第一篇：自考現(xiàn)代生物制藥技術(shù)

自考現(xiàn)代生物制藥技術(shù)

一、名詞概念

二、知識點(diǎn)

自考現(xiàn)代生物制藥技術(shù)

吉林大學(xué)現(xiàn)代生物制藥技術(shù))

一、名詞概念 1.生物工程：應(yīng)用生物科學(xué)17微細(xì)胞：是某些細(xì)菌的突變株在生長期間產(chǎn)生的一類微小的圓形的無核細(xì)胞，它具細(xì)胞壁及細(xì)胞膜、DNA上，并引入受體細(xì)胞，從而可使受體細(xì)胞獲得外源基因的遺傳信息，并進(jìn)行正常的復(fù)制，表達(dá)和遺傳。細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)。

52半連續(xù)培養(yǎng)法：在反應(yīng)器中投料和接種，培養(yǎng)一段時(shí)間后，將培養(yǎng)液和新鮮培的理論、方法，按照人們設(shè)計(jì)的藍(lán)圖，改良加工生物或用生物及其制備物作為加工原料，以提供所需生物制品為人類社會(huì)服力的綜合性科學(xué)技術(shù)。

2.養(yǎng)液進(jìn)行交換的掊養(yǎng)方法，稱為半連續(xù)培養(yǎng)法。

53動(dòng)物細(xì)胞工程：根據(jù)細(xì)胞生物學(xué)及工程學(xué)原理定向改造動(dòng)物細(xì)胞遺傳性、創(chuàng)造新物種，通過工程化為人類提供名貴藥品服務(wù)的技術(shù)，稱為動(dòng)物細(xì)胞工程。54動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)：在一定條件下，通過人工供給營養(yǎng)物質(zhì)及生長因子，使離體動(dòng)物細(xì)胞或組織生長繁殖的方法，稱為動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。

55細(xì)胞塊培養(yǎng)法：將動(dòng)物組織切成直徑1～2mm小塊，進(jìn)行培養(yǎng)的方法，稱為組織塊培養(yǎng)法。

56細(xì)胞單層培養(yǎng)法：動(dòng)物組織塊經(jīng)銷化分散成單個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)塊后，粘附于培養(yǎng)容器表面培養(yǎng)成新生細(xì)胞單層的培養(yǎng)法，稱為細(xì)胞單層培養(yǎng)法。

57單細(xì)胞分離培養(yǎng)：動(dòng)物組織分散后，將其單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)成純系細(xì)胞集群的技術(shù)，稱之為單胞分離培養(yǎng)。58確立細(xì)胞株：正常細(xì)胞在移植繼代過程中，有些細(xì)胞增殖力突增強(qiáng)，在特定條件下可無限繁殖，與初代細(xì)胞相比，其形態(tài)、生理生化特性，病毒敏感生，抗原性及染色體結(jié)構(gòu)均發(fā)生變化，具有致癌性，這些細(xì)胞稱為確立細(xì)胞株。

59動(dòng)物體細(xì)胞雜交技術(shù)：在外力作用下，令兩上或兩上以上異源細(xì)胞合并為一個(gè)多核細(xì)胞的過程，稱為動(dòng)物體細(xì)胞雜交技術(shù)。

60核體：細(xì)胞核連同其外表薄層細(xì)胞質(zhì)構(gòu)成的顆粒稱為核體。

61胞質(zhì)體：不具有細(xì)胞核的細(xì)胞稱為胞質(zhì)體。

62微核雜種細(xì)胞：按完整細(xì)胞之間的融合方式，將微核與另一完整細(xì)胞融合，使后者獲得另一種細(xì)胞中的若干個(gè)染色體，所獲融合子稱為微核雜種細(xì)胞。

63抗藥性篩選系統(tǒng)：利用生物細(xì)胞對藥物敏感性差異篩選雜種細(xì)胞的方法。64營養(yǎng)缺陷型細(xì)胞：在一些營養(yǎng)物質(zhì)的合成能力上出現(xiàn)缺陷，因此必須在基本培養(yǎng)基中加入相應(yīng)的有機(jī)成分才能正常生長的變異細(xì)胞。

65營養(yǎng)互補(bǔ)選擇法：利用兩種親本細(xì)胞營養(yǎng)互補(bǔ)作用原理篩選雜種細(xì)胞的方法稱為營養(yǎng)互補(bǔ)選擇法。66雜交瘤技術(shù)：骨髓瘤細(xì)胞與免疫淋巴細(xì)胞融合制自考現(xiàn)代生物制藥技術(shù)

備雜種細(xì)胞的方法為雜交瘤技術(shù)。

67雜合瘤：骨髓瘤細(xì)胞與免疫淋巴細(xì)胞融合制備的雜種細(xì)胞稱為雜合瘤。68微載體培養(yǎng)法：將細(xì)胞吸附于微載體表面的培養(yǎng)方法。

69酶工程：應(yīng)用酶的特異性催化功能并通過工程化為人類生產(chǎn)有用產(chǎn)品及提供有益服備的技術(shù)為本酶工程。

70酶：生物體內(nèi)具有特殊催化功能的蛋白質(zhì)稱為酶。85腫瘤壞死因子：是一種由巨噬細(xì)胞分泌能產(chǎn)生細(xì)胞素，使腫瘤細(xì)胞溶解的因子。

86干擾素：是一類在同種細(xì)胞上具有廣譜抗病毒活性的蛋白質(zhì)，其活性的發(fā)揮又受細(xì)胞基因組的調(diào)節(jié)和控制，涉及RNA和蛋白質(zhì)的合成。

87集落刺激因子：CSF為一組糖蛋白物質(zhì)，由淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞自然產(chǎn)生，有刺激紅細(xì)胞系以外造血細(xì)胞增殖和分化的作用。

質(zhì)粒。

11．雄性大腸桿菌表面的性纖毛是一種接合質(zhì)粒形成的表面物質(zhì)。12．根據(jù)質(zhì)粒在細(xì)胞中拷貝數(shù)的不同，可把質(zhì)粒分為松馳型質(zhì)粒和嚴(yán)緊型質(zhì)粒。13．嚴(yán)緊質(zhì)粒大多為具有自身傳遞能力的大質(zhì)粒。14．分子量較大，自身傳遞上嚴(yán)緊型質(zhì)粒的特點(diǎn)。15．分子量較小，不具自身傳遞性是松馳型質(zhì)粒的特點(diǎn)。16．基因工程中使用的質(zhì)粒39．大腸桿菌DNA連接酶只能催化DNA雙鏈的單鏈缺口和帶粘性末端的雙鏈DNA。

40．TDT即末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶。

41．DNA連接酶的最適溫度

0

是37C。42．連接反應(yīng)溫度應(yīng)介于催化反應(yīng)與末端粘合之間。43．根據(jù)受體系統(tǒng)不同，基因工程可分為微生物基因工程、動(dòng)物基因工程和植物基因工程。44．關(guān)于感受態(tài)本質(zhì)的假說71固定比酶：限制或定位于特定空間位置的酶稱為固定化醇。

72固定化細(xì)胞：被限制或定位于特定空間位置的細(xì)胞稱為固定化細(xì)胞。

73載體結(jié)合法：將細(xì)胞懸浮液直接與水不溶性轂體相結(jié)合的固定化方法。74包埋法：將細(xì)胞定位于凝膠網(wǎng)格內(nèi)的技術(shù)稱為包埋法。

75偶聯(lián)效率：偶聯(lián)固定化反應(yīng)過程中載體結(jié)合蛋白質(zhì)的能力稱為偶聯(lián)效率。QQ：806235356 76酶活力：醇類催化特定化學(xué)反應(yīng)的能力稱為酶活力。

77酶比活：指每毫克酶蛋白所表現(xiàn)的活力。

78固定化反應(yīng)的酶活力回收串：固定醇所顯示的活力與加入偶聯(lián)液中酶總活力的比值稱為固定化反應(yīng)的酶活力回收率。

79酶試劑盒；將酶、反應(yīng)試劑、穩(wěn)定劑、激活劑，填充劑、及緩沖劑等配成檢測用的混合制劑稱酶試劑盒。80細(xì)胞因子：是人類或動(dòng)物的各類細(xì)胞分泌的具有多樣生物活性的因子，是可溶性物質(zhì)，是一組不均一的蛋白質(zhì)分子，能調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長與分化。

81白細(xì)胞介素：由白細(xì)胞或其它細(xì)胞產(chǎn)生的又在白細(xì)胞間起調(diào)節(jié)作用和介導(dǎo)作用的因子。

82.IL-3：即白細(xì)胞介素3，由激活的T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，能刺激多能造血干細(xì)胞和各系細(xì)胞的分化和增殖，促進(jìn)和維持肥大細(xì)胞的增殖，增殖中性粒細(xì)胞、酸性粒細(xì)胞的活性，促進(jìn)NX細(xì)胞殺傷實(shí)體瘤的活性。

83.IL-10：由TH2細(xì)胞產(chǎn)生，能抑制TH1細(xì)胞合成因子的能力，是一種糖蛋白。84.IL-12：是由B淋巴細(xì)胞分泌的一種細(xì)胞因子，分子量為75KD的糖蛋白，其主要作有得促進(jìn)PHA活化的PBMC增殖以及亞適劑量IL-2協(xié)同促進(jìn)作用。88超誘導(dǎo)：是指細(xì)胞在某都是松馳型質(zhì)粒。種大分子合成抑制物的適17．松馳型質(zhì)?？杀宦让顾禺?dāng)作用，誘生蛋白合成增加擴(kuò)增。的現(xiàn)象。

18．細(xì)菌收獲可通過離心進(jìn)89生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑：是生行。

物體體內(nèi)的某些細(xì)胞和某19．細(xì)菌裂爭可采用：非離些分子，它們既是機(jī)體對內(nèi)子型或離子型去污劑，有機(jī)外環(huán)境刺激應(yīng)答的效應(yīng)機(jī)溶劑，堿處理及加熱處理。制，也是機(jī)體維持內(nèi)環(huán)境的20．λ噬菌體長約48.5kb。穩(wěn)定因素。21．野生型λ噬菌體為雙鏈

線形分子，具有12個(gè)堿基

二、知識點(diǎn) 的粘性末端，進(jìn)入大腸桿菌

包括局部原生質(zhì)體化假說及酶受體假說。45．大腸桿菌感受的制備方法包括Hanahan法，氯化鈣法及電轉(zhuǎn)化法。46．局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)只能轉(zhuǎn)導(dǎo)宿主染色體上少數(shù)基因。47．普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)可轉(zhuǎn)導(dǎo)宿主染色體上任何基因。

48．β-半乳糖基因插入失活法的重組質(zhì)粒產(chǎn)生白色菌落。

49．不帶β-半糖苷酶活性蛋白的菌落中央也可出現(xiàn)淡藍(lán)色斑點(diǎn)。50．動(dòng)植物病毒也可作為外源基因的載體。51．目的基因重組克隆的篩選方法包括：根據(jù)重組體表型篩選，重組體結(jié)構(gòu)分析法，檢測目的基因法及檢測目的基因表達(dá)產(chǎn)的法。52．原核生物中基因表達(dá)以操縱子形式進(jìn)行。

53．原核生物細(xì)胞沒有核膜，因此表達(dá)過程中的轉(zhuǎn)錄與翻譯往往同時(shí)進(jìn)行。54．原核生物的mRNA在翻譯完畢之后，隨即被水解掉。

55．真核生物轉(zhuǎn)錄成不均-RNA之后，還需加工，如

去掉內(nèi)含子，修飾，加工5，末端和3，末端。56．基因工程中基因表達(dá)的研究，是指外源基因在某一種細(xì)胞中的表達(dá)活動(dòng)。57．大腸桿菌，酵母與哺乳動(dòng)物細(xì)胞三大基因表達(dá)體系已成為當(dāng)前基因工程工業(yè)性生產(chǎn)的核心。58．基因表達(dá)合成功能蛋白的基本條件是依賴于基因的有效轉(zhuǎn)錄，mRNA正確的轉(zhuǎn)譯和轉(zhuǎn)譯后的加工。59．閱讀框架是由起始密碼子決定的。60．用于保證目的基因處于正確的閱讀框架中的方法有：選用適當(dāng)?shù)拿盖形稽c(diǎn)；用人工接頭調(diào)節(jié)閱讀框架；構(gòu)建一組適合不同閱讀框架的載體。61．基因的表達(dá)受到啟動(dòng)子等調(diào)控元件的控制。62．基因的高效表達(dá)必須依賴一個(gè)強(qiáng)的啟動(dòng)子。自考現(xiàn)代生物制藥技術(shù)

63．適當(dāng)?shù)膯?dòng)子，只能保證目的基因的正確轉(zhuǎn)錄，而并不能保證基因的完全正確表達(dá)。64．對已知功能的基因表達(dá)產(chǎn)物的檢測，可以采用蛋白質(zhì)電泳，免疫擴(kuò)散和凝集，酶聯(lián)免疫和放射免疫等方法。65．對未知目的基因功能的表達(dá)產(chǎn)物的檢測方法是在18．水的主要生理功能是參與代謝反應(yīng)，作為反應(yīng)的價(jià)質(zhì)，提供氫、氧元素；參與物質(zhì)運(yùn)輸；傳遞熱量，調(diào)節(jié)體溫。19．培養(yǎng)基中的生長因素的主要功能是作為酶的重要組成成分。20．化學(xué)物質(zhì)來菌只適用于局部空間或某些器械消毒。21．用于輻射滅菌的射線有性營養(yǎng)環(huán)境不利于放線菌

孢子形成。

43．一般情況下，干燥和限制營養(yǎng)可直接或間接誘導(dǎo)放線菌孢子形成。

44．霉菌的孢子培養(yǎng)，一般以大米、小米、玉米、麥米、麥粒等天然農(nóng)產(chǎn)品為培養(yǎng)基。45．細(xì)菌的斜面基多采用碳源限量而氮源豐富的配方。4．植物細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)法是懸浮、微室、平板、看護(hù)、懸滴及單花粉等多種培養(yǎng)方式。

5．懸浮培養(yǎng)特點(diǎn)是培養(yǎng)過程中，細(xì)胞總數(shù)不斷增加，一定時(shí)間后產(chǎn)量達(dá)最高點(diǎn)，生長趨于停止。

6．植物細(xì)胞接種濃度通常

4為2.5×10～5.0×10細(xì)胞/毫升。

攜帶有重組體分子的細(xì)胞中尋找新合成的蛋白質(zhì)。66．應(yīng)用大細(xì)胞系統(tǒng)檢測基因表達(dá)時(shí)，主要是利用質(zhì)?；颚溯d體擴(kuò)增的途徑。67．微細(xì)胞不含有染色體DNA。

68.HbsAg是指乙肝表面抗原。

69．HGH是指人生長激素。70．HGH可以治療侏儒癥，促進(jìn)燒傷及骨折等創(chuàng)傷性組織的恢復(fù)。

7．植物細(xì)胞單細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)有平板培養(yǎng)法，微室培養(yǎng)法、看護(hù)培養(yǎng)法等。

8．微室培養(yǎng)法的優(yōu)點(diǎn)是可直接觀察分裂繁殖及分化全過程，胞質(zhì)環(huán)流規(guī)律及線粒體生長與分裂活動(dòng)，亦可進(jìn)行連續(xù)觀察原生質(zhì)體融合，細(xì)胞壁再生及融合后細(xì)胞分裂活動(dòng)，同時(shí)可進(jìn)行顯微攝像。

9．看護(hù)培養(yǎng)法培養(yǎng)時(shí)間較微室培養(yǎng)長。10．細(xì)胞突變的主要原因是染色體缺失、重復(fù)、倒位、異位、堿基順序轉(zhuǎn)換、顛換及移碼所引起。11．植物細(xì)胞培養(yǎng)物易發(fā)生自發(fā)突變，其突變頻率在10-7～10-6

之間。12．人工誘發(fā)植物細(xì)胞突變的化學(xué)因素主要有堿基類似物、烷化劑、抗生素等。13．篩選植物突變細(xì)胞的目的在于獲得某些藥物高產(chǎn)細(xì)胞株或某些物質(zhì)轉(zhuǎn)化的高產(chǎn)酶細(xì)胞株。14．篩選細(xì)胞突變體主要依據(jù)細(xì)胞表型變化。15．自離體植物細(xì)胞培養(yǎng)物中篩選細(xì)胞突變體的方法有直接選擇法，間接選擇法及綠島法。16．植物細(xì)胞培養(yǎng)物處于無組織無器官分化的分散狀態(tài)時(shí)許多重要基因并不表達(dá)。17．目前已建立植物細(xì)胞種質(zhì)保存法有：干燥保存法，液體石蠟覆蓋法，低溫保存法，低壓低氧保存法及超低溫深凍保存法。18．超低溫深凍保存法系將

植物種質(zhì)于-1960

C的液氮中保存。

19．常用的凍凍保護(hù)劑有DMSO，甘油，PEG，葡萄糖、山梨糖及蔗糖。20．為提高存活力，凍存材料應(yīng)選用抗寒力強(qiáng)的幼齡培養(yǎng)細(xì)胞。

21．對于種子、花粉、球莖等高度脫水材料可以采用快速降溫的凍存。22．對于不耐寒植物細(xì)胞需采用慢速冰凍法。23．對于木本植物冬芽凍存

物需于00

C慢速化凍。24．深凍細(xì)胞活力及存活率測定的方法有再培養(yǎng)法、二醋酸熒光素染色法及氯化自考現(xiàn)代生物制藥技術(shù)

三笨四氮唑還原法。25．再培養(yǎng)法是檢查細(xì)胞活力的根本方法。26．植物原生質(zhì)體制備的材49．以組織塊為材料的培養(yǎng)方法叫組織塊培養(yǎng)法。50．細(xì)胞培養(yǎng)包括細(xì)胞及細(xì)胞團(tuán)塊單層培養(yǎng)及單細(xì)胞程謂之電場誘導(dǎo)融合作用。72．完整細(xì)胞間融合是擴(kuò)大生物變異的有效手段。73．兩種完整細(xì)胞融合時(shí)，95．微載體培養(yǎng)優(yōu)點(diǎn)在于兼有固定化培養(yǎng)與懸浮培養(yǎng)的雙重特點(diǎn)。

95．動(dòng)物細(xì)胞生長緩慢，又料應(yīng)用較多的是葉片，愈傷組織及懸浮培養(yǎng)細(xì)胞。27．高等植物細(xì)胞壁主要成分為纖維素，其次為半纖維素，果膠質(zhì)及蛋白質(zhì)。28．植物原生質(zhì)體制備時(shí)的脫壁酶有纖維素酶，果膠酶，斗纖維素酶，蝸牛酶及崩潰酶。

29．纖維素酶使用時(shí)的pH值為5.4。

30．果膠酶最適pH值為5.8。31．纖維素酶及果膠酶混合使用的pH值為5.4～5.6之間。

32．脫壁酶液采用0.45μm微孔濾膜過濾除菌。33．純化植物原生質(zhì)體的方法有離心法、飄浮法、界面法及滴洗法。34．植物原生質(zhì)體活力測定方法有：根據(jù)形態(tài)特征判斷其活力，活體染色法及光染料活體染色法。35．大多數(shù)植物原生質(zhì)培養(yǎng)1～3day，即再生新細(xì)胞壁。36．大多數(shù)植物原生質(zhì)體通常在1～2周內(nèi)發(fā)生

具有錨地依賴依。96．組織纖維溶酶原激活劑是一川絲氨酸蛋白酶。97．抗乙型肝炎表現(xiàn)抗原單克隆抗體是專一性識別HbsAg的單一抗體。98．體外法生產(chǎn)單克隆抗體是使雜交瘤細(xì)胞在人工反應(yīng)器內(nèi)大規(guī)模培養(yǎng)并表達(dá)相應(yīng)抗體。99．體內(nèi)法生產(chǎn)克隆抗體是利用生物體為細(xì)胞反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞生產(chǎn)抗體的方法。

100．檢出分泌特異抗體細(xì)胞后，應(yīng)即時(shí)進(jìn)行克隆化篩選與鑒定，以免非必需細(xì)胞過分生長。QQ：806235356

定的是IFNa。37．干擾素的受體主要存在于細(xì)胞膜中。

38．白介素-2的生物學(xué)作用主要是刺激細(xì)胞增生。39．酵母屬于真核生物，大腸肝菌，放線菌及蘭細(xì)菌等屬于原核生物，但它們均為單細(xì)胞生物。

40．NK細(xì)胞對射線照射最為敏感。

41．CTL細(xì)胞對射線照射最為敏感。

42．B細(xì)胞具有表面球蛋白，而T細(xì)胞、NK細(xì)胞，K細(xì)胞的表面則不具有表面球蛋白。

44．TNF對蛋白酶最為敏感。45．具有生物活性的腫瘤壞死因子為三聚體構(gòu)型。46．細(xì)胞因子使用的最終效應(yīng)部位在細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)。47．細(xì)胞因子多為單鏈分子，其基因多由多個(gè)外顯子和內(nèi)含子組成，但其基因均為單拷貝。

48．IL-5對細(xì)胞的作用包括增強(qiáng)B細(xì)胞的功能，促進(jìn)活性B細(xì)胞分泌，并可誘導(dǎo)B細(xì)胞表達(dá)IL-2受體。49．IL-8可來源于單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、T細(xì)胞等。

50．IFN的蛋的產(chǎn)物包括IFN-α，IFN-β及IFN-y。51．IFN-β在成纖維細(xì)胞中誘生。

52．IFN也可誘生IFN。53．TNF也可誘生IFN。54．IFN可抑制病素的生活周期的許多階段，包括病毒的吸附和脫殼、早期病毒轉(zhuǎn)錄、病毒轉(zhuǎn)譯、蛋白合成及從細(xì)胞表面芽生。

55．EPO的主要來源為腎小管，腎間質(zhì)細(xì)胞。56．可導(dǎo)致EPO生成增加的因素包括高原氣候、冠心病、肺心病、溶血性貧血等。57．細(xì)胞因子研究發(fā)展前景包括細(xì)胞因子的加工改造，細(xì)胞因子的受體及其免疫調(diào)節(jié)的信息傳遞，細(xì)胞因子基因表達(dá)的調(diào)控，分子水平上了解在疾病治療中的作用以及作為有效的免疫佐自考現(xiàn)代生物制藥技術(shù)

劑。58．天然干擾素是一種糖蛋白。

59．干擾素對蛋白酶敏感。60．干擾素可導(dǎo)致病毒繁殖中斷。61．干擾素具有廣泛的抗病毒活性。62．干擾素基因在正常生理狀態(tài)下不表達(dá)。

63．IFN對免疫功能的調(diào)節(jié)作用包括增強(qiáng)巨噬細(xì)胞活力，使補(bǔ)體水平下降及延長同種移植物的排斥反應(yīng)。84．細(xì)胞因子很難用常規(guī)方法純化。

86．TNF具有抗腫瘤作用。87．誘導(dǎo)TEF合成須經(jīng)過兩個(gè)階段：起動(dòng)期、促發(fā)期。88．TNF經(jīng)鑒定有兩類：TNFα，TNFβ。

89．TNF分子量因來源不同，制備方法不同及測定方法不同相差較大。

90．TNF與其它細(xì)胞因子，化療藥物聯(lián)合作用可以降低TNF劑量及副作用，提高療效。制，是以雙鏈DNA庫間媒介；利于體外純化；（2）不論單鏈DNA還是雙鏈復(fù)制形式DNA均能夠感染大腸桿菌；（3）單鏈DNA噬菌體顆粒的大小，是受其DNA多制約，而不存在包裝限制問題；（4）可以容易地測定出外源DNA片段的插入取向。

9．T4DNA連接酶的作用機(jī)制：（1）T4DNA連接酶與輔因子ATP形成酶-AMP復(fù)合物；25mMTris-HCL(pH8.0),10m

M EDTA Ph8.0）中劇烈振蕩；（4）加200μl親配制液溶液II（0.2M NaOH1%SDS）,混合內(nèi)容物，不要振蕩，置冰上；（5）加150μl冰預(yù)冷溶液III（5M Kac60ml,冰乙酸11.5ml,水28.5ml），溫和振蕩10s置

0

于闊步3-5min；（6）4C。12000rpm離心5min，轉(zhuǎn)移上清；（7）上清加等量酚；

0

氯仿抽提，4C，12000rpm離心2min，收集上清；（8）64．人白細(xì)胞干擾素制劑的半成品檢定包括比活性測定、無菌試驗(yàn)、余毒試驗(yàn)、安全試驗(yàn)及硫氰酸鉀殘余量檢測。65．干擾素制劑大劑量使用的最佳途徑是批注，皮下注射。66．干擾素制劑的局部用藥多采用噴霧、貼敷、滴鼻。67．干擾素臨床應(yīng)用的適應(yīng)癥包括急性病毒性感染、慢性病毒性感、惡性腫瘤、器官移植患者、乙型腦炎等。68．T細(xì)胞的激活與增殖包括三個(gè)時(shí)期，即細(xì)胞產(chǎn)生白介素-2及其受體表達(dá)，細(xì)胞進(jìn)入不依賴白介-2的增殖期。

69．白介素-2的臨床應(yīng)用包括抗病毒感染、抗細(xì)菌感染、抗腫瘤及艾滋病的治療等。70．關(guān)于集落刺激因子的特性，目前認(rèn)為四種集落刺激因子無序列同源性，均為糖蛋白分子，四種集落刺激因子各有特征的膜受體。71．紅細(xì)胞生成素的臨床應(yīng)用包括慢性腎功能衰竭、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、癌性貧血、早產(chǎn)嬰兒自體輸血及用于外科手術(shù)的輔助治療等。72．細(xì)胞因子大都是糖蛋白類物質(zhì)。73．糖基成份對細(xì)胞因子活性影響不大。

74．IL-lα與IL-1β可識別相同的受體。

75．LPS可誘導(dǎo)單核細(xì)胞但不能誘導(dǎo)皮膚纖維母細(xì)胞產(chǎn)生IL-8。76．去除糖鏈后IL-10的抗原性不受影響。

77．TNF發(fā)揮作用有相對的細(xì)胞周期特異性。

78．TNF直接注入是很有效的。79．體內(nèi)IFN通常在嚴(yán)格的誘導(dǎo)控制下產(chǎn)生。

80．IFN可以抑制正常細(xì)胞的生長。

81．對晚期癌癥IFNy不優(yōu)于IFNα。82．體外實(shí)CSF可引起腫瘤細(xì)胞增殖。83．高原居民的EPO年成增加。

（2）酶-AMP復(fù)合物再結(jié)合三、重點(diǎn)問題 到具有5，一磷酸基與3，羥1．重組DNA技術(shù)通常包括： 基切口的DNA上，使DNA（1）基因重組載體的選擇腺苷化。（3）產(chǎn)生一個(gè)新的和制備；（2）目的基因的分磷酸二酯鍵，把缺口封起離純化；（3）目的基因與載來。

體的重組；（4）重組克隆的10．DNA連接反應(yīng)中的注意轉(zhuǎn)化與感染；（5）重組克隆事項(xiàng)： 的篩選與鑒定；（6）目的基（1）連接及反應(yīng)溫度；（2）因的表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物的分防止粘末端的自身環(huán)化應(yīng)離與提純；

采取以下措施：①控制載體2．載體的基本條件： 與外源DNA分子的濃度與（1）本身是一個(gè)復(fù)制子，比例；②用堿性磷酸酶處理能自我復(fù)制；（2）分子量要載體防止自身環(huán)化；③定向小；（3）帶選擇標(biāo)記，以便克??；（3）用λDNA和科斯進(jìn)入宿主細(xì)胞后有可辨認(rèn)質(zhì)粒的載體時(shí)的連接；①λ的表型特征；（4）對幾種限D(zhuǎn)NA載體應(yīng)考慮兩個(gè)參數(shù)：制性酶有單一切點(diǎn)：（5）有插入分子左右臂的比例，兩一定的非必要區(qū)，在這段插者的濃度；②科斯質(zhì)粒常用入外源基因不影響其復(fù)制。兩種方法連接，一種是用堿3．可作為載體的有： 性磷酸酶處理，另一種是多（1）質(zhì)粒；（2）λ噬菌體；酶反應(yīng)進(jìn)行的克隆。（3）M13噬菌體；（4）科11．受體細(xì)胞一般具有的性斯質(zhì)粒；（5）動(dòng)、植物病毒。能：

4．選擇裂解細(xì)菌的方法取（1）有接受外源DNA的能決于：

力；（2）限制系統(tǒng)缺陷或限（1）質(zhì)粒的大??；（2）大制與修飾系統(tǒng)均缺陷型；腸桿菌菌株；（3）裂解后用（3）DNA重組缺陷型；（4）于純化質(zhì)粒DNA的技術(shù)； 不適于在非培養(yǎng)條件下生5．選擇裂解細(xì)胞的一般準(zhǔn)存。

則：

12．DNA分子轉(zhuǎn)化機(jī)理：（1）大質(zhì)粒（大于15Kb）（1）吸附：完整的雙鏈DNA易受損，故應(yīng)采用溫和裂解分子吸附在受體菌的表面；法（SDS裂解法）從細(xì)胞中（2）轉(zhuǎn)入：雙鏈DNA分子釋放出來；

解鏈，單鏈DNA進(jìn)入受體（2）對于小質(zhì)粒，可加入菌，另一鏈降解；（3）自穩(wěn)：EDTA后采用溶菌酶處理，外源質(zhì)粒DNA分子在細(xì)胞再通過煮沸或堿處理使之內(nèi)又復(fù)制成雙鏈環(huán)狀DNA裂解。

（4）表達(dá)：供體基因隨同6．λ噬菌體作為克隆載體復(fù)制子同時(shí)復(fù)制，并被轉(zhuǎn)錄的特點(diǎn)是：

和翻譯。（1）λ噬菌體可在體外包13．基因表達(dá)的三個(gè)基本條裝成病毒顆粒，高效地轉(zhuǎn)染件：

大腸桿菌；（2）λDNA的長（1）基因的密碼區(qū)不能被度只有在野生λ噬菌體的插入序列所中斷；（2）基因75%-105%之間才能夠包裝；必須在啟動(dòng)子控制之下；（3）λ噬菌體適于克隆大（3）mRNA必須相當(dāng)穩(wěn)定并片段DNA及組建基因文庫。有效轉(zhuǎn)譯，產(chǎn)生的外源蛋白7．科斯質(zhì)粒的特點(diǎn)是： 不被宿主很快降解。

（1）具有λ噬菌體的特性，14．堿裂解法制備質(zhì)粒DNA能高效地轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，但的方法：

它不含λ噬菌體的全部必（1）接種菌落于含抗生素要基因，不能裂解生成噬菌的LB中，370

C劇烈振蕩反斑；（2）具有質(zhì)粒載體的特應(yīng)；（2）培養(yǎng)液性，帶有質(zhì)粒的抗性基因而40

C12000rpm30min離心；易于篩選。

（3）重懸細(xì)菌于100μl8．M13載體的優(yōu)點(diǎn)： 冰預(yù)冷的溶液I（50mM葡萄（1）單鏈DNA噬菌體的復(fù)

糖，加入2倍體積乙醇，振蕩混合，室溫放置2min；（9）40

C，12000rpm，離心5min，棄上清；（10）倒置離心管，傾干液體；（11）1ml70%乙

醇40

C洗滌沉淀，棄上清，空氣中干燥10min；（12）用500μl含無DNA酶的胰RNA酶（20μg/ml）的TE重新溶解核酸，振蕩，貯于

-200

C。15．配制工業(yè)發(fā)酵培養(yǎng)基的一般要求：（1）營養(yǎng)物質(zhì)的組成比較豐富，濃度恰當(dāng)，能滿蹉力種發(fā)芽和生長繁殖成大量的有生理功能的菌絲體之需要；（2）在一定條件下，所采用的原料彼此之間不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，理化性質(zhì)相對穩(wěn)定；

（3）粘度適中，最有適當(dāng)?shù)臐B透壓；（4）要考慮所采用的原材料的品種和濃度，與代謝產(chǎn)物生物合成過程中的調(diào)節(jié)關(guān)系；（5）生產(chǎn)過程中，既不影響通氣與攪拌的效果，又不影響產(chǎn)物的分離，精制，以及廢物的處理。（6）原材料盡量做到因地制宜，質(zhì)優(yōu)價(jià)廉，成本低。16．培養(yǎng)基的配制原則：1）營養(yǎng)成分配制原則：2）營養(yǎng)成分配比應(yīng)恰當(dāng)；（3）滲透壓應(yīng)合適；（34）pH值應(yīng)合適；（5）氧化還原電位需符合要求。17．工業(yè)微生物篩選一般要求：（1）穩(wěn)定而高產(chǎn)的遺傳特性；（2）抗噬菌體能力強(qiáng)；（3）發(fā)酵過程泡沫少；（4）需氧量低；（5）底物轉(zhuǎn)化率高；（6）對培養(yǎng)基和前體耐受力強(qiáng)；（7）營養(yǎng)特性；（8）最適溫度高；（9）菌種既要高的遺傳穩(wěn)定性，又要有基因操作的可修飾性；（10）產(chǎn)物微生物常用的分離篩選途徑： 18．工業(yè)微生物常用的分離篩選途徑：（1）從菌種保存機(jī)構(gòu)的已知菌種中分離；（2）從自然界中分離篩選；（3）從生產(chǎn)過程中分離篩選。

19．單孢子懸液的制備方法：（1）對于細(xì)菌，因其在固體斜面培養(yǎng)基上常粘在一起，故要求轉(zhuǎn)接到新鮮肉自考現(xiàn)代生物制藥技術(shù)

湯液體中進(jìn)行培養(yǎng)，以取笪分散且生長活躍的菌體；（2）對放線菌和霉菌的孢子，采用玻璃珠或石英砂振蕩打散孢子后，用濾紙或棉花過濾。20．原生質(zhì)體融合技術(shù)的特點(diǎn)：（1）打破物種界限，可實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)緣雜交；（2）可實(shí)現(xiàn)兩上以上同種或不同種微生物細(xì)胞融合；（3）原生質(zhì)體易于受到誘變劑的作用而成為較好的誘變對象；（4）可使重組頻率大大提高。

21．微生物菌種保存方法：及基因型變異；2）森林及土地?zé)o止盡開發(fā)利用，自然種質(zhì)庫破壞，需建產(chǎn)人工種質(zhì)庫；（3）細(xì)胞工程中獲得的中草藥及農(nóng)作物優(yōu)良品種的特殊變異細(xì)胞及雜種細(xì)胞，常規(guī)保存法易于變異，需進(jìn)行種質(zhì)資源廣泛收集與長期保存；（4）細(xì)胞培養(yǎng)建立的人工種質(zhì)庫可節(jié)省土地與勞務(wù)。29．植物原生質(zhì)體制備的預(yù)處理方法：（1）預(yù)質(zhì)壁分離；（2）預(yù)培養(yǎng)；（3）暗處理；（4）光處理；（5）低溫處理； 38．動(dòng)物細(xì)胞融合的基本過

程：取數(shù)量(10-10個(gè)/ml)的兩種親本細(xì)胞充分混合，離心除去上清液，取下層細(xì)胞懸液0.1ml，逐滴加入

0

0.4ml37C的40%PEG溶液，0

37C靜置90s，緩慢加入5-10ml無血清培養(yǎng)液，輕搖離心管4-5次，離心去上清液，按每0.1ml融合混合液加25ml完全培養(yǎng)基，以每孔0.1ml分裝于96孔培養(yǎng)板及每孔0.5ml分裝于

0

24孔培養(yǎng)板上，于37C CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)之。39．脂質(zhì)體介導(dǎo)的細(xì)胞融合量與常規(guī)單層培養(yǎng)相同，通

過增加培養(yǎng)罐體積即可達(dá)到擴(kuò)大培養(yǎng)規(guī)模的目的，減少廠房及設(shè)備投資，節(jié)約動(dòng)力消耗及人力，又便于對反應(yīng)系統(tǒng)進(jìn)行檢測控制。46．利用有限稀法篩選雜交瘤細(xì)胞的過程：于克隆前一日向96孔板中加入0。1ml

2細(xì)胞懸液，于37℃CO培養(yǎng)箱中溫育，然后從陰性孔中吸取細(xì)胞計(jì)數(shù)，用完全培養(yǎng)基稀釋成30個(gè)／ml加入96孔板中，每孔0.1ml，余下細(xì)胞再稀釋成10／ml，再加于兩塊96孔板中，每孔（1）斜面低溫保藏法；（2）液體石蠟封存法；（3）沙土管保存法；（4）冷凍干燥保存法；（5）超低溫保藏法。22．工業(yè)微生物表面培養(yǎng)法的優(yōu)缺點(diǎn)：（1）優(yōu)點(diǎn)：①簡單易行；②投資少；③適于小型生產(chǎn)（2）缺點(diǎn)：①勞動(dòng)強(qiáng)度大；②占地面積大；③產(chǎn)量低；④易污染。23．工業(yè)發(fā)酵中提高發(fā)酵液的溶氧水平的措施：（1）提高通氣強(qiáng)度；（2）增加攪拌轉(zhuǎn)速；（3）增加罐壓；（4）增加擋板；（5）通氣中摻入純氧；（6）控制基質(zhì)培養(yǎng)基；（7）控制補(bǔ)料率；（8）調(diào)節(jié)溫度；（9）添加表面活性劑；（10）中間補(bǔ)水；11）液化培養(yǎng)基。24．影響微生物原生質(zhì)體制備的因素：1）菌體的預(yù)處理；（2）菌體的培養(yǎng)時(shí)間；3）酶濃度；（4）酶解溫度；（5）酶解時(shí)間；（6）滲透壓穩(wěn)定劑。25．微生物工程產(chǎn)品主要類型：（1）微生物菌體；（2）初級代謝物；（3）次級代謝物；（4）生物活性大分子； 26．微生物工程在醫(yī)藥工業(yè)中的應(yīng)用：（1）抗生素類；（2）氨基酸類；（3）核苷酸類；（4）維生素類；（5）甾體類激素；（6）治療酶及酶抑制劑。

27．植物細(xì)胞培養(yǎng)的特性：（1）植物細(xì)胞較微生物細(xì)胞大得多，有纖維素細(xì)胞壁，細(xì)胞耐拉不耐扭，抵抗剪切力差；（2）培養(yǎng)過程生長速度緩慢，易受微生物污染，需用抗生素；（3）細(xì)胞生長的中期及對數(shù)期，易凝聚成團(tuán)塊，懸浮培養(yǎng)較難；（4）培養(yǎng)時(shí)需供氧，培養(yǎng)液粘度大，不能耐受強(qiáng)力通風(fēng)攪拌；（5）具有群體效應(yīng)，無錨地依賴性及接觸抑制性；（6）培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)物滯留于細(xì)胞內(nèi)，且產(chǎn)量較低；（7）培養(yǎng)過程具有結(jié)構(gòu)與功能全能性。

28．種質(zhì)保存意義：（1）植物組織及細(xì)胞移植繼代培養(yǎng)過程可能導(dǎo)師致染色體30．植物細(xì)胞生長所需的營過程：動(dòng)物細(xì)胞破碎后，經(jīng)養(yǎng)成份：H2O、無機(jī)營養(yǎng)物、差分分離出線粒體及溶酶維生素、碳源、天然物、植體等細(xì)胞器，或采用生化技物激素、氨基酸類、核酸及術(shù)分離出的DNA，mRNA，逆其水解物以及其它成分。轉(zhuǎn)錄酶及其它生物大分子30．制備原生質(zhì)常用酶：（1）并將其包裝成脂質(zhì)體，然后纖維素酶；（2）果膠酶；（3）按完整細(xì)胞之間的融合方崩潰酶；（4）半纖維素酶；式，將脂體與另一種細(xì)胞融（5）蝸牛酶。合，即或獲得相應(yīng)雜種細(xì)31．測定植物原生質(zhì)體活力胞。的方法：（1）根據(jù)形態(tài)特征40．雜種動(dòng)物細(xì)胞篩選系統(tǒng)判斷其活力；（2）活體染色及方法：（1）HAT選擇系統(tǒng)；法；（3）熒光染料活體染色（2）抗藥性篩選系統(tǒng)；（3）法?；パa(bǔ)選擇法；（4）原位雜交32．植物細(xì)胞分化培養(yǎng)基與法；（5）基因探針選擇法。原生質(zhì)體培養(yǎng)基的差別：41．動(dòng)物雜種細(xì)胞遺傳表現(xiàn)（1）分化培養(yǎng)基中只有蔗型：（1）互補(bǔ)作用是指兩種糖為碳源，不加滲透壓穩(wěn)定親本細(xì)胞生物學(xué)特征在雜劑；（2）原生質(zhì)體培養(yǎng)基中，種細(xì)胞中共同表達(dá)的現(xiàn)象；生長素濃度高于細(xì)胞分裂（2）激活作用是指一個(gè)親素濃度，分化培養(yǎng)基正相本細(xì)胞的非活動(dòng)基因在雜反；

種細(xì)胞中得到表達(dá)的現(xiàn)象。33．植物細(xì)胞融合的特點(diǎn)：（3）消失作用指親本細(xì)胞（1）可以實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)緣雜交，某些遺傳性狀在雜種細(xì)胞獲得種間雜種，克服有性雜中消失的現(xiàn)象；（4）激活與交配系不親和性；（2）可獲消失作用指在雜種細(xì)胞中得另一親本非整倍性雜種原親本非活動(dòng)基因被激活，或胞質(zhì)雜種，且獲得的遺傳而同一親本某些遣傳性狀變異范圍極廣；（3）一次操同時(shí)消失的現(xiàn)象。作可實(shí)現(xiàn)兩個(gè)以上親本的42．MCAb的基本特性：（1）融合作用；（4）可獲得呈現(xiàn)MCAb為高純度單一抗性，雙親個(gè)體基因型總和的雜檢測靈敏度極高；（2）可通種；（5）可形成有性生殖障過雜交瘤大規(guī)模培養(yǎng)進(jìn)行礙植物種間雜種；（6）獲得生產(chǎn)；（3）雜交瘤可用液氮具有不同后生遺傳變化親深凍法長期保；（4）可在分本的雜種。子水平上解析出存在于病34．篩選植物雜種細(xì)胞的方毒表面的抗原或受體；（5）法；1）遺傳互補(bǔ)篩選法；可用不純抗原制備純（2）抗性互補(bǔ)篩選法；（3）MCAb；（6）但MCAb專一性利用物理特性篩選法；4）太強(qiáng)，難于檢出微生物突變利用生長特性篩選法。株，有時(shí)不能產(chǎn)生與抗原交35．動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)包括：（1）聯(lián)的功能易受PH、溫度及鹽組織塊培養(yǎng)法；（2）細(xì)胞單濃度影響，又親和力較低，層培養(yǎng)法；（3）單細(xì)胞分離半衰期短，又需長期持之以培養(yǎng)；（4）二倍體細(xì)胞株培恒的艱苦工作。

養(yǎng)。

43．單克隆抗體生產(chǎn)技術(shù)；36．二倍體細(xì)胞特征：（1）（1）體外培養(yǎng)法；（2）體具有兩倍性染色體（2n），內(nèi)培養(yǎng)法。組型正常；（2）培養(yǎng)條件下44．無血清培養(yǎng)基分類：（1）呈有限生命力，不能無限期基本合成培養(yǎng)基；（2）基本分裂繁殖；（3）無致癌性。合成培養(yǎng)基加生長因子；37．動(dòng)物細(xì)胞融合過程的促（3）基本合成培養(yǎng)加組織融因素：（1）病毒誘導(dǎo)融合；抽提物。（2）PEG誘導(dǎo)融合；（3）45．微載體培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)：兼電場誘導(dǎo)融合；（4）聚乙烯有固定培養(yǎng)與懸浮培養(yǎng)雙醇分離心力也能促進(jìn)融合。

重特點(diǎn)，培養(yǎng)過程細(xì)胞產(chǎn)物

板中，每孔0.1ml。再制備3個(gè)／ml細(xì)胞懸液，加入另外兩塊96孔板中，將上述

各板置37℃CO

2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-3周，待出現(xiàn)可見細(xì)胞集落后，檢查培養(yǎng)液中抗體活性，選出陽性孔，擴(kuò)大培養(yǎng)，如上法進(jìn)行反復(fù)克隆，直至選出純雜交瘤細(xì)胞為止。47．動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程中所具有的特性：（1）細(xì)胞生長緩慢，易受微生物污染，培養(yǎng)時(shí)需用抗生素；(2）動(dòng)物細(xì)胞較微生物大得多，無細(xì)胞壁，機(jī)械強(qiáng)度低，適應(yīng)環(huán)境能力差；(3）培養(yǎng)過程需氧量少，且不耐受強(qiáng)力通風(fēng)與攪拌；(4）在機(jī)體中，細(xì)胞相互粘連以集群形式存在，培養(yǎng)過程具有群體效應(yīng)、錨地依賴性、接觸抑制性及功能全能性；（5）培養(yǎng)過程產(chǎn)物分布于細(xì)胞內(nèi)外，反應(yīng)過程成本較高，但產(chǎn)品價(jià)格昂貴；（6）大規(guī)模培養(yǎng)時(shí)，不可套用微生物反應(yīng)的經(jīng)驗(yàn)；（7）原代培養(yǎng)細(xì)胞一般繁殖50代即退化死亡。48．深凍植物細(xì)胞復(fù)蘇后測其生命活力與存活率的三種方法：

（1）再培養(yǎng)法：將復(fù)蘇后細(xì)胞立即接種于新鮮培養(yǎng) 基上再培養(yǎng)，同時(shí)測定細(xì)胞增殖量，愈傷組織形成情況及人化為新植株能力；（2）二醋酸光素染色法：用1滴0.1%熒光素染料溶液與一滴化凍后細(xì)胞懸浮液混合，活細(xì)胞染色，死細(xì)胞不著色，用普通顯微鏡觀察計(jì)數(shù)得細(xì)胞總數(shù)，用紫外光顯微鏡觀計(jì)數(shù)得活細(xì)胞數(shù)，據(jù)此可計(jì)算出凍存細(xì)胞存活率；

（3）TTC法：根據(jù)活細(xì)胞內(nèi)脫氫酶可將氯化三苯四氮唑還原為for mazam,后者溶于乙醇而不溶于水，故前者與凍細(xì)胞保溫反應(yīng)用乙醇抽提，再用分光光度法測定吸收度，用以判斷細(xì)胞存活率及生活力。49．動(dòng)物細(xì)胞固定化培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)：（1）細(xì)胞可維持在較自考現(xiàn)代生物制藥技術(shù)

小體積培養(yǎng)液中生長；（2）細(xì)胞損傷程度低；（3）易于更換培養(yǎng)液；4）細(xì)胞和培養(yǎng)液易于分離；5）培養(yǎng)液中產(chǎn)物濃度高，簡化了產(chǎn)品分離純化操作。

50．中空纖維培養(yǎng)器優(yōu)點(diǎn)：（1）細(xì)胞生長密度高；（2）營養(yǎng)牧質(zhì)可有效分布，代謝產(chǎn)物可及時(shí)排除；（3）細(xì)胞培養(yǎng)可達(dá)數(shù)日，易于實(shí)現(xiàn)連續(xù)培養(yǎng)；（4）細(xì)胞分泌蛋白質(zhì)濃度高；（5）反應(yīng)器體積小并可用于培養(yǎng)多種細(xì)胞。液，混合均勻，再冷卻凝固成型和破碎即成固定化酶；(2)微囊化包埋法是將醇定位于具有豐透性膜的微小囊內(nèi)的技術(shù)，其基本制備方法有界面沉降法及界面聚合法兩類。

58.固定化酶反應(yīng)器：(1)攪拌罐型反應(yīng)器；(2)固定床型反應(yīng)器；(3)流化床型反應(yīng)器；(4)膜型反應(yīng)器；(5)鼓泡塔型反應(yīng)器； 59．固定化酶的形狀：（1）顆粒狀固定化酶；（2）纖維應(yīng)液，置于沸水中，加熱使

酶失知；（2）立即加入適宜的酶變性劑，使酶變性失活；3）加入酸或堿溶液，使反應(yīng)液的pH值迅速遠(yuǎn)離酶催化應(yīng)的最適pH值；（4）將取出的反應(yīng)液立即置于冰，或冰鹽溶液中，使反應(yīng)

0

液的溫度迅速低至10C以下。

63．酶與一般催化劑相比，所具有的優(yōu)點(diǎn)：（1）催化效率高；（2）專一性強(qiáng)；（3）反應(yīng)條件溫和；（4）酶的活體酶的合成，釋放增強(qiáng)，促

進(jìn)過氧化物酶合增強(qiáng)；（3）可促使白血病細(xì)胞分化及抑制白血病細(xì)胞生長。74．集落刺激因子的臨床應(yīng)用：（1）治療血細(xì)胞減少癥；（2）治療再生障礙性貧血、骨髓發(fā)育不良和自體骨髓移植后的恢復(fù)；（3）治療癌癥；（4）治療AIDS。75．細(xì)胞因子受體的信息傳遞途徑：（1）通過受體本身的酷氨酸激傳遞遞信息；（2）通過

息。76．用于制備細(xì)胞因子的培養(yǎng)細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)十分嚴(yán)格，對這些細(xì)胞的要求包括：（1）細(xì)胞來源要清楚；（2）細(xì)胞建株的鑒定資料要記錄清楚；（3）了解細(xì)胞系的生長特性和在培養(yǎng)條件下的細(xì)胞的穩(wěn)定性；（4）培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)所用的血清不含細(xì)菌、病菌、真菌和支原體。77．干擾素的基本特性：（1）種屬特異性；（2）作用廣譜性和選擇性；（3）相對無害性；（4）特殊穩(wěn)定性。78．真核基因在原核細(xì)胞中獲得表達(dá)必須具備的三個(gè)條件：（1）要有原核細(xì)胞的啟動(dòng)子；（2）要有能與原核細(xì)胞16SrRNA3’端相配合的順序；（3）表達(dá)的干擾素多肽要不被細(xì)胞酶類所迅速降解。

79．IL-2的生物學(xué)作用：（1）促T細(xì)胞增殖；（2）對自然殺傷細(xì)胞（NK）的作用；（3）誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生和增殖；（4）誘導(dǎo)淋巴因子活化淋巴細(xì)胞產(chǎn)生；（5）促B細(xì)胞增殖分化作用；（6）IL-2與其他白介素協(xié)同作用。

80．集落刺激因子的功能：（1）刺激造血細(xì)胞增殖；（2）維持細(xì)胞存活；（3）分化定型；（4）刺激終末細(xì)胞的功能活性。81．三種檢測重組基因工程CSF的方法（1）生物學(xué)檢測法；（2）分子生物學(xué)檢測法；（3）免疫學(xué)檢測法。82．TNF抗腫瘤作用的可能機(jī)制：（1）細(xì)胞的直接細(xì)胞毒及細(xì)胞生長抑制作用；（2）腫瘤內(nèi)血管陰塞引起腫瘤缺血性壞死；（3）TNF的免疫調(diào)節(jié)作用可能在其抗瘤效應(yīng)中起一定的作用。QQ：806235356 83．細(xì)胞因子共有特性：（1）多源性；（2）多效性；（3）高效性；（4）快速反應(yīng)性；（5）理化性質(zhì)：①化學(xué)本質(zhì)為大分子多肽或蛋白；②多為單鏈分子；③多具有“分泌型激素”的特性；④基因多由數(shù)個(gè)外顯子和內(nèi)含子組成；⑤基因均為單拷自考現(xiàn)代生物制藥技術(shù)

貝；⑥分子量均小于80KD。84．細(xì)胞因子的受體，根據(jù)其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和功能分類：抗細(xì)菌、抗真菌作用；（8）熱原質(zhì)作用；（9）參與骨質(zhì)重吸收。

種蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因與調(diào)節(jié)基因廣泛地存在于脊椎動(dòng)物以上的細(xì)胞內(nèi)，在一般2激活的細(xì)胞表面抗原標(biāo)

志，也說明LAK殺傷腫瘤細(xì)胞效應(yīng)是白介素—2激恬（1）細(xì)胞因子受體的新家族；（2）腫瘤壞死因子受體家族；（3）免疫球蛋白超級家族受體； 85．基因工程細(xì)胞因子制備的基本步驟：1）制備含特異性細(xì)胞因子基因的cDNA文庫；（2）從cDNA文庫中篩選目cDNA克??；（3）構(gòu)建表達(dá)性載體，制備高級表達(dá)性工程菌（細(xì)胞）。86．干擾素的生物功能本質(zhì)：（1）抗細(xì)胞內(nèi)侵害；①抑制病毒繁殖；②抑制胞內(nèi)的其它微生物繁殖；（2）抗細(xì)胞分裂活性；（3）調(diào)節(jié)免疫功能活性；①調(diào)節(jié)免疫監(jiān)視功能；②調(diào)節(jié)免疫自穩(wěn)功能； 87．基因工程干擾素的制備方法：（1）干擾素工程菌的組建；①分離提取干擾素基因；②制備人工重組質(zhì)粒；③轉(zhuǎn)化宿主菌；（2）基因工程干擾素的制備；（3）基因工程干擾素的質(zhì)量控制； 88．集落刺激因子的檢測方法：（1）生物活性檢測法；①骨髓細(xì)胞集落形成法；②依賴細(xì)胞株；（2）分子生物學(xué)檢測法；斑點(diǎn)雜交法；（3）免疫學(xué)檢測技術(shù)；雙抗體夾心ELISA法。89．CSFs制檢的一般步驟：（1）制備工程菌（或細(xì)胞）；2）工程菌（或細(xì)菌）的培養(yǎng)；（3）分離純化；①工程菌的破碎，沉淀；②離心；③層析：離子交換層析、親和層析；④超濾濃縮，分子篩層析；（4）除菌過濾，分裝，凍干；（5）半成品檢定，主要包括下列檢定項(xiàng)目：①蛋白含量測定②活性測定③比活性測定；④分子量測定；⑤純度測定；⑥核酸含量測定；⑦鼠lgG含量測定；⑧等電測定；⑨無菌試驗(yàn)；⑩熱原質(zhì)等檢定項(xiàng)目；（6）成品檢定：①外觀檢查；②活性測定；③水分測定；④無菌試驗(yàn)；⑤安全毒性試驗(yàn)；⑥熱原質(zhì)試驗(yàn)；⑦肽圖測定等檢測等檢測項(xiàng)目；（7）分包裝；（8）貯存。90．紅細(xì)胞生成素的測定方法：（1）生物體內(nèi)測定法；（2）生物體外測定法；（3）放射免疫測定法。91．腫瘤壞死因子生物學(xué)活性：（1）抗腫瘤活性；①TNF直接抗腫瘤細(xì)胞的作用；②TNF在體內(nèi)的抗腫瘤作用；（2）抗炎癥活性；（3）促凝血活性；（4）對脂肪細(xì)胞合成脂蛋白脂酶（LPL）和LPL活性的抑制作用；（5）促進(jìn)細(xì)胞因子分泌；（6）免疫調(diào)節(jié)作用（7）抗病毒、92．IL-13的作用：（1）強(qiáng)生理狀態(tài)下，細(xì)胞的干擾素烈報(bào)制外周血單核細(xì)胞分基因呈靜止?fàn)顟B(tài)，只有在特泌IL-

6、IL-1β、TNF-α、定誘生劑的作用下，細(xì)胞的IL-8和gro-β；（2）能抑干擾素基因才活動(dòng)，轉(zhuǎn)錄合制細(xì)胞培養(yǎng)分化的巨噬細(xì)成相應(yīng)的mRNA，進(jìn)而轉(zhuǎn)譯胞產(chǎn)生HIV，并能抑制體外出具有種屬特異性的干擾HIV復(fù)制；（3）較小程度直素蛋白； ③干擾素本身并接作用于大顆粒淋巴細(xì)胞不能直接滅活病毒，干擾素（LGL）合成IEN-y，并與作用于細(xì)胞后，使后者又產(chǎn)適量和亞適量的IL-2的協(xié)生多種其它蛋白質(zhì)(抗病毒同作用；（4）它能影響B(tài)蛋白)，從而阻斷病毒的繁淋巴細(xì)胞，增強(qiáng)其增殖并能殖； ④干擾素必須具有廣表達(dá)CD23表面抗原；（5）譜的抗病毒活性，如果某一有抗炎作用（敗血性休克和種抗病毒物質(zhì)僅對特定的風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎）并刺激體液病毒有作用，就不能稱為干免疫應(yīng)答；（6）增強(qiáng)由IL-2擾素。

誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞因子激活96．人淋巴細(xì)胞幾—2的制的殺傷細(xì)胞活性。備產(chǎn)物檢定方法：

93．基因工程重組細(xì)胞因子(1)活性檢定：采用CTLL的制備質(zhì)控：(1)詳細(xì)記錄細(xì)胞株的3H摻人法進(jìn)行活表達(dá)載體和宿主細(xì)胞，包括性測定，比活性必須在克隆基因的來源和鑒定，以106IU／mg以上；

及表達(dá)載體的構(gòu)建、遺傳學(xué)(2)純度檢定：①SDS—和結(jié)構(gòu)等，此外還要介紹載PAGE檢測，用銀染色，在體引入宿主細(xì)胞的方法，和15KD處呈單一條帶，后掃載體在宿主細(xì)胞中的狀況； 描測得幾—2條帶占95％(2)應(yīng)有詳細(xì)的插入基因和以上；

表達(dá)載體側(cè)翼調(diào)控區(qū)核苷 ②HPLC檢測，反相柱(C4、酸序列的資料；(3)在生產(chǎn)C8、C18等)或正相分子篩柱中啟動(dòng)和控制有關(guān)基因的測得IL—2主峰占95％以表達(dá)方法要有詳細(xì)記錄；(4)上；

產(chǎn)品純化方法要有明確詳(3)氨芐青霉素測定：因?yàn)楸M記載，如采用單抗法和層大腸桿菌發(fā)酵的基因工程析法，要采取適當(dāng)措施，保產(chǎn)品均采用氨芐青霉素抗證這些單抗或其它潛在污性菌株生產(chǎn)，所以必須檢定染物不損害終產(chǎn)品的質(zhì)量氨芐青霉素殘余量； 和安全性。(4)殘余DNA檢測：采用同94．細(xì)胞因子的分子生物學(xué)位素探針法，每劑殘余DNA測定法：

量不得超過100pg；

目前采用的分子生物學(xué)技 還有生物制品要求的常規(guī)術(shù)有RNA印跡法、核酸酶保實(shí)驗(yàn)檢定，如熱原質(zhì)測定、護(hù)分析、原位雜交和多聚酶制劑水分測定、安全試驗(yàn)、鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。均為通過檢測相急性毒性實(shí)驗(yàn)、無菌試驗(yàn)等應(yīng)的mRNA量、推算出幾量均必須合格。的方法。多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)97．LAK細(xì)胞的殺腫瘤細(xì)胞(PCR)是目前檢測幾最敏感作用：LAK細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)的方法，尤其適用于極微量胞分如下三個(gè)階段： 的標(biāo)本，或僅有極少數(shù)細(xì)胞(1)識別階段：LAK細(xì)胞對才能表達(dá)幾基因，或幾基因正常細(xì)胞無損傷作用，而對以低水平表達(dá)的標(biāo)本，目前腫瘤細(xì)胞結(jié)合進(jìn)而殺傷，而已可作半定量分析，且對多種腫瘤細(xì)胞結(jié)合而95．干擾素的定義及含義： 殺傷，說明多種腫瘤的細(xì)胞(1)干擾素的定義：干擾素表面存在著共同抗原決定是一類在同種細(xì)胞上具有簇，可被LAK細(xì)胞所識別；廣譜抗病毒活性的蛋白質(zhì)，正常細(xì)胞表面可能不存在其活性的發(fā)揮又受細(xì)胞基腫瘤抗原決定簇，就不能被因組的調(diào)節(jié)和控制，涉及LAK細(xì)胞所殺傷；關(guān)于LAKRNA和蛋白質(zhì)的合成； 細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞結(jié)合分子(2)目前認(rèn)為，干擾素是一特性研究發(fā)現(xiàn)了“淋巴因子種類似多肽激素的細(xì)胞功活化細(xì)胞相關(guān)抗原”(LAA)，能的調(diào)節(jié)物質(zhì)，是一種細(xì)胞而用LAA制備了單克隆抗素，這一定義的含義如下：體(KBA MoAb)可以抑制LAK①干擾素必須是一種蛋白細(xì)胞殺傷活性，提示了LAK質(zhì)，它對蛋白酶類是敏感細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的物質(zhì)的，而對DNA酶或RNA酶卻基礎(chǔ)，從分子水平認(rèn)識LAA有抵抗；天然干擾素是一種抗原為兩條鏈的糖蛋白組糖蛋白，采用DNA重組技術(shù)成的二聚體，LAA只存在受由大腸桿菌表達(dá)的人干擾白介素—2激活后的細(xì)胞素多肽不帶糖分子； ②這

表面，說明LAA是白介素—

的結(jié)果；

(2)殺傷階段：LAK細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞主要是通過細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用對腫瘤細(xì)胞的殺傷；LAK細(xì)胞內(nèi)含有溶細(xì)胞顆粒(C．C)，該顆粒中含有一種穿孔蛋白質(zhì)，所謂穿孔因子(Peffoin)；LAK細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞結(jié)合時(shí)，LAK細(xì)胞發(fā)生極化，首先高爾基體向與腫瘤細(xì)胞接觸點(diǎn)方向移動(dòng)，通過微管將顆粒分泌到兩

種細(xì)胞接觸面上，在Ca2+

激活下，LAK細(xì)胞也釋放一種腫瘤壞死因子樣毒素，對腫瘤細(xì)胞作用慢，不需Ca2+，又稱之為不依賴鈣離子的殺傷作用，常常使腫瘤細(xì)胞DNA變性和細(xì)胞核裂解，從而抑制腫瘤細(xì)胞生長；

(3)裂解階段：瘤細(xì)胞受到攻擊后，經(jīng)上述兩階段后，完成裂解，抑制腫瘤生長。98．集落刺激因子的功能：

各種CSF的活性是以半固體培養(yǎng)基中CSF刺激造血細(xì)胞形成集落的能力來衡量的。其功能可分為四個(gè)方面：(1)刺激造血細(xì)胞增殖。集落形成細(xì)胞的分裂需要CSF持續(xù)存在，如從培養(yǎng)基中撤掉CSF，則細(xì)胞分裂停止，CSF的濃度決定細(xì)胞周期長短和產(chǎn)生子代細(xì)胞的總數(shù)目；(2)CSF既維系祖細(xì)胞的存活，也延長成熟細(xì)胞的壽命；(3)分化定型；(4)刺激終末細(xì)胞的功能活性。目前已知CSF能影響細(xì)胞作用、膜抗原的表達(dá)、吞噬作用、過氧化物的產(chǎn)生、殺傷微生物及腫瘤細(xì)胞，并產(chǎn)生許多重要的生物活性物質(zhì)，如前列腺素E、腫瘤壞死因子、白細(xì)胞介素—

1、丫干擾素、血纖溶酶原活化因子等。

99．C—CSF和GM—CSF的異同點(diǎn)：

由于G—CSF和GM—CSF在許多相關(guān)的臨床病例中可能有用，所以它們之間生物學(xué)特性差異，對某些疾病發(fā)病機(jī)理的認(rèn)識有一定的意義；

(1)C—CSF特異性刺激中性白細(xì)胞，而GM—CSF則是所有粒細(xì)胞的總刺激因子，例如若要通過提高嗜酸性效應(yīng)細(xì)胞水平來治療寄生蟲感染，則GM—CSF作用比G—CSF為好；

(2)GM—CSF是單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的強(qiáng)激活劑，則G—CSF則不是，這種激活包括誘導(dǎo)產(chǎn)生諸如腫瘤壞死因子和IL—1類的其他自考現(xiàn)代生物制藥技術(shù)

細(xì)胞因子，如需提高單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞活性，可選用CM—CSF，而不是C—CSF； 的主要部位，也是參與炎癥的主要組織，內(nèi)皮細(xì)胞本身也是產(chǎn)生細(xì)胞因子的重要

（另附：工藝流程圖）

(3)CM—CSF是中性白細(xì)胞移動(dòng)的強(qiáng)抑制劑，然而G—CSF則增強(qiáng)中性白細(xì)胞的移 動(dòng)，例如當(dāng)局部損傷時(shí)，GM—CSF可在局部產(chǎn)生，起弱的化學(xué)引誘劑作用，抑制炎癥細(xì)胞離開炎癥部位，而G—CSF則可增強(qiáng)炎癥狀細(xì)胞向炎癥部位移動(dòng)，這可能是兩種造血生長因子共同提高宿主防御力的一種途徑，在細(xì)菌性膿毒癥時(shí)，接觸內(nèi)毒素可刺激單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞產(chǎn)生G—CSF，然后G—CSF刺激T細(xì)胞產(chǎn)生GM—CSF和IL—3，以增加骨髓內(nèi)的骨髓細(xì)胞生成和進(jìn)一步增強(qiáng)白細(xì)胞應(yīng)答。100．CSFs三種檢測方法的特點(diǎn)：

(1)生物活性檢測法，特點(diǎn)是靈敏、方便，但因造血前體細(xì)胞、依賴株細(xì)胞一般都受幾種因子的影響，因此，該法不能明確因子的特性； 質(zhì)產(chǎn)物合成；

(3)免疫學(xué)檢測法，特點(diǎn)是特異、靈敏，更高，缺點(diǎn)是不能證明有功能性蛋白缺點(diǎn)是不能證明被檢CSF是否為具有(2)分子生物學(xué)檢測法，特點(diǎn)是敏感性完整生物活性結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)而非變性蛋白質(zhì)，因此檢測時(shí)最好將

自考現(xiàn)代生物制藥技術(shù)

名詞概念

1、生物工程：應(yīng)用生物科學(xué)的理論、方法、按照人們設(shè)計(jì)的藍(lán)圖，改良加工生物或用生物及其制備物作為加工原料，以提供所需生物制品為人類社會(huì)服務(wù)的綜合性科學(xué)技術(shù)。2、51、植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)：在人工控制下高密度大朗養(yǎng)有益植物細(xì)胞即植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)。

52、半連續(xù)培養(yǎng)法：在反應(yīng)器中投料和接種，培養(yǎng)尸段時(shí)間后，將培養(yǎng)液和新鮮培養(yǎng)液進(jìn)行交換的培養(yǎng)方法，稱為半連續(xù)培養(yǎng)法。

53、動(dòng)物細(xì)胞工程：根據(jù)細(xì)胞生物學(xué)及工程學(xué)原理定向改造動(dòng)物細(xì)胞遺傳性、創(chuàng)造新物種，通過工程化為人類提供名貴藥品服務(wù)的技術(shù)，稱為動(dòng)物細(xì)胞工程。

54、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)：在一定條件下，通過人工供給營養(yǎng)物質(zhì)及生長因子，使離體動(dòng)物細(xì)胞或組織生長繁殖的方法，稱為動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。

55、細(xì)胞塊培養(yǎng)法：將動(dòng)物組織切成直徑1-2mm小塊，進(jìn)行培養(yǎng)的方法，稱為組織塊培養(yǎng)法。

56、細(xì)胞單層培養(yǎng)法：動(dòng)物組織塊經(jīng)消化分散成單個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)塊后，粘附于培養(yǎng)容器表面培養(yǎng)成新生細(xì)胞單層的培養(yǎng)法，稱為細(xì)胞單層培養(yǎng)法。

57、單細(xì)胞分離培養(yǎng)：動(dòng)物組織分散后，將其單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)成純系細(xì)胞集群的技術(shù)，稱之為單細(xì)胞分離培養(yǎng)。

58、確立細(xì)胞株：正常細(xì)胞在移植繼代過程中，有些細(xì)胞增殖力突然增強(qiáng)，在特定條件下可無限繁殖，與初代細(xì)胞相比，其形態(tài)、生理生化特性，病毒敏感性，抗原性及染色體結(jié)構(gòu)均發(fā)生變化，具有致癌性，這些細(xì)胞稱為確立細(xì)胞株。

59、動(dòng)物體細(xì)胞雜交技術(shù)：在外力作用下，令兩個(gè)或兩個(gè)以上異源細(xì)胞合并為一個(gè)多核細(xì)胞的過程，稱為動(dòng)物體細(xì)胞雜交技術(shù)。60、核體：細(xì)胞核連同其外表薄層細(xì)胞質(zhì)構(gòu)成的顆粒稱為核體。61、胞質(zhì)體：不具有細(xì)胞核的細(xì)胞稱為胞質(zhì)體。62、微核雜種細(xì)胞：按完整細(xì)胞之間的融合方式，將微核與另一完整細(xì)胞融合，使后者獲得另一種細(xì)胞中的若于個(gè)染色體，所獲融合子稱為微核雜種細(xì)胞。63、抗藥性篩選系統(tǒng)：利用生物細(xì)胞對藥物敏感性差異篩選雜種細(xì)胞的方法。64、營養(yǎng)缺陷型細(xì)胞：在一些營養(yǎng)物質(zhì)的合成能力上出現(xiàn)缺陷，因此必須在基本培養(yǎng)基中加入相應(yīng)的有機(jī)成分才能正常生長的變異細(xì)胞。65、營養(yǎng)互補(bǔ)選擇法：利用兩種親本細(xì)胞營養(yǎng)互補(bǔ)作用原理篩選雜種細(xì)胞的方法稱為營養(yǎng)互補(bǔ)選擇法。66、雜交瘤技術(shù)：骨髓瘤細(xì)胞與免疫淋巴細(xì)胞融合制備雜種細(xì)胞的方法為雜交瘤技術(shù)。67、雜合瘤：骨髓瘤細(xì)胞與免疫淋巴細(xì)胞融合制備的雜種細(xì)胞稱為雜合瘤。68：微載體培養(yǎng)法；將細(xì)胞吸附于微載體表面的培養(yǎng)方法。69、酶工程：應(yīng)用酶的特異性催化功能并通過工程化為人類生產(chǎn)有用產(chǎn)品及提供有益服務(wù)的技術(shù)為酶工程。70、酶：生物體內(nèi)具有特殊催化功能的蛋白質(zhì)稱為酶。71、固定化酶：限制或定位于特定空間位置的酶稱為固定化酶。

72、固定化細(xì)胞：蘋限制或定位于特定空間位置的細(xì)胞稱為固定化細(xì)胞。73、載體結(jié)合法：將細(xì)胞懸浮液直接與水不溶性載體相結(jié)合的固定化方法。74、包埋法：將細(xì)胞定位于凝膠網(wǎng)格內(nèi)的技術(shù)稱為包埋法。75、偶聯(lián)效率：偶聯(lián)固定化反應(yīng)過程中載體結(jié)合蛋白質(zhì)的能力稱為偶聯(lián)效率。76、酶活力：酶類催化特定化學(xué)反應(yīng)的能力稱為酶活力。77、酶比活：指每毫克酶蛋白所表現(xiàn)的活力。78、固定化反應(yīng)的酶活力回收率：固定酶所顯示的活力與加入偶聯(lián)液中酶總活力的比值稱為固定化反應(yīng)的酶活力回收率。

79、酶試劑盒：將酶、反應(yīng)試劑、穩(wěn)定劑、激活劑、填充劑、及緩沖劑等配成檢測用的混合制劑稱酶試劑盒。80、細(xì)胞因子：是人類或動(dòng)物的各類細(xì)胞分泌的具有多樣生物活性因子，是可溶性物質(zhì)，是一組不均一的蛋白質(zhì)能調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長與分化。81、白介素細(xì)胞：郵包細(xì)胞或其它體細(xì)胞產(chǎn)生的又在細(xì)胞間起調(diào)節(jié)作用和介導(dǎo)作用的因子。82、IL-3：即白細(xì)胞介素3，有激活的T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，能刺激多能造血干細(xì)胞和各系細(xì)胞的分化和增值，促進(jìn)和維持肥大細(xì)胞的增值，增值中性粒細(xì)胞、酸性粒細(xì)胞的活性，促進(jìn)NK細(xì)胞殺傷實(shí)體瘤的活性。

83、IL-10：由TH2細(xì)胞產(chǎn)生，能抑制TH1細(xì)胞合成細(xì)胞因子的能力，是一種糖蛋白。84、IL-12：是由B淋巴細(xì)胞分泌產(chǎn)生的一種細(xì)胞因子，分子量為75KD的糖蛋白，其主要作用是促進(jìn)PHA活化的PBMC增殖自考現(xiàn)代生物制藥技術(shù)

以及亞適劑量IL-2協(xié)同促進(jìn)作用。85、腫瘤壞死因子：是一種由巨噬細(xì)胞分泌能產(chǎn)生細(xì)胞毒，使腫瘤細(xì)胞溶解的因子。86、干擾素：是一類在同種細(xì)胞上具有廣譜抗病毒活性的蛋白質(zhì)，其活性的發(fā)揮又受細(xì)胞基因組的調(diào)節(jié)與控制，涉及RNA和蛋白質(zhì)的合成。

87、集落刺激因子：CSF為一組糖蛋白物質(zhì)，由淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞自然產(chǎn)生，有刺激紅細(xì)胞系以外造血細(xì)胞增殖和分化作用。88、超誘導(dǎo)：是指細(xì)胞在某種大分子合成抑制物的適當(dāng)作用下，誘生蛋白合成增加的現(xiàn)象。89、生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑：是生物體體內(nèi)的某些細(xì)胞和某些分子，它們既是機(jī)體對內(nèi)外環(huán)境刺激應(yīng)答的效應(yīng)機(jī)制，也是機(jī)體維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定因素。

第二篇：現(xiàn)代生物制藥技術(shù)的研究進(jìn)展

燕京理工學(xué)院

Yanching Institute of Technology（2016）屆化工與制藥專業(yè)現(xiàn)代制藥技術(shù)論文 題目：現(xiàn)代生物制藥技術(shù)的研究進(jìn)展

學(xué)院： XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX 專業(yè)：

XXXXX

學(xué)號： XXXXXXX

姓名：

Dream

指導(dǎo)教師：林貝

教研室主任（負(fù)責(zé)人）：林貝 2015 年 6 月 4 日

現(xiàn)代生物制藥技術(shù)的研究進(jìn)展 Dream 化工與材料工程學(xué)院化藥1204班學(xué)號XXXXXXX 指導(dǎo)教室林貝 摘要

本文簡述了近年來基因工程在生物制藥技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用。其中主要從基因操作中大分子的分離、PCR技術(shù)、基因芯片、外源基因的表達(dá)這4個(gè)方面敘述基因工程相關(guān)技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展,以及基因工程藥物的產(chǎn)業(yè)化現(xiàn)狀與發(fā)展趨勢。關(guān)鍵詞：生物技術(shù)基因工程基因操作技術(shù)生物制藥 1 基本概念 1.1 生物技術(shù)

廣義的生物技術(shù)是指人類對生物資源(包括動(dòng)物、植物、微生物)的利用、改造的相關(guān)技術(shù)。其發(fā)展經(jīng)歷了三個(gè)不同的階段——以釀造為代表的傳統(tǒng)生物技術(shù)，以微生物發(fā)酵為代表的近代生物技術(shù)，以基因工程、細(xì)胞工程、酶工程和蛋白質(zhì)工程為代表的現(xiàn)代生物技術(shù)。

現(xiàn)代生物技術(shù)可以理解為是直接操縱有機(jī)體細(xì)胞和基因的一種全新技術(shù)是二十世紀(jì)70年代開始異軍突起的高技術(shù)領(lǐng)域，在醫(yī)療、制藥、農(nóng)業(yè)、輕工食品及環(huán)保業(yè)發(fā)展迅速。[1]以上的生物技術(shù)成果集中應(yīng)用于醫(yī)藥工業(yè)。1.2 現(xiàn)代生物技術(shù)兩大核心工程 1.2.1 工程 概念：基因工程是分子遺傳學(xué)和工程技術(shù)結(jié)合的產(chǎn)物。是現(xiàn)代生物技術(shù)的核心它能按人類需要把遺傳物質(zhì)DNA分子從生物體中分離出來，進(jìn)行剪切、組合、拼裝合成新的DNA分子。再將新的DNA分子植入某種生物細(xì)胞中，使遺傳信息在新的宿主細(xì)胞或個(gè)體中得到表達(dá)，以達(dá)到定向改造或重建新物種的目的。1.2.2 細(xì)胞工程 概念：利用細(xì)胞融合技術(shù)把含有不同遺傳物質(zhì)的細(xì)胞合成雜種細(xì)胞。并使之分裂生長成為雜種生物。它包括體細(xì)胞融合、核移植、細(xì)胞器攝取和染色體片段的重組等。 1.3 現(xiàn)代生物制藥

主要指基因重組的蛋白質(zhì)分子類藥物的制造過程，即利用基因工程、抗體工程或細(xì)胞工程技術(shù)生產(chǎn)的源自生物體內(nèi)的天然物質(zhì)，用于體內(nèi)診斷、治療或預(yù)防藥物的生產(chǎn)過程(也可稱基因工程制藥)。2 基因操作技術(shù)

基因大分子的分離主要指質(zhì)粒(plasmid DNA)和基因組DNA的分離。質(zhì)粒分離的常用方法有堿變性抽提法、煮沸法、去污劑裂解法、質(zhì)粒DNA釋放法、酸酚法等。質(zhì)粒在基因工程中最常用來做成各種克隆載體(cloning vector)或表達(dá)載體(expression vector)。質(zhì)粒載體還可用于RNA干擾(RNA inter-ference)的研究[1](由于這一技術(shù)的研究和應(yīng)用,美國科學(xué)家Andrew Z.Fire博士和Craig C.Mello博士獲得了2006的諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng))?；蚪MDNA的分離通常采用酚-氯仿法、基因文庫(gene library)、Southern雜交以及PCR擴(kuò)增技術(shù)等。其中基因文庫是指含有某種生物基因組不同基因片段的一群DNA重組體克隆,包括cDNA文庫(com-plementaryDNA library, cDNA library)和基因組DNA文庫(genomic library)。最近又有研究者利用名為chum-RNA的小分子RNA建立非PCR擴(kuò)增的單細(xì)胞cDNA文庫[2]。2.1 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)是一種在體外模擬天然DNA復(fù)制過程的核酸擴(kuò)增技術(shù)。該法由Mullis等人于1985年發(fā)明,并于1993年獲得了諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火--延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；②模板DNA與引物的退火（復(fù)性）：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對結(jié)合；③引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基互補(bǔ)配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈，重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過程就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。PCR技術(shù)可分為定性PCR和定量PCR。2.2 定性PCR技術(shù)

定性PCR技術(shù)包括:反轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription PCR, RT-PCR),是從非常少量的mRNA樣品構(gòu)建大容量cDNA文庫的方法,還發(fā)展出實(shí)時(shí)RT-PCR用于定量實(shí)驗(yàn)[3];多重PCR(multiplex PCR),是指在同一PCR反應(yīng)體系中加入多對不同的引物,以擴(kuò)增同一模板的不同區(qū)域;反向PCR(inverse PCR),該法可以對一個(gè)已知DNA片段兩側(cè)的未知序列進(jìn)行擴(kuò)增和研究;錨定PCR(an-chored PCR),現(xiàn)稱為cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)(rap-id amplification of cDNA ends,RACE)[4]。2.3 熒光標(biāo)記分子

定量PCR技術(shù)以實(shí)時(shí)PCR(real time PCR)為代表,其基本原理是在PCR反應(yīng)體系中引入熒光標(biāo)記分子,對每一反應(yīng)時(shí)刻的熒光信號積累進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測,計(jì)算出PCR產(chǎn)物量,或通過標(biāo)準(zhǔn)曲線法得出初始模板量。2.4 基因芯片

基因芯片(gene chip ormicroarray),是生物芯片的一種,其基本技術(shù)包括:核酸方陣的構(gòu)建、樣品的制備、雜交和雜交圖譜的檢測及讀出。根據(jù)用途不同可分為表達(dá)譜芯片(expression profile chip)、測序芯片和診斷芯片。其中表達(dá)譜芯片的應(yīng)用最為廣泛,可用于基因功能分析、疾病發(fā)生機(jī)制的探討及藥物研究和篩選[5]。(1)確定藥靶基因:通過比較正常細(xì)胞與異常細(xì)胞表達(dá)譜之間的差異,從而確定藥靶基因。(2)監(jiān)測藥物治療前后的基因表達(dá)變化:該監(jiān)測可有3方面的作用。一是用于研究藥物作用機(jī)制,通過監(jiān)測基因表達(dá)的變化,可研究藥物作用途徑和對細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響,從而了解該藥物的作用機(jī)制;二是用于研究藥物毒理,從表達(dá)譜的改變和異常表達(dá),便可分析藥物毒理;三是用于藥物篩選,利用用藥前后表達(dá)譜的改變,通過分析病理、生理、生化原理,能高效地篩選出新的藥物或先導(dǎo)化合物。N A 芯片技術(shù)在藥物基因組學(xué)的應(yīng)用, 一方面可加速藥物基因組學(xué)的發(fā)展;另一方面: D N A 芯片利用藥物基因組學(xué)的研究成果, 根據(jù)基因型將人群劃分為各種類型。D N A芯片可自動(dòng)快速地檢測哪些可影響藥物效應(yīng)的基因(為藥物代謝酶、藥物作用靶標(biāo)等)例如設(shè)計(jì)一種淋巴白血病藥物基因組芯片, 包括所有可能影響病人化療反應(yīng)的基因, 借助于這種芯片, 根據(jù)病人的基因型分類, 醫(yī)生為每一個(gè)病人選擇合適的治療藥物和劑量。2.5 外源基因

導(dǎo)入宿主細(xì)胞的外源基因,通過基因表達(dá)得到相應(yīng)的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。根據(jù)宿主細(xì)胞的不同可分為原核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)和真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。在外源基因表達(dá)時(shí),通常把一個(gè)報(bào)告蛋白的基因與一個(gè)目的蛋白的基因融合在一起,形成融合蛋白,用于目的蛋白的檢測與純化。常用的報(bào)告蛋白有β-半乳糖苷酶(β-gal-actosidase)、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione s-transfer-ase,GST)、綠色熒光蛋白(green fluorescence protein,GFP)以及硫還蛋白(thioredoxin, Trx)等。其中值得一提的是GFP,2008年8月有3位科學(xué)家因此獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng):日本科學(xué)家Osamu Shimomura、美國科學(xué)家Martin Chalfie、美籍華人科學(xué)家錢永健。除了直接標(biāo)記目的蛋白用于檢測與純化外,還可利用某些GFP具有熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescence resonanceenergy transfer,FRET)的現(xiàn)象,用于蛋白質(zhì)折疊[6]、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用[7]、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等[8]方面的研究。3 現(xiàn)代生物制藥的現(xiàn)狀

國際上,生物制藥業(yè)主要集中在美國日本和歐洲,其中美國作為生物制藥的發(fā)源地,無論是在經(jīng)費(fèi)投入、產(chǎn)品開發(fā)和研制,還是在產(chǎn)品生產(chǎn)和市場卜都居于國際領(lǐng)先地位,其它開發(fā)的產(chǎn)品和市場銷售額占全球的90%以上。目前, 美國共有生物制藥公司約1400家,具中形成規(guī)模生產(chǎn)的有Alzlgen、Seherir一g一Plougll、EliIJ1l一yMcrk、Gelexlteell等20多家公司。日本在生物技術(shù)的開發(fā)僅次美國, 目前共有生物制藥公司約600家,其中麒麟啤灑、中外制藥、味之素等著名廠商不僅在日本習(xí)內(nèi)處與生物制藥各方面的領(lǐng)先地位,而不斷加強(qiáng)世界市場的開拓,進(jìn)入歐洲和亞洲市場。歐洲在生物技術(shù)的開發(fā)上稍落后于日本但近兩年來歐洲在生物技術(shù)的投入和新公司成眾的數(shù)量上急速增長,目前歐洲的生物制藥公司約有300家但還處在發(fā)展的開始階段。

3.1 我國生物制藥的現(xiàn)狀

至2004年我國有現(xiàn)代生物制藥企業(yè)114家，其中疫苗生產(chǎn)企業(yè)28家，可以生產(chǎn)27種基因工程藥物和26種病毒的41種疫苗。按現(xiàn)價(jià)統(tǒng)計(jì)規(guī)定，生物生化制品生產(chǎn)企業(yè)全國409家，總產(chǎn)值220億元，銷售收入196億元?！笆濉鼻八哪?，平均每年大于20%的速度增長用于該領(lǐng)域的投資不斷加大于固定資產(chǎn)平均增長32.5%。我國現(xiàn)已成為世界疫苗最大生產(chǎn)國年產(chǎn)量超過了10億個(gè)計(jì)量單位。兒科常見病疫苗年產(chǎn)量達(dá)5億人民幣除滿足自用外還向世界衛(wèi)生組織(WHO)提供疫苗產(chǎn)品用于其他國家。3.2 我國生物制藥存在的問題及應(yīng)采取的措施

我國生物制藥存在一系列問題開發(fā)水平低缺少創(chuàng)新產(chǎn)品生物制藥產(chǎn)業(yè)下游技術(shù)薄弱重復(fù)生產(chǎn)嚴(yán)重、資源浪費(fèi)過大產(chǎn)業(yè)化規(guī)模小、市場競爭無序?？刹扇〉拇胧┮苑轮拼龠M(jìn)創(chuàng)新最終以創(chuàng)新實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)飛躍，多渠道建立融資網(wǎng)絡(luò)改革科研體制建立新的產(chǎn)學(xué)研一體化的機(jī)制，加強(qiáng)國際交流與合作積極應(yīng)對國際競爭加強(qiáng)宏觀調(diào)控強(qiáng)化和規(guī)范財(cái)稅優(yōu)惠政策。4 基因工程在生物制藥中的發(fā)展趨勢

目前基因工程藥物的研發(fā)趨勢是:(1)發(fā)展表達(dá)載體:目前最主要的用于生產(chǎn)的表達(dá)載體是哺乳動(dòng)物細(xì)胞和大腸桿菌。大腸桿菌屬于原核表達(dá)系統(tǒng),沒有糖基化功能,只能用于表達(dá)功能蛋白不需要糖基化的重組藥物,如胰島素等,且目的蛋白大量表達(dá)之后易形成包涵體,不易復(fù)性。而功能蛋白需要糖基化的則主要在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)。也有用真核化的原核表達(dá)載體[9]。目前還有“人源化”酵母表達(dá)體系和植物表達(dá)體系正在發(fā)展。(2)對現(xiàn)有的重組藥進(jìn)行基因工程改造和修飾:通過基因工程的改造和修飾使蛋白藥物在臨床應(yīng)用上更安全更有療效,如G-CSF和EPO等突變體藥物研究與開發(fā)。目前,由于天然基因工程藥物品種的研究已經(jīng)相當(dāng)普遍,因此采取對現(xiàn)有的重組藥進(jìn)行基因工程改造和修飾的策略,既可以避免侵犯知識產(chǎn)權(quán),又可以為新藥研究開辟出新途徑。(3)改變給藥途徑:在繼續(xù)改進(jìn)注射用溶液和注射用無菌粉末的穩(wěn)定性之外,還發(fā)展出化學(xué)修飾型、控釋微球型和脈沖式給藥系統(tǒng)。而在鼻腔、口服、直腸、口腔、肺部給藥方面也已取得重大進(jìn)展。5 生物制藥研究新進(jìn)展

5.1 計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)技術(shù)發(fā)展

計(jì)算機(jī)技術(shù)的發(fā)展和向藥物化學(xué)學(xué)科的滲透，促進(jìn)了藥物設(shè)計(jì)的發(fā)展。20世紀(jì)90年代計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)取得突破性進(jìn)展，現(xiàn)已成為藥物研究和開發(fā)的重要方法和工具。

計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)利用了計(jì)算機(jī)快速、全方位的邏輯推理功能、圖形顯示控制功能，并將量子化學(xué)、分子力學(xué)、藥物化學(xué)、生物化學(xué)和信息科學(xué)結(jié)合起來，研究受體生物分子與藥物結(jié)合部位的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)、藥物與受體復(fù)合物的構(gòu)型和立體化學(xué)特征、藥物與受體結(jié)合的模式和選擇性、特異性、、藥物分子的活性基團(tuán)和藥效構(gòu)象關(guān)系等，從藥物機(jī)理出發(fā)，改進(jìn)現(xiàn)有生物活性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)，快速發(fā)現(xiàn)并優(yōu)化先導(dǎo)化合物，使其盡早進(jìn)入臨床前研究，減少傳統(tǒng)的新藥研究的盲目性，縮短新藥研制的時(shí)間。

計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)有兩類方法，一類是基于機(jī)理的藥物設(shè)計(jì)（MBDD），另一類是基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)（SBDD），基于機(jī)理的藥物設(shè)計(jì)要針對藥物作用機(jī)理，從靶點(diǎn)出發(fā)，考慮藥物與受體的作用過程，并要模擬藥物在體內(nèi)的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝等動(dòng)態(tài)過程，比基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)更合理，但該法還不成熟。目前的計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)主要還是基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)，今后的計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)的目標(biāo)是向基于機(jī)理的藥物設(shè)計(jì)方向發(fā)展。相信隨著生命科學(xué)和計(jì)算機(jī)科學(xué)的發(fā)展，考慮藥物不同作用機(jī)理和全部作用過程的計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)技術(shù)將逐步建立并不斷完善。

5.2 組合化學(xué)與高通量篩選技術(shù)發(fā)展

組合化學(xué)是近20年發(fā)展起來的一種合成大量化合物的新方法，它是建立在高效平行的合成之上，在同一個(gè)反應(yīng)器內(nèi)使用相同條件同時(shí)制備出多種化合物，建立各類化合物庫的策略。組合化學(xué)通常采用操作、分離簡便的固相化學(xué)合成。液相化學(xué)合成技術(shù)也在快速發(fā)展和完善中。

在藥物研究過程中，通過化合物活性篩選而獲得具有藥物活性的先導(dǎo)化合物是新藥研究的基礎(chǔ)。隨著分子水平的藥物篩選模型的建立，篩選方法和技術(shù)都發(fā)生了根本性的變化，出現(xiàn)了高通量篩選的新技術(shù)，大大加快了先導(dǎo)化合物的尋找和發(fā)現(xiàn)，并促進(jìn)了高通量有機(jī)合成。近年來，組合化學(xué)與高通量篩選結(jié)合，使組合化學(xué)的化合物庫種類、數(shù)量不斷擴(kuò)大，篩選的先導(dǎo)化合物數(shù)量和種類也在不斷地增多，使新藥的種類和數(shù)量也在不斷地增加。組合化學(xué)實(shí)現(xiàn)的自動(dòng)化合成僅20世紀(jì)90年代后得到的各類化合物總和已超過了人類有史以來所發(fā)現(xiàn)化合物的總和，故有人把組合化學(xué)與高通量篩選結(jié)合技術(shù)稱為“新藥發(fā)現(xiàn)的高速公路”，據(jù)文獻(xiàn)記載，1992年～1998年的幾年，經(jīng)過組合化學(xué)化合物庫與高通量篩選，確定的候選藥物已有46個(gè)，并已進(jìn)入人體測試階段。[10]顯然，組合化學(xué)與高質(zhì)量篩選的結(jié)合技術(shù)，大大地加快了新藥研制的步伐。雖然如此，組合化學(xué)建立的大型化合物庫，為篩選也帶來了困難，因此，利用組合化學(xué)設(shè)計(jì)，構(gòu)建具有結(jié)構(gòu)多樣性的小型而便于篩選的組合化合物庫，結(jié)合化學(xué)信息學(xué)和高通量篩選，將是組合化學(xué)與高通量篩選結(jié)合的一項(xiàng)重要課題。5.3 藥物手性合成技術(shù)發(fā)展

化學(xué)合成技術(shù)在新藥發(fā)現(xiàn)過程中發(fā)揮著十分重要的作用。近年來由于有機(jī)化學(xué)學(xué)科新理論、新反應(yīng)、新技術(shù)不斷發(fā)現(xiàn)，使得合成反應(yīng)具有化學(xué)選擇性成為現(xiàn)實(shí)，并促進(jìn)了藥物合成技術(shù)的快速發(fā)展，其中手性合成技術(shù)使新藥研制的領(lǐng)域不斷擴(kuò)大。

手性是自然界的本質(zhì)屬性。在生物體手性環(huán)境，如酶、受體、離子通道、蛋白質(zhì)、載體中，分子之間手性匹配是分子識別的基礎(chǔ)，受體與配體的專一作用，酶與底物的高度、區(qū)域、位點(diǎn)和立體催化專一性，抗原與抗體的免疫識別都與手性有關(guān)，同時(shí)藥物的生物應(yīng)答常受到手性影響，包括藥物在體內(nèi)的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)、分配、位點(diǎn)活性的作用以及代謝和消除。所以，手性藥物的開發(fā)是當(dāng)前醫(yī)藥界重點(diǎn)研究的熱點(diǎn)之一，并取得了令人注目的成就。目前已上市的藥物中手性藥物約占1/3，如2000年全球手性藥物銷售額達(dá)1233億美元。手性藥物的制備技術(shù)主要有拆分法、化學(xué)合成法和生物合成等三大類，發(fā)展較快的是后二類?；瘜W(xué)合成法是在不對稱催化劑存在下，利用化學(xué)反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)和熱力學(xué)不對稱性，進(jìn)行單一對映體合成。在已上市的手性藥物中，其手性中間體均可通過現(xiàn)有的重（雙）鍵不對稱還原技術(shù)，特別是不對稱氫化和不對稱轉(zhuǎn)移氫化來合成。至今為止在不對稱催化合成中，昂貴的手性配體和貴金屬的使用，以及手性催化劑的催化效率仍是制約其在手性技術(shù)上應(yīng)用的關(guān)鍵。因而，手性催化劑的設(shè)計(jì)和合成，以及催化劑的回收循環(huán)使用是當(dāng)今不對稱催化合成研究的方向。

生物合成法則利用催化劑, 酶-催化反應(yīng)的高度、底物、區(qū)域、位點(diǎn)和立體選擇性來合成手性藥物。生物合成法具有選擇性高、產(chǎn)率高、反應(yīng)條件溫和等特點(diǎn)，隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，生物合成法將成為手性制備的高效手段。5.4 藥物生物技術(shù)發(fā)展[11] 生物技術(shù)藥物是指利用DNA重組技術(shù)或單克隆抗體技術(shù)或其它生物技術(shù)研制的蛋白質(zhì)、抗體或核酸類藥物，它是目前生物技術(shù)研究最為活躍的領(lǐng)域，給生命科學(xué)的研究和生物制藥工業(yè)帶來了革命性變化。參考文獻(xiàn)

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[11]生物制藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展概況[J].化學(xué)試劑, 2008,(04)

第三篇：生物制藥技術(shù)

08藥學(xué)***3陳省委

組合生物合成藥物進(jìn)展

摘 要50年來抗生素在人類疾病治療中發(fā)揮了重要作用,今后的幾十年里它們也將是關(guān)鍵的治療劑。盡管在過去的20年中通過靶向篩選發(fā)現(xiàn)了一些微生物藥物,但是這種篩選方法很難發(fā)現(xiàn)新類型藥物。組合生物合成可以彌補(bǔ)這種不足,通過基因工程方法改造微生物基因和酶,產(chǎn)生新的抗生素,發(fā)現(xiàn)那些在自然界中不能發(fā)現(xiàn)的藥物。

關(guān)鍵詞 基因工程合生物合成新抗生素

微生物種類繁多,其產(chǎn)物化學(xué)結(jié)構(gòu)豐富多彩,生物活性十分廣泛,是開發(fā)各種新產(chǎn)品的豐富資源,但是傳統(tǒng)的篩選方法已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足社會(huì)發(fā)展的需要。隨著分子生物學(xué)和生物技術(shù)的發(fā)展,以及基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、生物信息組學(xué)、代謝組學(xué)研究的深入,人們對微生物基因組的研究也有了顯著進(jìn)展,已經(jīng)闡明了許多與微生物代謝有關(guān)的生物合成基因,為微生物組合生物合成藥物的研究和開發(fā)奠定了良好的基礎(chǔ)。

一、研究背景

自1928年弗萊明發(fā)現(xiàn)青霉素和1942年瓦克斯曼發(fā)現(xiàn)鏈霉素以來,微生物藥物在疾病防治和拯救人類生命中起著十分重要和不可替代的作用,特別是抗生素被國外科學(xué)家譽(yù)為20世紀(jì)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的皇冠寶石。微生物藥物一直是臨床最常用的藥物,在西方發(fā)達(dá)國家,抗生素占臨床處方藥物的20%以上,在中國約占處方藥物的30%。但自上世紀(jì)70年代后,隨著脊髓灰質(zhì)炎、天花、麻風(fēng)等傳染性疾病先后在全球范圍內(nèi)被消滅,國家對微生物藥物研究的支持逐漸下降,抗傳染病藥物研究進(jìn)入了困難時(shí)期。上世紀(jì)90年代后,我國在已有億乙肝病毒攜帶者的基礎(chǔ)上,又出現(xiàn)了100萬以上人類免疫缺陷病毒(HIV)攜帶者。2002年末以來,重急性呼吸窘迫綜合征(SARS)的出現(xiàn)使我國的傳病控制告急,不得不重新思考微生物藥物的研究策略在新的時(shí)期里,微生物藥物研究再度升溫,原因

①新病原微生物不斷出現(xiàn),如SARS、艾滋病(AIDS)瘋牛病等;②生物武器的使用,如炭疽等;③各種耐菌株在世界范圍的傳播;④許多傳染性疾病,如肺核、血吸蟲病等的死灰復(fù)燃。目前國內(nèi)外側(cè)重研究的生物藥物,主要有抗新病原微生物,抗耐藥菌,抗病毒,抗腫瘤抗生素以及微生物來源的生理活性物質(zhì)。微物藥物的研究主要

包括以下內(nèi)容:①抗新病原微生藥物的尋找與開發(fā);②細(xì)菌耐藥機(jī)制及其抗耐藥細(xì)藥物研究;③微生物藥物的生物合成基因研究;④組生物合成微生物藥物研究。其中組合生物合成微生藥物是近年發(fā)展較快的研究領(lǐng)域,將在創(chuàng)新藥物研中發(fā)揮重要作用。

二、組合生物合成生物技術(shù),尤其是基因工程技術(shù)的不斷發(fā)展,為生物醫(yī)藥領(lǐng)域開辟了廣闊的前景;通過基因工程技術(shù)所得到的藥物也在臨床治療某些疑難疾病中發(fā)揮著越來越重要的作用。

廣義,基因工程產(chǎn)品分為兩類

①單基因直接產(chǎn)物。通常是指單個(gè)基因編碼序列的翻譯產(chǎn)物(蛋白質(zhì)),它們一般是生物大分子如干擾素和單克隆抗體,目前生物醫(yī)藥領(lǐng)域中開發(fā)的多數(shù)產(chǎn)品均屬于此類,其中包含有效地用于臨床治療的如重組人胰島素、干擾素和促紅細(xì)胞生成素。我國在此領(lǐng)域獨(dú)創(chuàng)的藥物不多,而且這類藥物的一個(gè)突出缺點(diǎn)是它們比較容易被仿制,只要有了相應(yīng)的細(xì)胞系即可利用基本設(shè)備進(jìn)行生產(chǎn)。

②多基因間接產(chǎn)物。是指由多基因編碼的多酶體系介導(dǎo)而合成的小分子化合物和多肽,包括自然界由微生物和植物產(chǎn)生的天然產(chǎn)物,如抗生素、生理活性物質(zhì)或萜類化合物等結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜的化合物。它們品種繁多,性能各異,僅就目前研究得比較深入的聚酮體和萜類化合物,就包括具有抗腫瘤作用的阿霉素、紫杉醇,具有免疫抑制作用的FK506、西莫羅司,具有降血酯作用的洛伐他汀、銀杏內(nèi)酯,具有抗結(jié)核桿菌作用的利福霉素,抗瘧藥物青蒿素等。

組合生物合成(combinatorial biosynthesis)是在微生物次級代謝產(chǎn)物合成基因和酶學(xué)研究基礎(chǔ)上形成的。組合生物合成的概念是結(jié)構(gòu)不同但生物合成途徑相似的抗生素生物合成基因之間可以進(jìn)行重組、組合或互補(bǔ)產(chǎn)生新結(jié)構(gòu)的化合物。盡管微生物藥物的結(jié)構(gòu)多樣,但形成這些產(chǎn)物的主要生化反應(yīng)機(jī)制卻基本相同,它們通常是由非常簡單的化學(xué)物質(zhì),如小分子羧酸和某些氨基酸作為合成起始單位和延伸單位,通過由一系列基因編碼的多酶體系參與的生物化學(xué)反應(yīng)(構(gòu)成一個(gè)合成途徑)而形成的,參與這些天然產(chǎn)物生物合成的多酶體系是由多個(gè)結(jié)構(gòu)明顯分開的功能區(qū)域所組成。研究表明,參與這類小分子生物合成的基因通常是連鎖或鄰接而構(gòu)成一個(gè)基因簇(cluster),這為基因的克隆和操作提供了方便,同時(shí)由于參與

次級代謝生物合成酶系對底物的特異性,專一性要求不是很嚴(yán)格的,對結(jié)構(gòu)相類似的底物均可識別,這一特點(diǎn)為不同基因組合產(chǎn)生新的化合物創(chuàng)造了條件。因此,有針對性地對某些基因進(jìn)行操作,如替換、阻斷、重組以及添加、減少組件等,均有可能改變其生物合成途徑而產(chǎn)生新的代謝旁路(metabolic pathway),繼而形成新的化合物,這就為組合生物合成提供了基礎(chǔ),國際上已有通過這些手段得到多個(gè)化合物的報(bào)道。

三、研究的科學(xué)意義

開展微生物基因工程組合生物合成創(chuàng)制新型藥物研究,具有如下意義。

1、利用組合生物合成體系,完成化學(xué)方法不能完或難以完成的活性化合物的合成,如抗癌藥物紫杉(taxol)等;這類活性化合物在自然界中含量少、需要大、醫(yī)學(xué)價(jià)值高,而且通?；瘜W(xué)合成困難(成本高,難大,環(huán)境污染嚴(yán)重),為了確保紅豆杉資源的可持續(xù)用,除正在開展的苗圃栽培,并以苗圃作為紫杉醇提的原料之外,通過生物合成來使它們具最終的商業(yè)值是一個(gè)極具潛力的手段。例如,與抗癌藥物紫杉醇用相似的埃波霉素(epothilone)已在鏈霉菌中通過合生物合成方法獲得表達(dá),現(xiàn)已進(jìn)入開發(fā)研究階段。、對一些現(xiàn)有的結(jié)構(gòu)復(fù)雜的天然產(chǎn)物如青蒿素銀杏內(nèi)酯等有效組分進(jìn)行定向合成,對臨床用抗生品種進(jìn)行有針對性的修飾和改造,如對紅霉素進(jìn)行造產(chǎn)生酮內(nèi)酯型的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素,獲得對臨床藥菌具有活性的抗生素衍生物;或者通過對現(xiàn)有天產(chǎn)物或抗生素的結(jié)構(gòu)改造,獲得具有全新活性的或化性能有明顯改善的天然產(chǎn)物或新抗生素。、組合生物合成產(chǎn)生新化合物的潛力很大,化合數(shù)是以可操作基因的指數(shù)方式形成,如設(shè)R為可利的基因數(shù),n是每個(gè)基因的不同等位形式(即不同天產(chǎn)物來源的數(shù)目),從理論上講經(jīng)過基因組合可得Rn種排列組合,即得到Rn個(gè)化合物。通過組合生合成,獲得一大批新化合物,作為高通量藥物篩選樣庫的來源之一。、由于多基因組合操作的平臺是以易于大規(guī)模產(chǎn)的微生物體系為基礎(chǔ),使創(chuàng)制新型藥物的研究便產(chǎn)業(yè)化。、組合生物合成的研究,必將推動(dòng)我國在基因水對天然資源的利用,更好地利用植物代謝產(chǎn)物,挖掘前實(shí)驗(yàn)室條件下無法進(jìn)行培養(yǎng)的生物體,包括海洋的生物體。隨著研究和應(yīng)用的發(fā)展,植物和海洋生物級代謝產(chǎn)物的組合生物學(xué)研究,也將蓬勃

發(fā)展起來。

四、國內(nèi)外研究現(xiàn)狀

1985年,Hopwood教授[4]在世界首次報(bào)道用遺工程的手段合成“非天然”的天然產(chǎn)物isochromanequinone,該工作為后來的組合生物合成奠定了礎(chǔ)。在以后的十幾年里,這一領(lǐng)域成為天然產(chǎn)物代工程研究中最活躍的領(lǐng)域,許多微生物次級代謝研的專家都加入這一領(lǐng)域的工作,因?yàn)榻M合生物合成潛力制造出很多先導(dǎo)化合物。目前的發(fā)展趨勢由最初的基礎(chǔ)研究逐步演變?yōu)榛A(chǔ)與應(yīng)用兼顧,有的地向產(chǎn)業(yè)化邁進(jìn)。該領(lǐng)域的研究也同樣得到工界的重視,美國加州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)公司研制的埃波素(epothilone D)已進(jìn)入III期臨床評價(jià)階段。埃霉素原來由纖維堆囊黏細(xì)菌產(chǎn)生,其產(chǎn)量低,繁殖時(shí)間長,產(chǎn)品無法進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。該公司利用基因組合技術(shù)使纖維堆囊黏細(xì)菌的埃波霉素生物合成基因在鏈霉菌中得到表達(dá),并通過酰基轉(zhuǎn)移酶域替換及羥基化酶基因的阻斷,獲得了主要產(chǎn)生埃波霉素中抗腫瘤活性最好組分的epothilone D的基因工程菌。我國自上世紀(jì)80年代初開展以多基因組合工程技術(shù)研制新藥的研究,在聚酮類抗生素如大環(huán)內(nèi)酯類抗生素、利福霉素、安莎霉素及抗生素產(chǎn)生菌分子生物學(xué)研究方面,取得一定進(jìn)展。國家重大專項(xiàng)支持的基因工程必特螺旋霉素己進(jìn)入臨床研究,基因工程必特螺旋霉素的研制為組合生物合成技術(shù)應(yīng)用于小分子化合物的創(chuàng)制中提供了良好的工作基礎(chǔ)和經(jīng)驗(yàn)。我國微生物代謝產(chǎn)品研究歷史悠久,已形成多學(xué)科協(xié)調(diào)合作的體系,近年來在國家的支持下該體系已得到一定的發(fā)展,加強(qiáng)了微生物及代謝產(chǎn)物資源的開發(fā)。我們已逐步建立難培養(yǎng)極端微生物和未培養(yǎng)微生物資源及海洋微生物的挖掘工作,建立并完善從土壤或其他來源直接分離DNA技術(shù)。我國有很強(qiáng)的有機(jī)化學(xué)合成能力,可以合成進(jìn)行組合合成的起始單元,開展前體介導(dǎo)的組合生物合成(precursor-directed biosynthesis)研究。我們已建立并不斷完善多種生物活性篩選模型,有天然產(chǎn)物化學(xué)分離鑒定及藥理、藥效、毒理評估的配套學(xué)科。

目前基因工程技術(shù)的發(fā)展水平,在單基因操作方面已經(jīng)比較成熟;在多基因操作層次上雖然技術(shù)難度相對比較大,但近年來在此研究領(lǐng)域已有了迅猛的發(fā)展,已積累了較好的研究基礎(chǔ),許多次級代謝產(chǎn)物生物合成基因簇已得到克隆,基因結(jié)構(gòu)與功能已得到闡明,并且發(fā)展了一系列大容量載體和合適的宿主表達(dá)系統(tǒng)。組合生物合成已形成國際藥物領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)和一個(gè)重要發(fā)展方向。

五、研究方向與前景

我國天然微生物及植物資源豐富,以微生物作為平臺的藥物生產(chǎn)歷史悠久、種類繁多,利用這一寶庫開展組合生物合成研究,建立新型化合物庫,作為新型藥物或先導(dǎo)化合物的重要來源之一,有重要的理論與實(shí)際意義。組合生物合成為當(dāng)今世界研究熱點(diǎn),我國也有一定工作基礎(chǔ),開展這方面的研究將有利于加深對次級代謝生物合成機(jī)理的研究與應(yīng)用、促進(jìn)生物技術(shù)新藥研制中的作用,對發(fā)展我國新藥有重要意義,并推動(dòng)新藥研究中高通量篩選技術(shù)與方法的建立與善,篩選出有價(jià)值的新藥。

我們要重點(diǎn)加強(qiáng)難培養(yǎng)微生物及海洋生物資源挖掘工作,建立并完善從土壤或其他來源直接分DNA技術(shù),以豐富組合生物合成基因資源;加強(qiáng)微物天然化學(xué)研究,建立微量、快速、高效鑒定天然產(chǎn)化學(xué)結(jié)構(gòu)的技術(shù)和方法;充分利用我們已經(jīng)建立的種生物活性篩選模型,通過廣泛地聯(lián)合與協(xié)作,擴(kuò)展合生物合成技術(shù)在創(chuàng)新藥物中的應(yīng)用,建立我國基工程微生物組合生物合成創(chuàng)制新型藥物或先導(dǎo)化合研究的技術(shù)平臺。該研究將有助于開拓和促進(jìn)我國新技術(shù)在新藥研究與開發(fā)中的應(yīng)用,對創(chuàng)制具有我自主知識產(chǎn)權(quán)的新藥將會(huì)有積極推動(dòng)作用。

對本課程的意見：

1、可能是因?yàn)檫x課人太少的問題，上課的時(shí)候沒有很好的聽課氣氛，不過主要

還可能是自己的原因，自己不能集中精神聽講。

2、以后只要選課的人比較多了，應(yīng)該會(huì)好一些，上課的人少了，總是覺得就像

這門課不重要，老師講的很清晰，主要是我們上課時(shí)常開小差。自從上了大學(xué)，就沒太有人管了，有時(shí)聽起課來就愛聽不聽，這倒是對每門課都差不多的。

3、課堂上可以稍微提問一下，因?yàn)樘釂柾梢砸鹜瑢W(xué)們的注意，這樣走神的情況可能會(huì)少一些。

4、課堂中還可以穿插一些與課程有關(guān)的歷史、說一下那些地方比較適合做研究、考研究生去哪里比較好啊什么的，這樣既可以對現(xiàn)在的科研大環(huán)境有所了解，課堂內(nèi)容也不至于太單調(diào)。

最后謝謝老師兢兢業(yè)業(yè)地為我們把課上完，盡管上課人數(shù)少，你還是把課完整地給我們講完，謝謝老師為我們的付出。

第四篇：生物制藥技術(shù)

酶

分離純化酶的一般程序

1粗酶液的制備：材料的選擇，發(fā)酵液處理，細(xì)胞破碎及酶的抽提 2酶的初步分離：鹽析，等電點(diǎn)沉淀，有機(jī)溶劑沉淀，離心分離 3酶的高度純化（酶的精制）：層析法（凝膠過濾、離子交換層析、吸附層析及親和層析），電泳（等電聚焦電泳）

4濃縮干燥及結(jié)晶：透析，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，超濾，冷凍干燥

酶的主要純化技術(shù)－層析技術(shù)

利用混合液中各組分的物理化學(xué)性質(zhì)的不同，(分子的大小和形狀、分子極性、吸附力、分子親和力、分配系數(shù))，使各組分以不同的比例分布在兩相中，當(dāng)流動(dòng)相以一定的速度流經(jīng)固定相時(shí)，各組分的移動(dòng)速度不同，從而使不同的組分分離的技術(shù)過程。稱為層析技術(shù)（chromatography）

離子交換層析（ion exchange chromatography）

在一定的pH條件下，帶電荷的蛋白質(zhì)與高分子不溶性固定相偶聯(lián)的離子交換基團(tuán)相吸附，流動(dòng)相中解離的離子與被吸附的酶發(fā)生可逆的交換，而對不同吸附能力的蛋白質(zhì)進(jìn)行分離 離子交換劑的選擇：陰離子交換劑用于處理凈電荷為負(fù)的蛋白質(zhì)，陽離子交換劑用于處理凈電荷為正的蛋白質(zhì)

樣品在低離子濃度條件下上柱，逐漸增加洗脫液的離子濃度，使蛋白依次被洗脫下來 洗脫方式可以是步進(jìn)式洗脫或線性梯度洗脫 洗脫液一般用 NaCl

凝膠過濾法（gel filtration）亦稱分子篩層析、排阻層析，是利用生物大分子的相對分子質(zhì)量的差異進(jìn)行層析分離的一種方法

凝膠層析的固定相是惰性的珠狀凝膠顆粒，凝膠顆粒的內(nèi)部具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，形成很多孔穴。當(dāng)含有不同分子大小的組分的樣品進(jìn)入凝膠層析柱后，各個(gè)組分就向固定相的孔穴內(nèi)擴(kuò)散，組分的擴(kuò)散程度取決于孔穴的大小和組分分子大小。比孔穴孔徑大的分子不能擴(kuò)散到孔穴內(nèi)部，完全被排阻在孔外，只能在凝膠顆粒外的空間隨流動(dòng)相向下流動(dòng)，它們經(jīng)歷的流程短，流動(dòng)速度快，所以首先流出；而較小的分子則可以完全滲透進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，經(jīng)歷的流程長，流動(dòng)速度慢，所以最后流出；

分離提純 脫鹽 測定高分子物質(zhì)的相對分子量

疏水層析（hydrophobic chromatography）

原理：蛋白質(zhì)分子中含有亮氨酸、纈氨酸和苯丙氨酸等疏水性較強(qiáng)的氨基酸，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液經(jīng)過疏水層析介質(zhì)的疏水配基時(shí)，蛋白的疏水性集團(tuán)（疏水補(bǔ)?。?huì)與疏水配基發(fā)生親和作用而被吸附在介質(zhì)上。不同蛋白質(zhì)分子中疏水基團(tuán)的數(shù)量和特性有所不同。在洗脫時(shí)通過改變洗脫液的極性達(dá)到分離的目的

親和層析（affinity chromatography）

也稱功能層析、生物專一吸附或選擇層析。根據(jù)生物分子與特定的固相化配基（ligand）之間的親和力而使生物分子得到分離的方法 酶與激活劑/抑制劑/底物/輔酶；抗原與抗體；激素/配體與受體；蛋白質(zhì)與DNA/RNA上特定區(qū)域

特定的配基（激活劑/抑制劑/底物/輔酶）固定于惰性載體 目的酶與配基特異性親和吸附，雜質(zhì)被洗脫 改變洗脫條件，解除目的酶與配基的專一性結(jié)合

固定化酶（細(xì)胞）的定義

優(yōu)點(diǎn)：

1.穩(wěn)定性顯著提高；

2.同一批固定化酶能重復(fù)多次地使用； 3.固定化后，很容易與反應(yīng)物分開（過濾），不污 染產(chǎn)物，而且有利于控制生產(chǎn)過程，同時(shí)也省去了 熱處理等使酶失活的步驟；

4.可長期使用，并可預(yù)測衰變的速度； 5.提供了研究酶動(dòng)力學(xué)的良好模型。缺點(diǎn)：

①固定化時(shí)，酶活力往往有損失。②增加了生產(chǎn)的成本，初始投資大。

③只能用于可溶性底物，而且較適用于小分子底物，對大分子底物不適宜。④非均相反應(yīng)。

①注意維持酶的催化活性及專一性。在酶的固定化過程中，酶與載體的結(jié)合部位不應(yīng)當(dāng)是酶的活性部位，而且要盡量避免那些可能導(dǎo)致酶蛋白高級結(jié)構(gòu)破壞的條件。②固定化應(yīng)該有利于生產(chǎn)自動(dòng)化、連續(xù)化。為此，用于固定化的載體必須有一定的機(jī)械強(qiáng)度，不能因機(jī)械攪拌而破碎或脫落。

③固定化酶應(yīng)有最小的空間位阻，盡可能不妨礙酶與底物的接近，以提高產(chǎn)品的產(chǎn)量。④酶與載體必須結(jié)合牢固，從而使固定化酶能回收貯藏，利于反復(fù)使用。

⑤固定化酶應(yīng)有最大的穩(wěn)定性，所選載體不與廢物、產(chǎn)物或溶劑發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。⑥固定化酶成本要低，以利于工業(yè)使用。

載體結(jié)合法

1物理吸附法2離子結(jié)合法3共價(jià)結(jié)合法 是將酶結(jié)合于不溶性載體上的一種固定化方法。1）物理吸附法 作用方式：非特異性物理吸附作用：范德華力；氫鍵；疏水作用；靜電作用 優(yōu)點(diǎn)：制作簡單，酶分子的構(gòu)象很少或基本不發(fā)生變化，固定化酶活力較高 缺點(diǎn)：酶與載體結(jié)合力弱，酶易從載體脫落 載體：纖維素、瓊脂糖、活性炭、沸石及硅膠等 2)離子結(jié)合法

作用方式：離子鍵結(jié)合

優(yōu)點(diǎn)：制作簡單，處理?xiàng)l件緩和，酶蛋白的活性中心和高級結(jié)構(gòu)破壞較少，可以制得活力較高的固定化酶。

缺點(diǎn)：離子鍵結(jié)合較松散，如在高離子強(qiáng)度下進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，酶與載體易分開。載體：多糖類離子交換劑，合成高分子離子交換樹脂 3)共價(jià)鍵結(jié)合法

作用方式：共價(jià)鍵結(jié)合

優(yōu)點(diǎn)：酶分子和載體間的共價(jià)鍵較牢固，有良好的穩(wěn)定性及重復(fù)使用性 缺點(diǎn)：制備過程復(fù)雜，反應(yīng)條件比較劇烈，酶活性損失比較嚴(yán)重。

制作方法：先將載體活化，在載體上引入一個(gè)活化基團(tuán)，然后該活化基團(tuán)再與酶分子表面的基團(tuán)（羧基/氨基/羥基）反應(yīng)結(jié)合。有戊二醛法、重氮化法、烷基化法等。

交聯(lián)法

利用雙功能（或多功能）基團(tuán)的試劑，使酶蛋白分子之間發(fā)生交聯(lián)，凝集成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)而成為固定化酶

常用的雙功能試劑有戊二醛、己二胺、順丁烯二酸酐和雙偶氮苯等。其中最常用的是戊二醛

包埋法

1網(wǎng)格型2微囊型

將酶包埋在凝膠的微小空格內(nèi)或埋于半透膜的微型膠束內(nèi)，但底物仍能滲入到里面與酶接觸。

載體：凝膠，高分子聚合物（半透膜）

優(yōu)點(diǎn)：利用此法制得的固定化酶，由于酶分子僅僅是被包埋起來，而未受到化學(xué)作用。酶蛋白幾乎不起變化。

缺點(diǎn)：酶被包埋在內(nèi)部，對大分子底物很難發(fā)生催化作用。所以用包埋法制備的酶，一般只適用與小分子底物。

包埋法分為：網(wǎng)格包埋法和微囊包埋法。

酶傳感器（enzyme sensor）1生物傳感器的概念

由生物識別物質(zhì)（如酶、微生物、動(dòng)植物組織、抗體等）和能量轉(zhuǎn)換器相結(jié)合所構(gòu)成的分析儀器，可以簡便快速的測定各種特異性很強(qiáng)的物質(zhì) 要求識別物質(zhì)對被測物具有高度的敏感性和選擇性

根據(jù)識別物質(zhì)可分為：酶傳感器、組織傳感器、微生物傳感器、免疫傳感器

2、生物傳感器的一般結(jié)構(gòu)與工作原理 結(jié)構(gòu):有兩個(gè)部分組成

生物分子識別元件（感受器）：酶、核酸、抗體、細(xì)胞等 信號轉(zhuǎn)換器（換能器）：電化學(xué)電極、光學(xué)檢測元件、熱敏電阻、表面等離子共振器件等 原理：待測物質(zhì)經(jīng)擴(kuò)散作用進(jìn)入生物傳感器,通過分子識別發(fā)生特異的生物化學(xué)反應(yīng),產(chǎn)生的生化信號經(jīng)換能器轉(zhuǎn)換為可定量和可處理的電信號,進(jìn)而可檢測出該物質(zhì)的濃度.根據(jù)反應(yīng)產(chǎn)生的信號不同，可選擇相應(yīng)的換能器.抗體

多克隆抗體：由于一個(gè)抗原通常都有幾個(gè)抗原決定簇，因此每個(gè)免疫細(xì)胞都可能產(chǎn)生一種針對某一抗原決定簇（antigenic determinant）的抗體，這些由同一抗原產(chǎn)生的不同抗體統(tǒng)稱為多克隆抗體。這些由不同B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的抗體，稱為多克隆抗體（polyclonal antibodies，PcAb）。

單克隆抗體：單一類型的只針對某一抗原決定簇的抗體分子，是由單一的B淋巴細(xì)胞克隆產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)和特異性完全相同的高純度抗體。

抗原的制備

1.用基因工程技術(shù)制備重組蛋白抗原

2.提取純化天然抗原

3.合成多肽半抗原

4.小分子半抗原

5.多肽半抗原及小分子半抗原與載體偶聯(lián)

免疫

動(dòng)物選擇：Balb/c小鼠，品系一致

途徑

體內(nèi)，體外，脾內(nèi)免疫

篩選陽性克隆及克隆化

克隆：由單個(gè)細(xì)胞繁殖擴(kuò)增而形成性狀均一的細(xì)胞集落的過程。

目的：篩選陽性克?。淮_保雜交瘤細(xì)胞所分泌的抗體具有單克隆性以及從細(xì)胞群中篩選

出具有穩(wěn)定表現(xiàn)型。

篩選陽性克隆鑒定

單克隆抗體活性檢測方法：

1）酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）：可溶性抗原、細(xì)胞核病毒。2）放免測定（RIA）：可溶性抗原、細(xì)胞抗體。3）FAC（熒光激活細(xì)胞分選儀，流式培養(yǎng)儀）：針對細(xì)胞表面

抗原的抗體檢測。

4）IFA（間接免疫熒光法）：用于細(xì)胞和病毒抗體的檢測。

雜交瘤細(xì)胞的克隆化

（1）有限稀釋技術(shù) 柏松分布（2）半固體瓊脂培養(yǎng)法

0.5%瓊脂培養(yǎng)基中進(jìn)行克隆

1ml含不同數(shù)量的細(xì)胞懸液

1ml42度0.5%的瓊脂液

單克隆抗體的大量制備

基因工程抗體（genetically engineered antibodies,gAb）

是通過基因工程技術(shù)研制的，即通過PCR技術(shù)獲得抗體基因或抗體基因片段，與適當(dāng)載體重組后引入不同表達(dá)系統(tǒng)所產(chǎn)生的抗體。基因工程抗體既保持了單抗的均一性、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，又能克服其為鼠源性的不足，是拓展單抗廣泛人體使用的重要途徑。

（一）嵌合抗體（chimeric antibody）

特點(diǎn)：是用人抗體的C區(qū)替代鼠的C區(qū)。效果：使鼠源性單抗的免疫原性明顯減弱，并可延長其在體內(nèi)的半衰期及改善藥物的動(dòng)力學(xué)。嵌合抗體的優(yōu)點(diǎn)：

保持了親本鼠單抗的特異性和親和力；

減少人源性的恒定區(qū)的HAMA現(xiàn)象；

能有效地介導(dǎo)產(chǎn)生補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒作用(CDC)、抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用（ADCC）及免疫調(diào)理作用。缺點(diǎn)：

目前已有數(shù)十種嵌合抗體進(jìn)入了臨床試用，雖然HAMA現(xiàn)象較鼠單抗大為下降，但有相當(dāng)比例的患者仍會(huì)出現(xiàn)HAMA癥狀，針對可變區(qū)的抗獨(dú)特型抗體反應(yīng)仍很明顯。

（二）改型抗體（reshaped antibody，RAb）亦叫“重構(gòu)抗體”，“CDR移植抗體（CDR grafting antibody）”。它是利用基因工程技術(shù)，將人抗體可變區(qū)（V）中互補(bǔ)性決定區(qū)（complementarity determinative region，CDR）的氨基酸序列改換成鼠源單抗CDR 序列。

特點(diǎn)：此種抗體可以使人單抗獲得鼠單抗的特異性又保持人源抗體的親和力。

動(dòng)物

動(dòng)物細(xì)胞分類

1、貼壁依賴性細(xì)胞 概念：anchoraged-dependent cell需要有適量帶電荷的固體或半固體支持表面才能生長的細(xì)胞 大多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞都屬于此類。

2、非貼壁依賴性細(xì)胞

概念：anchoraged-independent cell不依賴于固體支持物表面生長的細(xì)胞，可在培養(yǎng)液中懸浮生長，被稱為懸浮細(xì)胞。舉例：血液、淋巴細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞和某些轉(zhuǎn)化細(xì)胞，Namalwa細(xì)胞。

3、兼性貼壁細(xì)胞

概念：對支持物的依賴性不嚴(yán)格，既可貼壁生長，也可懸浮生長。舉例：CHO細(xì)胞、BHK細(xì)胞、L929細(xì)胞。理想的藥物生產(chǎn)細(xì)胞系

轉(zhuǎn)基因技術(shù)的基本原理

將體外構(gòu)建的重組DNA分子(目的基因或基因組片段)通過顯微注射、或轉(zhuǎn)染胚胎干細(xì)胞等方法注入動(dòng)物的受精卵或著床前的胚胎細(xì)胞,然后將此受精卵或胚胎再植入受體動(dòng)物的輸卵管或子宮中，使其發(fā)育成攜帶外源基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。

同源重組

雙鏈DNA的兩個(gè)區(qū)段的DNA序列基本一致，但不一定完全相同，叫做同源區(qū)。同源的雙鏈DNA可以通過相互交換進(jìn)行重組。

外源DNA如有同源區(qū)，也可通過類似的同源重組過程整合到生物的染色體基因組上。

胚胎干細(xì)胞（Embryonic Stem Cell，ES）是從早期胚胎的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)經(jīng)體外培養(yǎng)建立起來的多潛能細(xì)胞系，具有胚胎細(xì)胞相似的形態(tài)特征和分化特征。

新型

反義技術(shù)：根據(jù)堿基互補(bǔ)原理，使用與目標(biāo)靶的遺傳物質(zhì)（DNA或mRNA）特定互補(bǔ)的核苷酸片段來封閉基因表達(dá)的技術(shù)方法。

反義藥物：人工合成或生物合成的DNA或RNA，能與RNA互補(bǔ)，抑制疾病基因的表達(dá)。反義核酸（antisense nucleic acid）是一段與靶基因的某段序列互補(bǔ)的天然存在或人工合成的核苷酸序列。它可通過堿基配對與細(xì)胞內(nèi)核酸特異結(jié)合形成雜交分子，從而在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，具有合成方便、序列設(shè)計(jì)簡單、容易修飾、選擇性高、親和力高等特點(diǎn)。

核酶(ribozyme)具有酶活性的RNA，可降解特異的mRNA序列。

RNA干擾（RNA interference，RNAi）

由雙鏈RNA介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)特異性mRNA降解過程，導(dǎo)致靶基因的表達(dá)沉默。

基因?qū)敕绞?/p>

直接體內(nèi)療法（in vivo）

是指將目的基因直接導(dǎo)入體內(nèi)有關(guān)的組織器官，使其進(jìn)入相應(yīng)的細(xì)胞并進(jìn)行表達(dá)。間接體內(nèi)療法（ex vivo）

是指在體外將目的基因?qū)氚屑?xì)胞，經(jīng)過篩選和增殖后將細(xì)胞回輸給患者，使該基因在體內(nèi)有效地表達(dá)相應(yīng)產(chǎn)物，以達(dá)到治療的目的。

腫瘤的基因治療

（一）通過抑癌基因抑制腫瘤細(xì)胞生長和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

（二）通過病毒感染殺傷腫瘤細(xì)胞

（三）通過誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)識別并殺傷腫瘤細(xì)胞

（四）腫瘤的自殺基因治療

（五）腫瘤抗原靶向的腫瘤基因治療

（六）細(xì)胞因子基因治療

第五篇：現(xiàn)代生物制藥技術(shù)的研究進(jìn)展

燕京理工學(xué)院現(xiàn)代制藥技術(shù)論文

燕京理工學(xué)院

Yanching Institute of Technology

（2016）屆化工與制藥專業(yè)現(xiàn)代制藥技術(shù)論

文

題目： 現(xiàn)代生物制藥技術(shù)的研究進(jìn)展 學(xué)院： XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX 專業(yè)： XXXXX 學(xué)號： XXXXXXX 姓名： Dream 指導(dǎo)教師： 林貝 教研室主任（負(fù)責(zé)人）： 林貝

2015 年 6 月 4 日

燕京理工學(xué)院現(xiàn)代制藥技術(shù)論文

現(xiàn)代生物制藥技術(shù)的研究進(jìn)展

Dream 化工與材料工程學(xué)院 化藥1204班 學(xué)號XXXXXXX

指導(dǎo)教室 林貝

摘 要

本文簡述了近年來基因工程在生物制藥技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用。其中主要從基因操作中大分子的分離、PCR技術(shù)、基因芯片、外源基因的表達(dá)這4個(gè)方面敘述基因工程相關(guān)技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展,以及基因工程藥物的產(chǎn)業(yè)化現(xiàn)狀與發(fā)展趨勢。

關(guān)鍵詞：生物技術(shù)

基因工程

基因操作技術(shù)

生物制藥 基本概念 1.1 生物技術(shù)

廣義的生物技術(shù)是指人類對生物資源(包括動(dòng)物、植物、微生物)的利用、改造的相關(guān)技術(shù)。其發(fā)展經(jīng)歷了三個(gè)不同的階段——以釀造為代表的傳統(tǒng)生物技術(shù)，以微生物發(fā)酵為代表的近代生物技術(shù)，以基因工程、細(xì)胞工程、酶工程和蛋白質(zhì)工程為代表的現(xiàn)代生物技術(shù)。

是二十世紀(jì)70年代開始異軍突起的高技術(shù)領(lǐng)域，在醫(yī)療、制藥、農(nóng)業(yè)、輕工食品及環(huán)保業(yè)發(fā)展迅速。[1]以上的生物技術(shù)成果集中應(yīng)用于醫(yī)藥工業(yè)。

1.2 現(xiàn)代生物技術(shù)兩大核心工程 1.2.1 工程

概念：基因工程是分子遺傳學(xué)和工程技術(shù)結(jié)合的產(chǎn)物。是現(xiàn)代生物技術(shù)的核心它能按人類需要把遺傳物質(zhì)DNA分子從生物體中分離出來，進(jìn)行剪切、組合、拼裝合成新的DNA分子。再將新的DNA分子植入某種生物細(xì)胞中，使遺傳信息在新的宿主細(xì)胞或個(gè)體中得到表達(dá)，以達(dá)到定向改造或重建新物種的目的。

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1.2.2 細(xì)胞工程

概念：利用細(xì)胞融合技術(shù)把含有不同遺傳物質(zhì)的細(xì)胞合成雜種細(xì)胞。并使之分裂生長成為雜種生物。它包括體細(xì)胞融合、核移植、細(xì)胞器攝取和染色體片段的重組等。

1.3 現(xiàn)代生物制藥

主要指基因重組的蛋白質(zhì)分子類藥物的制造過程，即利用基因工程、抗體工程或細(xì)胞工程技術(shù)生產(chǎn)的源自生物體內(nèi)的天然物質(zhì)，用于體內(nèi)診斷、治療或預(yù)防藥物的生產(chǎn)過程(也可稱基因工程制藥)?；虿僮骷夹g(shù)

基因大分子的分離主要指質(zhì)粒(plasmid DNA)和基因組DNA的分離。質(zhì)粒分離的常用方法有堿變性抽提法、煮沸法、去污劑裂解法、質(zhì)粒DNA釋放法、酸酚法等。質(zhì)粒在基因工程中最常用來做成各種克隆載體(cloning vector)或表達(dá)載體(expression vector)。質(zhì)粒載體還可用于RNA干擾(RNA inter-ference)的研究[1](由于這一技術(shù)的研究和應(yīng)用,美國科學(xué)家Andrew Z.Fire博士和Craig C.Mello博士獲得了2006的諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng))?；蚪MDNA的分離通常采用酚-氯仿法、基因文庫(gene library)、Southern雜交以及PCR擴(kuò)增技術(shù)等。其中基因文庫是指含有某種生物基因組不同基因片段的一群DNA重組體克隆,包括cDNA文庫(com-plementaryDNA library, cDNA library)和基因組DNA文庫(genomic library)。最近又有研究者利用名為chum-RNA的小分子RNA建立非PCR擴(kuò)增的單細(xì)胞cDNA文庫[2]。

2.1 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)是一種在體外模擬天然DNA復(fù)制過程的核酸擴(kuò)增技術(shù)。該法由Mullis等人于1985年發(fā)明,并于1993年獲得了諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火--延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引

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物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；②模板DNA與引物的退火（復(fù)性）：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對結(jié)合；③引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基互補(bǔ)配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈，重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過程就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。PCR技術(shù)可分為定性PCR和定量PCR。

2.2 定性PCR技術(shù)

定性PCR技術(shù)包括:反轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription PCR, RT-PCR),是從非常少量的mRNA樣品構(gòu)建大容量cDNA文庫的方法,還發(fā)展出實(shí)時(shí)RT-PCR用于定量實(shí)驗(yàn)[3];多重PCR(multiplex PCR),是指在同一PCR反應(yīng)體系中加入多對不同的引物,以擴(kuò)增同一模板的不同區(qū)域;反向PCR(inverse PCR),該法可以對一個(gè)已知DNA片段兩側(cè)的未知序列進(jìn)行擴(kuò)增和研究;錨定PCR(an-chored PCR),現(xiàn)稱為cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)(rap-id amplification of cDNA ends,RACE)[4]。

2.3 熒光標(biāo)記分子

定量PCR技術(shù)以實(shí)時(shí)PCR(real time PCR)為代表,其基本原理是在PCR反應(yīng)體系中引入熒光標(biāo)記分子,對每一反應(yīng)時(shí)刻的熒光信號積累進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測,計(jì)算出PCR產(chǎn)物量,或通過標(biāo)準(zhǔn)曲線法得出初始模板量。

2.4 基因芯片

基因芯片(gene chip ormicroarray),是生物芯片的一種,其基本技術(shù)包括:核酸方陣的構(gòu)建、樣品的制備、雜交和雜交圖譜的檢測及讀出。根據(jù)用途不同可分為表達(dá)譜芯片(expression profile chip)、測序芯片和診斷芯片。其中表達(dá)譜芯片的應(yīng)用最為廣泛,可用于基因功能分析、疾病發(fā)生機(jī)制的探討及藥物研究和篩選[5]。(1)確定藥靶基因:通過比較正常細(xì)胞與異常細(xì)胞表達(dá)譜之間的差異,從而確定藥靶基因。(2)監(jiān)測藥物治療前后的基因表達(dá)變化:該監(jiān)測可有3方面的作用。一是用于研究藥物作用機(jī)制,通過監(jiān)測基因表達(dá)的變化,可研究藥物作用途徑和對細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響,從而了解該藥物的作用機(jī)制;二是用于研究藥物毒

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理,從表達(dá)譜的改變和異常表達(dá),便可分析藥物毒理;三是用于藥物篩選,利用用藥前后表達(dá)譜的改變,通過分析病理、生理、生化原理,能高效地篩選出新的藥物或先導(dǎo)化合物。N A 芯片技術(shù)在藥物基因組學(xué)的應(yīng)用, 一方面可加速藥物基因組學(xué)的發(fā)展;另一方面: D N A 芯片利用藥物基因組學(xué)的研究成果, 根據(jù)基因型將人群劃分為各種類型。D N A芯片可自動(dòng)快速地檢測哪些可影響藥物效應(yīng)的基因(為藥物代謝酶、藥物作用靶標(biāo)等)例如設(shè)計(jì)一種淋巴白血病藥物基因組芯片, 包括所有可能影響病人化療反應(yīng)的基因, 借助于這種芯片, 根據(jù)病人的基因型分類, 醫(yī)生為每一個(gè)病人選擇合適的治療藥物和劑量。

2.5 外源基因

導(dǎo)入宿主細(xì)胞的外源基因,通過基因表達(dá)得到相應(yīng)的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。根據(jù)宿主細(xì)胞的不同可分為原核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)和真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。在外源基因表達(dá)時(shí),通常把一個(gè)報(bào)告蛋白的基因與一個(gè)目的蛋白的基因融合在一起,形成融合蛋白,用于目的蛋白的檢測與純化。常用的報(bào)告蛋白有β-半乳糖苷酶(β-gal-actosidase)、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione s-transfer-ase,GST)、綠色熒光蛋白(green fluorescence protein,GFP)以及硫還蛋白(thioredoxin, Trx)等。其中值得一提的是GFP,2008年8月有3位科學(xué)家因此獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng):日本科學(xué)家Osamu Shimomura、美國科學(xué)家Martin Chalfie、美籍華人科學(xué)家錢永健。除了直接標(biāo)記目的蛋白用于檢測與純化外,還可利用某些GFP具有熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescence resonanceenergy transfer,FRET)的現(xiàn)象,用于蛋白質(zhì)折疊[6]、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用[7]、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等[8]方面的研究?，F(xiàn)代生物制藥的現(xiàn)狀

國際上,生物制藥業(yè)主要集中在美國日本和歐洲,其中美國作為生物制藥的發(fā)源地,無論是在經(jīng)費(fèi)投入、產(chǎn)品開發(fā)和研制,還是在產(chǎn)品生產(chǎn)和市場卜都居于國際領(lǐng)先地位,其它開發(fā)的產(chǎn)品和市場銷售額占全球的90%以上。目前, 美國共有生物制藥公司約1400家,具中形成規(guī)模生產(chǎn)的有Alzlgen、Seherir一g一Plougll、EliIJ1l一yMcrk、Gelexlteell等20多家公司。日本在生物技術(shù)的開發(fā)僅次美國, 目前共有生物制藥公司約600家,其中麒麟啤灑、中外制藥、味之素等著名廠商不僅在日本習(xí)內(nèi)處與生物制藥各方面的領(lǐng)先地位,而不斷加強(qiáng)世界市場的開拓,進(jìn)入歐洲和亞洲市場。歐洲在生物技術(shù)的開發(fā)上稍落后于日本但

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近兩年來歐洲在生物技術(shù)的投入和新公司成眾的數(shù)量上急速增長,目前歐洲的生物制藥公司約有300家但還處在發(fā)展的開始階段。

3.1 我國生物制藥的現(xiàn)狀

至2004年我國有現(xiàn)代生物制藥企業(yè)114家，其中疫苗生產(chǎn)企業(yè)28家，可以生產(chǎn)27種基因工程藥物和26種病毒的41種疫苗。按現(xiàn)價(jià)統(tǒng)計(jì)規(guī)定，生物生化制品生產(chǎn)企業(yè)全國409家，總產(chǎn)值220億元，銷售收入196億元。“十五”前四年，平均每年大于20%的速度增長用于該領(lǐng)域的投資不斷加大于固定資產(chǎn)平均增長32.5%。我國現(xiàn)已成為世界疫苗最大生產(chǎn)國年產(chǎn)量超過了10億個(gè)計(jì)量單位。兒科常見病疫苗年產(chǎn)量達(dá)5億人民幣除滿足自用外還向世界衛(wèi)生組織(WHO)提供疫苗產(chǎn)品用于其他國家。

3.2 我國生物制藥存在的問題及應(yīng)采取的措施

我國生物制藥存在一系列問題開發(fā)水平低缺少創(chuàng)新產(chǎn)品生物制藥產(chǎn)業(yè)下游技術(shù)薄弱重復(fù)生產(chǎn)嚴(yán)重、資源浪費(fèi)過大產(chǎn)業(yè)化規(guī)模小、市場競爭無序?？刹扇〉拇胧┮苑轮拼龠M(jìn)創(chuàng)新最終以創(chuàng)新實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)飛躍，多渠道建立融資網(wǎng)絡(luò)改革科研體制建立新的產(chǎn)學(xué)研一體化的機(jī)制，加強(qiáng)國際交流與合作積極應(yīng)對國際競爭加強(qiáng)宏觀調(diào)控強(qiáng)化和規(guī)范財(cái)稅優(yōu)惠政策?；蚬こ淘谏镏扑幹械陌l(fā)展趨勢

目前基因工程藥物的研發(fā)趨勢是:(1)發(fā)展表達(dá)載體:目前最主要的用于生產(chǎn)的表達(dá)載體是哺乳動(dòng)物細(xì)胞和大腸桿菌。大腸桿菌屬于原核表達(dá)系統(tǒng),沒有糖基化功能,只能用于表達(dá)功能蛋白不需要糖基化的重組藥物,如胰島素等,且目的蛋白大量表達(dá)之后易形成包涵體,不易復(fù)性。

而功能蛋白需要糖基化的則主要在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)。也有用真核化的原核表達(dá)載體[9]。目前還有“人源化”酵母表達(dá)體系和植物表達(dá)體系正在發(fā)展。(2)對現(xiàn)有的重組藥進(jìn)行基因工程改造和修飾:通過基因工程的改造和修飾使蛋白藥物在臨床應(yīng)用上更安全更有療效,如G-CSF和EPO等突變體藥物研究與開發(fā)。目前,由于天然基因工程藥物品種的研究已經(jīng)相當(dāng)普遍,因此采取對現(xiàn)有的重組藥進(jìn)行基因工程改造和修飾的策略,既可以避免侵犯知識產(chǎn)權(quán),又可以為新藥研究

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開辟出新途徑。(3)改變給藥途徑:在繼續(xù)改進(jìn)注射用溶液和注射用無菌粉末的穩(wěn)定性之外,還發(fā)展出化學(xué)修飾型、控釋微球型和脈沖式給藥系統(tǒng)。而在鼻腔、口服、直腸、口腔、肺部給藥方面也已取得重大進(jìn)展。生物制藥研究新進(jìn)展

5.1 計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)技術(shù)發(fā)展

計(jì)算機(jī)技術(shù)的發(fā)展和向藥物化學(xué)學(xué)科的滲透，促進(jìn)了藥物設(shè)計(jì)的發(fā)展。20世紀(jì)90年代計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)取得突破性進(jìn)展，現(xiàn)已成為藥物研究和開發(fā)的重要方法和工具。

計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)利用了計(jì)算機(jī)快速、全方位的邏輯推理功能、圖形顯示控制功能，并將量子化學(xué)、分子力學(xué)、藥物化學(xué)、生物化學(xué)和信息科學(xué)結(jié)合起來，研究受體生物分子與藥物結(jié)合部位的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)、藥物與受體復(fù)合物的構(gòu)型和立體化學(xué)特征、藥物與受體結(jié)合的模式和選擇性、特異性、、藥物分子的活性基團(tuán)和藥效構(gòu)象關(guān)系等，從藥物機(jī)理出發(fā)，改進(jìn)現(xiàn)有生物活性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)，快速發(fā)現(xiàn)并優(yōu)化先導(dǎo)化合物，使其盡早進(jìn)入臨床前研究，減少傳統(tǒng)的新藥研究的盲目性，縮短新藥研制的時(shí)間。

計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)有兩類方法，一類是基于機(jī)理的藥物設(shè)計(jì)（MBDD），另一類是基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)（SBDD），基于機(jī)理的藥物設(shè)計(jì)要針對藥物作用機(jī)理，從靶點(diǎn)出發(fā)，考慮藥物與受體的作用過程，并要模擬藥物在體內(nèi)的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝等動(dòng)態(tài)過程，比基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)更合理，但該法還不成熟。目前的計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)主要還是基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)，今后的計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)的目標(biāo)是向基于機(jī)理的藥物設(shè)計(jì)方向發(fā)展。相信隨著生命科學(xué)和計(jì)算機(jī)科學(xué)的發(fā)展，考慮藥物不同作用機(jī)理和全部作用過程的計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)技術(shù)將逐步建立并不斷完善。

5.2 組合化學(xué)與高通量篩選技術(shù)發(fā)展

組合化學(xué)是近20年發(fā)展起來的一種合成大量化合物的新方法，它是建立在高效平行的合成之上，在同一個(gè)反應(yīng)器內(nèi)使用相同條件同時(shí)制備出多種化合物，建立各類化合物庫的策略。組合化學(xué)通常采用操作、分離簡便的固相化學(xué)合成。液

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相化學(xué)合成技術(shù)也在快速發(fā)展和完善中。

在藥物研究過程中，通過化合物活性篩選而獲得具有藥物活性的先導(dǎo)化合物是新藥研究的基礎(chǔ)。隨著分子水平的藥物篩選模型的建立，篩選方法和技術(shù)都發(fā)生了根本性的變化，出現(xiàn)了高通量篩選的新技術(shù)，大大加快了先導(dǎo)化合物的尋找和發(fā)現(xiàn)，并促進(jìn)了高通量有機(jī)合成。近年來，組合化學(xué)與高通量篩選結(jié)合，使組合化學(xué)的化合物庫種類、數(shù)量不斷擴(kuò)大，篩選的先導(dǎo)化合物數(shù)量和種類也在不斷地增多，使新藥的種類和數(shù)量也在不斷地增加。組合化學(xué)實(shí)現(xiàn)的自動(dòng)化合成僅20世紀(jì)90年代后得到的各類化合物總和已超過了人類有史以來所發(fā)現(xiàn)化合物的總和，故有人把組合化學(xué)與高通量篩選結(jié)合技術(shù)稱為“新藥發(fā)現(xiàn)的高速公路”，據(jù)文獻(xiàn)記載，1992年～1998年的幾年，經(jīng)過組合化學(xué)化合物庫與高通量篩選，確定的候選藥物已有46個(gè)，并已進(jìn)入人體測試階段。[10]顯然，組合化學(xué)與高質(zhì)量篩選的結(jié)合技術(shù)，大大地加快了新藥研制的步伐。雖然如此，組合化學(xué)建立的大型化合物庫，為篩選也帶來了困難，因此，利用組合化學(xué)設(shè)計(jì)，構(gòu)建具有結(jié)構(gòu)多樣性的小型而便于篩選的組合化合物庫，結(jié)合化學(xué)信息學(xué)和高通量篩選，將是組合化學(xué)與高通量篩選結(jié)合的一項(xiàng)重要課題。

5.3 藥物手性合成技術(shù)發(fā)展

化學(xué)合成技術(shù)在新藥發(fā)現(xiàn)過程中發(fā)揮著十分重要的作用。近年來由于有機(jī)化學(xué)學(xué)科新理論、新反應(yīng)、新技術(shù)不斷發(fā)現(xiàn)，使得合成反應(yīng)具有化學(xué)選擇性成為現(xiàn)實(shí)，并促進(jìn)了藥物合成技術(shù)的快速發(fā)展，其中手性合成技術(shù)使新藥研制的領(lǐng)域不斷擴(kuò)大。

手性是自然界的本質(zhì)屬性。在生物體手性環(huán)境，如酶、受體、離子通道、蛋白質(zhì)、載體中，分子之間手性匹配是分子識別的基礎(chǔ)，受體與配體的專一作用，酶與底物的高度、區(qū)域、位點(diǎn)和立體催化專一性，抗原與抗體的免疫識別都與手性有關(guān)，同時(shí)藥物的生物應(yīng)答常受到手性影響，包括藥物在體內(nèi)的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)、分配、位點(diǎn)活性的作用以及代謝和消除。所以，手性藥物的開發(fā)是當(dāng)前醫(yī)藥界重點(diǎn)研究的熱點(diǎn)之一，并取得了令人注目的成就。目前已上市的藥物中手性藥物約占1/3，如2000年全球手性藥物銷售額達(dá)1233億美元。

手性藥物的制備技術(shù)主要有拆分法、化學(xué)合成法和生物合成等三大類，發(fā)展較快的是后二類?；瘜W(xué)合成法是在不對稱催化劑存在下，利用化學(xué)反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)

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和熱力學(xué)不對稱性，進(jìn)行單一對映體合成。在已上市的手性藥物中，其手性中間體均可通過現(xiàn)有的重（雙）鍵不對稱還原技術(shù)，特別是不對稱氫化和不對稱轉(zhuǎn)移氫化來合成。至今為止在不對稱催化合成中，昂貴的手性配體和貴金屬的使用，以及手性催化劑的催化效率仍是制約其在手性技術(shù)上應(yīng)用的關(guān)鍵。因而，手性催化劑的設(shè)計(jì)和合成，以及催化劑的回收循環(huán)使用是當(dāng)今不對稱催化合成研究的方向。

生物合成法則利用催化劑, 酶-催化反應(yīng)的高度、底物、區(qū)域、位點(diǎn)和立體選擇性來合成手性藥物。生物合成法具有選擇性高、產(chǎn)率高、反應(yīng)條件溫和等特點(diǎn)，隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，生物合成法將成為手性制備的高效手段。

5.4 藥物生物技術(shù)發(fā)展[11]

生物技術(shù)藥物是指利用DNA重組技術(shù)或單克隆抗體技術(shù)或其它生物技術(shù)研制的蛋白質(zhì)、抗體或核酸類藥物，它是目前生物技術(shù)研究最為活躍的領(lǐng)域，給生命科學(xué)的研究和生物制藥工業(yè)帶來了革命性變化。

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