第一篇：生物技術(shù)制藥習(xí)題答案(夏煥章版)

生物技術(shù)制藥習(xí)題答案(夏煥章版)1.生物技術(shù)制藥的特征、。

2.生物藥物廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)各領(lǐng)域，按功能用途可分為三類，分別是藥物、診斷藥物。

3.現(xiàn)代生物藥物已形成四大類型：一是應(yīng)用DNA重組技術(shù)制造的類治療劑 ；二是基因藥物 ；三是來自動(dòng)物植物和微生物的天然生物藥物 ；四是合成與部分合成的生物藥物； 4.生物技術(shù)的發(fā)展按其技術(shù)特征來看，可分為三個(gè)不同的發(fā)展階段，近代生物技術(shù)階段 ； 現(xiàn)代生物技術(shù)階段。

5.生物技術(shù)所含的主要技術(shù)范疇有；質(zhì)核酸工程 和 生化工程 ； 1.生物技術(shù)的核心和關(guān)鍵是（細(xì)胞工程）

2.第三代生物技術(shù)（基因工程技術(shù)）的出現(xiàn)，大大擴(kuò)大了現(xiàn)在生物技術(shù)的研究范圍 3.下列哪個(gè)產(chǎn)品不是用生物技術(shù)生產(chǎn)的（氯化鈉）

4.下列哪組描述（高技術(shù)、高投入、高風(fēng)險(xiǎn)、高收益、長(zhǎng)周期）符合是生物技術(shù)制藥的特征

5.我國(guó)科學(xué)家承擔(dān)了人類基因組計(jì)劃（1%）的測(cè)序工作

1.生物技術(shù)制藥:采用現(xiàn)代生物技術(shù)可以人為的創(chuàng)造一些條件，借助某些微生物、植物或動(dòng)物來生產(chǎn)所需的醫(yī)學(xué)藥品，稱為生物技術(shù)制藥。

2.生物技術(shù)藥物:一般說來，采用DNA重組技術(shù)或其它生物新技術(shù)研制的蛋白質(zhì)或核酸來藥物稱為生物技術(shù)藥物。

3.生物藥物:生物技術(shù)藥物是重組產(chǎn)品概念在醫(yī)藥領(lǐng)域的擴(kuò)大應(yīng)用，并與天然藥物、微生物藥物、海洋藥物和生物制品一起歸類為生物生物藥物。

生物技術(shù)藥物的特征是：（1）分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜（2）具有種屬差異特異性（3）治療針對(duì)性強(qiáng)、療效高（4）穩(wěn)定性差（5）免疫原性（6）基因穩(wěn)定性（7）體內(nèi)半衰期短（8）受體效應(yīng)（9）多效應(yīng)和網(wǎng)絡(luò)效應(yīng)（10）檢驗(yàn)特殊性

2.簡(jiǎn)述生物技術(shù)發(fā)展的不同階段的技術(shù)特征和代表產(chǎn)品？（1）傳統(tǒng)生物技術(shù)的技術(shù)特征是釀造技術(shù)，所得產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)較為簡(jiǎn)單，屬于微生物的初級(jí)代謝產(chǎn)物。代表產(chǎn)品如酒、醋、乙醇，乳酸，檸檬酸等。（2）近代生物技術(shù)階段的技術(shù)特征是微生物發(fā)酵技術(shù)，所得產(chǎn)品的類型多，不但有菌體的初級(jí)代謝產(chǎn)物、次級(jí)代謝產(chǎn)物，還有生物轉(zhuǎn)化和酶反應(yīng)等的產(chǎn)品，生產(chǎn)技術(shù)要求高、規(guī)模巨大，技術(shù)發(fā)展速度快。代表產(chǎn)品有青霉素，鏈霉素，紅霉素等抗生素，氨基酸，工業(yè)酶制劑等。（3）現(xiàn)代生物技術(shù)階段的技術(shù)特征是DNA重組技術(shù)。所得的產(chǎn)品結(jié)構(gòu)復(fù)雜，治療針對(duì)性強(qiáng)，療效高，不足之處是穩(wěn)定性差，分離純化工藝更復(fù)雜。代表產(chǎn)品有胰島素，干擾素和疫苗等。

3.生物技術(shù)在制藥中有那些應(yīng)用? 生物技術(shù)應(yīng)用于制藥工業(yè)可大量生產(chǎn)廉價(jià)的防治人類重大疾病及疑難癥的新型藥物，具體體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：（1）基因工程制藥，利用基因工程技術(shù)可生產(chǎn)出具有生理活性的肽類和蛋白質(zhì)類藥物，基因工程疫苗和抗體，還可建立更有效的藥物篩選模型，改良現(xiàn)有發(fā)酵菌種，改進(jìn)生產(chǎn)工藝，提供更準(zhǔn)確的診斷技術(shù)和更有效的治療技術(shù)等。隨著基因技術(shù)的發(fā)展，應(yīng)用前景會(huì)更廣闊。（2）細(xì)胞工程和酶工程制藥:該技術(shù)的發(fā)展為現(xiàn)代制藥技術(shù)提供了更強(qiáng)大的技術(shù)手段，使人類可控制或干預(yù)生物體初次生代謝產(chǎn)物和生物轉(zhuǎn)化等過程，使動(dòng)植物能更有效的滿足人類健康方面的需求。（3）發(fā)酵工程制藥:發(fā)酵工程制藥的發(fā)展主要體現(xiàn)在對(duì)傳統(tǒng)工藝的改進(jìn)，新藥的研制和高效菌株的篩選和改造等。

1.基因工程藥物制造的主要步驟是： ； 菌 ； 目的基因的表達(dá) ； 產(chǎn)物的分離純化 ； 產(chǎn)品的檢驗(yàn)。2.目的基因獲得的主要方法是 和

3.基因表達(dá)的微生物宿主細(xì)胞分為2大類。第一類為 桿菌、枯草芽孢桿菌、鏈霉素 ；第二類為 真核細(xì)胞，常用的主要有 酵母、絲狀真菌。

4.基因工程菌在傳代過程中經(jīng)常出現(xiàn)質(zhì)粒不穩(wěn)定性的現(xiàn)象，質(zhì)粒不穩(wěn)定分為 和 結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性 ；基因工程菌的不穩(wěn)定性至少維持 25 代以上。5.基因工程菌的培養(yǎng)方式主要有 固定化培養(yǎng) ；

6.高密度發(fā)酵一般是制培養(yǎng)液中工程菌的濃度在以上，理論上的最高值可達(dá)。7.影響高密度發(fā)酵的因素有 ； ； ；

8.基因工程藥物的分離純化一般不應(yīng)超過5個(gè)步驟，包括與初步純化 ； 高度純化 和 成品加工。

9.在基因工程藥物分離純化過程中，分離細(xì)胞碎片比較困難，可用水相分配 的方法，使細(xì)胞碎片分配在一相，目標(biāo)藥物分配在另一相從而達(dá)到初步分離的目的。

10.人工化學(xué)合成DNA新形成的核苷酸鏈的合成方向是，合成的DNA 5’末端是 磷酸酯鍵，3’ 末端是-OH

1、凝膠過濾法是依賴（分子大?。﹣矸蛛x蛋白組分。

2、在工程菌發(fā)酵過程中，選用那種糖會(huì)對(duì)lac啟動(dòng)子有阻遏作用。（甘油）3.可用于醫(yī)藥目的的蛋白質(zhì)和多肽藥物都是由相應(yīng)的（基因）合成的 4.用反轉(zhuǎn)錄法獲得目的基因，首先必須獲得（mRNA）5.那一類細(xì)菌不屬于原核細(xì)胞（酵母）

6.基因工程菌的生長(zhǎng)代謝與（產(chǎn)物的分子量）無關(guān) 7.基因工程菌的穩(wěn)定性至少要維持在（25）以上

8.基因工程菌的高密度發(fā)酵過程中，目前普遍采用（葡萄糖）作為發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源 9.基因工程藥物多為胞內(nèi)產(chǎn)物，分離提取時(shí)需破碎細(xì)胞?；瘜W(xué)破碎法是常用的方法，但（酶溶法）不是化學(xué)破碎細(xì)胞的方法。下列那種色譜方法是依據(jù)分子篩作用來純化基因工程藥物（凝膠色譜）

1.基因工程技術(shù):也可稱為DNA重組技術(shù)，將所要重組對(duì)象的目的基因插入載體、拼接、轉(zhuǎn)入新的宿主細(xì)胞，構(gòu)建工程菌，實(shí)現(xiàn)遺傳物質(zhì)的重新組合，并使目的基因在工程菌內(nèi)進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)的技術(shù)。

2.基因工程藥物:利用DNA重組技術(shù)生產(chǎn)出來的藥物被稱為基因工程藥物。

3.基因表達(dá):基因表達(dá)是指結(jié)構(gòu)基因在生物體中的轉(zhuǎn)錄、翻譯以及所有加工過程。

3.高密度發(fā)酵:一般是指培養(yǎng)液中工程菌的菌體濃度在 50g DCW/L 以上的發(fā)酵過程，理論上的最高值可達(dá) 200g DCW/L。

1.簡(jiǎn)述基因工程生產(chǎn)藥品的優(yōu)點(diǎn)（5）可獲得新型化合物，擴(kuò)大藥物篩選來源。2.根據(jù)真核基因在原核細(xì)胞中表達(dá)的特點(diǎn)，表達(dá)載體必須具備下列條件：（1）能夠獨(dú)立的復(fù)制；（2）具有靈活的克隆位點(diǎn)和方便的篩選標(biāo)記，以利于外源基因的克隆、鑒定和篩選；（3）應(yīng)具有很強(qiáng)的啟動(dòng)子，能為大腸桿菌的RAN聚合酶所識(shí)別；（4）應(yīng)具有阻遏子（5）應(yīng)具有很強(qiáng)的終止子（6）所產(chǎn)生的mRNA必須具有翻譯的起始信號(hào)。

3.簡(jiǎn)述影響目的基因在大腸桿菌中表達(dá)的因素:（1）外源基因的劑量（2）外源基因的表達(dá)的表達(dá)效率（3）表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性（4）細(xì)胞的代謝負(fù)荷（5）工程菌的培養(yǎng)條件 4.為了提高基因工程菌的質(zhì)粒穩(wěn)定性，可采?。海?）選擇合適的宿主菌；（2）選擇合適的載體；（3）選擇壓力；（4）分階段控制培養(yǎng)；（5）控制培養(yǎng)條件；（6）固定化技術(shù)。

5.影響基因工程菌培養(yǎng)工藝的主要因素有：（1）培養(yǎng)基的影響（2）接種量的影響（3）溫度的影響（4）溶解氧的影響（5）誘導(dǎo)時(shí)機(jī)的影響（6）誘導(dǎo)表達(dá)程序的影響（7）PH的影響

6.建立基因工程藥物分離純化工藝時(shí)，應(yīng)該考慮下列因素：（1）含目的的產(chǎn)物的初始物料的特點(diǎn)；（2）物料中雜質(zhì)的種類和性質(zhì)；（3）目的產(chǎn)物特性；（4）產(chǎn)品的質(zhì)量要求 7.基因工程技術(shù)生產(chǎn)的目標(biāo)產(chǎn)物是多肽和蛋白質(zhì)類化合物，這些產(chǎn)品有什么特點(diǎn)？（1）目的產(chǎn)物在初始物料中含量低（2）含目的產(chǎn)物的初始物料組成復(fù)雜（3）目的產(chǎn)物的的穩(wěn)定性差，對(duì)酸堿熱等外界因素敏感；（4）種類繁多（5）產(chǎn)品的質(zhì)量要求

9.分離純化基因工程藥物常用的色譜方法有：離子交換色譜，疏水色譜，親和色譜和凝膠過濾色譜；離子交換色譜，以離子交換劑為固定相，依據(jù)流動(dòng)相中的組分離子和交換劑上的平衡離子進(jìn)行可擬交換時(shí)的結(jié)合力大小的差別而進(jìn)行分離的一種色譜方法；疏水色譜，利用蛋白質(zhì)表面的疏水區(qū)域與固定相上疏水性基團(tuán)相互作用力的差異對(duì)蛋白質(zhì)組分進(jìn)行分離的色譜方法；親和色譜：利用固定化配體與目的蛋白質(zhì)之間非常特異的生物親和力進(jìn)行吸附，這種結(jié)合既是特異的又是可逆的，改變條件可以使這種結(jié)合解除的原理分離純化蛋白質(zhì)；凝膠過濾色譜，是以多孔性凝膠填料為固定相，按分子大小對(duì)溶液中各組分進(jìn)行分離的液相色譜方法。

10.影響高密度發(fā)酵的因素有:（1）培養(yǎng)基:為滿足菌體生長(zhǎng)和外源蛋白表達(dá)的需求，常需投入幾倍于生物量的基質(zhì)，為了達(dá)到理想的效果，需要對(duì)培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的配比進(jìn)行優(yōu)化。（2）溶氧濃度:溶解氧的濃度過高或過低都會(huì)影響細(xì)菌的代謝，因而對(duì)菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)物表達(dá)影響很大。要保持適宜的溶氧濃度，需要確定發(fā)酵罐的通氣量和攪拌速度。（3）PH:在高密度發(fā)酵的過程中，PH的改變會(huì)影響細(xì)胞的表達(dá)和基因產(chǎn)物的表達(dá)，因此一定要考慮細(xì)菌的最適PH范圍。（4）溫度:溫度是影響細(xì)菌生長(zhǎng)和調(diào)控細(xì)胞代謝的重要因素。較高的溫度有利于細(xì)菌的生長(zhǎng)，提高菌體的生物量。（5）代謝副產(chǎn)物:大腸桿菌在發(fā)酵過程中都會(huì)產(chǎn)生一些有害的代謝副產(chǎn)物，這些副產(chǎn)物積累到一定量會(huì)抑制菌體的生長(zhǎng)和蛋白的表達(dá)，可通過填加某些物質(zhì)如氨基酸可減輕某些有害物質(zhì)如乙酸的抑制作用。1.發(fā)酵工業(yè)的生產(chǎn)水平取決于三個(gè)要素，分別是、和

2.發(fā)酵工程產(chǎn)品開發(fā)的關(guān)鍵是篩選到高效菌株，一般優(yōu)良菌種的選育方法主要有

育、誘變育種 和 原生質(zhì)體融合。3.微生物誘變育種導(dǎo)致遺傳物質(zhì)DNA結(jié)構(gòu)上發(fā)生變化，通常用、、等因素進(jìn)行對(duì)微生物的誘變。4.誘變育種的機(jī)制是導(dǎo)致微生物DNA的微細(xì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，主要分為色體畸變即大損傷突變、染色體組突變 三種類型。

5.誘變育種使用的物理誘變劑主要有、、線、超聲波、β-射線，其中以 紫外線 應(yīng)用最廣。

6.發(fā)酵的基本過程分為、、7.在制備大量微生物菌體或其代謝產(chǎn)物時(shí)，可采用不同的發(fā)酵方式。微生物的發(fā)酵方式可分為 分批發(fā)酵、補(bǔ)料分批發(fā)酵、連續(xù)發(fā)酵。7.發(fā)酵產(chǎn)物的提取方法一般有、8.用人工方法來誘發(fā)突變是加速基因突變的重要手段,突變部位一般發(fā)生在 因此突變后性狀能穩(wěn)定的遺傳.9.在發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)中使用的碳源有、、10.在發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)中,過去是直接假如酸或堿來控制發(fā)酵液的PH值,現(xiàn)在常用來控制。1.傳統(tǒng)的微生物發(fā)酵工程不能生產(chǎn)下列哪個(gè)產(chǎn)品（青霉素）

2.發(fā)酵生產(chǎn)使用的菌種必須以休眠狀態(tài)保存，一般保存溫度范圍是（0-4℃）3.發(fā)酵一般在不銹鋼制的釜式反應(yīng)罐內(nèi)進(jìn)行，菌種的接種量一般為（5-20%）4.那種發(fā)酵方式可以為微生物提供較穩(wěn)定的生活環(huán)境（連續(xù)發(fā)酵）

5.發(fā)酵培養(yǎng)基中需要的氮源分為速效氮源和遲效氮源。（玉米漿）是速效氮源 6.發(fā)酵產(chǎn)物的提取常用的四種方法是（吸附法 沉淀法 溶劑萃取法 離子交換法）7.鏈霉素抗生素合成基因組的典型特征是（高G-C堿基組成，含量高達(dá)70%；三聯(lián)體密碼子的第三個(gè)堿基的G,C比例極高）

8.發(fā)酵生產(chǎn)中培養(yǎng)基的成分是(碳源氮源無機(jī)鹽微量元素和水)9.下列那種熱不是發(fā)酵過程中散失熱能的因素（生物熱）微生物都有都有各自的最適PH,大多數(shù)微生物生長(zhǎng)的PH范圍是(3-6)發(fā)酵工程:又稱為微生物工程，是利用微生物制造工業(yè)原料與工業(yè)產(chǎn)品，并提供服務(wù)的技術(shù)。誘變劑:能誘發(fā)基因突變并使突變率提高到超過自發(fā)突變水平的物理化學(xué)因子都稱為誘變劑。

1.發(fā)酵工程發(fā)展大體上可分為四個(gè)階段，簡(jiǎn)述各階段的技術(shù)內(nèi)容，代表人物和主要產(chǎn)品 第一階段：20世紀(jì)以前時(shí)期，人類利用傳統(tǒng)的微生物發(fā)酵技術(shù)來生產(chǎn)葡萄酒、酒、醋，醬、奶酪等，生產(chǎn)規(guī)模小，主要憑經(jīng)驗(yàn)控制生產(chǎn)過程。代表人物巴斯德。第二階段，1900-1940年期間，微生物培養(yǎng)技術(shù)不斷進(jìn)步，有力的推動(dòng)了發(fā)酵工業(yè)的快速發(fā)展，能排除培養(yǎng)體系中的有害微生物，能進(jìn)行大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)發(fā)酵過程。代表產(chǎn)品是丙酮、丁醇，甘油，乳酸，檸檬酸等。第三階段，發(fā)酵工業(yè)大發(fā)展時(shí)期。能對(duì)微生物進(jìn)行深層培養(yǎng)，可采用純種發(fā)酵，無菌操作技術(shù)成熟，生產(chǎn)規(guī)模巨大，生產(chǎn)過程能有效控制，相應(yīng)的采用較復(fù)雜的工藝和設(shè)備。代表產(chǎn)品如青霉素，鏈霉素，紅霉素，氨基酸等。代表人物是發(fā)現(xiàn)青霉素的英國(guó)科學(xué)家Fleming.第四階段 基因工程等高新技術(shù)應(yīng)用階段?，F(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展是人們加深了對(duì)微生物代謝產(chǎn)物合成的遺傳學(xué)與調(diào)節(jié)機(jī)制的了解，為更好的應(yīng)用提供了前提條件。DAN雙螺旋結(jié)構(gòu)模型的建立，質(zhì)粒中遺傳物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)，DNA限制酶和連接酶的應(yīng)用，為人類控制生物體生物代謝過程提供了強(qiáng)大的工具，使發(fā)酵技術(shù)能為人類提供需要的產(chǎn)品。代表產(chǎn)品胰島素，干擾素等，人物如沃森、克里克等。2.簡(jiǎn)述培養(yǎng)基對(duì)發(fā)酵的影響:微生物的生長(zhǎng)需要一定的營(yíng)養(yǎng)，不同的微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)的要求有很大的差異，培養(yǎng)基的成分和配比合適與否，對(duì)產(chǎn)生菌的生長(zhǎng)發(fā)育，發(fā)酵單位的增長(zhǎng)，有相當(dāng)大的影響，同時(shí)還會(huì)影響到提取工藝和產(chǎn)品質(zhì)量。微生物的生長(zhǎng)需要較多供給有機(jī)碳架的碳源，構(gòu)成含氮物質(zhì)的氮源，還有無機(jī)鹽類，微量元素和水分等。碳源是構(gòu)成微生物細(xì)胞和各種代謝產(chǎn)物碳架的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)碳源在微生物的代謝過程中被氧化、釋放出能量，并以ATP的形式貯存于細(xì)胞內(nèi)，供給微生物生命活動(dòng)所需的能量。碳源是構(gòu)成菌體細(xì)胞的物質(zhì)，同時(shí)也是細(xì)胞合成氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸、酶類及含氮代謝產(chǎn)物的成分，選擇氮源需要注意氮源促進(jìn)菌體生長(zhǎng)、繁殖和合成產(chǎn)物間的關(guān)系。無機(jī)鹽和微量元素是構(gòu)成菌體原生質(zhì)的成分，可維持酶的活性，可調(diào)節(jié)細(xì)胞的滲透壓和PH，參與產(chǎn)物的合成等。水是必需的物質(zhì)，它既是構(gòu)成菌體細(xì)胞的主要成分，又是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)傳遞的介質(zhì)，對(duì)微生物的生長(zhǎng)繁殖和產(chǎn)物合成有很重要的作用。

3.簡(jiǎn)述溫度對(duì)發(fā)酵的影響，如何控制溫度可提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)率？在發(fā)酵過程中，菌體的生長(zhǎng)和產(chǎn)物的合成均溫度有密切關(guān)系，一般最適生長(zhǎng)溫度和最適生產(chǎn)溫度往往不一致。在具體控制過程中，究竟選擇哪個(gè)溫度，需要視在微生物生長(zhǎng)階段和產(chǎn)物合成階段中哪一矛盾是主要而定，另外，溫度還會(huì)影響微生物代謝的途徑和方向。在理論上，整個(gè)發(fā)酵過程中不應(yīng)只選一個(gè)培養(yǎng)溫度，而應(yīng)該根據(jù)發(fā)酵的不同階段選擇不同的培養(yǎng)溫度。在生長(zhǎng)階段，應(yīng)選擇最適生長(zhǎng)溫度；在產(chǎn)物分泌階段，應(yīng)選擇最適生產(chǎn)溫度。這樣變溫發(fā)酵所得產(chǎn)物的產(chǎn)量是比較理想的。但在工業(yè)發(fā)酵過程中，由于發(fā)酵液的體積很大，升降溫度都比較的困難，所以在整個(gè)發(fā)酵過程中，往往采用一個(gè)比較適合的培養(yǎng)溫度，使得到的產(chǎn)物產(chǎn)率最高。

4.簡(jiǎn)述溶氧對(duì)發(fā)酵的影響，如何控制溶氧濃度可提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)率？大部分工業(yè)微生物需要在有氧環(huán)境中生長(zhǎng)，培養(yǎng)這類微生物需要采取通氣發(fā)酵，適量的溶解氧可維持其呼吸代謝和代謝產(chǎn)物的合成。，對(duì)決大多數(shù)發(fā)酵來說，供氧不足會(huì)造成代謝異常，降低產(chǎn)物產(chǎn)量。因此，保證發(fā)酵液中溶氧和加速氣相、液相和微生物之間的物質(zhì)傳遞對(duì)于提高發(fā)酵的效率是至關(guān)重要的。發(fā)酵液的溶氧濃度，是由供氧和需氧兩方面多決定的，也就是說當(dāng)發(fā)酵的供氧量大于需氧量，溶氧濃度就上升，反之就下降。因此要控制好溶氧濃度需要從這兩方面入手。在供氧方面主要是設(shè)法提高氧傳遞的推動(dòng)力和液相體積氧傳遞系數(shù)的值，如可調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速或通氣速率來控制供氧；發(fā)酵液的需氧量受菌體濃度的影響最為明顯，發(fā)酵液的攝氧率隨菌濃增加而按一定比例增加，但是氧的傳遞速率隨菌濃的增加呈對(duì)數(shù)減少。因此可通過控制最合適菌體濃度來控制需氧量。在工業(yè)生產(chǎn)中還可通過調(diào)節(jié)溫度，液化培養(yǎng)基，中間補(bǔ)水，填加表面活性劑來改善溶氧水平。

5.簡(jiǎn)述PH對(duì)發(fā)酵的影響，如何控制PH可提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)率 發(fā)酵培養(yǎng)基的PH對(duì)微生物的生長(zhǎng)具有非常明顯的影響，也是影響發(fā)酵過程中各種酶活的重要因素，由于PH不當(dāng)，可能嚴(yán)重影響微生物的生長(zhǎng)和產(chǎn)物的合成，因此對(duì)微生物發(fā)酵來講，有最適生長(zhǎng)PH和最適生產(chǎn)PH。在了解發(fā)酵過程中的最適PH的要求后，就要采取各種方法來控制。首先要使培養(yǎng)基在發(fā)酵過程中的PH變化在合適的范圍內(nèi)，一般控制培養(yǎng)基PH變化的能力有限，在不能滿足要求的前提下，可在發(fā)酵過程中直接加堿或酸性物質(zhì)的方法來控制。6.抗生素合成基因的特點(diǎn)是：（1）抗生素合成基因的一個(gè)典型特點(diǎn)是高G-C堿基組成，含量達(dá)70%；三聯(lián)體密碼子中的第三個(gè)堿基的G-C比例極高；（2）對(duì)已克隆的抗生素合成基因進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)他們大多處在一個(gè)基因簇中；（3）抗生素合成基因除定位在染色體上外，還發(fā)現(xiàn)定位在質(zhì)粒上。

7.利用基因工程如何提高抗生素的產(chǎn)量？（1）增加參與生物合成限速階段基因的拷貝數(shù)；（2）通過調(diào)節(jié)基因的作用；（3）增加抗性基因；

8.基因工程在抗生素生產(chǎn)中有那些應(yīng)用？通過基因工程明確抗生素合成基因的典型特點(diǎn)和克隆的方法，解析合成基因的結(jié)構(gòu)，深入了解微生物的生長(zhǎng)代謝過程，更有效的控制抗生素的生產(chǎn)，為人類的健康提供更多更有效的產(chǎn)品，主要體現(xiàn)在以下幾方面：（1）提高抗生素的產(chǎn)量（2）改善抗生素的組分（3）改進(jìn)抗生素的生產(chǎn)工藝；（4）產(chǎn)生雜合抗生素，提供新的藥物來源（5），用組合生物合成方法合成復(fù)雜化合物

9.發(fā)酵工程的研究?jī)?nèi)容包括那些：菌種的培養(yǎng)和選育、菌的代謝和調(diào)節(jié)、培養(yǎng)基滅菌、通氣攪拌、溶氧、發(fā)酵條件的優(yōu)化、發(fā)酵過程各種參數(shù)與動(dòng)力學(xué)、發(fā)酵反應(yīng)器的設(shè)計(jì)和自動(dòng)控制、產(chǎn)品的分離純化和精制等。

10.理想的發(fā)酵罐應(yīng)該具有那些特點(diǎn)？（1）制造發(fā)酵罐的材料穩(wěn)定性好，對(duì)微生物無毒性（2）密封性良好（3）良好的傳質(zhì)傳熱和混合性能（4）內(nèi)壁平整光滑，連接接口無死角死腔；（5）能自動(dòng)控制且控制精確度高

根據(jù)生物技術(shù)制藥的特點(diǎn),在國(guó)內(nèi)外的發(fā)展現(xiàn)狀,分析該制藥技術(shù)在我國(guó)的發(fā)展前景.1、動(dòng)物與微生物、植物細(xì)胞培養(yǎng)生長(zhǎng)條件最明顯的區(qū)別是動(dòng)物細(xì)胞需要

2、生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞為細(xì)胞、細(xì)胞系、轉(zhuǎn)化 以及 細(xì)胞系。

3、按我國(guó)和美國(guó)FDA的規(guī)定，用于生產(chǎn)的工程細(xì)胞必須建立作細(xì)胞庫 兩個(gè)細(xì)胞庫。

4、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)根據(jù)培養(yǎng)基的不同分為 和

5、從生產(chǎn)實(shí)際看，懸浮培養(yǎng)。

1．人胚成纖維細(xì)胞約可以培養(yǎng)（50）代。

2．動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)新買的玻璃器材在使用前必須先（泡酸）。3．動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的最適PH為（7.2-7.4）。

4．目前衛(wèi)生部對(duì)生物工程的產(chǎn)品一般要求純度在（98%）以上。

5.將構(gòu)建好載體導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞最常用有方法是(磷酸鈣沉淀法和電穿孔法)。

6.攪拌的作用在于使罐內(nèi)物料充分混合，有利于營(yíng)養(yǎng)物和氧的傳遞，但在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中攪拌速度一般控制在（100）r/min.7.將蛋白質(zhì)分子與其它相對(duì)分子質(zhì)量較小的雜質(zhì)分開最常用的方法是（透析）。灌流式操作 ： 當(dāng)細(xì)胞和培養(yǎng)基一起加入反應(yīng)器后，在細(xì)胞增長(zhǎng)和產(chǎn)物形成過程中，不斷地將部分條件培養(yǎng)基取出，同時(shí)不斷地補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)基。

分批式操作:將細(xì)胞和培養(yǎng)基一次性加入反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞不斷增長(zhǎng)，產(chǎn)物不斷形成，最后將條件培養(yǎng)基取出，培養(yǎng)結(jié)束的方法。半連續(xù)操作 細(xì)胞工程

組織培養(yǎng)： 將組織或細(xì)胞從機(jī)體取出，在體外模擬機(jī)體體內(nèi)的生理?xiàng)l件進(jìn)行培養(yǎng)，使之生存和生長(zhǎng)。

貼壁細(xì)胞: 生長(zhǎng)須有貼附的支持物表面，自身分泌或培養(yǎng)基中提供的貼附因子才能在該表面上生長(zhǎng)。兩種形態(tài)：成纖維細(xì)胞型和上皮細(xì)胞型 1． 植物細(xì)胞及微生物相比動(dòng)物細(xì)胞有那些生理特點(diǎn)？

2． 無血清培養(yǎng)基有何優(yōu)點(diǎn)？（1）提高重復(fù)性（2）減少微生物污染（3）供應(yīng)充足穩(wěn)定（4）產(chǎn)品易純化（5）避免血清因素對(duì)細(xì)胞的毒性（6）減少血清中蛋白對(duì)生物測(cè)定的干擾 3.包埋或微囊培養(yǎng)法有何優(yōu)點(diǎn)？（1）細(xì)胞可獲得保護(hù)，避免了剪切力的損害。（2）可以獲得較高的細(xì)胞密度。（3）當(dāng)控制微囊膜的孔徑后，可使產(chǎn)品濃縮在微囊中，從而有利于下游產(chǎn)品的純化。（4）可采用多種生物反應(yīng)器進(jìn)行在規(guī)模培養(yǎng)。

4．理想的動(dòng)物細(xì)胞生物反應(yīng)器必須具備哪些基本要求？（1）制造生物反應(yīng)器所用材料必須無毒。（2）生物反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)必須使之具有良好的傳質(zhì)、傳熱和混合的性能；（3）密封性能良好；（4）對(duì)培養(yǎng)環(huán)境中多種物理化學(xué)參數(shù)能自動(dòng)檢測(cè)和調(diào)節(jié)控制，控制的精度高，而且能保持環(huán)境質(zhì)量的均一；（5）可長(zhǎng)期連續(xù)運(yùn)轉(zhuǎn)；（6）容器加工制造時(shí)要求內(nèi)表面光滑，無死角，以減少細(xì)胞或微生物的沉積；（7）拆裝、連接和清潔方便，能耐高壓蒸汽消毒，便于維修；（8）設(shè)備成本盡可能低；

5．灌流式操作有何優(yōu)點(diǎn)？（1）細(xì)胞處于較穩(wěn)定的良好環(huán)境，營(yíng)養(yǎng)條件較好，有害代謝廢物濃度較低。（2）可極大地提高細(xì)胞密度。（3）產(chǎn)品在罐內(nèi)停留時(shí)間短，可及時(shí)收留在低溫下保存，有利于產(chǎn)品質(zhì)量。（4）培養(yǎng)基的比消耗率低，加之產(chǎn)品質(zhì)量的提高，生產(chǎn)成本明顯降低。

1．Ig分子是由 二硫鍵 連接起來的 4條（兩對(duì)）條多肽鏈構(gòu)成的。2．單克隆抗體制備時(shí)對(duì)動(dòng)物的免疫方法分為 體內(nèi)免疫 和 體外免疫。3．一般來說PEG的 相對(duì)分子質(zhì)量 和 濃度 越大，細(xì)胞的融合率越高。

1.Ig分子的抗原結(jié)合部位是由（VL和VH的CDR區(qū)）共同構(gòu)成。

2.制備單克隆抗體時(shí)一般采用與（骨髓瘤細(xì)胞）供體同一品系的動(dòng)物進(jìn)行免疫。3.生物藥物檢驗(yàn)要求（理化指標(biāo)和生物活性指標(biāo)缺一不可）。4.下列不屬于基因產(chǎn)品液態(tài)保存的方法是（低濃度保存）

5.目前預(yù)防乙型肝炎使用的生物制品屬于（疫苗）。單克隆抗體 由單細(xì)胞經(jīng)分裂增殖而形成細(xì)胞群，即單克隆。單克隆細(xì)胞將合成針對(duì)一種抗原決定簇的抗體，稱為單克隆抗體。多克隆抗體: 病原微生物含有多種抗原決定簇的抗原物質(zhì)，因此這些抗體制劑也是多種抗體的混合物，故稱多克隆抗體。

抗體: 是指能與相應(yīng)抗原特異性結(jié)合具有免疫功能的球蛋白。

免疫球蛋白: 將具有抗體活性及化學(xué)結(jié)構(gòu)與抗體相似的球蛋白統(tǒng)稱為免疫球蛋白

改形抗體 :Ig 分子中參與構(gòu)成抗原結(jié)合部位的區(qū)域是H和L鏈V區(qū)中的互補(bǔ)決定區(qū)（CDR區(qū)），而不是整個(gè)可變區(qū)。H和L鏈各有三個(gè)CDR，其它部分稱框架區(qū)。用鼠源單抗的CDR序列替換人Ig 分子中CDR序列，則可使人的Ig 分子具有鼠源單抗的抗原結(jié)合特異性?？上庖咴葱?。

1．與動(dòng)物細(xì)胞和微生物細(xì)胞相比，植物細(xì)胞具有 細(xì)胞壁、液泡 和 質(zhì)體。2．植物細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)分為 靜止 和 振蕩。

3．植物組織和細(xì)胞培養(yǎng)物的生長(zhǎng)主要取決于 生長(zhǎng)素和 分裂素 的比例。4．大多數(shù)植物細(xì)胞的培養(yǎng)基中的氮都是以 NH4 和 NO3 形式提供的。

5．常用的對(duì)植物組織培養(yǎng)的表面滅菌劑是 次氯酸鈣、次氯酸鈉 和 氯化汞。

6．植物培養(yǎng)細(xì)胞重量的增加主要取決于對(duì)數(shù)期，而次級(jí)代謝產(chǎn)物的累積則主要在穩(wěn)定期。

次級(jí)代謝作用 :由特異蛋白質(zhì)調(diào)控產(chǎn)生的內(nèi)源化合物的合成,代謝及分解作用的綜合過程.次級(jí)代謝產(chǎn)物 除了核酸、核苷、核苷酸、氨基酸、蛋白質(zhì)及糖類以外，具有如下特征的成分成為次級(jí)代謝產(chǎn)物：有明顯的分類學(xué)區(qū)域界限；其合成需在一定的條件下才能發(fā)生；缺乏明確的生理功能；是生命的多余成分。

繼代培養(yǎng): 由最初的外植體上切下的新增殖的組織，培養(yǎng)一代稱為“第一代培養(yǎng)”，連續(xù)多代的培養(yǎng)就稱為繼代培養(yǎng)。

植物激素: 是植物代謝過程中形成的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，在極低濃度（小于1微摩時(shí)即能調(diào)節(jié)植物的生育過程，并能從合成部位轉(zhuǎn)運(yùn)到作用部位而發(fā)揮作用。

固體培養(yǎng): 是在培養(yǎng)基中加入一定量的凝固劑，經(jīng)加熱溶解后，分別裝入培養(yǎng)的容器，冷卻后凝結(jié)成固體培養(yǎng)基。

1． 影響植物次級(jí)代謝產(chǎn)物產(chǎn)生和累積的主要因素：（1）、生物條件：外植體、季節(jié)、休眠、分化等；（2）、物理?xiàng)l件：溫度、光（光照時(shí)間、光強(qiáng)、光質(zhì)）、通氣（氧氣）、酸度和滲透壓；（3）、化學(xué)條件：無機(jī)鹽、碳源、物質(zhì)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、維生素、氨基酸、核酸、抗生素、天然物質(zhì)和前體等；（4）、工業(yè)培養(yǎng)條件：培養(yǎng)罐類型、通氣、攪拌和培養(yǎng)方式。

2.各種植物細(xì)胞培養(yǎng)的生物反應(yīng)器的特點(diǎn):（1）機(jī)械攪拌式生物反應(yīng)器；優(yōu)點(diǎn)是：反應(yīng)器內(nèi)的溫度、PH值、溶氧及營(yíng)養(yǎng)物濃度較其他反應(yīng)器更易控制；缺點(diǎn)是：攪拌產(chǎn)生的剪切力對(duì)細(xì)胞造成傷害、抑制植物細(xì)胞生長(zhǎng)和次級(jí)代謝物產(chǎn)生。（2）鼓泡塔生物反應(yīng)器；優(yōu)點(diǎn)：操作不易染菌，提供了較高的熱量和質(zhì)量傳遞，放大相對(duì)容易；缺點(diǎn)是：流體流動(dòng)形式難以確定，混合不均，缺乏有關(guān)反應(yīng)器內(nèi)的非牛頓流體的流動(dòng)與傳遞的數(shù)據(jù)。（3）氣升式生物反應(yīng)器；優(yōu)點(diǎn)：在低剪切力下達(dá)到較好的混合和較高的氧傳遞效果，運(yùn)動(dòng)部件不易染菌，操作費(fèi)用低；缺點(diǎn)：高密度培養(yǎng)時(shí)混合不夠均勻；（4）轉(zhuǎn)鼓式生物反應(yīng)器；優(yōu)點(diǎn)：在高密度培養(yǎng)時(shí)有較高的氧傳遞效率，缺點(diǎn)：難于大規(guī)模操作，放大困難。（5）固定化細(xì)胞生物反應(yīng)器；優(yōu)點(diǎn)：在一定程度上克服了植物細(xì)胞遺傳和生理特性的不穩(wěn)定，細(xì)胞大小的不一致性、高產(chǎn)細(xì)胞系的低產(chǎn)率等植物細(xì)胞培養(yǎng)中的突出難題，提高產(chǎn)物的產(chǎn)率。缺點(diǎn)：固定化細(xì)胞培養(yǎng)的先決條件是細(xì)胞代謝產(chǎn)物必須分泌到胞外，3.植物組織的固體培養(yǎng)有何缺點(diǎn)？（1）外植體或愈傷組織僅有一部分與培養(yǎng)基接觸，造成培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的濃度差，導(dǎo)致生長(zhǎng)的不平衡；（2）外植體的基部插入培養(yǎng)基中，因此該處呈現(xiàn)氣體交換不暢，阻礙了組織呼吸作用的正常進(jìn)行，同時(shí)也堆積生長(zhǎng)過程中排出的有害物質(zhì)。（3）容易出現(xiàn)極化現(xiàn)象，導(dǎo)致細(xì)胞群體的不均勻。（4）在培養(yǎng)過程中需要檢測(cè)的一些生理特殊化指標(biāo)不方便。

4．植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的主要方法及其特點(diǎn)是什么？（1）成批培養(yǎng)法: 最適于植物細(xì)胞培養(yǎng)的是氣升式反應(yīng)器。兩步培養(yǎng)法，使用兩個(gè)反應(yīng)器第一個(gè)用于細(xì)胞生物量的累積，第二個(gè)用于次級(jí)代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)。（2）半連續(xù)培養(yǎng)法:在反應(yīng)器中投料和接種培養(yǎng)一段時(shí)間后，將部分培養(yǎng)液和新鮮培養(yǎng)液進(jìn)行交換的培養(yǎng)方法。是一種具有定時(shí)進(jìn)出裝置的成批培養(yǎng)系統(tǒng)。（3）連續(xù)培養(yǎng)法 :生產(chǎn)能力較高，但技術(shù)條件要求苛刻。（4）固定化培養(yǎng)法: 固定化的優(yōu)點(diǎn)是細(xì)胞位置固定，易于獲得高密度細(xì)胞群體和維持細(xì)胞間的物理化學(xué)梯度，利于細(xì)胞組織化，易于控制培養(yǎng)條件及獲得次級(jí)代謝產(chǎn)物。

方法處理，使酶變成不易隨水流失即運(yùn)動(dòng)受到限制，而又能發(fā)揮催化作用的酶制劑。模擬酶 根據(jù)酶的作用原理，用各種方法人為制造的具有酶性質(zhì)的催化劑。

酶化學(xué)修飾: 通過主鏈有切割、剪切和側(cè)鏈基團(tuán)有化學(xué)修飾對(duì)酶蛋白進(jìn)行分子改造，以改變其理化性質(zhì)和生物活性。這種應(yīng)用化學(xué)方法對(duì)酶分子施行種種“手術(shù)”的技術(shù)稱為酶分子的化學(xué)修飾。

固定化細(xì)胞: 將細(xì)胞限制或定位于特定空間位置的方法稱為細(xì)胞固定化技術(shù)。被限制或定位于特定空間位置的細(xì)胞稱為固定化細(xì)胞。

1．作為一個(gè)優(yōu)良的產(chǎn)酶菌種，下列描述不正確的是？（繁殖快、產(chǎn)酶高，最好是產(chǎn)生胞內(nèi)酶的菌株）B.不是致病菌，也不產(chǎn)生有毒物質(zhì)C.產(chǎn)酶性能穩(wěn)定、不易變異退化D.所需原料穩(wěn)定，來源廣泛，價(jià)格低廉 2．下列描述不正確的是？（酶經(jīng)固定化后，酶活力一般都升高）A.酶經(jīng)固定化后，酶活性中心的主要氨基酸與載體發(fā)生了部分結(jié)合C.酶經(jīng)固定化后，酶的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化D.酶經(jīng)固定化后，酶與底物結(jié)合時(shí)存在空間位阻效應(yīng)

3．酶經(jīng)固定化后，其最適pH值一般都（升高或下降）。

4．抗體酶是具有催化活性的（免疫球蛋白）。

5．有關(guān)酶固定化技術(shù)缺點(diǎn)的描述，下列說法不正確的是（適合于多酶反應(yīng)，特別是有輔助因子參與的反應(yīng)）。A.酶固定化后，其活力有所下降B.只能用于可溶性小分子底物C.胞內(nèi)酶需分離純化過程

6．載體結(jié)合法是酶和細(xì)胞固定化的主要方法之一，下列那種方法不屬于載體結(jié)合固定化方法（交聯(lián)法）。

7．核酶是具有催化活性的（核糖核酸）。

1．作為一個(gè)優(yōu)良的產(chǎn)酶菌種，應(yīng)具備條件有那些？(1)繁殖快、產(chǎn)酶高，酶的性質(zhì)應(yīng)符合使用要求，而且最好是產(chǎn)生胞外酶的菌株。(2)不是致病菌，在系統(tǒng)發(fā)育上與病原菌無關(guān)，也不產(chǎn)生有毒物質(zhì)。(3)產(chǎn)酶性能穩(wěn)定、不易變異退化，不易感染噬菌體。(4)所需原料穩(wěn)定，來源廣泛，價(jià)格低廉。發(fā)酵周期短，易于培養(yǎng)。

2．試比較物理吸附法和共價(jià)結(jié)合法兩種酶固定方法的優(yōu)缺點(diǎn)。物理吸附法 優(yōu)點(diǎn)：制作條件溫和、簡(jiǎn)便，成本低，載體再生、可反復(fù)使用。缺點(diǎn)：結(jié)合力弱，對(duì)pH、離子強(qiáng)度、溫度等因素敏感，酶易脫落。共價(jià)結(jié)合法 優(yōu)點(diǎn)：酶與載體結(jié)合力強(qiáng)，穩(wěn)定性好。缺點(diǎn)：條件激烈，易引起酶失活；成本高。

3．固定化酶和固定化細(xì)胞的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)各是什么？固定化酶的特點(diǎn)： 具有生物催化劑的功能，又有固相催化劑的功能。主要優(yōu)點(diǎn)如下：①可多次使用②反應(yīng)后，酶底物產(chǎn)物易分開，產(chǎn)物中無殘留酶，易純化，產(chǎn)品質(zhì)量高。③反應(yīng)條件易控制。④酶的利用效率高。⑤比水溶性酶更適合于多酶反應(yīng)。

4，為什么要對(duì)酶進(jìn)行化學(xué)修飾？（1）提高生物活性；（2）增強(qiáng)在不良環(huán)境中的穩(wěn)定性；（3）針對(duì)異體反應(yīng)，降低生物識(shí)別能力

1．Klenow酶的活性有：5’ → 3’ 聚合酶活性，3’ → 5’ 外切酶活性。

2．克隆抗生素生物合成基因的策略有：阻斷變株法，突變克隆法，在標(biāo)準(zhǔn)宿主菌中克隆檢測(cè)單基因產(chǎn)物，直接克隆法，克隆抗性基因法，寡核苷酸探針法，同源基因雜交法。3．人工化學(xué)合成DNA新形成的核苷酸鏈的合成方向是3’ → 5’，合成的DNA 5’末端是-OH，3’ 末端是-OH。

4．一個(gè)理想的載體應(yīng)具備的條件是： 至少有一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，有克隆位點(diǎn)，具備轉(zhuǎn)化的功能，遺傳標(biāo)記基因，具有較高的載裝能力。

5．進(jìn)行PCR擴(kuò)增DNA時(shí)，反應(yīng)體系應(yīng)加入模板DNA，Taq酶，一對(duì)引物，dNTP或緩沖液。

1．基因工程的單元操作順序是（酶切，連接，轉(zhuǎn)化，篩選，驗(yàn)證）

2．下列五個(gè) DNA 片段中含有回文結(jié)構(gòu)的是（GAAACTGCAGTTTC, GAAACTGCAGAAAG）3．T 4-DNA 連接酶是通過形成磷酸二酯鍵將兩段 DNA 片段連接在一起，其底物的關(guān)鍵基團(tuán)是（3'-OH 和 5'-P）

4．l-DNA 體外包裝的上下限是天然l-DNA 長(zhǎng)度的（75-105 %）

5．下列各常用載體的裝載量排列順序，正確的是（Cosmid > l-DNA > Plasmid）

6．某一重組質(zhì)粒（7.5 kb）的載體部分有2個(gè)SmaI酶切位點(diǎn)。用SmaI酶切后凝膠電泳上出現(xiàn)4條長(zhǎng)度不同的條帶，其長(zhǎng)度總和與已知數(shù)據(jù)吻合，該重組質(zhì)粒中插入的外源DNA片段上的SmaI酶切位點(diǎn)共有（2個(gè)）

7．若某質(zhì)粒帶有 lacZ 標(biāo)記基因，那么與之相匹配的篩選方法是在篩選培養(yǎng)基中加入(5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷（X-gal），異丙基巰基-b-半乳糖苷（IPTG）)8．分子雜交的化學(xué)原理是形成（氫鍵）

9．促紅細(xì)胞生長(zhǎng)素（EPO）基因能在大腸桿菌中表達(dá)，但卻不能用大腸桿菌的基因工程菌生產(chǎn)人的促紅細(xì)胞生長(zhǎng)素，這是因?yàn)椋ù竽c桿菌不能使人的促紅細(xì)胞生長(zhǎng)素糖基化）10．鳥槍法克隆目的基因的戰(zhàn)略適用于（原核細(xì)菌）11．cDNA第一鏈合成所需的引物是（Poly T）12．cDNA法獲得目的基因的優(yōu)點(diǎn)是（不含內(nèi)含子）

13．人工合成 DNA 的單元操作包括（．I + II + III + IV）I 去保護(hù) II 偶聯(lián) III 封端 IV 氧化

14．為了減輕工程菌的代謝負(fù)荷，提高外源基因的表達(dá)水平，可以采取的措施有（將宿主細(xì)胞生長(zhǎng)和外源基因的表達(dá)分成兩個(gè)階段。當(dāng)宿主細(xì)胞快速生長(zhǎng)時(shí)抑制重組質(zhì)粒的復(fù)制）15．菌體生長(zhǎng)所需能量（大于）菌體有氧代謝所能提供的能量時(shí)，菌體往往會(huì)產(chǎn)生代謝副產(chǎn)物乙酸。

1．基因工程菌的遺傳不穩(wěn)定性的兩種主要表現(xiàn)形式是什么？基因工程菌的遺傳不穩(wěn)定性的主要機(jī)制是什么？基因工程菌的遺傳不穩(wěn)定性主要表現(xiàn)在重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性，這種不穩(wěn)定性具有下列兩種表現(xiàn)形式：1．結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性：重組 DNA 分子上某一區(qū)域發(fā)生缺失、重排、修飾，導(dǎo)致其表觀生物學(xué)功能的喪失2．分配不穩(wěn)定性：整個(gè)重組 DNA 分子從受體細(xì)胞中逃逸?；蚬こ叹倪z傳不穩(wěn)定性的的產(chǎn)生機(jī)制1．受體細(xì)胞中的限制修飾系統(tǒng)對(duì)外源重組 DNA 分子的降解2．外源基因的高效表達(dá)嚴(yán)重干擾受體細(xì)胞正常的生長(zhǎng)代謝3．重組質(zhì)粒在受體細(xì)胞分裂時(shí)的不均勻分配，這是重組質(zhì)粒逃逸的基本原因4．受體細(xì)胞中內(nèi)源性的轉(zhuǎn)座元件促進(jìn)重組分子的缺失重排

2．在人胰島素AB鏈分別表達(dá)法中，為何將AB鏈編碼序列與b-半乳糖苷酶基因融合？小分子蛋白在大腸桿菌中表達(dá)后不穩(wěn)定，容易被細(xì)胞內(nèi)蛋白酶降解失活。表達(dá)融合蛋白的優(yōu)點(diǎn)是基因操作簡(jiǎn)便；在菌體內(nèi)比較穩(wěn)定，不易被細(xì)菌酶類所降解，容易實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)。人胰島素AB鏈分別表達(dá)法中，將A、B鏈編碼序列與b-半乳糖苷酶基因融合，分別表達(dá)出融合蛋白，使表達(dá)的蛋白分子量足夠大，避免被蛋白水解酶分解，提高其穩(wěn)定性及表達(dá)率。3．動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的方法有哪些？各自的特點(diǎn)是什么？1．懸浮培養(yǎng)：懸浮培養(yǎng)即讓細(xì)胞自由地懸浮于培養(yǎng)基內(nèi)生長(zhǎng)增殖。它適用于一切種類的非貼壁依賴性細(xì)胞（懸浮細(xì)胞），也適用于兼性貼壁細(xì)胞。該培養(yǎng)方法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便，培養(yǎng)條件比較均一，傳質(zhì)和傳氧較好，容易擴(kuò)大培養(yǎng)規(guī)模，在培養(yǎng)設(shè)備的設(shè)計(jì)和實(shí)際操作中可借鑒許多有關(guān)細(xì)菌發(fā)酵的經(jīng)驗(yàn)。不足之處是由于細(xì)胞體積較小，較難采用灌流培養(yǎng)（perfusion culture)，因此細(xì)胞密度一般較低。2．貼壁培養(yǎng)：貼壁培養(yǎng)是必須讓細(xì)胞貼附在某種基質(zhì)上生長(zhǎng)繁殖的培養(yǎng)方法。它適用于一切貼附依賴性細(xì)胞（貼壁細(xì)胞），也適用于兼性貼壁細(xì)胞。該方法的優(yōu)缺點(diǎn)與懸浮培養(yǎng)正好相反，優(yōu)點(diǎn)是適用的細(xì)胞種類廣（因?yàn)樯a(chǎn)中所使用的細(xì)胞絕大多數(shù)是貼壁細(xì)胞），較容易采用灌流培養(yǎng)的方式使細(xì)胞達(dá)到高密度；不足之處是操作比較麻煩，需要合適的貼附材料和足夠的面積，培養(yǎng)條件不易均一，傳質(zhì)和傳氧較差。3．貼壁—懸浮培養(yǎng)：微載體培養(yǎng)既可創(chuàng)造相當(dāng)大的貼附面積供細(xì)胞貼附生長(zhǎng)增殖，滿足了絕大多數(shù)細(xì)胞的基本要求，又由于載體的體積很小，比重較輕，在輕度攪拌下即可攜帶細(xì)胞自由地懸浮在培養(yǎng)基內(nèi)，充分發(fā)揮了懸浮培養(yǎng)的一切優(yōu)點(diǎn)。

4.闡述基因工程藥物研制有那些主要過程：基因工程藥物的生產(chǎn)必須首先獲得目的基因，然后用限制性內(nèi)切酶和連接酶將所需目的基因插入適當(dāng)?shù)妮d體質(zhì)?；蚴删w中并轉(zhuǎn)入大腸桿菌或其他宿主菌（細(xì)胞），以便大量復(fù)制目的基因。對(duì)目的基因要進(jìn)行限制性內(nèi)切酶和核苷酸序列分析。目的基因獲得后，最重要的就是使目的基因表達(dá)。基因的表達(dá)系統(tǒng)有原核生物系統(tǒng)和真核生物化的難易。將目的基因與表達(dá)載體重組，轉(zhuǎn)入合適表達(dá)系統(tǒng)，獲得穩(wěn)定高效表達(dá)的基因工程菌（細(xì)胞）。建立適于目的基因高效表達(dá)的發(fā)酵工藝，以便獲得較高產(chǎn)量的目的基因表達(dá)產(chǎn)物。建立起一系列相應(yīng)的分離純化、質(zhì)量控制、產(chǎn)品保存等技術(shù)。

5．闡述鼠源性單克隆抗體改造后的小分子抗體類型：（1）人－鼠嵌合抗體：將鼠MAb的可變區(qū)和人抗體的恒定區(qū)組成嵌合抗體由于這兩部分在空間結(jié)構(gòu)上相對(duì)獨(dú)立，其獨(dú)特的抗體親和力保持得很好，但因鼠單抗可變區(qū)的存在，應(yīng)用時(shí)仍有較強(qiáng)的排斥反應(yīng)。（2）改形抗體：在嵌合抗體的基礎(chǔ)上進(jìn)一步將鼠MAb可變區(qū)中相對(duì)保守的FR替換成人的FR，保留與抗原結(jié)合的CDR部位（3）Fab抗體：Fab段由重鏈V區(qū)及CH1功能區(qū)與整個(gè)輕鏈以二硫鍵形式連接而成，主要發(fā)揮抗體的抗原結(jié)合功能。Fab抗體只有完整IgG的1/3。（4）單鏈抗體：?jiǎn)捂溈贵w(Single chain Fv，scFv)是由一段彈性連接肽(Linker)把抗體可變區(qū)重鏈(VH)與輕鏈(VL)相連而成，是具有親代抗體全部抗原結(jié)合特異性的最小功能結(jié)構(gòu)單位。（5）單域抗體：只含V區(qū)基因片段的小分子抗體，即只有VH或 VL一個(gè)功能結(jié)構(gòu)域，也能保持原單克隆抗體的特異性。這種小分子的抗體片段就稱為單域或單區(qū)抗體，其分子量?jī)H為整個(gè)Ig分子的1／12。（6）分子識(shí)別單位：只含有一個(gè)CDR多肽的抗體。

第二篇：生物技術(shù)制藥課后習(xí)題

1.生物技術(shù)制藥分為哪些類型？ 生物技術(shù)制藥分為四大類：

（1）應(yīng)用重組DNA技術(shù)(包 括基因工程技術(shù)、蛋白質(zhì)工程技術(shù))制造的基因重組多肽，蛋白質(zhì)類治療劑。

（2）基因藥物，如基因治療劑，基因疫苗，反義藥物和核酶等（3）來自動(dòng)物、植物和微生物的天然生物藥物（4）合成與部分合成的生物藥物 2．生物技術(shù)制藥具有什么特征？（1）分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜（2）具有種屬特異性（3）治療針對(duì)性強(qiáng)，療效高（4）穩(wěn)定性差（5）基因穩(wěn)定性（6）免疫原性（7）體內(nèi)的半衰期短（8）受體效應(yīng)（9）多效性（10）檢驗(yàn)的特殊性

3.生物技術(shù)制藥中有哪些應(yīng)用？ 應(yīng)用主要有：

（1）基因工程制藥：包括基因工程藥物品種的開發(fā)，基因工程疫苗，基因工程抗體，基因診斷與基因治療，應(yīng)用基因工程技

術(shù)建立新藥的篩選模型，應(yīng)用基因工程技術(shù)改良菌種，產(chǎn)生新的微生物藥物，基因工程技術(shù)在改進(jìn)藥物生產(chǎn)工藝中的應(yīng)用，利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物生產(chǎn)蛋白質(zhì)類藥物

（2）細(xì)胞工程制藥：包括單克隆抗體，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)，植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物（3）酶工程制藥（4）發(fā)酵工程制藥

4.基因工程藥物制造的主要程序有哪些？

基因工程藥物制造的主要步驟有：目的基因的克隆，構(gòu)造DNA重組體，構(gòu)造工程菌，目的基因的表達(dá)，外源基因表達(dá)產(chǎn)物的分離純化產(chǎn)品的檢驗(yàn)

5.影響目的的基因在大腸桿菌中表達(dá)的因素有哪些？（1）外源基因的計(jì)量

（2）外源基因的表達(dá)效率：a、啟動(dòng)子的強(qiáng)弱

b、核糖體的結(jié)合位點(diǎn)

c、SD序列和起始密碼的間距

d、密碼子組成（3）表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性（4）細(xì)胞的代謝付荷（5）工程菌的培養(yǎng)條件

6.質(zhì)粒不穩(wěn)定分為哪兩類，如何解決質(zhì)粒不穩(wěn)定性？

質(zhì)粒不穩(wěn)定分為分裂分為分裂不穩(wěn)定和結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定。質(zhì)粒的分裂不穩(wěn)定是指工程菌分裂時(shí)出現(xiàn)一定比例不含質(zhì)粒的子代菌的現(xiàn)象；質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定是DNA從質(zhì)粒上丟失或堿基重排，缺失所致工程菌性能 的改變。

提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法如下：（1）選擇合適的宿主細(xì)菌（2）選擇合適的載體（3）選擇壓力（4）分階段控制培養(yǎng)（5）控制培養(yǎng)條件（6）固定化

7.影響基因工程菌發(fā)酵的因素有哪些？如何控制發(fā)酵的各種參數(shù)？ 影響因素：（1）培養(yǎng)基（2）接種量（3）溫度（4）溶解氧（5）誘導(dǎo)時(shí)機(jī)的影響（6）誘導(dǎo)表達(dá)程序（7）PH值

8.什么是高密度發(fā)酵？影響高密度發(fā)酵的因素有哪些？可采取哪些方法來實(shí)現(xiàn)高密度發(fā)酵？

高密度發(fā)酵：是指培養(yǎng)液中工程菌的菌體濃度在50gDCW/L以上，理論上的最高值可達(dá)200gDCW/L 影響因素：（1）培養(yǎng)基

（2）溶氧濃度

（3）PH(4)溫度

（5）

代謝副產(chǎn)物

實(shí)現(xiàn)高密度發(fā)酵的方法：

（1）改進(jìn)發(fā)酵條件：a、培養(yǎng)基 b、建立流加式培養(yǎng)基 c、提高供養(yǎng)能力

（2）構(gòu)建出產(chǎn)乙酸能力低的工程菌宿主菌：a、阻斷乙酸產(chǎn)生的主要途徑 b、對(duì)碳代謝流進(jìn)行分流 c、限制進(jìn)入糖酵解途徑的碳代謝流 d、引入血紅蛋白基因

（3）構(gòu)建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌

9.分離純化常用的色譜分離方法有哪些?它們的原理是什么? 方法有離子交換色譜、疏水色譜、反相色譜、親和色譜、凝膠過濾色譜及高壓液相色譜。

（1）離子交換色譜IEC：是以離子交換劑為固定相，依據(jù)流動(dòng)相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進(jìn)行可逆交換時(shí)的結(jié)合力大小的差別而進(jìn)行分離的一種層析方法。

（2）疏水層析HIC：是利用蛋白質(zhì)表面的疏水區(qū)與固定相上疏水性基團(tuán)相互作用力的差異，對(duì)蛋白質(zhì)組進(jìn)行分離的層析方法。（3）親和層析AC：是利用固定化配體與目的蛋白質(zhì)之間的非常特異的生物親和力進(jìn)行吸附，這種結(jié)合既是特異的，又是可逆的，改變條件可以使這種結(jié)合解除。

（4）凝膠過濾層析：以多孔性凝膠填料為固定相，按分子大小對(duì)溶液中各組分進(jìn)行分離的液相層析方法。

10.對(duì)由基因重組技術(shù)所獲得的蛋白質(zhì)藥物進(jìn)行鑒定時(shí)，常做哪些項(xiàng)

目分析？

基因工程藥物質(zhì)量控制主要包括以下幾點(diǎn)：產(chǎn)品的鑒別，純度，活性，安全性，穩(wěn)定性和一致性 項(xiàng)目分析主要有：（1）生物活性測(cè)定（2）理化性質(zhì)鑒定（3）蛋白質(zhì)含量鑒定（4）蛋白質(zhì)純度分析（5）雜志檢測(cè)（6）穩(wěn)定性考察（7）產(chǎn)品一致性的保證

11.離體培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞分為哪些類型? 分為三類：

（1）貼壁細(xì)胞：細(xì)胞生長(zhǎng)必須有可以貼附的支持物表面，細(xì)胞依靠自身分泌的培養(yǎng)基中提供的貼附因子才能在該表面上生長(zhǎng)增殖。

（2）懸浮細(xì)胞：細(xì)胞的生長(zhǎng)不依賴支持物表面，可在培養(yǎng)液中懸浮狀態(tài)生長(zhǎng)

（3）兼性貼壁細(xì)胞：既可 貼附于支持物表面生長(zhǎng)，又在懸浮生長(zhǎng)。12.生產(chǎn)用的動(dòng)物細(xì)胞有哪些種類？它們各有什么特點(diǎn)？ 13.常用的培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)基的種類有哪些？（1）天然培養(yǎng)基

（2）合成培養(yǎng)基（3）無血清培養(yǎng)基

14.如何進(jìn)行動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)？ 大規(guī)模培養(yǎng)的方法：（1）懸浮細(xì)胞（2）貼壁細(xì)胞

（3）貼壁—懸浮細(xì)胞：a、微載體培養(yǎng) b、包埋和微囊培養(yǎng) c、結(jié)團(tuán)培養(yǎng)

大規(guī)模培養(yǎng)的操作方式：（1）分批式操作（2）半連續(xù)式操作（3）灌流式操作

15.動(dòng)物細(xì)胞生物反應(yīng)器必須具備哪些基本要求？有哪些類型？特定是什么？

動(dòng)物細(xì)胞反應(yīng)器具備的基本要求：

（1）制造生物反應(yīng)器所采用的一切材料，尤其是與培養(yǎng)基，細(xì)胞直接接觸的材料，對(duì)細(xì)胞必須是無毒性的。

（2）生物反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)必須使之具有良好的傳質(zhì)、傳熱和混合的性能

（3）密封性良好，可避免一切外采的不需要的微生物污染。（4）對(duì)培養(yǎng)基環(huán)境中多種物理化學(xué)參數(shù)能自動(dòng)檢測(cè)和調(diào)節(jié)控制，控制的精度高，而且能保持環(huán)境質(zhì)量的均一。

（5）可長(zhǎng)期連續(xù)運(yùn)轉(zhuǎn)，這對(duì)于培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的生物反應(yīng)器顯得尤其重要。

（6）容器加工制造時(shí)要求內(nèi)面光滑，無死角，以減少細(xì)胞或微生物的沉積。

（7）拆裝，連結(jié)和清潔方便，能耐高壓蒸汽消毒，便于操作維修（8）設(shè)備成本盡可能低。反應(yīng)器類型及特點(diǎn)：

（1）攪拌罐式生物反應(yīng)器：主要用于是懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，微載體培養(yǎng)，微囊和巨載體培養(yǎng)以及結(jié)團(tuán)培養(yǎng)

（2）氣升式生物反應(yīng)器：氣體通過裝在罐底的噴管進(jìn)入 反應(yīng)器的導(dǎo)流管，致使該部液體的密度小于導(dǎo)流管外部的液體形成循環(huán)流。（3）中空纖維式生物反應(yīng)器：占地空間小，產(chǎn)品產(chǎn)量、質(zhì)量高，生產(chǎn)成本低，不能重復(fù)使用，不能耐高壓蒸汽滅菌，需用環(huán)氧乙烷或其它消毒劑滅菌，難以取樣檢測(cè)。

（4）透析袋或膜式生物反應(yīng)器：可使細(xì)胞達(dá)到高密度，又可隨意組合進(jìn)行操作，對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行濃縮純化。

（5）固定床或流化床生物反應(yīng)器：結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，裝填材料易得。16.動(dòng)物細(xì)胞制藥有哪些新進(jìn)展？

17.什么是單克隆抗體？單克隆抗體有哪些不足？

單克隆抗體：是針對(duì)一個(gè)抗原決定簇的抗體，又是單一的B淋巴細(xì)胞克隆產(chǎn)生的抗體。不足：

（1）單克隆抗體均是鼠源性抗體，應(yīng)用于人體內(nèi)可產(chǎn)生人抗鼠抗體，加速了排斥反應(yīng)，在人體內(nèi)半衰期只有5-6h，難以維持有效藥物作用靶組織時(shí)間。

（2）完整的抗體分子，即Ig的相對(duì)分子質(zhì)量過大，難以穿透實(shí)體腫瘤組織，達(dá)不到有效治療濃度。

18如何制備雜交瘤細(xì)胞？

將兩個(gè)細(xì)胞（例如 B淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞）通過誘導(dǎo)融合形成雜交細(xì)胞，具體操作時(shí)為了提高成功率會(huì)用多個(gè)細(xì)胞同時(shí)雜交，然后篩選出目的細(xì)胞，再進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)使其有絲分裂而增值，得到大量目的細(xì)胞（雜交瘤細(xì)胞）。

19．基因工程抗體有哪些類型？其特性和制備方法有什么不同？ 基因工程抗體主要包括嵌合抗體、人源化抗體、完全人源抗體、單鏈抗體、雙特異性抗體等。

（1）嵌合抗體 嵌合抗體（chimeric atibody）是最早制備成功的基因工程抗體。它是由鼠源性抗體的 V 區(qū)基因與人抗體的 C 區(qū)基因拼接為嵌合基因，然后插入載體，轉(zhuǎn)染骨髓瘤組織表達(dá)的抗體分子。因其減少了鼠源成分，從而降低了鼠源性抗體引起的不良反應(yīng)，并有助于提高療效。

（2）人源性抗體 是將人抗體的 CDR 代之以鼠源性單克隆抗體的 CDR，由此形成的抗體，鼠源性只占極少，稱為人源化抗體。

（3）完全人源化抗體 采用基因敲除術(shù)將小鼠 Ig 基因敲除，代之以人 Ig 基因，然后用 Ag 免疫小鼠，再經(jīng)雜交瘤技術(shù)即可產(chǎn)生大量完全人源化抗體。

（4）單鏈抗體 是將 Ig 的 H 鏈和 L 鏈的 V 區(qū)基因相連，轉(zhuǎn)染大腸桿菌表達(dá)的抗體分子，又稱單鏈 FV（single chain fragment of variable region,sFv）。SFv 穿透力強(qiáng)，易于進(jìn)入局部組織發(fā)揮作用。

（5）雙特異性抗體 將識(shí)別效應(yīng)細(xì)胞的抗體和識(shí)別靶細(xì)胞的抗體聯(lián)結(jié)在一起，制成雙功能性抗體，稱為雙特異性抗體。如由識(shí)別腫瘤抗原的抗體和識(shí)別細(xì)胞毒性免疫效應(yīng)細(xì)胞（CTL 細(xì)胞、NK 細(xì)胞、LAK 細(xì)胞）表面分子的抗體（CD3 抗體或 CD16 抗體）制成的雙特異性抗體，有利于免疫效應(yīng)細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤作用。20.抗體治療藥物有哪些？

（1）放射性同位素標(biāo)記的抗體治療藥物（2）抗癌藥物偶聯(lián)的抗體藥物（3）毒素偶聯(lián)的抗體藥物 21.抗體診斷試劑有哪些類型？（1）血清學(xué)鑒定用的抗體試劑（2）免疫標(biāo)記用的抗體試劑（3）導(dǎo)向診斷藥物（4）CD單克隆抗體系列

22.單克隆抗體制備的基本原理與過程？有什么意義？

原理：

B淋巴細(xì)胞在抗原的刺激下，能夠分化、增殖形成具有針對(duì)這種抗原分泌特異性抗體的能力。B細(xì)胞的這種能力和量是有限的，不可能持續(xù)分化增殖下去，因此產(chǎn)生免疫球蛋白的能力也是極其微小的。將這種B細(xì)胞與非分泌型的骨髓瘤細(xì)胞融合形成雜交瘤細(xì)胞，再進(jìn)一步克隆化，這種克隆化的雜交瘤細(xì)胞是既具有瘤的無限生長(zhǎng)的能力，又具有產(chǎn)生特異性抗體的B淋巴細(xì)胞的能力，將這種克隆化的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)或注入小鼠體內(nèi)即可獲得大量的高效價(jià)、單一的特異性抗體。這種技術(shù)即稱為單克隆抗體技術(shù)。過程

1）免疫脾細(xì)胞的制備 制備單克隆抗體的動(dòng)物多采用純系 Balb/c小鼠。免疫的方法取決于所用抗原的性質(zhì)。免疫方法同一般血清的制備，也可采用脾內(nèi)直接免疫法。

2）骨髓瘤細(xì)胞的培養(yǎng)與篩選 在融合前，骨髓瘤細(xì)胞應(yīng)經(jīng)過含8-AG的培養(yǎng)基篩選，防止細(xì)胞發(fā)生突變恢復(fù)HGPRT的活性（恢復(fù)HGPRT的活性的細(xì)胞不能在含8-AG的培養(yǎng)基中存活）。骨髓瘤細(xì)胞用10%小牛血清的培養(yǎng)液在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，融合前24h換液一次，使骨髓瘤細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

3）細(xì)胞融合的關(guān)鍵: 1技術(shù)上的誤差常常導(dǎo)致融合的失敗。例如，供者淋巴細(xì)胞沒有查到免疫應(yīng)答。這必然要失敗的。

2融合試驗(yàn)最大的失敗原因是污染，融合成功的關(guān)鍵是提供一個(gè)干凈的環(huán)境，以及適宜的無菌操作技術(shù)。

4）陽性克隆的篩選 應(yīng)盡早進(jìn)行。通常在融合后10天作第一次檢測(cè)，過早容易出現(xiàn)假陽性。檢測(cè)方法應(yīng)靈敏、準(zhǔn)確、而且簡(jiǎn)便快速。具體應(yīng)用的方法應(yīng)根據(jù)抗原的性質(zhì)，以及所需單克隆抗體的功能進(jìn)行選擇。常用的方法有 RIA法、ELISA法和免疫熒光法等。其中ELISA法最簡(jiǎn)便，RIA法最準(zhǔn)確。陽性克隆的篩選應(yīng)進(jìn)行多次，均陽性時(shí)才確定為陽性克隆進(jìn)行擴(kuò)增。

5）克隆化 克隆化的目的是為了獲得單一細(xì)胞系的群體?？寺』瘧?yīng)盡早進(jìn)行并反復(fù)篩選。這是因?yàn)槌跗诘碾s交瘤細(xì)胞是不穩(wěn)定的，有丟失染色體的傾向。反復(fù)克隆化后可獲得穩(wěn)定的雜交瘤細(xì)胞株?？寺』姆椒ê芏啵畛Ｓ玫氖怯邢尴♂尫?。

（1）顯微操作法：在顯微鏡下取單細(xì)胞，然后進(jìn)行單細(xì)胞培養(yǎng)。這種方法操作復(fù)雜，效率低，故不常用。

（2）有限稀釋法：將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的雜交瘤細(xì)胞用培養(yǎng)液作一定的稀釋后，按每孔1個(gè)細(xì)胞接種在培養(yǎng)皿中，細(xì)胞增值后成為單克隆細(xì)胞系。第一次克隆化時(shí)加一定量的飼養(yǎng)細(xì)胞。由于第一次克隆化生長(zhǎng)的細(xì)胞不能保證單克隆化，所以為獲得穩(wěn)定的單克隆細(xì)胞株需經(jīng)2～3次的再克隆才成。應(yīng)該注意的是，每次克隆化過程中所有有意義的細(xì)胞都應(yīng)冷凍保存，以便重復(fù)檢查，避免丟失有意義的細(xì)胞。

（3）軟瓊脂法：將雜交瘤細(xì)胞稀釋到一定密度，然后與瓊脂混懸。在瓊脂中的細(xì)胞不能自由移動(dòng)，彼此互不相混，從而達(dá)到單細(xì)胞培養(yǎng)的目的。但此法不如有限稀釋法好。

（4）熒光激光細(xì)胞分類法：用抗原包被的熒光乳膠微球標(biāo)記雜交瘤細(xì)胞，然后根據(jù)抗原與雜交瘤細(xì)胞結(jié)合的特異性選出細(xì)胞，并進(jìn)行單細(xì)胞培養(yǎng)。

6）細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇

7）大規(guī)模單克隆抗體的制備

選出的陽性細(xì)胞株應(yīng)及早進(jìn)行抗體制備，因?yàn)槿诤霞?xì)胞隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，發(fā)生污染、染包體丟失和細(xì)胞死亡的機(jī)率增加?？贵w制備有兩種方法。一是增量培養(yǎng)法，即將雜交瘤細(xì)胞在體外培養(yǎng)，在培養(yǎng)液中分離單克隆抗體。該法需用特殊的儀器設(shè)備，一般應(yīng)用無血清培養(yǎng)基，以利于單克隆抗體的濃縮和純化。最普遍采用的是小鼠腹腔接種法。選用BALB/c小鼠或其親代小鼠，先用降植烷或液體石蠟行小鼠腹腔注射，一周后將雜交瘤細(xì)胞接種到小鼠腹腔中去。通常在接種一周后即有明顯的腹水產(chǎn)生，每只小鼠可收集5～10ml的腹水，有時(shí)甚至超過40ml。該法制備的腹水抗體含量高，每毫升可達(dá)數(shù)毫克甚至數(shù)十毫克水平。此外，腹水中的雜蛋白也較少，便于抗體的純化。意義：

用于以下各種生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)并具有醫(yī)用價(jià)值（1）沉淀反應(yīng)：Precipitation reaction

（2）凝集實(shí)驗(yàn)：haemaglutination（3）放射免疫學(xué)方法檢測(cè)免疫復(fù)合物

（4）流式細(xì)胞儀：用于細(xì)胞的分型和細(xì)胞分離。（5）ELISA 等免疫學(xué)檢測(cè)

（6）BIAcore biosensor:檢測(cè)Ab-Ag或與蛋白的親和力。

(7)免疫印記（western blotting)（8）免疫沉淀：

（9）親和層析：分離蛋白質(zhì)（10）磁珠分離細(xì)胞

（11）臨床疾病的診斷和治療；

23.植物細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基由哪些主要成分組成？（1）無機(jī)鹽（2）碳源

（3）植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑（4）有機(jī)氮源（5）維生素

24.植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的主要方法及其特點(diǎn)是什么？

（1）成批培養(yǎng)法：將培養(yǎng)基一次性地加入反應(yīng)器中，接種，培養(yǎng)一定時(shí)間后收獲細(xì)胞的操作方式。

特點(diǎn)：操作強(qiáng)度低，設(shè)備簡(jiǎn)單，容易發(fā)生污染，通氣受限制。（2）半連續(xù)培養(yǎng)法：在反應(yīng)器中投料和接種培養(yǎng)一段時(shí)間后，將部

分培養(yǎng)液和 新鮮培養(yǎng)液進(jìn)行交換的培養(yǎng)方法。

（3）連續(xù)培養(yǎng)法：是利用連續(xù)培養(yǎng)反應(yīng)器，在投料和接種培養(yǎng)一段時(shí)間后，以一定速度采集細(xì)胞和培養(yǎng)液，并以同樣速度供給誒新鮮培養(yǎng)基以使細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境長(zhǎng)期恒定的方法。

（4）固定化培養(yǎng)法：將細(xì)胞固定于尼龍網(wǎng)套內(nèi)，或固定于中空纖維有網(wǎng)狀多孔板，尼龍?zhí)缀椭锌绽w維膜上，放入培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，或連續(xù)流入新鮮培養(yǎng)液，進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)及連續(xù)收集培養(yǎng)產(chǎn)物，也可通入凈化空氣以代替攪拌。25.影響植物細(xì)胞積累次級(jí)代謝產(chǎn)物的因素有哪些？（1）生物條件

（2）物理?xiàng)l件（3）化學(xué)條件（4）工業(yè)培養(yǎng)條件

26.各種植物細(xì)胞培養(yǎng)的生物反應(yīng)器的特點(diǎn)是什么？

（1）機(jī)械攪拌式生物反應(yīng)器：有較大的操作范圍，混合程度高，適應(yīng)性廣，剪切力大，容易損傷細(xì)胞。

（2）鼓泡式生物反應(yīng)器：優(yōu)于機(jī)械攪拌式反應(yīng)器。但由于鼓泡式反應(yīng)器對(duì)氧的利用率較低，如果用較大通氣量，則產(chǎn)生的剪切力會(huì)損傷細(xì)胞。

（3）氣升式生物反應(yīng)器：廣泛應(yīng)用于植物細(xì)胞培養(yǎng)的研究和生產(chǎn)，最高細(xì)胞濃度和最短倍增時(shí)間可從氣升罐中得到。

（4）轉(zhuǎn)鼓式生物反應(yīng)器：生長(zhǎng)速率高，其氧的傳遞及剪切力對(duì)細(xì)胞 的傷害水平方面均優(yōu)于氣升式反應(yīng)器。

（5）固定化細(xì)胞反應(yīng)器：可保護(hù)細(xì)胞免受剪切，可長(zhǎng)時(shí)間重復(fù)使用，易于實(shí)現(xiàn) 細(xì)胞的高密度培養(yǎng)，細(xì)胞接觸良好，易于分化，有利于次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成，減少細(xì)胞的遺傳不穩(wěn)定 性，易于實(shí)現(xiàn)連續(xù)化操作。

27.植物細(xì)胞培養(yǎng)有哪些新進(jìn)展？

（1）誘導(dǎo)了在植物細(xì)胞工程研究中的應(yīng)用（2）前體飼喂（3）兩相法培養(yǎng)

（4）轉(zhuǎn)基因技術(shù)在次級(jí)代謝產(chǎn)物生產(chǎn)中的應(yīng)用（5）植物身為轉(zhuǎn)化技術(shù)與生物制藥 28.酶工程主要研究?jī)?nèi)容是什么？

（1）酶的分離、純化、大批量生產(chǎn)及應(yīng)用。（2）酶和細(xì)胞的固定化及酶反應(yīng)器的研究。

（3）酶生產(chǎn)中基因工程技術(shù)的應(yīng)用及遺傳修飾酶研究。

（4）酶的分子改造與化學(xué)修飾以及酶的結(jié)構(gòu)與功能之間關(guān)系的研究。（5）有機(jī)相中酶反應(yīng)的研究。

（6）酶的抑制劑，激活劑的開發(fā)及應(yīng)用與研究。（7）抗體酶，核酸酶的研究。

（8）模擬酶，合成酶及酶分子的人工設(shè)計(jì)、合成的研究。29.固定化酶回合固定化細(xì)胞的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)各是什么？怎樣制備？ 固定化酶的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn):

（1）同一批固定化酶能在工藝流程中重復(fù)多次地使用；

（2）固定化后，和反應(yīng)物分開，有利于控制生產(chǎn)過程，同時(shí)也省去了熱處

理使酶失活的步驟；

（3）穩(wěn)定性顯著提高；

（4）可長(zhǎng)期使用，并可預(yù)測(cè)衰變的速度；

（5）提供了研究酶動(dòng)力學(xué)的良好模型。

固定化細(xì)胞的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)：

1.使用固定化細(xì)胞省去了酶的分離過程，顯著降低了成本。

2.固定化細(xì)胞為多酶系統(tǒng)，不需要輔助因子

3.增加了細(xì)胞對(duì)不利環(huán)境的耐逆性，可重復(fù)使用。

4.增加了酶的穩(wěn)定性。

固定化酶制備：

（1）吸附法：

過載體表面和酶分子表面間的次級(jí)鍵相互作用而達(dá)到固定目的的方法，是固定化中最簡(jiǎn)單的方法。酶與載體之間的親和力是范德華力、疏水相互作用、離子鍵和氫鍵等。（2）包埋發(fā)：

將酶包埋在高聚物的細(xì)微凝膠網(wǎng)格中或高分子半透膜內(nèi)的固定化方法。前者又稱為凝膠包埋法，酶被包埋成網(wǎng)格型；后者又稱為微膠囊包埋法，酶被包埋成微膠囊型。（3）共價(jià)鍵結(jié)合法：

將酶與聚合物載體以共價(jià)鍵結(jié)合的固定化方法。

（4）交聯(lián)法

使用雙功能或多功能試劑使酶分子之間相互交聯(lián)呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的固定化方法。由于酶蛋白的功能團(tuán)，如氨基、酚基、巰基和咪唑基，參與此反應(yīng)，所以酶的活性中心構(gòu)造可能受到影響，而使酶失活明顯。但是盡可能地降低交聯(lián)劑濃度和縮短反應(yīng)時(shí)間將有利于固定化酶活力的提高。

固定化細(xì)胞的制備：

一種固定化細(xì)胞的制備方法，包括以下步驟： a．選用甲烷利用細(xì)菌Methylomonas sp．GYJ3，在可供給微生物能量的甲烷和空氣的混合氣體中，輔以無機(jī)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)； b．培養(yǎng)好的菌體細(xì)胞離心后用無機(jī)培養(yǎng)基懸浮，加入到硅酸鈉溶液和鹽酸溶液制成的溶膠中，待溶膠凝固變成凝膠后，就制得了包埋的細(xì)胞，將包埋細(xì)胞置于低溫環(huán)境中以增加包埋強(qiáng)度； c．用磷酸鹽緩沖液洗去包埋細(xì)胞的雜質(zhì)，充入可給微生物提供能量的相應(yīng)的甲烷與空氣的混合氣體，在搖床上培養(yǎng)48－120小時(shí)。

30.為什么要對(duì)酶進(jìn)行化學(xué)修飾？

（1）.更好的熱穩(wěn)定性以及抗核酸酶性對(duì)于臨床應(yīng)用很重要；（2）提高酶蛋白在體內(nèi)的半衰期；（3）提高酶蛋白的靶向性；（4）提高酶蛋白效力。

31.何謂分子印跡？分子印跡的應(yīng)用范圍有哪些？

分子印跡：是指制備對(duì)某一特定化合物具有選擇性的聚合物的過程。

應(yīng)用范圍：

（1）用于化學(xué)仿生傳感器（2）色譜分離（3）固相萃?。?）天然杭體模擬（5）模擬酶催化（6）控緩釋藥物

32.有機(jī)相酶反應(yīng)的定義及其優(yōu)點(diǎn)是什么？

有機(jī)相酶反應(yīng)：是指酶在具有有機(jī)溶劑存在的介質(zhì)中所進(jìn)行對(duì)的催化反應(yīng)。優(yōu)點(diǎn)是：

（1）增加疏水性底物或產(chǎn)物的溶解度。（2）熱力學(xué)平衡向合成方向移動(dòng)。（3）可抑制有水劑中分離純化產(chǎn)物。（4）酶不溶于有機(jī)介質(zhì)，易于回收再利用。（5）容易從低沸點(diǎn)的溶劑中分離純化產(chǎn)物。（6）酶的熱穩(wěn)定性提高，PH的適應(yīng)性擴(kuò)大。（7）無微生物污染。

（8）能測(cè)定某介質(zhì)中反應(yīng)時(shí)，通過改變?nèi)軇?，能夠控制底物的特異性、區(qū)域選擇性和立體選擇性，并可以催化某些在水中不能進(jìn)行的反應(yīng)。33.何謂人工模擬酶？

人工模擬酶：是指根據(jù)酶的作用機(jī)理，用各種方法人為制造的具有酶性質(zhì)的催化劑。

34.發(fā)酵工程的研究?jī)?nèi)容包括哪些？

發(fā)酵工程研究?jī)?nèi)容涉及：菌種的培養(yǎng)和選育、菌的代謝與調(diào)節(jié)、培養(yǎng)基滅菌、通氣攪拌、溶氧、發(fā)酵條件的優(yōu)化、發(fā)酵過程各種參數(shù)與動(dòng)力學(xué)、發(fā)酵反應(yīng)器的設(shè)計(jì)和自動(dòng)控制、產(chǎn)品的分離純化和精制等。35.微生物菌種誘變使用的主要誘變劑有哪些？它們的誘變機(jī)制是什么？

(1)物理誘變劑：主要有紫外線、X射線、γ射線、快中子、α射線、β射線和超聲波等。

（2）化學(xué)誘變劑：金屬離子、一般化學(xué)試劑、生物堿、抗代謝物、生長(zhǎng)刺激素、抗生素及高分子化合物、殺菌劑、染料等。誘變機(jī)制：

1、堿基的類似物誘發(fā)突變

2、改變DNA的化學(xué)結(jié)構(gòu)

3、結(jié)合到DNA分子上誘發(fā)移碼突變

4、紫外線及其他射線引起的DNA分子的變化 36.微生物發(fā)酵主要有哪些方式？各具有什么特點(diǎn)？

（一）分批發(fā)酵：是將全部物料一次投入到反應(yīng)器中，經(jīng)滅菌，接種，經(jīng)過若干時(shí)間的發(fā)酵后再將發(fā)酵液一次放出的操作方式。特點(diǎn)：

（1）對(duì)溫度的要求低，工藝操作簡(jiǎn)單；（2）比較容易解決雜菌污染和菌種退化等問題；

（3）對(duì)營(yíng)養(yǎng)物的利用效率較高，產(chǎn)物濃度也比連續(xù)發(fā)酵要高（4）人力、物力、動(dòng)力消耗較大；（5）生產(chǎn)周期較長(zhǎng)（6）生產(chǎn)效率低

（二）補(bǔ)料分批發(fā)酵：指在微生物分批發(fā)酵過程中，以某種方式向發(fā)酵系統(tǒng)中補(bǔ)加一定物料，但并不連續(xù)地向外放出發(fā)酵液的發(fā)酵技術(shù)，是介于分批發(fā)酵和連續(xù)發(fā)酵之間的一種發(fā)酵技術(shù)。特點(diǎn)：

(1)可以解除底物的抑制、產(chǎn)物的反饋抑制和分解代謝物阻遏作用。

(2)可以減少菌體生長(zhǎng)量，提高有用產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率；(3)菌種的變異及雜菌污染問題易控制；(4)便于自動(dòng)化控制

(三)連續(xù)發(fā)酵：是指以一定的速度向發(fā)酵罐內(nèi)添加新鮮培養(yǎng)基，同時(shí)以相同速度流出培養(yǎng)液，從而使發(fā)酵罐內(nèi)的液量維持恒定的發(fā)酵過程。

特點(diǎn)：

（1）設(shè)備的體積可以減?。籿（2）操作時(shí)間短，總的操作管理方便，便于自動(dòng)化控制；（3）產(chǎn)物穩(wěn)定，人力物力節(jié)省，生產(chǎn)費(fèi)用低（4）對(duì)設(shè)備的合理性和加料設(shè)備的精確性要求甚高；（5）營(yíng)養(yǎng)成分的利用較分批發(fā)酵差，產(chǎn)物濃度比分批發(fā)酵低

（6）雜菌污染的機(jī)會(huì)較多，菌種易因變異而發(fā)生退化。37.影響發(fā)酵的主要因素有哪些？如何對(duì)發(fā)酵過程進(jìn)行控制？（1）溫度 溫度對(duì)微生物的影響是多方面的。首先，溫度影響酶的活性。在最適溫度范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，菌體生長(zhǎng)和代謝加快，發(fā)酵反應(yīng)的速率加快。當(dāng)超過最適溫度范圍以后，隨著溫度的升高，酶很快失活，菌體衰老，發(fā)酵周期縮短，產(chǎn)量降低。溫度也能影響生物合成的途徑。例如，金色鏈霉菌在30℃以下時(shí)，合成金霉素的能力較強(qiáng)，但當(dāng)溫度超過35℃時(shí)，則只合成四環(huán)素而不合成金霉素。此外，溫度還會(huì)影響發(fā)酵液的物理性質(zhì)，以及菌種對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的分解吸收等。因此，要保證正常的發(fā)酵過程，就需維持最適溫度。但菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成所需的最適溫度不一定相同。如灰色鏈霉菌的最適生長(zhǎng)溫度是37℃，但產(chǎn)生抗生素的最適溫度是28℃。通常，必須通過實(shí)驗(yàn)來確定不同菌種各發(fā)酵階段的最適溫度，采取分段控制。（2）pH pH能夠影響酶的活性，以及細(xì)胞膜的帶電荷狀況。細(xì)胞膜的帶電荷狀況如果發(fā)生變化，膜的透性也會(huì)改變，從而有可能影響微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收及代謝產(chǎn)物的分泌。此外，pH還會(huì)影響培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的分解等。因此，應(yīng)控制發(fā)酵液的pH。但不同菌種生長(zhǎng)階段和合成產(chǎn)物階段的最適pH往往不同，需要分別加以控制。在發(fā)酵過程中，隨著菌體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用和代謝產(chǎn)物的積累，發(fā)酵液的pH必然發(fā)生變化。如當(dāng)尿素被分解時(shí)，發(fā)酵液中的NH+4濃度就會(huì)上升，pH也隨之上升。在工業(yè)生產(chǎn)上，常采用在發(fā)酵液中添加維持pH的緩沖系統(tǒng)，或通過中間補(bǔ)加氨水、尿素、碳酸銨或碳酸

鈣來控制pH。目前，國(guó)內(nèi)已研制出檢測(cè)發(fā)酵過程的pH電極，用于連續(xù)測(cè)定和記錄pH變化，并由pH控制器調(diào)節(jié)酸、堿的加入量。（3）溶解氧 氧的供應(yīng)對(duì)需氧發(fā)酵來說，是一個(gè)關(guān)鍵因素。從葡萄糖氧化的需氧量來看，1 mol的葡萄糖徹底氧化分解，需6 mol的氧；當(dāng)糖用于合成代謝產(chǎn)物時(shí)，1 mol葡萄糖約需1.9 mol的氧。因此，好氧型微生物對(duì)氧的需要量是很大的，但在發(fā)酵過程中菌種只能利用發(fā)酵液中的溶解氧，然而氧很難溶于水。在101.32 kPa、25℃時(shí)，氧在水中的溶解度為0.26 mmol/L。在同樣條件下，氧在發(fā)酵液中的溶解度僅為0.20 mmol/L。而且隨著溫度的升高，溶解度還會(huì)下降。因此，必須向發(fā)酵液中連續(xù)補(bǔ)充大量的氧，經(jīng)攪拌，可以提高氧在發(fā)酵液中的溶解度。

（4）泡沫 在發(fā)酵過程中，通氣攪拌、微生物的代謝過程及培養(yǎng)基中某些成分的分解等，都有可能產(chǎn)生泡沫。發(fā)酵過程中產(chǎn)生一定數(shù)量的泡沫是正常現(xiàn)象，但過多的持久性泡沫對(duì)發(fā)酵是不利的。因?yàn)榕菽瓡?huì)占據(jù)發(fā)酵罐的容積，影響通氣和攪拌的正常進(jìn)行，甚至導(dǎo)致代謝異常，因而必須消除泡沫。常用的消泡沫措施有兩類：一類是安裝消泡沫擋板，通過強(qiáng)烈的機(jī)械振蕩，促使泡沫破裂；另一類是使用消泡沫劑。（5）營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的濃度 發(fā)酵液中各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的濃度，特別是碳氮比、無機(jī)鹽和維生素的濃度，會(huì)直接影響菌體的生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)物的積累。如在谷氨酸發(fā)酵中，NH+4濃度的變化，會(huì)影響代謝途徑(見谷氨酸發(fā)酵)。因此，在發(fā)酵過程中，也應(yīng)根據(jù)具體情況進(jìn)行控制。38.如何克隆抗生素生物合成基因？

在分子水平上提供一種純化和擴(kuò)增特定DNA片段的方法。常含有目的基因，用體外重組方法將它們插入克隆載體，形成重組克隆載體，通過轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)導(dǎo)的方式，引入適合的寄主體內(nèi)得到復(fù)制與擴(kuò)增，然后再從篩選的寄主細(xì)胞內(nèi)分離提純所需的克隆載體，可以得到插入DNA的許多拷貝，從而獲得目的基因的擴(kuò)增。39．基因工程在抗生素生產(chǎn)中有哪些應(yīng)用？

第三篇：生物技術(shù)制藥總結(jié)

生物技術(shù)：人們以現(xiàn)代生命科學(xué)為基礎(chǔ)，結(jié)合先進(jìn)的工程技術(shù)手段和其他基礎(chǔ)科學(xué)的科學(xué)原理，按照預(yù)先的設(shè)計(jì)改造生物體或加工生物原料，為人類生產(chǎn)出所需產(chǎn)品或達(dá)到某種目的的技術(shù)

1基因工程制藥：利用基因重組技術(shù)將外援基因?qū)胨拗骶蚣?xì)胞進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)，以獲得蛋白質(zhì)藥物的過程。

2.載體：是攜帶外源目的基因或DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)外援基因或DNA的無性繁殖或表達(dá)有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些DNA分子。

細(xì)胞傳代passage：將細(xì)胞從一個(gè)培養(yǎng)器皿中消化、分散并接種至另一個(gè)培養(yǎng)器皿中的操作。細(xì)胞克隆培養(yǎng)（clonal culture）：即單細(xì)胞分離培養(yǎng)，是將動(dòng)物組織分散后，將一個(gè)細(xì)胞從群體細(xì)胞中分離出來，由單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)成純系細(xì)胞集群。

動(dòng)物細(xì)胞的復(fù)蘇：其原則是快速融化，必須將凍存在-196℃液氮中的細(xì)胞快速融化至37℃，使細(xì)胞外凍存時(shí)的冰晶迅速融化，避免冰晶緩慢融化時(shí)進(jìn)入細(xì)胞形成再結(jié)晶，對(duì)細(xì)胞造成損害。

細(xì)胞融合（cell fusion）：是指在外力（誘導(dǎo)劑或促融劑）作用下，兩個(gè)或兩個(gè)以上的異源（種、屬間）細(xì)胞或原生質(zhì)體相互接觸，從而發(fā)生膜融合、胞質(zhì)融合和核融合并形成雜種細(xì)胞的現(xiàn)象，或稱細(xì)胞雜交。

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物（transgenic animal）：采用基因工程技術(shù)將外源目的基因?qū)雱?dòng)物生殖細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞和早期胚胎，并在受體動(dòng)物的染色體上穩(wěn)定整合，在經(jīng)過發(fā)育途徑將外源目的基因穩(wěn)定地傳給子代，通過這項(xiàng)技術(shù)所獲得的動(dòng)物即為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。

胚胎干細(xì)胞（embryo stem cell）：簡(jiǎn)稱ES細(xì)胞，是從早期胚胎細(xì)胞團(tuán)分離出來并能在體外培養(yǎng)的一種高度未分化的、具有形成所有成年細(xì)胞類型能力的全能干細(xì)胞。它是正常二倍體型，像早期胚胎細(xì)胞一樣具有發(fā)育上的全能性。

抗體工程制藥（antibody engineering pharmaceutics）：利用基因工程、細(xì)胞工程（包括動(dòng)物細(xì)胞工程和植物細(xì)胞工程）和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物及轉(zhuǎn)基因植物技術(shù)生產(chǎn)抗體藥物的過程。

單克隆抗體（monoclonal antibody，mAb）：簡(jiǎn)稱單抗，將能大量擴(kuò)增和永生的骨髓瘤細(xì)胞和能合成分泌特異性抗體的B細(xì)胞（僅識(shí)別一種抗原表位）進(jìn)行融合得到雜交瘤細(xì)胞，經(jīng)篩選和克隆化的雜交瘤細(xì)胞僅能合成及分泌抗單一抗原表位的特異性抗體。

雜交瘤細(xì)胞克隆化（cloning）：是指將陽性孔中分泌抗體的單個(gè)細(xì)胞分離出來。融合后的雜交瘤細(xì)胞一般要經(jīng)過3次克隆化才能達(dá)到100%的陽性克隆。

雙特異性抗體（bispecific antibody，bsAb）：亦稱雙功能抗體，是含有兩個(gè)不同配體結(jié)合位點(diǎn)的抗體分子，它有兩個(gè)不同的抗原結(jié)合部位（兩個(gè)臂），可分別結(jié)合兩種不同的抗原表位。嵌合抗體（chimeric antibody）：是利用DNA重組技術(shù)，將異源單抗的輕、重鏈可變區(qū)基因插入含有人抗體恒定區(qū)的表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的抗體，表達(dá)的抗體分子中輕、重鏈的V區(qū)是異源的，而C區(qū)是人源的，即整個(gè)抗體分子的60%~70%是人源的。

人源化抗體（humanized antibody，hAb）：通過CDR移植即把鼠抗體的CDR（互補(bǔ)決定區(qū)）序列移植到人抗體的可變區(qū)內(nèi)所得到的抗體，也稱CDR移植抗體或改型抗體。該抗體既具有鼠源性單抗的特異性又保持了人抗體的功能（C區(qū)的功能）。

免疫原性（immunogenicity）：抗原能刺激機(jī)體特異性免疫細(xì)胞，使其活化、增值、分化，最終產(chǎn)生免疫效應(yīng)物質(zhì)（抗體或致敏淋巴細(xì)胞）的特性。

免疫反應(yīng)性（immunoreactivity）：抗原與相應(yīng)免疫效應(yīng)物質(zhì)在體內(nèi)或體外相遇時(shí)，可發(fā)生

特異性結(jié)合而產(chǎn)生免疫反應(yīng)的特性。

減毒活疫苗（live attenuated vaccine）：是通過不同的方式手段使病原體的毒性即致病

性減弱或喪失后獲得的一種由完整的微生物組成的疫苗制品。

滅活疫苗（inactivated）：是將病原體經(jīng)培養(yǎng)增殖、滅活純化處理，使其完全喪失感染性，但保留了病原體的幾乎全部組分因此滅活疫苗具有較好的免疫原性和安全性。

亞單位疫苗（subunit vaccine）：利用微生物的某種表面結(jié)構(gòu)成分（抗原）制成、能誘發(fā)

機(jī)體產(chǎn)生抗體的疫苗。

分解代謝阻遏（catabolite repression）：在菌體的生長(zhǎng)階段被菌體快速利用的碳源會(huì)產(chǎn)

生大量的分解產(chǎn)物，這些代謝產(chǎn)物阻遏次級(jí)代謝酶系的合成，只有當(dāng)這類碳源被消耗完后，阻遏作用被消除，菌體才由生長(zhǎng)階段轉(zhuǎn)入次級(jí)代謝產(chǎn)物合成階段，這種發(fā)酵過程中的次級(jí)代

謝產(chǎn)物在碳源被消耗盡時(shí)才產(chǎn)生和積累的現(xiàn)象稱為分解代謝阻遏。

生物技術(shù)：人們以現(xiàn)代生命科學(xué)為基礎(chǔ)，結(jié)合先進(jìn)的工程技術(shù)手段和其他基礎(chǔ)科學(xué)的科學(xué)原

理，按照預(yù)先的設(shè)計(jì)改造生物體或加工生物原料，為人類生產(chǎn)出所需產(chǎn)品或達(dá)到某種目的的技術(shù)。

種齡（inoculumage）：種子罐中培養(yǎng)的菌絲轉(zhuǎn)入下一級(jí)種子罐或發(fā)酵罐時(shí)得培養(yǎng)時(shí)間

生物技術(shù)藥物的特性？

（1）理化性質(zhì)特性（1）相對(duì)分子量大（2）結(jié)構(gòu)復(fù)雜：蛋白質(zhì)和核酸均為生物大分子，蛋

白質(zhì)含有四級(jí)結(jié)構(gòu)（3）穩(wěn)定性差（2）藥理學(xué)作用特性（1）活性與作用機(jī)制明確：活性物

質(zhì)對(duì)生理功能的調(diào)節(jié)機(jī)制比較清楚（2）作用針對(duì)性強(qiáng)：有特定的靶分子、靶細(xì)胞或靶器官

（3）毒性低：生物技術(shù)藥物本身是體內(nèi)天然存在的物質(zhì)或它們的衍生物（4）體內(nèi)半衰期短

（5）有種屬特異性（6）可產(chǎn)生免疫原抑制（3）生產(chǎn)制備特性（1）藥物分子在原料中的含量低（2）原料液中常存在降解目標(biāo)產(chǎn)物的雜質(zhì)：應(yīng)采取快速分離純化的方法以除去影響

目標(biāo)產(chǎn)物穩(wěn)定性的物質(zhì)（3）制備工藝條件溫和：目的產(chǎn)物不穩(wěn)定（4）分離純化困難：需要

多種不同原理的層析單元操作才能達(dá)到要用的純度（5）產(chǎn)品易受有害物質(zhì)（4）質(zhì)量控制特

性

質(zhì)粒的特點(diǎn)：（1）是指獨(dú)立于原核生物染色體之外具有自主復(fù)制能力的遺傳物質(zhì)。（2）質(zhì)粒

具有遺傳傳遞和遺傳交換的能力（3）質(zhì)粒具有不相容性：兩種親緣關(guān)系密切的不同質(zhì)粒不

能在同一宿主細(xì)胞中穩(wěn)定共存。4..共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(ccDNA)，開環(huán)DNA(ocDNA)，線狀

DNA(lDNA)在瓊脂糖凝膠電泳中

5.復(fù)制子松弛型復(fù)制子的復(fù)制和宿主蛋白的合成功能

無關(guān)，宿主染色體DNA復(fù)制受阻時(shí)，質(zhì)粒仍可復(fù)制；嚴(yán)謹(jǐn)型復(fù)制子的復(fù)制與宿主蛋白質(zhì)的合成相關(guān)，因此在每個(gè)宿主細(xì)胞中為低拷貝數(shù)，僅1~3個(gè)。

6.克隆表達(dá)的質(zhì)粒載體涉及三個(gè)要素：

（1）復(fù)制子（2）選擇標(biāo)記：由質(zhì)粒攜帶的賦予宿主細(xì)胞新的表型的基因，用于鑒定和篩選

轉(zhuǎn)化有質(zhì)粒的宿主細(xì)胞。常見的標(biāo)記：氨芐西林（Amp），卡那霉素（Kan）（3）多克隆位點(diǎn)

（MCS）：質(zhì)粒載體中由多個(gè)限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列密集排列形成的序列。

7.目的基因常用制備方法

(1)化學(xué)合成法（2）PCR法：在含有DNA模板、引物、DNA聚合酶、dNTP的緩沖溶液中通

過下列步驟擴(kuò)增DNA：a）變性：雙鏈DNA模板加熱變性，解離成單鏈模板；b）退火：降

低溫度，引物與單鏈模板結(jié)合；c）延伸：溫度調(diào)整至DNA聚合酶最適宜溫度，最終與單鏈

模板形成雙鏈，并開始下一個(gè)變性、退火、延伸循環(huán)。（3）基因文庫法（4）cDNA文庫法

8.影響目的基因與載體之間連接效率的主要因素：

9.（1）DNA片段之間的連接方式：粘性末端的連接效率高于平頭末端。（2）目的基因與載

體的濃度和比例：增加DNA濃度可以提高連接效率，目的基因與載體DNA的摩爾數(shù)比應(yīng)大

于1.（3）連接溫度、時(shí)間、連接酶的活性及緩沖液。

9.重組DNA導(dǎo)入大腸桿菌，常用的感受態(tài)細(xì)胞制備方法：氯化鈣法

10.重組子的篩選與鑒定：

（1）載體遺傳標(biāo)記法：a)抗生素抗性篩選法

b)互補(bǔ)篩選法：重組子轉(zhuǎn)化成宿主細(xì)胞，載體的表達(dá)產(chǎn)物與宿主細(xì)胞中營(yíng)養(yǎng)缺陷性突變發(fā)生

互補(bǔ)作用，從而實(shí)現(xiàn)重組子的篩選。藍(lán)白斑篩選：lacZα基因可編碼β—半乳糖苷酶α氨基

端的α互補(bǔ)肽段，與宿主細(xì)胞編碼的缺陷型β—半乳糖苷酶α實(shí)現(xiàn)互補(bǔ)，可分解底物5-溴-4-

氫-3-吲哚-β-D-半乳糖苷，形成藍(lán)色菌落。由于lacAα基因的插入失活而成白色，空載體的宿主細(xì)胞呈藍(lán)色。c)營(yíng)養(yǎng)缺陷篩選法d噬菌斑篩選法(2)核酸分子雜交法

(3)限制性內(nèi)切酶圖譜法(4)DNA序列測(cè)定法：雙脫氧終止法(5)目的基因表達(dá)產(chǎn)物測(cè)定法

12.外源基因在大腸桿菌中的表達(dá)形式：

(1)胞內(nèi)表達(dá)：(a)非融合蛋白的胞內(nèi)表達(dá)：形成包涵體（B）融合蛋白的胞內(nèi)表達(dá)：在大腸桿

菌內(nèi)較穩(wěn)定（2）分泌表達(dá)：（a)分泌至周質(zhì)（b）分泌至胞外

11.外源基因在原核生物中表達(dá)的重要調(diào)控元件

(1)啟動(dòng)子：是DNA鏈上能與RNA聚合酶結(jié)合并起始mRNA合成的一段序列，是決定外源基

因在原核生物中表達(dá)效率的關(guān)鍵因素。(2)核糖體結(jié)合位點(diǎn)：SD序列(3)終止子

13.大腸桿菌中外源蛋白表達(dá)效率的影響因素：(1)外源基因密碼子：偏好密碼子（蛋白質(zhì)合成迅速，錯(cuò)配率低）和稀有密碼子(2)mRNA結(jié)構(gòu)：減少G、C含量，增加A、T含量(3)表達(dá)

載體：高拷貝數(shù)、適用范圍廣、穩(wěn)定性高、表達(dá)產(chǎn)物容易純化(4)外源蛋白穩(wěn)定性

14.分離純化技術(shù)應(yīng)滿足下列要求：(1)技術(shù)條件要溫和，能保持目的產(chǎn)物的生物活性；(2)選

擇性要好(3)回收率要高(4)兩個(gè)技術(shù)之間要能直接銜接(5)整個(gè)分離純化過程要快

15.基因重組蛋白的主要分離技術(shù)

(1)離心(2)沉淀(3)膜分離(4)雙水相萃取

16基因重組蛋白的主要純化技術(shù):

(1)離子交換層析(2)親和層析(3)凝膠過濾層析(4)反相層析和疏水層析

17.選擇分離純化方法的依據(jù)：

（元，層析分離次序的選擇也同樣重要。(3)根據(jù)分離純化工藝的要求來選擇(a)具有良好的穩(wěn)

定性、重復(fù)性和較高的安全性(b)盡可能減少組成工藝的步驟(c)分離純化工藝所用的時(shí)間要

盡可能的短(d)工藝和技術(shù)必須高效

18．基因工程藥物的質(zhì)量控制要點(diǎn)

(1)蛋白質(zhì)含量的測(cè)定(2)蛋白質(zhì)純度檢測(cè)(3)蛋白質(zhì)分子質(zhì)量測(cè)定(4)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)測(cè)定(5)蛋

白質(zhì)序列分析(6)內(nèi)毒素分析、宿主蛋白與核酸殘留分析

19.蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

(1)紫外吸收法(2)BCA法(3)Lowry法(4)考馬斯亮藍(lán)法(5)SDS-PAGE掃描分析法

20.蛋白質(zhì)純度的檢測(cè)：電泳法、層析法、質(zhì)譜法、末端氨基酸殘基分析法

21.蛋白質(zhì)Mr測(cè)定有SDS-PAGE法、凝膠層析法、質(zhì)譜法

22.蛋白質(zhì)等電點(diǎn)測(cè)定的常用方法：等電聚焦法。

23.蛋白質(zhì)序列的分析:N-端氨基酸序列分析，C-端氨基酸序列分析

根據(jù)體外培養(yǎng)時(shí)動(dòng)物細(xì)胞對(duì)生長(zhǎng)基質(zhì)的依賴性，可將動(dòng)物細(xì)胞分為

(1)貼壁依賴性細(xì)胞(2)非貼壁依賴性細(xì)胞(3)兼性貼壁細(xì)胞

1.動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的環(huán)境條件

(1)培養(yǎng)溫度（哺乳類37℃，昆蟲25~28℃）(2)pH值（大多數(shù)7.2~7.4）(3)通氧量（一定量的CO2）(4)防止污染(5)基本營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(6)滲透壓

3.動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)特性

(1)比微生物細(xì)胞大得多，無細(xì)胞壁，抗機(jī)械強(qiáng)度低，對(duì)剪切力敏感，適應(yīng)環(huán)境能力差；(2)

倍增時(shí)間長(zhǎng)，生長(zhǎng)緩慢，正常二倍體細(xì)胞的生長(zhǎng)壽命是有限的；(3)對(duì)培養(yǎng)基要求高，易受

微生物污染，培養(yǎng)時(shí)需要添加抗生素；(4)生長(zhǎng)大多需貼附于基質(zhì)，相互粘連以集群形式存

在，并有接觸抑制現(xiàn)象；(5)多半將產(chǎn)物分泌在細(xì)胞外，便于收集和純化；(6)對(duì)蛋白質(zhì)的合成條件和修飾功能與細(xì)菌不同，動(dòng)物細(xì)胞可對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行完善的翻譯后修飾，特別是糖基化，與天然產(chǎn)品更一致，更適合于臨床應(yīng)用。

4.原代培養(yǎng)的主要步驟

(1)從健康動(dòng)物體內(nèi)無菌條件下取出適量組織，剪切成小薄片；(2)加入適宜濃度的胰蛋白酶

或膠原酶和EDTA等進(jìn)行消化作用使細(xì)胞分散；(3)將分散的細(xì)胞進(jìn)行洗滌并純化后，以2×

10^6~7×10^6 /ml的濃度加到培養(yǎng)基中，37℃下進(jìn)行原代培養(yǎng)，并適時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。分為

組織塊培養(yǎng)和單層細(xì)胞培養(yǎng)兩種方法。

5.動(dòng)物細(xì)胞深低溫保存的基本原理

在-70℃以下時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的酶活性均已停止，即代謝處于完全停滯狀態(tài)，故可以長(zhǎng)期保存。

在不加任何條件下直接凍存細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞內(nèi)和外環(huán)境中的水都會(huì)形成冰晶，能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)發(fā)

生機(jī)械損傷、電解質(zhì)濃度升高、滲透壓改變、脫水、pH改變、蛋白質(zhì)變性等，能引起細(xì)胞

死亡。目前為了保存細(xì)胞，都采用液氮低溫（-196℃）凍存的方法。

6.動(dòng)物細(xì)胞的復(fù)蘇

其原則是快速融化，必須將凍存在-196℃液氮中的細(xì)胞快速融化至37℃，使細(xì)胞外凍

存時(shí)的冰晶迅速融化，避免冰晶緩慢融化時(shí)進(jìn)入細(xì)胞形成再結(jié)晶，對(duì)細(xì)胞造成損害。

7.動(dòng)物細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)要求特點(diǎn)

(1)碳源不能為無機(jī)物，大多為葡萄糖；(2)氮源不能為無機(jī)物，主要為各種氨基酸；(3)在很

多情況下尚需添加5%~20%的小牛血清或適量的動(dòng)物胚胎浸出液。

8.動(dòng)物細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)方法

(1)懸浮培養(yǎng)法(2)微載體培養(yǎng)法(3)多孔載體培養(yǎng)法(4)微囊化培養(yǎng)法(5)中空纖維培養(yǎng)法

9.誘導(dǎo)動(dòng)物細(xì)胞融合的方法主要有:(1)病毒法(2)PEG法(3)電擊法(4)激光法

10.轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生物反應(yīng)器（整體掌握？）

(1)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器（藥用蛋白，如抗凝血Ⅲ、抗胰蛋白酶、葡萄糖苷酶、C蛋白）

(2)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物血液生物反應(yīng)器（人血紅蛋白、抗體或非活性狀態(tài)的融合蛋白）(3)轉(zhuǎn)基因動(dòng)

物尿液生物反應(yīng)器（促性腺激素）(4)轉(zhuǎn)基因雞（蛋）生物反應(yīng)器（人干擾素）

1.單克隆抗體技術(shù)的基本原理

基于動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)得以實(shí)現(xiàn)的，即骨髓瘤細(xì)胞和B細(xì)胞的融合。骨髓瘤細(xì)胞在體外

培養(yǎng)能大量無限增殖，但不能分泌特異性抗體；抗原免疫的B細(xì)胞能產(chǎn)生特異性抗體，但在體外不能無限增殖。將免疫B細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合后形成的雜交瘤細(xì)胞，繼承了兩個(gè)親代

細(xì)胞的特性，既具有骨髓瘤細(xì)胞能無限增殖的特性，又具有免疫B細(xì)胞合成和分泌特異性抗

體的能力。通常使用HAT（H為次黃嘌呤、A為氨基蝶呤、T為胸腺嘧啶核苷）選擇培養(yǎng)基

對(duì)雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行篩選。未融合的脾細(xì)胞因不能在體外長(zhǎng)期存活而死亡，未融合的骨髓瘤細(xì)

胞合成DNA的從頭合成途徑被培養(yǎng)基中的A阻斷，又因缺乏HGPRT（次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸

核糖轉(zhuǎn)移酶）和TK（胸腺嘧啶核苷激酶），不能利用培養(yǎng)基中的H和T完成DNA的合成過

程而死亡。只有融合的雜交瘤細(xì)胞由于從脾細(xì)胞獲得了HGPRT和TK，因此能在HAT培養(yǎng)基

中長(zhǎng)期存活與繁殖并分泌抗體。

2.單克隆抗體的大量制備主要方法:（1）體內(nèi)培養(yǎng)法（2）體外培養(yǎng)法

6.重組ScFv的應(yīng)用:(1)用于構(gòu)建和生產(chǎn)免疫毒素(2)用于腫瘤的影像分析和治療

7.噬菌體抗體庫技術(shù)的基本原理:用PCR技術(shù)從人免疫細(xì)胞中擴(kuò)增出整套的VH和VL基因，克隆到噬菌體載體上并以融合蛋白的形式表達(dá)在其外殼表面。這樣一來噬菌體DNA中有抗

體基因的存在，同時(shí)在其表面又有抗體分子的表達(dá)，可以方便地利用抗原-抗體特異性結(jié)合而篩選出所需要的抗體，并進(jìn)行克隆擴(kuò)增。

7.噬菌體抗體庫構(gòu)建過程

(1)從外周血或脾、淋巴結(jié)等組織中分離B細(xì)胞，提取mRNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA；

(2)應(yīng)用抗體輕鏈和重鏈引物，根據(jù)建庫的需要通過PCR技術(shù)擴(kuò)增不同的抗體基因片段；

(3)構(gòu)建噬菌體載體；(4)用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化細(xì)菌，構(gòu)建全套抗體庫。

通過多輪的抗原親和吸附（結(jié)合）-洗脫-擴(kuò)增，最終篩選出抗原特異的抗體克隆。其中，噬

菌體抗體庫的篩選是關(guān)鍵環(huán)節(jié)和步驟。

減毒活疫苗的優(yōu)缺點(diǎn)：

優(yōu)點(diǎn)：

（1）通過自然感染途徑接種，可以誘導(dǎo)包括體液免疫、細(xì)胞免疫和粘膜免疫在內(nèi)的更全面的免疫應(yīng)答，使機(jī)體獲得更廣泛的免疫保護(hù)；（2）由于使用的是活的微生物他們可以在體內(nèi)

長(zhǎng)時(shí)間起作用而誘導(dǎo)較強(qiáng)的免疫反應(yīng)，且由于活的微生物有增殖的特性，理論上只需要接

種一次，即可達(dá)到滿意的免疫效果；（3）可能引起水平傳播擴(kuò)大免疫效果，增強(qiáng)群體免疫屏

障；(4)一般不需要再疫苗中添加佐劑，生產(chǎn)工藝一般不需要濃縮純化，價(jià)格低廉。

缺點(diǎn)：

(1)一般減毒活疫苗均保留一定殘余毒力，對(duì)一些個(gè)體如免疫缺陷者可能誘發(fā)嚴(yán)重疾病，并

且由于種種原因如基因修飾等，減毒活疫苗可能出現(xiàn)毒力回復(fù)即“返祖”現(xiàn)象；(2)減毒活

疫苗是活的微生物制劑，可能造成環(huán)境污染而引發(fā)交叉感染等，并可能滯留在環(huán)境中形成傳

染源；(3)缺損顆?？赡芨蓴_免疫效果，因此產(chǎn)品分析評(píng)估較為困難；(4)保存運(yùn)輸?shù)葪l件要

求較高，如需冷藏等。

1.滅活疫苗的特點(diǎn)：(1)滅活疫苗常需多次接種；(2)接種滅活疫苗產(chǎn)生的抗體滴度隨著時(shí)

間而下降；(3)滅活疫苗需要量大。

第七章 發(fā)酵工程制藥

1.發(fā)酵類型：(1)微生物菌體發(fā)酵(2)微生物的酶(3)微生物的代謝產(chǎn)物發(fā)酵(4)微生物轉(zhuǎn)化發(fā)

酵(5)生物工程菌發(fā)酵

2.微生物發(fā)酵生產(chǎn)藥物的分類：(1)抗生素類(2)氨基酸類(3)核苷酸類(4)維生素類(5)甾體類

激素(6)多糖類(6)治療酶及酶抑制劑

3.菌種保藏方法：(1)斜面低溫保藏法(2)石蠟油封存法(3)沙土管保藏法(4)麩皮保藏法(5)甘

油懸液保藏法(6)冷東真空干燥保藏法(7)液氮超低溫保藏法(8)宿主保藏法

4.種子液具備的條件：(1)菌種的生長(zhǎng)活力強(qiáng)，轉(zhuǎn)種至發(fā)酵罐后能迅速生長(zhǎng)，延遲期短；(2)

生理狀態(tài)穩(wěn)定；(3)菌體總量及濃度能滿足大容量發(fā)酵罐的要求；(4)無雜菌污染，保證純種培養(yǎng)；()保持穩(wěn)定的生產(chǎn)能力

5.微生物的發(fā)酵方式：（1）分批發(fā)酵（2）補(bǔ)料—分批發(fā)酵（3）半連續(xù)發(fā)酵（4）連續(xù)發(fā)酵

5.發(fā)酵過程的中間分析項(xiàng)目：（1）產(chǎn)物產(chǎn)量（2）PH值（3）糖（4）氨基氮（5）菌絲形

態(tài)

6.發(fā)酵過程的影響因素及控制：（1）菌體濃度的影響及控制（2）營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)發(fā)酵的影響

及控制（3）溫度的影響及控制（4）PH的影響及控制（5）溶氧的影響及控制（6）二氧化碳的影響及控制（7）泡沫的影響及控制（8）染菌對(duì)發(fā)酵的影響

第四篇：生物技術(shù)制藥教學(xué)大綱

第一章 緒論（2學(xué)時(shí)）第一節(jié) 生物技術(shù)概述 1 生物技術(shù)的概念 2 生物技術(shù)發(fā)展史 第二節(jié) 生物技術(shù)制藥 1 生物技術(shù)制藥的概念 2 生物技術(shù)在制藥中的應(yīng)用 我國(guó)生物技術(shù)制藥現(xiàn)狀和發(fā)展前景 4 醫(yī)藥生物技術(shù)發(fā)展展望

第二章 生物藥物（10學(xué)時(shí)）

1．生物藥物的來源、特性、分類與制備。（2學(xué)時(shí)）

2．氨基酸類藥物：氨基酸類藥物研究概況；在醫(yī)藥中的應(yīng)用；氨基酸生產(chǎn)。（2學(xué)時(shí)）3．多肽、蛋白質(zhì)類藥物：多肽、蛋白質(zhì)類藥物的特點(diǎn)、分離純化方法、工業(yè)生產(chǎn)制備過程。（2學(xué)時(shí)）

4．核酸類藥物：概述（分類、應(yīng)用）；生產(chǎn)方法；核酸類藥物的制備。（2學(xué)時(shí)）5．糖類藥物：制備；純化。（2學(xué)時(shí)）

第三章 基因工程制藥（8學(xué)時(shí)）

通過本章學(xué)習(xí)，了解基因工程藥物研制的意義，掌握基因工程藥物的研制過程、研制方法。1概述。

2基因工程藥物生產(chǎn)的基本過程。(2)3目的基因的獲得：直接分離法；從基因文庫中篩選；逆轉(zhuǎn)錄法；人工合成法。4目的基因與運(yùn)載體的體外重組：常用載體；目的基因與運(yùn)載體的體外重組。5重組分子導(dǎo)入受體細(xì)胞；導(dǎo)入方法；影響轉(zhuǎn)化的因素；陽性重組體的篩選。(2)6基因表達(dá)：大腸桿菌中的基因表達(dá)；真核基因在原核生物中的表達(dá)方式；真核基因在真核生物中的表達(dá)；真核基因在動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)。(2)7基因工程下游技術(shù)；下游技術(shù)的要求；基因工程菌的穩(wěn)定性；基因工程菌發(fā)酵。8基因工程藥物的分離、純化：分離純化的基本過程；分離純化的技術(shù)。

9基因工程藥物的質(zhì)量控制:材料的質(zhì)量控制;培養(yǎng)過程的質(zhì)量控制;純化工藝工程的質(zhì)量控制。(2)第四章 動(dòng)物細(xì)胞工程制藥（8學(xué)時(shí)）1 概述： 形態(tài)及生理特性。（2）生產(chǎn)用的動(dòng)物細(xì)胞：生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的要求；生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的獲取。4 基因工程細(xì)胞的構(gòu)建和篩選；真核細(xì)胞基因表達(dá)載體的構(gòu)建；基因載體的導(dǎo)入和高效表達(dá)工程細(xì)胞株的篩選。（2）動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基 6 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法（2）7 動(dòng)物細(xì)胞大量培養(yǎng)的方法和操作方式 動(dòng)物細(xì)胞生物反應(yīng)器及檢測(cè)控制系統(tǒng)：攪拌式生物反應(yīng)器；氣升式生物反應(yīng)器；流化床生物反應(yīng)器。（2）

第五章 抗體制藥（4學(xué)時(shí)）1概述

2單克隆抗體：制備；細(xì)胞融合；雜交瘤的培養(yǎng)、篩選及克隆化。（2）

3鼠源性單克隆抗體的改造：Ig分子的結(jié)構(gòu)模式圖；結(jié)構(gòu)改造；基因工程抗體。4抗體的應(yīng)用：臨床檢驗(yàn)；層析介質(zhì)；導(dǎo)向藥物。（2）

第五篇：生物技術(shù)制藥重點(diǎn)總結(jié)

1.生物藥物：又稱為生物工程，是指人們以現(xiàn)代生命科學(xué)為基礎(chǔ)，結(jié)合先進(jìn)的工程技術(shù)手段和其它基礎(chǔ)學(xué)科的科學(xué)原

理，按照預(yù)先的設(shè)計(jì)改造生物體或加工生物原料，為人類生產(chǎn)出所需產(chǎn)品或達(dá)到某種目的技術(shù)。

2.生物技術(shù)藥物： 采用DNA重組技術(shù)或其它生物技術(shù)生產(chǎn)的用于預(yù)防、治療和診斷疾病的藥物，主要是重組蛋白和

核酸類藥物，如細(xì)胞因子、纖溶酶原激活劑、血漿因子等。

3.質(zhì)粒載體：質(zhì)粒是指獨(dú)立于原核生物染色體之外具有自主復(fù)制能力的遺傳物質(zhì)。分三種構(gòu)型：共價(jià)閉合環(huán)狀

DNA(cccDNA)、開環(huán)DNA(ocDNA)、線狀DNA(IDDNA)。在瓊脂糖凝膠電泳中遷移率：cccDNA > IDDNA > ocDNA

4.目的基因的常用制備方法主要包括化學(xué)合成法、PCR法、基因文庫法和cDNA文庫法等。

5.PCR法是指聚合酶鏈反應(yīng)，是根據(jù)生物體內(nèi)DNA復(fù)制原理在DNA聚合酶催化和dNTP參與下，引物依賴DNA模

板特異性的擴(kuò)增DNA。在含有DNA模板、引物、DNA聚合酶、dNTP的緩沖溶液中通過三個(gè)循環(huán)步驟擴(kuò)增DNA：：①變性—雙鏈DNA模板加熱變性，解離成單鏈模板；②退火—溫度下降，引物與單鏈模板結(jié)合（溫度下降，PCR特性下降，效率升高）；③延伸—溫度調(diào)整至DNA聚合酶最適宜溫度，DNA聚合酶催化dNTP加至引物3′-OH，引物以5′→3′方向延伸，最終與單鏈模板形成雙聯(lián)DNA, 并開始下一個(gè)循環(huán)。

6.cDNA文庫法：cDNA是指與mRNA互補(bǔ)的DNA。cDNA文庫法是指提取生物體總mRNA，并以mRNA作為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的催化下合成cDNA的一條鏈，再在DNA聚合酶的作用下合成雙鏈cDNA，將全部cDNA都克隆到宿主細(xì)胞而構(gòu)建成cDNA文庫。

7.影響目的基因與載體之間連接效率的主要因素：

①DNA片段之間的連接方式；粘性末端的連接效率高于平頭末端。

②目的基因與載體的濃度和比例；增加DNA濃度可以提高連接效率，目的基因于載體DNA的摩爾數(shù)比應(yīng)大于1。③連接溫度，時(shí)間，連接酶的活性及緩沖體系。

8.重組DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞的方法：轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、顯微注射和電穿孔。

9.互補(bǔ)篩選法（最常見藍(lán)白班篩選法）需添加X–gal（X–Gal是β–半乳糖苷酶（β–galactosidase）的底物，水解后呈藍(lán)

色）和IPTG（是β–半乳糖苷酶的活性誘導(dǎo)物質(zhì)）篩選物質(zhì)進(jìn)行篩選。

10.菌落原位雜交：又稱探針原位雜交法，制備與目的的基因某一區(qū)域同源的探針序列，根據(jù)核酸雜交原理，探針序列

特異性地雜交目的基因，并通過放射性同位素或熒光基團(tuán)進(jìn)行定位監(jiān)測(cè)。

11.凝膠過濾層析：凝膠過濾層析(gel filtration chromatography)法又稱排阻層析或分子篩方法。基本原理是：根據(jù)生物

大分子的蛋白質(zhì)的質(zhì)量的大小來實(shí)現(xiàn)目的蛋白的分離純化。在凝膠過濾層析中所用的凝膠是一種惰性的不帶電荷具有三維空間結(jié)構(gòu)的多孔網(wǎng)狀物質(zhì)，凝膠的每個(gè)顆粒的微粒結(jié)構(gòu)就如一個(gè)篩子，當(dāng)樣品隨流動(dòng)相經(jīng)過凝膠柱時(shí)，較大的分子內(nèi)不能進(jìn)入凝膠網(wǎng)孔內(nèi)而收到排阻，將與流動(dòng)相一起首先被洗脫下來，而較小的分子進(jìn)入部分凝膠網(wǎng)孔內(nèi)，所以流出的速度相對(duì)較慢。

12.反相層析（RPC）和疏水層析（HIC）的比較：是根據(jù)蛋白質(zhì)疏水性差異來實(shí)現(xiàn)分離純化。先比反相層析而言，疏

水層析回收率較高，蛋白質(zhì)變性的可能性較小。反相層析和疏水層析的差異在于前者在有機(jī)相中進(jìn)行，蛋白質(zhì)經(jīng)過反向流動(dòng)相與固定相作用有時(shí)會(huì)發(fā)生部分變性，而后者通常在水溶液中進(jìn)行，蛋白質(zhì)在分離過程中一般仍保持其天然構(gòu)象。

13.蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法：紫外吸收法、BCA法、福林—酚試劑法（lowry）、考馬斯亮藍(lán)法、ELISA法等。

14.蛋白質(zhì)純度檢查的常見方法：SDS-PAGE法（最常用）、非變性PAGE法、層析法等。

15.蛋白質(zhì)序列的分析方法：N-端氨基酸序列分析法（基本原理Edman法）、C-端氨基酸序列分析法。

16.體外培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的類型：貼壁依賴性細(xì)胞，非貼壁依賴性細(xì)胞和兼性貼壁細(xì)胞。

17.動(dòng)物細(xì)胞與微生物細(xì)胞，植物細(xì)胞相比較具有的特點(diǎn)：

①比微生物細(xì)胞大得多，無細(xì)胞壁，抗機(jī)械強(qiáng)度低，對(duì)剪切力敏感，適應(yīng)環(huán)境能力差

②倍增時(shí)間長(zhǎng)生長(zhǎng)緩慢，正常二倍體細(xì)胞的生長(zhǎng)壽命是有限的③對(duì)培養(yǎng)基的要求高，易受微生物污染，培養(yǎng)時(shí)常常需要添加抗生素

④生長(zhǎng)大多需貼附于基質(zhì)，相互黏連以集群形式存在，并有接觸抑制現(xiàn)象

⑤多半將產(chǎn)物分泌在細(xì)胞外，便于收集和純化。

18.動(dòng)物細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)要求是：1.碳源不能為無機(jī)物，大多為葡萄糖

2.氮源也不能為無機(jī)物，主要為各種氨基酸

3.在很多情況下尚需添加5%-20%的小牛血清或適量的動(dòng)物胚胎浸出液

19.動(dòng)物培養(yǎng)基可分為：天然培養(yǎng)基，合成培養(yǎng)基和無血清培養(yǎng)基三大類.20.原代細(xì)胞：直接將動(dòng)物組織或器官經(jīng)過粉碎，消化而制的的懸浮細(xì)胞稱為原代細(xì)胞.21.懸浮培養(yǎng)法：是細(xì)胞在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)生長(zhǎng)繁殖的培養(yǎng)方法，它適用于一切種類的非貼壁細(xì)胞，兼性貼壁細(xì)胞，可連續(xù)測(cè)定細(xì)胞濃度，連續(xù)收集部分細(xì)胞進(jìn)行繼代培養(yǎng)，也無需消化分散，細(xì)胞收率高

22.木瓜蛋白酶水解IgG分子可產(chǎn)生兩個(gè)抗原結(jié)合片段（Fab）和一個(gè)可結(jié)晶片段（Fc）

23.胃蛋白酶水解IgG分子可產(chǎn)生一個(gè)F(ab’)2和若干裂解小分子片段（pFc’）

24..單克隆抗體技術(shù)的基本原理：基于動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)得以實(shí)現(xiàn)的，即骨髓瘤細(xì)胞與B細(xì)胞的融合。骨髓瘤細(xì)胞在體外培養(yǎng)能大量無限增殖，但不能分泌特異性抗體，而抗原免疫的B細(xì)胞能產(chǎn)生特異性抗體，但在體外不能無限增殖。將免疫B細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合后形成的雜交瘤細(xì)胞，繼承了連個(gè)親代細(xì)胞的特性，既具有骨髓瘤細(xì)胞能無限增殖的特性，又具有免疫B細(xì)胞合成和分泌特異性抗體的能力。

25.骨髓瘤細(xì)胞發(fā)生回復(fù)突變每3-6個(gè)月應(yīng)用8-氮雜鳥嘌呤（8-AG）篩選一次，以便殺死突變細(xì)胞

26.細(xì)胞融合的方法：常用的有轉(zhuǎn)動(dòng)法和離心法.27.雜交瘤細(xì)胞的克隆化的方法有：有限稀釋法和軟瓊脂平板法，顯微操作法

28.雙特異性抗體：是含有兩個(gè)不同配體結(jié)合位點(diǎn)的抗體分子，它有兩個(gè)不同的抗原結(jié)合部位（兩個(gè)臂），可分別結(jié)合兩種不同的抗原表位。其中一個(gè)可與靶細(xì)胞表面抗原結(jié)合，另一個(gè)則可與效應(yīng)物（如藥物，效應(yīng)細(xì)胞等）結(jié)合，從而將效應(yīng)物直接導(dǎo)向靶組織細(xì)胞。

29.細(xì)胞內(nèi)抗體：亦稱內(nèi)抗體，主要是指細(xì)胞內(nèi)合成并作用于細(xì)胞內(nèi)組分的抗體。

30.如何構(gòu)建噬菌體抗體庫？構(gòu)建噬菌體抗體庫通常包括以下幾個(gè)過程：1.從外周血或脾，淋巴結(jié)等組織中分離B細(xì)胞，提取mRNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA2，應(yīng)用抗體輕鏈和重鏈引物，根據(jù)建庫的需要通過PCR技術(shù)擴(kuò)增不同的抗體基因片段3，構(gòu)建噬菌體載體4，用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化細(xì)菌，構(gòu)建全套抗體庫。通過多倫的抗原親和吸附-洗脫-擴(kuò)增，最終篩選出抗原特異性地抗體克隆。篩選為關(guān)鍵環(huán)節(jié)和步驟。

31.疫苗的組成：具有免疫保護(hù)性的抗原（Ag）如蛋白質(zhì)，多肽，多糖或核酸等與免疫佐劑混合制備而成。

32.佐劑是指能非特異性的增強(qiáng)免疫應(yīng)答或改變免疫應(yīng)答類型的物質(zhì)，可先于抗原或與抗原一起注入機(jī)體。

33.目前用于人體的佐劑只有兩種：1，鋁佐劑（氫氧化鋁或磷酸鋁）2，MF59

34.滅活疫苗和活疫苗的特點(diǎn)比較：（P122,表5-4）

35.聯(lián)合疫苗包括多聯(lián)疫苗和多價(jià)疫苗，多聯(lián)疫苗可用于預(yù)防由不同病原微生物引起的傳染病，而多價(jià)疫苗僅預(yù)防同一

種病原微生物的不同亞型引起的傳染病。

36.核酸疫苗是20世紀(jì)90年代發(fā)展起來的一種新型疫苗。核酸疫苗包括DNA疫苗和RNA疫苗，由能引起機(jī)體保護(hù)性

免疫反應(yīng)的抗原的編碼基因和載體組成。核酸疫苗又稱為基因疫苗，基因免疫或核酸免疫

37.酶的分離純化過程必須遵循以下原則：

1、全部操作一般在低溫（0-4攝氏度）進(jìn)行。

2、在分離提純過程中，不能

劇烈攪拌。

3、在提純?nèi)軇┲屑右恍┍Ｗo(hù)劑，如少量EDTA,少量 –巰基乙醇等

4、在分離提純過程中要不斷測(cè)定酶的的活力和蛋白質(zhì)濃度，以對(duì)純化過程進(jìn)行檢測(cè)。一般用兩個(gè)指標(biāo)來衡量分離純化方法的好壞：總活力的回收率和比活力提高倍數(shù)。

38.傳統(tǒng)的酶固定化方法大致可分為載體聯(lián)合法，交聯(lián)法和包埋法

39.固定化對(duì)酶穩(wěn)定性的影響：

1、熱穩(wěn)定性提高

2、對(duì)有機(jī)試劑及酶抑制劑的穩(wěn)定性提高

3、對(duì)PH，蛋白酶，儲(chǔ)存

盒操作條件的穩(wěn)定性提高

40.目前常用的菌種保藏方法有：

1、斜面低溫保藏法，一般可保存1-6個(gè)月左右

2、石蠟油封存法，一般可保存1-2年左右

3、砂土管保藏法，保藏期約1-10年

4、麩皮保藏法，保藏期在一年以上

5、甘油懸液保藏法，-20度保藏期約為0.5-1年，-70度下保藏期可達(dá)10年

6、冷凍真空干燥保藏法，5-15年

7、液氮超低溫度保藏法，15年以上

8、宿主保藏法

41、產(chǎn)物產(chǎn)量的測(cè)定方法有：生物測(cè)定法和化學(xué)測(cè)定法，一般采用化學(xué)測(cè)定法，以求迅速躋身反應(yīng)生產(chǎn)情況。中國(guó)微生物菌種保藏委員會(huì)CCCCM中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC

美國(guó)典型菌種保藏中心 ATCC美國(guó)的北部地區(qū)研究實(shí)驗(yàn)室NRRL

英國(guó)的國(guó)家典型菌種保藏所NCTC日本的大阪發(fā)酵研究所IFO

德國(guó)菌種保藏中心DSM42、中間反應(yīng)產(chǎn)量測(cè)定：產(chǎn)物產(chǎn)量、ph值、糖、氨基酸、菌絲形態(tài)。

43、PH對(duì)發(fā)酵的影響有哪些？

1.PH影響酶的活性，當(dāng)PH值抑制菌體的某些酶的活性時(shí)使菌的新陳代謝受阻

2.PH影響微生物細(xì)胞膜所帶電荷的改變，從而改變細(xì)胞膜的通透性，影響微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和代謝物的排泄，因此影響新陳代謝的進(jìn)行

3.PH影響培養(yǎng)基某些成分和中間代謝物的解離，從而影響微生物對(duì)這些物質(zhì)的利用

4.PH影響代謝方向，PH不同，往往引起菌體代謝過程不同，是代謝產(chǎn)物的質(zhì)量和比例發(fā)生改變。

44、基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)的特點(diǎn)？采用基因重組技術(shù)構(gòu)建的基因工程菌與細(xì)胞，由于帶有外來基因，對(duì)其進(jìn)行培養(yǎng)和

發(fā)酵的工藝技術(shù)通常與單純的微生物細(xì)胞的工藝技術(shù)有不同之處?；蚬こ叹l(fā)酵的目的主要是實(shí)現(xiàn)外源基因的高效表達(dá)，以獲取大量的外源基因產(chǎn)物。而外源基因的高技術(shù)表達(dá)不僅涉及宿主、載體與外源基因三者之間的相互關(guān)系，與所處環(huán)境條件密切相關(guān)?；蚬こ叹l(fā)酵一般分兩個(gè)階段：前期是菌體生長(zhǎng)階段，后期是菌體生長(zhǎng)階段。

45、基因工程菌不穩(wěn)定性的原因？主要表現(xiàn)在質(zhì)粒的不穩(wěn)定性以及表達(dá)產(chǎn)物的不穩(wěn)定性。而質(zhì)粒的不穩(wěn)定性又分結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性以及分離不穩(wěn)定。結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性是由于轉(zhuǎn)位作用和重組作用所引起的質(zhì)粒DNA的重排與損失。分離的不穩(wěn)定性是細(xì)胞分裂過程中發(fā)生的不平均分配，從而造成質(zhì)粒的缺陷型分配，以致造成質(zhì)粒丟失。引起質(zhì)粒載體不穩(wěn)定性的原因只要是宿主新陳代謝負(fù)荷的加重，大量外源蛋白的形成對(duì)宿主細(xì)胞的損害，通常是致死的，失去制造外源蛋白的能力的細(xì)胞一般生長(zhǎng)的快得多，從而能替代有生產(chǎn)能力的菌株，這就導(dǎo)致了基因工程菌的不穩(wěn)定性。

46、突變生物合成：采用一些誘變劑，如紫外線，激光，高速電子流或一些化學(xué)藥物如亞硝基胍，溴化乙啶等對(duì)藥物的產(chǎn)生菌進(jìn)行誘變，是他們喪失合成某種中間體的能力，因而不能合成原來結(jié)構(gòu)的化合物，陳武阻斷突變株。在發(fā)酵培養(yǎng)這些阻斷突變株時(shí)添加某些天然或化學(xué)合成的化合物作為中間體，這些突變株能利用這些中間體合成一些新結(jié)構(gòu)的最終化合物，這個(gè)過程稱為突變生物合成。

47、微生物轉(zhuǎn)化系酶促化學(xué)反應(yīng)，具有與通常有機(jī)化學(xué)反應(yīng)不一樣的特點(diǎn)：

1.以具有活性中心和特殊空間結(jié)構(gòu)的酶作為催化劑

2、對(duì)作用的基質(zhì)有嚴(yán)格的選擇性和專一性

3、酶催化反應(yīng)的速度極高，非一般催化劑可比

4、一般在常溫常壓下進(jìn)行，反應(yīng)條件溫和

48、微生物對(duì)甾體轉(zhuǎn)化反應(yīng)的特點(diǎn)：在微生物轉(zhuǎn)化過程中，專一，有效的菌體量的多少，以及甾體底物在水相的溶解

性等問題成為影響轉(zhuǎn)化率的重要因素，目前采用的兩階段發(fā)酵及兩相發(fā)酵方法很好的解決了這些甾體微生物轉(zhuǎn)化中的問題。

49、蛋白質(zhì)藥物對(duì)化學(xué)修飾的意義：

50、最常用的修飾劑有：主要是水溶性高分子聚合物，如葡聚糖、右旋糖苷、肝素以及低分子肝素、多聚唾液酸、聚

乙烯吡咯烷酮、聚氨基酸、PEG、白蛋白等。目前以PEG最常用的。其毒性小、無抗原性、溶解性良好。

51、修飾策略有隨機(jī)修飾與定點(diǎn)修飾兩類。氨基修飾主要用隨機(jī)修飾，在利用特定的修飾劑可以實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)修飾。巰基

修飾多為定點(diǎn)修飾。羧基修飾為定點(diǎn)修飾。

52、選擇PEG修飾劑應(yīng)該考慮的因素：PEG的Mr，修飾位點(diǎn)，水解穩(wěn)定性和反應(yīng)活性。

53、核酶：核酶不是普通的蛋白質(zhì)酶，而是一類具有催化活性的核酸分子。目前已知的具有核酶催化功能的RNA結(jié)

構(gòu)至少可以分成5類：發(fā)夾狀核酶，錘頭狀核酶，I型內(nèi)含子核酶，RNaseP核酶，丁型肝炎病毒核酶等

54、反義核酸：是指具有抑制基因表達(dá)作用。包括反義RNA、反義DNA分子，由部分RNA和部分DNA形成RNA-DNA

嵌合分子，以及經(jīng)高度化學(xué)修飾的寡聚核酸類似物，這些分子統(tǒng)稱反義核酸類藥物。

55、褔米韋生經(jīng)美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市成為第一個(gè)反義核酸類藥物。

56、RNAi:即RNA干擾現(xiàn)象，是近幾年發(fā)現(xiàn)的一種由雙鏈RNA誘導(dǎo)的基因表達(dá)調(diào)控和基因沉默過程。主要階段：

啟動(dòng)階段和執(zhí)行階段

57、小干擾RNA(siRNA)：在啟動(dòng)階段，當(dāng)細(xì)胞由于病毒感染等原因出現(xiàn)雙鏈RNA分子或帶有較長(zhǎng)雙鏈的發(fā)卡結(jié)構(gòu)

RNA時(shí)，細(xì)胞中的Dicer的核酸酶會(huì)識(shí)別其雙鏈RNA，將其降解成21~23bp長(zhǎng)的小干擾RNA。主要參與RNA干擾（RNAi）現(xiàn)象，以帶有專一性的方式調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。