳代超過40代；雞胚成纖維細(xì)胞則只有少數(shù)能培養(yǎng)30代；而小鼠成纖維細(xì)胞多數(shù)只能生長8代左右。另外，從老年個體取得的成纖維細(xì)胞的壽命要比取自年輕者短。由于在細(xì)胞傳代和進(jìn)行體外培養(yǎng)時，細(xì)胞的生物學(xué)特性會逐漸發(fā)生一些不同于體內(nèi)的改變，故通常只將前10代視這正常細(xì)胞，可在此時將生長旺盛的成纖維細(xì)胞凍存起來，以備將來復(fù)蘇使用，這在將培養(yǎng)的細(xì)胞由動物實(shí)驗(yàn)向人體實(shí)驗(yàn)過渡的過程中必須給予足夠的重視。

6　成纖維細(xì)胞在體外培養(yǎng)中的成骨作用

徐榮輝［2］等通過體外培養(yǎng)家兔皮膚成纖維細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，經(jīng)傳代培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞至第8天時，其細(xì)胞集落中有不透光的骨小結(jié)節(jié)形成；到37天時，小結(jié)節(jié)擴(kuò)大、延伸，形成骨小梁樣結(jié)構(gòu)。經(jīng)活體四環(huán)素標(biāo)記顯示，所形成的結(jié)構(gòu)為新生骨組織。他們還注意到，成纖維細(xì)胞在參與骨形成的過程中并無分化為成軟骨細(xì)胞或成骨細(xì)胞的明確跡象，故推測并未發(fā)生此種分化，而成纖維細(xì)胞之所以能發(fā)揮成骨作用，很可能是受某些誘導(dǎo)因素作用的緣故。他們認(rèn)為用以培養(yǎng)成纖維細(xì)胞的中厚皮片中混雜存在的上皮細(xì)胞(或/與內(nèi)皮細(xì)胞)，可能是誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞形成骨組織的一種誘導(dǎo)因素。而Friedenstein［6，19］較早的實(shí)驗(yàn)則認(rèn)為，屬于誘導(dǎo)性骨祖細(xì)胞之一種的成纖維細(xì)胞，在上皮細(xì)胞(如膀胱上皮)或脫鈣骨基質(zhì)等誘導(dǎo)因子作用下，可以分化為成骨細(xì)胞進(jìn)而形成骨組織。鄧廉夫［20］等分離培養(yǎng)取自關(guān)節(jié)內(nèi)的損傷性和晚期骨關(guān)節(jié)炎性的滑膜細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其中的成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞增殖迅速，呈束狀或交叉鋪展并可形成多層結(jié)構(gòu)，細(xì)胞表面有其分泌物形成的不透光結(jié)節(jié)，經(jīng)四環(huán)素標(biāo)記、ARS(Alizarinred s)和甲苯胺藍(lán)(Toluidine blue)染色，顯示結(jié)節(jié)為新生骨組織。在缺乏常規(guī)的誘導(dǎo)因子——上皮細(xì)胞的作用下，取自滑膜的成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞也能發(fā)生成骨作用，他們推測是在關(guān)節(jié)損傷后或骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生與發(fā)展過程中，改變的關(guān)節(jié)微環(huán)境(如TNF樣活性物質(zhì)增多等)可能會觸發(fā)滑膜的成纖維細(xì)胞與骨形成相關(guān)的多基因表達(dá)，使其向成骨型細(xì)胞分化，這樣，滑膜成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞在體內(nèi)時即已具備成骨性能，故在培養(yǎng)條件下可發(fā)揮成骨作用。Dodda［21］等的研究則指出，變性滑膜細(xì)胞多種細(xì)胞因子和生長因子的表達(dá)、關(guān)節(jié)液內(nèi)多種細(xì)胞因子的出現(xiàn)，可能是滑膜成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞成骨表型表達(dá)的重要始動因素。這些相關(guān)的研究表明成纖維細(xì)胞成骨表型的表達(dá)可能存在著較復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制，而其誘導(dǎo)因素也是多樣的。

為獲取大量具有成骨表型的成纖維細(xì)胞并了解其轉(zhuǎn)化機(jī)制，鄧廉夫［22］等將分離純化的人皮膚成纖維細(xì)胞置于加有不同濃度EGF、IL-

6、TNF-α、BMp-2的培養(yǎng)液中進(jìn)行體外培養(yǎng)，采用生物化學(xué)、組織化學(xué)和電鏡觀察等方法檢測成纖維細(xì)胞成骨性標(biāo)記物的形成狀況，發(fā)現(xiàn)TNF-α和BMp-2聯(lián)合應(yīng)用，可使成纖維細(xì)胞分泌堿性磷酸酶、骨鈣素及膠原纖維的量增加；成纖維細(xì)胞可由梭形向圓形或多突形轉(zhuǎn)化，蛋白分泌旺盛；細(xì)胞外基質(zhì)中，豐富的膠原纖維定向或雜亂排列，其間散在較多的鈣顆粒；細(xì)胞可重疊交織形成多層結(jié)構(gòu)，其表面有分泌顆粒和鈣鹽結(jié)晶堆積，并不斷融合擴(kuò)大成骨結(jié)節(jié)，表明TNF-α和BMp-2可以誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞成骨。但這種完全由成纖維細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)而形成的骨組織，在缺乏典型的成骨細(xì)胞參與下是否能在體外或植入體內(nèi)后經(jīng)改建成為成熟的板層骨及其改建過程如何?仍有待進(jìn)一步研究。

7　展望

盡管成纖維細(xì)胞受哪些因素誘導(dǎo)可以產(chǎn)生成骨作用、這些因素的誘導(dǎo)方式及其機(jī)制如何以及成纖維細(xì)胞在骨形成中是否分化為成骨細(xì)胞等等問題尚未完全解決，但成纖維細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)可以形成骨組織這一現(xiàn)象已逐漸為廣大科學(xué)工作者所接受。由于成纖維細(xì)胞直接參與了骨折愈合過程中纖維性骨痂的形成，其自身又具備被誘導(dǎo)成骨的能力，可以設(shè)想，利用成纖維細(xì)胞分布廣泛、取材方便、對機(jī)體損傷較小、體外培養(yǎng)容易成活、增生繁殖較快等較其它具有成骨作用的細(xì)胞(如骨膜成骨細(xì)胞、骨髓基質(zhì)細(xì)胞等)優(yōu)越之處，在體外大量培養(yǎng)擴(kuò)增成纖維細(xì)胞，并施以有效的誘導(dǎo)因素(如上皮細(xì)胞、TNG-α和BMp等)使其具備成骨效能，然后與合適的生物材料載體復(fù)合，同時使該復(fù)合體在體外或體內(nèi)保持良好的成骨能力并進(jìn)行一定程度的成骨，則有望獲得具有一定的生物力學(xué)支撐強(qiáng)度而成骨作用又保持活躍的“活骨”復(fù)合體，用以替代自體骨或異體骨回植體內(nèi)治療難以自身修復(fù)的較大的骨缺損，這無疑將為骨缺損的修復(fù)治療開辟一條新的有輝煌前景的道路。在組織工程技術(shù)和生物材料科學(xué)已有較大發(fā)展的今天，這一設(shè)想是極有可能實(shí)現(xiàn)的。當(dāng)然，從目前所處的實(shí)驗(yàn)階段過渡到臨床應(yīng)用尚有很大一段距離，需要解決的問題還很多，而且隨著研究的展開和深入，問題可能還會越來越多，但這確實(shí)是一項(xiàng)很有臨床應(yīng)用價值和社會、經(jīng)濟(jì)效益的重大課題，值得廣大基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)工作者和臨床科研人員為之而努力。

第五篇：細(xì)胞免疫學(xué)論文

【摘要】 作為一種具有靶向性的生物大分子，單克隆抗體始終是人們關(guān)注的熱點(diǎn)之一，被廣泛用于治療腫瘤、病毒感染和抗移植排斥等。但鼠源單克隆抗體的臨床應(yīng)用受限于誘導(dǎo)產(chǎn)生人抗鼠抗體、腫瘤滲入量低、親和力低和半衰期短等。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展及其向各學(xué)科的滲透，通過基因操作技術(shù)對抗體進(jìn)行改造，可使其適用于多種疾病的治療。抗體人源化已經(jīng)成為治療性抗體的發(fā)展趨勢，同時各種抗體衍生物也不斷涌現(xiàn)，它們從不同角度克服了抗體本身的應(yīng)用局限，也為治療人類疾病提供了利器。本文簡要介紹上述技術(shù)的基本原理、特點(diǎn)和治療性抗體的研究進(jìn)展。

【關(guān)鍵詞】人--鼠嵌合抗體 生物導(dǎo)彈 人源化抗體 雙特異性抗體 【正文】

一、治療性抗體技術(shù)的研究背景 2000年前，人們將自白喉?xiàng)U菌培養(yǎng)上清液中分離到的可溶性毒素注入馬體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)得到的抗血清可以治療白喉，這是第一個用抗體治療疾病的例子。隨著免疫學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，以及抗體基因結(jié)構(gòu)的闡明，DNA 重組技術(shù)開始被用于抗體的改造，人們可以根據(jù)需要對以往的鼠抗體進(jìn)行相應(yīng)的改造，以消除抗體應(yīng)用的不利性狀或增加新的生物學(xué)功能，還可用新的技術(shù)重新制備各種形式的重組抗體，標(biāo)志著基因工程抗體時代的來臨。自第一個基因工程抗體———人--鼠嵌合抗體于1984 年誕生以來，新型基因工程抗體不斷出現(xiàn)，包括人源化抗體、單價小分子抗體（Fab、單鏈抗體、單域抗體等）、多價小分子抗體（雙鏈抗體、三鏈抗體、微型抗體等）、某些特殊類型的抗體（雙特異抗體、抗原化抗體、細(xì)胞內(nèi)抗體等）及抗體融合蛋白（免疫毒素、免疫黏連素等）等。用于制備新型抗體的噬菌體抗體庫技術(shù)成為繼雜交瘤技術(shù)之后生命科學(xué)研究中又一突破性進(jìn)展。在噬菌體抗體庫的基礎(chǔ)上，近年來又發(fā)展了核糖體展示抗體庫技術(shù)，利用核糖體展示技術(shù)篩選抗體的整個過程均在體外進(jìn)行，不經(jīng)過大腸桿菌轉(zhuǎn)化步驟，因此可以構(gòu)建高容量、高質(zhì)量的抗體庫，更易于篩選高親和力抗體和利用體外進(jìn)行的方法對抗體性狀進(jìn)行改造，核糖體展示抗體庫技術(shù)代表了抗體工程的未來發(fā)展趨勢。

二、各種抗體治療作用的機(jī)理與應(yīng)用 2.1 抗體的基本組成

抗體的基本單位是由4 條肽鏈組成的對稱結(jié)構(gòu)，包括2 條相同的重鏈和2 條相同的輕鏈。重鏈和輕鏈分別由可變區(qū)和恒定區(qū)組成。可變區(qū)中的互補(bǔ)決定區(qū)與抗體和抗原結(jié)合的多樣性直接有關(guān)，而恒定區(qū)的結(jié)構(gòu)與抗體的生物學(xué)活性相關(guān)。在少數(shù)情況下，抗體與抗原結(jié)合后可以對機(jī)體直接起保護(hù)作用，如用抗體中和毒素的毒性，但在多數(shù)情況下需要通過效應(yīng)功能滅活或清除外來抗原?？贵w的效應(yīng)功能有2 類，一類是通過激活補(bǔ)體，產(chǎn)生多種生物學(xué)效應(yīng)，如細(xì)胞裂解、免疫黏附及調(diào)理作用，促進(jìn)炎癥反應(yīng)；另一類是通過抗體分子中的Fc 段與細(xì)胞表面Fc 受體的相互作用，通過其Fc段分別介導(dǎo)調(diào)理作用或抗體依賴性細(xì)胞毒作用。此外，治療性抗體的效應(yīng)和作用機(jī)理直接取決于它所識別的抗原決定簇，例如治療非何杰金氏B細(xì)胞淋巴瘤的抗CD20 抗體能影響細(xì)胞膜上離子通道的功能，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化、增殖和凋亡。

由于多克隆抗體本身的局限性，所以直到單克隆抗體出現(xiàn)，抗體用于抗腫瘤治療才真正得以實(shí)現(xiàn)。自從1978 年成功制備出第一株抗黑色素瘤單抗以來，相繼出現(xiàn)了抗胃腸癌、肺癌、乳腺癌、白血病、淋巴瘤、胰腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤等的單克隆抗體。單克隆抗體殺傷腫瘤細(xì)胞的機(jī)制可能是抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞效應(yīng)（ADCC）及補(bǔ)體依賴性細(xì)胞溶解作用（CDC）。單克隆抗體與藥物、毒素或放射性物質(zhì)偶聯(lián)，成為一種全新的“生物導(dǎo)彈”，可用于導(dǎo)向治療，已越來越受到重視。另外，用單抗給予T 細(xì)胞所必需的重要表面信號分子交聯(lián)的刺激信號和生長信號，體外誘導(dǎo)腫瘤特異性細(xì)胞毒T 淋巴細(xì)胞，可用于特異性、被動性的免疫治療。

自身免疫病多與單或寡克隆抗體的異常增多有關(guān)。利用基因工程技術(shù)可制備針對這些異?？贵w獨(dú)特型的抗抗體或與自身抗體結(jié)合并抑制其作用，或制備能模擬抗原的內(nèi)影像抗體用于中和體內(nèi)的自身抗體。目前針對不同的發(fā)病機(jī)制，治療方法趨于多樣化。許多變態(tài)反應(yīng)與IgE 有關(guān)。Fc 片段可與變應(yīng)原特異性IgE競爭結(jié)合嗜堿性粒細(xì)胞，封閉變應(yīng)原介導(dǎo)的組胺釋放。此外，還可生產(chǎn)出與患者IgE 競爭結(jié)合變應(yīng)原的Fab 樣分子。

2.2 免疫毒素

免疫毒素是一種毒素肽和細(xì)胞選擇性靶向配體連接的融合蛋白，它能通過靶向結(jié)構(gòu)域的特異結(jié)合功能使毒素傳遞到靶細(xì)胞并與之作用進(jìn)而殺死腫瘤細(xì)胞。早期的免疫毒素是由無修飾生物毒素和鼠源抗體連接而成的，連接的方式常為化學(xué)偶聯(lián)法。由于非人源的毒素和鼠源抗體導(dǎo)致的免疫排斥反應(yīng)，以及低親和力和無靶向特異性，使免疫毒素?zé)o法在臨床中得到運(yùn)用。

新型免疫毒素是將毒素肽和細(xì)胞選擇性靶向配體都進(jìn)行改造后，再用工程菌或工程細(xì)胞實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)。細(xì)胞選擇性靶向配體使用了工程抗體、轉(zhuǎn)鐵蛋白、表皮生長因子以及IL-2等?？贵w的改造主要集中在降低免疫原性、提高親和力和增強(qiáng)實(shí)體腫瘤滲入率等方面，包括改用小分子工程抗體、人源化抗體、人源抗體和突變的高親和力抗體等。

2.3 抗體－細(xì)胞因子融合蛋白

細(xì)胞因子能激活某些免疫細(xì)胞，包括單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞、T細(xì)胞和B細(xì)胞等。應(yīng)用細(xì)胞因子治療癌癥能夠引起免疫應(yīng)答，但這種免疫反應(yīng)是非特異的，常產(chǎn)生全身毒性。有人嘗試使用抗體工程技術(shù)將細(xì)胞因子與抗體連接形成融合蛋白，通過靶向作用，細(xì)胞因子在腫瘤組織的靶細(xì)胞上聚集，在局部殺傷腫瘤細(xì)胞，而非特異性毒性將減少或消失。常用的細(xì)胞因子包括IL-

2、IL-12和GM-CSF 等，融合的部位可以是全長型抗體或ScFv的N端或C端?？贵w－細(xì)胞因子融合蛋白作為一種新型的腫瘤免疫治療藥物，其抗體功能域可引導(dǎo)細(xì)胞因子濃集在腫瘤組織的微環(huán)境中，之后抗體部分直接抑制腫瘤細(xì)胞活性，并誘導(dǎo)二次免疫應(yīng)答，多重作用的相加使抗體－細(xì)胞因子融合蛋白對腫瘤的抑制作用明顯強(qiáng)于單獨(dú)使用抗體或細(xì)胞因子。由于全長型抗體Fc上存在兩個效應(yīng)細(xì)胞結(jié)合位點(diǎn)，功能更為強(qiáng)大，其中一個位點(diǎn)與細(xì)胞因子結(jié)合，激活效應(yīng)細(xì)胞，另一個與FcγR結(jié)合，引發(fā)抗體依賴細(xì)胞的細(xì)胞毒作用(ADCC)。

三、治療性抗體的制備技術(shù)與研究意義

由識別一種抗原決定簇的細(xì)胞克隆所產(chǎn)生的均一性抗體稱為單克隆抗體，可視為第二代抗體。由于其具有特異性高、親和力強(qiáng)、效價高、血清交叉反應(yīng)少等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)在基礎(chǔ)研究、臨床診斷及治療、免疫預(yù)防等領(lǐng)域發(fā)揮了重要作用。在治療上，單克隆抗體主要用于抗腫瘤、抗器官移植排斥反應(yīng)、抗感染、解毒等。近年來將單抗與核素、各種毒素（如白喉外毒素或蓖麻毒素）或藥物通過化學(xué)偶聯(lián)或基因重組制備成導(dǎo)向藥物，用于腫瘤的治療成為研究的重點(diǎn)。制備單克隆抗體的常規(guī)方法是免疫小鼠，雜交瘤可在實(shí)驗(yàn)動物中產(chǎn)生無限量單克隆抗體。對大多數(shù)雜交瘤來說，現(xiàn)已可用體外方法生產(chǎn)單克隆抗體而無需應(yīng)用動物。體外單克隆抗體生產(chǎn)系統(tǒng)已有多種，但大規(guī)模生產(chǎn)治療性單克隆抗體需用中空纖維系統(tǒng)，其成功與否取決于雜交瘤的固有特性，如細(xì)胞生長和單克隆抗體生產(chǎn)能力等。因此，大量生產(chǎn)以供臨床研究應(yīng)用還有困難，但有幾種方法可以解決這些問題，如嵌合單克隆抗體、人源化單克隆抗體和全人單克隆抗體的產(chǎn)生。其中，人源化抗體是一個重要的里程碑，并伴隨著一系列重大的技術(shù)革新，如PCR技術(shù)、抗體庫技術(shù)、轉(zhuǎn)基因動物等。人源化抗體的形式也從最初的嵌合抗體、改型抗體等逐步發(fā)展為今天的人抗體?？贵w人源化已經(jīng)成為治療性抗體的發(fā)展趨勢，同時各種抗體衍生物也不斷涌現(xiàn)，它們從不同角度克服了抗體本身的應(yīng)用局限，也為治療人類疾病提供了更多利器。

人源化抗體是從鼠源單抗到全人抗體的過渡形式，在鼠單抗的基礎(chǔ)上，用人抗體恒定區(qū)置換鼠抗體的相應(yīng)部位，形成人鼠嵌合抗體。利用DNA重組技術(shù)將鼠單抗的輕、重鏈可變區(qū)基因插入含有人抗體恒定區(qū)的表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化哺乳動物細(xì)胞表達(dá)人鼠嵌合抗體，其人源化程度可達(dá)到70%左右。嵌合抗體完整地保留了異源單抗的可變區(qū)，最大限度地保持了其親和性，降低了免疫原性。美國食品藥品管理局（FDA）批準(zhǔn)的抗體藥物中有4個是嵌合抗體。但由于其整個可變區(qū)都是異源的，所以嵌合抗體的異源性還很明顯，解決HAMA的效果并不理想。

由于天然抗體主要是通過調(diào)理作用、ADCC 或依賴補(bǔ)體的細(xì)胞毒效應(yīng)起到殺傷靶細(xì)胞的作用，因此天然抗體的細(xì)胞毒效應(yīng)有限。下列幾種途徑可以增加抗體對靶細(xì)胞的殺傷，如免疫結(jié)合物、抗體細(xì)胞因子融合蛋白、雙特異性抗體、細(xì)胞內(nèi)抗體等。

雙特異性抗體亦稱雙功能抗體，是同一抗體的3 個抗原結(jié)合部位分別針對3 個不同的抗原，在結(jié)構(gòu)上是雙價的，而與抗原結(jié)合的功能是單價的。雙特異性抗體可以用化學(xué)交聯(lián)、細(xì)胞融合和基因工程等方法獲得。由于它可以同時與3 種抗原發(fā)生反應(yīng)，并使之交聯(lián)，因而可介導(dǎo)標(biāo)記物與靶抗原的結(jié)合，或使某種效應(yīng)分子定位于靶細(xì)胞；此外，又由于它與抗原結(jié)合的單價性，不易引起靶抗原的調(diào)變，從而可提高抗體的某些生物學(xué)效應(yīng)。雙特異性抗體重鏈的異質(zhì)性使其FC 片段與FC受體結(jié)合的能力明顯減弱，減少了該抗體在體內(nèi)的非特異性分布。雙特異性抗體的這些特性使它在診斷和治療上有廣泛的應(yīng)用前景。目前，作為治療腫瘤用的雙功能抗體常采用抗腫瘤相關(guān)抗原（TAA）及CD3 或抗TAA 及CD16，這類雙特異性抗體在

荷瘤動物模型中無論是抑瘤試驗(yàn)還是殺傷試驗(yàn)均獲得了良好結(jié)果。無論采用何種免疫活性細(xì)胞的效應(yīng)分子，其殺傷均無MHC限制，這為臨床應(yīng)用提供了許多方便，目前已有一些雙功能抗體正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)。

一般的抗體在細(xì)胞內(nèi)合成后分泌到胞外，如果在抗體的N端或C端加入引導(dǎo)序列，就能使抗體表達(dá)定位在亞細(xì)胞部位，如胞漿、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或細(xì)胞核部位。這種在細(xì)胞內(nèi)合成并作用于細(xì)胞內(nèi)組分的抗體稱為細(xì)胞內(nèi)抗體或內(nèi)抗體。細(xì)胞內(nèi)抗體可以提供一種獨(dú)有的研究分子功能的新方法，它可以在細(xì)胞內(nèi)抑制病毒復(fù)制、抑制生長因子受體或癌蛋白表達(dá)，因此有用于基因治療的前景，研究較多的是用細(xì)胞內(nèi)抗體抑制I型人類免疫缺損病毒I型（HIV-I）和抗腫瘤。

雙特異抗體是指具有兩種抗原結(jié)合特性的抗體，可同時結(jié)合兩個不同的抗原或抗原決定簇。與mAb相比，雙特異抗體具有以下優(yōu)點(diǎn)：(1)較低濃度即可殺傷或溶解腫瘤細(xì)胞；(2)對低表達(dá)或不表達(dá)腫瘤相關(guān)抗原的腫瘤細(xì)胞有殺傷或抑制作用；(3)激活結(jié)合的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞，發(fā)揮多種生物學(xué)效應(yīng)，協(xié)助殺傷腫瘤細(xì)胞。早期研制雙特異抗體的方法是采用細(xì)胞工程，即將兩株各自分泌不同特異性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞再融合得到四源雜交瘤，或?qū)⒁恢觌s交瘤細(xì)胞與免疫的脾細(xì)胞融合得到三源雜交瘤，這兩種雜交瘤被稱為二次雜交瘤)。多倍雜交瘤細(xì)胞的穩(wěn)定性差，BsAb的產(chǎn)量少且活性低，費(fèi)時費(fèi)力，臨床應(yīng)用時存在人抗鼠抗體免疫反應(yīng)(HAMA)，因此不適用于臨床。20世紀(jì)90年代起，基因工程和蛋白質(zhì)工程在抗體生產(chǎn)和改造中得到了成功應(yīng)用，由此產(chǎn)生了抗體工程。應(yīng)用抗體工程生產(chǎn)BsAb，具有分子量小、方法穩(wěn)定、可大量生產(chǎn)、成本顯著降低和操作簡便等優(yōu)點(diǎn)。

四、治療性抗體的研究方向與存在問題

抗體應(yīng)用于人類疾病的治療已有很長的歷史，但其發(fā)展歷程是曲折的，自單克隆抗體;雜交瘤技術(shù)宣告誕生以來，歷經(jīng)多年反復(fù)。目前，F(xiàn)DA 已經(jīng)批準(zhǔn)21 個治療性單抗上市。近年來，科學(xué)界和醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)界都對治療性抗體的研究表現(xiàn)出越來越多的關(guān)注。人源化抗體和人抗體的出現(xiàn)為治療性抗體的廣泛應(yīng)用帶來了新的希望。但人抗體是否可以解決鼠抗體臨床應(yīng)用中出現(xiàn)的所有問題，還有待大量臨床試驗(yàn)的檢驗(yàn)。影響抗體免疫原性的因素很多，如抗原呈遞方式、次級信號系統(tǒng)以及患者的個體差異性等，而抗體的人源化只能解決一個方面的問題。同樣，抗體衍生物也會面臨諸如免疫原性、毒副作用等自身固有的問題，所以可行的發(fā)展方向是在完善人抗體技術(shù)的同時，推進(jìn)治療性小分子抗體衍生物的研究。根據(jù)臨床實(shí)際設(shè)計(jì)靈活的治療方案，使人源化抗體和抗體衍生物互為補(bǔ)充，達(dá)到最佳治療效果。從已上市的抗體藥物不難看出，未來的治療性抗體將朝著人源化和小型化發(fā)展，兩條途徑的結(jié)合將最大程度地克服鼠單抗的缺陷使抗體藥物得到更為深入和廣泛的應(yīng)用。

五、治療性抗體的發(fā)展前景

單克隆抗體技術(shù)的問世,使研究和生產(chǎn)治療性單抗藥物成為現(xiàn)實(shí)。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展,新型的重組抗體技術(shù)也隨之而生。

人們可以利用DNA重組技術(shù)對鼠源抗體進(jìn)行人源化改造、構(gòu)建合成或半合成抗體庫及噬菌體抗體庫,從中篩選獲得人源抗體,甚至利用轉(zhuǎn)基因小鼠直接獲得人源抗體?？贵w藥物發(fā)展的趨勢也從鼠源、人-鼠嵌合、人源化到全人源。近年獲得批準(zhǔn)的抗體藥物以全人源為主。1996年至2008年間進(jìn)入臨床研究的人源化單克隆抗體中45%用于治療腫瘤,28%個用于治療免疫紊亂?？贵w藥物的發(fā)展進(jìn)入研發(fā)、回報(bào)的良性循環(huán),成了國際制藥業(yè)爭奪的焦點(diǎn)。文章就治療性抗體發(fā)展的歷史、現(xiàn)狀、市場及未來展望作了簡要綜述。利用抗體工程研制更有效的治療性抗體的前景非常光明盡管還存在很多問題。實(shí)踐已經(jīng)證明，許多新型工程抗體可以在原核或真核細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)，它們具有較長的半衰期和生物學(xué)效應(yīng)，大多為ScFv、Fab或它們的多聚體，能夠有效進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，具有比較理想的治療效果。新型抗體工程技術(shù)的不斷出現(xiàn)，將為抗體改造提供了強(qiáng)有力的技術(shù)平臺。相信不久的將來，治療性抗體會在人類疾病的治療中扮演重要的角色。

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