第一篇：生物技術(shù)制藥重點(diǎn)總結(jié)

1.生物藥物：又稱為生物工程，是指人們以現(xiàn)代生命科學(xué)為基礎(chǔ)，結(jié)合先進(jìn)的工程技術(shù)手段和其它基礎(chǔ)學(xué)科的科學(xué)原

理，按照預(yù)先的設(shè)計(jì)改造生物體或加工生物原料，為人類生產(chǎn)出所需產(chǎn)品或達(dá)到某種目的技術(shù)。

2.生物技術(shù)藥物： 采用DNA重組技術(shù)或其它生物技術(shù)生產(chǎn)的用于預(yù)防、治療和診斷疾病的藥物，主要是重組蛋白和

核酸類藥物，如細(xì)胞因子、纖溶酶原激活劑、血漿因子等。

3.質(zhì)粒載體：質(zhì)粒是指獨(dú)立于原核生物染色體之外具有自主復(fù)制能力的遺傳物質(zhì)。分三種構(gòu)型：共價(jià)閉合環(huán)狀

DNA(cccDNA)、開(kāi)環(huán)DNA(ocDNA)、線狀DNA(IDDNA)。在瓊脂糖凝膠電泳中遷移率：cccDNA > IDDNA > ocDNA

4.目的基因的常用制備方法主要包括化學(xué)合成法、PCR法、基因文庫(kù)法和cDNA文庫(kù)法等。

5.PCR法是指聚合酶鏈反應(yīng)，是根據(jù)生物體內(nèi)DNA復(fù)制原理在DNA聚合酶催化和dNTP參與下，引物依賴DNA模

板特異性的擴(kuò)增DNA。在含有DNA模板、引物、DNA聚合酶、dNTP的緩沖溶液中通過(guò)三個(gè)循環(huán)步驟擴(kuò)增DNA：：①變性—雙鏈DNA模板加熱變性，解離成單鏈模板；②退火—溫度下降，引物與單鏈模板結(jié)合（溫度下降，PCR特性下降，效率升高）；③延伸—溫度調(diào)整至DNA聚合酶最適宜溫度，DNA聚合酶催化dNTP加至引物3′-OH，引物以5′→3′方向延伸，最終與單鏈模板形成雙聯(lián)DNA, 并開(kāi)始下一個(gè)循環(huán)。

6.cDNA文庫(kù)法：cDNA是指與mRNA互補(bǔ)的DNA。cDNA文庫(kù)法是指提取生物體總mRNA，并以mRNA作為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的催化下合成cDNA的一條鏈，再在DNA聚合酶的作用下合成雙鏈cDNA，將全部cDNA都克隆到宿主細(xì)胞而構(gòu)建成cDNA文庫(kù)。

7.影響目的基因與載體之間連接效率的主要因素：

①DNA片段之間的連接方式；粘性末端的連接效率高于平頭末端。

②目的基因與載體的濃度和比例；增加DNA濃度可以提高連接效率，目的基因于載體DNA的摩爾數(shù)比應(yīng)大于1。③連接溫度，時(shí)間，連接酶的活性及緩沖體系。

8.重組DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞的方法：轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、顯微注射和電穿孔。

9.互補(bǔ)篩選法（最常見(jiàn)藍(lán)白班篩選法）需添加X(jué)–gal（X–Gal是β–半乳糖苷酶（β–galactosidase）的底物，水解后呈藍(lán)

色）和IPTG（是β–半乳糖苷酶的活性誘導(dǎo)物質(zhì)）篩選物質(zhì)進(jìn)行篩選。

10.菌落原位雜交：又稱探針原位雜交法，制備與目的的基因某一區(qū)域同源的探針序列，根據(jù)核酸雜交原理，探針序列

特異性地雜交目的基因，并通過(guò)放射性同位素或熒光基團(tuán)進(jìn)行定位監(jiān)測(cè)。

11.凝膠過(guò)濾層析：凝膠過(guò)濾層析(gel filtration chromatography)法又稱排阻層析或分子篩方法。基本原理是：根據(jù)生物

大分子的蛋白質(zhì)的質(zhì)量的大小來(lái)實(shí)現(xiàn)目的蛋白的分離純化。在凝膠過(guò)濾層析中所用的凝膠是一種惰性的不帶電荷具有三維空間結(jié)構(gòu)的多孔網(wǎng)狀物質(zhì)，凝膠的每個(gè)顆粒的微粒結(jié)構(gòu)就如一個(gè)篩子，當(dāng)樣品隨流動(dòng)相經(jīng)過(guò)凝膠柱時(shí)，較大的分子內(nèi)不能進(jìn)入凝膠網(wǎng)孔內(nèi)而收到排阻，將與流動(dòng)相一起首先被洗脫下來(lái)，而較小的分子進(jìn)入部分凝膠網(wǎng)孔內(nèi)，所以流出的速度相對(duì)較慢。

12.反相層析（RPC）和疏水層析（HIC）的比較：是根據(jù)蛋白質(zhì)疏水性差異來(lái)實(shí)現(xiàn)分離純化。先比反相層析而言，疏

水層析回收率較高，蛋白質(zhì)變性的可能性較小。反相層析和疏水層析的差異在于前者在有機(jī)相中進(jìn)行，蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)反向流動(dòng)相與固定相作用有時(shí)會(huì)發(fā)生部分變性，而后者通常在水溶液中進(jìn)行，蛋白質(zhì)在分離過(guò)程中一般仍保持其天然構(gòu)象。

13.蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法：紫外吸收法、BCA法、福林—酚試劑法（lowry）、考馬斯亮藍(lán)法、ELISA法等。

14.蛋白質(zhì)純度檢查的常見(jiàn)方法：SDS-PAGE法（最常用）、非變性PAGE法、層析法等。

15.蛋白質(zhì)序列的分析方法：N-端氨基酸序列分析法（基本原理Edman法）、C-端氨基酸序列分析法。

16.體外培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的類型：貼壁依賴性細(xì)胞，非貼壁依賴性細(xì)胞和兼性貼壁細(xì)胞。

17.動(dòng)物細(xì)胞與微生物細(xì)胞，植物細(xì)胞相比較具有的特點(diǎn)：

①比微生物細(xì)胞大得多，無(wú)細(xì)胞壁，抗機(jī)械強(qiáng)度低，對(duì)剪切力敏感，適應(yīng)環(huán)境能力差

②倍增時(shí)間長(zhǎng)生長(zhǎng)緩慢，正常二倍體細(xì)胞的生長(zhǎng)壽命是有限的③對(duì)培養(yǎng)基的要求高，易受微生物污染，培養(yǎng)時(shí)常常需要添加抗生素

④生長(zhǎng)大多需貼附于基質(zhì)，相互黏連以集群形式存在，并有接觸抑制現(xiàn)象

⑤多半將產(chǎn)物分泌在細(xì)胞外，便于收集和純化。

18.動(dòng)物細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)要求是：1.碳源不能為無(wú)機(jī)物，大多為葡萄糖

2.氮源也不能為無(wú)機(jī)物，主要為各種氨基酸

3.在很多情況下尚需添加5%-20%的小牛血清或適量的動(dòng)物胚胎浸出液

19.動(dòng)物培養(yǎng)基可分為：天然培養(yǎng)基，合成培養(yǎng)基和無(wú)血清培養(yǎng)基三大類.20.原代細(xì)胞：直接將動(dòng)物組織或器官經(jīng)過(guò)粉碎，消化而制的的懸浮細(xì)胞稱為原代細(xì)胞.21.懸浮培養(yǎng)法：是細(xì)胞在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)生長(zhǎng)繁殖的培養(yǎng)方法，它適用于一切種類的非貼壁細(xì)胞，兼性貼壁細(xì)胞，可連續(xù)測(cè)定細(xì)胞濃度，連續(xù)收集部分細(xì)胞進(jìn)行繼代培養(yǎng)，也無(wú)需消化分散，細(xì)胞收率高

22.木瓜蛋白酶水解IgG分子可產(chǎn)生兩個(gè)抗原結(jié)合片段（Fab）和一個(gè)可結(jié)晶片段（Fc）

23.胃蛋白酶水解IgG分子可產(chǎn)生一個(gè)F(ab’)2和若干裂解小分子片段（pFc’）

24..單克隆抗體技術(shù)的基本原理：基于動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)得以實(shí)現(xiàn)的，即骨髓瘤細(xì)胞與B細(xì)胞的融合。骨髓瘤細(xì)胞在體外培養(yǎng)能大量無(wú)限增殖，但不能分泌特異性抗體，而抗原免疫的B細(xì)胞能產(chǎn)生特異性抗體，但在體外不能無(wú)限增殖。將免疫B細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合后形成的雜交瘤細(xì)胞，繼承了連個(gè)親代細(xì)胞的特性，既具有骨髓瘤細(xì)胞能無(wú)限增殖的特性，又具有免疫B細(xì)胞合成和分泌特異性抗體的能力。

25.骨髓瘤細(xì)胞發(fā)生回復(fù)突變每3-6個(gè)月應(yīng)用8-氮雜鳥(niǎo)嘌呤（8-AG）篩選一次，以便殺死突變細(xì)胞

26.細(xì)胞融合的方法：常用的有轉(zhuǎn)動(dòng)法和離心法.27.雜交瘤細(xì)胞的克隆化的方法有：有限稀釋法和軟瓊脂平板法，顯微操作法

28.雙特異性抗體：是含有兩個(gè)不同配體結(jié)合位點(diǎn)的抗體分子，它有兩個(gè)不同的抗原結(jié)合部位（兩個(gè)臂），可分別結(jié)合兩種不同的抗原表位。其中一個(gè)可與靶細(xì)胞表面抗原結(jié)合，另一個(gè)則可與效應(yīng)物（如藥物，效應(yīng)細(xì)胞等）結(jié)合，從而將效應(yīng)物直接導(dǎo)向靶組織細(xì)胞。

29.細(xì)胞內(nèi)抗體：亦稱內(nèi)抗體，主要是指細(xì)胞內(nèi)合成并作用于細(xì)胞內(nèi)組分的抗體。

30.如何構(gòu)建噬菌體抗體庫(kù)？構(gòu)建噬菌體抗體庫(kù)通常包括以下幾個(gè)過(guò)程：1.從外周血或脾，淋巴結(jié)等組織中分離B細(xì)胞，提取mRNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA2，應(yīng)用抗體輕鏈和重鏈引物，根據(jù)建庫(kù)的需要通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增不同的抗體基因片段3，構(gòu)建噬菌體載體4，用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化細(xì)菌，構(gòu)建全套抗體庫(kù)。通過(guò)多倫的抗原親和吸附-洗脫-擴(kuò)增，最終篩選出抗原特異性地抗體克隆。篩選為關(guān)鍵環(huán)節(jié)和步驟。

31.疫苗的組成：具有免疫保護(hù)性的抗原（Ag）如蛋白質(zhì)，多肽，多糖或核酸等與免疫佐劑混合制備而成。

32.佐劑是指能非特異性的增強(qiáng)免疫應(yīng)答或改變免疫應(yīng)答類型的物質(zhì)，可先于抗原或與抗原一起注入機(jī)體。

33.目前用于人體的佐劑只有兩種：1，鋁佐劑（氫氧化鋁或磷酸鋁）2，MF59

34.滅活疫苗和活疫苗的特點(diǎn)比較：（P122,表5-4）

35.聯(lián)合疫苗包括多聯(lián)疫苗和多價(jià)疫苗，多聯(lián)疫苗可用于預(yù)防由不同病原微生物引起的傳染病，而多價(jià)疫苗僅預(yù)防同一

種病原微生物的不同亞型引起的傳染病。

36.核酸疫苗是20世紀(jì)90年代發(fā)展起來(lái)的一種新型疫苗。核酸疫苗包括DNA疫苗和RNA疫苗，由能引起機(jī)體保護(hù)性

免疫反應(yīng)的抗原的編碼基因和載體組成。核酸疫苗又稱為基因疫苗，基因免疫或核酸免疫

37.酶的分離純化過(guò)程必須遵循以下原則：

1、全部操作一般在低溫（0-4攝氏度）進(jìn)行。

2、在分離提純過(guò)程中，不能

劇烈攪拌。

3、在提純?nèi)軇┲屑右恍┍Ｗo(hù)劑，如少量EDTA,少量 –巰基乙醇等

4、在分離提純過(guò)程中要不斷測(cè)定酶的的活力和蛋白質(zhì)濃度，以對(duì)純化過(guò)程進(jìn)行檢測(cè)。一般用兩個(gè)指標(biāo)來(lái)衡量分離純化方法的好壞：總活力的回收率和比活力提高倍數(shù)。

38.傳統(tǒng)的酶固定化方法大致可分為載體聯(lián)合法，交聯(lián)法和包埋法

39.固定化對(duì)酶穩(wěn)定性的影響：

1、熱穩(wěn)定性提高

2、對(duì)有機(jī)試劑及酶抑制劑的穩(wěn)定性提高

3、對(duì)PH，蛋白酶，儲(chǔ)存

盒操作條件的穩(wěn)定性提高

40.目前常用的菌種保藏方法有：

1、斜面低溫保藏法，一般可保存1-6個(gè)月左右

2、石蠟油封存法，一般可保存1-2年左右

3、砂土管保藏法，保藏期約1-10年

4、麩皮保藏法，保藏期在一年以上

5、甘油懸液保藏法，-20度保藏期約為0.5-1年，-70度下保藏期可達(dá)10年

6、冷凍真空干燥保藏法，5-15年

7、液氮超低溫度保藏法，15年以上

8、宿主保藏法

41、產(chǎn)物產(chǎn)量的測(cè)定方法有：生物測(cè)定法和化學(xué)測(cè)定法，一般采用化學(xué)測(cè)定法，以求迅速躋身反應(yīng)生產(chǎn)情況。中國(guó)微生物菌種保藏委員會(huì)CCCCM中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC

美國(guó)典型菌種保藏中心 ATCC美國(guó)的北部地區(qū)研究實(shí)驗(yàn)室NRRL

英國(guó)的國(guó)家典型菌種保藏所NCTC日本的大阪發(fā)酵研究所IFO

德國(guó)菌種保藏中心DSM42、中間反應(yīng)產(chǎn)量測(cè)定：產(chǎn)物產(chǎn)量、ph值、糖、氨基酸、菌絲形態(tài)。

43、PH對(duì)發(fā)酵的影響有哪些？

1.PH影響酶的活性，當(dāng)PH值抑制菌體的某些酶的活性時(shí)使菌的新陳代謝受阻

2.PH影響微生物細(xì)胞膜所帶電荷的改變，從而改變細(xì)胞膜的通透性，影響微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和代謝物的排泄，因此影響新陳代謝的進(jìn)行

3.PH影響培養(yǎng)基某些成分和中間代謝物的解離，從而影響微生物對(duì)這些物質(zhì)的利用

4.PH影響代謝方向，PH不同，往往引起菌體代謝過(guò)程不同，是代謝產(chǎn)物的質(zhì)量和比例發(fā)生改變。

44、基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)的特點(diǎn)？采用基因重組技術(shù)構(gòu)建的基因工程菌與細(xì)胞，由于帶有外來(lái)基因，對(duì)其進(jìn)行培養(yǎng)和

發(fā)酵的工藝技術(shù)通常與單純的微生物細(xì)胞的工藝技術(shù)有不同之處?；蚬こ叹l(fā)酵的目的主要是實(shí)現(xiàn)外源基因的高效表達(dá)，以獲取大量的外源基因產(chǎn)物。而外源基因的高技術(shù)表達(dá)不僅涉及宿主、載體與外源基因三者之間的相互關(guān)系，與所處環(huán)境條件密切相關(guān)?；蚬こ叹l(fā)酵一般分兩個(gè)階段：前期是菌體生長(zhǎng)階段，后期是菌體生長(zhǎng)階段。

45、基因工程菌不穩(wěn)定性的原因？主要表現(xiàn)在質(zhì)粒的不穩(wěn)定性以及表達(dá)產(chǎn)物的不穩(wěn)定性。而質(zhì)粒的不穩(wěn)定性又分結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性以及分離不穩(wěn)定。結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性是由于轉(zhuǎn)位作用和重組作用所引起的質(zhì)粒DNA的重排與損失。分離的不穩(wěn)定性是細(xì)胞分裂過(guò)程中發(fā)生的不平均分配，從而造成質(zhì)粒的缺陷型分配，以致造成質(zhì)粒丟失。引起質(zhì)粒載體不穩(wěn)定性的原因只要是宿主新陳代謝負(fù)荷的加重，大量外源蛋白的形成對(duì)宿主細(xì)胞的損害，通常是致死的，失去制造外源蛋白的能力的細(xì)胞一般生長(zhǎng)的快得多，從而能替代有生產(chǎn)能力的菌株，這就導(dǎo)致了基因工程菌的不穩(wěn)定性。

46、突變生物合成：采用一些誘變劑，如紫外線，激光，高速電子流或一些化學(xué)藥物如亞硝基胍，溴化乙啶等對(duì)藥物的產(chǎn)生菌進(jìn)行誘變，是他們喪失合成某種中間體的能力，因而不能合成原來(lái)結(jié)構(gòu)的化合物，陳武阻斷突變株。在發(fā)酵培養(yǎng)這些阻斷突變株時(shí)添加某些天然或化學(xué)合成的化合物作為中間體，這些突變株能利用這些中間體合成一些新結(jié)構(gòu)的最終化合物，這個(gè)過(guò)程稱為突變生物合成。

47、微生物轉(zhuǎn)化系酶促化學(xué)反應(yīng)，具有與通常有機(jī)化學(xué)反應(yīng)不一樣的特點(diǎn)：

1.以具有活性中心和特殊空間結(jié)構(gòu)的酶作為催化劑

2、對(duì)作用的基質(zhì)有嚴(yán)格的選擇性和專一性

3、酶催化反應(yīng)的速度極高，非一般催化劑可比

4、一般在常溫常壓下進(jìn)行，反應(yīng)條件溫和

48、微生物對(duì)甾體轉(zhuǎn)化反應(yīng)的特點(diǎn)：在微生物轉(zhuǎn)化過(guò)程中，專一，有效的菌體量的多少，以及甾體底物在水相的溶解

性等問(wèn)題成為影響轉(zhuǎn)化率的重要因素，目前采用的兩階段發(fā)酵及兩相發(fā)酵方法很好的解決了這些甾體微生物轉(zhuǎn)化中的問(wèn)題。

49、蛋白質(zhì)藥物對(duì)化學(xué)修飾的意義：

50、最常用的修飾劑有：主要是水溶性高分子聚合物，如葡聚糖、右旋糖苷、肝素以及低分子肝素、多聚唾液酸、聚

乙烯吡咯烷酮、聚氨基酸、PEG、白蛋白等。目前以PEG最常用的。其毒性小、無(wú)抗原性、溶解性良好。

51、修飾策略有隨機(jī)修飾與定點(diǎn)修飾兩類。氨基修飾主要用隨機(jī)修飾，在利用特定的修飾劑可以實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)修飾。巰基

修飾多為定點(diǎn)修飾。羧基修飾為定點(diǎn)修飾。

52、選擇PEG修飾劑應(yīng)該考慮的因素：PEG的Mr，修飾位點(diǎn)，水解穩(wěn)定性和反應(yīng)活性。

53、核酶：核酶不是普通的蛋白質(zhì)酶，而是一類具有催化活性的核酸分子。目前已知的具有核酶催化功能的RNA結(jié)

構(gòu)至少可以分成5類：發(fā)夾狀核酶，錘頭狀核酶，I型內(nèi)含子核酶，RNaseP核酶，丁型肝炎病毒核酶等

54、反義核酸：是指具有抑制基因表達(dá)作用。包括反義RNA、反義DNA分子，由部分RNA和部分DNA形成RNA-DNA

嵌合分子，以及經(jīng)高度化學(xué)修飾的寡聚核酸類似物，這些分子統(tǒng)稱反義核酸類藥物。

55、褔米韋生經(jīng)美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市成為第一個(gè)反義核酸類藥物。

56、RNAi:即RNA干擾現(xiàn)象，是近幾年發(fā)現(xiàn)的一種由雙鏈RNA誘導(dǎo)的基因表達(dá)調(diào)控和基因沉默過(guò)程。主要階段：

啟動(dòng)階段和執(zhí)行階段

57、小干擾RNA(siRNA)：在啟動(dòng)階段，當(dāng)細(xì)胞由于病毒感染等原因出現(xiàn)雙鏈RNA分子或帶有較長(zhǎng)雙鏈的發(fā)卡結(jié)構(gòu)

RNA時(shí)，細(xì)胞中的Dicer的核酸酶會(huì)識(shí)別其雙鏈RNA，將其降解成21~23bp長(zhǎng)的小干擾RNA。主要參與RNA干擾（RNAi）現(xiàn)象，以帶有專一性的方式調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。

第二篇：生物技術(shù)制藥總結(jié)

生物技術(shù)：人們以現(xiàn)代生命科學(xué)為基礎(chǔ)，結(jié)合先進(jìn)的工程技術(shù)手段和其他基礎(chǔ)科學(xué)的科學(xué)原理，按照預(yù)先的設(shè)計(jì)改造生物體或加工生物原料，為人類生產(chǎn)出所需產(chǎn)品或達(dá)到某種目的的技術(shù)

1基因工程制藥：利用基因重組技術(shù)將外援基因?qū)胨拗骶蚣?xì)胞進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)，以獲得蛋白質(zhì)藥物的過(guò)程。

2.載體：是攜帶外源目的基因或DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)外援基因或DNA的無(wú)性繁殖或表達(dá)有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些DNA分子。

細(xì)胞傳代passage：將細(xì)胞從一個(gè)培養(yǎng)器皿中消化、分散并接種至另一個(gè)培養(yǎng)器皿中的操作。細(xì)胞克隆培養(yǎng)（clonal culture）：即單細(xì)胞分離培養(yǎng)，是將動(dòng)物組織分散后，將一個(gè)細(xì)胞從群體細(xì)胞中分離出來(lái)，由單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)成純系細(xì)胞集群。

動(dòng)物細(xì)胞的復(fù)蘇：其原則是快速融化，必須將凍存在-196℃液氮中的細(xì)胞快速融化至37℃，使細(xì)胞外凍存時(shí)的冰晶迅速融化，避免冰晶緩慢融化時(shí)進(jìn)入細(xì)胞形成再結(jié)晶，對(duì)細(xì)胞造成損害。

細(xì)胞融合（cell fusion）：是指在外力（誘導(dǎo)劑或促融劑）作用下，兩個(gè)或兩個(gè)以上的異源（種、屬間）細(xì)胞或原生質(zhì)體相互接觸，從而發(fā)生膜融合、胞質(zhì)融合和核融合并形成雜種細(xì)胞的現(xiàn)象，或稱細(xì)胞雜交。

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物（transgenic animal）：采用基因工程技術(shù)將外源目的基因?qū)雱?dòng)物生殖細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞和早期胚胎，并在受體動(dòng)物的染色體上穩(wěn)定整合，在經(jīng)過(guò)發(fā)育途徑將外源目的基因穩(wěn)定地傳給子代，通過(guò)這項(xiàng)技術(shù)所獲得的動(dòng)物即為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。

胚胎干細(xì)胞（embryo stem cell）：簡(jiǎn)稱ES細(xì)胞，是從早期胚胎細(xì)胞團(tuán)分離出來(lái)并能在體外培養(yǎng)的一種高度未分化的、具有形成所有成年細(xì)胞類型能力的全能干細(xì)胞。它是正常二倍體型，像早期胚胎細(xì)胞一樣具有發(fā)育上的全能性。

抗體工程制藥（antibody engineering pharmaceutics）：利用基因工程、細(xì)胞工程（包括動(dòng)物細(xì)胞工程和植物細(xì)胞工程）和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物及轉(zhuǎn)基因植物技術(shù)生產(chǎn)抗體藥物的過(guò)程。

單克隆抗體（monoclonal antibody，mAb）：簡(jiǎn)稱單抗，將能大量擴(kuò)增和永生的骨髓瘤細(xì)胞和能合成分泌特異性抗體的B細(xì)胞（僅識(shí)別一種抗原表位）進(jìn)行融合得到雜交瘤細(xì)胞，經(jīng)篩選和克隆化的雜交瘤細(xì)胞僅能合成及分泌抗單一抗原表位的特異性抗體。

雜交瘤細(xì)胞克隆化（cloning）：是指將陽(yáng)性孔中分泌抗體的單個(gè)細(xì)胞分離出來(lái)。融合后的雜交瘤細(xì)胞一般要經(jīng)過(guò)3次克隆化才能達(dá)到100%的陽(yáng)性克隆。

雙特異性抗體（bispecific antibody，bsAb）：亦稱雙功能抗體，是含有兩個(gè)不同配體結(jié)合位點(diǎn)的抗體分子，它有兩個(gè)不同的抗原結(jié)合部位（兩個(gè)臂），可分別結(jié)合兩種不同的抗原表位。嵌合抗體（chimeric antibody）：是利用DNA重組技術(shù)，將異源單抗的輕、重鏈可變區(qū)基因插入含有人抗體恒定區(qū)的表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的抗體，表達(dá)的抗體分子中輕、重鏈的V區(qū)是異源的，而C區(qū)是人源的，即整個(gè)抗體分子的60%~70%是人源的。

人源化抗體（humanized antibody，hAb）：通過(guò)CDR移植即把鼠抗體的CDR（互補(bǔ)決定區(qū)）序列移植到人抗體的可變區(qū)內(nèi)所得到的抗體，也稱CDR移植抗體或改型抗體。該抗體既具有鼠源性單抗的特異性又保持了人抗體的功能（C區(qū)的功能）。

免疫原性（immunogenicity）：抗原能刺激機(jī)體特異性免疫細(xì)胞，使其活化、增值、分化，最終產(chǎn)生免疫效應(yīng)物質(zhì)（抗體或致敏淋巴細(xì)胞）的特性。

免疫反應(yīng)性（immunoreactivity）：抗原與相應(yīng)免疫效應(yīng)物質(zhì)在體內(nèi)或體外相遇時(shí)，可發(fā)生

特異性結(jié)合而產(chǎn)生免疫反應(yīng)的特性。

減毒活疫苗（live attenuated vaccine）：是通過(guò)不同的方式手段使病原體的毒性即致病

性減弱或喪失后獲得的一種由完整的微生物組成的疫苗制品。

滅活疫苗（inactivated）：是將病原體經(jīng)培養(yǎng)增殖、滅活純化處理，使其完全喪失感染性，但保留了病原體的幾乎全部組分因此滅活疫苗具有較好的免疫原性和安全性。

亞單位疫苗（subunit vaccine）：利用微生物的某種表面結(jié)構(gòu)成分（抗原）制成、能誘發(fā)

機(jī)體產(chǎn)生抗體的疫苗。

分解代謝阻遏（catabolite repression）：在菌體的生長(zhǎng)階段被菌體快速利用的碳源會(huì)產(chǎn)

生大量的分解產(chǎn)物，這些代謝產(chǎn)物阻遏次級(jí)代謝酶系的合成，只有當(dāng)這類碳源被消耗完后，阻遏作用被消除，菌體才由生長(zhǎng)階段轉(zhuǎn)入次級(jí)代謝產(chǎn)物合成階段，這種發(fā)酵過(guò)程中的次級(jí)代

謝產(chǎn)物在碳源被消耗盡時(shí)才產(chǎn)生和積累的現(xiàn)象稱為分解代謝阻遏。

生物技術(shù)：人們以現(xiàn)代生命科學(xué)為基礎(chǔ)，結(jié)合先進(jìn)的工程技術(shù)手段和其他基礎(chǔ)科學(xué)的科學(xué)原

理，按照預(yù)先的設(shè)計(jì)改造生物體或加工生物原料，為人類生產(chǎn)出所需產(chǎn)品或達(dá)到某種目的的技術(shù)。

種齡（inoculumage）：種子罐中培養(yǎng)的菌絲轉(zhuǎn)入下一級(jí)種子罐或發(fā)酵罐時(shí)得培養(yǎng)時(shí)間

生物技術(shù)藥物的特性？

（1）理化性質(zhì)特性（1）相對(duì)分子量大（2）結(jié)構(gòu)復(fù)雜：蛋白質(zhì)和核酸均為生物大分子，蛋

白質(zhì)含有四級(jí)結(jié)構(gòu)（3）穩(wěn)定性差（2）藥理學(xué)作用特性（1）活性與作用機(jī)制明確：活性物

質(zhì)對(duì)生理功能的調(diào)節(jié)機(jī)制比較清楚（2）作用針對(duì)性強(qiáng)：有特定的靶分子、靶細(xì)胞或靶器官

（3）毒性低：生物技術(shù)藥物本身是體內(nèi)天然存在的物質(zhì)或它們的衍生物（4）體內(nèi)半衰期短

（5）有種屬特異性（6）可產(chǎn)生免疫原抑制（3）生產(chǎn)制備特性（1）藥物分子在原料中的含量低（2）原料液中常存在降解目標(biāo)產(chǎn)物的雜質(zhì)：應(yīng)采取快速分離純化的方法以除去影響

目標(biāo)產(chǎn)物穩(wěn)定性的物質(zhì)（3）制備工藝條件溫和：目的產(chǎn)物不穩(wěn)定（4）分離純化困難：需要

多種不同原理的層析單元操作才能達(dá)到要用的純度（5）產(chǎn)品易受有害物質(zhì)（4）質(zhì)量控制特

性

質(zhì)粒的特點(diǎn)：（1）是指獨(dú)立于原核生物染色體之外具有自主復(fù)制能力的遺傳物質(zhì)。（2）質(zhì)粒

具有遺傳傳遞和遺傳交換的能力（3）質(zhì)粒具有不相容性：兩種親緣關(guān)系密切的不同質(zhì)粒不

能在同一宿主細(xì)胞中穩(wěn)定共存。4..共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(ccDNA)，開(kāi)環(huán)DNA(ocDNA)，線狀

DNA(lDNA)在瓊脂糖凝膠電泳中

5.復(fù)制子松弛型復(fù)制子的復(fù)制和宿主蛋白的合成功能

無(wú)關(guān)，宿主染色體DNA復(fù)制受阻時(shí)，質(zhì)粒仍可復(fù)制；嚴(yán)謹(jǐn)型復(fù)制子的復(fù)制與宿主蛋白質(zhì)的合成相關(guān)，因此在每個(gè)宿主細(xì)胞中為低拷貝數(shù)，僅1~3個(gè)。

6.克隆表達(dá)的質(zhì)粒載體涉及三個(gè)要素：

（1）復(fù)制子（2）選擇標(biāo)記：由質(zhì)粒攜帶的賦予宿主細(xì)胞新的表型的基因，用于鑒定和篩選

轉(zhuǎn)化有質(zhì)粒的宿主細(xì)胞。常見(jiàn)的標(biāo)記：氨芐西林（Amp），卡那霉素（Kan）（3）多克隆位點(diǎn)

（MCS）：質(zhì)粒載體中由多個(gè)限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列密集排列形成的序列。

7.目的基因常用制備方法

(1)化學(xué)合成法（2）PCR法：在含有DNA模板、引物、DNA聚合酶、dNTP的緩沖溶液中通

過(guò)下列步驟擴(kuò)增DNA：a）變性：雙鏈DNA模板加熱變性，解離成單鏈模板；b）退火：降

低溫度，引物與單鏈模板結(jié)合；c）延伸：溫度調(diào)整至DNA聚合酶最適宜溫度，最終與單鏈

模板形成雙鏈，并開(kāi)始下一個(gè)變性、退火、延伸循環(huán)。（3）基因文庫(kù)法（4）cDNA文庫(kù)法

8.影響目的基因與載體之間連接效率的主要因素：

9.（1）DNA片段之間的連接方式：粘性末端的連接效率高于平頭末端。（2）目的基因與載

體的濃度和比例：增加DNA濃度可以提高連接效率，目的基因與載體DNA的摩爾數(shù)比應(yīng)大

于1.（3）連接溫度、時(shí)間、連接酶的活性及緩沖液。

9.重組DNA導(dǎo)入大腸桿菌，常用的感受態(tài)細(xì)胞制備方法：氯化鈣法

10.重組子的篩選與鑒定：

（1）載體遺傳標(biāo)記法：a)抗生素抗性篩選法

b)互補(bǔ)篩選法：重組子轉(zhuǎn)化成宿主細(xì)胞，載體的表達(dá)產(chǎn)物與宿主細(xì)胞中營(yíng)養(yǎng)缺陷性突變發(fā)生

互補(bǔ)作用，從而實(shí)現(xiàn)重組子的篩選。藍(lán)白斑篩選：lacZα基因可編碼β—半乳糖苷酶α氨基

端的α互補(bǔ)肽段，與宿主細(xì)胞編碼的缺陷型β—半乳糖苷酶α實(shí)現(xiàn)互補(bǔ)，可分解底物5-溴-4-

氫-3-吲哚-β-D-半乳糖苷，形成藍(lán)色菌落。由于lacAα基因的插入失活而成白色，空載體的宿主細(xì)胞呈藍(lán)色。c)營(yíng)養(yǎng)缺陷篩選法d噬菌斑篩選法(2)核酸分子雜交法

(3)限制性內(nèi)切酶圖譜法(4)DNA序列測(cè)定法：雙脫氧終止法(5)目的基因表達(dá)產(chǎn)物測(cè)定法

12.外源基因在大腸桿菌中的表達(dá)形式：

(1)胞內(nèi)表達(dá)：(a)非融合蛋白的胞內(nèi)表達(dá)：形成包涵體（B）融合蛋白的胞內(nèi)表達(dá)：在大腸桿

菌內(nèi)較穩(wěn)定（2）分泌表達(dá)：（a)分泌至周質(zhì)（b）分泌至胞外

11.外源基因在原核生物中表達(dá)的重要調(diào)控元件

(1)啟動(dòng)子：是DNA鏈上能與RNA聚合酶結(jié)合并起始mRNA合成的一段序列，是決定外源基

因在原核生物中表達(dá)效率的關(guān)鍵因素。(2)核糖體結(jié)合位點(diǎn)：SD序列(3)終止子

13.大腸桿菌中外源蛋白表達(dá)效率的影響因素：(1)外源基因密碼子：偏好密碼子（蛋白質(zhì)合成迅速，錯(cuò)配率低）和稀有密碼子(2)mRNA結(jié)構(gòu)：減少G、C含量，增加A、T含量(3)表達(dá)

載體：高拷貝數(shù)、適用范圍廣、穩(wěn)定性高、表達(dá)產(chǎn)物容易純化(4)外源蛋白穩(wěn)定性

14.分離純化技術(shù)應(yīng)滿足下列要求：(1)技術(shù)條件要溫和，能保持目的產(chǎn)物的生物活性；(2)選

擇性要好(3)回收率要高(4)兩個(gè)技術(shù)之間要能直接銜接(5)整個(gè)分離純化過(guò)程要快

15.基因重組蛋白的主要分離技術(shù)

(1)離心(2)沉淀(3)膜分離(4)雙水相萃取

16基因重組蛋白的主要純化技術(shù):

(1)離子交換層析(2)親和層析(3)凝膠過(guò)濾層析(4)反相層析和疏水層析

17.選擇分離純化方法的依據(jù)：

（元，層析分離次序的選擇也同樣重要。(3)根據(jù)分離純化工藝的要求來(lái)選擇(a)具有良好的穩(wěn)

定性、重復(fù)性和較高的安全性(b)盡可能減少組成工藝的步驟(c)分離純化工藝所用的時(shí)間要

盡可能的短(d)工藝和技術(shù)必須高效

18．基因工程藥物的質(zhì)量控制要點(diǎn)

(1)蛋白質(zhì)含量的測(cè)定(2)蛋白質(zhì)純度檢測(cè)(3)蛋白質(zhì)分子質(zhì)量測(cè)定(4)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)測(cè)定(5)蛋

白質(zhì)序列分析(6)內(nèi)毒素分析、宿主蛋白與核酸殘留分析

19.蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

(1)紫外吸收法(2)BCA法(3)Lowry法(4)考馬斯亮藍(lán)法(5)SDS-PAGE掃描分析法

20.蛋白質(zhì)純度的檢測(cè)：電泳法、層析法、質(zhì)譜法、末端氨基酸殘基分析法

21.蛋白質(zhì)Mr測(cè)定有SDS-PAGE法、凝膠層析法、質(zhì)譜法

22.蛋白質(zhì)等電點(diǎn)測(cè)定的常用方法：等電聚焦法。

23.蛋白質(zhì)序列的分析:N-端氨基酸序列分析，C-端氨基酸序列分析

根據(jù)體外培養(yǎng)時(shí)動(dòng)物細(xì)胞對(duì)生長(zhǎng)基質(zhì)的依賴性，可將動(dòng)物細(xì)胞分為

(1)貼壁依賴性細(xì)胞(2)非貼壁依賴性細(xì)胞(3)兼性貼壁細(xì)胞

1.動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的環(huán)境條件

(1)培養(yǎng)溫度（哺乳類37℃，昆蟲(chóng)25~28℃）(2)pH值（大多數(shù)7.2~7.4）(3)通氧量（一定量的CO2）(4)防止污染(5)基本營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(6)滲透壓

3.動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)特性

(1)比微生物細(xì)胞大得多，無(wú)細(xì)胞壁，抗機(jī)械強(qiáng)度低，對(duì)剪切力敏感，適應(yīng)環(huán)境能力差；(2)

倍增時(shí)間長(zhǎng)，生長(zhǎng)緩慢，正常二倍體細(xì)胞的生長(zhǎng)壽命是有限的；(3)對(duì)培養(yǎng)基要求高，易受

微生物污染，培養(yǎng)時(shí)需要添加抗生素；(4)生長(zhǎng)大多需貼附于基質(zhì)，相互粘連以集群形式存

在，并有接觸抑制現(xiàn)象；(5)多半將產(chǎn)物分泌在細(xì)胞外，便于收集和純化；(6)對(duì)蛋白質(zhì)的合成條件和修飾功能與細(xì)菌不同，動(dòng)物細(xì)胞可對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行完善的翻譯后修飾，特別是糖基化，與天然產(chǎn)品更一致，更適合于臨床應(yīng)用。

4.原代培養(yǎng)的主要步驟

(1)從健康動(dòng)物體內(nèi)無(wú)菌條件下取出適量組織，剪切成小薄片；(2)加入適宜濃度的胰蛋白酶

或膠原酶和EDTA等進(jìn)行消化作用使細(xì)胞分散；(3)將分散的細(xì)胞進(jìn)行洗滌并純化后，以2×

10^6~7×10^6 /ml的濃度加到培養(yǎng)基中，37℃下進(jìn)行原代培養(yǎng)，并適時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。分為

組織塊培養(yǎng)和單層細(xì)胞培養(yǎng)兩種方法。

5.動(dòng)物細(xì)胞深低溫保存的基本原理

在-70℃以下時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的酶活性均已停止，即代謝處于完全停滯狀態(tài)，故可以長(zhǎng)期保存。

在不加任何條件下直接凍存細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞內(nèi)和外環(huán)境中的水都會(huì)形成冰晶，能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)發(fā)

生機(jī)械損傷、電解質(zhì)濃度升高、滲透壓改變、脫水、pH改變、蛋白質(zhì)變性等，能引起細(xì)胞

死亡。目前為了保存細(xì)胞，都采用液氮低溫（-196℃）凍存的方法。

6.動(dòng)物細(xì)胞的復(fù)蘇

其原則是快速融化，必須將凍存在-196℃液氮中的細(xì)胞快速融化至37℃，使細(xì)胞外凍

存時(shí)的冰晶迅速融化，避免冰晶緩慢融化時(shí)進(jìn)入細(xì)胞形成再結(jié)晶，對(duì)細(xì)胞造成損害。

7.動(dòng)物細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)要求特點(diǎn)

(1)碳源不能為無(wú)機(jī)物，大多為葡萄糖；(2)氮源不能為無(wú)機(jī)物，主要為各種氨基酸；(3)在很

多情況下尚需添加5%~20%的小牛血清或適量的動(dòng)物胚胎浸出液。

8.動(dòng)物細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)方法

(1)懸浮培養(yǎng)法(2)微載體培養(yǎng)法(3)多孔載體培養(yǎng)法(4)微囊化培養(yǎng)法(5)中空纖維培養(yǎng)法

9.誘導(dǎo)動(dòng)物細(xì)胞融合的方法主要有:(1)病毒法(2)PEG法(3)電擊法(4)激光法

10.轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生物反應(yīng)器（整體掌握？）

(1)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器（藥用蛋白，如抗凝血Ⅲ、抗胰蛋白酶、葡萄糖苷酶、C蛋白）

(2)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物血液生物反應(yīng)器（人血紅蛋白、抗體或非活性狀態(tài)的融合蛋白）(3)轉(zhuǎn)基因動(dòng)

物尿液生物反應(yīng)器（促性腺激素）(4)轉(zhuǎn)基因雞（蛋）生物反應(yīng)器（人干擾素）

1.單克隆抗體技術(shù)的基本原理

基于動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)得以實(shí)現(xiàn)的，即骨髓瘤細(xì)胞和B細(xì)胞的融合。骨髓瘤細(xì)胞在體外

培養(yǎng)能大量無(wú)限增殖，但不能分泌特異性抗體；抗原免疫的B細(xì)胞能產(chǎn)生特異性抗體，但在體外不能無(wú)限增殖。將免疫B細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合后形成的雜交瘤細(xì)胞，繼承了兩個(gè)親代

細(xì)胞的特性，既具有骨髓瘤細(xì)胞能無(wú)限增殖的特性，又具有免疫B細(xì)胞合成和分泌特異性抗

體的能力。通常使用HAT（H為次黃嘌呤、A為氨基蝶呤、T為胸腺嘧啶核苷）選擇培養(yǎng)基

對(duì)雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行篩選。未融合的脾細(xì)胞因不能在體外長(zhǎng)期存活而死亡，未融合的骨髓瘤細(xì)

胞合成DNA的從頭合成途徑被培養(yǎng)基中的A阻斷，又因缺乏HGPRT（次黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤磷酸

核糖轉(zhuǎn)移酶）和TK（胸腺嘧啶核苷激酶），不能利用培養(yǎng)基中的H和T完成DNA的合成過(guò)

程而死亡。只有融合的雜交瘤細(xì)胞由于從脾細(xì)胞獲得了HGPRT和TK，因此能在HAT培養(yǎng)基

中長(zhǎng)期存活與繁殖并分泌抗體。

2.單克隆抗體的大量制備主要方法:（1）體內(nèi)培養(yǎng)法（2）體外培養(yǎng)法

6.重組ScFv的應(yīng)用:(1)用于構(gòu)建和生產(chǎn)免疫毒素(2)用于腫瘤的影像分析和治療

7.噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)的基本原理:用PCR技術(shù)從人免疫細(xì)胞中擴(kuò)增出整套的VH和VL基因，克隆到噬菌體載體上并以融合蛋白的形式表達(dá)在其外殼表面。這樣一來(lái)噬菌體DNA中有抗

體基因的存在，同時(shí)在其表面又有抗體分子的表達(dá)，可以方便地利用抗原-抗體特異性結(jié)合而篩選出所需要的抗體，并進(jìn)行克隆擴(kuò)增。

7.噬菌體抗體庫(kù)構(gòu)建過(guò)程

(1)從外周血或脾、淋巴結(jié)等組織中分離B細(xì)胞，提取mRNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA；

(2)應(yīng)用抗體輕鏈和重鏈引物，根據(jù)建庫(kù)的需要通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增不同的抗體基因片段；

(3)構(gòu)建噬菌體載體；(4)用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化細(xì)菌，構(gòu)建全套抗體庫(kù)。

通過(guò)多輪的抗原親和吸附（結(jié)合）-洗脫-擴(kuò)增，最終篩選出抗原特異的抗體克隆。其中，噬

菌體抗體庫(kù)的篩選是關(guān)鍵環(huán)節(jié)和步驟。

減毒活疫苗的優(yōu)缺點(diǎn)：

優(yōu)點(diǎn)：

（1）通過(guò)自然感染途徑接種，可以誘導(dǎo)包括體液免疫、細(xì)胞免疫和粘膜免疫在內(nèi)的更全面的免疫應(yīng)答，使機(jī)體獲得更廣泛的免疫保護(hù)；（2）由于使用的是活的微生物他們可以在體內(nèi)

長(zhǎng)時(shí)間起作用而誘導(dǎo)較強(qiáng)的免疫反應(yīng)，且由于活的微生物有增殖的特性，理論上只需要接

種一次，即可達(dá)到滿意的免疫效果；（3）可能引起水平傳播擴(kuò)大免疫效果，增強(qiáng)群體免疫屏

障；(4)一般不需要再疫苗中添加佐劑，生產(chǎn)工藝一般不需要濃縮純化，價(jià)格低廉。

缺點(diǎn)：

(1)一般減毒活疫苗均保留一定殘余毒力，對(duì)一些個(gè)體如免疫缺陷者可能誘發(fā)嚴(yán)重疾病，并

且由于種種原因如基因修飾等，減毒活疫苗可能出現(xiàn)毒力回復(fù)即“返祖”現(xiàn)象；(2)減毒活

疫苗是活的微生物制劑，可能造成環(huán)境污染而引發(fā)交叉感染等，并可能滯留在環(huán)境中形成傳

染源；(3)缺損顆粒可能干擾免疫效果，因此產(chǎn)品分析評(píng)估較為困難；(4)保存運(yùn)輸?shù)葪l件要

求較高，如需冷藏等。

1.滅活疫苗的特點(diǎn)：(1)滅活疫苗常需多次接種；(2)接種滅活疫苗產(chǎn)生的抗體滴度隨著時(shí)

間而下降；(3)滅活疫苗需要量大。

第七章 發(fā)酵工程制藥

1.發(fā)酵類型：(1)微生物菌體發(fā)酵(2)微生物的酶(3)微生物的代謝產(chǎn)物發(fā)酵(4)微生物轉(zhuǎn)化發(fā)

酵(5)生物工程菌發(fā)酵

2.微生物發(fā)酵生產(chǎn)藥物的分類：(1)抗生素類(2)氨基酸類(3)核苷酸類(4)維生素類(5)甾體類

激素(6)多糖類(6)治療酶及酶抑制劑

3.菌種保藏方法：(1)斜面低溫保藏法(2)石蠟油封存法(3)沙土管保藏法(4)麩皮保藏法(5)甘

油懸液保藏法(6)冷東真空干燥保藏法(7)液氮超低溫保藏法(8)宿主保藏法

4.種子液具備的條件：(1)菌種的生長(zhǎng)活力強(qiáng)，轉(zhuǎn)種至發(fā)酵罐后能迅速生長(zhǎng)，延遲期短；(2)

生理狀態(tài)穩(wěn)定；(3)菌體總量及濃度能滿足大容量發(fā)酵罐的要求；(4)無(wú)雜菌污染，保證純種培養(yǎng)；()保持穩(wěn)定的生產(chǎn)能力

5.微生物的發(fā)酵方式：（1）分批發(fā)酵（2）補(bǔ)料—分批發(fā)酵（3）半連續(xù)發(fā)酵（4）連續(xù)發(fā)酵

5.發(fā)酵過(guò)程的中間分析項(xiàng)目：（1）產(chǎn)物產(chǎn)量（2）PH值（3）糖（4）氨基氮（5）菌絲形

態(tài)

6.發(fā)酵過(guò)程的影響因素及控制：（1）菌體濃度的影響及控制（2）營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)發(fā)酵的影響

及控制（3）溫度的影響及控制（4）PH的影響及控制（5）溶氧的影響及控制（6）二氧化碳的影響及控制（7）泡沫的影響及控制（8）染菌對(duì)發(fā)酵的影響

第三篇：生物技術(shù)制藥復(fù)習(xí)要點(diǎn)與重點(diǎn)

復(fù)習(xí)要點(diǎn)

第一章 緒論

1．生物藥物的概念及21世紀(jì)生物藥物的分類

2．生物技術(shù)(Biotechnology)概念及現(xiàn)代生物技術(shù)的組成和特點(diǎn)

3．基因工程技術(shù)、細(xì)胞工程技術(shù)、酶工程技術(shù)、發(fā)酵工程技術(shù)定義

4．基因診斷、基因治療概念

5．生物技術(shù)在藥學(xué)應(yīng)用中的兩類方式

6．生物藥物的兩大來(lái)源及生物藥物的特點(diǎn)

7.生物制藥的特點(diǎn)、生物制藥基本過(guò)程及生物制藥基本方法

第五章 發(fā)酵工程制藥

1．發(fā)酵定義及發(fā)酵類型

2．菌種的選育方法

3．培養(yǎng)基概念和培養(yǎng)基的配制原則

4．發(fā)酵的基本過(guò)程

5．微生物發(fā)酵方式

6．發(fā)酵過(guò)程影響因素及控制

7．代謝工程定義

8．簡(jiǎn)述發(fā)酵工程下游加工過(guò)程的的特點(diǎn)和一般程序

第二章 基因工程制藥

1．基因的概念及基因的一般特性

2．基因工程藥物的概念

3．基因工程藥物制藥的主要流程

4．基因工程藥物建立分離純化工藝的根據(jù)

5．基因工程藥物分離純化的一般流程

6．基因工程產(chǎn)品的質(zhì)量控制內(nèi)容

7．基因工程藥物臨床前安全性評(píng)價(jià)的特殊性

8．蛋白質(zhì)工程的概念

第三章動(dòng)物細(xì)胞工程制藥

1．細(xì)胞定義、細(xì)胞的特征和細(xì)胞的化學(xué)組成2．細(xì)胞培養(yǎng)定義、細(xì)胞培養(yǎng)基本條件和基本過(guò)程

3．細(xì)胞融合技術(shù)定義和基本過(guò)程

4．細(xì)胞工程技術(shù)概念和動(dòng)物細(xì)胞工程制藥的基本概念

5．動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)和動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)特點(diǎn)

6．細(xì)胞株、細(xì)胞系、原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)的概念

7．動(dòng)物細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)方法

8．轉(zhuǎn)基因動(dòng)物概念(transgenic animal)及轉(zhuǎn)基因的技術(shù)方法

9．轉(zhuǎn)基因動(dòng)物在醫(yī)藥行業(yè)中的應(yīng)用

10．動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器（mammary gland bioreactor）概念

第四章植物細(xì)胞工程制藥

1．植物細(xì)胞工程制藥的兩大內(nèi)容

2．植物細(xì)胞的全能性定義和原理

3．植物細(xì)胞特點(diǎn)——外植體(explant)、脫分化（dedifferentiation）、再分化（redifferentiation）、愈傷組織（callus culture）概念

4．植物細(xì)胞的培養(yǎng)方法

5．轉(zhuǎn)基因植物概念及主要方法

6．植物細(xì)胞工程制藥應(yīng)用于哪些方面

第六章 酶工程制藥

1．酶工程概念和現(xiàn)代酶工程研究的主要內(nèi)容

2．酶固定化概念、方法和固定化酶的特點(diǎn)

3．細(xì)胞固定化概念和固定化細(xì)胞的特點(diǎn)

4．酶反應(yīng)器(Enzyme reactor)的概念

第七 章 新型生物制藥技術(shù)

抗體工程制藥

1．概念——抗體(antibody)、多克隆抗體(Polyclonal antibody,PcAb)、單克隆抗體(monoclonal

antibody)、雜交瘤細(xì)胞(hybridoma)技術(shù)、抗體工程

2．單抗制備的基本流程

3．HAT培養(yǎng)基的選擇培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞的原理

4．單克隆抗體的鑒定與檢測(cè)項(xiàng)目

5．基因工程抗體概念和基因工程抗體的類型———嵌合抗體(Chimeric Antibodies)，改形抗

體(reshaped Antibodies),單鏈抗體(single chain antigen binding protein,ScFv)等

6．噬菌體抗體工程和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物表達(dá)抗體的優(yōu)點(diǎn)

7．反義核酸(ribozyme)、核酶（antisense nucleic acide）、RNA干擾（RNA interference，RNAi）

概念

8．核酸疫苗（nucleic acid vaccine)又稱基因疫苗（gene caccine)或DNA疫苗（DNA vaccine）

概念和核酸疫苗的優(yōu)點(diǎn)

9．基因治療概念、基因治療的必要條件和主要方式

10．干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cell，ES細(xì)胞）的概念及應(yīng)用生物芯片基因芯片，蛋白芯片

12．。。。

復(fù)習(xí)重點(diǎn)

基本概念

1．Biotechnology 以現(xiàn)代生命科學(xué)為基礎(chǔ)，結(jié)合先進(jìn)的工程技術(shù)手段和其他基礎(chǔ)學(xué)科的科

學(xué)原理，按照預(yù)先的設(shè)計(jì)改造生物體或加工生物原料，為人類生產(chǎn)出所

需產(chǎn)品或達(dá)到某種目的2．Fermentation Engineering 微生物工程是利用微生物制造工業(yè)原料與工業(yè)產(chǎn)品并提供服

務(wù)的技術(shù).其特點(diǎn): 發(fā)酵工程是以某種特定的產(chǎn)物為工藝的目

標(biāo),這就要求微生物細(xì)胞既能正常生長(zhǎng)又能過(guò)量積累目的產(chǎn)物

3．Enzyme Engineering是酶學(xué)和工程學(xué)相互滲透結(jié)合發(fā)展而形成一門新的技術(shù)學(xué)科。它是

從應(yīng)用的目的出發(fā)研究酶、應(yīng)用酶的特異性催化功能，并通過(guò)工程

化將相應(yīng)原料轉(zhuǎn)化成有用物質(zhì)的技術(shù)。

4.Gene Engineering 是將重組對(duì)象的目的基因插入載體，拼接后轉(zhuǎn)入新的宿主細(xì)胞，構(gòu)建

成工程菌(或細(xì)胞），實(shí)現(xiàn)遺傳物質(zhì)的重新組合，并使目的基因在工程

菌內(nèi)進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)的技術(shù)。

5．蛋白質(zhì)工程 以蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)規(guī)律及其生物功能的關(guān)系作為基礎(chǔ)，通過(guò)基因修飾或基

因合成，對(duì)現(xiàn)有蛋白質(zhì)進(jìn)行改造，或制造一種新的蛋白質(zhì)。

6.抗體工程利用單克隆抗體技術(shù)和基因工程技術(shù)進(jìn)行天然抗體的生產(chǎn)和抗體改造以及研

制新型抗體.7．Metabolic engineering 利用多基因重組技術(shù)有目的的對(duì)細(xì)胞代謝途徑進(jìn)行修飾、改造，改變細(xì)胞特性，并與細(xì)胞基因調(diào)控、代謝調(diào)控及生化工程相結(jié)合，為實(shí)現(xiàn)構(gòu)建新的代謝途徑，生產(chǎn)特定目的產(chǎn)物而發(fā)展起來(lái)的一個(gè)新的學(xué)科領(lǐng)域。

8．biopharmaceutics是指運(yùn)用生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、生物化學(xué)等的研究成果，從生物體、生物組

織、細(xì)胞、體液等中，綜合利用物理學(xué)、化學(xué)、生物化學(xué)、生物技術(shù)

和藥學(xué)等學(xué)科的原理和方法制造的一類用于預(yù)防、治療和診斷的制品

9．基因工程藥物 是指以DNA重組技術(shù)生產(chǎn)的蛋白質(zhì)、多肽、酶、激素、疫苗、單克隆抗

體和細(xì)胞生長(zhǎng)因子類藥物。

10．GeneDNA分子中含有特定遺傳信息的一段核苷酸序列,是遺傳物質(zhì)的最小功能單位。

11．Cell 細(xì)胞是一切生物體進(jìn)行生命活動(dòng)的基本結(jié)構(gòu)和功能單位.細(xì)胞是有膜包圍的能獨(dú)立

進(jìn)行繁殖的原生質(zhì)。

12．Culture medium 是人工配制的適合于不同細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖或積累代謝產(chǎn)物的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì).其主要成份碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽、生長(zhǎng)因子、前體和水等幾大類.13．hybridoma技術(shù)：將含有特異免疫信息的淋巴細(xì)胞與具有無(wú)限增殖的腫瘤細(xì)胞在誘導(dǎo)

劑作用下使其融合,產(chǎn)生一個(gè)具有特異活性細(xì)胞及其產(chǎn)物技術(shù).14.monoclonal antibody由一個(gè)克隆產(chǎn)生只針對(duì)一種抗原決定簇的結(jié)構(gòu)與功能完全相同的抗體.15.Chimeric Antibodies將人抗體的恒定區(qū)(C區(qū))替代鼠源單抗的可變區(qū)(C區(qū))而得到的抗體

16．immobilized enzyme固定化酶是指限制或固定于特定空間位置的酶，具體來(lái)說(shuō)，是指經(jīng)

物理或化學(xué)方法處理，使酶變成不易隨水流失即運(yùn)動(dòng)受到限制，而

又能發(fā)揮催化作用的酶制劑。

17．Biosensors由生物識(shí)別物質(zhì)(酶,微生物 動(dòng)植物組織 抗體等)與換能器組成的分析系統(tǒng),其基于酶(細(xì)胞)固定化技術(shù)

18．transgenic animal 采用基因工程技術(shù)把外源基因?qū)雱?dòng)物生殖細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞和早

期胚胎,并在受體動(dòng)物染色體上穩(wěn)定整合,又經(jīng)過(guò)各種發(fā)育途徑能把外

源基因穩(wěn)定傳給子代的這種動(dòng)物

19.gene knockout 用基因打靶技術(shù)定點(diǎn)滅活一個(gè)內(nèi)源基因。

20．RNA interference（RNAi）是指對(duì)應(yīng)于某種Mrna的正義RNA和反義RNA組成的雙鏈

RNA（ds RNA）分子使mRNA發(fā)生特異性降解，導(dǎo)致其不能表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象

21．酶聯(lián)免疫法（ELISA）以酶代替放射同位素對(duì)抗原或抗體進(jìn)行標(biāo)記，使酶與抗原抗體共

價(jià)連接，稱之為酶聯(lián)免疫吸附法。

22基因治療 是指將正常的外基因?qū)肷矬w的靶細(xì)胞內(nèi)，以彌補(bǔ)或糾正基因缺陷或異常表

達(dá)，從而達(dá)到治療目的。

23.原代培養(yǎng)：從機(jī)體取出后立即培養(yǎng)的細(xì)胞為原代細(xì)胞。培養(yǎng)的第1代細(xì)胞與傳10代以內(nèi)的細(xì)胞稱為原代細(xì)胞培養(yǎng)。

24傳代培養(yǎng)：將原代細(xì)胞從培養(yǎng)瓶中取出，配制成細(xì)胞懸浮液，分裝到兩個(gè)或兩個(gè)以上的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，稱為傳代培養(yǎng)

25細(xì)胞株：原代細(xì)胞一般傳至10代左右細(xì)胞生長(zhǎng)停滯，大部分細(xì)胞衰老死亡，少數(shù)細(xì)胞存

活到40~50代，這種傳代細(xì)胞為細(xì)胞株。

26細(xì)胞系：細(xì)胞株傳代至50代后又出現(xiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)停滯狀態(tài)，只有部分細(xì)胞由于遺傳物質(zhì)的改變，使其在培養(yǎng)條件下可以無(wú)限制傳代，這種傳代細(xì)胞為細(xì)胞系。

27細(xì)胞株和細(xì)胞系的區(qū)別： 細(xì)胞系的遺傳物質(zhì)改變，具有癌細(xì)胞的特點(diǎn)，失去接觸抑制，容易傳代培養(yǎng)。

基本方法：

1.生物大分子的分離純化主要方法 超濾和凝膠過(guò)濾、離子交換法、電泳和等電聚焦法，等電點(diǎn)沉淀法和有機(jī)溶媒分級(jí)沉淀法、親和色譜法等

2.生物制藥基本方法有提取法 發(fā)酵法 化學(xué)合成法 組織培養(yǎng)法 現(xiàn)代生物技術(shù)方法

3.測(cè)定蛋白質(zhì)類藥物分子量方法超速離心、凝膠色譜法、SDS_PAGE 生物質(zhì)譜法等

4.酶和細(xì)胞固定化方法有載體偶聯(lián)法、交聯(lián)法、包埋法、新型固定法。

5.常用的菌種保藏方法① 斜面低溫保藏法 ②石蠟油封存法 ③砂土管保藏法 ④ 麩皮保

藏法 ⑤甘油懸液保藏法 ⑥冷凍真空干燥保藏法 ⑦液氮超低溫保藏法 ⑧宿主保藏法

等

6.基因工程操作中獲得目的基因的方法 逆轉(zhuǎn)錄法、化學(xué)合成法、PCR等

7.基因診斷主要技術(shù)包括基因探針技術(shù)、PCR技術(shù)、單抗試劑等。

8.發(fā)酵工程制藥中微生物發(fā)酵方式固體發(fā)酵、液體發(fā)酵

9.基因治療中外源基因?qū)氲姆绞??！?/p>

10.基本過(guò)程：

1．基因工程制藥的基本流程 獲得目的基因、組建重組質(zhì)粒、構(gòu)建工程菌（或細(xì)胞）、培養(yǎng)工程菌、產(chǎn)物分離純化、除菌過(guò)濾、半成品檢定、成品檢

定、包裝。

2．發(fā)酵的基本過(guò)程 菌種、種子制備、發(fā)酵、發(fā)酵液處理、提取精制。

3．單抗制備的基本流程抗原的制備、動(dòng)物的免疫、抗體產(chǎn)生細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合形成雜

交瘤細(xì)胞、雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)、篩選能產(chǎn)生某一特異抗體的陽(yáng)性克隆和克隆化、體外培養(yǎng)(動(dòng)物腹腔接種培養(yǎng))、大量制備單克隆抗體。

4．動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的基本過(guò)程：取動(dòng)物器官、和組織、剪碎組織、胰蛋白酶處理、單個(gè)細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)。

5．生物制藥的基本過(guò)程1.原料的選擇、預(yù)處理和保存 2.原料的粉碎3.提取4.分離純化5.濃縮6.結(jié)晶7.干燥

6． PCR三個(gè)基本步驟 變性--退火--延伸

基本原理、組成、分類和特點(diǎn)

1.單抗制備的基本原理 制備單克隆抗體通過(guò)B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)把能產(chǎn)生單一抗體的淋

巴細(xì)胞與有增殖能力的骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合形成雜交瘤細(xì)胞，通過(guò)

有限稀釋法及克隆化使雜交瘤細(xì)胞成為純一的單克隆細(xì)胞系而產(chǎn)

生的只針對(duì)一個(gè)抗原決定簇、結(jié)構(gòu)和特異性完全相同的高純度抗體

2．植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的理論基礎(chǔ) 植物細(xì)胞的全能性。

3現(xiàn)代生物藥物類型基因藥物 , 重組藥物，天然藥物，合成、半合成藥物。

4．現(xiàn)代生物技術(shù)主要組成基因工程、細(xì)胞工程、酶工程、發(fā)酵工程。

5．現(xiàn)代生物技術(shù)特點(diǎn): 高效益、高智力、高投入、高競(jìng)爭(zhēng)、高風(fēng)險(xiǎn)、高勢(shì)能。

6．生物藥物來(lái)源主要有兩大類 ①以天然生物材料為主,②有目的的人工制備生物原料。7 基因工程抗體的類型有嵌合抗體、改型抗體、小分子抗體、多功能化抗體。

8.生物藥物特點(diǎn)化學(xué)結(jié)構(gòu)和組成比較復(fù)雜；相對(duì)分子量較大，一般不易化學(xué)合成；藥理作

用針對(duì)性強(qiáng)，不良反應(yīng)?。化熜Т_切，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高；有的生物原料和生物

藥物不能代替.9.固定化酶的特點(diǎn)具有生物催化劑的功能，又有固相催化劑的功能。①可多次使用 ②反

應(yīng)后，酶底物產(chǎn)物易分開(kāi)，產(chǎn)物中無(wú)殘留酶，易純化，產(chǎn)品質(zhì)量高。③

反應(yīng)條件易控制。④酶的利用效率高。⑤比水溶性酶更適合于多酶反應(yīng)

10固定化細(xì)胞的特點(diǎn)有細(xì)胞特性，生物催化劑功能，固相催化劑特點(diǎn)。優(yōu)點(diǎn)： ①無(wú)須進(jìn)行

酶的分離純化 ②保持酶的原始狀態(tài)，酶回收率高③比固定化酶穩(wěn)定性

高④細(xì)胞內(nèi)酶附助因子可再生⑤細(xì)胞本身含多酶體系⑥抗污染能力強(qiáng)

11.影響大腸桿菌中外源蛋白表達(dá)的主要因素①外源基因密碼子的使用,②mRNA結(jié)構(gòu),③表

達(dá)載體的構(gòu)建,④培養(yǎng)條件

如何實(shí)現(xiàn)高表達(dá)…

12發(fā)酵工程制藥特點(diǎn) 是以某種特定的產(chǎn)物為工藝的目標(biāo),這就要求微生物細(xì)胞既能正常生

長(zhǎng)又能過(guò)量積累目的產(chǎn)物。

13．生物制藥的特點(diǎn)（特殊性）1.生物原料組成成分非常復(fù)雜2.有效成分含量低3.易變性

及被破壞4.分離制備過(guò)程影響因素多相對(duì)“均一性”

13．發(fā)酵過(guò)程影響因素：溫度、pH、溶解氧、菌體濃度、泡沫、營(yíng)養(yǎng)濃度。如何控制…

14．微生物發(fā)酵生產(chǎn)藥物主要種類抗生素類;氨基酸類;核苷酸類維生素類;甾體類激素;治

療酶及酶抑制劑等。

15．細(xì)胞的特征：在結(jié)構(gòu)上具有自我裝配的能力, 在生理活動(dòng)中具有自我調(diào)節(jié)的能力, 在增

殖上自我復(fù)制的能力。

16．生物技術(shù)在藥學(xué)研究中兩種基本作用方式 1作為生產(chǎn)工具----生物技術(shù)藥物

2.作為研究手段----合理藥物設(shè)計(jì)

17．單抗優(yōu)點(diǎn)和局限性優(yōu)點(diǎn)單克隆抗體的特性高度特異性高度的均一性和可重復(fù)性 高

度專一性：大量產(chǎn)生及穩(wěn)定性：

局限性：固有的親和性和局限的生物活性限制了它的應(yīng)用范圍反應(yīng)

強(qiáng)度不如多克隆抗體、制備技術(shù)復(fù)雜、費(fèi)時(shí)費(fèi)工、價(jià)格較高

18生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞類型貼壁依賴性細(xì)胞、非貼壁依賴性細(xì)胞、兼性貼壁細(xì)胞

19．動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)特點(diǎn) 無(wú)細(xì)胞壁,抗機(jī)械強(qiáng)度低,對(duì)剪切力敏感,適應(yīng)環(huán)境差；倍增時(shí)間長(zhǎng),生

長(zhǎng)緩慢,易污染,培養(yǎng)時(shí)必須加抗生素；培養(yǎng)過(guò)程需氧量少,有的需要

一定CO2；培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞相互粘連以集群形式存在20．基因工程藥物制備全程質(zhì)量控制理念包括

一、原材料的質(zhì)量控制(1.目的基因2.表達(dá)載體3.宿主細(xì)胞),二、培養(yǎng)過(guò)程的質(zhì)量控制(1.生產(chǎn)用細(xì)胞庫(kù)2.培養(yǎng)過(guò)程)

三、純化工藝中的質(zhì)量控制;四.目標(biāo)產(chǎn)品的質(zhì)量控制

21.選用動(dòng)物胚胎或幼齡個(gè)體的器官或組織做動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)材料的原理（目的）這些組織或

器官上的細(xì)胞生命力旺盛，分裂能力強(qiáng)

22．基因治療的必要條件1發(fā)病機(jī)制在DNA水平上已經(jīng)清楚2要轉(zhuǎn)移的基因已經(jīng)克隆分離，其表達(dá)產(chǎn)物有詳盡的了解 3該基因正常表達(dá)的組織可在體外進(jìn)行

遺傳操作

23．PCR原理 是體外酶促合成特異DNA片段的方法 反應(yīng)特點(diǎn)1.特異性強(qiáng)2.靈敏度高 3.簡(jiǎn)便、快速。確保PCR獲得目的基因序列正確應(yīng)注意:1.使用高保真的DNA

聚合酶,和相對(duì)保守的PCR擴(kuò)增條件.2.凡經(jīng)PCR擴(kuò)真制備的目的基因片段,克隆后必須要測(cè)序.24基因工程產(chǎn)品的質(zhì)量控制內(nèi)容：產(chǎn)品的鑒別、純度、活性、安全性、穩(wěn)定性、一致性。利用多學(xué)科的技術(shù)生物化學(xué)、免疫學(xué)、微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)。

25.基因工程藥物包含上游下游過(guò)程

上游技術(shù)主要是分離目的基因、構(gòu)建工程菌(細(xì)胞)。主要技術(shù)涉及

1、基因克隆載體:質(zhì)粒載體，2、重組DNA技術(shù)的有關(guān)工具酶及其應(yīng)用

3、核酸制備技術(shù)； 下游階段：從工程菌的大量培養(yǎng)一直到產(chǎn)品的分離純化和質(zhì)量控制。主要包括工程菌大規(guī)模發(fā)酵最佳參數(shù)的確立，新型生物反應(yīng)器的研制，高效分離介質(zhì)及裝置的開(kāi)發(fā)，分離純化的優(yōu)化控制，高純度產(chǎn)品的制備技術(shù)，生物傳感器等一系列儀器儀表的設(shè)計(jì)和制造，電子計(jì)算機(jī)的優(yōu)化控制等.26.基因工程中影響外源蛋白表達(dá)的主要因素

①外源基因密碼子的使用,②mRNA結(jié)構(gòu),③表達(dá)載體的構(gòu)建,④培養(yǎng)條件

如何實(shí)現(xiàn)高表達(dá)…

第四篇：生物技術(shù)制藥第二版總結(jié)

生物技術(shù)制藥 第一章

緒論 要求：

1、熟悉生物技術(shù)制藥的基本概念

2、熟悉生物技術(shù)藥物的特點(diǎn)

3、了解生物技術(shù)領(lǐng)域及生物制藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展現(xiàn)狀

1、生物技術(shù)制藥:就是利用基因工程、細(xì)胞工程、發(fā)酵工程、酶工程、蛋白質(zhì)工程技術(shù)、等來(lái)研究和開(kāi)發(fā)藥物，用來(lái)診斷、治療和預(yù)防疾病的發(fā)生。

2、生物技術(shù)藥物（biopharmaceutics）是利用生物體、生物組織、細(xì)胞或其他組分，綜合應(yīng)用生物學(xué)與醫(yī)學(xué)、生物化學(xué)與分子生物學(xué)、微生物學(xué)與免疫學(xué)、物理化學(xué)與工程學(xué)和藥學(xué)的基本原理與方法加工制造而成的一大類用于預(yù)防、診斷、治療和康復(fù)保健的制品。

特性 藥理學(xué)特性

1、藥理活性高

2、治療的針對(duì)性強(qiáng)，治療的生理、生化機(jī)制合理，療效可靠

3、毒副作用小，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高

4、生理副作用常有發(fā)生 理化與生物學(xué)特性

1、生物材料中含量低，雜質(zhì)多，分離提取工藝復(fù)雜

2、生物活性物質(zhì)結(jié)構(gòu)復(fù)雜、穩(wěn)定性差

3、生物材料易染菌、腐敗

4、生物技術(shù)藥物制劑有特殊要求

3、傳統(tǒng)生物技術(shù)的技術(shù)特征是釀造技術(shù)

4、近代生物技術(shù)的技術(shù)特點(diǎn)是微生物發(fā)酵技術(shù)

5、現(xiàn)代生物技術(shù)的技術(shù)特征是以基因工程為首要標(biāo)志

6、生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的特點(diǎn)：生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)投資大、風(fēng)險(xiǎn)高、周期長(zhǎng)。收益高

第二章

基因工程制藥 基因工程的概念。

基因工程的原理和技術(shù)。基因工程制藥——6大步驟

掌握：基因工程、載體的概念；基因工程的原理；常用載體和表達(dá)系統(tǒng)的類型。

2、熟悉：基因工程制藥的基本流程；目的基因制備、鏈接的方法；重組基因?qū)胨拗鞯姆椒?；重組子篩選和鑒定的方法；質(zhì)粒不穩(wěn)定的原因、分析方法和提高穩(wěn)定性的方法。

3、了解：生物技術(shù)藥物的下游分離和純化技術(shù)。復(fù)習(xí)

1.基因工程藥物制備的一般過(guò)程。2.基因工程常用的載體有哪些？各有什么特點(diǎn)？ 3.獲得目的基因常用的四種方法是（）、（）、（）和（）。

?

1、基因工程（genetic engineering）是指在基因水平上，采用與工程設(shè)計(jì)十分類似的方法，按照人類的需要進(jìn)行設(shè)計(jì)，然后按設(shè)計(jì)方案創(chuàng)建出具有某種新的性狀的生物新品系，并能使之穩(wěn)定地遺傳給后代 ?

2、原理：

1、提高外源基因的劑量——分子遺傳學(xué)原理

2、篩選修飾重組基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，如：?jiǎn)?dòng)子、增強(qiáng)子、操作子、終止子、上游調(diào)控序列等——分子生物學(xué)原理

3、修飾構(gòu)建蛋白質(zhì)生物合成的翻譯調(diào)控元件，如：SD序列、mRNA非編碼區(qū)、密碼子等——分子生物學(xué)原理

4、基因工程菌（微型生物反應(yīng)器）的增殖及穩(wěn)定生產(chǎn)——生化工程學(xué)原理

3、理論方面的三個(gè)重要的發(fā)現(xiàn)

1、生物遺傳物質(zhì)—DNA的發(fā)現(xiàn)

2、DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)和半保留復(fù)制機(jī)理的建立

3、遺傳信息傳遞方式的確立

4、技術(shù)上三個(gè)重要成果

1、基因工程的工具酶 DNA連接酶 限制性內(nèi)切酶 逆轉(zhuǎn)錄酶

思考：被同一種限制酶切斷的幾個(gè)DNA是否具有相同的黏性末端？

一種限制酶只能識(shí)別一種特定的核苷酸序列，并在特定的切點(diǎn)上切割DNA分子。逆轉(zhuǎn)錄酶是以RNA為模板指導(dǎo)三磷酸脫氧核苷酸合成互補(bǔ)DNA（cDNA）的酶 特點(diǎn)：逆轉(zhuǎn)錄酶是一個(gè)多功能性酶，至少具有以下3種酶 活性：

⑴

以單鏈RNA為模板，催化合成cDNA單鏈

⑵

具有RNase H 活性，能水解RNA:DNA雜交鏈中的 RNA ⑶

以DNA為模板，催化合成cDNA雙鏈。2.基因工程載體

3.基因的體外重組技術(shù)

5、重組子轉(zhuǎn)化的成功標(biāo)志著基因工程的誕生。

6、基因工程的操作流程

1、分：分離目的基因

2、切：對(duì)目的基因和載體適當(dāng)切割

3、接：目的基因與載體連接

4、轉(zhuǎn)：重組DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞

5、篩：篩選出含有重組體的受體細(xì)胞

6、表：目的基因在受體細(xì)胞中表達(dá)，受體細(xì)胞成長(zhǎng)為基因改造生物

?

7、基因工程制藥的基本過(guò)程

獲得目的基因 構(gòu)建運(yùn)輸載體 組建表達(dá)系統(tǒng) 表達(dá)系統(tǒng)培養(yǎng)

產(chǎn)物分離純化

?

8、目的基因的獲得

（一）從基因組中直接分離目的基因

1、密度梯度離心法

2、單鏈酶法

3、分子雜交法

4、酶切法直接分離目的基因

（二）PCR直接擴(kuò)增目的基因 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 高溫變性 低溫退火 適溫延伸

（三）反轉(zhuǎn)錄法合成目的基因 構(gòu)建cDNA文庫(kù) 調(diào)取基因

（四）化學(xué)合成目的基因

從反應(yīng)機(jī)理上分為：

1、磷酸二酯法

2、磷酸三酯法

3、亞磷酸三酯法

4、自動(dòng)化合成法

9、—運(yùn)載體的構(gòu)建

? 載體（Vector）:將外源目的DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞，并能自我復(fù)制和增殖的工具。? 常用載體

來(lái)源分類：

1、質(zhì)粒載體

質(zhì)粒（plasmid）:是附加到細(xì)胞中的非細(xì)胞的染色體或核區(qū)DNA原有的能夠自主復(fù)制的較小的DNA分子。人工質(zhì)粒載體必須包括三部分：一個(gè)DNA復(fù)制起始區(qū)，兩個(gè)遺傳標(biāo)記基因和一些限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。

2、噬菌體載體

λ噬菌體：（1）λ噬菌體宿主為E.coli 2）有溶原、溶菌兩種生活方式：

溶原方式：λDNA整合到宿主DNA進(jìn)行復(fù)制；

溶菌方式：可釋放出λDNA進(jìn)行殼蛋白包裝增殖。

優(yōu)點(diǎn)

1）對(duì)外源基因的容量較大（可達(dá)20多個(gè)kb）

（2）重組體DNA可在體外包裹成噬菌體顆粒，具有更高的侵染宿主能力，要比質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)菌的效率高得多，所以λ噬菌體載體常用于構(gòu)建cDNA文庫(kù)或基因組文庫(kù)。（3）宿主范圍窄，更安全

（4）可利用包裝限制性（對(duì)DNA分子大小的限制）對(duì)重組子分子進(jìn)行正選擇，利于重組子的篩選

3、病毒載體

4、人工染色體載體

用途分類：

1、克隆載體

能使插入的外源DNA序列被復(fù)制、擴(kuò)增而不能表達(dá)，這樣的載體為克隆載體。常見(jiàn):質(zhì)粒、噬菌體

2、表達(dá)載體

使插入的外源DNA序列轉(zhuǎn)錄翻譯，表達(dá)出多肽鏈，這樣的載體稱為表達(dá)載體。具有復(fù)制子，篩選標(biāo)記，位于多克隆位點(diǎn)的上下游具有轉(zhuǎn)錄效率較高的啟動(dòng)子，起始密碼子和核糖體結(jié)合位點(diǎn)，轉(zhuǎn)錄終止子結(jié)構(gòu)．

3、穿梭載體 這類載體中含有來(lái)源不同的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，既具備原核細(xì)胞復(fù)制所需的序列結(jié)構(gòu)，又具有能使外源片段在真核細(xì)胞表達(dá)所需的結(jié)構(gòu)元件和相應(yīng)的選擇標(biāo)記基因,故能在兩種受體細(xì)胞中復(fù)制并檢測(cè)，克隆的外源基因在此類載體直接從一種受體轉(zhuǎn)入另一種受體中進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)．

10、基因表達(dá)載體的構(gòu)建

1、用一定的_限制酶___切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個(gè)切口，露出_黏性末端 2.用__同一種限制酶___切斷目的基因，使其產(chǎn)生__相同的黏性末端

3..將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的___切口___處，再加入適量DNA連接酶_，形成了一個(gè)重組DNA分子（重組質(zhì)粒）

11、重組工程菌的構(gòu)建、篩選與鑒定 ?

1、目的基因與載體DNA的鏈接 1）黏性末端連接法 2）鈍性末端連接法

3）鈍性末端連接人工合成的接頭 4）同聚物末端連接法

?

2、將重組體導(dǎo)入宿主細(xì)胞（1）轉(zhuǎn)化2）轉(zhuǎn)導(dǎo)3）轉(zhuǎn)染 ?

3、重組子的篩選與鑒定

（1）抗藥性檢測(cè)篩選法

（2）顯色檢測(cè)

異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）可誘導(dǎo)LacZ基因片段編碼β-半乳糖苷酶氨基端片段,與宿主細(xì)胞所編碼的缺陷型β-半乳糖苷酶實(shí)現(xiàn)基因內(nèi)互補(bǔ)，又稱α互補(bǔ)。當(dāng)培養(yǎng)基中有IPTG時(shí)，使含此質(zhì)粒的菌在X-gal培養(yǎng)基上形成藍(lán)色菌落。（3）限制酶切圖譜檢測(cè)（4）PCR擴(kuò)增檢測(cè)（5）原位雜交檢測(cè)（6）外源蛋白質(zhì)功能檢測(cè)

12、表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建與基因表達(dá)

1、最佳的基因表達(dá)體系：生物活性高、表達(dá)產(chǎn)量高、表達(dá)產(chǎn)物穩(wěn)定、表達(dá)產(chǎn)物容易分離純化。

2、宿主細(xì)胞常用兩大類：

原核細(xì)胞：常用有大腸桿菌、枯草芽胞桿菌、鏈霉菌等；

真核細(xì)胞：常用有酵母、絲狀真菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞等。

? 質(zhì)粒的不穩(wěn)定性原因

1）分裂不穩(wěn)定：指工程菌分裂時(shí)出現(xiàn)一定比例不含質(zhì)粒的子代菌的現(xiàn)象。

（2）結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定：指外源基因從質(zhì)粒上丟失或堿基重排、缺失而導(dǎo)致工程菌性能的改變。? 質(zhì)粒穩(wěn)定性的分析方法

1）將工程菌培養(yǎng)液樣品適當(dāng)稀釋，均勻涂于不含抗生素標(biāo)記的平板培養(yǎng)基上，培養(yǎng)10-12小時(shí)，統(tǒng)計(jì)所長(zhǎng)出的菌落數(shù)A；

（2）然后隨機(jī)挑選100個(gè)菌落，接種到含有抗生素標(biāo)記的平板培養(yǎng)基上，培養(yǎng)10-12小時(shí)，統(tǒng)計(jì)所長(zhǎng)出的菌落數(shù)B；

（3）計(jì)算出B/A的比值。該比值能夠反映出質(zhì)粒的穩(wěn)定性。提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法

1）分階段培養(yǎng)法（2）在培養(yǎng)基中加入抗生素，形成選擇性壓力（3）通過(guò)溫度、PH值、培養(yǎng)基組分、溶解氧的綜合調(diào)節(jié)措施

第三章

動(dòng)物細(xì)胞工程制藥

1、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)

培養(yǎng)方法和培養(yǎng)條件 細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇

2、動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)

動(dòng)物細(xì)胞融合的過(guò)程和方法

3、單克隆抗體技術(shù) 單克隆抗體的概念；單抗制備的原理和方法

4、動(dòng)物細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)

1、培養(yǎng)的方法

1、原代培養(yǎng)

2、傳代培養(yǎng)

2、營(yíng)養(yǎng)條件

1、動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)基的種類和組成 ：培養(yǎng)基的基本要求 促生長(zhǎng)因子 激素 營(yíng)養(yǎng)成分 滲透壓pH 無(wú)毒、無(wú)污染

培養(yǎng)基的基本要求

1）營(yíng)養(yǎng)成分： 氨基酸

單糖 維生素 無(wú)機(jī)離子與微量元素

2）促生長(zhǎng)因子及激素各種激素、生長(zhǎng)因子的功能：①維持細(xì)胞的功能②保持細(xì)胞的狀態(tài)（分化或未分化）

3）滲透壓

4）pH大多數(shù)細(xì)胞適宜 pH為7.2～7.4，培養(yǎng)基應(yīng)具一定的緩沖能力 5）無(wú)毒、無(wú)污染

3、血清的主要成分和作用

主要成分 ：血清是由血漿去除纖維蛋白而形成的，血清中含有各種血漿蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生長(zhǎng)因子、激素、無(wú)機(jī)物等

主要作用：

1、提供基本營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)

2、提供激素和各種生長(zhǎng)因子

3、提供結(jié)合蛋白

4、對(duì)培養(yǎng)中的細(xì)胞起到某些保護(hù)作用

4、動(dòng)物細(xì)胞合成培養(yǎng)基種類：

1、MEM ： 僅含12 種必需氨基酸、谷氨酰胺，8 種維生素及必要的無(wú)機(jī)鹽，由于成分簡(jiǎn)單，易于添加某種特殊成分適于某些特殊細(xì)胞培養(yǎng)。

2、DMEM： 在 MEM 培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上研制的。與 MEM 比較增加了各種成分用量，分高糖型（低于4500g/L）和低糖型（低于1000g/L）

高糖型有利于細(xì)胞停泊于一個(gè)位置生長(zhǎng)，適于生長(zhǎng)較快、附著較困難低腫瘤細(xì)胞。

3、IMDM： 含有 42 種成分，與 DMEM 比較增加了許多非必須氨基酸及一些維生素，增加了羥乙基哌嗪乙硫磺酸（HEPES），葡萄糖含量為高糖型。

適合細(xì)胞密度較低、細(xì)胞生長(zhǎng)困難的情況，如細(xì)胞融合之后雜交細(xì)胞的篩選培養(yǎng)，DNA 轉(zhuǎn)染后轉(zhuǎn)化細(xì)胞的篩選培養(yǎng)。

4、RPMI1640：

其組分較為簡(jiǎn)單，適合許多種細(xì)胞生長(zhǎng)，如腫瘤細(xì)胞、正常細(xì)胞、原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)等。是目前應(yīng)用最為廣泛的培養(yǎng)基之一。

5、動(dòng)物細(xì)胞的種質(zhì)保存

細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇 冷凍速率、復(fù)溫速率、冷凍保護(hù)劑，冷凍保存溫度。

1.細(xì)胞凍存

2.細(xì)胞復(fù)蘇 ：在體外培養(yǎng)工作中，常要將體外培養(yǎng)物進(jìn)行冷凍保存，在需要時(shí)再?gòu)?fù)溫融解進(jìn)行體外培養(yǎng)（復(fù)蘇）

? 凍存和復(fù)蘇的原則：慢凍快融

原因：

當(dāng)細(xì)胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下變化：細(xì)胞器脫水，細(xì)胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶，冰晶導(dǎo)致細(xì)胞損傷甚至死亡。

甘油或二甲基亞砜可使冰點(diǎn)降低，在緩慢凍結(jié)條件下，可使細(xì)胞內(nèi)水分逐步透出，避免大的冰晶；相反，結(jié)晶就大，大結(jié)晶會(huì)造成細(xì)胞膜、細(xì)胞器的損傷和破裂。復(fù)蘇過(guò)程應(yīng)快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶。融化速度快，還可使迅速通過(guò)最易受損的-5－0度

冷凍速率：慢凍（？）復(fù)蘇速率：快融（？）

冷凍保護(hù)劑：5－15％甘油或二甲基亞砜（DMSO）（？）冷凍保存溫度：－196 ℃（液氮）

? 為什么要加冷凍保護(hù)劑

對(duì)大多數(shù)有核哺乳類動(dòng)物細(xì)胞來(lái)說(shuō)，在不加冷凍保護(hù)劑的情況下，無(wú)最適冷凍速率可言，也不能獲得活的凍存物。目前冷凍保護(hù)劑可分為滲透性和非滲透性兩類。具有滲透性的冷凍保護(hù)劑可以滲透到細(xì)胞內(nèi)，一般是一些小分子的物質(zhì)，主要有甘油、DMSO、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等。非滲透性冷凍保護(hù)劑不能滲透到細(xì)胞內(nèi)，一般是些大分子物質(zhì)，主要有聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、蔗糖、聚乙二醇、羥乙基淀粉等。

6、動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù) 基本過(guò)程

1）細(xì)胞準(zhǔn)備，分貼壁和懸浮細(xì)胞兩種。前者可直接將兩親本細(xì)胞混合培養(yǎng)，后者需制成一定濃度的細(xì)胞懸浮液。

（2）細(xì)胞融合，加促融因子于將行融合的細(xì)胞之中，誘導(dǎo)融合。

（3）雜種細(xì)胞選擇，利用選擇性培養(yǎng)基等，使親本細(xì)胞死亡，而讓雜種細(xì)胞存活。（4）雜種細(xì)胞克隆，對(duì)選出的雜種細(xì)胞進(jìn)行克?。ㄟx擇與純化），經(jīng)過(guò)培養(yǎng)，就能獲得所需要的無(wú)性繁殖系。

促融劑：

1、病毒誘導(dǎo)：某些病毒如：仙臺(tái)病毒、副流感病毒和新城雞瘟病毒的被膜中有融合蛋白（fusion protein），可介導(dǎo)病毒同宿主細(xì)胞融合，2、PEG誘導(dǎo)

3、物理學(xué)方法－電誘導(dǎo)細(xì)胞融合

7、單克隆抗體（monoclonal Antibody，McAb）通過(guò)B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，獲得特異性針對(duì)某一種抗原決定簇的細(xì)胞克隆，產(chǎn)生均一性的抗體。單克隆抗體的大量制備：（1）體外培養(yǎng)法：（2）動(dòng)物體內(nèi)誘生法：

單克隆抗體的特性：

1、高度均一性：純度很高的均一性抗體

2、高度專一性： 只對(duì)抗原分子上某一抗原決定簇起反應(yīng)

3、大量產(chǎn)生及穩(wěn)定性： 雜交瘤細(xì)胞能在體內(nèi)外無(wú)限繁殖傳代

8、動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)：懸浮培養(yǎng)、貼壁培養(yǎng)、假懸浮培養(yǎng)（微載體培養(yǎng)、微囊化培養(yǎng)）等

第四章

植物細(xì)胞工程制藥

基本概念：植物細(xì)胞工程；植物細(xì)胞的全能性；細(xì)胞融合

植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)：培養(yǎng)材料、培養(yǎng)方法；植物細(xì)胞培養(yǎng)的影響因素 植物原生質(zhì)體培養(yǎng)技術(shù)：原生質(zhì)體獲得、純化和培養(yǎng)的方法 植物細(xì)胞融合技術(shù)：細(xì)胞融合的過(guò)程、方法和雜種細(xì)胞的篩選

1、植物細(xì)胞工程：以植物細(xì)胞為基本單位，應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)等理論和技術(shù)，在離休條件下進(jìn)行培養(yǎng)、繁殖或人為的精細(xì)操作，使細(xì)胞的某些生物學(xué)特性按人們的意愿發(fā)生改變，從而改良品種、制造新品種，加速繁育植物個(gè)體或獲得有用物質(zhì)的一門科學(xué)或技術(shù)。

2、植物細(xì)胞的全能性：植物體中任何一個(gè)具有完整細(xì)胞核（完整染色體組）的細(xì)胞，在一定條件下都有直接發(fā)育成一個(gè)完整植株的能力。

3、全能性最早在植物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)。

4、植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)：植物細(xì)胞培養(yǎng)從植物組織培養(yǎng)而來(lái)，植物組織培養(yǎng)主要用于形成組織和再生成植株 植物細(xì)胞培養(yǎng)主要生成次生代謝產(chǎn)物

基本技術(shù)：

1、植物材料的準(zhǔn)備

2、培養(yǎng)基制備

3、培養(yǎng)方法的選擇

5、植物細(xì)胞的獲得

（1）外植體直接分離法:機(jī)械切割、組織破碎直接從植物外植體中分離 外植體：如根、莖、葉、花、花粉等

（2）原生質(zhì)體再生法：纖維素和果膠酶混合處理外植體或愈傷組織，分離原生質(zhì)體，再生培養(yǎng)基中培養(yǎng)，原生質(zhì)體細(xì)胞壁再生獲得植物細(xì)胞。

3）愈傷組織分離法：從愈傷組織制備小細(xì)胞團(tuán)或單細(xì)胞懸液

愈傷組織：在一定條件下，從外植體的切口部位長(zhǎng)出的脫分化的薄壁細(xì)胞團(tuán)。

6、常用培養(yǎng)基

MS培養(yǎng)基是目前應(yīng)用最多最普遍的培養(yǎng)基。無(wú)機(jī)鹽的濃度較高，KM-8p主要用于原生質(zhì)體培養(yǎng)，其特點(diǎn)是有機(jī)成分較復(fù)雜 White的無(wú)機(jī)鹽含量較低，適于生根培養(yǎng)

7、生長(zhǎng)素：用來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞的分裂、愈傷組織形成和根的分化

8、組織培養(yǎng)中常用的有：吲哚乙酸(IAA)：第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)和人工合成的的激素

二氯苯氧乙酸(2,4-D)；萘乙酸(NAA)；吲哚-3-丁酸(IBA)；萘氧乙酸(NOA)；對(duì)氯苯氧乙酸(P-CPA)NAA、IAA、IBA易引起生根，2,4-D有利于愈傷組織的誘導(dǎo)和生長(zhǎng)

培養(yǎng)影響

9、植物細(xì)胞生長(zhǎng)代謝特點(diǎn)：（1）需大量無(wú)機(jī)鹽（2）需多種維生素和植物生長(zhǎng)激素（3）無(wú)機(jī)氮源，硝酸鹽、銨鹽為主（4）以蔗糖為碳源

10、無(wú)機(jī)元素的功能：

①參與調(diào)節(jié)胞內(nèi)外的pH、滲透壓、氧化還原電位等

②參與多種酶的輔酶和激活因子的合成

③P是DNA、RNA、ATP等生物活性物質(zhì)的組成部分，也影響多種次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成

11、植物生長(zhǎng)物質(zhì)

1、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑

2、植物生長(zhǎng)激素：生長(zhǎng)素，細(xì)胞分裂素，赤霉素，脫落酸，乙烯。借生長(zhǎng)激素調(diào)控生長(zhǎng)分化，以及細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，獲得最大量的次生代謝產(chǎn)物

12、植物培養(yǎng)物的生長(zhǎng)取決于生長(zhǎng)素和分裂素的比例：

高濃度生長(zhǎng)素和低濃度分裂素——刺激細(xì)胞分裂，低濃度生長(zhǎng)素和高濃度分裂素——刺激細(xì)胞生長(zhǎng)

13、誘導(dǎo)子：刺激植物細(xì)胞合成防御性次生代謝產(chǎn)物的物質(zhì), 可以通過(guò)改變次生代謝途徑中催化酶的酶活力,引起代謝通量和反應(yīng)速率的改變, 提高次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。

非生物誘導(dǎo)子：水楊酸，茉莉酸等,稀土及重金屬鹽類

生物誘導(dǎo)子：微生物類，如真菌孢子，菌絲體、真菌培養(yǎng)物濾液等

14、碳源：細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中不進(jìn)行光合作用，需提供糖做碳源（2-5%）。

15、維生素：肌醇（胚狀體和芽的生長(zhǎng)），B族維生素（B1—根的生長(zhǎng)）

16、有機(jī)物：甘氨酸或水解絡(luò)蛋白，酵母提取物等。

17、植物細(xì)胞的培養(yǎng)方法 1.單細(xì)胞的培養(yǎng)：（1）看護(hù)培養(yǎng)法：2）微室培養(yǎng)法 3）平板培養(yǎng)法 4）條件培養(yǎng)法

條件培養(yǎng)基指培養(yǎng)過(guò)細(xì)胞的培養(yǎng)基上清，有植物生長(zhǎng)激素等殘留，用于制備成固體培養(yǎng)基 2.單倍體細(xì)胞的培養(yǎng)（花藥培養(yǎng)）

指將植物單倍體細(xì)胞培養(yǎng)成單倍體植株的過(guò)程。一般采取花藥作為單倍體細(xì)胞的培養(yǎng)對(duì)象 3.愈傷組織培養(yǎng) 4.毛狀根誘導(dǎo)和培養(yǎng)

毛狀根具有如下特點(diǎn)：激素自養(yǎng)，不必加外源激素；次級(jí)代謝產(chǎn)物含量高且穩(wěn)定；增殖速度快。

18、植物原生質(zhì)體培養(yǎng)技術(shù)

除去植物細(xì)胞壁的裸露細(xì)胞，稱為原生質(zhì)體。

1、原生質(zhì)體材料來(lái)源：

1、植物葉片－取材容易－比較容易用酶解法分離

2、植物根尖組織－可由各種植物的種子萌發(fā)后取得

3、植物花粉－產(chǎn)生單倍體原生質(zhì)體

4、愈傷組織、懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞－細(xì)胞壁容易解離

2、分離

1、機(jī)械法

先將細(xì)胞放在高滲溶液中預(yù)處理，待細(xì)胞發(fā)生輕微質(zhì)壁分離，原體質(zhì)體收縮成球形，再用機(jī)械法磨碎細(xì)胞，從傷口處可以釋放出完整的原生質(zhì)體。

2、酶解法

細(xì)胞壁降解酶種類：纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶、果酸酶等

3、純化

1）離心沉淀法

原理：原生質(zhì)體的比重比較大，離心后原生質(zhì)體沉于底部。2）漂浮法

原理：利用比重大于原生質(zhì)體的高滲蔗糖溶液，離心后使原生質(zhì)體漂浮其上，殘?jiān)樾汲恋焦艿住?）界面法

原理：選兩種不同滲透濃度的溶液，其中一種溶液密度大于原生質(zhì)體的密度，另一種溶液小于原生質(zhì)體的密度，形成不連續(xù)密度梯度，通過(guò)離心使原生質(zhì)體和破損細(xì)胞處于不同液相中。

4、培養(yǎng)

1）液體淺層培養(yǎng)

將含有原生質(zhì)體的培養(yǎng)液在培養(yǎng)皿底部鋪一薄層，封口后進(jìn)行培養(yǎng)。2）液體－固體雙層培養(yǎng)

在培養(yǎng)皿的底部鋪一層瓊脂糖固體培養(yǎng)基，再將原生質(zhì)體懸浮液滴于固體培養(yǎng)基表面。3）固體平板培養(yǎng)

瓊脂糖包埋培養(yǎng)。低融點(diǎn)的瓊脂糖可在約30℃融化與原生質(zhì)體混合而不影響原生質(zhì)體的生命活動(dòng)。混合后含有原生質(zhì)體的培養(yǎng)基鋪于培養(yǎng)皿底部，封口后進(jìn)行培養(yǎng)。4）瓊脂糖珠培養(yǎng)

將含有原生質(zhì)體的液態(tài)瓊脂糖培養(yǎng)基用吸管以大約50ul一滴的量滴于直徑6cm的培養(yǎng)皿，待其固化后向其中添加3ml液體培養(yǎng)基并于搖床上低速旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)。

培養(yǎng)過(guò)程中，通過(guò)調(diào)整液體培養(yǎng)基的滲透壓來(lái)調(diào)節(jié)培養(yǎng)物的滲透壓以利于其進(jìn)一步的生長(zhǎng)和發(fā)育。

19、植物細(xì)胞融合技術(shù)

細(xì)胞融合(cell fusion)概念：又稱細(xì)胞雜交：離體條件下用人工的方法把不同的細(xì)胞通過(guò)無(wú)性方式融合成一個(gè)雜合細(xì)胞的技術(shù)。

1、融合的程序：

1、原生質(zhì)體分離的分離、純化

2、融合方法選擇

3、雜種細(xì)胞的篩選

4、愈傷組織形成器官分化植株再生

5、雜種植物的鑒定

2、融合的方法：

1、鹽類融合法

2、高Ca2+和高pH值融合3、聚乙二醇（PEG）融合法

4、PEG與高Ca2+和高pH值結(jié)合融合法

5、電融合法

3、原生質(zhì)體的融合過(guò)程包括3個(gè)主要階段：1)兩個(gè)或多個(gè)原生質(zhì)體的質(zhì)膜彼此靠近； 2)局部區(qū)域質(zhì)膜緊密粘連，彼此融合；3)融合完成，形成球形的異核體或同核體。

20、雜種細(xì)胞的選擇和鑒定 1）融合體的類型

自體融合：發(fā)生在親本原生質(zhì)體自身 異體融合：

1、諧和的細(xì)胞雜種：具有雙親全套染色體組的異源兩倍體

2、部分諧和的細(xì)胞雜種：雙親的染色體經(jīng)逐步排斥，便發(fā)生少量染色體的重組，然后進(jìn)入同步分裂，最后形成帶有部分重組染色體的植株

3、異胞質(zhì)體細(xì)胞雜種：胞質(zhì)是雙親的，一親本細(xì)胞核被排斥

4、嵌合細(xì)胞雜種：不同種的雙親原生質(zhì)體，發(fā)生了膜融合和胞質(zhì)融合，尚未發(fā)生核融合。雙親的細(xì)胞核各自發(fā)生核分裂，接著形成細(xì)胞壁，最終形成嵌合體植物

2、選擇的方法

1、互補(bǔ)選擇法(遺傳或抗性)

2、可見(jiàn)標(biāo)記法

3、生長(zhǎng)特性選擇法

4、物理特性選擇法

5、其他方法

6、熒光染料法：異硫氰酸熒光素（FITC）和異硫氰酸羅丹明（RITC）分別發(fā)出綠色和紅色 3）細(xì)胞雜種的鑒定：

①雜種植物形態(tài)特征、特性鑒定②雜種植物的核型分析③同工酶分析④分子標(biāo)記鑒定

第五章

發(fā)酵工程制藥 發(fā)酵工程的概念

2、菌種的獲得與選育

3、發(fā)酵的基本過(guò)程和工藝控制

發(fā)酵工程的概念 菌種及其選育、自然育種、誘變育種、原生質(zhì)體融合、基因工程育種

發(fā)酵的基本過(guò)程、發(fā)酵的工藝控制、發(fā)酵產(chǎn)物的提取

1、發(fā)酵工程(fermentation engineering)：

微生物工程利用微生物制造工業(yè)原料與工業(yè)產(chǎn)品并提供服務(wù)的技術(shù)，是生物技術(shù)的基礎(chǔ)工程。

2、生產(chǎn)菌種的選育：

1、自然選育：自然狀態(tài)下，堿基對(duì)發(fā)生自然突變的機(jī)率為10-8～10-9

2、自發(fā)突變與定向育種

3、誘變育種：用各種物理、化學(xué)的因素人工誘發(fā)基因突變進(jìn)行的篩選，稱為誘變育種。物理誘變劑：紫外線

化學(xué)誘變劑 使用最多、最有效的是烷化劑。

4、原生質(zhì)體融合5、DNA重組

3、發(fā)酵產(chǎn)物提取的方法：

1、吸附法

2、沉淀法

3、溶劑萃取法

4、離子交換法

4、菌種保藏

1、斜面低溫法：短期保存

2、石蠟油封存法：中期保存

3、沙土管：產(chǎn)孢子和芽孢的

4、麩皮保存法：產(chǎn)孢子的霉菌和放線菌，工廠用

5、甘油懸液法：基因工程菌

6、凍干保藏 ：最廣泛使用的方法。大部分菌種可以在凍干狀態(tài)下保藏10年之久。且經(jīng)凍干后的菌株無(wú)需進(jìn)行冷凍保藏，便于運(yùn)輸

7、液氮法：最為有效，保藏15年以上，8、宿主保藏法：活細(xì)胞內(nèi)寄生的微生物

5、發(fā)酵過(guò)程的影響因素及控制 一）菌體濃度的影響及控制

菌體濃度反應(yīng)菌體細(xì)胞數(shù)和勝利特性 結(jié)構(gòu)越復(fù)雜的生物，分裂所需時(shí)間越長(zhǎng)

發(fā)酵中菌液需控制在合理濃度中，過(guò)高，營(yíng)養(yǎng)消耗過(guò)快，有毒廢物積累，改變菌體代謝途徑，影響溶氧；過(guò)低，產(chǎn)率下降

二）培養(yǎng)基的影響及其控制

1.碳源：葡萄糖速效碳源，生長(zhǎng)菌體，淀粉等遲效碳源，發(fā)酵次級(jí)代謝產(chǎn)物

2.氮源：氨基酸，玉米漿等速效氮源，生長(zhǎng)菌體，豆餅等遲效氮源，發(fā)酵次級(jí)代謝產(chǎn)物

氮源太多會(huì)促使菌體大量生長(zhǎng)。有些產(chǎn)物合成受到過(guò)量銨離子的抑制，因此必須控制適量的氮。

3.磷酸鹽和微量元素：微生物體內(nèi)磷含量較高，培養(yǎng)基中以磷酸鹽為主，發(fā)酵中用來(lái)計(jì)算磷含量的是磷酸根 抗生素對(duì)磷酸鹽濃度很敏感，生長(zhǎng)濃度：0.32-300 mol/L，生產(chǎn)濃度：1.0 mol/L 4.補(bǔ)料：補(bǔ)基質(zhì)和前體，中途補(bǔ)料，豐富培養(yǎng)基，避免菌體過(guò)早衰老，控制PH，改善通氣等 通常在生長(zhǎng)旺盛期后期，發(fā)酵液泡沫位下降，這時(shí)耗氧大，溶氧水平接近臨界點(diǎn)，補(bǔ)料少量多次

6、影響發(fā)酵溫度變化的因素

(1)生物熱：

微生物進(jìn)行有氧呼吸產(chǎn)生的熱比厭氧發(fā)酵產(chǎn)生的熱多。

(2)攪拌熱(3)蒸發(fā)熱：通氣時(shí)，引起發(fā)酵液的水分蒸發(fā)，水分蒸發(fā)所需的熱量叫蒸發(fā)熱(4)輻射熱：發(fā)酵罐內(nèi)溫度與環(huán)境溫度不同，發(fā)酵液中有部分熱通過(guò)罐體向外輻射。

7、.溫度的選擇與控制

(1)最適溫度的選擇：嗜冷菌適應(yīng)于0～26℃生長(zhǎng)，嗜溫菌適應(yīng)于15～43 ℃生長(zhǎng)，嗜熱菌適應(yīng)于37～65 ℃生長(zhǎng)，嗜高溫菌適應(yīng)于65 ℃以上生長(zhǎng) 最適生長(zhǎng)溫度，最適生產(chǎn)（發(fā)酵）溫度

發(fā)酵前期 要盡快達(dá)到大量的菌體，取稍高的溫度

中期菌量 已達(dá)到合成產(chǎn)物的最適量，發(fā)酵需要延長(zhǎng)中期，從而提高產(chǎn)量，因此中期溫度要稍低一些，發(fā)酵后期，產(chǎn)物合成能力降低，提高溫度，刺激產(chǎn)物合成到放罐。

8、pH的影響及其控制

菌體自溶，pH上升，發(fā)酵后期，pH上升

9、發(fā)酵過(guò)程pH變化的原因

1）糖代謝：特別是快速利用的糖，分解成小分子酸、醇，使pH下降。糖缺乏，pH上升，是補(bǔ)料的標(biāo)志之一（2）氮代謝：當(dāng)氨基酸中的-NH2被利用后pH會(huì)下降；尿素被分解成NH3，pH上升，NH3利用后pH下降，當(dāng)碳源不足時(shí)氮源當(dāng)碳源利用pH上升。（3）生理酸堿性物質(zhì)利用后pH會(huì)上升或下降

10、發(fā)酵過(guò)程pH的調(diào)節(jié)

1、調(diào)節(jié)好基礎(chǔ)料的pH?；A(chǔ)料中若含有玉米漿，pH呈酸性，必須調(diào)節(jié)pH。若要控制消后pH在6.0，消前pH往往要調(diào)到6.5－6.8 ２.在基礎(chǔ)料中加入維持pH的物質(zhì)，如CaCO3，或具有緩沖能力的試劑，如磷酸緩沖液等 ３.通過(guò)補(bǔ)料調(diào)節(jié)pH ４.當(dāng)補(bǔ)料與調(diào)pH發(fā)生矛盾時(shí)，加酸堿調(diào)pH

11、溶氧的影響及其控制

溶氧(DO)是需氧微生物生長(zhǎng)所必需。在發(fā)酵過(guò)程中有多方面的限制因素，而溶氧往往是最易成為控制因素。供氧不足，代謝異常，通氣，攪拌

12、發(fā)酵過(guò)程的溶氧變化

發(fā)酵初期，生產(chǎn)菌大量繁殖，需氧，溶氧下降 過(guò)了生長(zhǎng)階段，需氧減少，溶氧上升 發(fā)酵中后期，分批發(fā)酵的溶氧不變 生產(chǎn)后期，菌體衰老，溶氧上升

13、CO2的影響及控制：降低通氣攪拌，則增加CO2在發(fā)酵液中溶解度

14、發(fā)酵過(guò)程泡沫的形成與控制

發(fā)酵過(guò)程起泡的利弊：氣體分散、增加氣液接觸面積，但過(guò)多的泡沫是有害的 消泡：機(jī)械消泡，消泡劑消泡：天然油脂，聚醚類消泡劑，高碳醇，硅酮類

15、染菌的防治

發(fā)酵前期最易染菌，且危害最大。

原因 ： 發(fā)酵前期菌量不很多，與雜菌沒(méi)有競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)；且還未合成產(chǎn)物（抗生素）或產(chǎn)生很少，抵御雜菌能力弱。染菌措施 ： 可以用降低培養(yǎng)溫度，調(diào)整補(bǔ)料量，用酸堿調(diào)pH值，縮短培養(yǎng)周期等措施予以補(bǔ)救。如果前期染菌，且培養(yǎng)基養(yǎng)料消耗不多，可以重新滅菌，補(bǔ)加一些營(yíng)養(yǎng)，重新接種再用。

第六章

酶工程制藥 酶與酶工程的概念 固定化酶和細(xì)胞的制備 酶工程技術(shù)

酶分子的定點(diǎn)改造、酶分子的定向進(jìn)化、酶的化學(xué)修飾、抗體酶技術(shù)

1、酶工程是酶學(xué)和工程學(xué)相互滲透結(jié)合、發(fā)展而形成的一門新的技術(shù)學(xué)科。它是從應(yīng)用的目的出發(fā)研究酶、應(yīng)用酶的特異催化性能，并通過(guò)工程化將相應(yīng)原料轉(zhuǎn)化成有用物質(zhì)的技術(shù)。酶是生物細(xì)胞產(chǎn)生的、具有催化能力的生物催化劑。

2、固定化酶（immobilized enzyme）的定義:指限制或固定于特定空間位置的酶。具體講是指經(jīng)物理或化學(xué)方法處理，使酶變成不易隨水流失即運(yùn)動(dòng)受到限制，而又能發(fā)揮催化作用的酶制劑。制備固定化酶的過(guò)程稱為酶的固定化。固定化所采用的酶，可以是純化的酶，也可以是結(jié)合在菌體（死細(xì)胞）或細(xì)胞碎片上的酶或酶系

3、固定化酶的特點(diǎn)

（1）可以多次使用，酶的穩(wěn)定性提高；（2）反應(yīng)后，酶與底物和產(chǎn)物易于分開(kāi)，產(chǎn)物中無(wú)殘留酶，易于純化。（3）反應(yīng)條件易于控制，可實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化反應(yīng)的連續(xù)化和自動(dòng)控制；（4）酶的利用率高，單位酶催化的底物量增加，用酶量少；（5）比水溶性酶更適合于多酶反應(yīng)。

4、固定化酶的制備原則：

（1）不改變酶的性質(zhì)（2）酶結(jié)合牢固，性質(zhì)穩(wěn)定，易于與底物分離（3）能夠?qū)崿F(xiàn)生產(chǎn)的自動(dòng)化，成本合理

5、固定化酶載體材料：

A.高分子載體.天然高分子材料 殼聚糖，海藻酸鈉

合成有機(jī)高分子材 聚苯乙烯 B.無(wú)機(jī)載體 玻璃，硅凝膠，鋁等

C.復(fù)合載體：磁性高分子微球:內(nèi)部含有磁性金屬或金屬氧化物的超細(xì)粉末。

6、固定化方法的選擇

①固定化酶應(yīng)用的安全性 ②固定化酶在操作中的穩(wěn)定性 ③固定化的成本

7、新型的酶固定化方法：光偶聯(lián)法，等離子體法，無(wú)載體固定化酶

8、固定化細(xì)胞的方法：將細(xì)胞限制或定位于特定空間位置的方法.9、固定化酶的性質(zhì)

1）酶活力的變化：酶經(jīng)過(guò)固定化之后活力大都下降。

2）酶穩(wěn)定性的變化：包括對(duì)溫度、pH、蛋白酶變性劑和抑制劑的耐受程度。固定化后，穩(wěn)定性提高，有效壽命延長(zhǎng)。①熱穩(wěn)定性提高：熱穩(wěn)定性越高，工業(yè)化意義越大。熱穩(wěn)定性高可以提高反應(yīng)溫度和反應(yīng)速度，提高效率。②對(duì)有機(jī)試劑及酶抑制劑的穩(wěn)定性提高③PH，蛋白酶等穩(wěn)定性提高

3）酶學(xué)特性的變化：A、底物專一性：對(duì)底物的專一性下降。

B、最適pH：最適pH可能變大，也可能變??；pH-酶活曲線可能發(fā)生變化，其變化與酶蛋白和載體的帶電性質(zhì)有關(guān)。

C、最適溫度：一般升高。原因是固定化后空間結(jié)構(gòu)更為穩(wěn)定。

D、米氏常數(shù)(Km)：Km值均發(fā)生變化，有的增加很小，有的增加很大，但不會(huì)變小。

E、最大反應(yīng)速度（Vm）：變化很小或不變。

10、酶工程研究新技術(shù)

一、酶分子的定點(diǎn)改造：有目的的改變酶的特定活性位點(diǎn)或基因，產(chǎn)生具有新性狀的酶。定點(diǎn)突變是酶分子定點(diǎn)改造的常規(guī)手段，廣泛用于改善酶的性能。

定點(diǎn)突變是有目的的在已知DNA序列中取代、插入或刪除特定的核苷酸。定點(diǎn)突變的方法：

（1）引物介導(dǎo)的定點(diǎn)突變（2）PCR介導(dǎo)的定點(diǎn)突變（3）盒式突變

二、酶分子的定向進(jìn)化

酶分子的定向進(jìn)化（directed evolution）：模擬自然進(jìn)化過(guò)程（隨機(jī)突變和自然選擇），在體外進(jìn)行酶基因的人工隨機(jī)突變，建立突變基因文庫(kù)，在人工控制條件的特殊環(huán)境下，定向選擇得到具有優(yōu)良催化特性的酶的突變體的技術(shù)過(guò)程。特點(diǎn)：適應(yīng)面廣；目的性強(qiáng)；效果顯著。定向進(jìn)化的基本規(guī)則是“獲取你所篩選的突變體”。定向進(jìn)化=隨機(jī)突變+定向選擇。

三、酶的化學(xué)修飾：

通過(guò)主鏈的切割、剪接和側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)修飾對(duì)酶蛋白進(jìn)行分子改造，以改變其理化性質(zhì)及生物活性。

目的：① 提高酶的生物活性

② 增強(qiáng)在不良環(huán)境中的穩(wěn)定性

③ 降低或消除其免疫原性 方法：（1）酶的表面化學(xué)修飾

： 可降低酶的免疫原性，提高酶的穩(wěn)定性；或使酶固定到某一載體上。（2）酶分子內(nèi)部修飾（3）結(jié)合定點(diǎn)突變的化學(xué)修飾 ：制備化學(xué)修飾突變酶，從而得到一些新穎的酶制劑。

修飾酶的特性：⑴熱穩(wěn)定性提高 ⑵抗各類失活因子能力提高

⑶抗原性消除 ⑷體內(nèi)半衰期延長(zhǎng) ⑸最適pH改變 ⑹酶學(xué)性質(zhì)變化（Vmax不變，Km變大 ⑺對(duì)組織分布能力改變

11、抗體酶技術(shù)：能與過(guò)渡態(tài)結(jié)合的抗體也具有酶的性質(zhì) 抗體酶是酶還是抗體 ？

抗體——是B細(xì)胞識(shí)別抗原后增殖分化為漿細(xì)胞所產(chǎn)生的一種蛋白質(zhì)，主要存在于血清等體液中,能與相應(yīng)抗原特異性地結(jié)合，具有免疫功能。其本質(zhì)是一類免疫球蛋白。抗體酶是酶的高效催化能力和抗體的高度選擇性巧妙結(jié)的產(chǎn)物，本質(zhì)上是一類具有催化活力的免疫球蛋（Ig）其實(shí)抗體酶是一種特殊的抗體，它有著催化特性，可謂是酶和抗體性質(zhì)的兼得。所以又被稱為催化抗體?？贵w酶的制備：誘導(dǎo)法，基因工程法，拷貝法，化學(xué)修飾法

酶?jìng)鞲衅鳎核鼘⒒钚晕镔|(zhì)酶覆蓋在電極表面,酶與被測(cè)的有機(jī)物或無(wú)機(jī)物反應(yīng),形成一種能被電極響應(yīng)的物質(zhì) 第七章 藥物生物技術(shù)新進(jìn)展 新產(chǎn)品

新疫苗

1、多肽疫苗

2、基因疫苗

核酸藥物1.核酶2.反義核酸藥物3.RNAi藥物

1、抗體工程制藥

主體：細(xì)胞工程技術(shù)和基因工程技術(shù)

2、理想的抗體藥物的性質(zhì)：

1、高特異性和高親和力

2、對(duì)人沒(méi)有免疫原性，不誘導(dǎo)機(jī)體對(duì)抗體的排斥反應(yīng) 游離抗體不激活補(bǔ)體

3、一旦結(jié)合到靶抗原上，能誘導(dǎo)效應(yīng)功能細(xì)胞系穩(wěn)定，適合在無(wú)血清培養(yǎng)基中進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)

4、抗體符合生物制品標(biāo)準(zhǔn)

3、抗體治療存在的問(wèn)題：

1、異源蛋白導(dǎo)致產(chǎn)生抗抗體，影響靶向性和效果

2、靶部位攝取的量太低

3、效應(yīng)功能弱

4、在體內(nèi)被清除速度快

4、基因工程抗體的概念：利用DNA重組技術(shù)和蛋白質(zhì)工程技術(shù)對(duì)編碼抗體分子的基因按照不同需要進(jìn)行加工改造和重新裝配，再轉(zhuǎn)染到合適的受體細(xì)胞中所表達(dá)的抗體分子。

特點(diǎn)：

1、減少或消除排斥反應(yīng)

2、分子小，穿透力強(qiáng)，易到達(dá)病灶核心部位

3、抗體功能多樣化

4、可采用多種表達(dá)系統(tǒng)，成本低

研究?jī)?nèi)容 ①抗體人源化：②構(gòu)建抗體庫(kù)從中篩選新的單抗

種類： 人一鼠嵌合抗體：一鼠嵌合抗體是將鼠源單抗的可變區(qū)(V區(qū)）與人抗體的恒定區(qū)（C區(qū)）融合而得到的抗體。第一代 鼠單抗可變區(qū)的人源化－改型抗體 第二代 小分子抗體 1)Fab 完整的輕鏈和Fd組成，大小為完整分子的1/3。2)Fv 或 ScFv Fv、ScFv的大小約為全分子的1/6。

單鏈抗體（ScFv）的構(gòu)建在已知親本DNA序列時(shí)可用完全人工合成法;如果從雜交瘤細(xì)胞系構(gòu)建單鏈抗體，可用PCR方法擴(kuò)增可變區(qū)基因，再組裝到適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體上。單鏈抗體最常用的表達(dá)體系是大腸桿菌

3)單域抗體 即為VH，約為完整分子的1/12。它只由一個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，故稱單域抗體。

4)最小識(shí)別單位 約為完整分子的1/80-1/70大小，一般由一個(gè)CDR構(gòu)成，它也保持著抗體的特異性。4 雙特異抗體和多價(jià)抗體 雙鏈抗體（Diabody）乃是一種小分子的雙價(jià)雙特異性抗體片段。

特異性抗體(bispecific antibody,BSAb)是指能同時(shí)識(shí)別2種抗原的抗體。1種為對(duì)應(yīng)腫瘤相關(guān)抗原。另1種為對(duì)應(yīng)效應(yīng)成分。即能結(jié)合靶腫瘤細(xì)胞又能結(jié)合高細(xì)胞毒性的效應(yīng)細(xì)胞, 抗體融合蛋白主要分兩種形式： Fc融合蛋白

抗原結(jié)合融合蛋白 1)免疫粘附素

2、免疫毒素

噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)

定義：將體外克隆的抗體基因片段插入噬菌體載體，轉(zhuǎn)染工程細(xì)菌進(jìn)行表達(dá)，然后用抗原篩選即可獲得特異的單克隆噬菌體抗體。

特點(diǎn) 模擬天然全套抗體庫(kù) 避開(kāi)了人工免疫和雜交瘤技術(shù) 可獲得高親和力的人源化抗體

轉(zhuǎn)基因技術(shù)制藥

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物（transgenic animal）是指借助基因工程技術(shù)將外源基因?qū)胧荏w動(dòng)物染色體內(nèi)，外源基因與動(dòng)物基因整合后隨細(xì)胞的分裂而擴(kuò)增，在體內(nèi)表達(dá)并能穩(wěn)定地遺傳給后代的動(dòng)物。

培育1 目標(biāo)基因克隆和體外重組 2 外源基因的導(dǎo)入3 外源DNA整合、轉(zhuǎn)錄及表達(dá)的分子檢測(cè)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物品系或品種的建立

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)路線 ：

1、外源目的基因的制備

2、外源目的基因有效導(dǎo)入生殖細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞

3、選擇獲得攜有目的基因的細(xì)胞

4、選擇合適的體外培養(yǎng)系統(tǒng)和宿主動(dòng)物

4、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞胚胎發(fā)育及鑒定

5、篩選所得的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物品系

外源基因的轉(zhuǎn)移：

1、顯微注射法

2、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染

3、胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)法

4、精子載體介導(dǎo)法

5、YAC介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移

6、細(xì)胞核移植

胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cell，ES）是從早期胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（ICM）分離出來(lái)的，能在體外培養(yǎng)的一種高度未分化的多能干細(xì)胞。

精子與外源DNA結(jié)合的機(jī)理：

精子直接與外源DNA混合培養(yǎng)，外源基因可以直接進(jìn)入精子頭部，受精后就可發(fā)育成轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。后來(lái)Rottman對(duì)此方法進(jìn)行了改進(jìn)，將外源DNA在與精子共孵育之前用脂質(zhì)體包埋，使脂質(zhì)體與DNA相互作用形成脂質(zhì)體——DNA復(fù)合物。這種復(fù)合體比較容易和精子細(xì)胞融合，從而進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的應(yīng)用：1）生物制藥(乳腺生物反應(yīng)器)；（2）建立人類疾病的動(dòng)物模型；（3）生產(chǎn)可移植用的動(dòng)物器官。

動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器

一般把目的片段在器官或組織中表達(dá)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物叫動(dòng)物生物反應(yīng)器（bioreactor），幾乎任何有生命的器官、組織或其中一部分都可經(jīng)過(guò)人為馴化為生物反應(yīng)器,從生產(chǎn)的角度考慮，生物反應(yīng)器選擇的組織和器官要方便產(chǎn)物的獲得，例如，乳腺、膀胱、血液等，由此發(fā)展了動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器,動(dòng)物血液生物反應(yīng)器和動(dòng)物膀胱生物反應(yīng)器等。其中，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器的研究最為引人注目。

基因芯片

基因芯片(gene chip)又稱DNA芯片(DNA chip)或DNA微陣列(DNA micro-array)?；蚴禽d有生物體遺傳信息的基本單位，存在于細(xì)胞的染色體上；將大量的基因片段有序地、高密度地排列在玻璃片或纖維膜等載體上，稱之為基因芯片。

原理：基因芯片技術(shù)是建立在基因探針和雜交測(cè)序技術(shù)上的一種高效、快速的核酸序列分析手段?；蛐酒夹g(shù)主要包括四個(gè)主要步驟：芯片制備、樣品制備、雜交反應(yīng)和信號(hào)檢測(cè)以及結(jié)果分析。

1、芯片制備

1）合成探針

2）探針在載體表面的固定

探針在載體表面的固定可分為兩大類方法：

合成后點(diǎn)樣，多用于大片段DNA，有時(shí)也用于寡核苷酸，甚至mRNA。原位合成（即在支持物表面原位合成寡核苷酸探針），適用于寡核苷酸。原位合成（在片合成）有三種途徑：，原位光刻合成，點(diǎn)樣法，分子印章原位合成法（東南大學(xué)發(fā)明）。

3、雜交反應(yīng) 雜交反應(yīng)是熒光標(biāo)記的樣品與芯片上的探針進(jìn)行的反應(yīng)產(chǎn)生一系列信息的過(guò)程。

蛋白質(zhì)芯片（protein chip），又稱蛋白質(zhì)微陣列(protein microarray)，是用于蛋白質(zhì)功能研究及相互作用分析的生物芯片，采用原位合成、機(jī)械點(diǎn)樣或共價(jià)結(jié)合的等方法將多肽、蛋白、酶、抗原、抗體固定于硅片、玻璃片、塑料片、凝膠、尼龍膜等固相介質(zhì)上形成的生物分子點(diǎn)陣。

芯片實(shí)驗(yàn)室是將樣品制備、生化反應(yīng)和檢測(cè)分析的全過(guò)程集約化，并縮微到一張芯片上自動(dòng)完成，形成的所謂微型全分析系統(tǒng)（micro total analysis systen,μ-TAS）,或稱“縮微芯片實(shí)驗(yàn)室”（lab-on-a-chip）。

生物芯片的應(yīng)用：

1、尋找和發(fā)現(xiàn)新基因

2、基因表達(dá)分析

3、DNA序列測(cè)定與序列間比較

4、突變體和多態(tài)性的檢測(cè)

基因治療

基因治療：指應(yīng)用DNA重組技術(shù)，將外源正常基因?qū)氚屑?xì)胞，以糾正或補(bǔ)償因基因缺陷和異常引起的疾病,以達(dá)到治療的目的。

基因療法：

1、重建基因調(diào)控系統(tǒng)

2、替代異?；?/p>

3、封閉致病基因

4、剪去致病基因

5、修復(fù)受損基因

6、增強(qiáng)基因效能

基因干預(yù)

基因干預(yù)(gene interference)：指采用特定的方式抑制某個(gè)基因的表達(dá)，或者通過(guò)破壞某個(gè)基因而使之不表達(dá)，以達(dá)到治療疾病的目的。

基因干預(yù)的種類：1核酶： 裂解特異的靶mRNA 2反義RNA： 封閉基因表達(dá) 3 RNA干涉技術(shù)

腫瘤治療中基因的選擇：

1.能改變腫瘤細(xì)胞的惡性表型的基因

腫瘤細(xì)胞主要有癌基因的突變、擴(kuò)增、過(guò)度表達(dá)，對(duì)此可采用反義核酸或核酶；抑癌基因的突變、失活等，可采用野生型的正常基因作為治療基因，用正常基因剔除或替換缺陷基因。2.能提高腫瘤細(xì)胞的免疫原性的基因

3.腫瘤藥物增敏基因 常用的自殺基因有單純皰疹病毒胸苷激酶（HSK-TK）基因，基因載體的選擇 ：有病毒載體和非病毒體兩類，多用病毒載體，如逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒及腺相關(guān)病毒載體。

基因治療中體細(xì)胞的選擇：

1、免疫細(xì)胞

2、骨骼肌細(xì)胞

3、血管平滑肌細(xì)胞

1、成纖維細(xì)胞： 成纖維細(xì)胞位于全身并具有較強(qiáng)的自我更新能力。優(yōu)點(diǎn)有：①易于獲得；②容易體外培養(yǎng)和擴(kuò)增；③分裂中的成纖維細(xì)胞易與逆轉(zhuǎn)錄病毒一起穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)，并能較穩(wěn)定的表達(dá)外源目的基因；④攜帶外源基因后能穩(wěn)定地回植體內(nèi)并進(jìn)行表達(dá)等。

主要缺點(diǎn)是在體內(nèi)由于細(xì)胞凋亡而引起的基因表達(dá)失活。

2、造血干細(xì)胞

造血干細(xì)胞是基因治療遺傳病、自身免疫性疾病及癌癥常用的靶細(xì)胞。

理想載體應(yīng)具備下列條件：安全無(wú)毒害；不引起免疫反應(yīng)；高濃度或高滴度；能高效轉(zhuǎn)移外源基因 ,持續(xù)有效表達(dá)外源基因；可靶向特定組織細(xì)胞；可調(diào)控；容納外源基因可大可??；可供體內(nèi)注射（包括全身性靜脈注射）；便于規(guī)模生產(chǎn)供臨床應(yīng)用，可惜目前所應(yīng)用的載體尚沒(méi)有一個(gè)能符合上述全部的條件。這是今后努力研究的方向。基因組學(xué)與新藥研究 基因組（genome）：生物體單倍體細(xì)胞所有基因的總和?；蚪M學(xué)（genomics）：DNA測(cè)序、基因及非編碼區(qū)定位及繪圖。

人類基因組計(jì)劃（human genome project）人類基因組測(cè)序、基因定位、破譯人類全部遺傳信息。世紀(jì)90年代初期, 美國(guó)生物學(xué)家提出并實(shí)施了人類基因組計(jì)劃(human genome project, HGP),2003年4月14日,美國(guó)人類基因組研究項(xiàng)目首席科學(xué)家Collins F 博士在華盛頓隆重宣布: 人類基因組序列圖繪制成功。

藥物基因組學(xué)

概念：藥物基因組學(xué)是以提高藥物療效及安全性為目標(biāo)，研究遺傳變異與藥物反應(yīng)相互關(guān)系的一門學(xué)科。藥物效應(yīng)個(gè)體差異：不同個(gè)體對(duì)同一藥物同一劑量的反應(yīng)存在量與質(zhì)的差異

藥物基因組學(xué)的目的是通過(guò)基因分型指導(dǎo)個(gè)體化治療，研究的主要策略包括選擇藥物起效、活化、排泄等相關(guān)過(guò)程的候選基因進(jìn)行研究，鑒定基因序列的變異。

一）候選基因分析 候選基因分析（candidate gene approach）通過(guò)對(duì)已知候選基因與性狀表型值的關(guān)聯(lián)分析判斷其是否就是主基因（藥代動(dòng)力學(xué)和藥效動(dòng)力學(xué)相關(guān)基因）或是否與主基因緊密連鎖。候選基因”策略

給定某一藥物的條件下，比較有反應(yīng)者及無(wú)反應(yīng)者靶基因多態(tài)性出現(xiàn)的頻率。

局限性：

須明確給定藥物的作用機(jī)制、所治療疾病的病理生理學(xué)；

不能鑒定那些根據(jù)藥物作用或疾病生物學(xué)難以預(yù)測(cè)的新基因。

二）全基因組關(guān)聯(lián)分析 全基因組關(guān)聯(lián)分析（Genome-wide association study，GWAS）是一種在全基因組范圍內(nèi)尋找與藥物應(yīng)答相關(guān)遺傳變異的方法。

GWAS為人們打開(kāi)了一扇通往研究復(fù)雜疾病的大門，將在患者全基因組范圍內(nèi)檢測(cè)出的SNP位點(diǎn)與對(duì)照組進(jìn)行比較，找出所有的變異等位基因頻率，從而避免了像候選基因策略一樣需要預(yù)先假設(shè)致病基因。

藥物基因組學(xué)的根本目的

運(yùn)用遺傳信息進(jìn)行個(gè)性化用藥，將正確藥物、正確劑量在恰當(dāng)?shù)臅r(shí)間給予合適的患者。

后基因組時(shí)代

在后基因組時(shí)代, 研究的重心已從揭示生命的所有遺傳信息轉(zhuǎn)移到在整體水平上對(duì)生物功能的研究。

轉(zhuǎn)向的第一個(gè)標(biāo)志——產(chǎn)生了功能基因組學(xué)的新學(xué)科。另一個(gè)標(biāo)志——產(chǎn)生了一門在整體水平上研究細(xì)胞內(nèi)全部蛋白質(zhì)組成及其活動(dòng)規(guī)律的新興學(xué)科—蛋白質(zhì)組學(xué)。生命現(xiàn)象的主要體現(xiàn)者是蛋白質(zhì)

而蛋白質(zhì)有其自身的特定活動(dòng)規(guī)律,僅僅從基因的角度來(lái)研究是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的

必須研究由基因轉(zhuǎn)錄和翻譯出蛋白質(zhì)的過(guò)程,才能真正揭示生命現(xiàn)象的本質(zhì)和規(guī)律。蛋白質(zhì)組學(xué)的研究策略：

采用高通量的蛋白質(zhì)組研究技術(shù)，分析生物體內(nèi)盡可能多乃至接近所有的蛋白質(zhì)。（結(jié)構(gòu)、相互作用）研究不同時(shí)期細(xì)胞蛋白質(zhì)組成的變化，如蛋白質(zhì)在不同環(huán)境下的差異表達(dá)，以發(fā)現(xiàn)有差異的蛋白質(zhì)種類為主要目標(biāo)。（疾病研究——診斷、藥物靶點(diǎn)）

新型疫苗，多肽疫苗：基因工程疫苗，基因疫苗

核酶——一種具有核酸內(nèi)切酶活性的RNA分子，可特異性地切割靶RNA序列，具有解離后重復(fù)切割相同靶分子的能力，應(yīng)用前景：抗腫瘤，抗抗藥性，抗AIDS，抗白血病，抗病毒病 靶向腫瘤細(xì)胞是以 RNA 干擾為基礎(chǔ)的腫瘤治療的重要發(fā)展方向。

第八章 藥物制劑的設(shè)計(jì)

【掌握】藥物制劑設(shè)計(jì)的基本原則；【熟悉】藥物制劑設(shè)計(jì)的內(nèi)容，制劑處方設(shè)計(jì)前工作； 【了解】制劑處方的優(yōu)化設(shè)計(jì)；新藥制劑的研究與申報(bào)。

藥物制劑設(shè)計(jì)的程序：

1）對(duì)處方前工作包括理化性質(zhì)、藥理學(xué)、藥動(dòng)學(xué)有一個(gè)較全面的認(rèn)識(shí)。如果某些參數(shù)尚未具備，而又是劑型設(shè)計(jì)所必須得，應(yīng)先進(jìn)行試驗(yàn)，獲得足夠的數(shù)據(jù)以后，再進(jìn)行處方設(shè)計(jì) 2）根據(jù)藥物的理化性質(zhì)和治療需要，結(jié)合各項(xiàng)臨床前研究工作，確定給藥的最佳途徑，并綜合各方面因素，選擇合適的劑型；（3）根據(jù)所確定的劑型的特點(diǎn)，選擇合適于劑型的輔料或添加劑，通過(guò)各種測(cè)定方法考察制劑的各項(xiàng)指標(biāo)，采用實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化法對(duì)處方和制備工藝進(jìn)行優(yōu)選。

藥物制劑的設(shè)計(jì)的五個(gè)基本原則 1.安全性 2.有效性 3.可控性 4.穩(wěn)定性 5.順應(yīng)性

藥物制劑設(shè)計(jì)的目的是根據(jù)：

疾病的性質(zhì)；臨床用藥的需要；藥物的理化性質(zhì)；合適的輔料；制備工藝；制劑的最佳處方和工藝條件；確定包裝

處方前研究

一、化合物的物理化學(xué)性質(zhì)測(cè)定 解離常數(shù) 溶解度

對(duì)于易溶于水的藥物，可以制成各種固體或液體劑型，適合于各種給藥途徑

油水分配系數(shù)

油/水分配系數(shù)是分子親脂特性的度量，在藥劑學(xué)研究中主要用于預(yù)見(jiàn)藥物對(duì)在體組織的滲透或吸收難易程度。固有溶出速率

二、原料藥的固態(tài)性質(zhì) 鹽型 多晶型 吸濕性

水溶性藥物在大于其臨界相對(duì)濕度的環(huán)境中吸濕量突然增加，而水不溶性藥物隨空氣中的RH的增加緩緩吸濕。粉體學(xué)性質(zhì)

三、穩(wěn)定性和配伍研究 藥用化合物的穩(wěn)定性 輔料的配伍研究

四、處方前生物藥劑學(xué)研究 藥物的吸收

在有效期內(nèi)保持穩(wěn)定 生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng) 侯選化合物的藥代動(dòng)力學(xué)

固體制劑的配伍研究

輔料的添加對(duì)固態(tài)藥物的物理穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性都有影響。用dsc

液體制劑的配伍研究

第五篇：生物技術(shù)制藥教學(xué)大綱

第一章 緒論（2學(xué)時(shí)）第一節(jié) 生物技術(shù)概述 1 生物技術(shù)的概念 2 生物技術(shù)發(fā)展史 第二節(jié) 生物技術(shù)制藥 1 生物技術(shù)制藥的概念 2 生物技術(shù)在制藥中的應(yīng)用 我國(guó)生物技術(shù)制藥現(xiàn)狀和發(fā)展前景 4 醫(yī)藥生物技術(shù)發(fā)展展望

第二章 生物藥物（10學(xué)時(shí)）

1．生物藥物的來(lái)源、特性、分類與制備。（2學(xué)時(shí)）

2．氨基酸類藥物：氨基酸類藥物研究概況；在醫(yī)藥中的應(yīng)用；氨基酸生產(chǎn)。（2學(xué)時(shí)）3．多肽、蛋白質(zhì)類藥物：多肽、蛋白質(zhì)類藥物的特點(diǎn)、分離純化方法、工業(yè)生產(chǎn)制備過(guò)程。（2學(xué)時(shí)）

4．核酸類藥物：概述（分類、應(yīng)用）；生產(chǎn)方法；核酸類藥物的制備。（2學(xué)時(shí)）5．糖類藥物：制備；純化。（2學(xué)時(shí)）

第三章 基因工程制藥（8學(xué)時(shí)）

通過(guò)本章學(xué)習(xí)，了解基因工程藥物研制的意義，掌握基因工程藥物的研制過(guò)程、研制方法。1概述。

2基因工程藥物生產(chǎn)的基本過(guò)程。(2)3目的基因的獲得：直接分離法；從基因文庫(kù)中篩選；逆轉(zhuǎn)錄法；人工合成法。4目的基因與運(yùn)載體的體外重組：常用載體；目的基因與運(yùn)載體的體外重組。5重組分子導(dǎo)入受體細(xì)胞；導(dǎo)入方法；影響轉(zhuǎn)化的因素；陽(yáng)性重組體的篩選。(2)6基因表達(dá)：大腸桿菌中的基因表達(dá)；真核基因在原核生物中的表達(dá)方式；真核基因在真核生物中的表達(dá)；真核基因在動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)。(2)7基因工程下游技術(shù)；下游技術(shù)的要求；基因工程菌的穩(wěn)定性；基因工程菌發(fā)酵。8基因工程藥物的分離、純化：分離純化的基本過(guò)程；分離純化的技術(shù)。

9基因工程藥物的質(zhì)量控制:材料的質(zhì)量控制;培養(yǎng)過(guò)程的質(zhì)量控制;純化工藝工程的質(zhì)量控制。(2)第四章 動(dòng)物細(xì)胞工程制藥（8學(xué)時(shí)）1 概述： 形態(tài)及生理特性。（2）生產(chǎn)用的動(dòng)物細(xì)胞：生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的要求；生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的獲取。4 基因工程細(xì)胞的構(gòu)建和篩選；真核細(xì)胞基因表達(dá)載體的構(gòu)建；基因載體的導(dǎo)入和高效表達(dá)工程細(xì)胞株的篩選。（2）動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基 6 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法（2）7 動(dòng)物細(xì)胞大量培養(yǎng)的方法和操作方式 動(dòng)物細(xì)胞生物反應(yīng)器及檢測(cè)控制系統(tǒng)：攪拌式生物反應(yīng)器；氣升式生物反應(yīng)器；流化床生物反應(yīng)器。（2）

第五章 抗體制藥（4學(xué)時(shí)）1概述

2單克隆抗體：制備；細(xì)胞融合；雜交瘤的培養(yǎng)、篩選及克隆化。（2）

3鼠源性單克隆抗體的改造：Ig分子的結(jié)構(gòu)模式圖；結(jié)構(gòu)改造；基因工程抗體。4抗體的應(yīng)用：臨床檢驗(yàn)；層析介質(zhì)；導(dǎo)向藥物。（2）