第一篇：彭文豪運動生物化學(xué)實驗報告

用pH試紙檢測晨尿的酸堿度實驗報告

課程：運動生物化學(xué)實驗名稱：用pH試紙檢測晨尿的酸堿度實驗 實驗時間：2013年4月18日實驗地點：長江大學(xué)新體育館

姓名：彭文豪班級：體教11001班

學(xué)號：201000290得分：

實驗?zāi)康模簩W(xué)習(xí)并掌握如何用pH試紙檢測晨尿的酸堿度，討論尿液的成分以及24訓(xùn)小時練對尿液成分的影響。

實驗原理： pH試紙是用來檢測液體或氣體酸堿度的工具,pH 英文全名hydrogen ion concentration，氫離子濃度指數(shù)。這是一種現(xiàn)成的試紙，想要使用時，撕下一條，放在平整的玻璃器上。然后用一支干燥的玻璃棒或滴管從玻璃容器中蘸取一滴溶液滴到pH試紙的中部,從它的顏色變化中可以知道溶液的酸堿度。pH試紙遇酸變紅，遇堿變藍(lán)。通過試紙變化的顏色與標(biāo)準(zhǔn)的比色卡的顏色進行對照，我們大致可以知道溶液的的pH值了。想要檢測尿液的酸堿度，我們可以采用早晨起床的第一次的尿液，這樣我們檢測的值會相對比較準(zhǔn)確。實驗器材：1個玻璃杯、玻璃棒、pH試紙、標(biāo)準(zhǔn)比色卡、記錄的工具、清潔劑、干抹布、手機上的秒表

實驗對象： 測試者：彭文豪（網(wǎng)球?qū)ｍ棧┯涗泦T：彭文豪

實驗步驟：

1、清晨起床后開始收集自己未進食的尿液，盛放在玻璃杯中，并放在可測量的桌面上。

2、取出保存好的pH試紙，撕下一片，并將其他的pH試紙繼續(xù)放在容器中好好保存同時把標(biāo)準(zhǔn)的比色卡平整的放在便于自己觀察的桌面上。

3、取出干燥的玻璃棒，從玻璃杯中蘸取一滴尿液，滴到pH試紙的中部。14、過了半分鐘，觀察pH試紙的顏色變化，與標(biāo)準(zhǔn)的比色卡進行對照，觀察出自己的尿液pH值，記錄下各自的數(shù)據(jù)。

5、大約過2分鐘之后進行第二次實驗，重復(fù)第一次的實驗步驟。并記錄結(jié)果。倒掉剩余的盛放在玻璃杯中的尿液，清洗干凈玻璃杯玻璃棒。并及時歸還儀器。

6、通過檢測出來的pH值，分析尿液是否正常，或者是造成尿液過酸或過堿的原因。

實驗結(jié)果：

1，第一次測得彭文豪同學(xué)晨尿的pH值為6，第二次測得的結(jié)果為7。正常的尿液的pH值在5.5到7.4之間，所以,彭文豪同學(xué)晨尿的pH值在正常的范圍內(nèi)。

2，尿液的成分有水：95 %蛋白質(zhì)，0%葡萄糖，0%尿素，1.8 %尿酸，0.05%無機鹽1.1%。

3，兩次測得的結(jié)果不一樣是由于我們生活的大氣中到處都是有細(xì)菌的。尿液放置一段時間后，會被細(xì)菌分解，自然產(chǎn)生了氨氣，氨氣成弱堿性，所以在第二次測試的結(jié)果上，尿液的pH值有所升高。

4，作為羽毛球?qū)ｍ椘褲瑢W(xué)第一次的測試結(jié)果是5，第二次的測試的結(jié)果是6.而尿液的酸堿度的不同也是有許多方面的因素構(gòu)成的，經(jīng)調(diào)查蒲濤同學(xué)在前一天在激烈的網(wǎng)球運動過程中，機體處于缺氧狀態(tài)，導(dǎo)致大量氧化不全，產(chǎn)物如乳酸、酮體和丙酮酸等酸性物質(zhì)堆積，從而使尿PH值明顯下降，尿液PH值可達(dá)5—6程度。而彭文豪同學(xué)進食正常，運動量也不大，所以尿液檢測結(jié)果基本正常。而蒲濤同學(xué)檢測結(jié)果相對呈酸性尿液。5，結(jié)論：飲食和運動的劇烈性可以影響人的尿液的酸堿度。

測試者：彭文豪被測試者：彭文豪記錄員：彭文豪評分人：彭文豪

第二篇：生物化學(xué)實驗報告格式

《生物化學(xué)實驗》

實驗報告本

專業(yè)

班級

姓名

學(xué)號

目錄

實驗一 基本操作

實驗二 血糖測定

實驗三 血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶的測定 實驗四 血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳 實驗五 凝膠層析（分子篩層析）

實驗六 飽食和饑餓對白鼠肝糖原含量的比較 實驗七 血清脂蛋白瓊脂糖凝膠電泳 實驗八 分離純化基因組DNA

（一）實驗九 分離純化基因組DNA

（二）實驗十 PCR

實驗十一 瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物

實驗題目

1.實驗?zāi)康?.實驗原理

3.實驗步驟

4.實驗數(shù)據(jù)及處理（或?qū)嶒灛F(xiàn)象及分析）

5.結(jié)論

6.討論

《生物化學(xué)實驗》

預(yù)習(xí)與原始記錄本

專業(yè)

班級

姓名

學(xué)號

目錄

實驗一 基本操作

實驗二 血糖測定

實驗三 血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶的測定

實驗四 血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳 實驗五 凝膠層析（分子篩層析）

實驗六 飽食和饑餓對白鼠肝糖原含量的比較 實驗七 血清脂蛋白瓊脂糖凝膠電泳 實驗八 分離純化基因組DNA

（一）實驗九 分離純化基因組DNA

（二）實驗十 PCR

實驗十一 瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物

實驗題目

1.預(yù)習(xí)報告

1.1實驗?zāi)康?.2實驗流程

1.3 預(yù)計結(jié)果

1.4注意事項

2.實驗原始數(shù)據(jù)記錄（或?qū)嶒灛F(xiàn)象）

第三篇：運動控制上機實驗報告

基于SIMULINK的雙閉環(huán)直流調(diào)速系統(tǒng)仿真

張磊

（江南大學(xué) 物聯(lián)網(wǎng)工程學(xué)院, 江蘇 無錫 214122)摘要：本文首先介紹了雙閉環(huán)直流調(diào)速系統(tǒng)的組成及其特性，接著建立了其動態(tài)數(shù)學(xué)模型，分析了其動態(tài)性能，并通過SIMULINK仿真技術(shù)研究了其抗負(fù)載擾動能力。實驗結(jié)果表明，雙閉環(huán)直流調(diào)速系統(tǒng)具有良好的抗負(fù)載擾動特性。

關(guān)鍵詞:抗負(fù)載擾動 動態(tài)數(shù)學(xué)模型 動態(tài)性能 SIMULINK The double-loop DC speed control system simulation

Based on SIMULINK

Zhang Lei(School of Internet of Things Engineering, Jiangnan University, Wuxi Jiangsu 214122, China)Abstract:This paper introduces the double-loop DC speed system components and their characteristics, and then built its dynamic mathematical model to analyze its dynamic performance, and through SIMULINK simulation technology for its anti-load disturbances.Experimental results show that the double-loop DC speed control system has a good anti-load disturbance characteristics.Keywords: Anti-load disturbance Dynamic mathematical model Dynamic Performance SIMULINK

1引言

轉(zhuǎn)速、電流雙閉環(huán)直流調(diào)速系統(tǒng)調(diào)速范圍寬、平穩(wěn)性好、穩(wěn)速精度高以及具有良好的動態(tài)性能，廣泛應(yīng)用于冶金、建材、印刷、電纜、機床和礦山等行業(yè)，在拖動領(lǐng)域中發(fā)揮著極其重要的作用，具有動態(tài)響應(yīng)快、抗干擾能力強等優(yōu)點。采用PI調(diào)節(jié)的單個轉(zhuǎn)速閉環(huán)直流調(diào)速系統(tǒng)可以在保證系統(tǒng)穩(wěn)定的前提下實現(xiàn)轉(zhuǎn)速無靜差，但是，如果對系統(tǒng)的動態(tài)性能要求較高，例如要求快速起制動，突加負(fù)載動態(tài)速降小等等，單閉環(huán)系統(tǒng)就難以滿足需要，可以采用轉(zhuǎn)速和電流兩個調(diào)節(jié)器構(gòu)成轉(zhuǎn)速、電流雙閉環(huán)調(diào)速系統(tǒng)，以獲得近似理想的過渡過程。

圖1 轉(zhuǎn)速、電流雙閉環(huán)直流調(diào)速系統(tǒng) 為了獲得良好的靜、動態(tài)性能，轉(zhuǎn)速和電流兩個調(diào)節(jié)器一般采用PI調(diào)節(jié)器，這樣構(gòu)成的雙閉環(huán)直流調(diào)速系統(tǒng)的電路原理圖，如圖2所示。圖中標(biāo)出了兩個調(diào)節(jié)器輸入輸出電壓的實際極性，它們是按照電力電子變換器的控制電壓Uc為正電壓的情況標(biāo)出的，并考慮到運算放大器的倒相作用。圖中還表示了兩個調(diào)節(jié)器的輸出都是帶限幅作用的，轉(zhuǎn)速調(diào)節(jié)器ASR的輸出限幅電壓Um*決定了電流給定電壓的最大值，電流調(diào)節(jié)器ACR的輸出限幅電壓Ucm限制了電力電子變換器的最大輸出電壓Udm。

2雙閉環(huán)雙閉環(huán)直流調(diào)速系統(tǒng)的組成及其特性

2.1轉(zhuǎn)速、電流雙閉環(huán)直流調(diào)速系統(tǒng)的組成

為了實現(xiàn)轉(zhuǎn)速和電流兩種負(fù)反饋分別起作用，在系統(tǒng)中設(shè)置了兩個調(diào)節(jié)器，分別調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速和電流，即分別引入轉(zhuǎn)速負(fù)反饋和電流負(fù)反饋。二者之間實行嵌套連接，如圖1所示。即把轉(zhuǎn)速調(diào)節(jié)器的輸出當(dāng)作電流調(diào)節(jié)器的輸入，再用電流調(diào)節(jié)器的輸出去控制電力電子變換器UPE。從閉環(huán)結(jié)構(gòu)上看，電流環(huán)在里面，稱作內(nèi)環(huán)；轉(zhuǎn)速環(huán)在外邊，稱作外環(huán)。這就形成了轉(zhuǎn)速、電流雙閉環(huán)調(diào)速系統(tǒng)。

圖2 雙閉環(huán)直流調(diào)速系統(tǒng)電路

原理圖 2.2穩(wěn)態(tài)結(jié)構(gòu)圖和靜特性

雙閉環(huán)直流系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)結(jié)構(gòu)圖如圖3所示，分析雙閉環(huán)調(diào)速系統(tǒng)靜特性的關(guān)鍵是掌握PI調(diào)節(jié)器的穩(wěn)穩(wěn)態(tài)特征，一般存在兩種狀況：飽和——輸出達(dá)到限幅值；不飽和——輸出未達(dá)到限幅值。當(dāng)調(diào)節(jié)器飽和時，輸出為恒值，輸入量的變化不再影響輸出，除非有反向的輸入信號使調(diào)節(jié)器推出飽和，此時飽和的調(diào)節(jié)器暫時隔斷了輸入和輸出間的聯(lián)系，相當(dāng)與使該調(diào)節(jié)環(huán)開環(huán)。當(dāng)調(diào)節(jié)器不飽和時，PI作用使輸入偏差電壓?U在穩(wěn)太時總是為零。

實際上，在正常運行時，電流調(diào)節(jié)器是不會達(dá)到飽和狀態(tài)的。因此，對于靜特性來說，只有轉(zhuǎn)速調(diào)節(jié)飽和與不飽和的兩種情況。

圖3 雙閉環(huán)直流調(diào)速系統(tǒng)的

穩(wěn)態(tài)結(jié)構(gòu)框圖

3雙閉環(huán)直流調(diào)速系統(tǒng)的數(shù)學(xué)模型

3.1雙閉環(huán)調(diào)速系統(tǒng)的動態(tài)數(shù)學(xué)模型

雙閉環(huán)控制系統(tǒng)數(shù)學(xué)模型的主要形式仍然是以傳遞函數(shù)或零極點模型為基礎(chǔ)的系統(tǒng)動態(tài)結(jié)構(gòu)圖。雙閉環(huán)直流調(diào)速系統(tǒng)的動態(tài)結(jié)構(gòu)框圖如圖4所示，圖中WASR(s)和WACR(s)分別表示轉(zhuǎn)速調(diào)節(jié)器和電流調(diào)節(jié)器的傳遞函數(shù)。為了引出電流反饋，在電動機的動態(tài)結(jié)構(gòu)框圖中必須把電樞電流Id顯露出來。

圖4 雙閉環(huán)直流調(diào)速系統(tǒng)的

動態(tài)結(jié)構(gòu)框圖

3.2起動過程分析

雙閉環(huán)調(diào)速系統(tǒng)突加給定電壓Un*由靜止?fàn)顟B(tài)起動時，轉(zhuǎn)速和電流的動態(tài)過程如圖5所示。在起動過程中轉(zhuǎn)速調(diào)節(jié)器ASR經(jīng)歷了不飽和、飽和、退飽和三種情況，整個動態(tài)過程分成圖中標(biāo)明的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三個階段。

圖5 雙閉環(huán)直流調(diào)速起動過程的

轉(zhuǎn)速和電流波形

第I階段（0—t1）電流上升的階段。突加給定

電壓 Un*后，Id上升，當(dāng)Id小于負(fù)載電流IdL時，電

機還不能轉(zhuǎn)動。當(dāng)Id≥IdL后，電機開始起動，由于機電慣性作用，轉(zhuǎn)速不會很快增長，轉(zhuǎn)速調(diào)節(jié)器ASR輸入偏差電壓仍較大，ASR很快進入飽和狀態(tài)，而ACR一般不飽和。直到Id≈Idm，Ui≈Uim*。在這一階段中，ASR很快進入并保持飽和狀態(tài)，ACR一直不飽和。

第II階段（t1--t2）恒流升速階段。ASR始終

是飽和的，轉(zhuǎn)速環(huán)相當(dāng)于開環(huán)，系統(tǒng)為在恒值電流Uim*給定下的電流調(diào)節(jié)系統(tǒng)，基本上保持電流Id恒定，因而系統(tǒng)的加速度恒定，轉(zhuǎn)速呈線性增長，直到n=n*。電機的反電動勢E也按線性增長，對電流調(diào)節(jié)系統(tǒng)來說，E是一個線性漸增的擾動量，為了克服它的擾動，Ud0和Uc也必須基本上按線性增長，才能保持Id恒定。當(dāng)ACR采用PI調(diào)節(jié)器時，要使其輸出量按線性增長，其輸入偏差電壓必須維持一定的恒值，也就是說，Id應(yīng)略低于Idm。在這一階段，ASR處于飽和狀態(tài)，電流無靜差系統(tǒng)，轉(zhuǎn)速線性上升，Id略小于Idm。

第Ⅲ階段（t2 以后）轉(zhuǎn)速調(diào)節(jié)階段。ASR

和ACR都不飽和，ASR起主導(dǎo)作用，ACR力圖使

Id盡快地跟隨Ui*，或者說，電流內(nèi)環(huán)是一個電流隨動子系統(tǒng)。當(dāng)n=n*時，ASR輸入偏差為零，但其輸出卻由于積分作用還維持在限幅值Uim*，所以電機仍在加速，使轉(zhuǎn)速超調(diào)。ASR輸入偏差電壓變負(fù)，開始退出飽和，Ui*和Id很快下降。但是，只要Id仍大于負(fù)載電流IdL，轉(zhuǎn)速就繼續(xù)上升。直到Id=IdL時，轉(zhuǎn)矩Te=TL，則dn/dt=0，轉(zhuǎn)速n才到達(dá)峰值（t=t3時）。此后，電動機在負(fù)載的阻力下減速，在一小段時間內(nèi)（t3-t4），Id

綜上所述，雙閉環(huán)直流調(diào)速系統(tǒng)的起動過程有以下三個特點：（1）飽和非線性控制；（2）轉(zhuǎn)速超調(diào)；（3）準(zhǔn)時間最優(yōu)控制。

4雙閉環(huán)直流調(diào)速系統(tǒng)的抗負(fù)載擾動仿真

雙閉環(huán)調(diào)速系統(tǒng)一般來說具有比較滿意的動態(tài)性能。對于調(diào)速系統(tǒng)，最重要的動態(tài)性能是抗干擾性。主要是抗負(fù)載擾動和抗電網(wǎng)電壓擾動的性能。本文研究了雙閉環(huán)調(diào)速系統(tǒng)的抗負(fù)載擾動性能。

雙閉環(huán)調(diào)速系統(tǒng)的抗負(fù)載擾動結(jié)構(gòu)圖如圖5所示，負(fù)載擾動作用在電流環(huán)之后，因此只能靠轉(zhuǎn)速調(diào)節(jié)器ASR來產(chǎn)生抗負(fù)載擾動的作用。

圖5 雙閉環(huán)調(diào)速抗負(fù)載擾動作用

本文研究了雙閉環(huán)調(diào)速系統(tǒng)的抗負(fù)載擾動性能，基于MATLAB/SIMULINK接線圖如圖6所示，無擾動信號、階躍擾動信號、正弦擾動信號作用下輸出轉(zhuǎn)速仿真結(jié)果如圖7的（a）（b）（c）所示。

圖6雙閉環(huán)調(diào)速系統(tǒng)的抗負(fù)載擾動接線圖

(a)無擾動信號

（b）階躍擾動信號

（c）正弦擾動信號

實驗結(jié)果表明，IdL改變時，負(fù)載擾動能較快的反映到被調(diào)量n上，從而得到調(diào)節(jié)，該系統(tǒng)具有很好的抗負(fù)載擾動性能。小結(jié)

由雙閉環(huán)調(diào)速系統(tǒng)抗負(fù)載擾動作用的動態(tài)結(jié)構(gòu)圖可以看出，負(fù)載擾動作用在電流環(huán)之外，轉(zhuǎn)速環(huán)之內(nèi)，所以雙閉環(huán)調(diào)速系統(tǒng)在抗擾動方面和單閉環(huán)調(diào)速系統(tǒng)只能依靠轉(zhuǎn)速環(huán)來進行抗擾調(diào)節(jié)。通過以上的仿真實驗，轉(zhuǎn)速環(huán)有效地抑制并消除了負(fù)載擾動的影響。

參考文獻(xiàn)：

[1]王兆安，等.電力電子技術(shù)[M].北京：機械工業(yè)出版社，2000.[2]張廣溢，等.電機學(xué)[M].重慶：重慶大學(xué)出版社，2002.[3]王軍.自動控制原理[M].重慶：重慶大學(xué)出版社，2008.[4]導(dǎo)向科技.Protel DXP電子電路設(shè)計培訓(xùn)教程[M].北京：人民郵電大學(xué)出版社，2003.[5]周淵深.交直流調(diào)速系統(tǒng)與Matlab仿真[M].北京：中國電力出版社，2004.

第四篇：運動生物化學(xué)期末考試重點 體育系

一名詞解釋

1運動生物化學(xué)：是研究人體運動時體內(nèi)的化學(xué)變化即物質(zhì)代謝及其調(diào)節(jié)的特點與規(guī)律，研究運動引起體內(nèi)子水平適應(yīng)性變化及其機理的一門學(xué)科。2新陳代謝：生物體內(nèi)不斷進行著的化學(xué)變化 3酶：具有催化功能的蛋白質(zhì)。酶催化反應(yīng)的能力稱為酶活性

4限速酶：催化能力較弱，對整個代謝過程反應(yīng)速度起控制作用的酶

5激活劑：凡是能提酶活性的物質(zhì) 6抑制劑：凡是能降低酶活性或使酶活性喪失的物質(zhì) 7維生素：是維持人體生長發(fā)育和代謝所必需的一類小分子有機物 8生物氧化：指物質(zhì)在體內(nèi)氧化成二氧化碳和水，并釋放能量的過程

9呼吸鏈：線粒體內(nèi)膜上的一系列遞氫、遞電子體按一定順序排列，形成一個連續(xù)反應(yīng)的生氧化結(jié)構(gòu)，稱為呼吸鏈

10底物水平磷酸化：代謝物分子的高能磷酸基直接轉(zhuǎn)移給ADP生成ATP的方式

11氧化磷酸化：代謝物脫下的氫，經(jīng)呼吸鏈傳遞，最終生成水，同時伴有ADP磷酸化合成ATP的過程

12糖：是一類含有多羥基的醛類或酮類化合物的總稱

13糖酵解：糖在氧供應(yīng)不足的情況下，經(jīng)細(xì)胞液中一系列酶催化，最后生成乳酸的過程 14三羧酸循環(huán)：由乙酰輔酶A與草酰乙酸縮合成檸檬酸開始，經(jīng)過反復(fù)的脫氫、脫羧再形成草酰乙酸的循環(huán)過程

15糖的有氧氧化：葡萄糖或糖原在有氧條件下氧化分解，生成二氧化碳和水，同時釋放出大量能量的過程

16乳酸閾：在遞增負(fù)荷運動中，血乳酸濃度隨運動負(fù)荷遞增而增加，當(dāng)運動強度達(dá)到某一負(fù)荷時乳酸濃度急劇上升的一個人拐點稱乳酸閾

17糖異生作用：由非糖物質(zhì)（丙酮酸、乳酸、甘油、生糖氨基酸等）轉(zhuǎn)變成葡萄糖或糖原的過程

18必要脂肪酸：維持人體正常生長所需而體內(nèi)不能合成必須從食物中攝取的脂肪酸

19必需氨基酸：機體無法自身合成必須由食物途徑獲得的氨基酸

20脂肪動員：脂肪細(xì)胞內(nèi)儲存的脂肪經(jīng)脂肪酶催化水解釋放出脂肪酸，并進入血液循環(huán)供給全身各組織攝取利用的過程

21聯(lián)合脫氨基作用：是俺基酸分解代謝的主要途徑，結(jié)果是脫下氨基

22運動性疲勞：由于運動引起的機體機能水平下降或運動能力下降，從而難以維持一定的運動強度，但經(jīng)過適當(dāng)休息后可以恢復(fù)的現(xiàn)象

23酮體：肝臟細(xì)胞內(nèi)，脂肪酸氧化不完全，生成的乙酰輔酶A有一部分轉(zhuǎn)變成乙酰乙酸、B-羥丁酸、丙酮，這三種物質(zhì)統(tǒng)稱酮體

24中樞疲勞：由運動訓(xùn)練引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)不能產(chǎn)生和維持足夠的沖動給肌肉以滿足運動所需的現(xiàn)象

25外周疲勞：運動引起的骨骼肌功能下降，不能維持預(yù)定收縮強度的半所需要的時間也稱半時反應(yīng)現(xiàn)象

26超量恢復(fù)：在運動中消耗的能源物質(zhì)在運動后一段時間內(nèi)不僅恢復(fù)到原來水平，甚至超過原來水平的現(xiàn)象

27半時反應(yīng)：運動中消耗的物質(zhì)，在運動后的恢復(fù)期中，數(shù)量增加至運動前數(shù)量的一半所需要的時間，而運動中代謝的產(chǎn)物在運動后的恢復(fù)期中，數(shù)量減少一 半所需要的時間也稱半時反應(yīng)

28酶促反應(yīng)：酶催化的反應(yīng)

29脂肪酸的B-氧化：之指脂肪酸在一系列酶的作用下，在@、B-碳原子之間斷裂，B-碳原子被氧化結(jié)羧基，成成兩個碳原子的乙酰輔酶A和較原來少兩個碳原子的脂肪酸 30轉(zhuǎn)氨基作用：又稱氨基轉(zhuǎn)移作用，是指某一氨基酸與@-酮戊二酸進行氨基轉(zhuǎn)移反應(yīng)，生成相應(yīng)的@-酸酮和谷氨酸二填空題

1從生化的視角看，組成人體的基本單位是：分子

2組成人體物質(zhì)的分類：能源物質(zhì)、非能源物質(zhì)

3新陳代謝包括：合成代謝、分解代謝

4酶的分子組成：單純酶、結(jié)合酶（全酶）5酶催化反應(yīng)特點：高效性、高度專一性、可調(diào)控性、不穩(wěn)定性

6影響酶促反應(yīng)的因素：底物濃度與酶濃度、PH值、溫度、激活劑和抑制劑

7在血液中直接發(fā)揮作用的酶（功能性血清酶）：脂蛋白脂肪酶、凝血酶 8糖酵解的終產(chǎn)物是乳酸，有氧氧化的終產(chǎn)物是二氧化碳和水，蛋白質(zhì)的終產(chǎn)物是氨氣、二氧化碳和水

9高能化合物分為：高能磷酸化合物、高能硫酯化合物

10糖酵解在細(xì)胞質(zhì)中進行，其他生物氧化過程都需要在線粒體進行

11呼吸鏈類型：NADH+氧化呼吸鏈、虎珀酸氧化呼吸鏈

12呼吸鏈組成成分：遞氫體、遞電子體 13ATP合成方式：氧化磷酸化、底物水平磷酸化

14血糖濃度在空腹時較恒定，大約為4.4~6.6mmol/L

15運動后乳酸的代謝去路：乳酸的氧化、乳酸的糖異生、在肝臟合成其他物質(zhì)

16糖分為結(jié)合糖和自由糖，糖原分為肝糖原和肌糖原17合成糖原的器官：肝臟和饑肉 18糖異生原料：丙酮酸、乳酸、甘油、生糖氨基酸

20血糖濃度超過腎糖閾8.8mmol/L時出現(xiàn)糖尿現(xiàn)象

21肌糖原特點：含量大，能直接被利用，只能由葡萄糖合成，不能分解成葡萄糖

22ATP分子是由腺嘌呤、核糖、3個磷酸基團組成23聯(lián)合脫氨基作用包括：轉(zhuǎn)氨基作用、氧化脫氨基作用

24疲勞鏈假說是用來解釋運動性外周疲勞發(fā)生機制的25三大供能系統(tǒng)：磷酸原供能系統(tǒng)、有氧氧化供能系統(tǒng)、糖酵解供能系統(tǒng)

26提高磷酸原供能的訓(xùn)練方法：最大強度間歇訓(xùn)練法、重復(fù)訓(xùn)練法

27發(fā)展糖酵解供能系統(tǒng)的方法：最高乳酸訓(xùn)練法、乳酸耐受力訓(xùn)練法 28必需氨基酸：異亮氨酸、甲硫氨酸、賴氨酸、纈氨酸、亮氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸

29糖原合成的原材料：血液中的葡萄糖，重要器官：肝臟、肌肉，場所：細(xì)胞液，能量消耗：ATP

30升高血糖的激素：腎上腺素、去甲腎上腺素、胰高血糖素、糖皮質(zhì)激素，降低血糖的是胰島素

31必需脂肪酸：亞麻酸、亞油酸

32脂肪酸B-氧化作用包括：脫氫、水化、再脫氫、硫解

33糖酵解過程中的限速酶：己糖激酶、磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶

34運動性疲勞分為：中樞疲勞和外周疲勞 35ATP功能：生命活動的直接能源，合成磷酸肌酸和其他高能磷酸化合物三簡答題

1生物氧化合成ATP有幾種形式，有何異同？ 相同：合成ATP.不同：

氧化磷酸化：是最主要的方式，需要消耗氧，生成能量多；

底物水平磷酸化：不直接消耗氧，生成的能量少，主要為無氧代謝運動中肌肉收縮提供能量

2生物氧化一般過程及其特點？ 過程：

(1)糖、脂肪、蛋白質(zhì)經(jīng)分解代謝生成乙酰輔酶A

(2)乙酰輔酶進入三羧酸循環(huán)四次脫氫使

NAD+和FA還原成NADHH+和FADH2，兩次脫羧生成二氧化碳

(3)NADHH+和FADH2中氫經(jīng)呼吸鏈將電子傳遞給氧生成水，氧化過程放出的能量用于合成ATP 特點：

(1)物質(zhì)的氧化方式主要為脫氫

(2)在細(xì)胞內(nèi)37'C及近中性水環(huán)境中，通過酶的催化作用逐步進行

(3)物質(zhì)中的能量逐步釋放，ATP生成效率高(4)生物氧化中生成的水由物質(zhì)脫下的氫與氧結(jié)合產(chǎn)生，二氧化碳由有機酸脫羧產(chǎn)生 3糖異生的意義？

(1)彌補體內(nèi)糖量不足，維持血糖相對穩(wěn)定(2)乳酸異生為糖有利于運動中乳酸消除

4簡述人體血糖、血乳酸來源、去路，血糖如何保持動太平衡？

血糖來源：食物中的肌糖原，去路：供應(yīng)能量，以糖原的形式儲存在器官中。

血乳酸來源：骨骼肌細(xì)胞中的糖原或葡萄糖，去路：乳酸的氧化，乳酸的糖異生，在肝臟合成其他物質(zhì)。

血糖的調(diào)節(jié)：組織器官的調(diào)節(jié)、激素調(diào)節(jié)、神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)

5肌糖原儲量與運動能力的關(guān)系？

(1)與無氧運動：劇烈的短時間運動中，肌肉中由于缺氧，糖原可經(jīng)糖酵解轉(zhuǎn)變?yōu)槿樗岱懦瞿芰抗┻\動之需，但一般不會引起明顯的糖原耗竭反應(yīng)或者發(fā)生低血糖癥

(2)與有氧氣運動：在長時間大強度運動中，運動前肌糖原儲量決定了運動員達(dá)到運動力竭的時間

6脂肪酸的B-氧化過程？

(1)脂肪酸的活化：在酯酰輔酶A合成酶的作用下，脂肪酸轉(zhuǎn)變?yōu)橹］o酶A的過程，該過程需要輔酶A和ATP參與

(2)脂酰輔酶A進入線粒體：脂肪酸的B-氧化是在線粒體基質(zhì)中進行的，而在細(xì)胞液中形成的脂酰輔酶A不能透過線粒體內(nèi)膜(3)脂酰輔酶A的B-氧化：脂酰輔酶A進入線粒體后，經(jīng)歷多次B-氧化作用而逐步降解成多個乙酰輔酶A。每次B-氧化包括：脫氫、水化、再脫氫、硫解四個過程 7酮體代謝的意義？

(1)酮體是體內(nèi)能源物質(zhì)轉(zhuǎn)運輸?shù)囊环N形式(2)酮體參與腦組織和肌肉的能量代謝(3)參與脂肪酸動員的調(diào)節(jié)

(4)血、尿酮體濃度可評定體內(nèi)糖儲備狀況 8運動對血漿游離脂肪酸的利用有何影響？ 短時間大強度運動時，骨骼肌攝取血漿游離脂肪酸的數(shù)量有限，血漿游離脂肪酸的供能意義不大，超過20~30min長時間中等運動中，血漿中游離脂肪酸持續(xù)而緩慢升高，肌細(xì)胞吸收血漿游離脂肪酸供能的比例增大，運動結(jié)束后，脂肪酸的利用率減少，而脂肪水解仍維持在較高水平，在運動結(jié)束后15min時血漿游離脂肪酸達(dá)到最高水平時，然后再逐漸下降到靜息狀態(tài)水平

9簡述血漿脂蛋白的分類與功能？ 乳糜微粒(CM)：外源性脂肪的主要運輸形式，極低密度脂蛋白(VLDL)：內(nèi)源性脂肪的主要運輸形式，低密度脂蛋白(LDL)：將肝臟合成的內(nèi)源性膽固醇轉(zhuǎn)運至外周組織，并調(diào)節(jié)膽固醇的合成，高密度脂蛋白(HDL)：完成膽固醇的逆向轉(zhuǎn)運，把外周組織的游離膽固醇轉(zhuǎn)運至肝得到清除10氨基酸分解代謝的過程？

(1)轉(zhuǎn)氨基作用：某一氨基酸與@-酮戊二酸進行氨基轉(zhuǎn)移反應(yīng)，生成相應(yīng)的@-酮酸和谷氨酸。

(2)氧化脫氨基作用：通過氧化脫氫酶的作用，氨基酸變成亞氨基酸，后者水解產(chǎn)生@-酮酸和氨氣

11簡述糖、脂肪、蛋白質(zhì)三大代謝物之間的關(guān)系？

能量供應(yīng)都以糖、脂肪為主，盡量節(jié)約蛋白質(zhì)的消耗；任何一種能源物質(zhì)代謝占優(yōu)勢，就可能抑制和節(jié)約其他能源物質(zhì)的分解；三大物質(zhì)之間可以相互轉(zhuǎn)化

12簡述三大供能系統(tǒng)的特點？ 磷酸原供能系統(tǒng)：

(1)不需要氧，不產(chǎn)生乳酸(2)能量輸出功率最大(3)持續(xù)時間最短(4)供能總量少

(5)速度素質(zhì)的物質(zhì)基礎(chǔ) 糖酵解供能系統(tǒng)：

(1)不需要氧，但有副產(chǎn)品乳酸產(chǎn)生(2)能量輸出功率僅次于磷酸原系統(tǒng)(3)持續(xù)時間長于磷酸原系統(tǒng)(4)供能總量較磷酸原系統(tǒng)多(5)速歸耐力的物質(zhì)基礎(chǔ)，有氧氧化供能系統(tǒng)：(1)需要氧

(2)能量輸出功率最小(3)持續(xù)時間最長(4)供能總量最大

(5)耐力素質(zhì)的物質(zhì)基礎(chǔ)

12運動時三大供能系統(tǒng)之間的關(guān)系？

(1)運動過程中骨骼肌各供能系統(tǒng)同時發(fā)揮作用，不存在一種能源物質(zhì)單獨供能的情況，只是時間、順序和相對比例隨運動狀況而異(2)各供能系統(tǒng)最大輸出功率差異較大，順序為：磷酸原系統(tǒng)>糖酵解系統(tǒng)>糖有氧氧化>脂肪氧化

(3)各供能系統(tǒng)維持運動的時間不同

(4)運動后能源物質(zhì)的恢復(fù)及代謝產(chǎn)物的消除，必須依靠有氧代謝供能，所以有氧代謝是機能恢復(fù)的主要代謝方式 13中樞疲勞的特點？

(1)腦內(nèi)代謝的變化：腦內(nèi)糖大量消耗；ATP/ADP的比值下降(2)神經(jīng)遞質(zhì)的變化

14評定運動員生化指標(biāo)選擇的原則是什么？(1)用代謝產(chǎn)物作指標(biāo)，如乳酸

(2)用功能性物質(zhì)作指標(biāo)，如血紅蛋白(3)用代謝調(diào)節(jié)物質(zhì)作指標(biāo)，如激素、酶 15試述不同強度運動時血乳酸值的變化？ 短時間劇烈運動時，血乳酸濃度可達(dá)

15mmol/L；短時間間歇運動可達(dá)32mmol/L：周期性項目低強度訓(xùn)練后濃度為4mmol/L；大強度度負(fù)荷運動可達(dá)12mmol/L

16發(fā)展三大供能系統(tǒng)采用的訓(xùn)練方法？特點？

(1)發(fā)展磷酸原系統(tǒng)方法：a最大強度間歇訓(xùn)練b最大強度重復(fù)訓(xùn)練。

特點：a要求最大強度訓(xùn)練b時間在十秒內(nèi)c最宜休息時間為三十秒(2)發(fā)展糖酵解系統(tǒng)方法：a最高乳酸訓(xùn)練法b乳酸耐受力訓(xùn)練法。

特點：a最大強度間歇訓(xùn)練b時間為1~2分鐘c間歇休息為3~5分鐘。

(3)發(fā)展有氧代謝供能系統(tǒng)方法：a有氧代謝間歇訓(xùn)練法b乳酸閾訓(xùn)練法c持續(xù)性耐力訓(xùn)練法d高原訓(xùn)法。

特點：a運動強度80%~85%b最大攝氧量強度跑3~5分鐘c間歇休息3~5分鐘

17影響三大供能系統(tǒng)供能能力的因素有哪些？

(1)影響磷酸原：ATP、CP儲量，ATP分解、再合成速率，Na+-K+ATP酶，Ca2+-Mg2+-ATP酶

(2)影響糖酵解供能因素：a糖酵解過程中的限速酶b乳酸生成(3)影響有氧代謝供能因素：a供能底物b線粒體氧化磷酸化能力c高原和高原訓(xùn)練的影響

18運動強度：身體練習(xí)對人體生理刺激的程度。

運動負(fù)荷：又稱生理負(fù)荷，指人做練習(xí)時所承受的生理負(fù)荷。

生化指標(biāo)：血乳酸、血尿素、血紅蛋白、尿素蛋白、血睪酮、血清肌酸激酶、尿肌肝 19葡萄糖-丙氨酸循環(huán)的過程及意義？ 過程：

人體運動時，骨骼肌和心肌中糖的分解代謝過程加強，生成大量中間代謝產(chǎn)物丙酮酸，丙酮酸濃度逐漸增高，其中大部分丙酮酸進入線粒體后進一步氧化，部分丙酮酸還原成乳酸，還有一部分丙酮算經(jīng)過轉(zhuǎn)氨基作用生成丙氨酸。生成的丙氨酸會隨血液循環(huán)到肝，再在肝作為糖異生的“原材料”，異生成葡萄糖再輸入到血液維持血糖濃穩(wěn)定。意義：

(1)丙氨酸在肝臟異生為糖，有利于維持血糖穩(wěn)定

(2)防止運動肌丙酮酸濃度升高所導(dǎo)致的乳酸增加

(3)將肌肉中的氨以無毒的形式運輸?shù)礁闻K，避免血氨濃度過度升高，對健康和維持運動能力有利

第五篇：生物化學(xué)實驗報告：Western blotting檢測大腸桿菌重組蛋白

實驗三 Western blotting檢測大腸桿菌重組蛋白

一、實驗?zāi)康?/p>

利用Western Blotting技術(shù)，定性（或定量）檢測苦蕎黃酮醇合酶基因（Flavonol synthase gene, FtFLS）在大腸桿菌表達(dá)宿主菌Escherichia coli BL(DE3)中的誘導(dǎo)表達(dá)。

二、實驗原理

黃酮醇合酶（FLS，EC 1.14.11.23）屬于2-ODD家族，催化黃酮醇合成支路中最后一步氧化反應(yīng)，也是直接合成黃酮醇的反應(yīng)。FLS可以使二氫黃酮醇在C3鏈中C2和C3之間氧化形成雙鍵，從而生成黃酮醇：a Dihydroflavonol + 2-oxoglutarate + O2 a Flavonol + succinate + CO2 + H2O。

本實驗采用PCR的方法，在苦蕎黃酮醇合酶基因（FtFLS）ORF起始密碼子前引入Kpn ?酶切位點，去掉終止密碼并引入BamH ?酶切位點?？寺∫朊盖形稽c后的FtFLS到表達(dá)載體pET-30b(+)質(zhì)粒中，其表達(dá)產(chǎn)物分別在N-末端和C-末端各含有6 × His標(biāo)簽。重組質(zhì)粒（pET-30b(+)-FtFLS）經(jīng)鑒定后轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌E.coli BL21(DE3)并使用IPTG進行誘導(dǎo)表達(dá)。收集誘導(dǎo)0 h、2 h、4 h、6 h和8 h的產(chǎn)物，經(jīng)SDS-PAGE后用于考馬斯亮藍(lán)R-250染色或Western blotting分析。

Western blotting的標(biāo)準(zhǔn)流程如下：蛋白質(zhì)首先通過SDS-PAGE胺凝膠電泳分離，通過電泳轉(zhuǎn)移到固相支持物上（硝酸纖維素膜、PVDF膜和尼龍膜）；將膜上未反應(yīng)的位點封閉起來，以抑制抗體的非特異性吸附，固定的蛋白質(zhì)即可與特異性的多克隆或單克隆抗體相互作用并通過放射、生色或化學(xué)發(fā)光的方法進行定位。

本實驗采用小鼠抗聚組氨酸單克隆抗體（Anti-His tag IgG，一抗）與重組FtFLS蛋白的N-末端和C-末端6 × His發(fā)生抗原-抗體特異反應(yīng)，再利用辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗小鼠IgG（peroxidase-Goat Anti-Mouse IgG，二抗）與一抗發(fā)生特異結(jié)合，最后使用DAB進行顯色。DAB即：二氨基聯(lián)苯胺（3, 3'-diaminobenzidine），是過氧化物酶（Peroxidase）的生色底物。DAB在過氧化氫的存在下失去電子而呈現(xiàn)出顏色變化和積累，形成淺棕色不溶性產(chǎn)物。該方法常用于檢測過氧化物酶的活性，它靈敏度高，特異性好，在免疫組化，原位雜交，Western blotting等膜顯色中 1

應(yīng)用廣泛。

三、操作步驟 3.1 樣品的制備

原始樣品可為細(xì)胞、組織、培養(yǎng)上清、免疫沉淀或親和純化的蛋白，以下為定性檢測大腸桿菌重組蛋白時細(xì)胞樣品的處理方法，其余的樣品制備方法參閱相關(guān)文獻(xiàn)。

材料與試劑：

重組pET-30b(+)-FtFLS質(zhì)粒、表達(dá)宿主菌E.coli BL21(DE3)、LB固體培養(yǎng)基（Kan 50μg/mL）、LB 液體培養(yǎng)基（10mL、50mL）、Kan（50 mg/mL）、IPTG（24 mg/mL）、PBS緩沖液、5 X SDS上樣緩沖液。儀器與設(shè)備：

恒溫培養(yǎng)箱、恒溫?fù)u床、超凈工作臺、酒精燈、消毒酒精（75%）、棉球、接種環(huán)、臺式離心機、冰盤、Tip（10 μL、200 μL、1 mL）、微量加樣器（10 μL、200 μL、1 mL）、離心管（1.5 mL、10 mL）。操作步驟：

①含重組質(zhì)粒pET-30b(+)-FtFLS的表達(dá)宿主菌E.coli BL21(DE3)劃線于LB 固體培養(yǎng)基（Kan抗性），37℃培養(yǎng)16 h。

②挑選單菌落，接種至10 mL LB培養(yǎng)基（按0.1%加入Kan，10 μL）于37 ℃過夜培養(yǎng)，即為種子液。

③按2 %的接種量（1 mL）將種子液接種到50 mL LB Kan培養(yǎng)基中（按0.1%加入Kan，50 μL），于37 ℃培養(yǎng)OD600至0.5（約2.5 h）。

④加入IPTG至終濃度為1 mmol/L（100 μL），置于25℃連續(xù)誘導(dǎo)表達(dá)8 h，分別取誘導(dǎo)前0 h，誘導(dǎo)后2 h、4 h、6 h和8 h的培養(yǎng)液5 mL于10 mL離心管中，置于冰水混合物上備用。

⑤誘導(dǎo)完畢后，各樣品于8000 rpm（12000 rpm易爆管）離心5 min收集沉淀，用等體積PBS（5 mL）重懸漂洗細(xì)胞2次，收集菌體。

⑥各管分別加入400 μL PBS重懸細(xì)胞，加入100 μL 5 X SDS上樣緩沖液，置于沸水浴中10 min（注意防止爆管）。注意事項：

①重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)應(yīng)進行正確的無菌操作并加入適宜濃度的抗生素，避免可能的污染。

②在合適的鹽濃度下，應(yīng)保持蛋白質(zhì)的最大溶解性。

③選擇合適的表面活性劑和還原劑，破壞所有非共價結(jié)合的蛋白質(zhì)復(fù)合物和共價鍵二硫鍵。盡量去除核酸，多糖，脂類等干擾分子。

④制備過程應(yīng)在低溫下進行，以避免細(xì)胞破碎釋放出的各種酶類的修飾。

⑤樣品建議分裝成合適的量（比如分裝出20ul檢測蛋白質(zhì)定量用），然后保存與-20°或-80℃中長期保存，但要注意不要反復(fù)凍融，因為會使蛋白的抗原特性發(fā)生改變。3.2 SDS-PAGE SDS-PAGE（SDS變性不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳）的分離原理則僅根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量的差異。因為SDS-PAGE上樣緩沖液含有SDS和巰基乙醇（2-ME）或二巰基赤蘚醇（DTT），其可以斷開半胱氨酸殘基之間的二硫鍵、分子內(nèi)氫鍵、破壞蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)、形成SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物。該復(fù)合物形成榛狀結(jié)構(gòu)，平均每兩個氨基酸殘基結(jié)合一個SDS分子，使其帶有大量的負(fù)電荷（蛋白質(zhì)分子本身的電荷完全被SDS掩蓋），從而消除了不同分子之間原有的電荷差別。材料與試劑：

① 分離膠緩沖液（1.5 mol/L Tris-HCl，0.4% SDS，pH 8.8）。② 濃縮膠緩沖液（0.5 mol/L Tris-HCl，0.4% SDS，pH 6.8）。

③ 30%丙烯酰胺/N, N'-亞甲基雙丙烯酰胺（Arc/Bis）：29.2 g Acr，0.8 g Bis，定容至100 mL。

④ 10%過硫酸銨（W/V），需新鮮配制。

⑤ 2 X 上樣緩沖液（pH 8.0）：含0.5 mol/L Tris-HCl（pH 6.8）2 mL，甘油2 mL，20% SDS 2 mL（W/V），0.1%溴酚藍(lán) 0.5 mL，2-β-巰基乙醇（2-ME）1.0 mL，定容至10 mL。

⑥ 電極緩沖液（pH 8.3）：3.03 g Tris，14.41 g Gly，1.0 g SDS，調(diào)整pH后定容至1000 mL。

⑦ 染色液：45%甲醇，10%乙酸，0.25%考馬斯亮藍(lán)R-250。⑧ 脫色液：10%（V/V）乙酸，5%（V/V）乙醇。⑨ 封底膠：1g瓊脂糖溶于100 mL電極緩沖液。⑩ 預(yù)染標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白質(zhì)Marker。儀器與設(shè)備：

垂直板電泳槽及其附件，電爐，電泳儀，微量加樣器（10 μL），Tip（10 μL）。操作步驟：

① 電泳槽的安裝：將成套的兩塊玻璃板正確放入硅膠條中，夾在電泳槽里，按對角線順序旋緊螺絲（注意分辨上下槽）。用1%的瓊脂糖封底（封于下槽底部），待瓊脂糖凝固后即可制膠。

② 制膠：選擇合適的膠濃度，按下表配制分離膠，灌入兩玻璃板之間，加至距短玻璃板頂端3 cm處，立即覆蓋5 mm左右水層，靜置等待聚合，當(dāng)分離膠與水層之間的界面重新出現(xiàn)時表明膠已聚合。小心倒掉分離膠上水層，配制濃縮膠后加入玻璃板中，插入梳子并及時補充由于濃縮膠聚合產(chǎn)生的空隙（該過程避免氣泡的產(chǎn)生）。

本實驗選用12.5%的SDS-PAGE膠對重組FtFLS進行分離。

試劑 濃度 分離膠緩沖液 mL 濃縮膠緩沖液 mL Acr/Bis mL

分離膠

7.5% 10% 12.5% 15% 4.05.3

4.08.0

30% 4.01.25 0.75 4

H2O mL 10% AP mL TEMED mL

8.0 0.3

6.7 0.3

5.3 0.3

4.0 0.3

1.3 0.3

3.0 0.15 0.005

0.008 0.008 0.008 0.008 0.008 ③ 點樣：分別在上下電泳槽中倒入電極緩沖液，上槽淹沒短玻璃板，下槽淹沒電極即可。此時，小心拔出梳子，用微量加樣器調(diào)整點樣孔之間的濃縮膠（此步驟應(yīng)檢查電泳槽是否漏液）。使用微量進樣器分別在樣品槽內(nèi)分別加入預(yù)染的標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白質(zhì)、誘導(dǎo)前0 h，誘導(dǎo)2 h、4 h、6 h和8 h后處理好的樣品18 μL（上樣總體積一般不超過15 μL，加樣孔的最大限度可加20 μL樣品）。

④ 電泳：接通電源，調(diào)節(jié)電壓至100 V，恒壓電泳；待指示劑進入分離膠后，調(diào)節(jié)電壓至200 V恒壓電泳。待指示劑在分離膠中遷移5-6 cm左右時，停止電泳。剝膠：小心剝膠，將濃縮膠（濃縮膠影響操作）和分離膠上不用的部分切去（便于識別），見圖3和圖4.⑤ 染色：凝膠經(jīng)蒸餾水漂洗1次后加入染色液，電爐加熱處理10-20 min染色。⑥ 脫色：使用蒸餾水漂洗取出染色液，加入脫色液，電爐加熱脫色至出現(xiàn)清晰的蛋白條帶。注意事項：

①上樣總體積一般不超過15?L，膠孔的最大限度可加20?L樣品。

②微量加樣器應(yīng)貼壁吸取樣品，避免吸進氣泡；將微量加樣器Tip頭插至加樣孔中緩慢加入樣品，避免樣品溢出。

③電泳設(shè)備應(yīng)注意檢查正負(fù)極、是否短路或接觸不良、是否漏液、電流電壓大?。娏鲝姸葧S電泳的進行有所降低）。

④電極緩沖液和AP應(yīng)新鮮配制，上下槽緩沖液不可混用（電泳完畢分別收集）。3.3 轉(zhuǎn)膜與雜交

雜交膜的選擇是決定Western blotting成敗的重要環(huán)節(jié)。應(yīng)根據(jù)雜交方案、被轉(zhuǎn)移蛋白的特性以及分子大小等因素，選擇合適材質(zhì)、孔徑和規(guī)格的雜交膜。

用于Western blot 的膜主要有兩種：硝酸纖維素膜（NC）和聚偏氟乙烯（PVDF）膜。NC膜是蛋白印跡實驗的標(biāo)準(zhǔn)固相支持物，在低離子轉(zhuǎn)移緩沖液的環(huán)境下，大多數(shù)帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)會與膜發(fā)生疏水作用而高親和力的結(jié)合在一起，但在非離子型的去污劑作用下，結(jié)合的蛋白還可以被洗脫下來。根據(jù)被轉(zhuǎn)移的蛋白分子量大小，選擇不同孔徑的NC膜。因為隨著膜孔徑的不斷減小，膜對低分子量蛋白的結(jié)合就越牢固。通常用0.45 μm和0.2 μm兩種規(guī)格的NC膜。大于20 kDa的蛋白可用0.45 μm 的膜，小于20 kDa的蛋白用0.2 μm的膜。PVDF 膜靈敏度、分辨率和蛋白親和力比常規(guī)的膜要高，非常適合于低分子量蛋白的檢測。但PVDF 膜在使用之前必需用純甲醇浸泡飽和1-5 sec。蛋白質(zhì)常用的轉(zhuǎn)移方法主要有兩種：槽式濕轉(zhuǎn)和半干轉(zhuǎn)移。前者操作容易，轉(zhuǎn)移效率高；而后者適用于大膠的蛋白轉(zhuǎn)移，所用緩沖液少。以下為槽式濕轉(zhuǎn)的操作步驟。材料與試劑：

材料：PVDF膜，Whatman 濾紙，搪瓷盤，一次性PE手套，鑷子，玻棒，試劑：轉(zhuǎn)移緩沖液 pH 8.3（25 mmol/L Tris，0.2 M 甘氨酸，20%甲醇），1000 mL 10 X TBS緩沖液pH 7.6（24.2 g Tris base，80 g NaCl，用1N HCl調(diào)pH=7.6），脫脂奶粉、BSA或試劑盒自帶的蛋白質(zhì)干粉，洗滌緩沖液（1 X TBS，0.1% Tween-20），封閉緩沖液（1×TBS，0.1% Tween-20，5% w/v脫脂奶粉或BSA），抗體稀釋液[1×TBS, 0.1% Tween-20 加5% BSA（多抗）或5%脫脂奶粉（單抗）]。儀器與設(shè)備：

轉(zhuǎn)膜電泳儀及其附件，雜交儀，培養(yǎng)皿，凝膠成像系統(tǒng)。操作步驟： 轉(zhuǎn)膜

① 準(zhǔn)備轉(zhuǎn)移緩沖液，依據(jù)膠的大小剪取膜和濾紙6片，將凝膠和PVDF膜和濾紙放入轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡10min。

② 裝配轉(zhuǎn)移三明治（海綿→3層濾紙→膠→膜→3層濾紙→海綿）：在加有轉(zhuǎn)移液的搪瓷盤里放入轉(zhuǎn)膜用的夾子、兩塊海綿墊、一支玻棒、濾紙和浸過的膜；將夾子打開使一面保持水平（規(guī)定為正極）。在上面墊一張海綿墊，用玻棒來回?fù){幾遍以

搟走里面的氣泡。在墊子上墊三層濾紙，一手固定濾紙一手用玻棒搟去其中的氣泡。依次加膜、加膠，再在膜上蓋3張濾紙并除去氣泡，見圖5。

③ 將轉(zhuǎn)移槽置于冰浴中，放入三明治，加轉(zhuǎn)移緩沖液，插上電極，100V電泳1h（電流約為0.3 A）。

④ 電泳結(jié)束，觀察預(yù)染的蛋白質(zhì)Marker是否轉(zhuǎn)移到膜上。雜交

① 用25-50 mL洗滌緩沖液洗滌硝酸纖維素膜5 min, 1 次。

② 封閉硝酸纖維膜：加封閉緩沖液25 mL，37℃封閉2 h。用量以浸沒整張膜為準(zhǔn)，圖6。

③ 抗體的稀釋（已依?。盒∈罂咕劢M氨酸單克隆抗體使用100 μL抗體稀釋液進行溶解稀釋，儲存與4℃。（一般特異性抗體濃度1 μg/mL）

④ 硝酸纖維膜孵育一抗：加入20 mL抗體稀釋液，將25 μL一抗加入培養(yǎng)皿中（已完全覆蓋膜為準(zhǔn)），37℃孵育2 h左右，見圖7和圖8。（視實驗時間，也可以4℃孵育過夜）

⑤ 用25 mL洗滌緩沖液振蕩洗滌硝酸纖維素膜3 次, 每次5 min。

⑥ 硝酸纖維膜孵育二抗：加入25 mL抗體稀釋液，將25μL二抗全部加入培養(yǎng)皿中（以完全覆蓋膜為準(zhǔn)），37 ℃孵育2 h，見圖7和圖8。

⑦ 用30 mL洗滌緩沖液振蕩洗滌硝酸纖維膜4 次, 每次5 min。

⑧ DAB 顯色：按每2 mL蒸餾水加顯色劑A，B，C 各１滴，混勻?；靹蚝蠹又聊ど?。室溫顯色。一般顯色1－30 分鐘。若無背景出現(xiàn)則可繼續(xù)顯色。顯色后用蒸餾水洗滌以終止反應(yīng)。注意事項：

①操作中戴手套，不要用手觸膜。

②如檢測小于20 kDa的蛋白應(yīng)用0.2μm的膜，并可省略轉(zhuǎn)移時的平衡步驟。③某些抗原和抗體可被Tween-20 洗脫，此時可用1.0% BSA代替Tween-20。④關(guān)于封閉劑的選擇：5%脫脂奶/TBS or PBS: 能和某些抗原相互作用，掩蓋抗體結(jié)合能力；0.3~3% BSA in PBS：低的內(nèi)源性交叉反應(yīng)性。

⑤如用0.1% Tween 20、0.02% NaN3 in PBS or TBS作封閉劑和抗體稀釋液，抗體檢測后可進行蛋白染色。

⑥如要同時檢測大分子量和小分子蛋白，最好用梯度膠分離蛋白。

四、實驗結(jié)果

4.1 考馬斯亮藍(lán)顯色結(jié)果

4.2 DAB顯色結(jié)果

五、討論與分析

1.考馬斯亮藍(lán)顯色結(jié)果

由圖可知，其變化趨勢是目的條帶顏色越來越深，條帶寬度也逐漸變寬。說明隨著培養(yǎng)時間推移，產(chǎn)生的目的蛋白越來越多，也就意味著轉(zhuǎn)入的基因得到表達(dá)。而目的條帶寬度在6h以后變化已經(jīng)不明顯，說明此時目的蛋白的表達(dá)已達(dá)到接近峰值。實驗結(jié)果的背景色偏深，但還不影響結(jié)果的判定。2.DAB顯色結(jié)果

由于顯色結(jié)果并不理想，不能清晰反映我們實驗設(shè)計所需要的結(jié)果。上圖顯色結(jié)果為繪制的示意圖。主要可能是因為一抗孵育時間較短導(dǎo)致，也可能是由于蛋白樣品本身上樣量不足或蛋白濃度較低，以及轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)印效率不夠高。另外，也可能由于以下這些方面沒有嚴(yán)格做到影響了實驗結(jié)果：

A制作凝膠時，嚴(yán)格按照配方制作，倒膠時做到既快又穩(wěn)，防止產(chǎn)生氣泡。同時，制膠前應(yīng)洗凈玻板并使其完全干燥，否則會影響實驗結(jié)果。

B進入雜交階段，重要的是控制溫度和孵育時間，在孵育之前，封閉也是必不可少的步驟。顯色效果與各個步驟都是密不可分的，但一抗、二抗品質(zhì)與用量尤為重要。這一步必須尤為仔細(xì)。

C 當(dāng)進入轉(zhuǎn)膜階段時，注意轉(zhuǎn)移三明治的順序，海綿、濾紙、膠、膜，濾紙，海綿。還需要注意的是一定要驅(qū)趕完海綿里的氣泡，不然會造成短路。

D為提高實驗準(zhǔn)確度樣品應(yīng)按照以下標(biāo)準(zhǔn)：樣品不能反復(fù)凍融，樣品未加蛋白酶抑制劑。同時，建議檢查Western Blot過程，提高抗?jié)舛?。對于加蛋白酶抑制劑來說，一般加PMSF就可以了，最好能多加幾中種蛋白酶抑制劑。