第一篇：生物技術(shù)制藥課后思考題

生物技術(shù)制藥思考題

第一章：緒論

思考題

1.什么是生物技術(shù)？生物技術(shù)所包含的內(nèi)容及定義。

答：1）生物技術(shù)又稱生物工程，指人們以現(xiàn)代生命科學(xué)為基礎(chǔ)，結(jié)合先進(jìn)的工程技術(shù)手段和其他基礎(chǔ)學(xué)科的科學(xué)原理，按照預(yù)先的設(shè)計改造生物體或加工生物原料，為人類生產(chǎn)出所需產(chǎn)品或達(dá)到某種目的的技術(shù)。2）包括基因工程、細(xì)胞工程、發(fā)酵工程、酶工程、蛋白質(zhì)工程、抗體工程、糖鏈工程、海洋生物技術(shù)及生物轉(zhuǎn)化等。（具體定義見P1）。

2.生物技術(shù)藥物的概念及分類。

答：1）指采用DNA重組技術(shù)或其他生物技術(shù)生產(chǎn)的用于預(yù)防、治療和診斷疾病的藥物，主要是重組蛋白或核酸類藥物。2）a.按照用途：預(yù)防、診斷、治療；b.按作用類型：細(xì)胞因子類、激素類、酶類、疫苗、單克隆抗體類、反義核酸、RNA干擾類、基因治療藥物；c.按照生化特性：多肽類、蛋白質(zhì)類、核酸類、聚乙二醇化多肽或蛋白質(zhì)。3.生物技術(shù)藥物在理化性質(zhì)、藥理學(xué)與作用、生產(chǎn)制備和質(zhì)量控制方面的特性。答：1）理化性質(zhì)（從藥物多是蛋白質(zhì)或核酸出發(fā)）：a.相對分子質(zhì)量大；b.結(jié)構(gòu)復(fù)雜；c.穩(wěn)定性差；2）藥理學(xué)作用：a.活性與作用機(jī)制明確；b.作用針對性強(qiáng)；c.毒性低；d.體內(nèi)半衰期短；e.有種屬特異性；f.可產(chǎn)生免疫原性；3）生產(chǎn)制備特性：a.藥物分子在原料中含量低；b.原料中常存在降解目標(biāo)產(chǎn)物的雜質(zhì)；c.制備工藝條件溫和；d.分離純化困難；e.產(chǎn)品易受有害物質(zhì)污染；4）質(zhì)量控制特性：a.質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容的特殊性；b.制造項(xiàng)下的特殊規(guī)定；c.檢定項(xiàng)下的特殊規(guī)定。4.生物技術(shù)制藥的概念和主要研究內(nèi)容與任務(wù)。

答：1）指利用基因工程、細(xì)胞工程等生物技術(shù)的原理和方法，來研究、開發(fā)和生產(chǎn)預(yù)防、治療和診斷疾病的藥物的一門科學(xué)。2）主要研究內(nèi)容與任務(wù)：a.生物制藥技術(shù)的研究、開發(fā)與應(yīng)用；b.利用生物技術(shù)研究、開發(fā)和生產(chǎn)藥物。

第二章：基因工程制藥

思考題

1.簡述基因工程制藥的基本原理和基本流程。

答：1）利用重組DNA技術(shù)將外源基因?qū)氲剿拗骶蛩拗骷?xì)胞進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)和誘導(dǎo)表達(dá)以獲取蛋白質(zhì)藥物的過程稱為基因工程制藥。2）目的基因的獲得、表達(dá)載體的選擇、目的基因與載體的連接、重組DNA轉(zhuǎn)入到宿主細(xì)胞、重組子的篩選與鑒定、工

生物技術(shù)制藥思考題

程菌的發(fā)酵表達(dá)重組蛋白、表達(dá)產(chǎn)物的分離純化、重組蛋白制劑的生產(chǎn)。2.與化學(xué)藥物相比較，基因工程藥物有什么特點(diǎn)？

答：a.基因工程藥物是由活細(xì)胞代謝產(chǎn)生的；b.基因工程藥物的相對分子質(zhì)量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于一般的小分子化學(xué)藥物；c.在制備基因工程藥物時，需要除去宿主蛋白和核酸殘留，同時還要防止其他物質(zhì)的污染，而化學(xué)藥物大多是通過組合合成的，雜質(zhì)是原料殘留及反應(yīng)副產(chǎn)物等。

3.原核與真核表達(dá)體系各有什么優(yōu)缺點(diǎn)？哪些蛋白質(zhì)需要用真核表達(dá)體系？ 答：1）原核表達(dá)體系優(yōu)點(diǎn)：宿主遺傳背景清楚，商品化菌種齊全，方便購買；原核細(xì)胞操作簡便、繁殖快、周期短；大規(guī)模生產(chǎn)成本低，產(chǎn)量較高；下游純化工藝簡單，易于控制，生產(chǎn)效率高；缺點(diǎn)：缺乏蛋白質(zhì)折疊和翻譯后加工系統(tǒng)；分泌能力不足，真核蛋白質(zhì)常形成不溶性的包含體，表達(dá)產(chǎn)物需經(jīng)變性、復(fù)性才恢復(fù)活性；有的表達(dá)系統(tǒng)，如大腸桿菌有內(nèi)毒素，很難除去；大腸桿菌中的表達(dá)不存在信號肽，產(chǎn)品多為胞內(nèi)產(chǎn)物，提取困難。

2）真核表達(dá)系統(tǒng)：優(yōu)點(diǎn)：具有轉(zhuǎn)錄后加工能力，外源基因可以是DNA也可以是cDNA；具有蛋白質(zhì)折疊和翻譯后加工系統(tǒng)，可形成正確折疊、裝配和糖基化等修飾的蛋白質(zhì)；可是重組蛋白分泌表達(dá)，有利于純化；缺點(diǎn)：生長緩慢、操作復(fù)雜、產(chǎn)量較低、生產(chǎn)成本較高等。

3）某些需要修飾的蛋白質(zhì)需要采用真核表達(dá)體系。4.重組蛋白類藥物的質(zhì)量控制要考慮哪幾個方面? 答：蛋白質(zhì)含量測定、純度檢查、理化性質(zhì)的鑒定（分子量、等電點(diǎn)、序列、肽圖、二硫鍵、氨基酸組成）、生物學(xué)活性鑒定、內(nèi)毒素分析、宿主蛋白與核酸殘留分析。5.基因工程藥物如何提高其療效？今后的發(fā)展趨勢有哪些？

答：1）提高蛋白質(zhì)藥物的穩(wěn)定性；減少蛋白質(zhì)藥物的免疫原性；延長半衰期；提高組織的特異性。

2）提高基因工程藥物的產(chǎn)量；一些現(xiàn)在還沒有使用基因工程的手段的藥物，實(shí)現(xiàn)基因工程化生產(chǎn)；構(gòu)建突變體，改造已知的藥物，增強(qiáng)療效，減少臨床上療效弱、易產(chǎn)生抗性等不足。

第三章：動物細(xì)胞工程制藥

思考題

1.離體培養(yǎng)的動物細(xì)胞有哪些類型？答：貼壁細(xì)胞、懸浮細(xì)胞和兼性貼壁細(xì)胞。

生物技術(shù)制藥思考題

2.生產(chǎn)用動物細(xì)胞有哪些種類？各有何特點(diǎn)？

答：1）原代細(xì)胞：直接取自動物組織器官,經(jīng)過粉碎消化而獲得的細(xì)胞懸液。需要大量動物，費(fèi)錢、費(fèi)勞力。2）傳代細(xì)胞系：染色體組型是2n核型；貼壁依賴，接觸抑制；可傳代培養(yǎng)50代；無致癌性。3）轉(zhuǎn)化細(xì)胞系：轉(zhuǎn)化過程可以是自發(fā)的和人工的，也可從腫瘤組織中獲得；具備無限的生命力；較短的倍增時間；較低的培養(yǎng)條件要求；適合于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的要求；基因工程藥物表達(dá)的宿主細(xì)胞，主要是轉(zhuǎn)化細(xì)胞。4）工程細(xì)胞系：利用細(xì)胞融合技術(shù)或基因工程技術(shù)對轉(zhuǎn)化細(xì)胞系的遺傳物質(zhì)進(jìn)行修飾改造或重組，獲得的具有穩(wěn)定遺傳特性的細(xì)胞系。

3.常用的動物細(xì)胞培養(yǎng)基有哪幾類？答：天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基及無血清培養(yǎng)基。4.動能細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)有哪幾種方式？

答：懸浮培養(yǎng)法、微載體培養(yǎng)法、多孔載體培養(yǎng)法、微囊化培養(yǎng)法、中空纖維培養(yǎng)法。5.利用動物細(xì)胞生產(chǎn)的藥物主要有哪些？

答：疫苗、單克隆抗體、激素、淋巴因子、多肽生長因子、酶類等。

第四章：抗體工程制藥

思考題

1.傳統(tǒng)的鼠抗體在治療應(yīng)用上有哪些局限？

答：傳統(tǒng)的鼠抗體在人體中反復(fù)使用會出現(xiàn)人抗鼠抗體反應(yīng)（HAMA），導(dǎo)致抗體在人體內(nèi)會迅速被清除，半衰期縮短，甚至出現(xiàn)出現(xiàn)嚴(yán)重的不良反應(yīng)。2.如何對鼠源性單抗進(jìn)行改造？

答：將抗體的Fc段用人源替換，僅保留CDR區(qū)（超可變區(qū)）是鼠源的，即為構(gòu)造成嵌合抗體；或者生產(chǎn)全人源化抗體。3.如何制備雜交瘤細(xì)胞？

答：用免疫原與免疫小鼠，從小鼠體內(nèi)獲得淋巴B細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，然后與骨髓瘤細(xì)胞一起混合，使用聚乙二醇誘導(dǎo)細(xì)胞融合，將融合后的細(xì)胞混合液在HAT選擇性培養(yǎng)基上生長，在培養(yǎng)基上生長的即為雜交瘤細(xì)胞，進(jìn)行抗體檢測和克隆化培養(yǎng)，可以獲得既能夠產(chǎn)生單一性抗體，又能夠無限增殖的雜交瘤細(xì)胞。4.在制備單抗時為什么要進(jìn)行兩次篩選？

答：第一次篩選：獲得淋巴B細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的融合細(xì)胞；第二次篩選：獲得能夠產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。

5.制備單抗時為什么要選用B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合形成雜交細(xì)胞？

生物技術(shù)制藥思考題

答：能夠產(chǎn)生抗體的淋巴B細(xì)胞不能夠無限增殖，而骨髓瘤在體外培養(yǎng)具有無限增殖的特性，但是不能產(chǎn)生抗體，將二者融合，融合細(xì)胞繼承了兩個親代細(xì)胞的特性，形成了能夠產(chǎn)生抗體又能夠無限增殖。

第五章：疫苗及其制備技術(shù)

思考題

1.簡述疫苗的概念、組成及其作用原理。

答：1）是將病原微生物（如細(xì)菌、立克次氏體、病毒等）及其代謝產(chǎn)物，經(jīng)過人工減毒、滅活或利用基因工程等方法制成的用于預(yù)防傳染病的自動免疫制劑。2）組成：具有免疫保護(hù)性的抗原，如蛋白質(zhì)、多肽、多糖及核酸等，與免疫佐劑混合制成。3）當(dāng)機(jī)體通過注射或口服等途徑接種疫苗后，疫苗中的抗原分子就會發(fā)生免疫原性作用，刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生高效價特異性的免疫保護(hù)物質(zhì)，如特異性抗體、免疫細(xì)胞及細(xì)胞因子等，當(dāng)機(jī)體再次接觸到相同的抗原時候，機(jī)體的免疫系統(tǒng)便會依循免疫記憶，迅速制造出更多的保護(hù)物質(zhì)來阻斷病原菌的入侵，從而使機(jī)體獲得針對病原體特異性的免疫力，使其免受侵害而得到保護(hù)。

2.傳統(tǒng)的滅活疫苗和減毒活疫苗在實(shí)際應(yīng)用中存在哪些局限？

答：傳統(tǒng)的減毒活疫苗，如果減毒程度不夠，在使用時有致病的可能性，過分減毒又會使得免疫原性不足或喪失，失去活疫苗的效力。滅活疫苗常常需要多次接種，抗體滴度隨時間而下降。

3.簡述基因工程亞單位疫苗的主要特點(diǎn)及制備方法。

答：1）優(yōu)點(diǎn)：產(chǎn)量高、純度高、安全性好，用于難以培養(yǎng)或具有潛在致癌性病毒的疫苗制備。缺點(diǎn)：生產(chǎn)成本比較高（純化），產(chǎn)品研發(fā)成本高，免疫接種成本高（多次注射），與傳統(tǒng)疫苗相比，免疫效果較差。

2）制備方法：在分離出病原體特異抗原編碼基因的基礎(chǔ)上，將外源基因轉(zhuǎn)入另外一個非致病微生物或細(xì)胞中表達(dá)，然后通過分離純化而獲得特異的蛋白質(zhì)。表達(dá)系統(tǒng)有大腸桿菌、酵母菌和高等植物。

4.何為治療性疫苗？請比較治療性疫苗與預(yù)防性疫苗的主要區(qū)別？

答：1）治療性疫苗是指在已感染病原微生物或已患有某些疾病的機(jī)體中，通過誘導(dǎo)特異性的免疫應(yīng)答，達(dá)到治療或防止疾病惡化的天然、人工合成或用基因重組技術(shù)表達(dá)的產(chǎn)品或制品。

2）治療性疫苗兼有治療和預(yù)防的作用，當(dāng)機(jī)體已經(jīng)處于感染或患病狀態(tài)時，治療性疫苗

生物技術(shù)制藥思考題

會誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，治療疾病。預(yù)防性疫苗是使機(jī)體處于免疫保護(hù)狀態(tài)，當(dāng)病原菌再次入侵時候，依循免疫記憶，會迅速做出免疫應(yīng)答，阻止病原菌的入侵。5.設(shè)計并簡述禽流感H5N1滅活疫苗的主要制備流程。答：P122

第二篇：生物技術(shù)制藥 第二版 課后思考題及答案(全)

1.生物技術(shù)制藥分為哪些類型？ 生物技術(shù)制藥分為四大類：

（1）應(yīng)用重組DNA技術(shù)(包 括基因工程技術(shù)、蛋白質(zhì)工程技術(shù))制造的基因重組多肽，蛋白質(zhì)類治療劑。

（2）基因藥物，如基因治療劑，基因疫苗，反義藥物和核酶等（3）來自動物、植物和微生物的天然生物藥物（4）合成與部分合成的生物藥物 2．生物技術(shù)制藥具有什么特征？

（1）分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜（2）具有種屬特異性

（3）治療針對性強(qiáng)，療效高（4）穩(wěn)定性差（5）基因穩(wěn)定性（6）免疫原性（7）體內(nèi)的半衰期短（8）受體效應(yīng)（9）多效性（10）檢驗(yàn)的特殊性

3.生物技術(shù)制藥中有哪些應(yīng)用？ 應(yīng)用主要有：

（1）基因工程制藥：包括基因工程藥物品種的開發(fā)，基因工程疫苗，基因工程抗體，基因診斷與基因治療，應(yīng)用基因工程技術(shù)建立新藥的篩選模型，應(yīng)用基因工程技術(shù)改良菌種，產(chǎn)生新的微生物藥物，基因工程技術(shù)在改進(jìn)藥物生產(chǎn)工藝中的應(yīng)用，利用轉(zhuǎn)基因動植物生產(chǎn)蛋白質(zhì)類藥物

（2）細(xì)胞工程制藥：包括單克隆抗體，動物細(xì)胞培養(yǎng)，植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝 產(chǎn)物

（3）酶工程制藥（4）發(fā)酵工程制藥 4.基因工程藥物制造的主要程序有哪些？

基因工程藥物制造的主要步驟有：目的基因的克隆，構(gòu)造DNA重組體，構(gòu)造工程菌，目的基因的表達(dá)，外源基因表達(dá)產(chǎn)物的分離純化產(chǎn)品的檢驗(yàn) 5.影響目的的基因在大腸桿菌中表達(dá)的因素有哪些？

（1）外源基因的計量

（2）外源基因的表達(dá)效率：a、啟動子的強(qiáng)弱 b、核糖體的結(jié)合位點(diǎn) c、SD序列和起始密碼的間距 d、密碼子組成（3）表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性（4）細(xì)胞的代謝付荷（5）工程菌的培養(yǎng)條件

6.質(zhì)粒不穩(wěn)定分為哪兩類，如何解決質(zhì)粒不穩(wěn)定性？ 質(zhì)粒不穩(wěn)定分為分裂分為分裂不穩(wěn)定和結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定。質(zhì)粒的分裂不穩(wěn)定是指工程菌分裂時出現(xiàn)一定比例不含質(zhì)粒的子代菌的現(xiàn)象；質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定是DNA從質(zhì)粒上丟失或堿基重排，缺失所致工程菌性能的改變。提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法如下：（1）選擇合適的宿主細(xì)菌2）選擇合適的載體（3）選擇壓力

（4）分階段控制培養(yǎng)（5）控制培養(yǎng)條件（6）固定化

7.影響基因工程菌發(fā)酵的因素有哪些？如何控制發(fā)酵的各種參數(shù)？

影響因素：（1）培養(yǎng)基（2）接種量（3）溫度（4）溶解氧（5）誘導(dǎo)時機(jī)的影響（6）誘導(dǎo)表達(dá)程序（7）PH值

8.什么是高密度發(fā)酵？影響高密度發(fā)酵的因素有哪些？可采取哪些方法來實(shí)現(xiàn)高密度發(fā)酵？

高密度發(fā)酵：是指培養(yǎng)液中工程菌的菌體濃度在50gDCW/L以上，理論上的最高值可達(dá)200gDCW/L 影響因素：（1）培養(yǎng)基（2）溶氧濃度（3）PH(4)溫度（5）代謝副產(chǎn)物 實(shí)現(xiàn)高密度發(fā)酵的方法：

（1）改進(jìn)發(fā)酵條件：a、培養(yǎng)基 b、建立流加式培養(yǎng)基 c、提高供養(yǎng)能力

（2）構(gòu)建出產(chǎn)乙酸能力低的工程菌宿主菌：a、阻斷乙酸產(chǎn)生的主要途徑 b、對碳代謝流 進(jìn)行分流 c、限制進(jìn)入糖酵解途徑的碳代謝流 d、引入血紅蛋白基因（3）構(gòu)建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌 9.分離純化常用的色譜分離方法有哪些?它們的原理是什么? 方法有離子交換色譜、疏水色譜、反相色譜、親和色譜、凝膠過濾色譜及高壓液相色譜。（1）離子交換色譜IEC：是以離子交換劑為固定相，依據(jù)流動相中的組分離子與交換劑 上的平衡離子進(jìn)行可逆交換時的結(jié)合力大小的差別而進(jìn)行分離的一種層析方法。

（2）疏水層析HIC：是利用蛋白質(zhì)表面的疏水區(qū)與固定相上疏水性基團(tuán)相互作用力的差 異，對蛋白質(zhì)組進(jìn)行分離的層析方法。

（3）親和層析AC：是利用固定化配體與目的蛋白質(zhì)之間的非常特異的生物親和力進(jìn)行 吸附，這種結(jié)合既是特異的，又是可逆的，改變條件可以使這種結(jié)合解除。

（4）凝膠過濾層析：以多孔性凝膠填料為固定相，按分子大小對溶液中各組分進(jìn)行分離 的液相層析方法。

10.對由基因重組技術(shù)所獲得的蛋白質(zhì)藥物進(jìn)行鑒定時，常做哪些項(xiàng)目分析？

基因工程藥物質(zhì)量控制主要包括以下幾點(diǎn)：產(chǎn)品的鑒別，純度，活性，安全性，穩(wěn)定性和一致性

項(xiàng)目分析主要有：（1）生物活性測定（2）理化性質(zhì)鑒定（3）蛋白質(zhì)含量鑒定（4）蛋白質(zhì)純度分析（5）雜志檢測（6）穩(wěn)定性考察（7）產(chǎn)品一致性的保證 11.離體培養(yǎng)的動物細(xì)胞分為哪些類型? 分為三類：

（1）貼壁細(xì)胞：細(xì)胞生長必須有可以貼附的支持物表面，細(xì)胞依靠自身分泌的培養(yǎng)基中 提供的貼附因子才能在該表面上生長增殖。

（2）懸浮細(xì)胞：細(xì)胞的生長不依賴支持物表面，可在培養(yǎng)液中懸浮狀態(tài)生長（3）兼性貼壁細(xì)胞：既可 貼附于支持物表面生長，又在懸浮生長。12.生產(chǎn)用的動物細(xì)胞有哪些種類？它們各有什么特點(diǎn)？

（1）生產(chǎn)用的動物細(xì)胞的種類：原代細(xì)胞系、二倍體細(xì)胞系、轉(zhuǎn)化細(xì)胞、融合細(xì)胞系、重組工程細(xì)胞系

（2）它們各自的特點(diǎn)：

（A）二倍體細(xì)胞系的特點(diǎn)：

①染色體組型仍然是2n的核型

②具有明顯的貼壁依賴和接觸抑制的特性

③只有有限的增值能力，一般可連續(xù)傳代培養(yǎng)50代 ④物致瘤性

（B）轉(zhuǎn)化細(xì)胞系的特點(diǎn)：

①具有無限生命力 ②倍增時間較短

③對培養(yǎng)條件和生長因子等要求較低

（C）融合細(xì)胞系的特點(diǎn)：

①可使不同的動物和動物細(xì)胞融合 ②可是動物和植物細(xì)胞融合

13.常用的培養(yǎng)動物細(xì)胞的培養(yǎng)基的種類有哪些？

（1）天然培養(yǎng)基（2）合成培養(yǎng)基（3）無血清培養(yǎng)基 14.如何進(jìn)行動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)？

大規(guī)模培養(yǎng)的方法：（1）懸浮細(xì)胞（2）貼壁細(xì)胞

（3）貼壁—懸浮細(xì)胞：a、微載體培養(yǎng) b、包埋和微囊培養(yǎng) c、結(jié)團(tuán)培養(yǎng) 大規(guī)模培養(yǎng)的操作方式：（1）分批式操作（2）半連續(xù)式操作（3）灌流式操作 15.動物細(xì)胞生物反應(yīng)器必須具備哪些基本要求？有哪些類型？特定是什么？

動物細(xì)胞反應(yīng)器具備的基本要求：

（1）制造生物反應(yīng)器所采用的一切材料，尤其是與培養(yǎng)基，細(xì)胞直接接觸的材料，對細(xì) 胞必須是無毒性的。

（2）生物反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)必須使之具有良好的傳質(zhì)、傳熱和混合的性能（3）密封性良好，可避免一切外采的不需要的微生物污染。

（4）對培養(yǎng)基環(huán)境中多種物理化學(xué)參數(shù)能自動檢測和調(diào)節(jié)控制，控制的精度高，而且能 保持環(huán)境質(zhì)量的均一。

（5）可長期連續(xù)運(yùn)轉(zhuǎn)，這對于培養(yǎng)動物細(xì)胞的生物反應(yīng)器顯得尤其重要。（6）容器加工制造時要求內(nèi)面光滑，無死角，以減少細(xì)胞或微生物的沉積。（7）拆裝，連結(jié)和清潔方便，能耐高壓蒸汽消毒，便于操作維修（8）設(shè)備成本盡可能低。

反應(yīng)器類型及特點(diǎn)：

（1）攪拌罐式生物反應(yīng)器：主要用于是懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，微載體培養(yǎng)，微囊和巨載體培養(yǎng) 以及結(jié)團(tuán)培養(yǎng)

（2）氣升式生物反應(yīng)器：氣體通過裝在罐底的噴管進(jìn)入 反應(yīng)器的導(dǎo)流管，致使該部液體 的密度小于導(dǎo)流管外部的液體形成循環(huán)流。

（3）中空纖維式生物反應(yīng)器：占地空間小，產(chǎn)品產(chǎn)量、質(zhì)量高，生產(chǎn)成本低，不能重復(fù) 使用，不能耐高壓蒸汽滅菌，需用環(huán)氧乙烷或其它消毒劑滅菌，難以取樣檢測。

（4）透析袋或膜式生物反應(yīng)器：可使細(xì)胞達(dá)到高密度，又可隨意組合進(jìn)行操作，對產(chǎn)品 進(jìn)行濃縮純化。

（5）固定床或流化床生物反應(yīng)器：結(jié)構(gòu)簡單，裝填材料易得。16.動物細(xì)胞制藥有哪些新進(jìn)展？

①改進(jìn)表達(dá)載體，提高表達(dá)水平和產(chǎn)量

②利用代謝工程改進(jìn)培養(yǎng)工藝 ③抑制細(xì)胞凋亡，延長培養(yǎng)周期 ④采用糖基化工程，提高產(chǎn)品質(zhì)量 ⑤轉(zhuǎn)基因動物的研究 ⑥組織工程研究

17.什么是單克隆抗體？單克隆抗體有哪些不足？

單克隆抗體：是針對一個抗原決定簇的抗體，又是單一的B淋巴細(xì)胞克隆產(chǎn)生的抗體。不足：

（1）單克隆抗體均是鼠源性抗體，應(yīng)用于人體內(nèi)可產(chǎn)生人抗鼠抗體，加速了排斥反應(yīng)，在人體內(nèi)半衰期只有5-6h，難以維持有效藥物作用靶組織時間。

（2）完整的抗體分子，即Ig的相對分子質(zhì)量過大，難以穿透實(shí)體腫瘤組織，達(dá)不到有 效治療濃度。

18如何制備雜交瘤細(xì)胞？

將兩個細(xì)胞（例如 B淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞）通過誘導(dǎo)融合形成雜交細(xì)胞，具體操作時為了提高成功率會用多個細(xì)胞同時雜交，然后篩選出目的細(xì)胞，再進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)使其有絲分裂而增值，得到大量目的細(xì)胞（雜交瘤細(xì)胞）。

19．基因工程抗體有哪些類型？其特性和制備方法有什么不同？

基因工程抗體主要包括嵌合抗體、人源化抗體、完全人源抗體、單鏈抗體、雙特異性抗體等。（1）嵌合抗體 嵌合抗體（chimeric atibody）是最早制備成功的基因工程抗體。它是由鼠源性抗體的 V 區(qū)基因與人抗體的 C 區(qū)基因拼接為嵌合基因，然后插入載體，轉(zhuǎn)染骨髓瘤組織表達(dá)的抗體分子。因其減少了鼠源成分，從而降低了鼠源性抗體引起的不良反應(yīng)，并有助于提高療效。

（2）人源性抗體 是將人抗體的 CDR 代之以鼠源性單克隆抗體的 CDR，由此形成的抗體，鼠源性只占極少，稱為人源化抗體。

（3）完全人源化抗體 采用基因敲除術(shù)將小鼠 Ig 基因敲除，代之以人 Ig 基因，然后用 Ag 免疫小鼠，再經(jīng)雜交瘤技術(shù)即可產(chǎn)生大量完全人源化抗體。

（4）單鏈抗體 是將 Ig 的 H 鏈和 L 鏈的 V 區(qū)基因相連，轉(zhuǎn)染大腸桿菌表達(dá)的抗體分子，又稱單鏈 FV（single chain fragment of variable region,sFv）。SFv 穿透力強(qiáng)，易于進(jìn)入局部組織發(fā)揮作用。

（5）雙特異性抗體 將識別效應(yīng)細(xì)胞的抗體和識別靶細(xì)胞的抗體聯(lián)結(jié)在一起，制成雙功能性抗體，稱為雙特異性抗體。如由識別腫瘤抗原的抗體和識別細(xì)胞毒性免疫效應(yīng)細(xì)胞（CTL 細(xì)胞、NK 細(xì)胞、LAK 細(xì)胞）表面分子的抗體（CD3 抗體或 CD16 抗體）制成的雙特異性抗體，有利于免疫效應(yīng)細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤作用。20.抗體治療藥物有哪些？

（1）放射性同位素標(biāo)記的抗體治療藥物（2）抗癌藥物偶聯(lián)的抗體藥物（3）毒素偶聯(lián)的抗體藥物

21.抗體診斷試劑有哪些類型？（1）血清學(xué)鑒定用的抗體試劑（2）免疫標(biāo)記用的抗體試劑（3）導(dǎo)向診斷藥物

（4）CD單克隆抗體系列

22.單克隆抗體制備的基本原理與過程？有什么意義？ 原理：

B淋巴細(xì)胞在抗原的刺激下，能夠分化、增殖形成具有針對這種抗原分泌特異性抗體的能力。B細(xì)胞的這種能力和量是有限的，不可能持續(xù)分化增殖下去，因此產(chǎn)生免疫球蛋白的能力也是極其微小的。將這種B細(xì)胞與非分泌型的骨髓瘤細(xì) 胞融合形成雜交瘤細(xì)胞，再進(jìn)一步克隆化，這種克隆化的雜交瘤細(xì)胞是既具有瘤的無限生長的能力，又具有產(chǎn)生特異性抗體的B淋巴細(xì)胞的能力，將這種克隆化的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)或注入小鼠體內(nèi)即可獲得大量的高效價、單一的特異性抗體。這種技術(shù)即稱為單克隆抗體技術(shù)。過程

1）免疫脾細(xì)胞的制備 制備單克隆抗體的動物多采用純系 Balb/c小鼠。免疫的方法取決于所用抗原的性質(zhì)。免疫方法同一般血清的制備，也可采用脾內(nèi)直接免疫法。

2）骨髓瘤細(xì)胞的培養(yǎng)與篩選 在融合前，骨髓瘤細(xì)胞應(yīng)經(jīng)過含8-AG的培養(yǎng)基篩選，防止細(xì)胞發(fā)生突變恢復(fù)HGPRT的活性（恢復(fù)HGPRT的活性的細(xì)胞不能在含8-AG的培養(yǎng)基中存活）。骨髓瘤細(xì)胞用10%小牛血清的培養(yǎng)液在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，融合前24h換液一次，使骨髓瘤細(xì)胞處于對數(shù)生長期。3）細(xì)胞融合的關(guān)鍵: 1技術(shù)上的誤差常常導(dǎo)致融合的失敗。例如，供者淋巴細(xì)胞沒有查到免疫應(yīng)答。這必然要失敗的。

2融合試驗(yàn)最大的失敗原因是污染，融合成功的關(guān)鍵是提供一個干凈的環(huán)境，以及適宜的無菌操作技術(shù)。4）陽性克隆的篩選 應(yīng)盡早進(jìn)行。通常在融合后10天作第一次檢測，過早容易出現(xiàn)假陽性。檢測方法應(yīng)靈敏、準(zhǔn)確、而且簡便快速。具體應(yīng)用的方法應(yīng)根據(jù)抗原的性質(zhì)，以及所需單克隆抗體的功能進(jìn)行選擇。常用的方法有 RIA法、ELISA法和免疫熒光法等。其中ELISA法最簡便，RIA法最準(zhǔn)確。陽性克隆的篩選應(yīng)進(jìn)行多次，均陽性時才確定為陽性克隆進(jìn)行擴(kuò)增。5）克隆化 克隆化的目的是為了獲得單一細(xì)胞系的群體?？寺』瘧?yīng)盡早進(jìn)行并反復(fù)篩選。這是因?yàn)槌跗诘碾s交瘤細(xì)胞是不穩(wěn)定的，有丟失染色體的傾向。反復(fù)克隆化后可獲得穩(wěn)定的雜交瘤細(xì)胞株?？寺』姆椒ê芏?，而最常用的是有限稀釋法。（1）顯微操作法：在顯微鏡下取單細(xì)胞，然后進(jìn)行單細(xì)胞培養(yǎng)。這種方法操作復(fù)雜，效率低，故不常用。

（2）有限稀釋法：將對數(shù)生長期的雜交瘤細(xì)胞用培養(yǎng)液作一定的稀釋后，按每孔1個細(xì)胞接種在培養(yǎng)皿中，細(xì)胞增值后成為單克隆細(xì)胞系。第一次克隆化時加一定量的飼養(yǎng)細(xì)胞。由于第一次克隆化生長的細(xì)胞不能保證單克隆化，所以為獲得穩(wěn)定的單克隆細(xì)胞株需經(jīng)2～3次的再克隆才成。應(yīng)該注意的是，每次克隆化過程中所有有意義的細(xì)胞都應(yīng)冷凍保存，以便重復(fù)檢查，避免丟失有意義的細(xì)胞。（3）軟瓊脂法：將雜交瘤細(xì)胞稀釋到一定密度，然后與瓊脂混懸。在瓊脂中的細(xì)胞不能自由移動，彼此互不相混，從而達(dá)到單細(xì)胞培養(yǎng)的目的。但此法不如有限稀釋法好。

（4）熒光激光細(xì)胞分類法：用抗原包被的熒光乳膠微球標(biāo)記雜交瘤細(xì)胞，然后根據(jù)抗原與雜交瘤細(xì)胞結(jié)合的特異性選出細(xì)胞，并進(jìn)行單細(xì)胞培養(yǎng)。6）細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇7）大規(guī)模單克隆抗體的制備 選出的陽性細(xì)胞株應(yīng)及早進(jìn)行抗體制備，因?yàn)槿诤霞?xì)胞隨培養(yǎng)時間延長，發(fā)生污染、染包體丟失和細(xì)胞死亡的機(jī)率增加。抗體制備有兩種方法。一是增量培養(yǎng)法，即將雜交瘤細(xì)胞在體外培養(yǎng)，在培養(yǎng)液中分離單克隆抗體。該法需用特殊的儀器設(shè)備，一般應(yīng)用無血清培養(yǎng)基，以利于單克隆抗體的濃縮和純化。最普遍采用的是小鼠腹腔接種法。選用BALB/c小鼠或其親代小鼠，先用降植烷或液體石蠟行小鼠腹腔注射，一周后將雜交瘤細(xì)胞接種到小鼠腹腔中去。通常在接種一周后即有明顯的腹水產(chǎn)生，每只小鼠可收集5～10ml的腹水，有時甚至超過40ml。該法制備的腹水抗體含量高，每毫升可達(dá)數(shù)毫克甚至數(shù)十毫克水平。此外，腹水中的雜蛋白也較少，便于抗體的純化。意義：

用于以下各種生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)并具有醫(yī)用價值（1）沉淀反應(yīng)：Precipitation reaction（2）凝集實(shí)驗(yàn)：haemaglutination（3）放射免疫學(xué)方法檢測免疫復(fù)合物

（4）流式細(xì)胞儀：用于細(xì)胞的分型和細(xì)胞分離。（5）ELISA 等免疫學(xué)檢測（6）BIAcore biosensor:檢測Ab-Ag或與蛋白的 親和力。(7)免疫印記（western blotting)（8）免疫沉淀：（9）親和層析：分離蛋白質(zhì)（10）磁珠分離細(xì)胞（11）臨床疾病的診斷和治療；

23.植物細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基由哪些主要成分組成？（1）無機(jī)鹽（2）碳源（3）植物生長調(diào)節(jié)劑（4）有機(jī)氮源（5）維生素 24.植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的主要方法及其特點(diǎn)是什么？

（1）成批培養(yǎng)法：將培養(yǎng)基一次性地加入反應(yīng)器中，接種，培養(yǎng)一定時間后收獲細(xì)胞的操作方式。

特點(diǎn)：操作強(qiáng)度低，設(shè)備簡單，容易發(fā)生污染，通氣受限制。

（2）半連續(xù)培養(yǎng)法：在反應(yīng)器中投料和接種培養(yǎng)一段時間后，將部分培養(yǎng)液和 新鮮培養(yǎng) 液進(jìn)行交換的培養(yǎng)方法。

（3）連續(xù)培養(yǎng)法：是利用連續(xù)培養(yǎng)反應(yīng)器，在投料和接種培養(yǎng)一段時間后，以一定速度 采集細(xì)胞和培養(yǎng)液，并以同樣速度供給誒新鮮培養(yǎng)基以使細(xì)胞生長環(huán)境長期恒定的方法。（4）固定化培養(yǎng)法：將細(xì)胞固定于尼龍網(wǎng)套內(nèi)，或固定于中空纖維有網(wǎng)狀多孔板，尼龍 套和中空纖維膜上，放入培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，或連續(xù)流入新鮮培養(yǎng)液，進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)及連續(xù)收集培養(yǎng)產(chǎn)物，也可通入凈化空氣以代替攪拌。

25.影響植物細(xì)胞積累次級代謝產(chǎn)物的因素有哪些？（1）生物條件（2）物理?xiàng)l件（3）化學(xué)條件（4）工業(yè)培養(yǎng)條件

26.各種植物細(xì)胞培養(yǎng)的生物反應(yīng)器的特點(diǎn)是什么？

（1）機(jī)械攪拌式生物反應(yīng)器：有較大的操作范圍，混合程度高，適應(yīng)性廣，剪切力大，容易損傷細(xì)胞。

（2）鼓泡式生物反應(yīng)器：優(yōu)于機(jī)械攪拌式反應(yīng)器。但由于鼓泡式反應(yīng)器對氧的利用率較低，如果用較大通氣量，則產(chǎn)生的剪切力會損傷細(xì)胞。

（3）氣升式生物反應(yīng)器：廣泛應(yīng)用于植物細(xì)胞培養(yǎng)的研究和生產(chǎn)，最高細(xì)胞濃度和最短倍增時間可從氣升罐中得到。

（4）轉(zhuǎn)鼓式生物反應(yīng)器：生長速率高，其氧的傳遞及剪切力對細(xì)胞的傷害水平方面均優(yōu)于氣升式反應(yīng)器。

（5）固定化細(xì)胞反應(yīng)器：可保護(hù)細(xì)胞免受剪切，可長時間重復(fù)使用，易于實(shí)現(xiàn) 細(xì)胞的高密度培養(yǎng)，細(xì)胞接觸良好，易于分化，有利于次級代謝產(chǎn)物的合成，減少細(xì)胞的遺傳不穩(wěn)定 性，易于實(shí)現(xiàn)連續(xù)化操作。

27.植物細(xì)胞培養(yǎng)有哪些新進(jìn)展？

（1）誘導(dǎo)了在植物細(xì)胞工程研究中的應(yīng)用（2）前體飼喂（3）兩相法培養(yǎng)

（4）轉(zhuǎn)基因技術(shù)在次級代謝產(chǎn)物生產(chǎn)中的應(yīng)用（5）植物身為轉(zhuǎn)化技術(shù)與生物制藥 28.酶工程主要研究內(nèi)容是什么？

（1）酶的分離、純化、大批量生產(chǎn)及應(yīng)用。（2）酶和細(xì)胞的固定化及酶反應(yīng)器的研究。（3）酶生產(chǎn)中基因工程技術(shù)的應(yīng)用及遺傳修飾酶研究。

（4）酶的分子改造與化學(xué)修飾以及酶的結(jié)構(gòu)與功能之間關(guān)系的研究。（5）有機(jī)相中酶反應(yīng)的研究。

（6）酶的抑制劑，激活劑的開發(fā)及應(yīng)用與研究。（7）抗體酶，核酸酶的研究。（8）模擬酶，合成酶及酶分子的人工設(shè)計、合成的研究。

29.固定化酶回合固定化細(xì)胞的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)各是什么？怎樣制備？ 固定化酶的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn):（1）同一批固定化酶能在工藝流程中重復(fù)多次地使用；（2）固定化后，和反應(yīng)物分開，有利于控制生產(chǎn)過程，同時也省去了熱處 理使酶失活的步驟；

（3）穩(wěn)定性顯著提高；

（4）可長期使用，并可預(yù)測衰變的速度；（5）提供了研究酶動力學(xué)的良好模型。

固定化細(xì)胞的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)：

1.使用固定化細(xì)胞省去了酶的分離過程，顯著降低了成本。2.2.固定化細(xì)胞為多酶系統(tǒng)，不需要輔助因子

3.增加了細(xì)胞對不利環(huán)境的耐逆性，可重復(fù)使用。4.增加了酶的穩(wěn)定性。固定化酶制備：（1）吸附法：

過載體表面和酶分子表面間的次級鍵相互作用而達(dá)到固定目的的方法，是固定化中最簡單的方法。酶與載體之間的親和力是范德華力、疏水相互作用、離子鍵和氫鍵等。（2）包埋發(fā)：

將酶包埋在高聚物的細(xì)微凝膠網(wǎng)格中或高分子半透膜內(nèi)的固定化方法。前者又稱為凝膠包埋法，酶被包埋成網(wǎng)格型；后者又稱為微膠囊包埋法，酶被包埋成微膠囊型。（3）共價鍵結(jié)合法：

將酶與聚合物載體以共價鍵結(jié)合的固定化方法。（4）交聯(lián)法

使用雙功能或多功能試劑使酶分子之間相互交聯(lián)呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的固定化方法。由于酶蛋白的功能團(tuán)，如氨基、酚基、巰基和咪唑基，參與此反應(yīng)，所以酶的活性中心構(gòu)造可能受到影響，而使酶失活明顯。但是盡可能地降低交聯(lián)劑濃度和縮短反應(yīng)時間將有利于固定化酶活力的提高。固定化細(xì)胞的制備： 一種固定化細(xì)胞的制備方法，包括以下步驟： a．選用甲烷利用細(xì)菌

Methylomonas sp．GYJ3，在可供給微生物能量的甲烷和空氣的混合氣體中，輔以無機(jī)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)； b．培養(yǎng)好的菌體細(xì)胞離心后用無機(jī)培養(yǎng)基懸浮，加入到硅酸鈉溶液和鹽酸溶液制成的溶膠中，待溶膠凝固變成凝膠后，就制得了包埋的細(xì)胞，將包埋細(xì)胞置于低溫環(huán)境中以增加包埋強(qiáng)度； c．用磷酸鹽緩沖液洗去包埋細(xì)胞的雜質(zhì)，充入可給微生物提供能量的相應(yīng)的甲烷與空氣的混合氣體，在搖床上培養(yǎng)48－120小時。

30.為什么要對酶進(jìn)行化學(xué)修飾？

（1）.更好的熱穩(wěn)定性以及抗核酸酶性對于臨床應(yīng)用很重要；（2）提高酶蛋白在體內(nèi)的半衰期；（3）提高酶蛋白的靶向性；（4）提高酶蛋白效力。31.何謂分子印跡？分子印跡的應(yīng)用范圍有哪些？

分子印跡：是指制備對某一特定化合物具有選擇性的聚合物的過程。應(yīng)用范圍：

（1）用于化學(xué)仿生傳感器（2）色譜分離（3）固相萃?。?）天然杭體模擬（5）模擬酶催化（6）控緩釋藥物

32.有機(jī)相酶反應(yīng)的定義及其優(yōu)點(diǎn)是什么？

有機(jī)相酶反應(yīng)：是指酶在具有有機(jī)溶劑存在的介質(zhì)中所進(jìn)行對的催化反應(yīng)。優(yōu)點(diǎn)是：（1）增加疏水性底物或產(chǎn)物的溶解度。（2）熱力學(xué)平衡向合成方向移動。（3）可抑制有水劑中分離純化產(chǎn)物。

（4）酶不溶于有機(jī)介質(zhì)，易于回收再利用。（5）容易從低沸點(diǎn)的溶劑中分離純化產(chǎn)物。（6）酶的熱穩(wěn)定性提高，PH的適應(yīng)性擴(kuò)大。（7）無微生物污染。（8）

能測定某介質(zhì)中反應(yīng)時，通過改變?nèi)軇?，能夠控制底物的特異性、區(qū)域選擇性和立體選擇性，并可以催化某些在水中不能進(jìn)行的反應(yīng)。33.何謂人工模擬酶？

人工模擬酶：是指根據(jù)酶的作用機(jī)理，用各種方法人為制造的具有酶性質(zhì)的催化劑。34.發(fā)酵工程的研究內(nèi)容包括哪些？

發(fā)酵工程研究內(nèi)容涉及：菌種的培養(yǎng)和選育、菌的代謝與調(diào)節(jié)、培養(yǎng)基滅菌、通氣攪拌、溶氧、發(fā)酵條件的優(yōu)化、發(fā)酵過程各種參數(shù)與動力學(xué)、發(fā)酵反應(yīng)器的設(shè)計和自動控制、產(chǎn)品的分離純化和精制等。

35.微生物菌種誘變使用的主要誘變劑有哪些？它們的誘變機(jī)制是什么？(1)物理誘變劑：主要有紫外線、X射線、γ射線、快中子、α射線、β射線和超聲波等。（2）化學(xué)誘變劑：金屬離子、一般化學(xué)試劑、生物堿、抗代謝物、生長刺激素、抗生素及高分子化合物、殺菌劑、染料等。

誘變機(jī)制：

1、堿基的類似物誘發(fā)突變

2、改變DNA的化學(xué)結(jié)構(gòu)

3、結(jié)合到DNA分子上誘發(fā)移碼突變

4、紫外線及其他射線引起的DNA分子的變化

36.微生物發(fā)酵主要有哪些方式？各具有什么特點(diǎn)？

（一）分批發(fā)酵：是將全部物料一次投入到反應(yīng)器中，經(jīng)滅菌，接種，經(jīng)過若干時間的發(fā)酵后再將發(fā)酵液一次放出的操作方式。特點(diǎn)：（1）對溫度的要求低，工藝操作簡單；

（2）比較容易解決雜菌污染和菌種退化等問題；

（3）對營養(yǎng)物的利用效率較高，產(chǎn)物濃度也比連續(xù)發(fā)酵要高（4）人力、物力、動力消耗較大；（5）生產(chǎn)周期較長（6）生產(chǎn)效率低

（二）補(bǔ)料分批發(fā)酵：指在微生物分批發(fā)酵過程中，以某種方式向發(fā)酵系統(tǒng)中補(bǔ)加一定物料，但并不連續(xù)地向外放出發(fā)酵液的發(fā)酵技術(shù)，是介于分批發(fā)酵和連續(xù)發(fā)酵之間的一種發(fā)酵技術(shù)。特點(diǎn)：(1)可以解除底物的抑制、產(chǎn)物的反饋抑制和分解代謝物阻遏作用。(2)可以減少菌體生長量，提高有用產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率；(3)菌種的變異及雜菌污染問題易控制；(4)便于自動化控制(三)連續(xù)發(fā)酵：是指以一定的速度向發(fā)酵罐內(nèi)添加新鮮培養(yǎng)基，同時以相同速度流出培養(yǎng)液，從而使發(fā)酵罐內(nèi)的液量維持恒定的發(fā)酵過程。特點(diǎn)：

（1）設(shè)備的體積可以減小；v（2）操作時間短，總的操作管理方便，便于自動化控制；（3）產(chǎn)物穩(wěn)定，人力物力節(jié)省，生產(chǎn)費(fèi)用低

（4）對設(shè)備的合理性和加料設(shè)備的精確性要求甚高；

（5）營養(yǎng)成分的利用較分批發(fā)酵差，產(chǎn)物濃度比分批發(fā)酵低（6）雜菌污染的機(jī)會較多，菌種易因變異而發(fā)生退化。

37.影響發(fā)酵的主要因素有哪些？如何對發(fā)酵過程進(jìn)行控制？

（1）溫度 溫度對微生物的影響是多方面的。首先，溫度影響酶的活性。在最適溫度范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，菌體生長和代謝加快，發(fā)酵反應(yīng)的速率加快。當(dāng)超過最適溫度范圍以后，隨著溫度的升高，酶很快失活，菌體衰老，發(fā)酵周期縮短，產(chǎn)量降低。溫度也能影響生物合成的途徑。例如，金色鏈霉菌在30℃以下時，合成金霉素的能力較強(qiáng)，但當(dāng)溫度超過35℃時，則只合成四環(huán)素而不合成金霉素。此外，溫度還會影響發(fā)酵液的物理性質(zhì)，以及菌種對營養(yǎng)物質(zhì)的分解吸收等。因此，要保證正常的發(fā)酵過程，就需維持最適溫度。但菌體生長和產(chǎn)物合成所需的最適溫度不一定相同。如灰色鏈霉菌的最適生長溫度是37℃，但產(chǎn)生抗生素的最適溫度是28℃。通常，必須通過實(shí)驗(yàn)來確定不同菌種各發(fā)酵階段的最適溫度，采取分段控制。

（2）pH pH能夠影響酶的活性，以及細(xì)胞膜的帶電荷狀況。細(xì)胞膜的帶電荷狀況如果發(fā)生變化，膜的透性也會改變，從而有可能影響微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收及代謝產(chǎn)物的分泌。此外，pH還會影響培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的分解等。因此，應(yīng)控制發(fā)酵液的pH。但不同菌種生長階段和合成產(chǎn)物階段的最適pH往往不同，需要分別加以控制。在發(fā)酵過程中，隨著菌體對營養(yǎng)物質(zhì)的利用和代謝產(chǎn)物的積累，發(fā)酵液的pH必然發(fā)生變化。如當(dāng)尿素被分解時，發(fā)酵液中的NH+4濃度就會上升，pH也隨之上升。在工業(yè)生產(chǎn)上，常采用在發(fā)酵液中添加維持pH的緩沖系統(tǒng)，或通過中間補(bǔ)加氨水、尿素、碳酸銨或碳酸鈣來控制pH。目前，國內(nèi)已研制出檢測發(fā)酵過程的pH電極，用于連續(xù)測定和記錄pH變化，并由pH控制器調(diào)節(jié)酸、堿的加入量。（3）溶解氧 氧的供應(yīng)對需氧發(fā)酵來說，是一個關(guān)鍵因素。從葡萄糖氧化的需氧量來看，1 mol的葡萄糖徹底氧化分解，需6 mol的氧；當(dāng)糖用于合成代謝產(chǎn)物時，1 mol葡萄糖約需1.9 mol的氧。因此，好氧型微生物對氧的需要量是很大的，但在發(fā)酵過程中菌種只能利用發(fā)酵液中的溶解氧，然而氧很難溶于水。在101.32 kPa、25℃時，氧在水中的溶解度為0.26 mmol/L。在同樣條件下，氧在發(fā)酵液中的溶解度僅為0.20 mmol/L。而且隨著溫度的升高，溶解度還會下降。因此，必須向發(fā)酵液中連續(xù)補(bǔ)充大量的氧，經(jīng)攪拌，可以提高氧在發(fā)酵液中的溶解度。

（4）泡沫 在發(fā)酵過程中，通氣攪拌、微生物的代謝過程及培養(yǎng)基中某些成分的分解等，都有可能產(chǎn)生泡沫。發(fā)酵過程中產(chǎn)生一定數(shù)量的泡沫是正?，F(xiàn)象，但過多的持久性泡沫對發(fā)酵是不利的。因?yàn)榕菽瓡紦?jù)發(fā)酵罐的容積，影響通氣和攪拌的正常進(jìn)行，甚至導(dǎo)致代謝異常，因而必須消除泡沫。常用的消泡沫措施有兩類：一類是安裝消泡沫擋板，通過強(qiáng)烈的機(jī)械振蕩，促使泡沫破裂；另一類是使用消泡沫劑。

（5）營養(yǎng)物質(zhì)的濃度 發(fā)酵液中各種營養(yǎng)物質(zhì)的濃度，特別是碳氮比、無機(jī)鹽和維生素的濃度，會直接影響菌體的生長和代謝產(chǎn)物的積累。如在谷氨酸發(fā)酵中，NH+4濃度的變化，會影響代謝途徑(見谷氨酸發(fā)酵)。因此，在發(fā)酵過程中，也應(yīng)根據(jù)具體情況進(jìn)行控制。38.如何克隆抗生素生物合成基因？

在分子水平上提供一種純化和擴(kuò)增特定DNA片段的方法。常含有目的基因，用體外重組方法將它們插入克隆載體，形成重組克隆載體，通過轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)導(dǎo)的方式，引入適合的寄主體內(nèi)得到復(fù)制與擴(kuò)增，然后再從篩選的寄主細(xì)胞內(nèi)分離提純所需的克隆載體，可以得到插入DNA的許多拷貝，從而獲得目的基因的擴(kuò)增。39．基因工程在抗生素生產(chǎn)中有哪些應(yīng)用？ 基因工程技術(shù)在抗生素生產(chǎn)過程中的幾類應(yīng)用 4.1 提高抗生素的產(chǎn)量

4.1.1 增加參與生物合成限速階段基因的拷貝數(shù)

增加生物合成中限速階段酶系基因劑量有可能提高抗生素的產(chǎn)量。抗生素的生物合成基因成簇存在于菌體內(nèi)，包括抗性基因、結(jié)構(gòu)基因、調(diào)節(jié)基因，各基因之間以種種機(jī)制相互制約，相互調(diào)控，配對同步翻譯，通過基因重組修飾可以提高產(chǎn)量?，F(xiàn)已知曉，抗生素的產(chǎn)量與產(chǎn)生對該抗生素的抗性基因密切相關(guān)，因此可以通過外源抗性基因的拷貝數(shù)來提高菌種的抗性水平，達(dá)到提高產(chǎn)量的目的，如卡那霉素的抗性基因—6’-N-乙酞轉(zhuǎn)移酶基因克隆到多拷貝數(shù)質(zhì)粒pIJ702，然后轉(zhuǎn)人卡那霉素產(chǎn)生菌—卡那鏈霉菌ATCC12853中，得到的轉(zhuǎn)化子產(chǎn)卡那霉素能力提高6倍，轉(zhuǎn)人新霉素產(chǎn)生菌—弗氏鏈霉菌ATCC10745，含重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子，產(chǎn)生抗生素能力亦有顯著提高[9]。4.1.2 通過調(diào)節(jié)基因的作用

調(diào)節(jié)基因的作用可以增加或降低抗生素的產(chǎn)量，在許多鏈霉菌中關(guān)鍵的調(diào)節(jié)基因嵌在控制抗生素產(chǎn)生的基因簇中，它常常是抗生素生物合成和自身抗性基因簇的組成部分。正調(diào)節(jié)基因可能通過一些正調(diào)控機(jī)制對結(jié)構(gòu)基因進(jìn)行正向調(diào)節(jié)，加速抗生素的產(chǎn)生。負(fù)調(diào)節(jié)則反之。因此，增加正調(diào)節(jié)基因或降低負(fù)調(diào)節(jié)基因的作用也是一種增加抗生素產(chǎn)量的可行方法。4.2 改善抗生素組分

Hoopwood在1981年提出鏈霉菌之間生物合成基因重組可以產(chǎn)生新抗生素，其后率先利用基因克隆技術(shù)成功地將放線紫紅素產(chǎn)生菌羥化酶基因轉(zhuǎn)人Medennycin產(chǎn)生菌中并使之表達(dá)獲得雜合抗生素Medennycin，將放線紫紅素生物合成途徑基因轉(zhuǎn)移到Granatin產(chǎn)生菌內(nèi)，通過兩個不同鏈霉菌相互作用產(chǎn)生地雜合抗生素Dihydrogranatiylhodin(二氫榴菌紫素)[10]。β-內(nèi)酞胺抗生素是臨床應(yīng)用最廣泛的抗生素，其生物合成途徑研究最徹底，合成基因已被克隆和測序表達(dá)。其中編碼異青霉素N合成酶（IPNS）即環(huán)化酶的研究倍受重視。因?yàn)?，它是前體氨基酸L—α—氨基己二酸(A)、L—擷氨酸(V)、L—半胺氨酸(C)轉(zhuǎn)化為LLD-ACV三膚進(jìn)而環(huán)化為青霉素，頭孢霉素母核的關(guān)鍵酶。由于IPNS的專一性不強(qiáng)，可利用A、V及發(fā)生修飾的ACV類似物進(jìn)行三膚合成并環(huán)化，研究證明采用150種人工合成的三膚底物進(jìn)行體外酶促反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)有80種不同程度地轉(zhuǎn)化產(chǎn)生β-內(nèi)酞胺衍生物，其中1/4有抗菌活性，意味著利用IPNS酶的催化特性，應(yīng)用適當(dāng)三膚底物可以合成全新的件內(nèi)酞胺類抗生素。4.3 改進(jìn)抗生素生產(chǎn)工藝

半合成頭抱菌素7ACA制造法，目前國內(nèi)外仍以化學(xué)裂解法生產(chǎn)。最近國外報道二步酶法生產(chǎn)7ACA。頭孢霉素酞基轉(zhuǎn)移酶不能直接水解頭抱菌素生產(chǎn)7ACA，必須先將頭孢霉素C側(cè)鏈氨基氧化為酮基才能進(jìn)行水解，現(xiàn)已實(shí)現(xiàn)D一氨基酸氧化酶(DAO)編碼基因和頭孢霉素酞基轉(zhuǎn)移酶編碼基因直接轉(zhuǎn)人頭孢霉素C工程菌的構(gòu)建工作，可直接制備7ACA。雖然，目前收率不高，但展現(xiàn)了基因工程的美好前景.

第三篇：生物技術(shù)制藥課后習(xí)題

1.生物技術(shù)制藥分為哪些類型？ 生物技術(shù)制藥分為四大類：

（1）應(yīng)用重組DNA技術(shù)(包 括基因工程技術(shù)、蛋白質(zhì)工程技術(shù))制造的基因重組多肽，蛋白質(zhì)類治療劑。

（2）基因藥物，如基因治療劑，基因疫苗，反義藥物和核酶等（3）來自動物、植物和微生物的天然生物藥物（4）合成與部分合成的生物藥物 2．生物技術(shù)制藥具有什么特征？（1）分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜（2）具有種屬特異性（3）治療針對性強(qiáng)，療效高（4）穩(wěn)定性差（5）基因穩(wěn)定性（6）免疫原性（7）體內(nèi)的半衰期短（8）受體效應(yīng)（9）多效性（10）檢驗(yàn)的特殊性

3.生物技術(shù)制藥中有哪些應(yīng)用？ 應(yīng)用主要有：

（1）基因工程制藥：包括基因工程藥物品種的開發(fā)，基因工程疫苗，基因工程抗體，基因診斷與基因治療，應(yīng)用基因工程技

術(shù)建立新藥的篩選模型，應(yīng)用基因工程技術(shù)改良菌種，產(chǎn)生新的微生物藥物，基因工程技術(shù)在改進(jìn)藥物生產(chǎn)工藝中的應(yīng)用，利用轉(zhuǎn)基因動植物生產(chǎn)蛋白質(zhì)類藥物

（2）細(xì)胞工程制藥：包括單克隆抗體，動物細(xì)胞培養(yǎng)，植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物（3）酶工程制藥（4）發(fā)酵工程制藥

4.基因工程藥物制造的主要程序有哪些？

基因工程藥物制造的主要步驟有：目的基因的克隆，構(gòu)造DNA重組體，構(gòu)造工程菌，目的基因的表達(dá)，外源基因表達(dá)產(chǎn)物的分離純化產(chǎn)品的檢驗(yàn)

5.影響目的的基因在大腸桿菌中表達(dá)的因素有哪些？（1）外源基因的計量

（2）外源基因的表達(dá)效率：a、啟動子的強(qiáng)弱

b、核糖體的結(jié)合位點(diǎn)

c、SD序列和起始密碼的間距

d、密碼子組成（3）表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性（4）細(xì)胞的代謝付荷（5）工程菌的培養(yǎng)條件

6.質(zhì)粒不穩(wěn)定分為哪兩類，如何解決質(zhì)粒不穩(wěn)定性？

質(zhì)粒不穩(wěn)定分為分裂分為分裂不穩(wěn)定和結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定。質(zhì)粒的分裂不穩(wěn)定是指工程菌分裂時出現(xiàn)一定比例不含質(zhì)粒的子代菌的現(xiàn)象；質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定是DNA從質(zhì)粒上丟失或堿基重排，缺失所致工程菌性能 的改變。

提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法如下：（1）選擇合適的宿主細(xì)菌（2）選擇合適的載體（3）選擇壓力（4）分階段控制培養(yǎng)（5）控制培養(yǎng)條件（6）固定化

7.影響基因工程菌發(fā)酵的因素有哪些？如何控制發(fā)酵的各種參數(shù)？ 影響因素：（1）培養(yǎng)基（2）接種量（3）溫度（4）溶解氧（5）誘導(dǎo)時機(jī)的影響（6）誘導(dǎo)表達(dá)程序（7）PH值

8.什么是高密度發(fā)酵？影響高密度發(fā)酵的因素有哪些？可采取哪些方法來實(shí)現(xiàn)高密度發(fā)酵？

高密度發(fā)酵：是指培養(yǎng)液中工程菌的菌體濃度在50gDCW/L以上，理論上的最高值可達(dá)200gDCW/L 影響因素：（1）培養(yǎng)基

（2）溶氧濃度

（3）PH(4)溫度

（5）

代謝副產(chǎn)物

實(shí)現(xiàn)高密度發(fā)酵的方法：

（1）改進(jìn)發(fā)酵條件：a、培養(yǎng)基 b、建立流加式培養(yǎng)基 c、提高供養(yǎng)能力

（2）構(gòu)建出產(chǎn)乙酸能力低的工程菌宿主菌：a、阻斷乙酸產(chǎn)生的主要途徑 b、對碳代謝流進(jìn)行分流 c、限制進(jìn)入糖酵解途徑的碳代謝流 d、引入血紅蛋白基因

（3）構(gòu)建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌

9.分離純化常用的色譜分離方法有哪些?它們的原理是什么? 方法有離子交換色譜、疏水色譜、反相色譜、親和色譜、凝膠過濾色譜及高壓液相色譜。

（1）離子交換色譜IEC：是以離子交換劑為固定相，依據(jù)流動相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進(jìn)行可逆交換時的結(jié)合力大小的差別而進(jìn)行分離的一種層析方法。

（2）疏水層析HIC：是利用蛋白質(zhì)表面的疏水區(qū)與固定相上疏水性基團(tuán)相互作用力的差異，對蛋白質(zhì)組進(jìn)行分離的層析方法。（3）親和層析AC：是利用固定化配體與目的蛋白質(zhì)之間的非常特異的生物親和力進(jìn)行吸附，這種結(jié)合既是特異的，又是可逆的，改變條件可以使這種結(jié)合解除。

（4）凝膠過濾層析：以多孔性凝膠填料為固定相，按分子大小對溶液中各組分進(jìn)行分離的液相層析方法。

10.對由基因重組技術(shù)所獲得的蛋白質(zhì)藥物進(jìn)行鑒定時，常做哪些項(xiàng)

目分析？

基因工程藥物質(zhì)量控制主要包括以下幾點(diǎn)：產(chǎn)品的鑒別，純度，活性，安全性，穩(wěn)定性和一致性 項(xiàng)目分析主要有：（1）生物活性測定（2）理化性質(zhì)鑒定（3）蛋白質(zhì)含量鑒定（4）蛋白質(zhì)純度分析（5）雜志檢測（6）穩(wěn)定性考察（7）產(chǎn)品一致性的保證

11.離體培養(yǎng)的動物細(xì)胞分為哪些類型? 分為三類：

（1）貼壁細(xì)胞：細(xì)胞生長必須有可以貼附的支持物表面，細(xì)胞依靠自身分泌的培養(yǎng)基中提供的貼附因子才能在該表面上生長增殖。

（2）懸浮細(xì)胞：細(xì)胞的生長不依賴支持物表面，可在培養(yǎng)液中懸浮狀態(tài)生長

（3）兼性貼壁細(xì)胞：既可 貼附于支持物表面生長，又在懸浮生長。12.生產(chǎn)用的動物細(xì)胞有哪些種類？它們各有什么特點(diǎn)？ 13.常用的培養(yǎng)動物細(xì)胞的培養(yǎng)基的種類有哪些？（1）天然培養(yǎng)基

（2）合成培養(yǎng)基（3）無血清培養(yǎng)基

14.如何進(jìn)行動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)？ 大規(guī)模培養(yǎng)的方法：（1）懸浮細(xì)胞（2）貼壁細(xì)胞

（3）貼壁—懸浮細(xì)胞：a、微載體培養(yǎng) b、包埋和微囊培養(yǎng) c、結(jié)團(tuán)培養(yǎng)

大規(guī)模培養(yǎng)的操作方式：（1）分批式操作（2）半連續(xù)式操作（3）灌流式操作

15.動物細(xì)胞生物反應(yīng)器必須具備哪些基本要求？有哪些類型？特定是什么？

動物細(xì)胞反應(yīng)器具備的基本要求：

（1）制造生物反應(yīng)器所采用的一切材料，尤其是與培養(yǎng)基，細(xì)胞直接接觸的材料，對細(xì)胞必須是無毒性的。

（2）生物反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)必須使之具有良好的傳質(zhì)、傳熱和混合的性能

（3）密封性良好，可避免一切外采的不需要的微生物污染。（4）對培養(yǎng)基環(huán)境中多種物理化學(xué)參數(shù)能自動檢測和調(diào)節(jié)控制，控制的精度高，而且能保持環(huán)境質(zhì)量的均一。

（5）可長期連續(xù)運(yùn)轉(zhuǎn)，這對于培養(yǎng)動物細(xì)胞的生物反應(yīng)器顯得尤其重要。

（6）容器加工制造時要求內(nèi)面光滑，無死角，以減少細(xì)胞或微生物的沉積。

（7）拆裝，連結(jié)和清潔方便，能耐高壓蒸汽消毒，便于操作維修（8）設(shè)備成本盡可能低。反應(yīng)器類型及特點(diǎn)：

（1）攪拌罐式生物反應(yīng)器：主要用于是懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，微載體培養(yǎng)，微囊和巨載體培養(yǎng)以及結(jié)團(tuán)培養(yǎng)

（2）氣升式生物反應(yīng)器：氣體通過裝在罐底的噴管進(jìn)入 反應(yīng)器的導(dǎo)流管，致使該部液體的密度小于導(dǎo)流管外部的液體形成循環(huán)流。（3）中空纖維式生物反應(yīng)器：占地空間小，產(chǎn)品產(chǎn)量、質(zhì)量高，生產(chǎn)成本低，不能重復(fù)使用，不能耐高壓蒸汽滅菌，需用環(huán)氧乙烷或其它消毒劑滅菌，難以取樣檢測。

（4）透析袋或膜式生物反應(yīng)器：可使細(xì)胞達(dá)到高密度，又可隨意組合進(jìn)行操作，對產(chǎn)品進(jìn)行濃縮純化。

（5）固定床或流化床生物反應(yīng)器：結(jié)構(gòu)簡單，裝填材料易得。16.動物細(xì)胞制藥有哪些新進(jìn)展？

17.什么是單克隆抗體？單克隆抗體有哪些不足？

單克隆抗體：是針對一個抗原決定簇的抗體，又是單一的B淋巴細(xì)胞克隆產(chǎn)生的抗體。不足：

（1）單克隆抗體均是鼠源性抗體，應(yīng)用于人體內(nèi)可產(chǎn)生人抗鼠抗體，加速了排斥反應(yīng)，在人體內(nèi)半衰期只有5-6h，難以維持有效藥物作用靶組織時間。

（2）完整的抗體分子，即Ig的相對分子質(zhì)量過大，難以穿透實(shí)體腫瘤組織，達(dá)不到有效治療濃度。

18如何制備雜交瘤細(xì)胞？

將兩個細(xì)胞（例如 B淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞）通過誘導(dǎo)融合形成雜交細(xì)胞，具體操作時為了提高成功率會用多個細(xì)胞同時雜交，然后篩選出目的細(xì)胞，再進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)使其有絲分裂而增值，得到大量目的細(xì)胞（雜交瘤細(xì)胞）。

19．基因工程抗體有哪些類型？其特性和制備方法有什么不同？ 基因工程抗體主要包括嵌合抗體、人源化抗體、完全人源抗體、單鏈抗體、雙特異性抗體等。

（1）嵌合抗體 嵌合抗體（chimeric atibody）是最早制備成功的基因工程抗體。它是由鼠源性抗體的 V 區(qū)基因與人抗體的 C 區(qū)基因拼接為嵌合基因，然后插入載體，轉(zhuǎn)染骨髓瘤組織表達(dá)的抗體分子。因其減少了鼠源成分，從而降低了鼠源性抗體引起的不良反應(yīng)，并有助于提高療效。

（2）人源性抗體 是將人抗體的 CDR 代之以鼠源性單克隆抗體的 CDR，由此形成的抗體，鼠源性只占極少，稱為人源化抗體。

（3）完全人源化抗體 采用基因敲除術(shù)將小鼠 Ig 基因敲除，代之以人 Ig 基因，然后用 Ag 免疫小鼠，再經(jīng)雜交瘤技術(shù)即可產(chǎn)生大量完全人源化抗體。

（4）單鏈抗體 是將 Ig 的 H 鏈和 L 鏈的 V 區(qū)基因相連，轉(zhuǎn)染大腸桿菌表達(dá)的抗體分子，又稱單鏈 FV（single chain fragment of variable region,sFv）。SFv 穿透力強(qiáng)，易于進(jìn)入局部組織發(fā)揮作用。

（5）雙特異性抗體 將識別效應(yīng)細(xì)胞的抗體和識別靶細(xì)胞的抗體聯(lián)結(jié)在一起，制成雙功能性抗體，稱為雙特異性抗體。如由識別腫瘤抗原的抗體和識別細(xì)胞毒性免疫效應(yīng)細(xì)胞（CTL 細(xì)胞、NK 細(xì)胞、LAK 細(xì)胞）表面分子的抗體（CD3 抗體或 CD16 抗體）制成的雙特異性抗體，有利于免疫效應(yīng)細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤作用。20.抗體治療藥物有哪些？

（1）放射性同位素標(biāo)記的抗體治療藥物（2）抗癌藥物偶聯(lián)的抗體藥物（3）毒素偶聯(lián)的抗體藥物 21.抗體診斷試劑有哪些類型？（1）血清學(xué)鑒定用的抗體試劑（2）免疫標(biāo)記用的抗體試劑（3）導(dǎo)向診斷藥物（4）CD單克隆抗體系列

22.單克隆抗體制備的基本原理與過程？有什么意義？

原理：

B淋巴細(xì)胞在抗原的刺激下，能夠分化、增殖形成具有針對這種抗原分泌特異性抗體的能力。B細(xì)胞的這種能力和量是有限的，不可能持續(xù)分化增殖下去，因此產(chǎn)生免疫球蛋白的能力也是極其微小的。將這種B細(xì)胞與非分泌型的骨髓瘤細(xì)胞融合形成雜交瘤細(xì)胞，再進(jìn)一步克隆化，這種克隆化的雜交瘤細(xì)胞是既具有瘤的無限生長的能力，又具有產(chǎn)生特異性抗體的B淋巴細(xì)胞的能力，將這種克隆化的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)或注入小鼠體內(nèi)即可獲得大量的高效價、單一的特異性抗體。這種技術(shù)即稱為單克隆抗體技術(shù)。過程

1）免疫脾細(xì)胞的制備 制備單克隆抗體的動物多采用純系 Balb/c小鼠。免疫的方法取決于所用抗原的性質(zhì)。免疫方法同一般血清的制備，也可采用脾內(nèi)直接免疫法。

2）骨髓瘤細(xì)胞的培養(yǎng)與篩選 在融合前，骨髓瘤細(xì)胞應(yīng)經(jīng)過含8-AG的培養(yǎng)基篩選，防止細(xì)胞發(fā)生突變恢復(fù)HGPRT的活性（恢復(fù)HGPRT的活性的細(xì)胞不能在含8-AG的培養(yǎng)基中存活）。骨髓瘤細(xì)胞用10%小牛血清的培養(yǎng)液在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，融合前24h換液一次，使骨髓瘤細(xì)胞處于對數(shù)生長期。

3）細(xì)胞融合的關(guān)鍵: 1技術(shù)上的誤差常常導(dǎo)致融合的失敗。例如，供者淋巴細(xì)胞沒有查到免疫應(yīng)答。這必然要失敗的。

2融合試驗(yàn)最大的失敗原因是污染，融合成功的關(guān)鍵是提供一個干凈的環(huán)境，以及適宜的無菌操作技術(shù)。

4）陽性克隆的篩選 應(yīng)盡早進(jìn)行。通常在融合后10天作第一次檢測，過早容易出現(xiàn)假陽性。檢測方法應(yīng)靈敏、準(zhǔn)確、而且簡便快速。具體應(yīng)用的方法應(yīng)根據(jù)抗原的性質(zhì)，以及所需單克隆抗體的功能進(jìn)行選擇。常用的方法有 RIA法、ELISA法和免疫熒光法等。其中ELISA法最簡便，RIA法最準(zhǔn)確。陽性克隆的篩選應(yīng)進(jìn)行多次，均陽性時才確定為陽性克隆進(jìn)行擴(kuò)增。

5）克隆化 克隆化的目的是為了獲得單一細(xì)胞系的群體?？寺』瘧?yīng)盡早進(jìn)行并反復(fù)篩選。這是因?yàn)槌跗诘碾s交瘤細(xì)胞是不穩(wěn)定的，有丟失染色體的傾向。反復(fù)克隆化后可獲得穩(wěn)定的雜交瘤細(xì)胞株?？寺』姆椒ê芏啵畛Ｓ玫氖怯邢尴♂尫?。

（1）顯微操作法：在顯微鏡下取單細(xì)胞，然后進(jìn)行單細(xì)胞培養(yǎng)。這種方法操作復(fù)雜，效率低，故不常用。

（2）有限稀釋法：將對數(shù)生長期的雜交瘤細(xì)胞用培養(yǎng)液作一定的稀釋后，按每孔1個細(xì)胞接種在培養(yǎng)皿中，細(xì)胞增值后成為單克隆細(xì)胞系。第一次克隆化時加一定量的飼養(yǎng)細(xì)胞。由于第一次克隆化生長的細(xì)胞不能保證單克隆化，所以為獲得穩(wěn)定的單克隆細(xì)胞株需經(jīng)2～3次的再克隆才成。應(yīng)該注意的是，每次克隆化過程中所有有意義的細(xì)胞都應(yīng)冷凍保存，以便重復(fù)檢查，避免丟失有意義的細(xì)胞。

（3）軟瓊脂法：將雜交瘤細(xì)胞稀釋到一定密度，然后與瓊脂混懸。在瓊脂中的細(xì)胞不能自由移動，彼此互不相混，從而達(dá)到單細(xì)胞培養(yǎng)的目的。但此法不如有限稀釋法好。

（4）熒光激光細(xì)胞分類法：用抗原包被的熒光乳膠微球標(biāo)記雜交瘤細(xì)胞，然后根據(jù)抗原與雜交瘤細(xì)胞結(jié)合的特異性選出細(xì)胞，并進(jìn)行單細(xì)胞培養(yǎng)。

6）細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇

7）大規(guī)模單克隆抗體的制備

選出的陽性細(xì)胞株應(yīng)及早進(jìn)行抗體制備，因?yàn)槿诤霞?xì)胞隨培養(yǎng)時間延長，發(fā)生污染、染包體丟失和細(xì)胞死亡的機(jī)率增加。抗體制備有兩種方法。一是增量培養(yǎng)法，即將雜交瘤細(xì)胞在體外培養(yǎng)，在培養(yǎng)液中分離單克隆抗體。該法需用特殊的儀器設(shè)備，一般應(yīng)用無血清培養(yǎng)基，以利于單克隆抗體的濃縮和純化。最普遍采用的是小鼠腹腔接種法。選用BALB/c小鼠或其親代小鼠，先用降植烷或液體石蠟行小鼠腹腔注射，一周后將雜交瘤細(xì)胞接種到小鼠腹腔中去。通常在接種一周后即有明顯的腹水產(chǎn)生，每只小鼠可收集5～10ml的腹水，有時甚至超過40ml。該法制備的腹水抗體含量高，每毫升可達(dá)數(shù)毫克甚至數(shù)十毫克水平。此外，腹水中的雜蛋白也較少，便于抗體的純化。意義：

用于以下各種生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)并具有醫(yī)用價值（1）沉淀反應(yīng)：Precipitation reaction

（2）凝集實(shí)驗(yàn)：haemaglutination（3）放射免疫學(xué)方法檢測免疫復(fù)合物

（4）流式細(xì)胞儀：用于細(xì)胞的分型和細(xì)胞分離。（5）ELISA 等免疫學(xué)檢測

（6）BIAcore biosensor:檢測Ab-Ag或與蛋白的親和力。

(7)免疫印記（western blotting)（8）免疫沉淀：

（9）親和層析：分離蛋白質(zhì)（10）磁珠分離細(xì)胞

（11）臨床疾病的診斷和治療；

23.植物細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基由哪些主要成分組成？（1）無機(jī)鹽（2）碳源

（3）植物生長調(diào)節(jié)劑（4）有機(jī)氮源（5）維生素

24.植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的主要方法及其特點(diǎn)是什么？

（1）成批培養(yǎng)法：將培養(yǎng)基一次性地加入反應(yīng)器中，接種，培養(yǎng)一定時間后收獲細(xì)胞的操作方式。

特點(diǎn)：操作強(qiáng)度低，設(shè)備簡單，容易發(fā)生污染，通氣受限制。（2）半連續(xù)培養(yǎng)法：在反應(yīng)器中投料和接種培養(yǎng)一段時間后，將部

分培養(yǎng)液和 新鮮培養(yǎng)液進(jìn)行交換的培養(yǎng)方法。

（3）連續(xù)培養(yǎng)法：是利用連續(xù)培養(yǎng)反應(yīng)器，在投料和接種培養(yǎng)一段時間后，以一定速度采集細(xì)胞和培養(yǎng)液，并以同樣速度供給誒新鮮培養(yǎng)基以使細(xì)胞生長環(huán)境長期恒定的方法。

（4）固定化培養(yǎng)法：將細(xì)胞固定于尼龍網(wǎng)套內(nèi)，或固定于中空纖維有網(wǎng)狀多孔板，尼龍?zhí)缀椭锌绽w維膜上，放入培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，或連續(xù)流入新鮮培養(yǎng)液，進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)及連續(xù)收集培養(yǎng)產(chǎn)物，也可通入凈化空氣以代替攪拌。25.影響植物細(xì)胞積累次級代謝產(chǎn)物的因素有哪些？（1）生物條件

（2）物理?xiàng)l件（3）化學(xué)條件（4）工業(yè)培養(yǎng)條件

26.各種植物細(xì)胞培養(yǎng)的生物反應(yīng)器的特點(diǎn)是什么？

（1）機(jī)械攪拌式生物反應(yīng)器：有較大的操作范圍，混合程度高，適應(yīng)性廣，剪切力大，容易損傷細(xì)胞。

（2）鼓泡式生物反應(yīng)器：優(yōu)于機(jī)械攪拌式反應(yīng)器。但由于鼓泡式反應(yīng)器對氧的利用率較低，如果用較大通氣量，則產(chǎn)生的剪切力會損傷細(xì)胞。

（3）氣升式生物反應(yīng)器：廣泛應(yīng)用于植物細(xì)胞培養(yǎng)的研究和生產(chǎn)，最高細(xì)胞濃度和最短倍增時間可從氣升罐中得到。

（4）轉(zhuǎn)鼓式生物反應(yīng)器：生長速率高，其氧的傳遞及剪切力對細(xì)胞 的傷害水平方面均優(yōu)于氣升式反應(yīng)器。

（5）固定化細(xì)胞反應(yīng)器：可保護(hù)細(xì)胞免受剪切，可長時間重復(fù)使用，易于實(shí)現(xiàn) 細(xì)胞的高密度培養(yǎng)，細(xì)胞接觸良好，易于分化，有利于次級代謝產(chǎn)物的合成，減少細(xì)胞的遺傳不穩(wěn)定 性，易于實(shí)現(xiàn)連續(xù)化操作。

27.植物細(xì)胞培養(yǎng)有哪些新進(jìn)展？

（1）誘導(dǎo)了在植物細(xì)胞工程研究中的應(yīng)用（2）前體飼喂（3）兩相法培養(yǎng)

（4）轉(zhuǎn)基因技術(shù)在次級代謝產(chǎn)物生產(chǎn)中的應(yīng)用（5）植物身為轉(zhuǎn)化技術(shù)與生物制藥 28.酶工程主要研究內(nèi)容是什么？

（1）酶的分離、純化、大批量生產(chǎn)及應(yīng)用。（2）酶和細(xì)胞的固定化及酶反應(yīng)器的研究。

（3）酶生產(chǎn)中基因工程技術(shù)的應(yīng)用及遺傳修飾酶研究。

（4）酶的分子改造與化學(xué)修飾以及酶的結(jié)構(gòu)與功能之間關(guān)系的研究。（5）有機(jī)相中酶反應(yīng)的研究。

（6）酶的抑制劑，激活劑的開發(fā)及應(yīng)用與研究。（7）抗體酶，核酸酶的研究。

（8）模擬酶，合成酶及酶分子的人工設(shè)計、合成的研究。29.固定化酶回合固定化細(xì)胞的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)各是什么？怎樣制備？ 固定化酶的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn):

（1）同一批固定化酶能在工藝流程中重復(fù)多次地使用；

（2）固定化后，和反應(yīng)物分開，有利于控制生產(chǎn)過程，同時也省去了熱處

理使酶失活的步驟；

（3）穩(wěn)定性顯著提高；

（4）可長期使用，并可預(yù)測衰變的速度；

（5）提供了研究酶動力學(xué)的良好模型。

固定化細(xì)胞的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)：

1.使用固定化細(xì)胞省去了酶的分離過程，顯著降低了成本。

2.固定化細(xì)胞為多酶系統(tǒng)，不需要輔助因子

3.增加了細(xì)胞對不利環(huán)境的耐逆性，可重復(fù)使用。

4.增加了酶的穩(wěn)定性。

固定化酶制備：

（1）吸附法：

過載體表面和酶分子表面間的次級鍵相互作用而達(dá)到固定目的的方法，是固定化中最簡單的方法。酶與載體之間的親和力是范德華力、疏水相互作用、離子鍵和氫鍵等。（2）包埋發(fā)：

將酶包埋在高聚物的細(xì)微凝膠網(wǎng)格中或高分子半透膜內(nèi)的固定化方法。前者又稱為凝膠包埋法，酶被包埋成網(wǎng)格型；后者又稱為微膠囊包埋法，酶被包埋成微膠囊型。（3）共價鍵結(jié)合法：

將酶與聚合物載體以共價鍵結(jié)合的固定化方法。

（4）交聯(lián)法

使用雙功能或多功能試劑使酶分子之間相互交聯(lián)呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的固定化方法。由于酶蛋白的功能團(tuán)，如氨基、酚基、巰基和咪唑基，參與此反應(yīng)，所以酶的活性中心構(gòu)造可能受到影響，而使酶失活明顯。但是盡可能地降低交聯(lián)劑濃度和縮短反應(yīng)時間將有利于固定化酶活力的提高。

固定化細(xì)胞的制備：

一種固定化細(xì)胞的制備方法，包括以下步驟： a．選用甲烷利用細(xì)菌Methylomonas sp．GYJ3，在可供給微生物能量的甲烷和空氣的混合氣體中，輔以無機(jī)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)； b．培養(yǎng)好的菌體細(xì)胞離心后用無機(jī)培養(yǎng)基懸浮，加入到硅酸鈉溶液和鹽酸溶液制成的溶膠中，待溶膠凝固變成凝膠后，就制得了包埋的細(xì)胞，將包埋細(xì)胞置于低溫環(huán)境中以增加包埋強(qiáng)度； c．用磷酸鹽緩沖液洗去包埋細(xì)胞的雜質(zhì)，充入可給微生物提供能量的相應(yīng)的甲烷與空氣的混合氣體，在搖床上培養(yǎng)48－120小時。

30.為什么要對酶進(jìn)行化學(xué)修飾？

（1）.更好的熱穩(wěn)定性以及抗核酸酶性對于臨床應(yīng)用很重要；（2）提高酶蛋白在體內(nèi)的半衰期；（3）提高酶蛋白的靶向性；（4）提高酶蛋白效力。

31.何謂分子印跡？分子印跡的應(yīng)用范圍有哪些？

分子印跡：是指制備對某一特定化合物具有選擇性的聚合物的過程。

應(yīng)用范圍：

（1）用于化學(xué)仿生傳感器（2）色譜分離（3）固相萃?。?）天然杭體模擬（5）模擬酶催化（6）控緩釋藥物

32.有機(jī)相酶反應(yīng)的定義及其優(yōu)點(diǎn)是什么？

有機(jī)相酶反應(yīng)：是指酶在具有有機(jī)溶劑存在的介質(zhì)中所進(jìn)行對的催化反應(yīng)。優(yōu)點(diǎn)是：

（1）增加疏水性底物或產(chǎn)物的溶解度。（2）熱力學(xué)平衡向合成方向移動。（3）可抑制有水劑中分離純化產(chǎn)物。（4）酶不溶于有機(jī)介質(zhì)，易于回收再利用。（5）容易從低沸點(diǎn)的溶劑中分離純化產(chǎn)物。（6）酶的熱穩(wěn)定性提高，PH的適應(yīng)性擴(kuò)大。（7）無微生物污染。

（8）能測定某介質(zhì)中反應(yīng)時，通過改變?nèi)軇?，能夠控制底物的特異性、區(qū)域選擇性和立體選擇性，并可以催化某些在水中不能進(jìn)行的反應(yīng)。33.何謂人工模擬酶？

人工模擬酶：是指根據(jù)酶的作用機(jī)理，用各種方法人為制造的具有酶性質(zhì)的催化劑。

34.發(fā)酵工程的研究內(nèi)容包括哪些？

發(fā)酵工程研究內(nèi)容涉及：菌種的培養(yǎng)和選育、菌的代謝與調(diào)節(jié)、培養(yǎng)基滅菌、通氣攪拌、溶氧、發(fā)酵條件的優(yōu)化、發(fā)酵過程各種參數(shù)與動力學(xué)、發(fā)酵反應(yīng)器的設(shè)計和自動控制、產(chǎn)品的分離純化和精制等。35.微生物菌種誘變使用的主要誘變劑有哪些？它們的誘變機(jī)制是什么？

(1)物理誘變劑：主要有紫外線、X射線、γ射線、快中子、α射線、β射線和超聲波等。

（2）化學(xué)誘變劑：金屬離子、一般化學(xué)試劑、生物堿、抗代謝物、生長刺激素、抗生素及高分子化合物、殺菌劑、染料等。誘變機(jī)制：

1、堿基的類似物誘發(fā)突變

2、改變DNA的化學(xué)結(jié)構(gòu)

3、結(jié)合到DNA分子上誘發(fā)移碼突變

4、紫外線及其他射線引起的DNA分子的變化 36.微生物發(fā)酵主要有哪些方式？各具有什么特點(diǎn)？

（一）分批發(fā)酵：是將全部物料一次投入到反應(yīng)器中，經(jīng)滅菌，接種，經(jīng)過若干時間的發(fā)酵后再將發(fā)酵液一次放出的操作方式。特點(diǎn)：

（1）對溫度的要求低，工藝操作簡單；（2）比較容易解決雜菌污染和菌種退化等問題；

（3）對營養(yǎng)物的利用效率較高，產(chǎn)物濃度也比連續(xù)發(fā)酵要高（4）人力、物力、動力消耗較大；（5）生產(chǎn)周期較長（6）生產(chǎn)效率低

（二）補(bǔ)料分批發(fā)酵：指在微生物分批發(fā)酵過程中，以某種方式向發(fā)酵系統(tǒng)中補(bǔ)加一定物料，但并不連續(xù)地向外放出發(fā)酵液的發(fā)酵技術(shù)，是介于分批發(fā)酵和連續(xù)發(fā)酵之間的一種發(fā)酵技術(shù)。特點(diǎn)：

(1)可以解除底物的抑制、產(chǎn)物的反饋抑制和分解代謝物阻遏作用。

(2)可以減少菌體生長量，提高有用產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率；(3)菌種的變異及雜菌污染問題易控制；(4)便于自動化控制

(三)連續(xù)發(fā)酵：是指以一定的速度向發(fā)酵罐內(nèi)添加新鮮培養(yǎng)基，同時以相同速度流出培養(yǎng)液，從而使發(fā)酵罐內(nèi)的液量維持恒定的發(fā)酵過程。

特點(diǎn)：

（1）設(shè)備的體積可以減??；v（2）操作時間短，總的操作管理方便，便于自動化控制；（3）產(chǎn)物穩(wěn)定，人力物力節(jié)省，生產(chǎn)費(fèi)用低（4）對設(shè)備的合理性和加料設(shè)備的精確性要求甚高；（5）營養(yǎng)成分的利用較分批發(fā)酵差，產(chǎn)物濃度比分批發(fā)酵低

（6）雜菌污染的機(jī)會較多，菌種易因變異而發(fā)生退化。37.影響發(fā)酵的主要因素有哪些？如何對發(fā)酵過程進(jìn)行控制？（1）溫度 溫度對微生物的影響是多方面的。首先，溫度影響酶的活性。在最適溫度范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，菌體生長和代謝加快，發(fā)酵反應(yīng)的速率加快。當(dāng)超過最適溫度范圍以后，隨著溫度的升高，酶很快失活，菌體衰老，發(fā)酵周期縮短，產(chǎn)量降低。溫度也能影響生物合成的途徑。例如，金色鏈霉菌在30℃以下時，合成金霉素的能力較強(qiáng)，但當(dāng)溫度超過35℃時，則只合成四環(huán)素而不合成金霉素。此外，溫度還會影響發(fā)酵液的物理性質(zhì)，以及菌種對營養(yǎng)物質(zhì)的分解吸收等。因此，要保證正常的發(fā)酵過程，就需維持最適溫度。但菌體生長和產(chǎn)物合成所需的最適溫度不一定相同。如灰色鏈霉菌的最適生長溫度是37℃，但產(chǎn)生抗生素的最適溫度是28℃。通常，必須通過實(shí)驗(yàn)來確定不同菌種各發(fā)酵階段的最適溫度，采取分段控制。（2）pH pH能夠影響酶的活性，以及細(xì)胞膜的帶電荷狀況。細(xì)胞膜的帶電荷狀況如果發(fā)生變化，膜的透性也會改變，從而有可能影響微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收及代謝產(chǎn)物的分泌。此外，pH還會影響培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的分解等。因此，應(yīng)控制發(fā)酵液的pH。但不同菌種生長階段和合成產(chǎn)物階段的最適pH往往不同，需要分別加以控制。在發(fā)酵過程中，隨著菌體對營養(yǎng)物質(zhì)的利用和代謝產(chǎn)物的積累，發(fā)酵液的pH必然發(fā)生變化。如當(dāng)尿素被分解時，發(fā)酵液中的NH+4濃度就會上升，pH也隨之上升。在工業(yè)生產(chǎn)上，常采用在發(fā)酵液中添加維持pH的緩沖系統(tǒng)，或通過中間補(bǔ)加氨水、尿素、碳酸銨或碳酸

鈣來控制pH。目前，國內(nèi)已研制出檢測發(fā)酵過程的pH電極，用于連續(xù)測定和記錄pH變化，并由pH控制器調(diào)節(jié)酸、堿的加入量。（3）溶解氧 氧的供應(yīng)對需氧發(fā)酵來說，是一個關(guān)鍵因素。從葡萄糖氧化的需氧量來看，1 mol的葡萄糖徹底氧化分解，需6 mol的氧；當(dāng)糖用于合成代謝產(chǎn)物時，1 mol葡萄糖約需1.9 mol的氧。因此，好氧型微生物對氧的需要量是很大的，但在發(fā)酵過程中菌種只能利用發(fā)酵液中的溶解氧，然而氧很難溶于水。在101.32 kPa、25℃時，氧在水中的溶解度為0.26 mmol/L。在同樣條件下，氧在發(fā)酵液中的溶解度僅為0.20 mmol/L。而且隨著溫度的升高，溶解度還會下降。因此，必須向發(fā)酵液中連續(xù)補(bǔ)充大量的氧，經(jīng)攪拌，可以提高氧在發(fā)酵液中的溶解度。

（4）泡沫 在發(fā)酵過程中，通氣攪拌、微生物的代謝過程及培養(yǎng)基中某些成分的分解等，都有可能產(chǎn)生泡沫。發(fā)酵過程中產(chǎn)生一定數(shù)量的泡沫是正?，F(xiàn)象，但過多的持久性泡沫對發(fā)酵是不利的。因?yàn)榕菽瓡紦?jù)發(fā)酵罐的容積，影響通氣和攪拌的正常進(jìn)行，甚至導(dǎo)致代謝異常，因而必須消除泡沫。常用的消泡沫措施有兩類：一類是安裝消泡沫擋板，通過強(qiáng)烈的機(jī)械振蕩，促使泡沫破裂；另一類是使用消泡沫劑。（5）營養(yǎng)物質(zhì)的濃度 發(fā)酵液中各種營養(yǎng)物質(zhì)的濃度，特別是碳氮比、無機(jī)鹽和維生素的濃度，會直接影響菌體的生長和代謝產(chǎn)物的積累。如在谷氨酸發(fā)酵中，NH+4濃度的變化，會影響代謝途徑(見谷氨酸發(fā)酵)。因此，在發(fā)酵過程中，也應(yīng)根據(jù)具體情況進(jìn)行控制。38.如何克隆抗生素生物合成基因？

在分子水平上提供一種純化和擴(kuò)增特定DNA片段的方法。常含有目的基因，用體外重組方法將它們插入克隆載體，形成重組克隆載體，通過轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)導(dǎo)的方式，引入適合的寄主體內(nèi)得到復(fù)制與擴(kuò)增，然后再從篩選的寄主細(xì)胞內(nèi)分離提純所需的克隆載體，可以得到插入DNA的許多拷貝，從而獲得目的基因的擴(kuò)增。39．基因工程在抗生素生產(chǎn)中有哪些應(yīng)用？

第四篇：生物技術(shù)制藥總結(jié)

生物技術(shù)：人們以現(xiàn)代生命科學(xué)為基礎(chǔ)，結(jié)合先進(jìn)的工程技術(shù)手段和其他基礎(chǔ)科學(xué)的科學(xué)原理，按照預(yù)先的設(shè)計改造生物體或加工生物原料，為人類生產(chǎn)出所需產(chǎn)品或達(dá)到某種目的的技術(shù)

1基因工程制藥：利用基因重組技術(shù)將外援基因?qū)胨拗骶蚣?xì)胞進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)，以獲得蛋白質(zhì)藥物的過程。

2.載體：是攜帶外源目的基因或DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)外援基因或DNA的無性繁殖或表達(dá)有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些DNA分子。

細(xì)胞傳代passage：將細(xì)胞從一個培養(yǎng)器皿中消化、分散并接種至另一個培養(yǎng)器皿中的操作。細(xì)胞克隆培養(yǎng)（clonal culture）：即單細(xì)胞分離培養(yǎng)，是將動物組織分散后，將一個細(xì)胞從群體細(xì)胞中分離出來，由單個細(xì)胞培養(yǎng)成純系細(xì)胞集群。

動物細(xì)胞的復(fù)蘇：其原則是快速融化，必須將凍存在-196℃液氮中的細(xì)胞快速融化至37℃，使細(xì)胞外凍存時的冰晶迅速融化，避免冰晶緩慢融化時進(jìn)入細(xì)胞形成再結(jié)晶，對細(xì)胞造成損害。

細(xì)胞融合（cell fusion）：是指在外力（誘導(dǎo)劑或促融劑）作用下，兩個或兩個以上的異源（種、屬間）細(xì)胞或原生質(zhì)體相互接觸，從而發(fā)生膜融合、胞質(zhì)融合和核融合并形成雜種細(xì)胞的現(xiàn)象，或稱細(xì)胞雜交。

轉(zhuǎn)基因動物（transgenic animal）：采用基因工程技術(shù)將外源目的基因?qū)雱游锷臣?xì)胞、胚胎干細(xì)胞和早期胚胎，并在受體動物的染色體上穩(wěn)定整合，在經(jīng)過發(fā)育途徑將外源目的基因穩(wěn)定地傳給子代，通過這項(xiàng)技術(shù)所獲得的動物即為轉(zhuǎn)基因動物。

胚胎干細(xì)胞（embryo stem cell）：簡稱ES細(xì)胞，是從早期胚胎細(xì)胞團(tuán)分離出來并能在體外培養(yǎng)的一種高度未分化的、具有形成所有成年細(xì)胞類型能力的全能干細(xì)胞。它是正常二倍體型，像早期胚胎細(xì)胞一樣具有發(fā)育上的全能性。

抗體工程制藥（antibody engineering pharmaceutics）：利用基因工程、細(xì)胞工程（包括動物細(xì)胞工程和植物細(xì)胞工程）和轉(zhuǎn)基因動物及轉(zhuǎn)基因植物技術(shù)生產(chǎn)抗體藥物的過程。

單克隆抗體（monoclonal antibody，mAb）：簡稱單抗，將能大量擴(kuò)增和永生的骨髓瘤細(xì)胞和能合成分泌特異性抗體的B細(xì)胞（僅識別一種抗原表位）進(jìn)行融合得到雜交瘤細(xì)胞，經(jīng)篩選和克隆化的雜交瘤細(xì)胞僅能合成及分泌抗單一抗原表位的特異性抗體。

雜交瘤細(xì)胞克隆化（cloning）：是指將陽性孔中分泌抗體的單個細(xì)胞分離出來。融合后的雜交瘤細(xì)胞一般要經(jīng)過3次克隆化才能達(dá)到100%的陽性克隆。

雙特異性抗體（bispecific antibody，bsAb）：亦稱雙功能抗體，是含有兩個不同配體結(jié)合位點(diǎn)的抗體分子，它有兩個不同的抗原結(jié)合部位（兩個臂），可分別結(jié)合兩種不同的抗原表位。嵌合抗體（chimeric antibody）：是利用DNA重組技術(shù)，將異源單抗的輕、重鏈可變區(qū)基因插入含有人抗體恒定區(qū)的表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化哺乳動物細(xì)胞表達(dá)的抗體，表達(dá)的抗體分子中輕、重鏈的V區(qū)是異源的，而C區(qū)是人源的，即整個抗體分子的60%~70%是人源的。

人源化抗體（humanized antibody，hAb）：通過CDR移植即把鼠抗體的CDR（互補(bǔ)決定區(qū)）序列移植到人抗體的可變區(qū)內(nèi)所得到的抗體，也稱CDR移植抗體或改型抗體。該抗體既具有鼠源性單抗的特異性又保持了人抗體的功能（C區(qū)的功能）。

免疫原性（immunogenicity）：抗原能刺激機(jī)體特異性免疫細(xì)胞，使其活化、增值、分化，最終產(chǎn)生免疫效應(yīng)物質(zhì)（抗體或致敏淋巴細(xì)胞）的特性。

免疫反應(yīng)性（immunoreactivity）：抗原與相應(yīng)免疫效應(yīng)物質(zhì)在體內(nèi)或體外相遇時，可發(fā)生

特異性結(jié)合而產(chǎn)生免疫反應(yīng)的特性。

減毒活疫苗（live attenuated vaccine）：是通過不同的方式手段使病原體的毒性即致病

性減弱或喪失后獲得的一種由完整的微生物組成的疫苗制品。

滅活疫苗（inactivated）：是將病原體經(jīng)培養(yǎng)增殖、滅活純化處理，使其完全喪失感染性，但保留了病原體的幾乎全部組分因此滅活疫苗具有較好的免疫原性和安全性。

亞單位疫苗（subunit vaccine）：利用微生物的某種表面結(jié)構(gòu)成分（抗原）制成、能誘發(fā)

機(jī)體產(chǎn)生抗體的疫苗。

分解代謝阻遏（catabolite repression）：在菌體的生長階段被菌體快速利用的碳源會產(chǎn)

生大量的分解產(chǎn)物，這些代謝產(chǎn)物阻遏次級代謝酶系的合成，只有當(dāng)這類碳源被消耗完后，阻遏作用被消除，菌體才由生長階段轉(zhuǎn)入次級代謝產(chǎn)物合成階段，這種發(fā)酵過程中的次級代

謝產(chǎn)物在碳源被消耗盡時才產(chǎn)生和積累的現(xiàn)象稱為分解代謝阻遏。

生物技術(shù)：人們以現(xiàn)代生命科學(xué)為基礎(chǔ)，結(jié)合先進(jìn)的工程技術(shù)手段和其他基礎(chǔ)科學(xué)的科學(xué)原

理，按照預(yù)先的設(shè)計改造生物體或加工生物原料，為人類生產(chǎn)出所需產(chǎn)品或達(dá)到某種目的的技術(shù)。

種齡（inoculumage）：種子罐中培養(yǎng)的菌絲轉(zhuǎn)入下一級種子罐或發(fā)酵罐時得培養(yǎng)時間

生物技術(shù)藥物的特性？

（1）理化性質(zhì)特性（1）相對分子量大（2）結(jié)構(gòu)復(fù)雜：蛋白質(zhì)和核酸均為生物大分子，蛋

白質(zhì)含有四級結(jié)構(gòu)（3）穩(wěn)定性差（2）藥理學(xué)作用特性（1）活性與作用機(jī)制明確：活性物

質(zhì)對生理功能的調(diào)節(jié)機(jī)制比較清楚（2）作用針對性強(qiáng)：有特定的靶分子、靶細(xì)胞或靶器官

（3）毒性低：生物技術(shù)藥物本身是體內(nèi)天然存在的物質(zhì)或它們的衍生物（4）體內(nèi)半衰期短

（5）有種屬特異性（6）可產(chǎn)生免疫原抑制（3）生產(chǎn)制備特性（1）藥物分子在原料中的含量低（2）原料液中常存在降解目標(biāo)產(chǎn)物的雜質(zhì)：應(yīng)采取快速分離純化的方法以除去影響

目標(biāo)產(chǎn)物穩(wěn)定性的物質(zhì)（3）制備工藝條件溫和：目的產(chǎn)物不穩(wěn)定（4）分離純化困難：需要

多種不同原理的層析單元操作才能達(dá)到要用的純度（5）產(chǎn)品易受有害物質(zhì)（4）質(zhì)量控制特

性

質(zhì)粒的特點(diǎn)：（1）是指獨(dú)立于原核生物染色體之外具有自主復(fù)制能力的遺傳物質(zhì)。（2）質(zhì)粒

具有遺傳傳遞和遺傳交換的能力（3）質(zhì)粒具有不相容性：兩種親緣關(guān)系密切的不同質(zhì)粒不

能在同一宿主細(xì)胞中穩(wěn)定共存。4..共價閉合環(huán)狀DNA(ccDNA)，開環(huán)DNA(ocDNA)，線狀

DNA(lDNA)在瓊脂糖凝膠電泳中

5.復(fù)制子松弛型復(fù)制子的復(fù)制和宿主蛋白的合成功能

無關(guān)，宿主染色體DNA復(fù)制受阻時，質(zhì)粒仍可復(fù)制；嚴(yán)謹(jǐn)型復(fù)制子的復(fù)制與宿主蛋白質(zhì)的合成相關(guān)，因此在每個宿主細(xì)胞中為低拷貝數(shù)，僅1~3個。

6.克隆表達(dá)的質(zhì)粒載體涉及三個要素：

（1）復(fù)制子（2）選擇標(biāo)記：由質(zhì)粒攜帶的賦予宿主細(xì)胞新的表型的基因，用于鑒定和篩選

轉(zhuǎn)化有質(zhì)粒的宿主細(xì)胞。常見的標(biāo)記：氨芐西林（Amp），卡那霉素（Kan）（3）多克隆位點(diǎn)

（MCS）：質(zhì)粒載體中由多個限制性內(nèi)切酶識別序列密集排列形成的序列。

7.目的基因常用制備方法

(1)化學(xué)合成法（2）PCR法：在含有DNA模板、引物、DNA聚合酶、dNTP的緩沖溶液中通

過下列步驟擴(kuò)增DNA：a）變性：雙鏈DNA模板加熱變性，解離成單鏈模板；b）退火：降

低溫度，引物與單鏈模板結(jié)合；c）延伸：溫度調(diào)整至DNA聚合酶最適宜溫度，最終與單鏈

模板形成雙鏈，并開始下一個變性、退火、延伸循環(huán)。（3）基因文庫法（4）cDNA文庫法

8.影響目的基因與載體之間連接效率的主要因素：

9.（1）DNA片段之間的連接方式：粘性末端的連接效率高于平頭末端。（2）目的基因與載

體的濃度和比例：增加DNA濃度可以提高連接效率，目的基因與載體DNA的摩爾數(shù)比應(yīng)大

于1.（3）連接溫度、時間、連接酶的活性及緩沖液。

9.重組DNA導(dǎo)入大腸桿菌，常用的感受態(tài)細(xì)胞制備方法：氯化鈣法

10.重組子的篩選與鑒定：

（1）載體遺傳標(biāo)記法：a)抗生素抗性篩選法

b)互補(bǔ)篩選法：重組子轉(zhuǎn)化成宿主細(xì)胞，載體的表達(dá)產(chǎn)物與宿主細(xì)胞中營養(yǎng)缺陷性突變發(fā)生

互補(bǔ)作用，從而實(shí)現(xiàn)重組子的篩選。藍(lán)白斑篩選：lacZα基因可編碼β—半乳糖苷酶α氨基

端的α互補(bǔ)肽段，與宿主細(xì)胞編碼的缺陷型β—半乳糖苷酶α實(shí)現(xiàn)互補(bǔ)，可分解底物5-溴-4-

氫-3-吲哚-β-D-半乳糖苷，形成藍(lán)色菌落。由于lacAα基因的插入失活而成白色，空載體的宿主細(xì)胞呈藍(lán)色。c)營養(yǎng)缺陷篩選法d噬菌斑篩選法(2)核酸分子雜交法

(3)限制性內(nèi)切酶圖譜法(4)DNA序列測定法：雙脫氧終止法(5)目的基因表達(dá)產(chǎn)物測定法

12.外源基因在大腸桿菌中的表達(dá)形式：

(1)胞內(nèi)表達(dá)：(a)非融合蛋白的胞內(nèi)表達(dá)：形成包涵體（B）融合蛋白的胞內(nèi)表達(dá)：在大腸桿

菌內(nèi)較穩(wěn)定（2）分泌表達(dá)：（a)分泌至周質(zhì)（b）分泌至胞外

11.外源基因在原核生物中表達(dá)的重要調(diào)控元件

(1)啟動子：是DNA鏈上能與RNA聚合酶結(jié)合并起始mRNA合成的一段序列，是決定外源基

因在原核生物中表達(dá)效率的關(guān)鍵因素。(2)核糖體結(jié)合位點(diǎn)：SD序列(3)終止子

13.大腸桿菌中外源蛋白表達(dá)效率的影響因素：(1)外源基因密碼子：偏好密碼子（蛋白質(zhì)合成迅速，錯配率低）和稀有密碼子(2)mRNA結(jié)構(gòu)：減少G、C含量，增加A、T含量(3)表達(dá)

載體：高拷貝數(shù)、適用范圍廣、穩(wěn)定性高、表達(dá)產(chǎn)物容易純化(4)外源蛋白穩(wěn)定性

14.分離純化技術(shù)應(yīng)滿足下列要求：(1)技術(shù)條件要溫和，能保持目的產(chǎn)物的生物活性；(2)選

擇性要好(3)回收率要高(4)兩個技術(shù)之間要能直接銜接(5)整個分離純化過程要快

15.基因重組蛋白的主要分離技術(shù)

(1)離心(2)沉淀(3)膜分離(4)雙水相萃取

16基因重組蛋白的主要純化技術(shù):

(1)離子交換層析(2)親和層析(3)凝膠過濾層析(4)反相層析和疏水層析

17.選擇分離純化方法的依據(jù)：

（元，層析分離次序的選擇也同樣重要。(3)根據(jù)分離純化工藝的要求來選擇(a)具有良好的穩(wěn)

定性、重復(fù)性和較高的安全性(b)盡可能減少組成工藝的步驟(c)分離純化工藝所用的時間要

盡可能的短(d)工藝和技術(shù)必須高效

18．基因工程藥物的質(zhì)量控制要點(diǎn)

(1)蛋白質(zhì)含量的測定(2)蛋白質(zhì)純度檢測(3)蛋白質(zhì)分子質(zhì)量測定(4)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)測定(5)蛋

白質(zhì)序列分析(6)內(nèi)毒素分析、宿主蛋白與核酸殘留分析

19.蛋白質(zhì)含量的測定

(1)紫外吸收法(2)BCA法(3)Lowry法(4)考馬斯亮藍(lán)法(5)SDS-PAGE掃描分析法

20.蛋白質(zhì)純度的檢測：電泳法、層析法、質(zhì)譜法、末端氨基酸殘基分析法

21.蛋白質(zhì)Mr測定有SDS-PAGE法、凝膠層析法、質(zhì)譜法

22.蛋白質(zhì)等電點(diǎn)測定的常用方法：等電聚焦法。

23.蛋白質(zhì)序列的分析:N-端氨基酸序列分析，C-端氨基酸序列分析

根據(jù)體外培養(yǎng)時動物細(xì)胞對生長基質(zhì)的依賴性，可將動物細(xì)胞分為

(1)貼壁依賴性細(xì)胞(2)非貼壁依賴性細(xì)胞(3)兼性貼壁細(xì)胞

1.動物細(xì)胞培養(yǎng)的環(huán)境條件

(1)培養(yǎng)溫度（哺乳類37℃，昆蟲25~28℃）(2)pH值（大多數(shù)7.2~7.4）(3)通氧量（一定量的CO2）(4)防止污染(5)基本營養(yǎng)物質(zhì)(6)滲透壓

3.動物細(xì)胞的培養(yǎng)特性

(1)比微生物細(xì)胞大得多，無細(xì)胞壁，抗機(jī)械強(qiáng)度低，對剪切力敏感，適應(yīng)環(huán)境能力差；(2)

倍增時間長，生長緩慢，正常二倍體細(xì)胞的生長壽命是有限的；(3)對培養(yǎng)基要求高，易受

微生物污染，培養(yǎng)時需要添加抗生素；(4)生長大多需貼附于基質(zhì)，相互粘連以集群形式存

在，并有接觸抑制現(xiàn)象；(5)多半將產(chǎn)物分泌在細(xì)胞外，便于收集和純化；(6)對蛋白質(zhì)的合成條件和修飾功能與細(xì)菌不同，動物細(xì)胞可對蛋白質(zhì)進(jìn)行完善的翻譯后修飾，特別是糖基化，與天然產(chǎn)品更一致，更適合于臨床應(yīng)用。

4.原代培養(yǎng)的主要步驟

(1)從健康動物體內(nèi)無菌條件下取出適量組織，剪切成小薄片；(2)加入適宜濃度的胰蛋白酶

或膠原酶和EDTA等進(jìn)行消化作用使細(xì)胞分散；(3)將分散的細(xì)胞進(jìn)行洗滌并純化后，以2×

10^6~7×10^6 /ml的濃度加到培養(yǎng)基中，37℃下進(jìn)行原代培養(yǎng)，并適時進(jìn)行傳代培養(yǎng)。分為

組織塊培養(yǎng)和單層細(xì)胞培養(yǎng)兩種方法。

5.動物細(xì)胞深低溫保存的基本原理

在-70℃以下時，細(xì)胞內(nèi)的酶活性均已停止，即代謝處于完全停滯狀態(tài)，故可以長期保存。

在不加任何條件下直接凍存細(xì)胞時，細(xì)胞內(nèi)和外環(huán)境中的水都會形成冰晶，能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)發(fā)

生機(jī)械損傷、電解質(zhì)濃度升高、滲透壓改變、脫水、pH改變、蛋白質(zhì)變性等，能引起細(xì)胞

死亡。目前為了保存細(xì)胞，都采用液氮低溫（-196℃）凍存的方法。

6.動物細(xì)胞的復(fù)蘇

其原則是快速融化，必須將凍存在-196℃液氮中的細(xì)胞快速融化至37℃，使細(xì)胞外凍

存時的冰晶迅速融化，避免冰晶緩慢融化時進(jìn)入細(xì)胞形成再結(jié)晶，對細(xì)胞造成損害。

7.動物細(xì)胞營養(yǎng)要求特點(diǎn)

(1)碳源不能為無機(jī)物，大多為葡萄糖；(2)氮源不能為無機(jī)物，主要為各種氨基酸；(3)在很

多情況下尚需添加5%~20%的小牛血清或適量的動物胚胎浸出液。

8.動物細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)方法

(1)懸浮培養(yǎng)法(2)微載體培養(yǎng)法(3)多孔載體培養(yǎng)法(4)微囊化培養(yǎng)法(5)中空纖維培養(yǎng)法

9.誘導(dǎo)動物細(xì)胞融合的方法主要有:(1)病毒法(2)PEG法(3)電擊法(4)激光法

10.轉(zhuǎn)基因動物生物反應(yīng)器（整體掌握？）

(1)轉(zhuǎn)基因動物乳腺生物反應(yīng)器（藥用蛋白，如抗凝血Ⅲ、抗胰蛋白酶、葡萄糖苷酶、C蛋白）

(2)轉(zhuǎn)基因動物血液生物反應(yīng)器（人血紅蛋白、抗體或非活性狀態(tài)的融合蛋白）(3)轉(zhuǎn)基因動

物尿液生物反應(yīng)器（促性腺激素）(4)轉(zhuǎn)基因雞（蛋）生物反應(yīng)器（人干擾素）

1.單克隆抗體技術(shù)的基本原理

基于動物細(xì)胞融合技術(shù)得以實(shí)現(xiàn)的，即骨髓瘤細(xì)胞和B細(xì)胞的融合。骨髓瘤細(xì)胞在體外

培養(yǎng)能大量無限增殖，但不能分泌特異性抗體；抗原免疫的B細(xì)胞能產(chǎn)生特異性抗體，但在體外不能無限增殖。將免疫B細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合后形成的雜交瘤細(xì)胞，繼承了兩個親代

細(xì)胞的特性，既具有骨髓瘤細(xì)胞能無限增殖的特性，又具有免疫B細(xì)胞合成和分泌特異性抗

體的能力。通常使用HAT（H為次黃嘌呤、A為氨基蝶呤、T為胸腺嘧啶核苷）選擇培養(yǎng)基

對雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行篩選。未融合的脾細(xì)胞因不能在體外長期存活而死亡，未融合的骨髓瘤細(xì)

胞合成DNA的從頭合成途徑被培養(yǎng)基中的A阻斷，又因缺乏HGPRT（次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸

核糖轉(zhuǎn)移酶）和TK（胸腺嘧啶核苷激酶），不能利用培養(yǎng)基中的H和T完成DNA的合成過

程而死亡。只有融合的雜交瘤細(xì)胞由于從脾細(xì)胞獲得了HGPRT和TK，因此能在HAT培養(yǎng)基

中長期存活與繁殖并分泌抗體。

2.單克隆抗體的大量制備主要方法:（1）體內(nèi)培養(yǎng)法（2）體外培養(yǎng)法

6.重組ScFv的應(yīng)用:(1)用于構(gòu)建和生產(chǎn)免疫毒素(2)用于腫瘤的影像分析和治療

7.噬菌體抗體庫技術(shù)的基本原理:用PCR技術(shù)從人免疫細(xì)胞中擴(kuò)增出整套的VH和VL基因，克隆到噬菌體載體上并以融合蛋白的形式表達(dá)在其外殼表面。這樣一來噬菌體DNA中有抗

體基因的存在，同時在其表面又有抗體分子的表達(dá)，可以方便地利用抗原-抗體特異性結(jié)合而篩選出所需要的抗體，并進(jìn)行克隆擴(kuò)增。

7.噬菌體抗體庫構(gòu)建過程

(1)從外周血或脾、淋巴結(jié)等組織中分離B細(xì)胞，提取mRNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA；

(2)應(yīng)用抗體輕鏈和重鏈引物，根據(jù)建庫的需要通過PCR技術(shù)擴(kuò)增不同的抗體基因片段；

(3)構(gòu)建噬菌體載體；(4)用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化細(xì)菌，構(gòu)建全套抗體庫。

通過多輪的抗原親和吸附（結(jié)合）-洗脫-擴(kuò)增，最終篩選出抗原特異的抗體克隆。其中，噬

菌體抗體庫的篩選是關(guān)鍵環(huán)節(jié)和步驟。

減毒活疫苗的優(yōu)缺點(diǎn)：

優(yōu)點(diǎn)：

（1）通過自然感染途徑接種，可以誘導(dǎo)包括體液免疫、細(xì)胞免疫和粘膜免疫在內(nèi)的更全面的免疫應(yīng)答，使機(jī)體獲得更廣泛的免疫保護(hù)；（2）由于使用的是活的微生物他們可以在體內(nèi)

長時間起作用而誘導(dǎo)較強(qiáng)的免疫反應(yīng)，且由于活的微生物有增殖的特性，理論上只需要接

種一次，即可達(dá)到滿意的免疫效果；（3）可能引起水平傳播擴(kuò)大免疫效果，增強(qiáng)群體免疫屏

障；(4)一般不需要再疫苗中添加佐劑，生產(chǎn)工藝一般不需要濃縮純化，價格低廉。

缺點(diǎn)：

(1)一般減毒活疫苗均保留一定殘余毒力，對一些個體如免疫缺陷者可能誘發(fā)嚴(yán)重疾病，并

且由于種種原因如基因修飾等，減毒活疫苗可能出現(xiàn)毒力回復(fù)即“返祖”現(xiàn)象；(2)減毒活

疫苗是活的微生物制劑，可能造成環(huán)境污染而引發(fā)交叉感染等，并可能滯留在環(huán)境中形成傳

染源；(3)缺損顆?？赡芨蓴_免疫效果，因此產(chǎn)品分析評估較為困難；(4)保存運(yùn)輸?shù)葪l件要

求較高，如需冷藏等。

1.滅活疫苗的特點(diǎn)：(1)滅活疫苗常需多次接種；(2)接種滅活疫苗產(chǎn)生的抗體滴度隨著時

間而下降；(3)滅活疫苗需要量大。

第七章 發(fā)酵工程制藥

1.發(fā)酵類型：(1)微生物菌體發(fā)酵(2)微生物的酶(3)微生物的代謝產(chǎn)物發(fā)酵(4)微生物轉(zhuǎn)化發(fā)

酵(5)生物工程菌發(fā)酵

2.微生物發(fā)酵生產(chǎn)藥物的分類：(1)抗生素類(2)氨基酸類(3)核苷酸類(4)維生素類(5)甾體類

激素(6)多糖類(6)治療酶及酶抑制劑

3.菌種保藏方法：(1)斜面低溫保藏法(2)石蠟油封存法(3)沙土管保藏法(4)麩皮保藏法(5)甘

油懸液保藏法(6)冷東真空干燥保藏法(7)液氮超低溫保藏法(8)宿主保藏法

4.種子液具備的條件：(1)菌種的生長活力強(qiáng)，轉(zhuǎn)種至發(fā)酵罐后能迅速生長，延遲期短；(2)

生理狀態(tài)穩(wěn)定；(3)菌體總量及濃度能滿足大容量發(fā)酵罐的要求；(4)無雜菌污染，保證純種培養(yǎng)；()保持穩(wěn)定的生產(chǎn)能力

5.微生物的發(fā)酵方式：（1）分批發(fā)酵（2）補(bǔ)料—分批發(fā)酵（3）半連續(xù)發(fā)酵（4）連續(xù)發(fā)酵

5.發(fā)酵過程的中間分析項(xiàng)目：（1）產(chǎn)物產(chǎn)量（2）PH值（3）糖（4）氨基氮（5）菌絲形

態(tài)

6.發(fā)酵過程的影響因素及控制：（1）菌體濃度的影響及控制（2）營養(yǎng)物質(zhì)對發(fā)酵的影響

及控制（3）溫度的影響及控制（4）PH的影響及控制（5）溶氧的影響及控制（6）二氧化碳的影響及控制（7）泡沫的影響及控制（8）染菌對發(fā)酵的影響

第五篇：生物技術(shù)制藥教學(xué)大綱

第一章 緒論（2學(xué)時）第一節(jié) 生物技術(shù)概述 1 生物技術(shù)的概念 2 生物技術(shù)發(fā)展史 第二節(jié) 生物技術(shù)制藥 1 生物技術(shù)制藥的概念 2 生物技術(shù)在制藥中的應(yīng)用 我國生物技術(shù)制藥現(xiàn)狀和發(fā)展前景 4 醫(yī)藥生物技術(shù)發(fā)展展望

第二章 生物藥物（10學(xué)時）

1．生物藥物的來源、特性、分類與制備。（2學(xué)時）

2．氨基酸類藥物：氨基酸類藥物研究概況；在醫(yī)藥中的應(yīng)用；氨基酸生產(chǎn)。（2學(xué)時）3．多肽、蛋白質(zhì)類藥物：多肽、蛋白質(zhì)類藥物的特點(diǎn)、分離純化方法、工業(yè)生產(chǎn)制備過程。（2學(xué)時）

4．核酸類藥物：概述（分類、應(yīng)用）；生產(chǎn)方法；核酸類藥物的制備。（2學(xué)時）5．糖類藥物：制備；純化。（2學(xué)時）

第三章 基因工程制藥（8學(xué)時）

通過本章學(xué)習(xí)，了解基因工程藥物研制的意義，掌握基因工程藥物的研制過程、研制方法。1概述。

2基因工程藥物生產(chǎn)的基本過程。(2)3目的基因的獲得：直接分離法；從基因文庫中篩選；逆轉(zhuǎn)錄法；人工合成法。4目的基因與運(yùn)載體的體外重組：常用載體；目的基因與運(yùn)載體的體外重組。5重組分子導(dǎo)入受體細(xì)胞；導(dǎo)入方法；影響轉(zhuǎn)化的因素；陽性重組體的篩選。(2)6基因表達(dá)：大腸桿菌中的基因表達(dá)；真核基因在原核生物中的表達(dá)方式；真核基因在真核生物中的表達(dá)；真核基因在動物細(xì)胞中的表達(dá)。(2)7基因工程下游技術(shù)；下游技術(shù)的要求；基因工程菌的穩(wěn)定性；基因工程菌發(fā)酵。8基因工程藥物的分離、純化：分離純化的基本過程；分離純化的技術(shù)。

9基因工程藥物的質(zhì)量控制:材料的質(zhì)量控制;培養(yǎng)過程的質(zhì)量控制;純化工藝工程的質(zhì)量控制。(2)第四章 動物細(xì)胞工程制藥（8學(xué)時）1 概述： 形態(tài)及生理特性。（2）生產(chǎn)用的動物細(xì)胞：生產(chǎn)用動物細(xì)胞的要求；生產(chǎn)用動物細(xì)胞的獲取。4 基因工程細(xì)胞的構(gòu)建和篩選；真核細(xì)胞基因表達(dá)載體的構(gòu)建；基因載體的導(dǎo)入和高效表達(dá)工程細(xì)胞株的篩選。（2）動物細(xì)胞的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基 6 動物細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法（2）7 動物細(xì)胞大量培養(yǎng)的方法和操作方式 動物細(xì)胞生物反應(yīng)器及檢測控制系統(tǒng)：攪拌式生物反應(yīng)器；氣升式生物反應(yīng)器；流化床生物反應(yīng)器。（2）

第五章 抗體制藥（4學(xué)時）1概述

2單克隆抗體：制備；細(xì)胞融合；雜交瘤的培養(yǎng)、篩選及克隆化。（2）

3鼠源性單克隆抗體的改造：Ig分子的結(jié)構(gòu)模式圖；結(jié)構(gòu)改造；基因工程抗體。4抗體的應(yīng)用：臨床檢驗(yàn)；層析介質(zhì)；導(dǎo)向藥物。（2）