第一篇：03281食品微生物學(xué)(二)實(shí)驗(yàn)考試大綱

江蘇省高等教育自學(xué)考試大綱江南大學(xué)編

食品微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)

一、課程性質(zhì)及其設(shè)置目的與要求

（一）課程性質(zhì)和特點(diǎn)

微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)是為專業(yè)基礎(chǔ)課《微生物學(xué)》配套的同步實(shí)驗(yàn)課程，為必修課程，本教學(xué)大綱是根據(jù)食品科學(xué)專業(yè)的人才培養(yǎng)目標(biāo)制定的。其目的是為了使學(xué)生加深理解微生物基礎(chǔ)理論，掌握微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的基本技能，通過(guò)實(shí)驗(yàn)教學(xué)，培養(yǎng)學(xué)生觀察、思考、分析和解決問(wèn)題的綜合能力，以及實(shí)事求是、嚴(yán)肅認(rèn)真的科學(xué)研究態(tài)度，提高學(xué)生的綜合素質(zhì)，熟悉并掌握微生物學(xué)研究方法，能用微生物學(xué)方法解決一些專業(yè)實(shí)際問(wèn)題。為學(xué)生今后的學(xué)習(xí)及工作實(shí)踐打下寬厚的基礎(chǔ)

（二）本課程的基本要求

1．要求學(xué)生熟悉微生物實(shí)驗(yàn)的基本原理，包括普通光學(xué)顯微鏡的工作原理，簡(jiǎn)單染色法原理，革蘭氏染色法原理，測(cè)量微生物細(xì)胞大小的原理，微生物的分離、純化的基本原理，培養(yǎng)基的配制原理，高壓蒸汽滅菌原理、干熱滅菌原理，細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定原理，微生物生理生化反應(yīng)原理，食品衛(wèi)生微生物檢驗(yàn)檢測(cè)原理等。

2要求學(xué)生掌握顯微技術(shù)、染色技術(shù)、消毒與滅菌技術(shù)、接種技術(shù)、培養(yǎng)技術(shù)，代謝產(chǎn)物檢測(cè)技術(shù)、菌種鑒定技術(shù)與食品衛(wèi)生微生物檢驗(yàn)檢測(cè)技術(shù)等，并運(yùn)用這些技術(shù)從事微生物學(xué)研究、解決有關(guān)微生物專業(yè)的實(shí)際問(wèn)題，為進(jìn)一步學(xué)習(xí)有關(guān)專業(yè)課程與微生物學(xué)相關(guān)研究與生產(chǎn)基礎(chǔ)奠定良好基礎(chǔ)。

3.要求學(xué)生及時(shí)規(guī)范地寫(xiě)出實(shí)驗(yàn)報(bào)告：有繪圖要求的實(shí)驗(yàn)，必須在課堂內(nèi)完成顯微鏡下繪圖，力求真實(shí)、準(zhǔn)確；無(wú)繪圖要求的實(shí)驗(yàn)，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果要認(rèn)真觀察、記錄、整理；實(shí)驗(yàn)報(bào)告寫(xiě)作要規(guī)范，要有簡(jiǎn)要的分析討論。

（三）與其他課程的聯(lián)系與分工

本課程側(cè)重介紹微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)原理、技術(shù)，開(kāi)設(shè)時(shí)間最好略后或同步于微生物學(xué)理論課。

二、課程內(nèi)容與考核目標(biāo)

實(shí)驗(yàn)

一、普通光學(xué)顯微鏡的使用

【目的和要求】

1.學(xué)習(xí)普通光鏡的結(jié)構(gòu)、功能、使用方法。

2.學(xué)習(xí)并掌握油鏡的原理和使用方法。

【實(shí)驗(yàn)內(nèi)容】

1.了解光鏡各部分結(jié)構(gòu)。

2.熟悉普通光學(xué)顯微鏡使用方法，并學(xué)習(xí)油鏡的使用方法。

3.掌握利用光鏡觀察微生物的技能，了解細(xì)菌（球菌、桿菌）、真菌等微生物的主要特征。

【重難點(diǎn)】

1.油鏡的使用

2.聚光器的調(diào)節(jié)

【注意事項(xiàng)】

1.安全取放顯微鏡。

2.油鏡使用后要徹底清潔。

實(shí)驗(yàn)

二、微生物的染色

【目的和要求】

1.學(xué)習(xí)并掌握微生物的制片技術(shù)

2.學(xué)習(xí)掌握簡(jiǎn)單染色的基本技術(shù)。

3.學(xué)習(xí)革蘭氏染色法的原理和方法。

【實(shí)驗(yàn)內(nèi)容】

1.簡(jiǎn)單染色技術(shù)并觀察。

2.革蘭氏染色并觀察鑒定。

【重難點(diǎn)】

1.革蘭氏染色，結(jié)果鑒定。

【注意事項(xiàng)】

1.革蘭氏染色的染色和脫色時(shí)間要恰當(dāng)，否則結(jié)果不明顯。

2.觀察芽孢時(shí)要調(diào)節(jié)光線，否則不易觀察到。

實(shí)驗(yàn)

三、放線菌、霉菌的形態(tài)觀察

【目的和要求】

1.練習(xí)絲狀微生物的制片和簡(jiǎn)單染色技術(shù)。

2.了解放線菌、霉菌的形態(tài)特征。

【實(shí)驗(yàn)內(nèi)容】

1.觀察放線菌、霉菌的自然絲狀生長(zhǎng)狀態(tài)。

2.簡(jiǎn)單染色并觀察細(xì)胞特征。

3.熟悉顯微鏡下觀察絲狀微生物的一般方法。

【重難點(diǎn)】

1.放線菌、霉菌的自然絲狀生長(zhǎng)狀態(tài)的觀察。

2.比較兩者形態(tài)的異同點(diǎn)。

【注意事項(xiàng)】

1.注意防止菌絲污染顯微鏡物鏡鏡頭。

實(shí)驗(yàn)

四、酵母菌的形態(tài)觀察及死活細(xì)胞的鑒別

【目的和要求】

1.學(xué)習(xí)水浸片法制作酵母菌臨時(shí)裝片。

2.了解酵母菌的形態(tài)特征，觀察出芽繁殖的狀態(tài)。

3.了解鑒別細(xì)胞死活的方法。

【實(shí)驗(yàn)內(nèi)容】

1.水浸片法制作酵母菌臨時(shí)裝片。

2.觀察酵母菌的形態(tài)特征，并注意芽殖的狀態(tài)。

3.通過(guò)染色結(jié)果鑒別細(xì)胞的死活。

【重難點(diǎn)】

1． 酵母菌的芽殖特征。

2． 鑒別細(xì)胞的死活。

【注意事項(xiàng)】

1.美藍(lán)染液水浸片法制作酵母菌制片注意染液的濃度和染色時(shí)間。

2.菌體與染液混合時(shí)不要?jiǎng)×彝磕?，以免破壞?xì)胞。

3.蓋片時(shí)緩慢傾斜覆蓋，以免產(chǎn)生氣泡。

實(shí)驗(yàn)

五、微生物大小的測(cè)定

【目的和要求】

1.學(xué)習(xí)并掌握使用顯微測(cè)微尺測(cè)定微生物大小的方法。

2.掌握對(duì)不同形態(tài)酵母菌細(xì)胞大小測(cè)定的要求，增強(qiáng)對(duì)微生物大小的感性認(rèn)識(shí)。

【實(shí)驗(yàn)內(nèi)容】

1.安裝并校正測(cè)微尺。

2.測(cè)定并記錄不同形態(tài)微生物細(xì)胞的大小。

3.處理數(shù)據(jù)，計(jì)算細(xì)胞平均實(shí)際大小。

【重難點(diǎn)】

1.換算目鏡測(cè)微尺每格長(zhǎng)度的代表值。

2.安全使用測(cè)微尺，保護(hù)高倍物鏡鏡頭。

【注意事項(xiàng)】

1.校正目鏡測(cè)微尺時(shí)光線宜弱些，以便找到鏡臺(tái)測(cè)微尺的刻度。

2.換高倍鏡時(shí)要十分小心，防止壓壞鏡臺(tái)測(cè)微尺和損壞鏡頭。

3.測(cè)量對(duì)象要有代表性，數(shù)據(jù)及單位換算要準(zhǔn)確。

實(shí)驗(yàn)

六、顯微鏡直接計(jì)數(shù)法

【目的和要求】

1.了解血球計(jì)數(shù)板的結(jié)構(gòu)和功能。

2.學(xué)習(xí)并掌握使用血球計(jì)數(shù)板測(cè)定酵母菌細(xì)胞或孢子數(shù)量的方法。

【實(shí)驗(yàn)內(nèi)容】

1.制備菌懸液

2．檢查血球計(jì)數(shù)板

3.加樣并計(jì)數(shù)，計(jì)算樣品的含菌量

【重難點(diǎn)】

1.計(jì)數(shù)板中計(jì)數(shù)室的尋找。

2.調(diào)節(jié)成合適的濃度以便計(jì)數(shù)和減小誤差。

【注意事項(xiàng)】

1.清洗計(jì)數(shù)板時(shí)要小心，不能使用刷子等硬物，以免破壞精細(xì)度；干燥計(jì)數(shù)板不能火上烘烤。

2.取樣時(shí)要搖勻菌液，且加樣時(shí)不可有氣泡產(chǎn)生。

實(shí)驗(yàn)

七、培養(yǎng)基的配制及滅菌

【目的和要求】

1.學(xué)習(xí)掌握培養(yǎng)基的配制原理。

2.掌握配制培養(yǎng)基的一般方法步驟。

3.熟悉高壓滅菌鍋的使用原理和方法。

4.熟悉干熱滅菌箱的使用原理和方法。

【實(shí)驗(yàn)內(nèi)容】

1.按照培養(yǎng)基的配方濃度要求計(jì)算各成分所需要的量。

2.準(zhǔn)確配制培養(yǎng)基并滅菌。

3.各種玻璃儀器的包扎與滅菌。

【重難點(diǎn)】

1.規(guī)范準(zhǔn)確量取各成分。

2.高壓滅菌鍋的安全使用。

3.干熱滅菌箱的安全使用。

【注意事項(xiàng)】

1.計(jì)算要準(zhǔn)確無(wú)誤。

2.稱量要精確。

3.安全使用高壓滅菌鍋。

4.安全使用干熱滅菌箱。

實(shí)驗(yàn)

八、微生物的接種、分離與培養(yǎng)

【目的和要求】

1.學(xué)習(xí)微生物的接種、分離方法原理與培養(yǎng)技術(shù)。

2.學(xué)習(xí)無(wú)菌操作培養(yǎng)微生物的技術(shù)方法。

【實(shí)驗(yàn)內(nèi)容】

1.學(xué)習(xí)常用的接種與分離方法，掌握無(wú)菌操作要求。

2.制備菌種混懸液，無(wú)菌操作進(jìn)行劃線及涂布培養(yǎng)。

3.學(xué)習(xí)一般微生物的培養(yǎng)方法。

【重難點(diǎn)】

1.無(wú)菌操作

【注意事項(xiàng)】

1.劃線分離菌懸液要無(wú)菌操作，以免污染空氣中雜菌。

2.劃線分離時(shí)各級(jí)劃線區(qū)域不要重疊。

實(shí)驗(yàn)

九、細(xì)菌的代謝與生化反應(yīng)—細(xì)菌對(duì)含碳、氮化合物的分解和利用

【目的和要求】

通過(guò)不同細(xì)菌對(duì)不同含碳化合物的分解利用情況，了解細(xì)菌碳代謝類型的多樣性 通過(guò)不同細(xì)菌對(duì)不同含氮化合物的分解利用情況，了解細(xì)菌氮代謝類型的多樣性

【實(shí)驗(yàn)內(nèi)容】

對(duì)大腸桿菌、沙門(mén)氏菌做不同生化反應(yīng)試驗(yàn)，觀察記錄結(jié)果。

【重難點(diǎn)】

1.對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有正確的判斷

【注意事項(xiàng)】

1.無(wú)菌操作，以免污染空氣中雜菌。

2.接種時(shí)標(biāo)記要清楚，各菌種間切忌交叉污染

實(shí)驗(yàn)

十、食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)

【目的和要求】

1.學(xué)習(xí)食品衛(wèi)生微生物學(xué)中菌落總數(shù)測(cè)定原理與方法

2.學(xué)習(xí)食品衛(wèi)生微生物學(xué)中大腸菌群測(cè)定原理與方法

【實(shí)驗(yàn)內(nèi)容】

1.測(cè)定飲用水中的菌落總數(shù)。

2.測(cè)定飲用水中大腸菌群的數(shù)量。

【重難點(diǎn)】

1.樣品的量取、稀釋、澆注法接種。

2.數(shù)據(jù)處理，結(jié)果的判斷。

【注意事項(xiàng)】

1.注意無(wú)菌操作。

2.樣品稀釋倍數(shù)要準(zhǔn)確，標(biāo)記要清楚，接種前要搖勻。

3.培養(yǎng)基的溫度要適宜。

4.數(shù)據(jù)處理。

三、有關(guān)說(shuō)明和實(shí)施要求

（一）自學(xué)教材

本課程使用教材為：江南大學(xué)編寫(xiě)的微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)講義，GB/T4789.2-2008, GB/T4789.3-2008

參考書(shū)：錢(qián)存柔，微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程，北京大學(xué)出版社，1999.7

(二)考核方式

考核方式：

1.本課程的最后成績(jī)?yōu)楦鞔螌?shí)驗(yàn)成績(jī)的平均值與實(shí)驗(yàn)操作考核相結(jié)合的方式。各次實(shí)

驗(yàn)成績(jī)由實(shí)驗(yàn)報(bào)告成績(jī)與實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)成績(jī)組成。

2.各次實(shí)驗(yàn)成績(jī)的平均值占總成績(jī)的70%，實(shí)驗(yàn)操作考核占總成績(jī)的30%。實(shí)驗(yàn)報(bào)告評(píng)分依據(jù)：

1.實(shí)驗(yàn)報(bào)告撰寫(xiě)的完整程度以及正確性；

2.所觀察結(jié)果的正確性、繪圖的完整性；

3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果的正確性；

4.回答問(wèn)題的正確性；

5.分析和討論中所體現(xiàn)的對(duì)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中出現(xiàn)問(wèn)題的認(rèn)知程度。

第二篇：微生物學(xué)考試大綱

《微生物學(xué)》課程考試大綱

（適用于生物科學(xué)專業(yè)）

課程編碼：

151512060

學(xué)時(shí)：

學(xué)分：3 開(kāi)課學(xué)期：第5學(xué)期 課程類型：專業(yè)必修課 考試方式：筆試

額外攜帶的考試工具：計(jì)算器 考試持續(xù)時(shí)間：110分鐘

成績(jī)構(gòu)成：平時(shí)成績(jī)×20%+實(shí)驗(yàn)成績(jī)×20%+期末考試成績(jī)×60%

一、課程簡(jiǎn)介

微生物學(xué)是高校生物專業(yè)的主要專業(yè)基礎(chǔ)課，是生物科學(xué)中一個(gè)活躍的分支學(xué)科。其目的與任務(wù)旨在使學(xué)生獲得微生物學(xué)方面的基礎(chǔ)理論、基本知識(shí)和基本技能，著力培養(yǎng)學(xué)生分析問(wèn)題、解決問(wèn)題的能力。

本大綱依據(jù)該課程的教學(xué)大綱編制而成，適用于生物科學(xué)專業(yè)。

二、考試內(nèi)容

第一章 緒論

一、考試知識(shí)點(diǎn)

微生物的六大特點(diǎn)，生物界的分類，微生物學(xué)發(fā)展簡(jiǎn)史、特殊人物及其貢獻(xiàn)，微生物學(xué)在生命學(xué)科中的地位及前景。

二、考核要求

1、了解微生物及其特點(diǎn)。

2、理解微生物在生物界的地位，微生物學(xué)在生命學(xué)科中的地位及前景。

3、掌握生物界的分類，微生物學(xué)發(fā)展簡(jiǎn)史、特殊人物及其貢獻(xiàn)。

第二章 原核微生物

一、考試知識(shí)點(diǎn)

細(xì)菌的一般和特殊結(jié)構(gòu)，鞭毛、芽孢特殊結(jié)構(gòu)及意義，革蘭氏染色的原理，芽孢、糖被、菌落等概念。

二、考核要求

1、了解放線菌、籃細(xì)菌及其他原核微生物的形態(tài)、結(jié)構(gòu)與繁殖。

2、理解革蘭氏染色的原理，芽孢的抗逆性機(jī)制。

3、掌握細(xì)菌的一般和特殊結(jié)構(gòu)，鞭毛、芽孢特殊結(jié)構(gòu)及意義，革蘭氏染色的原理，芽孢、糖被、菌落等概念。

第三章 真核微生物

一、考試知識(shí)點(diǎn) 真核微生物與原核微生物的區(qū)別，酵母菌的繁殖方式，霉菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)與繁殖。

二、考核要求

1、了解酵母菌的繁殖方式及生活史。

2、理解芽殖與芽裂殖的區(qū)別。

3、掌握真核微生物與原核微生物的區(qū)別，霉菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)及繁殖方式。

第四章 病毒

一、考試知識(shí)點(diǎn)

病毒的概念、特點(diǎn)及繁殖過(guò)程，溫和噬菌體、烈性噬菌體、前噬菌體、盲傳、噬菌斑等概念，溶原性細(xì)菌的定義及特點(diǎn)，病毒的研究方法。

二、考核要求

1、了解病毒的研究方法。

2、理解病毒的概念及特點(diǎn)。

3、掌握溫和噬菌體、烈性噬菌體、前噬菌體、盲傳、噬菌斑等概念，病毒繁殖過(guò)程，溶原性細(xì)菌的定義及特點(diǎn)。

第五章 微生物的營(yíng)養(yǎng)

一、考試知識(shí)點(diǎn)

營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸方式，培養(yǎng)基的配制原則，凝固劑的優(yōu)劣。

二、考核要求

1、了解微生物的六大營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及功能，微生物的營(yíng)養(yǎng)類型。

2、理解微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收方式。

3、掌握培養(yǎng)基的類型及配制原則。

第七章 微生物的生長(zhǎng)及其控制

一、考試知識(shí)點(diǎn)

微生物生長(zhǎng)的測(cè)定方法，微生物純培養(yǎng)的分離及生長(zhǎng)規(guī)律，溫度對(duì)微生物生長(zhǎng)的影響，干、濕熱滅菌。

二、考核要求

1、了解影響微生物生長(zhǎng)的因素。

2、理解溫度對(duì)微生物生長(zhǎng)的影響，濕熱滅菌的原理。

3、掌握微生物純培養(yǎng)的生長(zhǎng)及其測(cè)量方法，微生物生長(zhǎng)繁殖的控制的方法，干、濕熱滅菌步驟及其注意事項(xiàng)。

第八章 微生物的遺傳變異

一、考試知識(shí)點(diǎn)

證明自發(fā)突變的兩個(gè)典型的實(shí)驗(yàn)，轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)化、接合的發(fā)現(xiàn)，普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)與局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)的區(qū)別，誘變育種的定義及方法步驟，營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株的篩選與分離方法，原生質(zhì)體融合育種、基因工程定義，菌種保藏的一般方法。

二、考核要求

1、了解微生物的突變類型及原因，菌種保藏的一般方法。

2、理解證明自發(fā)突變的兩個(gè)典型的實(shí)驗(yàn)，3、掌握遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ)的實(shí)驗(yàn)證明，細(xì)菌的基因轉(zhuǎn)移和重組方式，普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)與局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)的區(qū)別，誘變育種的定義及方法，營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株的篩選與分離方法，營(yíng)養(yǎng)缺陷型、轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)化、接合、原生質(zhì)體融合育種、基因工程等概念。

第九章

微生物的生態(tài)

一、考試知識(shí)點(diǎn)

微生物與其生態(tài)環(huán)境關(guān)系的主要類型，引起水體污染的生物因素及治理。

二、考核要求

1、了解微生物與環(huán)境保護(hù)，污水生物處理原理及措施。

2、理解生態(tài)環(huán)境中微生物與其環(huán)境的相互關(guān)系。

3、掌握拮抗、共生、水華、赤潮等概念。

第十章 傳染與免疫

一、考試知識(shí)點(diǎn)

傳染、特異性免疫概念，決定傳染結(jié)局的三大因素，抗體類型，抗體產(chǎn)生規(guī)律及應(yīng)用，免疫應(yīng)答的概念及過(guò)程，生物制品及應(yīng)用。

二、考核要求

1、了解免疫學(xué)技術(shù)及應(yīng)用，生物制品及應(yīng)用。

2、理解決定傳染結(jié)局的因素，體液免疫和細(xì)胞免疫。

3、掌握傳染、免疫、抗原、抗體、免疫應(yīng)答、特異性免疫、單克隆抗體等概念，抗體產(chǎn)生規(guī)律及應(yīng)用，活疫苗與死疫苗的區(qū)別。

三、基本題型及評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

（一）題型及分?jǐn)?shù)比例

名詞解釋 24% 選擇題 10% 填空題 26% 判斷題 10% 簡(jiǎn)答題 30%

（二）試題難易及分?jǐn)?shù)比例

一般50% 綜合40% 較難10%

四、選用教材

《微生物學(xué)》 黃秀梨，2003.7，高等教育出版社。

五、課程主要參考書(shū)

1、《微生物學(xué)》 沈萍，2000，高等教育出版社。

2、《微生物學(xué)教程》 周德慶，2002，高等教育出版社。

執(zhí)筆人：唐蕊

審核人：唐蕊

第三篇：食品微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)題目

食品微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)（名詞解釋選一題，簡(jiǎn)答題選三題）

一．名詞解釋

1.細(xì)菌總數(shù)

2.大腸菌群

3.高壓蒸汽滅菌

4.乳酸菌

5.芽孢

二．簡(jiǎn)答題

1.簡(jiǎn)述革蘭氏染色原理

2.簡(jiǎn)述培養(yǎng)基配置步驟

3.影響高壓蒸汽滅菌效果的因素有哪些？

4.革蘭氏染色分為那幾步？其關(guān)鍵是哪一步？為什么？

5.MRS培養(yǎng)基中加入CaCO3的作用是什么？

6.為什么檢測(cè)乳酸菌不用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基？

7.牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中各成分分別起什么作用？

8.細(xì)菌細(xì)胞特殊結(jié)構(gòu)有哪些？分別起什么作用？

9.簡(jiǎn)述顯微鏡使用步驟

10.高壓蒸汽鍋滅菌與干熱空氣滅菌相比有什么優(yōu)點(diǎn)？為什么？

11.比較平板計(jì)數(shù)法和顯微鏡直接計(jì)數(shù)法的優(yōu)缺點(diǎn)

12.高壓蒸汽鍋滅菌開(kāi)始之前為什么要將鍋內(nèi)的冷空氣排盡？滅菌后為什么要待壓力表指針降到0時(shí)，才能打開(kāi)排氣閥，開(kāi)蓋取物。

13.鮮乳中存在霉毒素會(huì)對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)起什么作用？

14.普通酸乳制作中常加入乳酸菌有哪些？比例如何？二者關(guān)系如何？

15.用作消毒劑的乙醇濃度是多少？請(qǐng)說(shuō)明用此濃度的乙醇的原因和機(jī)理。

第四篇：微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)

細(xì)菌群體生長(zhǎng)表現(xiàn)為細(xì)胞數(shù)目的增加或細(xì)胞物質(zhì)的增加。測(cè)定細(xì)胞數(shù)目的方法有顯微鏡直接計(jì)數(shù)法(direct microscopic count)、平板菌落計(jì)數(shù)法(plate count)、光電比油法(turbidity estimation by spectrophotometer)、最大或然數(shù)法(most probable number MPN)以及膜過(guò)濾法(membrane filtration)等。測(cè)定細(xì)胞物質(zhì)的方法有細(xì)胞干重的測(cè)定，細(xì)胞某種成分如氮的含量、RNA和DNA的含量測(cè)定，代謝產(chǎn)物的測(cè)定等。總之，測(cè)定微生物生長(zhǎng)量的方法很多，各有優(yōu)缺點(diǎn)，工作中應(yīng)根據(jù)具體情況要求加以選擇。本實(shí)驗(yàn)主要介紹生產(chǎn)、科研工作中比較常用的顯微鏡直接計(jì)數(shù)法、平板菌落計(jì)數(shù)法和光電比濁計(jì)數(shù)法。

一 顯微鏡直接計(jì)數(shù)法

（一）目的要求

1．明確血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)的原理。

2．掌握使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行微生物計(jì)數(shù)的方法。

（二）基本原理

顯微鏡直接計(jì)數(shù)法是將小量待測(cè)樣品的懸浮液置于一種特別的具有確定面積和容積的載玻片上(又稱計(jì)菌器)，于顯微鏡下直接計(jì)數(shù)的一種簡(jiǎn)便、快速、直觀的方法。目前國(guó)內(nèi)外常用的計(jì)菌器有：血細(xì)胞計(jì)數(shù)板、Peteroff-Hauser計(jì)菌器以及Hawksley計(jì)菌器等，它們都可用于酵母、細(xì)菌、霉菌孢子等懸液的計(jì)數(shù)，基本原理相同。后兩種計(jì)菌器由于蓋上蓋玻片后，總?cè)莘e為0.02mm3，而且蓋玻片和載波片之間的距離只有0.02mm，因此可用油浸物鏡對(duì)細(xì)菌等較小的細(xì)胞進(jìn)行觀察和計(jì)數(shù)。除了用這些計(jì)菌器外，還有在顯微鏡下直接觀察涂片面積與視野面積之比的估算法，此法一般用于牛乳的細(xì)菌學(xué)檢查。顯微鏡直接計(jì)數(shù)法的優(yōu)點(diǎn)是直觀、快速、操作簡(jiǎn)單。但此法的缺點(diǎn)是所測(cè)得的結(jié)果通常是死菌體和活菌體的總和。目前已有一些方法可以克服這一缺點(diǎn)，如結(jié)合活菌染色微室培養(yǎng)（短時(shí)間）以及加細(xì)胞分裂抑制劑等方法來(lái)達(dá)到只計(jì)數(shù)活菌體的目的。本實(shí)驗(yàn)以血球計(jì)數(shù)板為例進(jìn)行顯微鏡直接計(jì)數(shù)。另外兩種計(jì)菌器的使用方法可參看各廠商的說(shuō)明書(shū)。

用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板在顯微鏡下直接計(jì)數(shù)是一種常用的微生物計(jì)數(shù)方法。該計(jì)數(shù)板是一塊特制的載玻片，其上由四條槽構(gòu)成三個(gè)平臺(tái)；中間較寬的平臺(tái)又被一短橫槽隔成兩半，每一邊的平臺(tái)上各列有一個(gè)方格網(wǎng)，每個(gè)方格網(wǎng)共分為九個(gè)大方格，中間的大方格即為計(jì)數(shù)室。血細(xì)胞計(jì)數(shù)板構(gòu)造如圖l5-1。計(jì)數(shù)室的刻度一般有兩種規(guī)格，一種是一個(gè)大方格分成25個(gè)中方格，而每個(gè)中方格又分成16個(gè)小方格(圖15—2)；另一種是一個(gè)大方格分成16個(gè)中方格，而每個(gè)中方格又分成25個(gè)小方格，但無(wú)論是哪一種規(guī)格的計(jì)數(shù)板，每一個(gè)大方格中的小方格都是400個(gè)。每一個(gè)大方格邊長(zhǎng)為lmm，則每一個(gè)大方格的面積為lmm2，蓋上蓋玻片后，蓋玻片與載玻片之間的高度為0.lmm，所以計(jì)數(shù)室的容積為0.lmm3(萬(wàn)分之一毫升)。

圖15—1 血細(xì)胞計(jì)數(shù)板構(gòu)造

（一）圖15—2 血細(xì)胞計(jì)數(shù)板構(gòu)造

（二）A.正面圖；B.縱切面圖； 放大后的方格網(wǎng)，中間大方格為計(jì)數(shù)室

1.血細(xì)胞計(jì)數(shù)板；2.蓋玻片；3.計(jì)數(shù)室

計(jì)數(shù)時(shí)，通常數(shù)五個(gè)中方格的總菌數(shù)，然后求得每個(gè)中方格的平均值，再乘上25或16，就得出一個(gè)大方格中的總菌數(shù)，然后再換算成lml菌液中的總菌數(shù)。

設(shè)五個(gè)中方格中的總菌數(shù)為A，菌液稀釋倍數(shù)為B，如果是25個(gè)中方格的計(jì)數(shù)板，則

1mL菌液中的總菌數(shù)=A/5×25×104×B=50000A·B（個(gè)）

同理，如果是16個(gè)中方格的計(jì)數(shù)板，1mL菌液中的總菌數(shù)=A/5×16×104×B=32000A·B（個(gè)）

（三）器材

1．菌種 釀酒酵母

2．儀器或其他用具 血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，顯微鏡，蓋玻片，無(wú)菌毛細(xì)滴管。

（四）操作步驟

l．菌懸液制備

以無(wú)菌生理鹽水將釀酒酵母制成濃度適當(dāng)?shù)木鷳乙骸?/p>

2．鏡檢計(jì)數(shù)室

在加樣前，先對(duì)計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)室進(jìn)行鏡檢。若有污物，則需清洗，吹干后才能進(jìn)行計(jì)數(shù)。

3．加樣品

將清潔干燥的血細(xì)胞計(jì)數(shù)板蓋上蓋玻片，再用無(wú)菌的毛細(xì)滴管將搖勻的釀酒酵母菌懸液由蓋玻片邊緣滴一小滴，讓菌液沿縫隙靠毛細(xì)滲透作用自動(dòng)進(jìn)入計(jì)數(shù)室，一般計(jì)數(shù)室均能充滿菌液。

取樣時(shí)先要搖勻菌液；加樣時(shí)計(jì)數(shù)室不可有氣泡產(chǎn)生。

4．顯微鏡計(jì)數(shù)

加樣后靜止5min，然后將血細(xì)胞計(jì)數(shù)板置于顯微鏡載物臺(tái)上，先用低倍鏡找到計(jì)數(shù)室所在位置，然后換成高倍鏡進(jìn)行計(jì)數(shù)。

調(diào)節(jié)顯微鏡光線的強(qiáng)弱適當(dāng)，對(duì)于用反光鏡采光的顯微鏡還要注意光線不要偏向一邊，否則視野中不易舌清楚計(jì)數(shù)室方格線，或只見(jiàn)豎線或只見(jiàn)橫線。

在計(jì)數(shù)前若發(fā)現(xiàn)菌液太濃或太稀，需重新調(diào)節(jié)稀釋度后再計(jì)數(shù)。一般樣品稀釋度要求每小格內(nèi)約有5~10個(gè)菌體為宜。每個(gè)計(jì)數(shù)室選5個(gè)中格(可選4個(gè)角和中央的一個(gè)中格)中的菌體進(jìn)行計(jì)數(shù)。位于格線上的菌體一般只數(shù)上方和右邊線上的。如遇酵母出芽，芽體大小達(dá)到母細(xì)胞的一半時(shí)，即作為兩個(gè)菌體計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)一個(gè)樣品要從兩個(gè)計(jì)數(shù)室中計(jì)得的平均數(shù)值來(lái)計(jì)算樣品的含菌量。

5．清洗血細(xì)胞計(jì)數(shù)板

使用完畢后，將血細(xì)胞計(jì)數(shù)板在水龍頭用水沖洗干凈，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹風(fēng)機(jī)吹干。鏡檢，觀察每小格內(nèi)是否有殘留菌體或其他沉淀物。若不干凈，則必須重復(fù)洗滌至干凈為止。

（五）實(shí)驗(yàn)報(bào)告

l．結(jié)果

將結(jié)果記錄于下表中。A表示五個(gè)中方格中的總菌數(shù)；B表示菌液稀釋倍數(shù)。

各中格中菌數(shù)AB二室平均值菌數(shù)/ml

12345

第一室

第二室

2．思考題

(1)根據(jù)你的體會(huì)，說(shuō)明用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)的誤差主要來(lái)自哪些方面?應(yīng)如何盡量減少誤差．力求準(zhǔn)確?

(2)某單位要求知道一種干酵母粉中的活菌存活率，請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)1～2種可行的檢測(cè)方法。

二平板菌落計(jì)數(shù)法

（一）目的要求

學(xué)習(xí)習(xí)近平板菌落計(jì)數(shù)的基本原理和方法。

（二）、基本原理

平板菌落計(jì)數(shù)法是將待測(cè)樣品經(jīng)適當(dāng)稀釋之后，其中的微生物充分分散成單個(gè)細(xì)胞，取一定量的稀釋樣液接種到平板上，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)，由每個(gè)單細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖而形成肉眼可見(jiàn)的菌落，即一個(gè)單菌落應(yīng)代表原樣品中的一個(gè)單細(xì)胞。統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)，根據(jù)其稀釋倍數(shù)和取樣接種量即可換算出樣品中的含菌數(shù)。但是，由于待測(cè)樣品往往不易完全分散成單個(gè)細(xì)胞，所以，長(zhǎng)成的一個(gè)單菌落也可來(lái)自樣品中的2～3或更多個(gè)細(xì)胞。因此平板菌落計(jì)數(shù)的結(jié)果往往偏低。為了清楚地闡述平板菌落計(jì)數(shù)的結(jié)果，現(xiàn)在已傾向使用菌落形成單位(colony-forming units，cfu)而不以絕對(duì)菌落數(shù)來(lái)表示樣品的活菌含量。

平板菌落計(jì)數(shù)法雖然操作較繁，結(jié)果需要培養(yǎng)一段時(shí)間才能取得，而且測(cè)定結(jié)果易受多種因素的影響，但是，由于該計(jì)數(shù)方法的最大優(yōu)點(diǎn)是可以獲得活菌的信息，所以被廣泛用于生物制品檢驗(yàn)(如活菌制劑)，以及食品、飲料和水(包括水源水)等的含菌指數(shù)或污染程度的檢測(cè)。

（三）器材

1．菌種 大腸桿菌菌懸液。

2．培養(yǎng)基 牛肉膏蛋白陳培養(yǎng)基。

3．儀器或其他用具lm1無(wú)菌吸管，無(wú)菌平皿，盛有4.5ml無(wú)菌水的試管，試管架，恒溫培養(yǎng)箱等。

（四）操作步驟

l．編號(hào)

取無(wú)菌平皿9套，分別用記號(hào)筆標(biāo)明10-

4、10-

5、10-6。(稀釋度)各3套。另取6支盛有4.5mL無(wú)菌水的試管，依次標(biāo)是10-

1、10-

2、10-

3、10-

4、10-

5、10-6。

2．稀釋

用lmL無(wú)菌吸管吸取lmL已充分混勻的大腸桿菌菌縣液(待測(cè)樣品)，精確地放0.5ml至10-1的試管中，此即為10倍稀釋。將多余的菌液放回原菌液中。

OptionsEmail Replies將10-1試管置試管振蕩器上振蕩，使菌液充分混勻。另取一支lml吸管插入10?1試管中來(lái)回吹吸菌懸液三次，進(jìn)一步將菌體分散、混勻。吹吸菌液時(shí)不要太猛太快，吸時(shí)吸管伸人管底，吹時(shí)離開(kāi)液面，以免將吸管中的過(guò)濾棉花浸濕或使試管內(nèi)液體外溢。用此吸管吸取10-1菌液lmL，精確地放0.5mL至10-2試管中，此即為100倍稀釋?！溆嘁来晤愅?，整個(gè)過(guò)程如圖15-3所示。

放菌液時(shí)吸管尖不要碰到液面，即每一支吸管只能接觸一個(gè)稀釋度的菌懸液，否則稀釋不精確，結(jié)果誤差較大。

3，取樣

用三支1mL無(wú)菌吸管分別吸取10-

4、10-5和10-6。的稀釋菌懸液各lmL，對(duì)號(hào)放入編好號(hào)的無(wú)菌平皿中，每個(gè)平皿放0.2mL。

不要用lmL吸管每次只靠吸管尖部吸0.2mL稀釋菌液放入平皿臼，這樣容易加大同一稀釋度幾個(gè)重復(fù)平板間的操作誤差。

圖15—3平板菌落計(jì)數(shù)操作步驟

4．倒平板．

盡快向上述盛有不同稀釋度菌液的平皿中倒入融化后冷卻至45℃左右的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基約15毫升/平皿，置水平位置迅速旋動(dòng)平皿，使培養(yǎng)基與菌液混合均勻，而又不使培養(yǎng)基蕩出平皿或?yàn)R到平皿蓋上。由于細(xì)菌易吸附到玻璃器皿表面，所以菌液加入到培養(yǎng)皿后，應(yīng)盡快倒入融化并于已冷卻至45℃左右的培養(yǎng)基，立即搖勻，否則細(xì)菌將不易分散或長(zhǎng)成的菌落連在一起，影響計(jì)數(shù)。

待培養(yǎng)基凝固后，將平板倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

5．計(jì)數(shù)

培養(yǎng)48h后，取出培養(yǎng)平板，算出同一稀釋度三個(gè)平板上的菌落平均數(shù)，并按下列公式進(jìn)行計(jì)算，每毫升中菌落形成單位(cfu)=同一稀釋度三次重復(fù)的平均菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×5

一般選擇每個(gè)平板上長(zhǎng)有30~300個(gè)菌落的稀釋度計(jì)算每毫升的含菌量較為合適。同一稀釋度的三個(gè)重復(fù)對(duì)照的菌落數(shù)不應(yīng)相差很大，否則表示試驗(yàn)不精確。實(shí)際工作中同一稀釋度重復(fù)對(duì)照平板不能少于三個(gè)，這樣便于數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，減少誤差。由10-

4、10-

5、10-6三個(gè)稀釋度計(jì)算出的每毫升菌液中菌落形成單位數(shù)也不應(yīng)相差太大。

平板菌落計(jì)數(shù)法，所選擇倒平板的稀釋度是很重要的。一般以三個(gè)連續(xù)稀釋度中的第二個(gè)稀釋度倒平板培養(yǎng)后所出現(xiàn)的平均菌落數(shù)在50個(gè)左右為好，否則要適當(dāng)增加或減少稀釋度加以調(diào)整。

平板菌落計(jì)數(shù)法的操作除上述傾注倒平板的方式以外，還可以用涂布平板的方式進(jìn)行。二者操作基本相同，所不同的是后者先將牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基融化后倒平板，待凝固后編號(hào)，并于37℃左右的溫箱中烘烤30min，或在超靜工作臺(tái)上適當(dāng)吹干，然后用無(wú)菌吸管吸取稀釋好的菌液對(duì)號(hào)接種于不同稀釋度編號(hào)的平板上，并盡快用無(wú)菌玻璃涂棒將菌液在平板上涂布均勻，平放于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上20～30min，使菌液滲入培養(yǎng)基表層內(nèi)，然后倒置37℃的恒溫箱中培養(yǎng)24～48h。

涂布平板用的菌懸液量一般以0.1ml較為適宜，如果過(guò)少菌液不易涂布開(kāi)，過(guò)多則在涂布完后或在培養(yǎng)時(shí)菌液仍會(huì)在平板表面流動(dòng)，不易形成單菌落。

五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告

1．結(jié)果

2．將培養(yǎng)后菌落計(jì)數(shù)結(jié)果填入下表

稀釋度10-410-510-6

Cfu數(shù)/平板123平均123平均123平均

每毫升中的cfu

2．思考題

(1)為什么融化后的培養(yǎng)基要冷卻至45℃左右才能倒平板?

(2)要使平板菌落計(jì)數(shù)準(zhǔn)確，需要掌握哪幾個(gè)關(guān)鍵?為什么?

(3)試比較平板菌落計(jì)數(shù)法和顯微鏡下直接計(jì)數(shù)法的優(yōu)缺點(diǎn)及應(yīng)用。

(4)當(dāng)你的平板上長(zhǎng)出的菌落不是均勻分散的而是集中在一起時(shí)，你認(rèn)為問(wèn)題出在哪里?

(5)用倒平板法和涂布法計(jì)數(shù)，其平板上長(zhǎng)出的菌落有何不同?為什么要培養(yǎng)較長(zhǎng)時(shí)間(48h)后觀察結(jié)果?

三 光電比濁計(jì)數(shù)法

一、目的要求

1．了解光電比濁計(jì)數(shù)法的原理。

2．學(xué)習(xí)、掌握光電比濁計(jì)數(shù)法的操作方法。

二、基本原理

當(dāng)光線通過(guò)微生物菌懸液時(shí)，由于菌體的散射及吸收作用使光線的透過(guò)量降低。在一定的范圍內(nèi)，微生物細(xì)胞濃度與透光度成反比，與光密度成正比，而光密度或透光度可以由光電池精確測(cè)出(圖15-4)。因此，可用一系列已知菌數(shù)的菌懸液測(cè)定光密度，作出光密度—菌數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后，以樣品液所測(cè)得的光密度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出對(duì)應(yīng)的菌數(shù)。制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，菌體計(jì)數(shù)可采用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，平板菌落計(jì)數(shù)或細(xì)胞干重測(cè)定等方法。本實(shí)驗(yàn)采用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。

光電比濁計(jì)數(shù)法的優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)便、迅速，可以連續(xù)測(cè)定，適合于自動(dòng)控制。但是，由于光密度或透光度除了受菌體濃度影響之外，還受細(xì)胞大小、形態(tài)、培養(yǎng)液成分以及所采用的光波長(zhǎng)等因素的影響。因此，對(duì)于不同微生物的菌懸液進(jìn)行光電比濁計(jì)數(shù)應(yīng)采用相同的菌株和培養(yǎng)條件制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。光波的選擇通常在400~700nm之間，具體到某種微生物采用多少還需要經(jīng)過(guò)最大吸收波長(zhǎng)以及穩(wěn)定性試驗(yàn)來(lái)確定。另外，對(duì)于顏色太深的樣品或在樣品中還含有其他干擾物質(zhì)的懸液不適合用此法進(jìn)行測(cè)定。

圖15—4 比濁法測(cè)定細(xì)胞濃度的原理

（三）器材

1．菌種 釀酒酵母培養(yǎng)液

2．儀器或其他用具 721型分光光度計(jì)，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，顯微鏡，試管，吸水紙，無(wú)菌吸管，無(wú)菌生理鹽水等。

（四）操作步驟

1．標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

（1）編號(hào) 取無(wú)菌試管7支，分別用記號(hào)筆將試管編號(hào)為1、2、3、4、5、6、7。

（2）調(diào)整菌液濃度 用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)培養(yǎng)24小時(shí)的釀酒酵母菌懸液，并用無(wú)菌生理鹽水分別稀釋調(diào)整為每毫升1×106、2×106、4×106、6×106、8×106、10×106、12×106含菌數(shù)的細(xì)胞懸液。再分別裝入已編好號(hào)的1至7號(hào)無(wú)菌試管中。

（3）測(cè)OD值 將1至7號(hào)不同濃度的菌懸液搖均勻后于560nm波長(zhǎng)、1cm比色皿中測(cè)定OD值。比色測(cè)定時(shí)，用無(wú)菌生理鹽水作空白對(duì)照，并將OD值填入下表

管號(hào)12345678

細(xì)胞數(shù)106/ml

光密度（OD）

每管菌懸液在測(cè)定OD值時(shí)均必須先搖勻后再倒入比色皿中測(cè)定

(4)以光密度(OD)值為縱坐標(biāo)，以每毫升細(xì)胞數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2．樣品測(cè)定

將待測(cè)樣品用無(wú)菌生理鹽水適當(dāng)稀釋，搖均勻后，用560nm波長(zhǎng)、lcm比色皿測(cè)定光密度。測(cè)定時(shí)用無(wú)菌生理鹽水作空白對(duì)照。

各種操作條件必須與制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)的相同，否則，測(cè)得值所換算的含菌數(shù)就不準(zhǔn)確。

3．根據(jù)所測(cè)得的光密度值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得每毫升的含菌數(shù)。

（五）實(shí)驗(yàn)報(bào)告

l．結(jié)果

每毫升樣品原液菌數(shù)=從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得每毫升的菌數(shù)×稀釋倍數(shù)

2．思考題

(1)光電比濁計(jì)數(shù)的原理是什么?這種計(jì)數(shù)法有何優(yōu)缺點(diǎn)?

(2)光電比濁計(jì)數(shù)在生產(chǎn)實(shí)踐中有何應(yīng)用價(jià)值?

(3)本實(shí)驗(yàn)為什么采用560nm波長(zhǎng)測(cè)定酵母菌懸液的光密度?如果你在實(shí)驗(yàn)中需要測(cè)定大腸桿菌生長(zhǎng)的OD值，你將如何選擇波長(zhǎng)?

四 大腸桿菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

(一)目的要求

1．通過(guò)細(xì)菌數(shù)量的測(cè)量了解大腸桿菌的生物特征和規(guī)律，繪制生長(zhǎng)線。

2．復(fù)習(xí)光電比濁法測(cè)量細(xì)菌數(shù)量的方法。

(二)基本原理

大多數(shù)細(xì)菌的繁殖速率很快，在合適的條件下，一定時(shí)期的大腸桿菌細(xì)胞每20min分裂一次。將一定量的細(xì)菌轉(zhuǎn)入新鮮液體培養(yǎng)基中，在適宜的條件下培養(yǎng)細(xì)胞要經(jīng)歷延遲期，對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期四個(gè)階段。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，以細(xì)菌數(shù)目的對(duì)數(shù)或生長(zhǎng)速率為縱坐標(biāo)作圖所繪制的曲線稱為該細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線。不同的細(xì)菌在相同的培養(yǎng)條件下其生長(zhǎng)曲線不同，同樣的細(xì)菌在不同的培養(yǎng)條件下所繪制的生長(zhǎng)曲線也不相同。測(cè)定細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線，了解其生長(zhǎng)繁殖規(guī)律，這對(duì)人們根據(jù)不同的需要，有效地利用和控制細(xì)菌的生長(zhǎng)具有重要意義。

用于測(cè)定細(xì)菌細(xì)胞數(shù)量的方法已在上述實(shí)驗(yàn)作了介紹。本實(shí)驗(yàn)用分光光度計(jì)(spectrophotometer)進(jìn)行光電比濁測(cè)定不同培養(yǎng)時(shí)間細(xì)菌懸浮液的OD值，繪制生長(zhǎng)曲線。也可以直接用試管或帶有測(cè)定管的三角瓶(圖15-5)測(cè)定“klett units”值的光度計(jì)。如圖15—6所示，只要接種1支試管或1個(gè)帶測(cè)定管的三角瓶，在不同的培養(yǎng)時(shí)間(橫坐標(biāo))取樣測(cè)定，以測(cè)得的klett units為縱坐標(biāo)，便可很方便地繪制出細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線。如果需要，可根據(jù)公式1 klett units=OD/0.002換算出所測(cè)菌懸液的OD值。

圖15—5 帶側(cè)臂試管的三角燒瓶

(三)器材

1．菌種 大腸桿菌

2．培養(yǎng)基 LB液體培養(yǎng)基70ml，分裝2支大試管(5ml/支)，剩余60ml裝入250ml的三角瓶。

3．儀器或其他用具 722型分光光度計(jì)，水浴振蕩搖床，無(wú)菌試管，無(wú)菌吸管等。

圖15—6 直接用試管測(cè)OD值

(四)操作步驟

1．標(biāo)記

取11支無(wú)菌大試管，用記號(hào)筆分別標(biāo)明培養(yǎng)時(shí)間，即0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16和20h。

2．接種

分別用5ml無(wú)菌吸管吸取2.5ml大腸桿菌過(guò)夜培養(yǎng)液(培養(yǎng)10~12h)轉(zhuǎn)入盛有50ml LB液的三角瓶?jī)?nèi)，混合均勻后分別取5ml混合液放入上述標(biāo)記的11支無(wú)菌大試管中。

3．培養(yǎng)

將已接種的試管置搖床37℃振蕩培養(yǎng)(振蕩頻率250r/min)，分別培養(yǎng)0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16和20h，將標(biāo)有相應(yīng)時(shí)間的試管取出，立即放冰箱中貯存，最后一同比濁測(cè)定其光密度值。

4．比濁測(cè)定

用未接種的LB液體培養(yǎng)基作空白對(duì)照，選用600nm波長(zhǎng)進(jìn)行光電比濁測(cè)定。從早取出的培養(yǎng)液開(kāi)始依次測(cè)定，對(duì)細(xì)胞密度大的培養(yǎng)液用LB液體培養(yǎng)基適當(dāng)稀釋后測(cè)定，使其光密度值在0.1~0.65之內(nèi)(測(cè)定OD值前，將待測(cè)定的培養(yǎng)液振蕩，使細(xì)胞均勻分布)。

本操作步驟也可用簡(jiǎn)便的方法代替：

1．用1ml無(wú)菌吸管取0.25ml大腸桿菌過(guò)夜培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入盛有3~5ml LB液的試管中、混勻后將試管直接插入分光光度計(jì)的比色糟中，比色糟上方用自制的暗盒將試管及比色暗室全部罩上，形成一個(gè)大的暗環(huán)境，另以1支盛有LB液但沒(méi)有接種的試管調(diào)零點(diǎn)，測(cè)定樣品中培養(yǎng)0h的OD值。測(cè)定完畢后，取出試管置37℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)。

2．分別在培養(yǎng)0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16和20h，取出培養(yǎng)物試管按上述方法測(cè)定OD值。該方法準(zhǔn)確度高、操作簡(jiǎn)便。但須注意的是使用的2支試管要很干凈，其透光程度愈接近，測(cè)定的準(zhǔn)確度愈高。

(五)實(shí)驗(yàn)報(bào)告

1．結(jié)果

(1)將測(cè)定的OD600值填入下表：

培養(yǎng)時(shí)間對(duì)照 0 1.5 3 4 6 8 10 12 14 16 20

光密度值OD600

(2)繪制大腸桿菌的生長(zhǎng)曲線。

2．思考題

(1)如果用活菌計(jì)數(shù)法制作生長(zhǎng)曲線，你認(rèn)為會(huì)有什么不同？?jī)烧吒饔惺裁磧?yōu)缺點(diǎn)？

(2)細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖所經(jīng)歷的四個(gè)時(shí)期中，哪個(gè)時(shí)期其代時(shí)最短？若細(xì)胞密度為103/ml，培養(yǎng)4.5h后，其密度高達(dá)2×108/ml，計(jì)計(jì)算出其代時(shí)。

(3)次生代謝產(chǎn)物的大量積累在哪個(gè)時(shí)期？根據(jù)細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖的規(guī)律，采用哪些措施可使次生代謝產(chǎn)物積累更多？

評(píng)論這張

第五篇：微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)考試要求

課程名稱：微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)（微生物專業(yè)）

一、考試的總體要求

微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)是微生物學(xué)和工業(yè)生物技術(shù)等專業(yè)技術(shù)人才最重要的專業(yè)基礎(chǔ)技能。通過(guò)本課程的考核，重點(diǎn)檢查考生對(duì)微生物學(xué)基本實(shí)驗(yàn)技能及其原理和應(yīng)用等掌握情況，主要包括微生物的染色與顯微觀察技術(shù)；微生物的分離純化與培養(yǎng)技術(shù)；微生物生長(zhǎng)測(cè)定與生理生化技術(shù)、微生物遺傳育種技術(shù)以及分子微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)等。要求掌握實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)原理、主要步驟、注意事項(xiàng)以及該實(shí)驗(yàn)技術(shù)的適用對(duì)象等。

二、試題類型及比例

1、簡(jiǎn)答題：約40%

2、問(wèn)答題：約60%

三、考試形式及時(shí)間

考試形式為筆試?？荚嚂r(shí)間為3小時(shí)。

四、考試主要內(nèi)容

（一）微生物染色與顯微觀察技術(shù)

1.顯微鏡的使用及維護(hù)

2.細(xì)菌簡(jiǎn)單染色、革蘭氏染色、芽孢染色與細(xì)菌形態(tài)觀察

3.酵母菌美蘭染色與酵母細(xì)胞形態(tài)觀察

4.霉菌的形態(tài)觀察

（二）微生物的分離純化與純培養(yǎng)技術(shù)

1.培養(yǎng)基的制備與滅菌（含玻璃器皿的包扎）

2.無(wú)菌操作技術(shù)

3.平板劃線、傾注平板與涂布平板分離技術(shù)

（三）微生物生長(zhǎng)測(cè)定與生理生化技術(shù)

1.微生物大小與總數(shù)測(cè)定

2.平板菌落計(jì)數(shù)法及其它生長(zhǎng)測(cè)定技術(shù)

3.微生物的生理生化試驗(yàn)

4.水的衛(wèi)生細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)

（四）微生物遺傳育種及分子微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)

1.從自然界中分離篩選特定類型的微生物

2.微生物誘變技術(shù)及特定突變型的篩選

3.微生物原生質(zhì)體制備與融合技術(shù)

4.細(xì)菌質(zhì)粒DNA的抽提與電泳檢測(cè)

5.細(xì)菌質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化

6.DNA的PCR擴(kuò)增及其產(chǎn)物純化

五、主要參考書(shū)目

1.諸葛健，李華鐘主編，微生物學(xué)（第二版，實(shí)驗(yàn)部分），科學(xué)出版社，2009

2.諸葛健，李華鐘，王正祥主編，微生物遺傳育種學(xué)（實(shí)驗(yàn)部分），化學(xué)工業(yè)出版社，2009

3.諸葛健主編，工業(yè)微生物實(shí)驗(yàn)與研究技術(shù)，科學(xué)出版社，2007