第一篇：分子生物學(xué)在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的臨床應(yīng)用及前景

分子生物學(xué)在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的臨床應(yīng)用及前景 班級(jí)：2013級(jí)科碩6班 專業(yè)：臨床檢驗(yàn)診斷學(xué) 姓名：姜世濤

學(xué)號(hào)：20*** 評(píng)分： 導(dǎo)師簽名：

分子生物學(xué)是一門正在蓬勃發(fā)展的學(xué)科，新技術(shù)和應(yīng)用條件的不斷出現(xiàn)，為檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展提供了嶄新的時(shí)代并提供新的機(jī)遇和挑戰(zhàn)。分子生物學(xué)是以核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子為研究對(duì)象的學(xué)科，分子生物學(xué)技術(shù)即建立在核酸生化基礎(chǔ)上的一類研究手段，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中，同時(shí)也逐漸滲入數(shù)理科學(xué)、結(jié)構(gòu)基因組學(xué)、功能基因組學(xué)和環(huán)境基因組學(xué)，研究?jī)?nèi)容也從DNA鑒定、擴(kuò)展到核酸及表達(dá)產(chǎn)物分析，技術(shù)不斷進(jìn)步為微生物檢驗(yàn)、腫瘤診斷及評(píng)估、遺傳病診斷、兔疫系統(tǒng)疾病診斷提供重要依據(jù)和創(chuàng)新思路。在結(jié)構(gòu)基因組學(xué)、功能基因組學(xué)和環(huán)境基因組學(xué)蓬勃發(fā)展形勢(shì)下，分子診斷學(xué)技術(shù)將會(huì)取得突破性進(jìn)展。一．利用分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)樣品中核酸水平

PCR[1]技術(shù)是目前應(yīng)用較廣泛和成熟的臨床檢測(cè)方法，在法醫(yī)學(xué)、常見傳染病、性病、寄生蟲和優(yōu)生優(yōu)育等領(lǐng)域有很高的應(yīng)用價(jià)值，尤其對(duì)肝炎病毒的早期診斷。1．核酸分子雜交技術(shù)和基因芯片技術(shù)

核酸分子雜交技術(shù)也稱為基因探針技術(shù)，利用核酸的變性、復(fù)性和堿基互補(bǔ)配對(duì)的原理，用已知的探針序列檢測(cè)樣本中是否含有與之配對(duì)的核苷酸序列的技術(shù)，是印跡雜交、基因芯片等技術(shù)的基礎(chǔ)。目前基因芯片技術(shù)可廣泛應(yīng)用在腫瘤基因表達(dá)譜差異研究、基因突變、基因測(cè)序、基因多態(tài)性分析、微生物篩選鑒定、遺傳病產(chǎn)前診斷等方面。另外，現(xiàn)已獲得一些微生物的全基因序列，包括百余種病毒，多種細(xì)菌(流感嗜血桿菌、產(chǎn)甲烷球菌及實(shí)驗(yàn)室常用的大腸桿菌等)和一些酵母等。因此，將一種或多種病原微生物的全部或部分特異的保守序列集成在一塊基因芯片上，可快速、簡(jiǎn)便地檢測(cè)出病原體，判斷侵入機(jī)體引起感染性疾病的病原微生物(病毒、細(xì)菌或寄生蟲等)，從而對(duì)疾病作出診斷及鑒別診斷。2．單核苷酸多態(tài)性分析(SNP)技術(shù)

在人群中，個(gè)體基因的核苷酸序列存在差異性，稱為基因多態(tài)性?；蚨鄳B(tài)性位點(diǎn)普遍存在于人的基因組中。如果在某個(gè)家庭中，某一致病基因與特定的多態(tài)性片段緊密連鎖，就可以用這一多態(tài)性片段作為一種”遺傳標(biāo)記”來判斷家庭成員或胎兒是否攜帶有致病基因。目前認(rèn)為基因多態(tài)性是個(gè)體的”身份證”，因此，基因多態(tài)性分析技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于群體遺傳學(xué)研究、疾病連鎖分析和關(guān)聯(lián)分析、疾病遺傳機(jī)制研究、腫瘤易感性研究、個(gè)性化用藥等諸多方面。單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)分析技術(shù)為臨床檢測(cè)提供了依據(jù)。SNP是一種最常見的遺傳變異，在人類DNA多態(tài)性中，SNP約占90％。SNP是指在基因組內(nèi)特定核苷酸位置上存在兩種不同的堿基。SNP與RFLP和STR等DNA標(biāo)記的主要不同在于：它不再以”長(zhǎng)度”的差異作為檢測(cè)手段，而是直接以序列的差異作為標(biāo)記。由于SNP是二態(tài)的，易于自動(dòng)化批量檢測(cè)，易于計(jì)算機(jī)分析結(jié)果，因此SNP檢測(cè)已廣泛地應(yīng)用于疾病的連鎖分析及關(guān)聯(lián)分析、腫瘤的雜合性缺失研究、疾病遺傳機(jī)制研究、個(gè)性化用藥研究等諸多領(lǐng)域。盡管SNP檢測(cè)在搜尋疾病基因方面有潛在的價(jià)值，但實(shí)際應(yīng)用中卻比人們想象的要難得多，它需要花費(fèi)大量的時(shí)間進(jìn)行篩查，才能建立可靠的SNP分析圖譜。3．microRNA是潛在的臨床診斷工具 microRNAs(miRNAs)是一類分布廣泛的小的非編碼蛋白質(zhì)的RNAs，其功能是負(fù)調(diào)控基因表達(dá)。在正常組織中，miRNA轉(zhuǎn)錄，加工，結(jié)合到靶mRNA的互補(bǔ)位點(diǎn)，通過抑制蛋白翻譯或是改變mRNA的穩(wěn)定性來抑制基因表達(dá)，維持細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化和死亡的正常進(jìn)行。不同miRNA的分布有組織特異性，因此在生理和病理?xiàng)l件下，miRNA的表達(dá)水平存在差異。成熟miRNA水平下降可能是由于miRNA生物合成的任何步驟的缺陷造成的，而這最終將導(dǎo)致不適當(dāng)?shù)膍iRNA的靶蛋白的表達(dá)。最后的結(jié)果可能導(dǎo)致過度增殖、侵入、凋亡的減少、不能正常分化或者去分化，引起腫瘤的形成。最近的證據(jù)表明，miRNA突變或者異位表達(dá)與多種人類癌癥相關(guān)，miRNAs可以起到腫瘤抑制基因或者癌基因的功能。目前已知的miRNA中，大約50％在基因組上定位于與腫瘤相關(guān)的脆性位點(diǎn)，這說明miRNAs在腫瘤發(fā)生過程中起了至關(guān)重要的作用。例如，mir-125b一1，線蟲lin一4的同源基因，在染色體的1lq24脆性位點(diǎn)，在很多乳腺癌、肺癌、卵巢癌、子宮癌病人中有缺失。若能確定多種腫瘤的miRNA表達(dá)譜特征庫，可以幫助診斷和治療腫瘤。由于miRNAs可以從福爾馬林固定的石蠟包埋的樣品中分離出來，這使得miRNA表達(dá)譜特征庫建立成為可能。在此基礎(chǔ)上，用特定的miRNAs表達(dá)差異圖譜，還可以用于預(yù)測(cè)病人的預(yù)后。另外從治療的角度，miRNA表達(dá)譜可能為臨床上確定一個(gè)治療方案提供一個(gè)強(qiáng)有力的工具。

二、蛋白組學(xué)技術(shù)在臨床檢驗(yàn)中的應(yīng)用 隨著生物體全基因組序列的解析，特別是人類基因組序列草圖的完成，基因組學(xué)研究重點(diǎn)不可避免地從結(jié)構(gòu)基因組學(xué)轉(zhuǎn)向功能基因組學(xué)，因此在上世紀(jì)90年代中期，蛋白質(zhì)組學(xué)正研究成為基礎(chǔ)研究的重要支柱。蛋白組學(xué)是在基因組學(xué)之后又一組學(xué)，其發(fā)展之迅速，是由于其能夠較為全面的考察蛋白層面的表達(dá)情況，有利于獲得各種蛋白、多肽因子等信息從而對(duì)相關(guān)機(jī)制進(jìn)行更深入的研究[2]。蛋白質(zhì)組學(xué)研究的是在不同時(shí)間和空間發(fā)揮功能的特定蛋白質(zhì)群體，從而揭示和說明生命活動(dòng)的基本規(guī)律。與基因組相比蛋白質(zhì)組具有多樣性和可變性，雖然可以通過PCR、基因芯片等方法顯示生物體的基因水平，但mRNA水平(包括mRNA的種類和含量)并不能完全反映出蛋白質(zhì)的表達(dá)。由此可見，對(duì)一個(gè)機(jī)體而言，基因的數(shù)目是恒定的，而蛋白質(zhì)的種類和數(shù)目在生理和病理等不同條件下，其表達(dá)也不同。若能獲得與某種疾病相關(guān)的蛋白水平的差異表達(dá)信息，將為臨床診斷、治療和預(yù)后提供有力依據(jù)。1．蛋白質(zhì)芯片技術(shù)蛋白質(zhì)芯片技術(shù)是近年來蛋白質(zhì)組學(xué)研究中興起的一種新的方法，它類似于基因芯片，是將蛋白質(zhì)點(diǎn)到固相物質(zhì)上，然后與要檢測(cè)的組織或細(xì)胞等進(jìn)行”雜交”，再通過自動(dòng)化儀器分析得出結(jié)果。這里所指的”雜交”是指蛋白與蛋白之間如(抗體與抗原)在空間構(gòu)象上能特異性的相互識(shí)別。例如免疫芯片，是一種特殊的蛋白質(zhì)芯片，它在臨床分子診斷學(xué)有著明顯的發(fā)展?jié)摿?，如腫瘤標(biāo)志的檢測(cè)、不同激素的測(cè)定，自身免疫性疾病中多種自身抗體或抗原的檢測(cè)和超敏反應(yīng)中多種過敏原的篩查等。

2．液體芯片飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)在臨床檢測(cè)中的應(yīng)用根據(jù)探針標(biāo)記和色譜分析的原理，液體芯片飛行時(shí)間質(zhì)譜主要由兩部分組成：磁珠部分即液體芯片部分；飛行時(shí)間質(zhì)譜儀部分，用于獲取磁珠捕獲的蛋白質(zhì)質(zhì)量和含量，根據(jù)不同質(zhì)荷比的蛋白質(zhì)在長(zhǎng)度一定的真空管中飛行所需時(shí)間不同，被測(cè)定的蛋白質(zhì)以一系列波鋒的形式出現(xiàn)，并由此繪制出待測(cè)蛋白的質(zhì)譜圖，可發(fā)現(xiàn)各樣本間的蛋白質(zhì)表達(dá)和含量的異同。

液體芯片一飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)利用磁珠俘獲腫瘤患者與健康對(duì)照體液中低豐度特異蛋白或多肽，經(jīng)飛行時(shí)間質(zhì)譜測(cè)定和軟件分析，建立由兩者差異表達(dá)蛋白或多肽組成的質(zhì)譜圖模型，用于預(yù)測(cè)未知樣品的歸屬。液體芯片飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)主要用于從復(fù)雜體液如血清、血漿、尿液、唾液或腦脊液、組織裂解液、細(xì)胞培養(yǎng)上清液中發(fā)現(xiàn)潛在的生物標(biāo)志物。一方面，該技術(shù)能夠在生物液體中檢測(cè)指示特異疾病的生物標(biāo)志物模式或生物標(biāo)志物譜，另一方面，該技術(shù)還可以鑒定單個(gè)的生物標(biāo)志物候選物。在哈佛大學(xué)女子醫(yī)院、紐約斯隆-凱特琳癌癥研究所、麻省總醫(yī)院、貝勒醫(yī)學(xué)院等世界一流醫(yī)院和醫(yī)學(xué)研究所中，該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、腦膠質(zhì)瘤、頭頸鱗癌、膀胱癌等的早期診斷研究中。應(yīng)用該技術(shù)可協(xié)助診斷多種遺傳性代謝紊亂疾病，如各種氨基酸代謝失常血癥，包括胱氨酸尿癥、瓜氨酸血癥、酪氨酸血癥、超苯丙氨酸血癥、精氨酸缺乏癥、精氨琥珀酸尿癥和各種超甲硫氨酸血癥；短鏈核長(zhǎng)鏈?；o酶A脫氫酶缺乏癥、異戊酸血癥、丙酸血癥、甲基丙二酸血癥、戊二酸血癥和其他各種有機(jī)酸代謝失常疾病等。由于液體芯片飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)具有準(zhǔn)確度高、快速、高通量、靈敏度高、重復(fù)性好、分辨率高、檢測(cè)費(fèi)用低等特點(diǎn)，是極具潛力的臨床腫瘤早期診斷工具。

三．分子生物芯片技術(shù)在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用

隨著人類基因組計(jì)劃(HGP)的完成，蛋白質(zhì)組計(jì)劃也已經(jīng)啟動(dòng)，基因序列數(shù)據(jù)、蛋白序列和功能數(shù)據(jù)以驚人的速度增長(zhǎng)，而傳統(tǒng)的生物技術(shù)已經(jīng)不能滿足數(shù)據(jù)倍增的要求，生命科學(xué)需要更快捷、更準(zhǔn)確的自動(dòng)化的生物技術(shù)，而生物芯片在這種情況下應(yīng)運(yùn)而生。生物芯片(biochip)的概念雖源于計(jì)算機(jī)芯片但不同于計(jì)算機(jī)芯片。狹義的生物芯片即微陣列芯片，主要包括cDNA微陣列、寡核昔酸微陣列、蛋白質(zhì)微陣列和小分子化合物微陣列。分析的基本單位是在一定尺寸的基片(如硅片、玻璃、塑料等)表面以點(diǎn)陣方式固定的一系列可尋找的識(shí)別分子，點(diǎn)陣中每一個(gè)點(diǎn)都可視為一個(gè)傳感器的探頭。芯片表面固定的分子在一定的條件下與被檢測(cè)物進(jìn)行反應(yīng)，其結(jié)果利用化學(xué)熒光法、酶標(biāo)法、同位素法或電化學(xué)法顯示，再用掃描儀等儀器記錄，最后通過專門的計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行分析。而廣義的生物芯片是指能對(duì)生物成分或生物分子進(jìn)行快速并行處理和分析的厘米見方的固體薄型器件。生物芯片技術(shù)是融微電子學(xué)、生物學(xué)、物理學(xué)、化學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)為一體的高度交叉的新技術(shù)，具有重大的基礎(chǔ)研究?jī)r(jià)值，又具有明顯的產(chǎn)業(yè)化前景。經(jīng)過十多年發(fā)展，生物芯片技術(shù)已日臻完善，其應(yīng)用前景非常廣闊，因其具有技術(shù)操作簡(jiǎn)易、自動(dòng)化程度高、檢測(cè)目的分子數(shù)量多、高通量等特點(diǎn)，為“基因組計(jì)劃”時(shí)期基因功能的研究及科學(xué)及醫(yī)學(xué)診斷學(xué)的發(fā)展提供了強(qiáng)有力的工具。在臨床檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)方面，生物芯片技術(shù)已經(jīng)被應(yīng)用于病毒、細(xì)茵的檢測(cè)自身兔疫性疾病的兔疫標(biāo)志物的檢測(cè)。遺傳性疾病的檢測(cè)及腫瘤免疫標(biāo)志物的單一檢測(cè)及其聯(lián)檢等方面。甘志遠(yuǎn)等[3]通過呼吸道斑點(diǎn)試驗(yàn)芯片法檢測(cè)呼吸道病毒抗體具有簡(jiǎn)便快速、靈敏度和特異度高等優(yōu)點(diǎn)，是臨床呼吸道病毒感染輔助診斷的有效方法。值得推廣使用生物芯片具有操作簡(jiǎn)單、信息量大、節(jié)約試劑、減少誤差、診斷快速的特點(diǎn)。在臨床診斷、科學(xué)研究和流行病學(xué)篩選中具有廣泛的應(yīng)用前景，它的的誕生也為人們提供了一種高通量、高效率的腫瘤學(xué)研究手段[4-6]。五．分子生物納米技術(shù)在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用

1.納米科學(xué)技術(shù)是20世紀(jì)末期剛剛誕生并正在崛起的新科技。通過直接操縱和安排原子、分子創(chuàng)制新物質(zhì)，納米技術(shù)與醫(yī)學(xué)相結(jié)合，促進(jìn)了基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究技術(shù)的完善、臨床診斷技術(shù)的革新及治療水平的提高[7]。通過應(yīng)用納米技術(shù)，在DNA檢測(cè)時(shí)，檢測(cè)方法更加簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確。美國(guó)NASA Ames Center for Nanote Chnology與中南大學(xué)衛(wèi)生部納米生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室合作，將碳納米管用于基因芯片，樣本需要量低于1000個(gè)NDA分子（傳統(tǒng)DNA檢測(cè)的樣本需要量超過106個(gè)DNA分子）；需要的樣品量更少，可免去傳統(tǒng)的PcR擴(kuò)增步驟；結(jié)果可靠、重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)單、易實(shí)現(xiàn)檢測(cè)自動(dòng)化[8]。免疫分析加上磁性修飾已成功地用于各種生物活性物質(zhì)和異生質(zhì)，如藥物、致癌物等的檢測(cè)。將特異性抗體或抗原固定到納米磁球表面，并以酶、放射性同位素?zé)晒馊玖匣蚧瘜W(xué)發(fā)光物質(zhì)為基礎(chǔ)所產(chǎn)生的檢測(cè)與傳統(tǒng)微量滴定板技術(shù)相比具有簡(jiǎn)單、快速和靈敏的特點(diǎn)?；裘揽〉萚9]利用抗體偶聯(lián)的靶向磁性納米顆粒，同時(shí)具有可在病毒感染的細(xì)胞周圍特異性富集和磁顆粒可在交變磁場(chǎng)下感應(yīng)升溫的雙重功能，將其作為磁感應(yīng)熱療的靶向介質(zhì)，有望研制出病毒感染性疾病磁感應(yīng)熱療的靶向介質(zhì)。為尋求一條快速診斷EV71病毒感染的新方法，納米細(xì)胞分離技術(shù)的出現(xiàn)有助于解決生物醫(yī)學(xué)中快速獲取細(xì)胞標(biāo)本的難題。應(yīng)用納米免疫磁珠檢測(cè)早期肺癌患者循環(huán)血液中的腫瘤細(xì)胞，可監(jiān)測(cè)肺癌的轉(zhuǎn)移情況。2.六．分子生物學(xué)技術(shù)在臨床檢測(cè)應(yīng)用中的問題

疾病的發(fā)生是由于人體受內(nèi)外因素的影響，導(dǎo)致機(jī)體細(xì)胞、組織或器官功能紊亂，歸根到底是核酸、蛋白等分子水平表達(dá)異常，由此可見，利用分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行臨床檢測(cè)是協(xié)助臨床診斷和治療的必不可少的工具。但由于分子生物學(xué)技術(shù)不僅對(duì)臨床樣品的處理有較高要求，而且對(duì)檢測(cè)人員的技術(shù)水平也有要求，這就涉及到從標(biāo)本收集、處理、檢測(cè)和分析等多個(gè)環(huán)節(jié)的系統(tǒng)化和規(guī)范化，為此，我國(guó)已制定了臨床實(shí)驗(yàn)室定量測(cè)定室內(nèi)質(zhì)量控制指南。

利用分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行臨床監(jiān)測(cè)，在某些情況下可能存在一定困難，例如與核酸相比，蛋白和多肽作為生物標(biāo)志的一個(gè)優(yōu)勢(shì)是它們能夠很容易的在血液、尿液和其他生物體液中找到。這些類型的樣品很容易獲得，并代表了含有豐富的具有潛在信息的生物學(xué)信息分子。但從研究手段方面來說，蛋白質(zhì)研究技術(shù)比核酸技術(shù)相對(duì)要復(fù)雜和困難，不僅氨基酸殘基數(shù)量多于核甘酸殘基，而且在蛋白質(zhì)組研究中沒有一種方法象PCR那樣能迅速擴(kuò)增目的片段，這樣對(duì)于豐度低但功能重要的蛋白質(zhì)很難進(jìn)行大規(guī)模的研究。miRNA雖然是新興的研究領(lǐng)域，但它們與疾病的相關(guān)性日益受到人們的重視，相信隨著基礎(chǔ)研究對(duì)miRNA不斷深入的認(rèn)識(shí)，miRNA必將成為臨床檢測(cè)中的手段之一。七．參考文獻(xiàn)

[1] 王海英.分子生物學(xué)技術(shù)在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用發(fā)展［J］.當(dāng)代醫(yī)學(xué)2011,17（6）16.[2] 解福生，李歡.蛋白組學(xué)在心血管方面的研究進(jìn)展.醫(yī)學(xué)信息(中旬刊), 2011,8,3812-3813.[3] 甘志遠(yuǎn)，顏云盈，朱心智.生物芯片在嬰幼兒呼吸道病原體感染診斷中的應(yīng)用[J].內(nèi)科,2011,6(3):215-216.[4] 王新允，袁玲，鄭海燕等.肺癌中FHIT蛋白表達(dá)細(xì)胞芯片的研究[J].中國(guó)肺癌雜志,2009,12(2):131-134.[5] 朱抿，于軍，周文利等.生物芯片技術(shù)在肺癌研究中的應(yīng)用價(jià)值[J].中國(guó)肺癌雜志,2011,14,5:441-445.[6] 張戰(zhàn)，朱波，林治華.生物芯片技術(shù)在腫瘤研究中的應(yīng)用[J].重慶醫(yī)學(xué),2011,5(4):493-495..[7] 曲秋蓮，張英鴿.納米技術(shù)和材料在醫(yī)學(xué)上應(yīng)用的現(xiàn)狀與展望[J].東南大學(xué)學(xué)報(bào),醫(yī)學(xué)版,2011,30(1):157-163.[8] 張陽德，納米技術(shù)與外科.中華實(shí)驗(yàn)外科雜志[J].2004,21(10):1159.[9] 霍美俊，張長(zhǎng)清，閏妍等.抗EV71多克隆抗體偶聯(lián)的靶向磁性納米顆粒對(duì)病毒的特異性富集[J].科技導(dǎo)報(bào),2010,28(16):25-30.

第二篇：分子生物學(xué)技術(shù)在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用進(jìn)展

分子生物學(xué)技術(shù)在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用進(jìn)展

[摘要] 分子生物學(xué)技術(shù)是醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)的重要診療手段。本文概述醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中常用的分子生物學(xué)技術(shù)，列舉其在臨床病原微生物檢驗(yàn)、腫瘤診斷及評(píng)估、遺傳病診斷、免疫系統(tǒng)疾病診斷中的具體應(yīng)用，分析分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用中應(yīng)注意的問題，并對(duì)發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行預(yù)測(cè)。

[關(guān)鍵詞] 分子生物學(xué)技術(shù)；醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)；應(yīng)用；

進(jìn)展分子生物學(xué)是以核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子為研究對(duì)象的學(xué)科，分子生物學(xué)技術(shù)即建立在核酸生化基礎(chǔ)上的一類研究手段，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中。研究?jī)?nèi)容也從DNA鑒定、擴(kuò)展到核酸及表達(dá)產(chǎn)物分析，技術(shù)不斷進(jìn)步為原微生物檢驗(yàn)、腫瘤診斷及評(píng)估、遺傳病診斷、免疫系統(tǒng)疾病診斷提供重要依據(jù)和創(chuàng)新思路?，F(xiàn)就分子生物學(xué)技術(shù)在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行綜述，試分析應(yīng)注意的問題及預(yù)測(cè)發(fā)展趨勢(shì)。

醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中常用的分子生物學(xué)技術(shù)概述

分子生物學(xué)技術(shù)的核心是聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，能在最短的時(shí)間內(nèi)擴(kuò)增。由此衍生出新PCR技術(shù)，如原位PCR技術(shù)、實(shí)時(shí)定量PCR、鏈置換擴(kuò)增技術(shù)、LCR、NASBA、TAS等。此外，生物芯片技術(shù)、核酸探針技術(shù)、生物傳感器、SELEX技術(shù)、循環(huán)核酸分析技術(shù)都極大的完善了檢驗(yàn)技術(shù)，直接解釋生命規(guī)律，在臨床診斷和治療中意義重大。

分子生物學(xué)技術(shù)在臨床中的具體應(yīng)用

2.1 病原微生物檢驗(yàn) PCR和生物芯片技術(shù)用于病原微生物檢驗(yàn)術(shù)與傳統(tǒng)的培養(yǎng)鑒定、免疫測(cè)定相比，其具有高的敏感性，較短的耗時(shí)和更廣的適用范圍[1]。PCR通過向反應(yīng)管中加入特異性引物可同時(shí)鑒定出單種或多種病原體，即便存在大量死菌也能得到準(zhǔn)確結(jié)果，不受混合標(biāo)本和微生物生長(zhǎng)時(shí)間的限制。生物芯片技術(shù)則以其更高的靈敏性和高效率，同時(shí)檢測(cè)出上百種病原微生物，可用于快速查找樣本的耐藥基因指導(dǎo)臨床用藥。

2.2 腫瘤及遺傳病診斷 研究證實(shí)腫瘤及遺傳病幾乎都存在著一定的基因缺陷，只要找到人體中與基因相互作用的結(jié)合點(diǎn)，從基因水平診斷就能準(zhǔn)確診斷。通過基因芯片判定靶基因P53抑癌基因的突變，通過分子蛋白質(zhì)組學(xué)、生物傳感器和流式細(xì)胞術(shù)診斷腫瘤特異性標(biāo)志物。在遺傳病中，分子生物技術(shù)能識(shí)別患病家族基因存在的特定多態(tài)性，常用技術(shù)有DNA限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析，單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析，熒光原位雜交染色體分析，酶基因調(diào)控和微陣列技術(shù)。

2.3 免疫系統(tǒng)疾病診斷 免疫系統(tǒng)疾病診斷關(guān)鍵是確定基因水平上的調(diào)控表達(dá)。如在人類免疫缺陷病毒的研究中，分子生物納米技術(shù)即以抗體為基礎(chǔ)，用免疫分析和磁性修飾的方法來檢測(cè)免疫物質(zhì)，通過酶、熒光劑、同位素把特異的抗體抗原與納米磁性微球固定，既能自動(dòng)檢測(cè)人免疫缺陷病毒1型和2型抗體，為人類防治病毒性疾病提供了有力的武器。

分子生物學(xué)技術(shù)在檢驗(yàn)應(yīng)用的新進(jìn)展

現(xiàn)階段分子生物學(xué)新技術(shù)的發(fā)展方興未艾，給人們提供了探索人類生命科學(xué)的工具，推動(dòng)了檢驗(yàn)學(xué)發(fā)展。分子生物技術(shù)最顯著的醫(yī)學(xué)成就是對(duì)遺產(chǎn)病中的致病基因的準(zhǔn)確定位及克隆，早在1998年就完成了遺傳性耳聾的基因克?。?003年SARS肆虐時(shí)，科學(xué)家就研制出專門診斷該病的基因芯片；2004年后實(shí)現(xiàn)了用多重PCR技術(shù)對(duì)我國(guó)新生兒多發(fā)的地中海貧血、苯丙酮尿癥、G6DP缺乏癥的產(chǎn)前和病例診斷；近年來，遺傳標(biāo)記技術(shù)的進(jìn)步，結(jié)合現(xiàn)有分子學(xué)研究技術(shù)，加速了遺傳基因圖譜的制作和相關(guān)疾病的基因檢測(cè)和鑒定，從而為醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)的加速發(fā)展提供了有效的載體。

存在問題及發(fā)展趨勢(shì)

現(xiàn)階段面臨的問題主要是技術(shù)相對(duì)復(fù)雜和儀器要求太高、藥品和反應(yīng)盒昂貴等[2]，限制了臨床推廣。首先，合理選用檢驗(yàn)項(xiàng)目的問題，分子生物學(xué)方法具有高特異性和高靈敏性，但臨床中仍要根據(jù)實(shí)際需要選用經(jīng)濟(jì)合理的檢驗(yàn)項(xiàng)目，如結(jié)核菌培養(yǎng)和涂片鏡檢就能達(dá)到目的，不必舍廉選貴，增加患者負(fù)擔(dān)。其次，疾病診斷過度依賴檢驗(yàn)結(jié)果問題，應(yīng)將臨床資料綜合考慮，不能僅靠分子生物學(xué)技術(shù)檢驗(yàn)結(jié)果就妄下診斷，忽略標(biāo)本取樣和檢驗(yàn)過程中的操作不當(dāng)及病程發(fā)展規(guī)律造成的假陽性或是假陰性，貽誤病情。再者，上級(jí)部門管理不足問題，國(guó)家相關(guān)部門要擔(dān)任監(jiān)管的職責(zé)，參考國(guó)際慣例，制定符合我國(guó)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)現(xiàn)狀的實(shí)驗(yàn)操作管理規(guī)章制度，嚴(yán)格培訓(xùn)檢驗(yàn)人員，規(guī)范試劑的準(zhǔn)入和儀器的管理，最大程度保證檢驗(yàn)結(jié)果的可信度。

雖然分子生物技術(shù)在臨床推廣應(yīng)用中存在著許多尚待解決的問題，但是它仍然顯現(xiàn)出了快速發(fā)展的趨勢(shì)。未來其發(fā)展會(huì)傾向于：①現(xiàn)有、僅停留在實(shí)驗(yàn)室的分子生物學(xué)技術(shù)逐步向臨床實(shí)用型改進(jìn)，降低實(shí)驗(yàn)投入、簡(jiǎn)化操作步驟，推進(jìn)實(shí)驗(yàn)過程全自動(dòng)化的實(shí)施降低人為因素對(duì)結(jié)果的影響，根據(jù)臨床實(shí)際修正技術(shù)，提高檢驗(yàn)的特異性和敏感性。②積極推進(jìn)實(shí)驗(yàn)室建設(shè)，加大儀器和檢驗(yàn)人員的培訓(xùn)投入，為分子生物學(xué)的臨床應(yīng)用提供必要的基礎(chǔ)保障，以先進(jìn)的、可持續(xù)性的實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)手段為臨床提供可靠的依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

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王耿新 劉德亮 王志群 陳獻(xiàn)業(yè)

山東省青島市腫瘤醫(yī)院 青島 266042

聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction, PCR）又稱體外基因擴(kuò)增技術(shù)或 DNA 擴(kuò)增技術(shù)。自 1985 年美國(guó) PE-Cetus 公司的 K.B Mullis 等人首創(chuàng)了 PCR 技術(shù)之后，它以相當(dāng)驚人的速度被廣泛地應(yīng)用于醫(yī)學(xué)及分子生物學(xué)等各個(gè)領(lǐng)域?，F(xiàn)今，PCR 技術(shù)已成為一種對(duì)標(biāo)本中特定的 DNA 片段進(jìn)行分析研究和檢測(cè)鑒定的重要方法。近20 年來 PCR 技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)等各個(gè)研究領(lǐng)域和臨床應(yīng)用中發(fā)揮了重大的作用，在病原體鑒定、遺傳病診斷、免疫學(xué)研究、癌基因探索及治療等方面都作出了相應(yīng)的貢獻(xiàn)。

1.PCR 技術(shù)的基本原理與特點(diǎn) [1-2]

PCR 技術(shù)的基本原理是模仿 DNA 體內(nèi)復(fù)制的機(jī)制，在體外進(jìn)行擴(kuò)增特異的 DNA 片段。它主要是由三個(gè)基本步驟組成的循環(huán)反應(yīng)。首先是變性，用加熱的方法使雙鏈 DNA 解鏈成兩股單鏈；其次是復(fù)性，用降溫的辦法使這兩股單鏈按堿基互補(bǔ)的原則分別與加入的兩條人工合成的寡聚核苷酸鏈（引物）結(jié)合成雙鏈；最后是延伸，在合適的緩沖液、鎂離子及脫氧核苷酸存在的條件下，用 DNA 聚合酶進(jìn)行催化，按堿基配對(duì)的原則合成互補(bǔ)鏈。引物從 3 '端進(jìn)行延伸，合成的方向?yàn)?5 '端（一條人工合成的引物）至 3 '端，從而合成與模板 DNA 結(jié)構(gòu)相同的片段。重復(fù)上述三步驟，變性→復(fù)性→引物延伸的過程，經(jīng)過約 30 個(gè)周期的循環(huán)（每三個(gè)步驟為一周期，約需 2-3 分鐘），1-2 小時(shí)就能將所需基因擴(kuò)增幾百萬倍，使極微量的所需 DNA 達(dá)到極易檢測(cè)的水平。其擴(kuò)增效率公式為： Y=（1+X）n，式中 Y 為擴(kuò)增數(shù)目，X 為放大效率，n 為循環(huán)次數(shù)。

PCR 技術(shù)具有敏感性高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便、快速省時(shí)等特點(diǎn)。其靈敏度可達(dá)到 Pg 級(jí)，甚至達(dá)到 fg 級(jí) [3] 水平，而被擴(kuò)增的基因片段能與原基因片段保持不變。PCR 技術(shù)操作簡(jiǎn)便、快速而易掌握，并且對(duì)標(biāo)本要求不高。用過去的方法完成一項(xiàng)試驗(yàn)少則幾周，多則幾個(gè)月。應(yīng)用全自動(dòng) DNA 擴(kuò)增儀，整個(gè) PCR 過程均由電腦控制，只需數(shù)小時(shí)即可完成整個(gè)試驗(yàn)過程，用極微量的粗制標(biāo)本就可獲取目的產(chǎn)物。

2.常用的幾種 PCR 及主要用途 [4-5]

2.1 定量 PCR ：用于 mRNA 定量及轉(zhuǎn)錄水平的研究。

2.2 抗原捕獲 PCR（AC-PCR）：用于病毒感染的檢測(cè)。

2.3 不對(duì)稱 PCR（Asymmetric PCR）：用于制備探針或測(cè)序。

2.4 彩色 PCR（CCA-PCR）“用于檢測(cè)某些多型別病毒的混合感染。

2.5 原位逆轉(zhuǎn)錄 PCR（In Situ RT-PCR）：定位檢測(cè)細(xì)胞中 RNA 病毒感染。

2.6 逆轉(zhuǎn)錄 PCR（RT-PCR）：用于克隆 cDNA、檢測(cè) RNA 病毒、cDNA 探針。

2.7 反向 PCR（inverted PCR）：用于擴(kuò)增已知基因片段兩側(cè)的未知序列。

2.8 膜 PCR（membrane-bound PCR）：可去除污染的雜質(zhì)或 PCR 產(chǎn)物殘留，檢測(cè)低豐度靶 DNA。

2.9 間接原位 PCR（Indirect In Situ PCR）：定位檢測(cè)細(xì)胞中 DNA 病毒感染，是目前應(yīng)用較廣泛的一種原位 PCR 技術(shù)，其特異性比直接 PCR 強(qiáng)。

3.PCR 技術(shù)在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的地位

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證明，人類疾病多數(shù)是直接或間接與基因有關(guān) [6]，如腫瘤、糖尿病和心血管疾病等。在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)診斷中我們經(jīng)歷了生化和免疫診斷的發(fā)展過程，由于各類擴(kuò)增技術(shù)的出現(xiàn)使我們進(jìn)入了基因診斷的新時(shí)代并成就了現(xiàn)代意義基因診斷的崛起。這將改變以往對(duì)疾病的表型認(rèn)識(shí)和表型診斷，從本質(zhì)上認(rèn)識(shí)疾病和診斷疾病。在各類擴(kuò)增技術(shù)中，PCR 的地位尤為突出。目前，全世界利用 PCR 技術(shù)診斷感染性疾病每年達(dá)幾千萬人次，其費(fèi)用早已大幅下降，說明 PCR 有著巨大的潛在市場(chǎng)。美國(guó)臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)于 1995 年頒布了關(guān)于感染性疾病分子診斷應(yīng)用范圍、條件和質(zhì)量控制細(xì)則等準(zhǔn)則文件 [7]。而國(guó)際臨床化學(xué)學(xué)會(huì)于 1998 年又發(fā)布了關(guān)于分子擴(kuò)增在臨床診斷中應(yīng)用的質(zhì)量評(píng)估基礎(chǔ)的文件并對(duì) PCR 操作的各個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行了詳細(xì)論述 [8]。由此可見，兩個(gè)權(quán)威性文件也都肯定了 PCR 技術(shù)在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)方面的重要性?；蛟\斷可能將是以后的發(fā)展方向并作為疾病的常規(guī)診斷技術(shù)。

4.PCR 技術(shù)在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用

4.1 PCR 技術(shù)在腫瘤方面的應(yīng)用

目前，腫瘤發(fā)病的分子機(jī)制尚不完全清楚。研究表明，人類許多常見的腫瘤疾病與某些病毒病因及腫瘤相關(guān)基因的遺傳學(xué)改變有著密切的關(guān)系。PCR 技術(shù)的腫瘤病毒病因、腫瘤相關(guān)基因、腫瘤相關(guān)抑癌基因等研究方面已取得可喜成果。

據(jù)有關(guān)資料表明 [1，4] 前列腺癌、結(jié)腸癌和 Kaposi 肉瘤等與人巨細(xì)胞病毒（CMV）有關(guān)；鼻咽癌和 Burkitt 淋巴瘤與 EB 病毒有關(guān)；原發(fā)性肝癌與乙型肝炎病毒（HBV）有關(guān)；泌尿道腫瘤和食道腫瘤等與人乳頭瘤病毒（HPV）有關(guān)。人類腫瘤病毒病因中較為重要的一類病毒是 HPV，其中大部分只與良性增生有關(guān)，只有 16、18、31、35、39 等十余型與惡性腫瘤關(guān)系密切。PCR 在檢測(cè) HPV，尤其是第 16、18 型有無感染，對(duì)子宮頸癌的早期診斷及預(yù)防有著顯著的意義。

目前，已知腫瘤相關(guān)基因有上百多種，但較常見的是 ras 家族的 H-ras、K-ras 和 N-ras 三種癌基因。它們的結(jié)構(gòu)相似，其表達(dá)產(chǎn)物是 P21 蛋白。在不同腫瘤中 ras 家族癌基因的 H-ras、K-ras 點(diǎn)突變多集中在第 12 和 61 號(hào)密碼子上，而 N-ras 在第 13 號(hào)密碼子上多發(fā)生突變。PCR 在癌基因的研究方面主要是 ras 基因與腫瘤的關(guān)系?，F(xiàn)已查明與 ras 基因突變有關(guān) [1，2，4，9，10] 的腫瘤有幾十種。如：各種急性慢性白血病、精原細(xì)胞癌、惡性黑色素瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、卵巢癌、胰腺病、肺癌、膀胱癌、結(jié)腸癌、子宮瘤等。Rb 基因 [11] 是人類最早（1986 年）發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，其后又相繼發(fā)現(xiàn)了 P53、WT1、NF1、DCC、MCC、APC、P16 和 P21 等抑癌基因。在遺傳性視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤研究中發(fā)現(xiàn)位于 13 號(hào)染色體上 Rb 基因的缺失與癌變有關(guān)。在許多常見腫瘤，如骨肉瘤、肺癌、膀胱癌、乳腺癌等惡性腫瘤中，常發(fā)現(xiàn)該基因失活 [11]。在對(duì) P53 基因的研究中 [12-14] 發(fā)現(xiàn)該基因的突變和缺失是許多腫瘤發(fā)生的原因，這些腫瘤主要有子宮頸癌、肝癌、成骨肉瘤等。遺傳學(xué)改變主要是引起癌基因激活和抑癌基因的失活，使基因發(fā)生突變、缺失、增加和易位等而導(dǎo)致了細(xì)胞癌變。PCR 不但能有效地檢測(cè)基因的突變、重排、易位等，而且能準(zhǔn)確檢測(cè)癌基因表達(dá)量，可據(jù)此進(jìn)行腫瘤早期診斷、鑒別、分型、分期、治療及預(yù)后評(píng)估等。

近年，剛興起的熒光定量逆轉(zhuǎn)錄（RT）-PCR [10] 在腫瘤診斷、治療和微轉(zhuǎn)移以及微小殘留病灶檢測(cè)等方面具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。研究表明，癌細(xì)胞或癌前期細(xì)胞在進(jìn)入血液循環(huán)以后，通過定量 RT-PCR 檢測(cè)外周血腫瘤特異性標(biāo)志物 mRNA，可進(jìn)行實(shí)體腫瘤的篩查，檢測(cè)腫瘤術(shù)后及淋巴轉(zhuǎn)移陰性的病人外周血腫瘤細(xì)胞的數(shù)量，以便估計(jì)腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，制訂合理的治療方案。另外，定量 RT-PCR 還可用于腫瘤耐藥基因（MDR1）[10] 表達(dá)水平檢測(cè)，為臨床篩選化療藥物及治療方法提供依據(jù)。

4.2 PCR 技術(shù)在遺傳病方面的應(yīng)用

PCR 技術(shù)首次臨床應(yīng)用 [10] 就是從檢測(cè)鐮狀細(xì)胞和 β-地中海貧血的基因突變開始的。十幾年來，該技術(shù)在遺傳病診斷的臨床應(yīng)用方面獲得了極大的成功。它能用于檢測(cè)已知基因序列的任何遺傳病基因的突變，如倒位、缺失 / 插入、動(dòng)態(tài)突變、部分高發(fā)的點(diǎn)突變及表達(dá)量的異常等都可通過基因分析直接檢測(cè)用于臨床進(jìn)行診斷，像地中海貧血、血友病、杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥、脆 X 綜合征、苯丙酮尿癥等這些遺傳性疾病。PCR 在遺傳病診斷及遺傳病預(yù)防與產(chǎn)前基因診斷方面具有明顯的應(yīng)用價(jià)值，PCR 產(chǎn)物直接測(cè)序已成為檢測(cè)遺傳病基因突變的常用方法。另外，PCR 在鑒定編碼抗生素耐藥性基因 [10]，尤其是在細(xì)菌不攜帶同源性序列且取單個(gè)菌落進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增時(shí)，具有較高的特異性和敏感性。

4.3 PCR 技術(shù)在感染性疾病方面的應(yīng)用 目前 PCR 在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中對(duì)感染性疾病的診斷 [10，15] 極具突出，只要核酸序列是清楚的，就可以檢測(cè)到任何有限的病原體。一般實(shí)驗(yàn)室可檢出 10-100 個(gè)基因拷貝，而目前，病原體抗原檢測(cè)方法一般需要 10 5 ～ 10 7 個(gè)病原體才能檢測(cè)到。PCR 技術(shù)的運(yùn)用解決了免疫學(xué)檢測(cè)的“窗口期”問題，可判斷疾病是否處于隱性或亞臨床狀態(tài)。再者，抗體檢測(cè)不能判定是現(xiàn)癥感染還是既往感染時(shí)，也需要用 PCR 方法來確定。另外，病原體感染后的發(fā)病時(shí)間和病情輕重均與病原體數(shù)量有關(guān)。如艾滋?。ˋIDS）由人免疫缺陷病毒（HIV）感染后，可根據(jù) HIV 檢測(cè)的含量預(yù)知發(fā)病的時(shí)間。因?yàn)?AIDS 潛伏期的長(zhǎng)短和臨床癥狀的輕重與血液中的病毒量呈顯著相關(guān)。在其它病毒性疾病中也多半存在類似情況，這均需 PCR 來定量說明。

PCR 在 HBV 定量研究中表明，HBV 載量與肝炎的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后以及與藥物療效有關(guān)，并證明定量 PCR 是鑒別 HBV 感染各期的良好工具。該技術(shù)能有效地確定血清 HBeAg 轉(zhuǎn)陰和非活動(dòng)性攜帶者病人的 HBV DNA 水平，而常規(guī)雜交法則對(duì)這些低病毒血癥的 HBV DNA 探測(cè)不到。在抗病毒治療中，通過定量 PCR 檢測(cè) HBV 的載量，來觀察拉咪呋啶及多種聯(lián)合用藥治療慢性乙型肝炎的療效具有指導(dǎo)意義。

PCR 對(duì)某些傳染性疾病疫苗接種后感染的鑒別也是極為重要的。例如：腮腺炎病毒疫苗接種后感染的病例時(shí)有發(fā)生，是疫苗引起的還是野生型腮腺炎病毒引起的，這就需要一種行之有效的方法來進(jìn)行鑒別，以往的血清學(xué)、病毒培養(yǎng)及探針雜交等方法都很難做到。

過去，對(duì)結(jié)核病等其他分支桿菌病的診斷方法雖然很多，但均不夠理想。簡(jiǎn)便易行的方法經(jīng)常查不到抗酸桿菌，也無法鑒別結(jié)核桿菌與其他分支桿菌。用分支桿菌培養(yǎng)的方法且陽性率較低又耗時(shí)，而麻風(fēng)桿菌在體外又不能培養(yǎng)，主要靠感染組織的涂片或切片鏡檢。其他方法，如血清學(xué)、氣相色譜等方法的敏感性及特異性都不夠理想，PCR 技術(shù)的運(yùn)用使上述問題得到了解決。還有 PCR 技術(shù)在技術(shù)性病監(jiān)控和性病病原體的檢測(cè)方面也正在擴(kuò)大，并列為監(jiān)控手段和作為檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)。

5.PCR 技術(shù)在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)應(yīng)用中的問題 5.1 假陽性

通常 PCR 在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)應(yīng)用中所面臨的問題之一是擴(kuò)增產(chǎn)物污染帶來的假陽性，而實(shí)驗(yàn)室污染又是假陽性的主要因素。只要實(shí)驗(yàn)室被擴(kuò)增產(chǎn)物污染，擴(kuò)增片段隨時(shí)都可能污染新的樣本并又被同一 PCR 反應(yīng)體系擴(kuò)增出來而產(chǎn)生假陽性。解決的根本措施就是在封閉狀態(tài)下進(jìn)行擴(kuò)增和產(chǎn)物分析。近年發(fā)展了一種熒光定量 PCR 技術(shù)，從根本上解決了 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物污染和不能定量的問題。該技術(shù)把基因擴(kuò)增 PCR、分子雜交和光化學(xué)融為一體，實(shí)現(xiàn)了對(duì) PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行全過程的封閉，并進(jìn)行實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)檢測(cè)和自動(dòng)分析結(jié)果，進(jìn)一步提高了其特異性。由于造成假陽性的因素相對(duì)單一，因此假陽性并不是困惑檢驗(yàn)工作的主要原因。

5.2 假陰性

PCR 假陰性的原因相對(duì)較為復(fù)雜，主要包括有儀器設(shè)備的質(zhì)量、試劑開殼劑和操作問題、PCR 產(chǎn)物的電泳檢測(cè)時(shí)間及有關(guān) PCR 反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)等。PCR 儀本身的質(zhì)量問題能使擴(kuò)增效率下降或造成非特異性擴(kuò)增而出現(xiàn)假陰性或假陽性。離心機(jī)的質(zhì)量問題或使用不正確，可造成離心標(biāo)本模板不能分離而產(chǎn)生假陰性。試劑開殼劑和操作問題造成標(biāo)本 DNA 沒有暴露出來，致使擴(kuò)增無法進(jìn)行而導(dǎo)致假陰性。PCR 產(chǎn)物的電泳檢測(cè)時(shí)間一般為 48h 以內(nèi)，大于 48h 后帶型不規(guī)則甚致消失不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶而程現(xiàn)假陰性。PCR 反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有模板核酸的制備、引物的質(zhì)量與特異性、酶的質(zhì)量及 PCR 循環(huán)條件等，在這些環(huán)節(jié)中操作不當(dāng)都可引起假陰性。另外，Mg 2+ 濃度和物理因素變性等對(duì) PCR 擴(kuò)增效率影響也很大。Mg 2+ 濃度過高可降低 PCR 擴(kuò)增的特異性，濃度過低則影響 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)量。而變性溫度低，變性時(shí)間短，極有可能出現(xiàn)假陰性；退火溫度過低，可致非特異性擴(kuò)增而降低異性擴(kuò)增效率；退火溫度過高，影響引物與模板的結(jié)合而降低 PCR 擴(kuò)增效率，最終都可導(dǎo)致 PCR 擴(kuò)增失敗。還有靶序列變異使引物與模板失去互補(bǔ)序列，其 PCR 擴(kuò)增也不會(huì)成功。

6.PCR 技術(shù)的應(yīng)用前景 自從 PCR 技術(shù)誕生以來，隨著其深入不斷的發(fā)展與完善，許多與其相關(guān)的新類型及改良的新方法在不斷的涌現(xiàn)，這些派生出的新類型和新方法解決了以往傳統(tǒng) PCR 的瓶頸問題。雖然，PCR 可對(duì)基因分析直接檢測(cè)用于臨床進(jìn)行診斷，但大部分基因突變還是難以直接檢測(cè)。近年來，分子診斷技術(shù)最大突破就是集擴(kuò)增、檢測(cè)和靶定量于一體的實(shí)時(shí)熒光 PCR 技術(shù)的問世。該技術(shù)的出現(xiàn)，對(duì)基因檢測(cè)和基因分型的應(yīng)用范圍將進(jìn)一步擴(kuò)大，為 PCR 的臨床應(yīng)用帶來曙光。因此，PCR 技術(shù)將有極大的發(fā)展空間和廣泛的應(yīng)用前景，它將對(duì)腫瘤學(xué)、遺傳學(xué)、免疫學(xué)、微生物學(xué)、寄生蟲學(xué)和基因治療等進(jìn)一步研究及臨床應(yīng)用起著積極重要的作用。在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中，PCR 的應(yīng)用將更加廣泛和深入。相信在不久的將來，隨著 PCR 技術(shù)的更進(jìn)一步完善，它將作為常規(guī)檢驗(yàn)方法進(jìn)行全面普及，發(fā)揮更大的作用，為全人類健康做出更大的貢獻(xiàn)。

參考文獻(xiàn)

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第三篇：分子生物學(xué)在微生物檢驗(yàn)中的應(yīng)用(精)

分子生物學(xué)在微生物檢驗(yàn)中的應(yīng)用

南京軍區(qū)福州總醫(yī)院全軍臨床檢驗(yàn)研究所

蘭小鵬 世紀(jì)是以分子生物學(xué)為代表的生命科學(xué)的時(shí)代，近年來,隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的快速發(fā)展,人類基因組計(jì)劃的完成,尤其是生物化學(xué)、免疫學(xué)、生物儀器及計(jì)算機(jī)理論與技術(shù)的進(jìn)步，分子生物學(xué)技術(shù)在醫(yī)學(xué)、遺傳學(xué)、法醫(yī)學(xué)、生物學(xué)等各個(gè)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用, 新的診斷技術(shù)和方法不斷涌現(xiàn)并被廣泛應(yīng)用于微生物檢測(cè)，為傳染病的流行病學(xué)調(diào)查、基因的多樣性、微生物的生物學(xué)特性、微生物的致病性和藥物的耐受性、微生物的生物降解能力等各個(gè)方面提供了重要的信息。一．核酸雜交法

最初應(yīng)用于微生物檢測(cè)的分子生物學(xué)技術(shù)是基因探針方法,它是用帶有同位素標(biāo)記或非同位素標(biāo)記的DNA 或RNA 片段來檢測(cè)樣本中某一特定微生物核苷酸的方法。核酸雜交有原位雜交、打點(diǎn)雜交、斑點(diǎn)雜交、Sorthern雜交、Northern雜交等,核酸分子探針又可根據(jù)它們的來源和性質(zhì)分為DNA探針、cDNA探針、RNA探針及人工合成的寡聚核苷酸探針等。其原理是通過標(biāo)記根據(jù)病原體核酸片段制備的探針與病原體核酸片段雜交,觀察是否產(chǎn)生特異的雜交信號(hào)。核酸探針技術(shù)具有特異性好、敏感性高、診斷速度快、操作較為簡(jiǎn)便等特點(diǎn)。目前,已建立了多種病原體的核酸雜交檢測(cè)方法,尤其是近年來發(fā)展起來的熒光原位雜交技術(shù)(FISH)更為常用。二．質(zhì)粒DNA圖譜分型技術(shù)

細(xì)菌質(zhì)粒分析是較早被使用的對(duì)病原微生物流行病學(xué)進(jìn)行調(diào)查的分子分型技術(shù)。這種技術(shù)包括萃取質(zhì)粒DNA ,通過瓊脂糖凝膠電泳分離DNA。由于不同菌株質(zhì)粒DNA序列和大小不同,通過瓊脂糖凝膠電泳分離得到的DNA質(zhì)粒圖譜也將不同,因此,與流行病相關(guān)的分離株能夠被分類分型。質(zhì)粒圖譜分析的再現(xiàn)性和分辨力可通過限制性內(nèi)切酶消化質(zhì)粒而提高。雖然2個(gè)不相關(guān)質(zhì)粒有相同的分子量, 但性內(nèi)切酶位點(diǎn)的位置和頻率是不同的。但質(zhì)粒是可移動(dòng)的非染色體遺傳物質(zhì),細(xì)菌能自發(fā)的失去或很容易的獲得,結(jié)果流行病相關(guān)的菌株可以展示不同質(zhì)粒指紋圖譜。許多質(zhì)粒帶有抗性決定因子的基因,存在于轉(zhuǎn)位子上,而轉(zhuǎn)位子很容易丟失或獲得,這同樣可以迅速改變質(zhì)粒DNA組成。產(chǎn)生圖譜的再現(xiàn)性也會(huì)由于質(zhì)?？臻g存在的不一致性(超螺旋的、斷口的和線形的)而被影響,而凝膠電泳時(shí)具有不同遷移速度。大多數(shù)病原微生物有質(zhì)粒,但沒有質(zhì)粒的就不能用此技術(shù)分型。此外,由于有些分離株中含有1個(gè)或2個(gè)質(zhì)粒,會(huì)使菌株間的分辨力降低。三染色體DNA 限制性內(nèi)切酶分析技術(shù)

染色體DNA經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶消化,消化后的片段再通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離。用限制性內(nèi)切核酸酶BglⅡ和EcoRI等消化病原微生物基因組DNA可以產(chǎn)生大量短的片段。電泳后,將獲得一系列被分離的DNA圖譜。通過比較圖譜,就可以進(jìn)行菌相似性研究。幾乎所有的病原微生物分離株都可以通過這種方法分型,但由于基因組DNA巨大,酶切后產(chǎn)生的片段眾多,且含有大量的重疊片段,這將導(dǎo)致菌株間圖譜一致性分析產(chǎn)生困難。但若細(xì)菌只含一個(gè)或少量核糖體操縱子, 則只產(chǎn)生1～ 2條帶, 這限制區(qū)分密切相關(guān)菌株的能力。RFLP分析分辨力低于脈沖場(chǎng)凝膠電泳分型技術(shù)（PFGE）, 且比較復(fù)雜圖譜(數(shù)百條帶)的難度較大。四．DNA 的脈沖場(chǎng)凝膠電泳分型技術(shù)

脈沖場(chǎng)凝膠電泳分型技術(shù)（PFGE）是使用對(duì)染色體有很少酶切位點(diǎn)的限制性核酸內(nèi)切酶消化細(xì)菌DNA ,產(chǎn)生大的DNA片段(10～800 kb),這些大片段不能通過常規(guī)電泳方法進(jìn)行有效分離。在電場(chǎng)方向周期改變(脈沖)的凝膠電泳條件下,DNA片段根據(jù)大小有效分離。PFGE產(chǎn)生的染色體DNA圖譜比用那些高頻率切割的限制性內(nèi)切酶產(chǎn)生的圖譜更為簡(jiǎn)單清晰。理論上,所有的細(xì)菌都能使用PFGE 進(jìn)行分型分類,結(jié)果具有極高的再現(xiàn)性和分辨率, 常作為分子生物學(xué)分型方法的“金標(biāo)準(zhǔn)”使用。PFGE 也有一些局限,例如所需時(shí)間長(zhǎng),使用的試劑非常昂貴,要求專門的儀器等。另外,很小的電泳條件的不同就可以改變每條光譜帶間距離,使用不同凝膠進(jìn)行電泳得到的結(jié)果也比較復(fù)雜,這為不同實(shí)驗(yàn)室間的結(jié)果比較帶來一定麻煩。五．聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)

聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)自1985年發(fā)明以來,因其高度靈敏性和良好的特異性受到了人們的高度重視,各種各樣以PCR 為基礎(chǔ)的DNA序列的擴(kuò)增和檢測(cè)方法得到了迅猛發(fā)展,幾乎已應(yīng)用于基礎(chǔ)研究的各個(gè)領(lǐng)域。各種衍生技術(shù)如反轉(zhuǎn)錄PCR(RTR)、多重PCR、巢式PCR、PCR單鏈構(gòu)象多態(tài)性(PCRSSCP)、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）、隨機(jī)擴(kuò)增的多態(tài)性DNA 技術(shù)(RAPD)和重復(fù)序列PCR技術(shù)(Rep-PCR)、熒光定量PCR等。其中定量PCR 既可以用于臨床感染性疾病的診斷,又可用于監(jiān)測(cè)其療效，PCR及其衍生的技術(shù)近年來在病原微生物分型研究上得到了廣泛應(yīng)用。

1.隨機(jī)擴(kuò)增的多態(tài)性DNA 技術(shù)

隨機(jī)擴(kuò)增的多態(tài)性DNA 技術(shù)（RAPD）是一種典型PCR衍生技術(shù), 在低復(fù)性溫度下用短任意序列引物(10～15m ers)擴(kuò)增有密切同源性的基因組DNA序列, 模板上任意引物雜交點(diǎn)的數(shù)目和位置因種的不同株而異, 理論上特定株形成特定圖譜?；蚪M在這些雜交區(qū)段如發(fā)生了DNA片段缺失、插入或堿基突變,就可能導(dǎo)致這些特定結(jié)合位點(diǎn)分布發(fā)生相應(yīng)的變化。通過電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物DNA片段的多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)、分析就可以反應(yīng)出不同菌株基因組的DNA特點(diǎn),從而對(duì)他們進(jìn)行分型，RAPD是目前最簡(jiǎn)單的DNA分型方法, 分辨力高于RFLP, 但低于Rep－PCR，RAPD技術(shù)的使用范圍也非常廣,分辨結(jié)果也有較好的實(shí)驗(yàn)室再現(xiàn)性。雖然RAPD技術(shù)簡(jiǎn)單、快速, 但由于其對(duì)引物和DNA濃度、DNA模板質(zhì)量、凝膠電泳和DNA聚合酶類型的變化高度敏感, 故RAPD的重復(fù)性不夠理想。雖然RAPD的分型結(jié)果在不同實(shí)驗(yàn)室間變化較大,分辨力不如PFGE技術(shù),但在疾病暴發(fā)流行時(shí),PAPD仍是一種分析相關(guān)菌株和排除不相關(guān)菌株的良好技術(shù)。2.重復(fù)序列PCR技術(shù)

重復(fù)序列PCR技術(shù)（Rep－PCR是利用細(xì)菌基因組中廣泛分布的短重復(fù)序列為引物靶序列,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,通過對(duì)PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果的比較,分析菌株間基因組存在的差異。這些重復(fù)序列在原核生物界廣泛存在,在一些細(xì)菌屬和種中是保守的。在這種方式獲得的圖譜中,光譜帶的大小和數(shù)量的不同代表著不同菌株重復(fù)序列間的距離和重復(fù)序列的數(shù)量。已成功地用于分型的細(xì)菌重復(fù)DNA序列有腸道菌重復(fù)基因間共有(ERIC)序列、重復(fù)基因外回紋序列(REP)和BOX序列的分析，與其他分類技術(shù)相比,這種技術(shù)有更高的分辨力。研究表明,雖然有時(shí)Rep-PCR分辨力稍低,但與PFGE獲得的結(jié)果卻有很好的相關(guān)性。3.免疫PCR 免疫PCR(immuno polymerase chain reaction ,IM PCR)是1992 年Sano 等建立的一種檢測(cè)微量抗原的高靈敏度技術(shù)。該技術(shù)把抗原抗體反應(yīng)的高特異性和聚合酶鏈反應(yīng)的高敏感性有機(jī)結(jié)合在一起,它的基本原理是用一段已知DNA分子標(biāo)記抗體作為探針,用此探針與待測(cè)抗原反應(yīng), 用PCR擴(kuò)增粘附在抗原抗體復(fù)合物上的這段DNA分子,電泳定性,根據(jù)特異性PCR產(chǎn)物的有無,來判斷待測(cè)抗原是否存在。目前,國(guó)內(nèi)外報(bào)道的免疫PCR的敏感性一般比現(xiàn)行的ELISA 法高102 ～105 倍。由于PCR產(chǎn)物在抗原量未達(dá)到飽和前與抗原抗體復(fù)合物的量成正比,因此免疫PCR 還可用于抗原的半定量試驗(yàn)。

PCR－ELISA是PCR與ELISA技術(shù)結(jié)合的檢測(cè)方法，其綜合了PCR、分子雜交和ELISA三種技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，主要用于檢測(cè)樣品中的特定基因。它引入地高辛(或生物素)標(biāo)記的dNTP或引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,利用酶標(biāo)抗地高辛抗體(或酶標(biāo)記親和素)進(jìn)行ELISA檢測(cè),代替了用于常規(guī)PCR產(chǎn)物檢測(cè)的電泳方法,方便快捷,易于處理大量樣品,且其靈敏度比使用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)方法高100倍,當(dāng)有適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)品時(shí),還可進(jìn)行定量測(cè)定。六．DNA 序列測(cè)定

與檢測(cè)全染色體的PFGE、Rep－PCR和RAPD分析相比,DNA測(cè)序只檢測(cè)細(xì)菌或真菌株間潛在變化序列的很小一部分。用于辨別菌株的被測(cè)序DNA區(qū)域必須滿足以下條件:DNA區(qū)的結(jié)構(gòu)必須是可變序列，兩側(cè)為高度保守區(qū);DNA序列的可變性必須能足以區(qū)分特定種的不同株;DNA序列不能水平轉(zhuǎn)移到其它株。對(duì)細(xì)菌和真菌, 極少序列滿足這些條件。相反,DNA測(cè)序被認(rèn)為是病毒分型的 “金標(biāo)準(zhǔn)”。DNA測(cè)序費(fèi)用高、需要很高的技術(shù)條件, 而且自動(dòng)化DNA 測(cè)序儀十分昂貴。

七．基于16SrRNA的檢測(cè)技術(shù)

自Woese 等于1987年首次運(yùn)用rRNA分析以來,rRNA數(shù)據(jù)庫快速擴(kuò)大起來,成為研究細(xì)菌多樣性、進(jìn)化、系統(tǒng)發(fā)育中被廣泛采用的序列。16SrRNA存在于所有原核生物細(xì)胞中,它們相對(duì)穩(wěn)定且有較高的拷貝數(shù)(每個(gè)細(xì)胞幾千個(gè)拷貝),其序列中含可變區(qū)及高度保守區(qū),因此可設(shè)計(jì)群、屬、種特異性的探針?，F(xiàn)階段各種常見細(xì)菌的16SrRNA基因幾乎全部測(cè)序完成,16S rRNA編碼基因的這些特點(diǎn)使之成為較理想的細(xì)菌基因分類的靶序列,逐漸成為細(xì)菌鑒定、分類的“金標(biāo)準(zhǔn)”。目前, 16SrRNA 檢測(cè)技術(shù)已在醫(yī)學(xué)界得到廣泛應(yīng)用,可以用現(xiàn)有病原菌標(biāo)準(zhǔn)菌株制作DGGE(變性梯度凝膠電泳)標(biāo)準(zhǔn)marker , 然后對(duì)疑似“病原菌”擴(kuò)增16SrRNA進(jìn)行DGGE分析,這樣可以做到快速檢測(cè)。八．生物芯片

生物芯片技術(shù)是將生物大分子,如寡核苷酸、cDNA、基因組DNA、肽、抗原以及抗體等固定在諸如硅片、玻璃片、塑料片、凝膠和尼龍膜等固相介質(zhì)上形成生物分子點(diǎn)陣,當(dāng)待測(cè)樣品中的生物分子與生物芯片的探針分子發(fā)生雜交或相互作用后,利用激光共聚焦顯微掃描儀對(duì)雜交信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)和分析。微生物檢測(cè)基因芯片是指用來檢測(cè)樣品中是否含有微生物目的核酸片段的芯片。基于高通量、微型化和平行分析的特點(diǎn),微生物檢測(cè)基因芯片在微生物病原體檢測(cè)、種類鑒定、功能基因檢測(cè)、基因分型、突變檢測(cè)、基因組監(jiān)測(cè)等研究領(lǐng)域中發(fā)揮著越來越重要的作用。目前,許多細(xì)菌、病毒等病原體的基因組測(cè)序已經(jīng)完成,將許多代表各種微生物的特殊基因制成1張芯片,經(jīng)反轉(zhuǎn)錄就可檢測(cè)樣本中有無病原體基因的表達(dá)及表達(dá)水平,由此判斷病人感染病原、感染進(jìn)程以及宿主反應(yīng)等。這樣就大大提高了檢測(cè)效率?；蛐酒\斷病原菌的原理基于細(xì)菌的16SrRNA基因的高度保守性,由于RNA易于降解,因此多采用檢測(cè)16SrRNA 所對(duì)應(yīng)染色體上的16SrDNA序列。對(duì)16SrDNA而言,如果出現(xiàn)3 個(gè)堿基以上的差異就可以斷定細(xì)菌不屬于同一種屬,因此可用于細(xì)菌的分類和鑒別。對(duì)病毒和耐藥性病原菌的檢測(cè)是通過將待測(cè)的特定基因(病毒特異性基因和耐藥基因)經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄、PCR、逆轉(zhuǎn)錄、末端標(biāo)記等處理成標(biāo)記有熒光分子的核酸分子,然后與芯片上的探針進(jìn)行雜交,用計(jì)算機(jī)對(duì)雜交信號(hào)進(jìn)行處理,依信號(hào)和強(qiáng)度即可得出核酸含量。

液態(tài)芯片（Suspension Array Technology，SAT），又稱微球蛋白芯片（Protein Bead arrays，PBA），是近年來出現(xiàn)的一種新的芯片技術(shù)，也是唯一被美國(guó)食品和藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)的用于臨床診斷的生物芯片。其原理是用兩種熒光染料按照不同比例將直徑為5.6um的微球（beads/microfluorospheres）染成100種染色，每種顏色的微球共價(jià)結(jié)合一種生物探針，可以是抗原、抗體、配體，也可以是核酸或酶，分別針對(duì)一種待檢物?；旌陷d有100種不同顏色的微球，就可以在一個(gè)反應(yīng)孔里同時(shí)完成100種不同的生物反應(yīng)。隨后微球成單列通過兩束激光照射的管道，計(jì)算機(jī)采集并處理每種顏色微球的熒光強(qiáng)度變化就可以分別對(duì)每個(gè)待測(cè)物進(jìn)行定性或定量的檢測(cè)，該系統(tǒng)可用于多種微生物抗原、抗體和特定基因的聯(lián)合檢測(cè)，與固態(tài)芯片相比，液態(tài)芯片在反應(yīng)動(dòng)力學(xué)、反應(yīng)速度、檢測(cè)敏感性、穩(wěn)定性以及自動(dòng)化程度方面都有較大的優(yōu)越性，因此不少學(xué)者看好液態(tài)芯片的應(yīng)用前景。九．生物傳感器

生物傳感器是將新興的傳感器技術(shù)和分子診斷技術(shù)相結(jié)合而成的一種新技術(shù),是現(xiàn)代臨床檢驗(yàn)診斷發(fā)展的一個(gè)新方向。由于生物傳感器檢測(cè)準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn),近年來已經(jīng)在許多領(lǐng)域取得了很大的進(jìn)展,在生物分子相互作用、藥物篩選、臨床診斷、食物檢測(cè)等領(lǐng)域獲得了廣泛的應(yīng)用，其中臨床中用于病原體檢測(cè)的以DNA生物傳感器最為常見。盡管生物傳感器作為一種新的傳感元件近年來得到了很大的發(fā)展,許多光化學(xué)、電化學(xué)以及壓電晶體都相繼在生物傳感器中得到應(yīng)用。與常規(guī)的核酸和蛋白質(zhì)檢測(cè)相比,具有檢測(cè)準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn),但由于它存在靈敏度不夠、容易受雜質(zhì)干擾等缺點(diǎn),隨著研究的進(jìn)一步深化和技術(shù)方法的改進(jìn),這些問題將會(huì)得到解決。

十.蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù) 蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)是隨著蛋白質(zhì)組學(xué)興起的一種新技術(shù)，其中表面增強(qiáng)激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜蛋白芯片技術(shù)(SELDI-TOF-MS，下稱SELDI-TOF-MS)是由T.William Hutchens 和 Tai-Tung Yip等科學(xué)家在上世紀(jì)90年代早期所創(chuàng)立的一種蛋白指紋圖譜分析技術(shù)，并獲得了2002年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)，為研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、屬性、功能提供了高效而可靠的技術(shù)平臺(tái)。其原理是利用各種方法（共價(jià)鍵、電荷等）將蛋白“富集”到芯片表面，在激光的轟擊下，蛋白解吸附并電離成帶電粒子，并在電場(chǎng)作用下飛行，其飛行單位距離的時(shí)間取決于其所帶電荷數(shù)量和其分子量之比（質(zhì)荷比），從而達(dá)到分離和分析蛋白質(zhì)的目的。該技術(shù)是目前最有前途的比較蛋白質(zhì)組分析方法，為蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供了一個(gè)利器，具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和能力：可直接用粗生物樣品（血清、尿、體液）進(jìn)行分析、可同時(shí)快速發(fā)現(xiàn)多個(gè)生物標(biāo)記物、具有高通量的驗(yàn)證能力、能發(fā)現(xiàn)低豐度蛋白質(zhì)（靈敏度高達(dá)fmol/ml），與“雙相電泳加飛行質(zhì)譜”相比，除了有相似功能外，并可增加測(cè)定疏水蛋白質(zhì)，可在同一系統(tǒng)中集發(fā)現(xiàn)和檢測(cè)為一體，SELDI在微生物檢驗(yàn)方面將發(fā)揮重要的作用。十一.適體技術(shù)

1990年,Tuerk和Gold[1]分別獨(dú)立研制了一種新型的體外篩選技術(shù),即指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(Systematic evolution of ligand by exponential enrichment, SELEX),用于研究小分子核酸與靶物質(zhì)相結(jié)合的部位、序列及空間構(gòu)像。適體（aptamer），又稱適配分子或適配子，實(shí)質(zhì)是運(yùn)用SELEX技術(shù)從人工體外合成的隨機(jī)寡核苷酸序列庫中反復(fù)篩選得到的能以極高的親和力和特異性與靶分子結(jié)合的一段寡核苷酸序列。

由于適體分子可用酶、放射性核素、熒光物質(zhì)及生物素等標(biāo)記以作為檢測(cè)分子，它協(xié)同傳統(tǒng)的單克隆抗體在流式細(xì)胞技術(shù)、生物傳感器、熒光偏振、分子燈塔和毛細(xì)管電泳等檢測(cè)技術(shù)上得到了廣泛的運(yùn)用。

適體與抗體相比，具有針對(duì)靶分子的范圍廣、親和力和特異性高、性能穩(wěn)定、便于修飾等諸多優(yōu)點(diǎn)。利用針對(duì)微生物的特定蛋白和基因的適體對(duì)微生物進(jìn)行鑒定和分型以及耐藥基因的檢測(cè)方面，適體將具有良好的前景，有的學(xué)者認(rèn)為，未來適體有可能取代抗體。

十二.結(jié)語

長(zhǎng)期以來,人們?cè)噲D找到一種既簡(jiǎn)便又快速、又有足夠分辨力的技術(shù)來鑒別和區(qū)分各種病原微生物，各種新方法和新技術(shù)不斷涌現(xiàn)，但每一種方法都有其局限性，為了彌補(bǔ)各自的不足，使用一種以上的技術(shù)即采用多種方法聯(lián)合使用的策略,一種技術(shù)的缺點(diǎn)會(huì)被其他技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)所代替。選擇檢測(cè)方法應(yīng)考慮到自身所擁有的條件,檢測(cè)所要求達(dá)到的靈敏度,而提高靈敏度和去除假陽性是檢測(cè)方法發(fā)展的趨勢(shì)。近年來,隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)的不斷發(fā)展,臨床病原菌檢測(cè)將向著簡(jiǎn)便、快速、高通量、自動(dòng)化的方向發(fā)展。分子生物學(xué)技術(shù)通過自動(dòng)化儀器的使用,將在病原菌診斷、鑒定和耐藥基因檢測(cè)方面越來越廣泛地應(yīng)用于臨床。

第四篇：醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)前景

醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)就業(yè)前景

2011年，中國(guó)藥業(yè)人才網(wǎng)聯(lián)合國(guó)內(nèi)多家機(jī)構(gòu)，針對(duì)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)行業(yè)就業(yè)做出了分析。

醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)近年來在我國(guó)得到了快速發(fā)展，隨著我國(guó)不斷建立的新的檢驗(yàn)技術(shù)，如生化檢驗(yàn)中的酶促速率法分析技術(shù)、臨床檢驗(yàn)中的干化學(xué)試紙條法檢測(cè)、免疫檢驗(yàn)中的放射免疫、酶免疫及化學(xué)發(fā)光、微生物檢驗(yàn)中的全自動(dòng)鑒定技術(shù)和最近發(fā)展起來的以聚合酶鏈反應(yīng)為代表的分子生物學(xué)新技術(shù)，使檢測(cè)方法的靈敏度不斷提高，特異性越來越好，檢測(cè)結(jié)果也更加準(zhǔn)確可靠。

檢驗(yàn)儀器的迅速發(fā)展在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域更是惹人注目，生化、臨床檢驗(yàn)、免疫學(xué)和微生物學(xué)檢驗(yàn)中的部分項(xiàng)目已實(shí)現(xiàn)了全自動(dòng)或半自動(dòng)化。醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)的進(jìn)步和設(shè)備的更新?lián)Q代，對(duì)許多疾病的診斷、治療監(jiān)測(cè)和預(yù)后評(píng)估都起著越來越重要的作用。過去臨床檢驗(yàn)科室一直被看作是醫(yī)院的“輔助科室”，只對(duì)臨床部門起“輔助”作用。而目前檢驗(yàn)科室已經(jīng)成為各醫(yī)院很重要的一個(gè)部門。衡量一個(gè)醫(yī)院整體水平的高低，其中很重要的一方面就是這個(gè)醫(yī)院的檢驗(yàn)部門可以檢測(cè)多少項(xiàng)目、檢測(cè)的水平如何，以及所應(yīng)用的技術(shù)手段是否先進(jìn)。另外，隨著檢測(cè)技術(shù)的不斷發(fā)展，檢測(cè)項(xiàng)目的逐步增多，臨床疾病的診斷對(duì)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)項(xiàng)目的依賴愈加明顯。因此，檢驗(yàn)學(xué)科及其相關(guān)部門在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中的地位和作用已經(jīng)越來越受到重視。

醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)的快速發(fā)展對(duì)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)人才提出了更高的要求，使得醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)專業(yè)成為當(dāng)今醫(yī)學(xué)教育中發(fā)展最快的專業(yè)之一。

90年代起，一些醫(yī)科大學(xué)相繼建立了醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)專業(yè)，目前許多大、中型醫(yī)院的檢驗(yàn)科室都已有醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)專業(yè)畢業(yè)的大學(xué)生及研究生。

但目前一些市級(jí)、縣級(jí)和縣級(jí)以下的醫(yī)院，中專學(xué)歷的檢驗(yàn)專業(yè)人員，仍然是檢驗(yàn)科室的主力軍，這些檢驗(yàn)人員為我省的醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)事業(yè)作出了很大的貢獻(xiàn)，但由于知識(shí)陳舊，跟不上檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)的自動(dòng)化、規(guī)范化、信息化的發(fā)展，因此基層醫(yī)院需要實(shí)踐能力強(qiáng)、綜合素質(zhì)高、基礎(chǔ)理論知識(shí)夠用、能夠迅速適應(yīng)崗位工作的應(yīng)用型醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)人才。此外，疾病控制中心、血站、計(jì)劃生育指導(dǎo)站以及相繼成立的各種形式的專科醫(yī)院、私立醫(yī)院對(duì)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)人才也有較大的需求，這就使得醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)專業(yè)的學(xué)生具有很大的發(fā)展空間和市場(chǎng)需求。本專業(yè)為國(guó)家控制布點(diǎn)的一個(gè)熱門專業(yè)：

具體分析：本專業(yè)學(xué)生具有基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)等方面的基本理論知識(shí)和基本能力，將是隨著醫(yī)學(xué)事業(yè)的發(fā)展而愈來愈受到重視的醫(yī)學(xué)高級(jí)專門人才。

考生類別：理工類。

醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)專業(yè)主要的課程簡(jiǎn)介：

（1）公修課 ：

1：政治理論課

主要包括毛澤東思想、鄧小平理論和“三個(gè)代表重要思想”概論，思想道德修養(yǎng)與法律基礎(chǔ)。通過學(xué)習(xí)使學(xué)生把握毛澤東思想、鄧小平理論要點(diǎn)，樹立正確的思想道德觀念和法律法規(guī)觀念。

2：大學(xué)英語

主要開設(shè)大學(xué)英語課程，通過教學(xué)，培養(yǎng)學(xué)生英語聽、說、讀、寫、譯和查閱資料的能力，能熟練閱讀本專業(yè)外文書刊。

3：計(jì)算機(jī)應(yīng)用基礎(chǔ)

包括計(jì)算機(jī)基礎(chǔ)知識(shí)，windows操作系統(tǒng)，漢字輸入、word及電子表格等內(nèi)容。通過教學(xué)，使學(xué)生掌握計(jì)算機(jī)使用基本知識(shí)，具有一定的計(jì)算機(jī)應(yīng)用能力。

（2）專業(yè)基礎(chǔ)課：

4．醫(yī)用生物學(xué)

本門課程介紹生命的本質(zhì)、細(xì)胞、繁殖、遺傳與變異、生物與環(huán)境的關(guān)系等內(nèi)容，使學(xué)生認(rèn)識(shí)生命現(xiàn)象的本質(zhì)和生物發(fā)生發(fā)展的規(guī)律，為進(jìn)一步學(xué)習(xí)醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)課和專業(yè)課打基礎(chǔ)。

5．醫(yī)用物理學(xué)

主要內(nèi)容包括力學(xué)和聲學(xué)、電學(xué)和磁學(xué)、物理光學(xué)、幾何光學(xué)、原子物理學(xué)以及物理學(xué)新技術(shù)在專業(yè)方面的應(yīng)用，為學(xué)生了解生命現(xiàn)象的本質(zhì)、學(xué)習(xí)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)基礎(chǔ)課和專業(yè)課打下必不可少的基礎(chǔ)

6．無機(jī)化學(xué);

本課程是醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)專業(yè)的一門專業(yè)基礎(chǔ)課，它是研究無機(jī)化合物的組成、結(jié)構(gòu)、性質(zhì)及其變化規(guī)律的一門學(xué)科。通過無機(jī)化學(xué)的學(xué)習(xí)，使學(xué)生獲得醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)專業(yè)所必需的無機(jī)化學(xué)的基本理論、基本知識(shí)、基本操作技能。為學(xué)生學(xué)習(xí)專業(yè)知識(shí)和職業(yè)技能等方面提高全面的素質(zhì)，并為將來的學(xué)習(xí)打下扎實(shí)的基礎(chǔ)。

7．有機(jī)化學(xué)

主要講授有機(jī)化學(xué)基本理論和烴類化合物、烴類衍生物和雜環(huán)類化合物等的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、制備及應(yīng)用，使學(xué)生通過學(xué)習(xí)學(xué)會(huì)用化學(xué)知識(shí)解決實(shí)際問題的能力。

8．分析化學(xué)

本課程的主要內(nèi)容有常見陽離子、陰離子的定性分析，酸堿滴定法、氧化還原滴定法、沉淀滴定法、重量分析及比色分析等定量化學(xué)分析法。使學(xué)生掌握分析化學(xué)的基本原理、基本知識(shí)和基本操作技能，培養(yǎng)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目茖W(xué)態(tài)度和解決實(shí)際問題的能力。

9．醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)學(xué)

學(xué)生通過本門課程的學(xué)習(xí)應(yīng)達(dá)到理解醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)學(xué)的基本原理與基本概念，學(xué)會(huì)搜集、整理與分析資料的基本知識(shí)與技能、學(xué)會(huì)常用統(tǒng)計(jì)指標(biāo)與基本統(tǒng)計(jì)方法的正確使用，同時(shí)培養(yǎng)科學(xué)的統(tǒng)計(jì)思維方法和嚴(yán)肅、認(rèn)真和實(shí)事求是的科學(xué)態(tài)度。

10．正常人體學(xué) :

介紹人體各系統(tǒng)的組成、人體重要器官的位置、形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能；人體基本組織和器官系統(tǒng)的微細(xì)結(jié)構(gòu)及其相關(guān)功能，個(gè)體發(fā)生與生長(zhǎng)發(fā)育及其發(fā)育機(jī)制；正常人體各器官系統(tǒng)的主要生理功能及其功能的調(diào)節(jié)。使學(xué)生掌握正常人體形態(tài)、結(jié)構(gòu)和生理功能的基本知識(shí)、基本理論，理解人體是一個(gè)統(tǒng)一的有機(jī)整體。

11．生物化學(xué)

主要內(nèi)容包括大分子（蛋白質(zhì)、糖、脂）的組成、結(jié)構(gòu)、生化性質(zhì)、生物活性功能；三大物質(zhì)代謝與三大物質(zhì)生物合成；遺傳信息的傳遞；酶的概念、結(jié)構(gòu)、作用原理、酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)；生物氧化、水與電解質(zhì)代謝、酸堿平衡、腎和肝膽生化等。使學(xué)生通過學(xué)習(xí)初步掌握體內(nèi)重要的有機(jī)物和無機(jī)鹽的基本代謝過程、變化規(guī)律及其與臨床的關(guān)系，初步運(yùn)用生物化學(xué)的基礎(chǔ)理論知識(shí)，解釋臨床醫(yī)學(xué)中的一些基本現(xiàn)象。

12．病理學(xué)

本課程闡述疾病的一些共同性病理變化和各系統(tǒng)常見疾病的病理改變及其演變規(guī)律，使學(xué)生掌握疾病過程一般的共同規(guī)律及各系統(tǒng)主要疾病和臟器功能衰竭的基本病理知識(shí)，加深對(duì)人、環(huán)境、健康、疾病關(guān)系的理解，并學(xué)會(huì)病理學(xué)的觀察方法。

13．儀器分析

本課程主要介紹光化學(xué)分析法、電化學(xué)分析法、色譜分析法等儀器分析方法，并對(duì)質(zhì)量控制、自動(dòng)分析技術(shù)、生物樣品前處理、計(jì)算機(jī)在儀器分析中的應(yīng)用、常用儀器調(diào)試與常見故障等內(nèi)容進(jìn)行了闡述。

（3）專業(yè)課 ：

14．臨床醫(yī)學(xué)概論

主要包括問診與體格檢查、特殊檢查、各系統(tǒng)常見病的病因、發(fā)病機(jī)制、臨床表現(xiàn)、診斷和有關(guān)的檢驗(yàn)項(xiàng)目等。通過學(xué)習(xí)使學(xué)生獲得臨床醫(yī)學(xué)的基本知識(shí)和診斷常見疾病的基本方法，為學(xué)習(xí)專業(yè)課程奠定必要的基礎(chǔ)。

15．生物化學(xué)檢驗(yàn)

本門課程主要介紹臨床普通生化檢驗(yàn)如肝功能試驗(yàn)、腎功能試驗(yàn)、腫瘤標(biāo)記物測(cè)定、血脂檢驗(yàn)、血糖檢驗(yàn)、電解質(zhì)分析和常用生化分析儀器的使用以及臨床生化檢驗(yàn)的質(zhì)量控制，通過學(xué)習(xí)使學(xué)生掌握臨床普通生化檢驗(yàn)方法、結(jié)果的正確解釋、常用儀器參數(shù)的設(shè)置和操作，了解和控制影響生化檢驗(yàn)質(zhì)量的控制因素。

16．微生物學(xué)檢驗(yàn)

本課程闡述微生物的種類、主要病原微生物的生物學(xué)特性、致病性與免疫原性、微生物學(xué)檢驗(yàn)程序及檢查方法，常用試劑的配置、培養(yǎng)基的制備和消毒滅菌等內(nèi)容，使學(xué)生通過學(xué)習(xí)能夠正確使用微生物學(xué)檢驗(yàn)儀器、配制常用染色

液，并能常見病原生物作出正確的鑒定。

17．寄生蟲學(xué)檢驗(yàn)

本課程的主要內(nèi)容有醫(yī)學(xué)蠕蟲、醫(yī)學(xué)原蟲、醫(yī)學(xué)節(jié)肢動(dòng)物的形態(tài)結(jié)構(gòu)、生活史、致病性及其實(shí)驗(yàn)診斷技術(shù)。要求學(xué)生通過學(xué)習(xí)，學(xué)會(huì)常見寄生蟲病的實(shí)驗(yàn)室診斷方法，并能聯(lián)系實(shí)際，分析有關(guān)流行因素，為制定有效防治措施提供依據(jù)。

18：免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)

主要內(nèi)容包括免疫學(xué)基礎(chǔ)知識(shí)、免疫檢驗(yàn)技術(shù)、免疫檢驗(yàn)質(zhì)量控制和臨床免疫學(xué)的基礎(chǔ)知識(shí)。要求學(xué)生在掌握免疫學(xué)基本知識(shí)的基礎(chǔ)上，掌握主要免疫學(xué)技術(shù)的基本操作技能及其儀器的正確使用。

19：臨床檢驗(yàn)基礎(chǔ)

主要內(nèi)容有血液、尿液、糞便、腦脊液、漿膜腔積液、精液、前列腺液、脫落細(xì)胞等的檢驗(yàn)。要求學(xué)生掌握人體血液、體液、分泌物和排泄物檢驗(yàn)的操作方法、診斷指標(biāo)及其臨床意義。

20：血液學(xué)檢驗(yàn)

本課程主要包括了血液生理、血細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)、造血器官穿刺檢驗(yàn)、白細(xì)胞系統(tǒng)疾病及其實(shí)驗(yàn)診斷、紅細(xì)胞疾病及其實(shí)驗(yàn)診斷、出血與凝血系統(tǒng)疾病及其實(shí)驗(yàn)診斷。要求學(xué)生學(xué)會(huì)識(shí)別各種血細(xì)胞、掌握血液學(xué)檢驗(yàn)的基本方法，協(xié)助臨床診斷。

畢業(yè)生能力測(cè)試：醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)專業(yè)學(xué)生通過在校期間的學(xué)習(xí)能熟練掌握醫(yī)用化學(xué)和計(jì)算機(jī)應(yīng)用的基本知識(shí)和基本技能；掌握基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)的基本理論知識(shí)和臨床疾病診療基本知識(shí)；掌握免疫學(xué)、病原診斷學(xué)、血液學(xué)、輸血學(xué)、分子生物學(xué)等專業(yè)基本理論和操作技術(shù)，了解常用檢驗(yàn)儀器的基本構(gòu)造和性能；

熟悉國(guó)家衛(wèi)生工作及臨床實(shí)驗(yàn)室管理有關(guān)的方針、政策和法規(guī)；掌握文獻(xiàn)檢索、資料調(diào)查的基本方法，具有一定的科學(xué)研究和實(shí)際工作能力。具有臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)及衛(wèi)生檢驗(yàn)的基本能力。

就業(yè)前景，該專業(yè)主要培養(yǎng)具有基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)等方面基本理論知識(shí)和基本能力，能在各級(jí)醫(yī)院、血站及防疫等部門從事醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)及醫(yī)學(xué)類實(shí)驗(yàn)室工作的醫(yī)學(xué)專業(yè)人才。學(xué)生畢業(yè)后的去向呈現(xiàn)多元化，基本的就業(yè)方向有以下幾種：各級(jí)醫(yī)院檢驗(yàn)科、防疫站、血站等部門從事工作；商品檢驗(yàn)、環(huán)境保護(hù)、海關(guān)檢疫等部門從事工作；也可從事管理，醫(yī)檢設(shè)備維修、試劑研制及營(yíng)銷工作，也就是說能適應(yīng)于社會(huì)主義市場(chǎng)經(jīng)濟(jì)多樣化的需要。

這些專業(yè)就業(yè)主要分布最多五省市分別為：湖南、浙江、山東、北京、廣東。

醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)畢業(yè)生就業(yè)分布統(tǒng)計(jì)分別為國(guó)有企業(yè)：17.7%；錄取研究生：2.2%；部隊(duì)：4.2%；高等學(xué)校：2.22%；醫(yī)療衛(wèi)生單位：60%

第五篇：PCR技術(shù)在臨床檢驗(yàn)中的應(yīng)用

PCR技術(shù)在臨床檢驗(yàn)中的應(yīng)用

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醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)大致可分為形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)、血清免疫學(xué)和分子生物學(xué)幾大類，其分別代表幾代實(shí)驗(yàn)診斷技術(shù)。60年代DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)及半保留復(fù)制模式的出現(xiàn)，70年代基因重組及體外基因克隆技術(shù)、分子雜交技術(shù)的應(yīng)用使分子生物學(xué)在疾病診斷中得到了長(zhǎng)足的發(fā)展。特別是1985年Mullis發(fā)明了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)，使醫(yī)學(xué)界真正興起了基因診斷技術(shù)熱，成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)展的又一里程碑。用于臨床檢驗(yàn)的PCR技術(shù)與經(jīng)典的PCR反應(yīng)在操作上稍有區(qū)別，有其自己的特色。一般在樣品處理上，多采用非離子去污劑一次加熱處理，這種方法對(duì)DNA純化有限，但適應(yīng)臨床微量、快速的特點(diǎn)。另外PCR反應(yīng)體系中各組成成份往往都預(yù)分裝到反應(yīng)管中，既減少操作者的工作強(qiáng)度而且也減少了污染的機(jī)會(huì)，具有極高的使用價(jià)值。本公司率先研制并推出單管單人份的PCR診斷試劑，具有開創(chuàng)性意義。這些改進(jìn)都不影響PCR效果，同樣表現(xiàn)出高特異性、高敏感性、簡(jiǎn)便快捷等PCR最優(yōu)秀的特征，在常見傳染病、性病、腫瘤、遺傳病、寄生蟲病、優(yōu)生優(yōu)育、法醫(yī)學(xué)等廣泛領(lǐng)域中有相當(dāng)高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

常見的傳染性疾病有細(xì)菌、病毒、衣原體、支原體等，可引起消化、呼吸、循環(huán)、泌尿生殖等不同系統(tǒng)相應(yīng)的病變。消化系統(tǒng)感染性疾病在我國(guó)具有代表性意義的有肝炎、胃炎及腸道感染性疾病。引起肝炎的病原體主要包括乙型肝炎病毒（乙肝）、丙型肝炎病毒（丙肝），其它還有甲型肝炎病毒（甲肝）、丁型肝炎病毒（丁肝）、戊型肝炎病毒（戊肝）、庚型肝炎病毒（庚肝）等。這幾種肝炎病毒中只有乙型肝炎病毒是DNA病毒，其余均為RNA病毒。我國(guó)是乙肝高發(fā)區(qū)，乙肝病人為世界乙肝病人總數(shù)的50％。乙肝病毒經(jīng)血液傳播，病毒主要在肝細(xì)胞中增殖，也可以長(zhǎng)期存留在骨髓細(xì)胞或外周血白細(xì)胞中。通常用PCR法檢測(cè)血清中的乙肝病毒。有報(bào)道用PCR法可以在淚液、乳汁、精液及血白細(xì)胞中檢出乙肝病毒，這些發(fā)現(xiàn)提示其它傳染途經(jīng)存在的可能。PCR法檢測(cè)乙肝的優(yōu)勢(shì)表現(xiàn)在：①早期診斷，因?yàn)镻CR擴(kuò)增極其敏感，理論上可檢出100CID/ml乙肝病毒的患者血清，在感染潛伏期即可被PCR法檢出。②對(duì)低持續(xù)感染乙肝病人的診斷，有些乙肝病人體內(nèi)的病毒長(zhǎng)期低復(fù)制感染，血清病毒濃度極低，一般酶標(biāo)試劑無法檢出，可以用PCR法檢出。③療效跟蹤及病程判斷，因?yàn)镻CR能半定量檢測(cè)乙肝病毒基因，是病毒是否存在及其數(shù)量多少的最直接指標(biāo)。在治療過程中通過監(jiān)測(cè)血清或白細(xì)胞中病毒基因存在與否及其動(dòng)態(tài)變化即能準(zhǔn)確地了解病情。丙型肝炎病毒在血清中的濃度很低，丙肝病毒的分離尚未成功。目前用于丙肝病毒檢驗(yàn)的方法主要是ELISA法測(cè)定血清中的HCV抗體。由于HCV尚無法分離純化，所以用于包被的抗原是人工合成肽或基因工程蛋白，這些人工抗原與天然病毒抗原有一定的區(qū)別，理論上是存在假陽性或假陰性。同時(shí)血清中抗體的出現(xiàn)及動(dòng)態(tài)變化與病人病情無線性相關(guān)關(guān)系。RT－PCR技術(shù)使這些困難得到解決。HCV是RNA病毒，需先將病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA（RT）后再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，這種技術(shù)稱之為逆轉(zhuǎn)錄－PCR（RT－PCR）。PCR敏感性高可以檢測(cè)出血清中低濃度的病毒，了解病毒在體內(nèi)復(fù)制的動(dòng)態(tài)狀況。RNA純化要求嚴(yán)格，是RT－PCR的技術(shù)關(guān)鍵，本公司目前使用的高效基因釋放劑，聯(lián)合特異性固相基因吸附乳膠顆粒，對(duì)樣本中的RNA進(jìn)行分離純化，使這一問題得到解決。通常用于RNA→cDNA逆轉(zhuǎn)錄的酶大致可以分為二大類，即低溫逆轉(zhuǎn)錄酶，如AMV/MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，高溫逆轉(zhuǎn)錄酶，如Tth酶。Tth酶在錳離子作用下，具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性，Tth酶活性溫度高，可以使核酸充分線性化，提高逆轉(zhuǎn)錄效率及特異性。Tth酶在鎂離子的作用下，又具有DNA聚合酶活性，從而真正實(shí)現(xiàn)單管單酶單人份的擴(kuò)增要求，這樣就在不降低擴(kuò)增敏感性的條件下，一步完成擴(kuò)增，不僅簡(jiǎn)化操作，而且又減少污染，提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性。國(guó)內(nèi)本公司已采用這種技術(shù)推出單管單酶單人份的RT－PCR診斷試劑。丁型肝炎病毒是缺陷病毒，與乙型肝炎病毒協(xié)同感染。甲型肝炎病毒、戊型肝炎病毒主要存在于急性病人糞便樣本中，戊型肝炎病毒也長(zhǎng)期存在于血清中。在PCR檢測(cè)時(shí)，需注意取材的合理性。在消化道傳染性疾病中，另一類最重要的感染性疾病是幽門螺旋桿菌（HP）所引起的胃炎、胃潰瘍等。HP可以經(jīng)口－口途經(jīng)傳播并定位于胃粘膜上皮細(xì)胞，早期表現(xiàn)為淺表性胃炎，可發(fā)展成為胃潰瘍。我國(guó)胃炎發(fā)病率之高估計(jì)比乙型肝炎更嚴(yán)重，對(duì)HP的檢測(cè)應(yīng)受到廣大醫(yī)務(wù)工作者的重視。對(duì)HP的檢測(cè)可以用生化法測(cè)試尿素酶或用免疫法測(cè)試血清中對(duì)HP特異性抗體，也可對(duì)胃液、胃粘膜樣本進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)及菌種鑒定。PCR法檢測(cè)HP非常敏感且特異性高，有研究發(fā)現(xiàn)可以從病人的唾液或口腔含漱液中檢出HP。PCR法避免了取胃液及胃粘膜，減少病人痛苦，是目前最理想的方法。

呼吸系統(tǒng)感染性疾病主要的有肺結(jié)核、非典型性肺炎等。結(jié)核桿菌感染曾給人類健康帶來很大威脅，一度是較嚴(yán)重的致死性疾病之一。解放以后由于對(duì)結(jié)核病的預(yù)防的重視，特別是特效抗癆藥物的出現(xiàn)，使結(jié)核病流行基本被控制。近來結(jié)核病有抬頭的趨勢(shì)，基原因可能有兩方面，其一是耐藥株的不斷出現(xiàn)，其二是對(duì)結(jié)核預(yù)防重視不足。結(jié)核菌痰涂片鏡檢陽性率太低，酶標(biāo)法又因抗原交叉反應(yīng)易出現(xiàn)假陽性，結(jié)核檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)是結(jié)核菌培養(yǎng)法。但培養(yǎng)法費(fèi)時(shí)昂貴并且受到用藥的影響，在實(shí)際應(yīng)用中受到限制。PCR在結(jié)核菌檢測(cè)方面有簡(jiǎn)便、敏感、特異的優(yōu)點(diǎn)。一般認(rèn)為樣本中內(nèi)要有100個(gè)左右的結(jié)核菌即可被檢出。目前用于結(jié)核菌PCR診斷的試劑，其引物主要來源于以下基因片段36KD/65KD抗原蛋白基因；染色體重復(fù)插入序列IS986、IS960、IS6110、染色體質(zhì)粒DNA PH7311、PMTB4、P36基因等。其中最常用的是染色體重復(fù)插入序列IS986或IS6110，1990年Hermans首先介紹并使用了IS986基因設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增產(chǎn)物為245BP，研究表明這一基因?qū)θ诵徒Y(jié)核菌有特異性。而后Thierry又介紹了插入序列IS6110基因，并認(rèn)為這一基因?qū)θ诵徒Y(jié)核菌具有比IS986更高的特異性及敏感性，最適合M.TB的檢測(cè)。結(jié)核菌痰標(biāo)本的PCR檢測(cè)應(yīng)注意以下幾種常見的問題。其一，多條帶。即擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后有三條或三條以上的螢光除最前面的引物以外有兩條產(chǎn)物帶，這與插入序列本身各片段長(zhǎng)度有差異、結(jié)核菌在治療過程中染色體畸變、斷裂、缺欠及不等位交換有關(guān)。這種擴(kuò)增結(jié)果的判斷應(yīng)特別注意，凡在陽性對(duì)照相應(yīng)位置有明顯條帶的判陽性，否則應(yīng)為陰性，或建議病人過一些時(shí)間后再復(fù)檢一次；其二，結(jié)核痰樣本PCR檢測(cè)時(shí)，要使樣本充分液化，否則痰液中的粘液成份將影響擴(kuò)增效果，甚至?xí)?dǎo)致嚴(yán)重非特異性擴(kuò)增，電泳結(jié)果呈霧狀；基三，結(jié)核痰樣本PCR檢測(cè)結(jié)果可能表現(xiàn)為陽性、陰性交替出現(xiàn)，這與結(jié)核病灶的不規(guī)律排菌有關(guān)。

循環(huán)系統(tǒng)以腸道小RNA病毒感染最具代表意義，如柯薩奇病毒等。這些病毒經(jīng)腸道粘膜、淋巴結(jié)進(jìn)入血液，最終可定位于心肌細(xì)胞中導(dǎo)致心肌炎。目前對(duì)這些病毒的血液樣本檢測(cè)往往比較困難。PCR用于柯薩奇病毒檢測(cè)時(shí)因其是RNA病毒所以應(yīng)注意樣本的保存。外在環(huán)境中存在大量RNA酶，病毒脫殼后RNA將被迅速降解。一般用于RNA檢測(cè)的血清常溫下不應(yīng)超過24小時(shí)，4℃下可保存2天，-20℃下可以保存2月以下。

PCR檢測(cè)在性傳播性疾病(STD)的診斷中有較廣泛的應(yīng)用。經(jīng)典的性傳播疾病有梅毒、淋病、腹股溝淋巴肉芽腫、軟銳濕癘、硬下疳等。而在現(xiàn)代STD中、解尿支原體及沙眼衣原體引起的非淋菌性尿道炎（NGU）可能更具有代表性意義。梅毒是由梅毒螺旋體感染布致，首先在局部形成硬軟下疳，布后經(jīng)血行播散到全身，最嚴(yán)重的是波及中樞神經(jīng)系統(tǒng)。感染早期，梅毒螺旋體大量存在于硬下疳中，可以用生理鹽水濕棉簽擦去皮疹表面污物再用鈍刀片輕輕刮去上皮及結(jié)痂，用潔凈棉簽取滲出液樣本作PCR檢測(cè)，其敏感性及特異性極高。二期梅毒皮疹中也存在梅毒螺體其取樣方法同埂下疳，三期梅毒皮疹中一般無螺旋體存在，因此III病人及部分無皮疹的I、II期梅毒病人可以取EDTA抗凝全血檢測(cè)。淋病是目前發(fā)病率最高的性傳播性疾病之一，由淋病雙球菌引起。淋病雙球菌一般為胞內(nèi)寄生，常見的感染部位為外生殖器、尿道粘膜最常見。在尿道及外生殖器分泌物中有許多非致病的雙菌存在，對(duì)分泌物拭子進(jìn)行涂片鏡檢時(shí)，常導(dǎo)致誤診。另外目前非淋球菌性尿道炎的發(fā)病率不斷增加，鑒別診斷特要，培養(yǎng)法準(zhǔn)確但費(fèi)時(shí)且費(fèi)用高，受用藥的影響。PCR法簡(jiǎn)便、快捷、準(zhǔn)確非常理想。常用的引物多采用外膜蛋白抗原基因、隱性質(zhì)粒DNA或16s RNA基因。16s RNA基因設(shè)計(jì)的引物特異性高但其敏感性低；隱性質(zhì)粒設(shè)計(jì)的引物敏感性高但偶爾出現(xiàn)多條帶的擴(kuò)增產(chǎn)物，判斷結(jié)果時(shí)應(yīng)以陽性對(duì)照為標(biāo)準(zhǔn)，凡在陽性對(duì)照相應(yīng)部位有明顯條帶的為陽性，其余均為陰性。以往對(duì)沙眼衣原體及解脲支原體的檢測(cè)主要靠培養(yǎng)法，費(fèi)時(shí)且昂貴，簡(jiǎn)便快速的PCR檢測(cè)對(duì)其有極高的使用價(jià)值。沙眼衣原體、解脲支原體樣本來源主要是尿道及宮頸分泌物拭子，由于分泌物中有許多污物含有PCR擴(kuò)增的抑制劑，因此每次采樣時(shí)盡量避免采集過多膿性分泌物，如果宮頸分泌物太多可以先用濕棉簽將表面的分泌物擦去，再用潔凈的濕棉簽輕壓旋轉(zhuǎn)采集宮頸脫落細(xì)胞送檢，其準(zhǔn)確性更高。PCR也可以用檢測(cè)單純皰疹病毒、EB病毒、乳頭瘤病毒等。引物尖銳濕疣的病毒是人類乳頭瘤（HPV）,可致生殖系統(tǒng)感染的乳頭瘤病毒主要是6、11、16、18、33型。新近研究結(jié)果表明，在乳頭瘤病毒引起的良、惡性生殖器病變中，與血清型的關(guān)系并不密切，經(jīng)常有交叉或多型民時(shí)感染。為簡(jiǎn)化操作，對(duì)其基因?qū)Ρ确治鰧ふ夜餐蛄性O(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并引物可以同時(shí)檢出這幾種型別的病毒既簡(jiǎn)化操作又減少費(fèi)用是一種極理想的方法。

我國(guó)惡性腫瘤為人口死亡的第一位原因，其中以肺癌、胃癌及食管癌的發(fā)病率最高，占惡性腫瘤死亡總數(shù)的60％以上。引起腫瘤的原因非常復(fù)雜包括外界環(huán)境因素及遺傳背景。外界因此可分為三大類即化學(xué)、物理及生物因素。腫瘤與遺傳有關(guān)的證據(jù)越來越多，除已知的單基因遺傳腫瘤如視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤、腎母細(xì)胞瘤等以外，還在幾乎所有的腫瘤細(xì)胞中觀察到原癌基因的重排，這些基因的變化常導(dǎo)致細(xì)胞增殖調(diào)控失調(diào)終形成腫瘤。癌基因是指在自然或?qū)嶒?yàn)條件下具有潛在誘導(dǎo)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的基因，它們是在研究逆轉(zhuǎn)錄病毒時(shí)發(fā)現(xiàn)的。目前已知的腫瘤基因有60多種，1969年Hubner根據(jù)Rous(1911)的實(shí)驗(yàn)，在小雞肉瘤濾液中發(fā)現(xiàn)一種能誘導(dǎo)宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化的RNA病毒性癌基因（Viral Oncogene）。后來又在其它哺乳動(dòng)物基因中發(fā)現(xiàn)與病毒癌基因同源序列，這種正常的細(xì)胞基因表達(dá)產(chǎn)物與細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化有關(guān)。但若被某種因素激活就會(huì)轉(zhuǎn)化為有活力的癌基因，通常稱之為原癌基因（Proto Oncogene）。為了與病毒癌基因區(qū)分，分別用V-Onc及C-Onc基因來代表。目前了解較多的癌基因（C-one）有scr基因族、ras基因族、mgc及myb基因族。原癌基因存在于正常細(xì)胞中，并表達(dá)生物功能，只有在原癌基因被激活后才能誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，可能的原癌基因活化機(jī)理有：①點(diǎn)突變，受到射線、化學(xué)因素、生物因素的誘導(dǎo)，這樣微小的變化，就會(huì)活化癌基因，活化的基因產(chǎn)物僅有極微的結(jié)構(gòu)差異，但在功能在卻有很大的區(qū)別。②獲得啟動(dòng)子，原癌基因從病毒基因中獲得啟動(dòng)子而活化。③基因易位，內(nèi)外界因素能導(dǎo)致染色體的某些基因易位、重排使原來無活性的原癌基因移至某些強(qiáng)的啟動(dòng)因子或增強(qiáng)子附近而被活化。④原癌基因的過量擴(kuò)增，原癌基因產(chǎn)物一般與生長(zhǎng)因子、生長(zhǎng)因子受體、跨膜信息蛋白有關(guān)或功能相近，過度表達(dá)時(shí)，會(huì)因調(diào)控失常而引起細(xì)胞癌變。另一類與腫瘤相關(guān)的基因是抑癌基因如P53。抑癌基因較復(fù)雜，作用機(jī)理不太清楚。癌基因檢測(cè)中常用的分子生物學(xué)技術(shù)有：雜交、DNA分子克隆、PCR擴(kuò)增及序列分析。PCR擴(kuò)增簡(jiǎn)便、快捷有較強(qiáng)的實(shí)用性，甚至可從病人體液樣本中檢測(cè)活化的癌基因而不需取活組織，對(duì)癌癥的早期診斷有極重要的意義。Ras基因是1964年首次從大鼠肉瘤的急性逆轉(zhuǎn)錄病毒（Harver Murine Sarcoma and Kister Murine Sarcoma Virus）中分離出來取大鼠肉瘤（Rat Sarcoma）的字首命名。1982年首次在人膀胱細(xì)胞細(xì)胞癌中檢出有轉(zhuǎn)化能力的ras基因與Harver大鼠肉瘤病毒癌基因有同源性稱C-H-ras基因，后從肺細(xì)胞癌中發(fā)現(xiàn)了與Kister大鼠肉瘤癌基因同源的C-K-ras基因，從神經(jīng)母細(xì)胞中又發(fā)現(xiàn)了N-ras基因。Ras基因激活的最常見方式是點(diǎn)突變。人類原發(fā)腫瘤時(shí)點(diǎn)突變主要發(fā)生在密碼子12、13、59、61位。激活后的ras基因不牟自行滅活，根據(jù)其點(diǎn)突變的情況可以基因診斷、療效觀察。用PCR擴(kuò)增樣本ras原癌基因，再使用雜交法、限制性內(nèi)切酶消化或產(chǎn)物測(cè)序法檢測(cè)基因的突變情況即可用診斷。P53是抑制癌基因的代表，位于17號(hào)染色體短臂上，其產(chǎn)物為53KD分子量的蛋白從此而得名，可分為突變型和野生型，前者為癌基因，后者為抗癌基因。1979年Cane發(fā)現(xiàn)了P53蛋白Eliyahu發(fā)現(xiàn)了p53基因有抑癌作用。P53突變后其產(chǎn)物突變蛋白穩(wěn)定性增加，半衰期較野生型基因產(chǎn)物長(zhǎng)，在細(xì)胞內(nèi)堆積，可以用免疫組化法測(cè)出。PCR-RELP、PCR-SSCP則因方法簡(jiǎn)單、快速、特異性高，更具有實(shí)用價(jià)值。在SSCP分析中，單鏈DNA因堿基序列的變異，導(dǎo)致構(gòu)型改變，在進(jìn)行凝膠電泳時(shí)，其泳動(dòng)速率發(fā)生改變，從布將變異的DNA與正常DNA區(qū)分開，統(tǒng)計(jì)表明100-300bp分子大小的ssDNA突變檢出率可達(dá)97％，300-450bp標(biāo)出率可達(dá)69％，因此大于400bp的片段多態(tài)性應(yīng)采用其它方法檢測(cè)。

遺傳病是由于遺傳基礎(chǔ)異常而引起的疾病，人類遺傳病約有3000多種，患者占總?cè)丝跀?shù)的10％。遺傳病大概可分為單基因、多基因及染色體遺傳病。常用診斷方法有家系譜分析、染色體檢查（特別是顯帶法）、生物化分析等。隨分子生物學(xué)發(fā)展，基因診斷愈來愈表現(xiàn)出其優(yōu)越性，PCR技術(shù)是基因診斷的主要技術(shù)之一，為快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)人類遺傳病開辟了一個(gè)新的途徑，預(yù)計(jì)與遺傳相關(guān)的疾病的檢測(cè)有80％將在3-5年內(nèi)被PCR法所取代。PCR在遺傳病診斷應(yīng)用中，可以利用引物直接擴(kuò)增變化的基因產(chǎn)物，也可以結(jié)合應(yīng)用限制內(nèi)切酶，分子雜交及電泳圖譜分析進(jìn)行診斷。應(yīng)用較為廣泛的有PCR法檢測(cè)中海貧血、苯丙酮尿癥、血友病、脆性X綜合癥及性別鑒定等。地中海貧血（Thalassmia）是世界上最常見的單基因遺傳病，不有同類型，以a地中海貧血及在中海貧血最常見。a珠蛋白基因位于11號(hào)染色體短臂上，a珠蛋白基因突變致血紅蛋白的全成減少或缺失，表現(xiàn)溶血性貧血，肝脾腫大，在我國(guó)發(fā)病率為0.66％，貴州、四川等地高發(fā)可達(dá)2.2％。應(yīng)用PCR技術(shù)可以直接檢測(cè)突變的基因診斷此病。苯丙酮尿癥（Phenylketouria,PKU）是一種常染色體隱性遺傳病。病人肝臟苯丙氨酸羥化酶嚴(yán)重缺乏使苯丙氨酸不能轉(zhuǎn)化為酷氨酸血癥，出現(xiàn)腦組織損傷，智力障礙。此病患者出生時(shí)正常，出生后一經(jīng)確診立即停止母乳喂養(yǎng)，采用低苯丙氨酸飲食治療8-10年不致影響患者智力，但低苯丙氨酸飲食代價(jià)之昂貴是一般家庭所不能承受的，關(guān)鍵在于避免患兒出生。因此本病的早期診斷有極其重要的意義。PCR結(jié)合斑點(diǎn)雜交能有效診斷PKU。遺傳性疾病的基因變化很復(fù)雜，單基因固定位點(diǎn)變異布致病的情況很少，因此基因診斷過程中往往需要PCR技術(shù)與限制性內(nèi)切酶、斑點(diǎn)雜交、聚丙烯酰胺膠電泳圖譜分析及擴(kuò)增產(chǎn)物序列分析結(jié)合，作綜合判斷。

優(yōu)生學(xué)包括基礎(chǔ)優(yōu)生學(xué)、社會(huì)優(yōu)生學(xué)、臨床優(yōu)生學(xué)及環(huán)境優(yōu)生學(xué)。孕期檢查及產(chǎn)前診斷是臨床優(yōu)生學(xué)的最重要內(nèi)容之一。孕期檢查除一般項(xiàng)目外還能及時(shí)了解孕婦是患有某些對(duì)胎兒發(fā)育有嚴(yán)重影響的疾病如風(fēng)疹病毒感染、沙眼衣原體、解脲支原體、單純皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒、弓體感染等，及時(shí)發(fā)現(xiàn)及時(shí)治療并采取有效措施預(yù)防發(fā)展成為宮內(nèi)感染。PCR技術(shù)對(duì)這些病原體的檢測(cè)簡(jiǎn)便而確實(shí)，另外利用PCR技術(shù)可以對(duì)地中海貧血、血友病、苯丙酮尿癥、脆性X綜合癥等遺傳性疾病進(jìn)行宮內(nèi)診斷?？梢奝CR在優(yōu)生優(yōu)育方面有很高的應(yīng)用價(jià)值。

PCR技術(shù)的出現(xiàn)對(duì)法醫(yī)學(xué)的發(fā)展也有不可低估的作用。在法醫(yī)物證如血斑、毛發(fā)、組織碎片等的確證，DAN多態(tài)性分析遠(yuǎn)比血清學(xué)或等方法確實(shí)可靠。早期DNA多態(tài)性分析主要使用Southern印跡雜交的方法。1985年Jeffreys首先采用肌紅基因第一個(gè)內(nèi)含子中的串聯(lián)重復(fù)序列作探針，從人的基因庫中篩選出小衛(wèi)量DNA，使用阿交法產(chǎn)生雜交圖譜即DNA指紋。這一技術(shù)成功地應(yīng)用于個(gè)人識(shí)別及親子鑒定。這種方法仍受到樣本量的限制，當(dāng)樣本DNA數(shù)量不足時(shí)或DAN嚴(yán)重降解則不能正常檢出。且雜交技術(shù)常使用同位素杯記探針要求較鎬的防護(hù)措施。PCR技術(shù)的出現(xiàn)，可以對(duì)極少量物證如一根毛發(fā)、一滴血液、極小精斑都可以進(jìn)行分析。在人類基因組中有許多由10-15bp核心順序構(gòu)成的串聯(lián)重復(fù)DNA序列，具有單位點(diǎn)特征的稱為VNTR結(jié)構(gòu)，多位點(diǎn)串聯(lián)成為衛(wèi)星DNA。由于VNTR在等位基因中的多態(tài)性便構(gòu)成了遺傳標(biāo)記。使用PCR技術(shù)對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增結(jié)合對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳圖譜分析即可進(jìn)行個(gè)人識(shí)別及親子鑒定。由2-6核苷組成的重復(fù)串聯(lián)序列稱為微衛(wèi)星。在人類基因組中，微衛(wèi)星更加豐富。微衛(wèi)星的重復(fù)序列比VNTR短，擴(kuò)增分型簡(jiǎn)便，易于自動(dòng)化，在VNTR或微衛(wèi)星不僅重復(fù)片段的數(shù)量不同而且重復(fù)片段的核苷酸也具有多態(tài)性。在VNTR或微衛(wèi)星多態(tài)性分析時(shí)，如再結(jié)合堿基配對(duì)分析可以藜得更大量的信息，這一種更有希望的標(biāo)志即MVR（Microsatllite Variant Repeats）。理論上其對(duì)嫌疑人的排除率為99.999％。PCR技術(shù)可以完成替代早期的Southern印跡法進(jìn)行多態(tài)性分析而且操作簡(jiǎn)便，敏感性及準(zhǔn)確性都有大幅度的提高。當(dāng)然PCR技術(shù)在法醫(yī)中的應(yīng)用仍在起步階段有許多技術(shù)問題等待解決，如樣本中的抑制劑、檢村中DNA的損報(bào)告?zhèn)?、PCR擴(kuò)增污染等。想念隨著PCR技術(shù)的不斷完善它將在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中有更加廣泛的應(yīng)用。