第一篇：研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用方法總結(jié)-實(shí)驗(yàn)步驟

研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用方法總結(jié)-實(shí)驗(yàn)步驟

蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間相互作用構(gòu)成了細(xì)胞生化反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)的一個(gè)主要組成部分，蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)與轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)對(duì)調(diào)控細(xì)胞及其信號(hào)有重要意義。把原來(lái)spaces空間上的一篇蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)間相互作用研究方法轉(zhuǎn)來(lái)，算是實(shí)驗(yàn)技巧分類(lèi)目錄的首篇。間相互作用的實(shí)驗(yàn)方法比較)

一、酵母雙雜交系統(tǒng)

酵母雙雜交系統(tǒng)是當(dāng)前廣泛用于蛋白質(zhì)相互作用組學(xué)研究的一種重要方法。其原理是當(dāng)靶蛋白和誘餌蛋白特異結(jié)合后，誘餌蛋白結(jié)合于報(bào)道基因的啟動(dòng)子，啟動(dòng)報(bào)道基因在酵母細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，如果檢測(cè)到報(bào)道基因的表達(dá)產(chǎn)物，則說(shuō)明兩者之間有相互作用，反之則兩者之間沒(méi)有相互作用。將這種技術(shù)微量化、陣列化后則可用于大規(guī)模蛋白質(zhì)之間相互作用的研究。在實(shí)際工作中，人們根據(jù)需要發(fā)展了單雜交系統(tǒng)、三雜交系統(tǒng)和反向雜交系統(tǒng)等。Angermayr等設(shè)計(jì)了一個(gè)SOS蛋白介導(dǎo)的雙雜交系統(tǒng)?？梢匝芯磕さ鞍椎墓δ?，豐富了酵母雙雜交系統(tǒng)的功能。此外，酵母雙雜交系統(tǒng)的作用也已擴(kuò)展至對(duì)蛋白質(zhì)的鑒定。

二、噬茵體展示技術(shù)

在編碼噬菌體外殼蛋白基因上連接一單克隆抗體的DNA序列，當(dāng)噬菌體生長(zhǎng)時(shí)，表面就表達(dá)出相應(yīng)的單抗，再將噬菌體過(guò)柱，柱上若含目的蛋白，就會(huì)與相應(yīng)抗體特異性結(jié)合，這被稱(chēng)為噬菌體展示技術(shù)。此技術(shù)也主要用于研究蛋白質(zhì)之間的相互作用，不僅有高通量及簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，還具有直接得到基因、高選擇性的篩選復(fù)雜混合物、在篩選過(guò)程中通過(guò)適當(dāng)改變條件可以直接評(píng)價(jià)相互結(jié)合的特異性等優(yōu)點(diǎn)。目前，用優(yōu)化的噬菌體展示技術(shù)，已經(jīng)展示了人和鼠的兩種特殊細(xì)胞系的cDNA文庫(kù)，并分離出了人上皮生長(zhǎng)因子信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的信號(hào)分子。

三、等離子共振技術(shù)

表面等離子共振技術(shù)(Surface Plasmon Resonance，SPR)已成為蛋白質(zhì)相互作用研究中的新手段。它的原理是利用一種納米級(jí)的薄膜吸附上“誘餌蛋白”，當(dāng)待測(cè)蛋白與誘餌蛋白結(jié)合后，薄膜的共振性質(zhì)會(huì)發(fā)生改變，通過(guò)檢測(cè)便可知這兩種蛋白的結(jié)合情況。SPR技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是不需標(biāo)記物或染料，反應(yīng)過(guò)程可實(shí)時(shí)監(jiān)控。測(cè)定快速且安全，還可用于檢測(cè)蛋白一核酸及其它生物大分子之間的相互作用。

(另補(bǔ)充2：檢測(cè)兩種蛋白質(zhì)之

四、熒光能量轉(zhuǎn)移技術(shù)

熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）廣泛用于研究分子間的距離及其相互作用;與熒光顯微鏡結(jié)合，可定量獲取有關(guān)生物活體內(nèi)蛋白質(zhì)、脂類(lèi)、DNA 和RNA 的時(shí)空信息。隨著綠色熒光蛋白（GFP）的發(fā)展，F(xiàn)RET 熒光顯微鏡有可能實(shí)時(shí)測(cè)量活體細(xì)胞內(nèi)分子的動(dòng)態(tài)性質(zhì)。提出了一種定量測(cè)量FRET效率以及供體與受體間距離的簡(jiǎn)單方法，僅需使用一組濾光片和測(cè)量一個(gè)比值，利用供體和受體的發(fā)射譜消除光譜間的串?dāng)_。該方法簡(jiǎn)單快速，可實(shí)時(shí)定量測(cè)量FRET 的效率和供體與受體間的距離，尤其適用于基于GFP 的供體受體對(duì)。

五、抗體與蛋白質(zhì)陣列技術(shù)

蛋白芯片技術(shù)的出現(xiàn)給蛋白質(zhì)組學(xué)研究帶來(lái)新的思路。蛋白質(zhì)組學(xué)研究中一個(gè)主要的內(nèi)容就是研究在不同生理狀態(tài)下蛋白水平的量變，微型化，集成化，高通量化的抗體芯片就是一個(gè)非常好的研究工具，他也是芯片中發(fā)展最快的芯片，而且在技術(shù)上已經(jīng)日益成熟。這些抗體芯片有的已經(jīng)在向臨床應(yīng)用上發(fā)展，比如腫瘤標(biāo)志物抗體芯片等，還有很多已經(jīng)應(yīng)用再眼就的各個(gè)領(lǐng)域里。

六、免疫共沉淀技術(shù)

免疫共沉淀主要是用來(lái)研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的一種技術(shù)，其基本原理是，在細(xì)胞裂解液中加入抗興趣蛋白的抗體，孵育后再加入與抗體特異結(jié)合的結(jié)合于Pansobin珠上的金黃色葡萄球菌蛋白A(SPA)，若細(xì)胞中有正與興趣蛋白結(jié)合的目的蛋白，就可以形成這樣一種復(fù)合物：“目的蛋白—興趣蛋白—抗興趣蛋白抗體—SPA|Pansobin”，因?yàn)镾PA|Pansobin比較大，這樣復(fù)合物在離心時(shí)就被分離出來(lái)。經(jīng)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，復(fù)合物四組分又被分開(kāi)。然后經(jīng)Western blotting法，用抗體檢測(cè)目的蛋白是什么，是否為預(yù)測(cè)蛋白。這種方法得到的目的蛋白是在細(xì)胞內(nèi)天然與興趣蛋白結(jié)合的，符合體內(nèi)實(shí)際情況，得到的蛋白可信度高。但這種方法有兩個(gè)缺陷：一是兩種蛋白質(zhì)的結(jié)合可能不是直接結(jié)合，而可能有第三者在中間起橋梁作用；二是必須在實(shí)驗(yàn)前預(yù)測(cè)目的蛋白是什么，以選擇最后檢測(cè)的抗體，所以，若預(yù)測(cè)不正確，實(shí)驗(yàn)就得不到結(jié)果，方法本身具有冒險(xiǎn)性。

七、pull-down技術(shù)

蛋白質(zhì)相互作用的類(lèi)型有牢固型相互作用和暫時(shí)型相互作用兩種。牢固型相互作用以多亞基蛋白復(fù)合體常見(jiàn)，最好通過(guò)免疫共沉淀（Co-IP）、Pull-down技術(shù)或Far-western法研究。Pull-down技術(shù)用固相化的、已標(biāo)記的餌蛋白或標(biāo)簽蛋白（生物素-、PolyHis-或GST-），從細(xì)胞裂解液中

釣出與之相互作用的蛋白。通過(guò)Pull-down技術(shù)可以確定已知的蛋白與釣出蛋白或已純化的相關(guān)蛋白間的相互作用關(guān)系，從體外傳路或翻譯體系中檢測(cè)出蛋白相互作用關(guān)系。

檢測(cè)兩種蛋白質(zhì)之間相互作用的實(shí)驗(yàn)方法比較

研究蛋白-蛋白相互作用是理解生命活動(dòng)的基礎(chǔ)。蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)是生物信息調(diào)控的主要實(shí)現(xiàn)方式，是決定細(xì)胞命運(yùn)的關(guān)鍵因素。檢測(cè)蛋白質(zhì)間相互作用的實(shí)驗(yàn)方法有哪些？(補(bǔ)充：研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用方法總結(jié)1)這些檢測(cè)方法各有什么優(yōu)缺點(diǎn)？總結(jié)如下。1.生化方法

●共純化、共沉淀，在不同基質(zhì)上進(jìn)行色譜層析（需要補(bǔ)充）

●蛋白質(zhì)親和色譜 基本原理是將一種蛋白質(zhì)固定于某種基質(zhì)上（如Sepharose），當(dāng)細(xì)胞抽提液經(jīng)過(guò)改基質(zhì)時(shí)，可與改固定蛋白相互作用的配體蛋白被吸附，而沒(méi)有吸附的非目標(biāo)蛋白則隨洗脫液流出。被吸附的蛋白可以通過(guò)改變洗脫液或者洗脫條件而回收下來(lái)。

GST pull down技術(shù)：為了更有效的利用蛋白質(zhì)親和色譜，可以將待純?cè)挼牡鞍滓匀诤系鞍椎男问奖磉_(dá)，即將”誘餌“蛋白與一種易于純化的配體蛋白融合。例如與GST融合的蛋白再經(jīng)過(guò)GSH的色譜柱時(shí)，就可以通過(guò)GST和GSH的相互作用而被吸附。當(dāng)載有細(xì)胞抽提物經(jīng)過(guò)柱時(shí)，就可以得到能夠與“誘餌”蛋白相互作用的目標(biāo)蛋白了。

Epitope-tag技術(shù)：表位附加標(biāo)記技術(shù) 就是將附加的抗原融合到目的蛋白以檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)，同時(shí)還可以通過(guò)親和層析法來(lái)純化目的蛋白。缺點(diǎn)：表位附加標(biāo)記可能會(huì)使融合蛋白不穩(wěn)定，改變或使融合蛋白功能喪失。

以上兩種方法都要共同的缺點(diǎn)：假陽(yáng)性。實(shí)驗(yàn)所檢測(cè)到的相互作用可能時(shí)由蛋白質(zhì)所帶電荷引起的，并不是生理性的相互作用；蛋白的相互作用可能并不是直接的，可是由第三者作為中介的；有時(shí)會(huì)檢測(cè)到兩種在細(xì)胞中不可能相遇卻有極強(qiáng)親和力的蛋白。因此實(shí)驗(yàn)結(jié)果還應(yīng)經(jīng)其他方法驗(yàn)證。

●免疫共沉淀 免疫共沉淀是以抗體和抗原之間的專(zhuān)一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法。改法的優(yōu)點(diǎn)是蛋白處于天然狀態(tài)，蛋白的相互作用可以在天然狀態(tài)下進(jìn)行，可以避免認(rèn)為影響；可以分離得到天然狀態(tài)下相互作用的蛋白復(fù)合體。缺點(diǎn)：免疫共沉淀同樣不能保證沉淀的蛋白復(fù)合物時(shí)候?yàn)橹苯酉嗷プ饔玫膬煞N蛋白。另外靈敏度不如親和色譜高。

●Far-Western 又叫做親和印記。將PAGE膠上分離好的凡百樣品轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上，然后檢測(cè)哪種蛋白能與標(biāo)記了同位素的誘餌蛋白發(fā)生作用，最后顯影。缺點(diǎn)是轉(zhuǎn)膜前需要將蛋白復(fù)性。

2.等離子表面共振技術(shù)（Surface plasmon resonance）該技術(shù)是將誘餌蛋白結(jié)合于葡聚糖表面，葡聚糖層固定于幾十納米厚的技術(shù)膜表面。當(dāng)有蛋白質(zhì)混合物經(jīng)過(guò)時(shí)，如果有蛋白質(zhì)同“誘餌”蛋白發(fā)生相互作用，那么兩者的結(jié)合將使金屬膜表面的折射綠上升，從而導(dǎo)致共振角度的改變。而共振角度的改變與該處的蛋白質(zhì)濃度成線性關(guān)系，由此可以檢測(cè)蛋白質(zhì)之間的相互作用。該技術(shù)不需要標(biāo)記物和染料，安全靈敏快速，還可定量分析。缺點(diǎn)：需要專(zhuān)門(mén)的等離子表面共振檢測(cè)儀器。

3.遺傳學(xué)方法 使某處發(fā)生缺損，檢測(cè)對(duì)其他地方的影響。

●基因外抑制子?；蛲庖种谱邮峭ㄟ^(guò)一個(gè)基因的突變來(lái)彌補(bǔ)原有基因的突變。比如相互作用的蛋白A和B，如果A發(fā)生了突變使兩者不再相互作用，此時(shí)B如果再發(fā)生彌補(bǔ)性突變就可以使兩者的相互作用恢復(fù)，那么B就是A的基因外抑制子。缺點(diǎn)：需要知道基因，要有表型，篩選抑制子比較費(fèi)時(shí)。

●合成致死篩選 指兩個(gè)基因同時(shí)發(fā)生突變會(huì)產(chǎn)生致死效應(yīng)，而當(dāng)每個(gè)基因單獨(dú)發(fā)生突變時(shí)則無(wú)致死效應(yīng)。用于分析兩個(gè)具有相同重要蛋白之間的相互作用。

4.雙雜交技術(shù) 原理基于真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)特殊性，這些轉(zhuǎn)錄因子通常需要兩個(gè)或以上相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域組成。分別使結(jié)合域和激活域同誘餌蛋白和獵物蛋白形成融合蛋白，在真核細(xì)胞中表達(dá)，如果兩種蛋白可以發(fā)生相互作用，則可使結(jié)合域和激活域在空間上充分接近，從而激活報(bào)告基因。缺點(diǎn)：自身有轉(zhuǎn)錄功能的蛋白會(huì)造成假陽(yáng)性。融合蛋白會(huì)影響蛋白的真實(shí)結(jié)構(gòu)和功能。不利于核外蛋白研究，會(huì)導(dǎo)致假隱性。

5.熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù) 指兩個(gè)熒光法色基團(tuán)在足夠近（<100埃）時(shí)，它們之間可發(fā)生能量轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象。熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)可以研究分子內(nèi)部對(duì)某些刺激發(fā)生的構(gòu)象變化，也能研究分子間的相互作用。它可以在活體中檢測(cè)，非常靈敏，分辯率高，能夠檢測(cè)大分子的構(gòu)象變化，能夠定性定量的檢測(cè)相互作用的強(qiáng)度。缺點(diǎn) 此項(xiàng)技術(shù)要求發(fā)色基團(tuán)的距離小于100埃。另外設(shè)備昂貴，還需要融合GFP給蛋白標(biāo)記。

此外還有交聯(lián)技術(shù)（cross－linKing），蛋白質(zhì)探針技術(shù)，噬菌體展示技術(shù)（Phage display）以及生物信息學(xué)的方法來(lái)檢測(cè)蛋白質(zhì)之間相互作用

Western雜交是將蛋白質(zhì)電泳、印跡、免疫測(cè)定融為一體的特異性蛋白質(zhì)的檢測(cè)方法。其原理是：生物中含有一定量的目的蛋白。先從生物細(xì)胞中提取總蛋白或目的蛋白，將蛋白質(zhì)樣品溶解于含有去污劑和還原劑的溶液中，經(jīng)SDS-PAGE電泳將蛋白質(zhì)按分子量大小分離，再把分離的各蛋白質(zhì)條帶原位轉(zhuǎn)移到固相膜（硝酸纖維素膜或尼龍膜）上，接著將膜浸泡在高濃度的蛋白質(zhì)溶液中溫育，以封閉其非特異性位點(diǎn)。然后加入特異抗性體（一抗），膜上的目的蛋白（抗原）與一抗結(jié)合后，再加入能與一抗專(zhuān)一性結(jié)合的帶標(biāo)記的二抗（通常一抗用兔來(lái)源的抗體時(shí)，二抗常用羊抗兔免疫球蛋白抗體），最后通過(guò)二抗上帶標(biāo)記化合物（一般為辣根過(guò)氧化物酶或堿性磷酸酶）的特異性反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，從而可得知被檢生物（植物）細(xì)胞內(nèi)目的蛋白的表達(dá)與否、表達(dá)量及分子量等情況。

Western雜交方法靈敏度高，通?？蓮闹参锟偟鞍字袡z測(cè)出50ng的特異性的目的蛋白

第二篇：分子克隆3—蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù)

蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù)

一、雙雜交和其他雙成分系統(tǒng)

二、用GST融合蛋白進(jìn)行Far Western 印記來(lái)檢測(cè)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用

三、用GST融合蛋白沉降技術(shù)檢測(cè)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用

四、通過(guò)免疫共沉淀確定結(jié)合蛋白

五、采用GFP和熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)測(cè)定蛋白質(zhì)相互作用

六、利用BIAcore通過(guò)表面胞質(zhì)基因共振光譜學(xué)分析相互作用的蛋白質(zhì)

七、。。

導(dǎo)言

一、多數(shù)蛋白質(zhì)研究工作可分為四個(gè)類(lèi)別：

1.二、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用研究的3個(gè)層次

1.研究的目的是確定各種可能與目標(biāo)蛋白相互作用的蛋白質(zhì)，此時(shí)要撒大網(wǎng)，因此生理意義暫時(shí)不被看重；

2.感興趣的相互作用蛋白質(zhì)已被確定，研究的目的是通過(guò)詳細(xì)分析生物學(xué)功能，來(lái)確定相互作用的生理學(xué)意義和影響。

3.某中相互作用已被發(fā)現(xiàn)，并且被證實(shí)是生理性的，此時(shí)研究的目的是提供一種高通量的方法，以發(fā)現(xiàn)能夠按所需的方式調(diào)節(jié)這種相互作用的試劑。

三、與蛋白質(zhì)相互作用直接相關(guān)的另一領(lǐng)域是分子模建：

四、各種技術(shù)應(yīng)用分析：

1.所列方案（1~6），不能證明觀察到的相互作用是直接或間接的，如果研究目的是確定直接相互作用，最終使用的方法中必須采用純化的蛋白質(zhì)。

2.特定蛋白質(zhì)的內(nèi)在性質(zhì)在某種程度上決定了哪種技術(shù)能有效的用于分析蛋白質(zhì)相互作用；`` 3.雙雜交和基于GST-融合的篩選方法（方案1，2，3）適用于撒大網(wǎng)式的應(yīng)用研究。方案2，3只是用來(lái)確定體外的相互作用,這種體外的相互作用應(yīng)當(dāng)進(jìn)一步在體內(nèi)通過(guò)單獨(dú)的方法來(lái)證實(shí)。

4.對(duì)于相互作用在生理上的證實(shí)和探索，采用內(nèi)源蛋白質(zhì)的免疫共沉淀（方案4）和FRET（方案5）的方法更可??；

5.為快速分析過(guò)去已確定的相互作用，雙雜交和GST沉降分析具有一些明顯的優(yōu)勢(shì)；

一、雙雜交和其他雙成分系統(tǒng)

二、用GST融合蛋白進(jìn)行Far Western 印記來(lái)檢測(cè)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(一)`引言

1.細(xì)菌表達(dá)的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)融合蛋白被用于直接測(cè)定蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，以及親和純化。

2.融合蛋白的設(shè)計(jì)依賴(lài)于所選擇的檢測(cè)方法和計(jì)劃采用的篩選方式。

[1].對(duì)于文庫(kù)篩選，將盡可能大的探針蛋白包括進(jìn)去可以增加檢測(cè)到的相互作用的數(shù)目。

[2].如果探針蛋白含有已知的相互作用區(qū)，并且他們用于證實(shí)預(yù)期的相互作用，那么僅含有這些結(jié)構(gòu)區(qū)域的融合蛋白可能更好。

3.GST成分可以二聚化并能產(chǎn)生背景。

4.籌劃Far Western 印記實(shí)驗(yàn)需要考慮的因素：

[1].最重要的因素是：在沒(méi)有過(guò)多降解和不溶解蛋白質(zhì)的條件下合成融合蛋白的能力。

[2].從不同融合蛋白制備物得到的結(jié)果可能有所不同，所以監(jiān)控融合蛋白的狀態(tài)是非常重要的，這包括純化期間和純化后，如果蛋白質(zhì)被存放，還包括使用前后。[3].有助于確認(rèn)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用特異性的兩個(gè)對(duì)照是 a)用融合蛋白突變體探測(cè)，這種突變體可以破壞相互作用； b)用標(biāo)記GST來(lái)探測(cè)膜。？

[4].最終，還要確定是否用變性/復(fù)性循環(huán)來(lái)探測(cè)膜，這樣設(shè)計(jì)是為了使錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)重新折疊成天然構(gòu)像。

a)從SDS-PAGE轉(zhuǎn)移到膜的蛋白質(zhì)通常不需要變性和復(fù)性，如果在檢測(cè)SDS-PAGE時(shí)沒(méi)有產(chǎn)生蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，那么引入變性/復(fù)性過(guò)程可能產(chǎn)生陽(yáng)性結(jié)果； b)在探測(cè)表達(dá)文庫(kù)覆蓋印記的濾膜時(shí)，許多研究人員發(fā)現(xiàn)變性/復(fù)性是必需的步驟。[5].5 5.5(二)實(shí)驗(yàn)方案

1.Materials [1].緩沖液和溶液 [2].2.Methods: [1].放射標(biāo)記蛋白探針的制備 [2].探測(cè)膜

3.3(三)注意事項(xiàng)

三、用GST融合蛋白沉降技術(shù)檢測(cè)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用

(一)`引言

1.GST-pull down 利用了GST對(duì)谷胱甘肽偶聯(lián)球珠的親和性，從非相互作用蛋白的溶液中純化相互作用蛋白。該技術(shù)對(duì)探測(cè)蛋白質(zhì)在溶液中的相互作用特別有用，而這種相互作用在膜的分析中可能是檢測(cè)不到的。2.GST-pull down通常有兩種應(yīng)用：

1)確定融合（或探針）蛋白與未知（或靶）蛋白間新的相互作用；

a)未知蛋白可能受濃度的限制，為確定新的相互作用，未知蛋白質(zhì)必須以足夠的量存在，以使這種相互作用能用所選擇的檢測(cè)方法觀察到。b)放射標(biāo)記的細(xì)胞裂解液時(shí)最常用的蛋白質(zhì)來(lái)源

c)在實(shí)驗(yàn)前要考慮：實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，探針蛋白的表達(dá)等。2)證實(shí)探針蛋白與已知蛋白間可疑的相互作用；

a)各種蛋白質(zhì)來(lái)源可用于確定和探詢(xún)這種相互作用。

b)用于檢測(cè)相互作用的方法是由能否獲得對(duì)靶蛋白的抗體來(lái)決定的；如果抗體得不到，那么就可利用S標(biāo)記的體外翻譯蛋白或靶蛋白用表位做標(biāo)簽。必要時(shí)，可用編碼蛋白的質(zhì)粒轉(zhuǎn)然培養(yǎng)細(xì)胞，以增加分析蛋白質(zhì)的豐度。c)控制質(zhì)量作用（如非特異性聚集）的影響，并確認(rèn)探針蛋白同靶蛋白分子間結(jié)合的特異性是非常重要的。

d)結(jié)合特異性的最好控制是包括一種帶有突變相互作用域的GST融合蛋白，喪

35失與這種突變探針蛋白的結(jié)合就表明靶和探針間的正常結(jié)合是特異性的。e)測(cè)試假定靶蛋白與GST間的結(jié)合也很重要。

3)3

這兩種實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)和實(shí)施都有所不同。

3.GST-pull down必須對(duì)每個(gè)蛋白質(zhì)復(fù)合物的分析進(jìn)行優(yōu)化：

1)發(fā)生相互作用的緩沖液；

2)與融合（探針）蛋白混合的把蛋白的量；所需材料的量主要由把蛋白的豐度和相互作用的親和力決定（實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)兩個(gè)參數(shù)通常是未知的。）3)清洗球珠的條件； 4.4(二)實(shí)驗(yàn)方案 A.材料

1.緩沖液和溶液

1）裂解緩沖液：? 2）50%谷胱甘肽瓊脂糖球珠懸液：在裂解緩沖液中配。（Beads are often supplied by commercial vendors in solutions containing alcohols.It is important to wash the beads thoroughly in GST pull-down lysis buffer and to generate a 50/50 slurry of beads in GST pull-down lysis buffer prior to use.）

3）溶于50mmol/L Tris-Cl(pH 8.0)中的還原型谷胱甘肽（20mmol/L）

（glutathione;γ-L-glutamyl-L-cysteinylglycine, GSH）

4）

2.專(zhuān)用設(shè)備

1)沸水浴

2)翻轉(zhuǎn)樣品旋轉(zhuǎn)儀（有，無(wú)？）3)谷胱甘肽瓊脂糖球珠 3.細(xì)胞和組織 4.附加試劑 B.方法

預(yù)清除細(xì)胞裂解液

1.將細(xì)胞裂解液與50?l的50%谷胱甘肽瓊脂糖球珠懸液和25?g GST在4℃翻轉(zhuǎn)混合孵育2h（實(shí)驗(yàn)室內(nèi)如何實(shí)現(xiàn)？）。需要檢測(cè)相互作用的裂解液的量是高度可變的。開(kāi)始用1×106~1×107個(gè)細(xì)胞的裂解液。（細(xì)胞裂解液提前制備好是否可以？若提前制備好，放于4℃還是-20℃）

a)預(yù)清除步驟主要是從裂解液中除去與GST成分或球珠有非特異性相互作用的蛋白質(zhì)。b)如果相互作用的檢測(cè)主要是用針對(duì)候選相互作用蛋白質(zhì)的抗體，那么做預(yù)清除并不總是必須的。包含兩種對(duì)照很重要：GST加球珠和僅有球珠。

c)在用35S標(biāo)記的細(xì)胞裂解液用于確定新的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用時(shí)，預(yù)清除步驟有助于降低本底。

d)實(shí)驗(yàn)的目的是比較GST與GST融合蛋白，有必要對(duì)每個(gè)反應(yīng)制備足夠量的預(yù)清除細(xì)胞裂解液。（多少算足夠？以蛋白質(zhì)的濃度定？還是靶蛋白的表達(dá)量來(lái)定？）

e)試劑有效的混合是成功的關(guān)鍵，為達(dá)到此目的，反應(yīng)應(yīng)在一個(gè)合理的體積中進(jìn)行：一個(gè)好的起始值是500~1000?l。

2.在微量離心機(jī)上以最大速度在4℃離心混合物2min。（13,000 rpm）3.將上清（就是預(yù)清除的細(xì)胞裂解液）轉(zhuǎn)移到新的離心管中。

探測(cè)細(xì)胞裂解液

4.設(shè)定兩個(gè)含等量預(yù)清除細(xì)胞裂解液及50?l的50%谷胱甘肽瓊脂糖球珠懸液的微量離心管。在一個(gè)管中加約（~5-10 μg）的GST蛋白，另一管中加約（~5-10 μg）的GST融合探針蛋白。將離心管在4℃翻轉(zhuǎn)混合孵育2h。兩個(gè)反應(yīng)中加入的探針和對(duì)照蛋白終濃度應(yīng)該是相同的。（終濃度相同的意義是什么？如果融合蛋白不純化，如何確保其濃度相同？）

5.在微量離心機(jī)上以最大速度離心樣品2min。（13,000 rpm）（谷胱甘肽瓊脂糖球珠的分子量，其連上蛋白后是否可以沉淀下來(lái)？）

6.在新的離心管中收集上清。這些樣品可通過(guò)步驟10中的SDS-PAGE進(jìn)行分析。（進(jìn)行分析的目的：How much of the interacting protein was depleted from the total cell lysate.以?xún)?yōu)化實(shí)驗(yàn)條件）

7.用1ml冰冷的裂解液洗球珠。在微量離心機(jī)上以最大速度離心混合物1min。棄去上清。重復(fù)洗三次。（4次---cold spring harbor protocol）8.（可選）加入50?l 20mmol/L的還原型谷胱甘肽到球珠中，洗脫GST融合蛋白及任何與其結(jié)合的蛋白質(zhì)。在微量離心機(jī)上以最大速度離心2min。（洗脫方法的缺點(diǎn)：若多次洗脫，最后終體積較大，后續(xù)上樣較麻煩。所以多數(shù)研究者選擇將球珠煮沸以使目的蛋白與GST融合蛋白分離。）

9.將球珠（來(lái)自步驟7）或洗脫蛋白質(zhì)（來(lái)自步驟8）與等體積的2×SDS-PAGE上樣緩沖液混合。

檢測(cè)相互作用蛋白質(zhì)

10.將樣品煮沸4min并作SDS-PAGE分析。

11.檢測(cè)與GST融合蛋白結(jié)合的蛋白質(zhì)的方法取決于細(xì)胞裂解液是否被的目的。

5S標(biāo)記以及實(shí)驗(yàn)a)如果目的是檢測(cè)與融合蛋白結(jié)合的所有的35S標(biāo)記的蛋白，就在干膠儀上將膠抽干，并用X線膠片曝光進(jìn)行放射自顯影。

b)如果目的是檢測(cè)特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)，就將蛋白質(zhì)從SDS-PAGE轉(zhuǎn)移到膜上，進(jìn)行免疫印跡分析。

c)如果目的是確定與融合蛋白結(jié)合的蛋白質(zhì)的大小和豐度，而這些蛋白質(zhì)是來(lái)自非放射性的裂解液，就用考馬斯亮藍(lán)或硝酸銀將膠染色。

(三)注意事項(xiàng)

四、通過(guò)免疫共沉淀確定結(jié)合蛋白

(一)`引言(二)實(shí)驗(yàn)方案

A.材料 1.緩沖液和溶液 2.專(zhuān)用設(shè)備 3.細(xì)胞和組織 4.附加試劑

B.方法

(三)注意事項(xiàng)

五、采用GFP和熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)測(cè)定蛋白質(zhì)相互作用

(一)`引言(二)實(shí)驗(yàn)方案

A.材料 5.緩沖液和溶液

6.專(zhuān)用設(shè)備 7.細(xì)胞和組織 8.附加試劑

B.方法

(三)注意事項(xiàng)

六、利用BIAcore通過(guò)表面胞質(zhì)基因共振光譜學(xué)分析相互作用的蛋白質(zhì)

(一)`引言(二)實(shí)驗(yàn)方案(三)注意事項(xiàng)

第三篇：核磁共振方法研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)

核磁共振方法研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)

維特里希教授創(chuàng)建的方法是對(duì)水溶液中的蛋白質(zhì)樣品測(cè)定一系列不同的二維核磁共振圖譜，然后根據(jù)已確定的蛋白質(zhì)分子的一級(jí)結(jié)構(gòu)，通過(guò)對(duì)各種二維核磁共振圖譜的比較和解析，在圖譜上找到各個(gè)序列號(hào)氨基酸上的各種氫原子所對(duì)應(yīng)的峰。有了這些被指認(rèn)的峰，就可以根據(jù)這些峰在核磁共振譜圖上所呈現(xiàn)的相互之間的關(guān)系得到它們所對(duì)應(yīng)的氫原子之間的距離。可以想象，正是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)分子具有空間結(jié)構(gòu)，在序列上相差甚遠(yuǎn)的兩個(gè)氨基酸有可能在空間距離上是很近的，它們所含的氫原子所對(duì)應(yīng)的NMR峰之間就會(huì)有相關(guān)信號(hào)出現(xiàn)。通常，如果兩個(gè)氫原子之間距離小于0.5納米的話，它們之間就會(huì)有相關(guān)信號(hào)出現(xiàn)。一個(gè)由幾十個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)分子可以得到幾百個(gè)甚至幾千個(gè)這樣與距離有關(guān)的信號(hào)，按照信號(hào)的強(qiáng)弱把它們轉(zhuǎn)換成對(duì)應(yīng)的氫原子之間的距離，然后運(yùn)用計(jì)算機(jī)程序根據(jù)所得到的距離條件模擬出該蛋白質(zhì)分子的空間結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)既要滿足從核磁共振圖譜上得到的所有距離條件，還要滿足化學(xué)上有關(guān)原子與原子結(jié)合的一些基本限制條件，如原子間的化學(xué)鍵長(zhǎng)、鍵角和原子半徑等。

從1980年代初維特里希教授發(fā)展出這種方法至今，核磁共振技術(shù)在生物大分子的結(jié)構(gòu)研究方面有了飛速的發(fā)展，一方面是由于儀器技術(shù)本身的發(fā)展，能夠產(chǎn)生的磁場(chǎng)越來(lái)越強(qiáng)；計(jì)算機(jī)的計(jì)算速度也越來(lái)越快，更多地是由于實(shí)驗(yàn)方法上的創(chuàng)新和發(fā)展，由二維的核磁共振實(shí)驗(yàn)發(fā)展成三維甚至更多維的實(shí)驗(yàn)；借助于基因技術(shù)可以得到同位素富集的蛋白質(zhì)樣品,核磁共振的實(shí)驗(yàn)也從原來(lái)單一的核發(fā)展到三種甚至四種核同時(shí)在一個(gè)實(shí)驗(yàn)中共振而產(chǎn)生相關(guān)信號(hào)。核磁共振方法的應(yīng)用范圍也從原來(lái)單一的蛋白質(zhì)分子的空間結(jié)構(gòu)研究發(fā)展到蛋白質(zhì)動(dòng)力學(xué)方面的研究，蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)與核酸以及小分子的相互作用和藥物篩選中蛋白質(zhì)分子與藥物分子的結(jié)合等方面。隨著人類(lèi)基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)研究的不斷深入，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)組學(xué)的研究也會(huì)隨之興起，核磁共振技術(shù)在這方面的應(yīng)用會(huì)更多更廣。這些應(yīng)用的需求反過(guò)來(lái)也會(huì)促進(jìn)核磁共振技術(shù)本身的進(jìn)步和發(fā)展，使之更趨成熟和完善

H-HCOSY是確定質(zhì)子間偶合關(guān)系的有力工具，就這種作用來(lái)說(shuō)，它相當(dāng)于多次質(zhì)子同核自旋去偶實(shí)驗(yàn)，但二者各有長(zhǎng)處。H-HCOSY中的相關(guān)峰（或稱(chēng)交叉峰）主要反映的是2J和3J偶合關(guān)系，偶爾會(huì)出現(xiàn)遠(yuǎn)程相關(guān)峰。

TOCSY（全相關(guān)譜，TOtal Correlation Spectroscopy）

可以找到同一偶合體系中所有氫核的相關(guān)信息，也就是說(shuō)，從某一個(gè)氫核的信號(hào)出發(fā)，能找到與它處在同一個(gè)自旋系統(tǒng)中所有質(zhì)子的相關(guān)峰。這是一種很有用的2DNMR技術(shù)。

COSY通常只能看到相鄰碳的氫的相關(guān)，（有時(shí)稍微遠(yuǎn)一點(diǎn)）。但是TOCSY順著化學(xué)鍵可以看到相隔若干個(gè)碳的氫相關(guān)。因此TOCSY譜圖繁雜得多，不過(guò)也確實(shí)很有用。所需要時(shí)間和COSY差不多。

核磁共振ROESY和NOESY的區(qū)別及 適用范圍

核磁共振ROESY和NOESY的區(qū)別及 適用范圍

答案一： 在1000~3000用ROESY，小于1000大于3000用NOESY。

答案二： ROESY是旋轉(zhuǎn)坐標(biāo)系下的NOESY。小分子的NOE是反相的，大分子是正相的。當(dāng)分子量接近2000時(shí)，NOE趨于0。在旋轉(zhuǎn)坐標(biāo)系下NOE始終為正，故測(cè)2000左右的樣品時(shí)須用ROESY。

答案三：

NOESY：Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy 二維NOE譜

ROESY：Rotating Frame Overhauser Effect Spectroscopy 旋轉(zhuǎn)坐標(biāo)系NOE譜

相同點(diǎn)：

1)都是二維核磁共振實(shí)驗(yàn)(包括同核和異核實(shí)驗(yàn))。同核實(shí)驗(yàn)主要有1H-1H COSY，TOCSY，E.COSY, NOESY，ROESY，relay-NOESY等實(shí)驗(yàn)，主要用于自旋體系(殘基內(nèi)部)的譜峰確認(rèn)，耦合常數(shù)的測(cè)定，順序識(shí)別，以及由NOE交叉峰的強(qiáng)度得出質(zhì)子間距離約束條件。這也是非標(biāo)記樣品所能進(jìn)行的主要實(shí)驗(yàn)。

2)都是檢測(cè) H-H 的空間相關(guān), 距離3.5-5 A，可以考察化合物的立體結(jié)構(gòu);

不同點(diǎn)：

1)分子量在 1000-3000范圍，建議使用 roesy;小于1000和大于3000的化合物宜做NOESY。

2)noesy 是相敏圖, 在對(duì)角峰附近的分辨率較差;

3)roesy 得到的都是吸收譜，因此有相信號(hào)點(diǎn)(交叉峰)距離對(duì)角峰近的可以考慮使用 roesy。

氫原子在分子中的化學(xué)環(huán)境不同,而顯示出不同的吸收峰,峰與峰之間的差距被稱(chēng)作化學(xué)位移；化學(xué)位移的大小,可采用一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化合物為原點(diǎn),測(cè)出峰與原點(diǎn)的距離,就是該峰的化學(xué)位移,現(xiàn)在一般采用(CH3)4Si(四甲基硅烷T(mén)MS)為標(biāo)準(zhǔn)化合物,其化學(xué)位移值為0 ppm.處在不同環(huán)境中的氫原子因產(chǎn)生共振時(shí)吸收電磁波的頻率不同,在圖譜上出現(xiàn)的位置也不同,利用化學(xué)位移,峰面積和積分值以及耦合常數(shù)等信息,進(jìn)而推測(cè)其在碳骨架上的位置.二維核磁共振波譜的基本原理

二維核磁共振譜的出現(xiàn)和發(fā)展，是近代核磁共振波譜學(xué)的最重要的里程碑。極大地方便了核磁共振的譜圖解析。

二維核磁共振譜是有兩個(gè)時(shí)間變量，經(jīng)兩次傅里葉變換得到的兩個(gè)獨(dú)立的頻率變量圖一般把第二個(gè)時(shí)間變量t2表示采樣時(shí)間，第一個(gè)時(shí)間變量t1則是與 t2無(wú)關(guān)的獨(dú)立變量，是脈沖序列中的某一個(gè)變化的時(shí)間間隔。

二維核磁共振譜的特點(diǎn)是將化學(xué)位移、耦合常數(shù)等核磁共振參數(shù)展開(kāi)在二維平面上，這樣在一維譜中重疊在一個(gè)頻率坐標(biāo)軸上的信號(hào)分別在兩個(gè)獨(dú)立的頻率坐標(biāo)軸上展開(kāi)，這樣不僅減少了譜線的擁擠和重疊，而且提供了自旋核之間相互作用的信息。這些對(duì)推斷一維核磁共振譜圖中難以解析的復(fù)雜化合物結(jié)構(gòu)具有重要作用。

劃分區(qū)域

一個(gè)二維核磁共振試驗(yàn)的脈沖序列一般可劃分為下列幾個(gè)區(qū)域：

預(yù)備期(preraration)—演化期 t1(evolution)—混合期tm(mixing)—檢測(cè)期t2(detection)。檢測(cè)期完全對(duì)應(yīng)于一維核磁共振的檢測(cè)期，在對(duì)時(shí)間域t2進(jìn)行Fourier變換后得到F2頻率域的頻率譜。二維核磁共振的關(guān)鍵是引入了第二個(gè)時(shí)間變量演化期 t1。當(dāng)樣品中核自旋被激發(fā)后，它以確定頻率進(jìn)動(dòng)，并且這種進(jìn)動(dòng)將延續(xù)相當(dāng)一段時(shí)間。在這個(gè)意義上講，我們可以把核自旋體系看成有記憶能力的體系，Jeener就是利用這種記憶能力，通過(guò)檢測(cè)期間接演化期中核自旋的行為。

氫的核磁共振譜提供了三類(lèi)極其有用的信息：化學(xué)位移、偶合常數(shù)、積分曲線。應(yīng)用這些信 息，可以推測(cè)質(zhì)子在碳胳上的位置。

根據(jù)前面討論的基本原理，在某一照射頻率下，只能在某一磁感應(yīng)強(qiáng)度下發(fā)生核磁共振。例如：照射頻率為60 MHz，磁感應(yīng)強(qiáng)度是 14.092 Gs(14.092×10^-4 T），100 MHz—23.486

Gs(23.486×10^-4

T），200

MHz—46.973 Gs(46.973×10^-4 T）。600 MHz—140.920 Gs(140.920×10^-4 T）。但實(shí)驗(yàn)證明：當(dāng)1H在分子中所處化學(xué)環(huán)境（化學(xué)環(huán)境是指1H的核外電子以及與1H 鄰近的其它原子核的核外電子的運(yùn)動(dòng)情況）不同時(shí)，即使在相同照射頻率下，也將在不同的共振磁場(chǎng)下顯示吸收峰。下圖是乙酸乙酯的核磁共振圖譜，圖譜表明：乙酸乙酯中的8個(gè)氫，由 于分別處在a，b，c三種不同的化學(xué)環(huán)境中，因此在三個(gè)不同的共振磁場(chǎng)下顯示吸收峰。同種核由于在分子中的化學(xué)環(huán)境不同而在不同共振磁感應(yīng)強(qiáng)度下顯示吸收峰，這稱(chēng)為化學(xué)位移（chemical shift）。化學(xué)位移是怎樣產(chǎn)生的？分子中磁性核不是完全裸露的，質(zhì)子被價(jià)電子包圍著。這些電子 在外界磁場(chǎng)的作用下發(fā)生循環(huán)的流動(dòng)，會(huì)產(chǎn)生一個(gè)感應(yīng)的磁場(chǎng)，感應(yīng)磁場(chǎng)應(yīng)與外界磁場(chǎng)相反（楞次定律），所以，質(zhì)子實(shí)際上感受到的有效磁感應(yīng)強(qiáng)度應(yīng)是外磁場(chǎng)感應(yīng)強(qiáng)度減去感應(yīng)磁場(chǎng)強(qiáng)度。即

B有效=B0(1-σ）=B0-B0σ=B0-B感應(yīng)

外電子對(duì)核產(chǎn)生的這作用稱(chēng)為屏蔽效應(yīng)（shielding effect），也叫抗磁屏蔽效應(yīng)（diamagnetic effect）。稱(chēng)為屏蔽常數(shù)（shielding constant）。與屏蔽較少的質(zhì)子比較，屏蔽多的質(zhì)子對(duì)外磁場(chǎng)感受較少，將在較高的外磁場(chǎng)B0作用下才能發(fā)生共振吸收。由于磁力線是閉合的，因此感應(yīng)磁 場(chǎng)在某些區(qū)域與外磁場(chǎng)的方向一致，處于這些區(qū)域的質(zhì)子實(shí)際上感受到的有效磁場(chǎng)應(yīng)是外磁場(chǎng)B0加上感應(yīng)磁場(chǎng)B感應(yīng)。這種作用稱(chēng)為去屏蔽效應(yīng)（deshielding effect）。也稱(chēng)為順磁去屏蔽效應(yīng)（paramagnetic effect）。受去屏蔽效應(yīng)影響的質(zhì)子在較低外磁場(chǎng)B0作用下就能發(fā)生共振吸收。綜上所述：質(zhì)子發(fā)生核磁共振實(shí)際上應(yīng)滿足：

ν射=γB有效/2π

因在相同頻率電磁輻射波的照射下，不同化學(xué)環(huán)境的質(zhì)子受的屏蔽效應(yīng)各不相同，因此它們發(fā)生 核磁共振所需的外磁場(chǎng)B0也各不相同，即發(fā)生了化學(xué)位移。

對(duì)1H化學(xué)位移產(chǎn)生主要影響的是局部屏蔽效應(yīng)和遠(yuǎn)程屏蔽效應(yīng)。核外成鍵電子的電子云 密度對(duì)該核產(chǎn)生的屏蔽作用稱(chēng)為局部屏蔽效應(yīng)。分子中其它原子和基團(tuán)的核外電子對(duì)所研究的 原子核產(chǎn)生的屏蔽作用稱(chēng)為遠(yuǎn)程屏蔽效應(yīng)。遠(yuǎn)程屏蔽效應(yīng)是各向異性的?；瘜W(xué)位移的差別約為百萬(wàn)分之十，要精確測(cè)定其數(shù)值十分困難。現(xiàn)采用相對(duì)數(shù)值表示法，即選用一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，以該標(biāo)準(zhǔn)物的共振吸收峰所處位置為零點(diǎn)，其它吸收峰的化學(xué)位移值根據(jù)這 些吸收峰的位置與零點(diǎn)的距離來(lái)確定。最常用的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是四甲基硅（CH3)4Si簡(jiǎn)稱(chēng)TMS。選TMS為標(biāo)準(zhǔn)物是因?yàn)椋篢MS中的四個(gè)甲基對(duì)稱(chēng)分布，因此所有氫都處在相 同的化學(xué)環(huán)境中，它們只有一個(gè)銳利的吸收峰。另外，TMS的屏蔽效應(yīng)很高，共振吸收在高場(chǎng)出現(xiàn)，而且吸收峰的位置處在一般有機(jī)物中的質(zhì)子不發(fā)生吸收的區(qū)域內(nèi)。現(xiàn)規(guī)定化學(xué)位移用δ來(lái) 表示，四甲基硅吸收峰的δ值為零，其峰右邊的δ值為負(fù)，左邊的δ值為正。測(cè)定時(shí)，可把標(biāo)準(zhǔn)物與樣品放在一起配成溶液，這稱(chēng)為內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)法。也可將標(biāo)準(zhǔn)物用毛細(xì)管封閉后放人樣品溶液中進(jìn) 行測(cè)定，這稱(chēng)為外標(biāo)準(zhǔn)法。此外，還可以利用溶劑峰來(lái)確定待測(cè)樣品各個(gè)峰的化學(xué)位移。

由于感應(yīng)磁場(chǎng)與外磁場(chǎng)的B0成正比，所以屏蔽作用引起的化學(xué)位移也與外加磁場(chǎng)B0成正 比。在實(shí)際測(cè)定工作中，為了避免因采用不同磁感應(yīng)強(qiáng)度的核磁共振儀而引起化學(xué)位移的變化，δ一般都應(yīng)用相對(duì)值來(lái)表示，其定義為

δ=(ν樣-ν標(biāo))/ν儀×10^6 ④

在式④中，ν樣和ν標(biāo)分別代表樣品和標(biāo)準(zhǔn)化合物的共振頻率，ν儀為操作儀器選用的頻率。多數(shù)有機(jī)物的質(zhì)子信號(hào)發(fā)生在0～10處，零是高場(chǎng)，10是低場(chǎng)。需注意也有一些質(zhì)子的信號(hào)是在小于0的地方出現(xiàn)的。如安扭烯的環(huán)內(nèi)的質(zhì)子，受到其外芳環(huán)磁各向異性的影響，甚至可以達(dá)到-2.99。此外，在不同兆數(shù)的儀器中，化學(xué)位移的值是相同的?；瘜W(xué)位移取決于核外電子云密度，因此影響電子云密度的各種因素都對(duì)化學(xué)位移有影響，影 響最大的是電負(fù)性和各向異性效應(yīng)。

⑴電負(fù)性（誘導(dǎo)效應(yīng)）

電負(fù)性對(duì)化學(xué)位移的影響可概述為：電負(fù)性大的原子（或基團(tuán)）吸電子能力強(qiáng)，1H核附近的吸電子基團(tuán)使質(zhì)子峰向低場(chǎng)移（左移），給電子基閉使質(zhì)子峰向高場(chǎng)移（右移）。這是因?yàn)槲娮踊鶊F(tuán)降低了氫核周?chē)碾娮釉泼芏龋帘涡?yīng)也就隨之降低，所以質(zhì)子的化學(xué)位 移向低場(chǎng)移動(dòng)。給電子基團(tuán)增加了氫核周?chē)碾娮釉泼芏?，屏蔽效?yīng)也就隨之增加，所以質(zhì)子的 化學(xué)位移向高場(chǎng)移動(dòng)。下面是一些實(shí)例。

實(shí)例一： 電負(fù)性 C 2.6 N 3.0 O 3.5 δ C—CH3(0.77～1.88)N—CH3(2.12～3.10)O—CH3(3.24～4.02)實(shí)例二： 電負(fù)性 Cl 3.1 Br 2.9 I 2.6 δ CH3—Cl(3.05)CH2—Cl2(5.30)CH—Cl3(7.27)CH3—Br(2.68)CH3—I(2.16)電負(fù)性對(duì)化學(xué)位移的影響是通過(guò)化學(xué)鍵起作用的，它產(chǎn)生的屏蔽效應(yīng)屬于局部屏蔽效應(yīng)。

⑵各向異性效應(yīng)

當(dāng)分子中某些基團(tuán)的電子云排布不呈球形對(duì)稱(chēng)時(shí)，它對(duì)鄰近的1H核產(chǎn) 生一個(gè)各向異性的磁場(chǎng)，從而使某些空間位置上的核受屏蔽，而另一些空間位置上的核去屏蔽，這一現(xiàn)象稱(chēng)為各向異性效應(yīng)（anisotropic effect）。

除電負(fù)性和各向異性的影響外，氫鍵、溶劑效應(yīng)、van der Waals效應(yīng)也對(duì)化學(xué)位移有影響。氫鍵對(duì)羥基質(zhì)子化學(xué)位移的影響與氫鍵的強(qiáng)弱及氫鍵的電子給予體的性質(zhì)有關(guān)，在大多數(shù)情況 下，氫鍵產(chǎn)生去屏蔽效應(yīng)，使1H的δ值移向低場(chǎng)。有時(shí)同一種樣品使用不同的溶劑也會(huì)使化學(xué)位移值發(fā)生變化，這稱(chēng)為溶劑效應(yīng)?；顫姎涞娜軇┬?yīng)比較明顯。

當(dāng)取代基與共振核之間的距離小于van der Waals半徑時(shí)，取代基周?chē)碾娮釉婆c共振核周?chē)碾娮釉凭突ハ嗯?斥，結(jié)果使共振核周?chē)碾娮釉泼芏冉档?，使質(zhì)子受到的屏蔽效應(yīng)明顯下降，質(zhì)子峰向低場(chǎng)移動(dòng)，這稱(chēng)為van der Waals效應(yīng)。氫鍵的影響、溶劑效應(yīng)、van der Waals效應(yīng)在剖析NMR圖譜時(shí)很有用。

（3）共軛效應(yīng)

苯環(huán)上的氫若被推電子基取代，由于P-π共軛，使苯環(huán)電子云密度增大，質(zhì)子峰向高場(chǎng)位移。而當(dāng)有拉電子取代基則反之。對(duì)于雙鍵等體系也有類(lèi)似的效果。

第四篇：蛋白質(zhì)-配基相互作用的鑒定

10.蛋白質(zhì)－配基相互作用的鑒定

Timothy Palzkill 張曉君、毛躍建、李旻、張晶、趙琴麗、徐靈筠譯；申劍初校；張曉君修校

10.1 前言

基因組測(cè)序計(jì)劃已鑒定了大量的以前未知的基因。然而，甚至對(duì)于已被深入研究的模式生物，如大腸桿菌和釀酒酵母，大約三分之一的基因的功能仍未知。了解基因組中所有基因的功能的挑戰(zhàn)促進(jìn)了高通量實(shí)驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展，并因此推動(dòng)了大規(guī)模描繪蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)以及蛋白質(zhì)－配基的相互作用。

蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用在功能性細(xì)胞內(nèi)扮演著重要的角色。在基因組規(guī)模上確定蛋白質(zhì)的相互作用可建立蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，這種網(wǎng)絡(luò)可為基因產(chǎn)物的功能提供重要的線索。例如，如果一個(gè)未知功能的蛋白可與已知功能的一族蛋白相互作用，說(shuō)明這個(gè)蛋白與它們具有相同的功能（Schwikowski等，2000）。蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用的鑒定可以通過(guò)提供它們與復(fù)合體的結(jié)合模式為生物學(xué)過(guò)程的機(jī)制的了解提供新觀點(diǎn)。例如，即使知道一類(lèi)蛋白參與某個(gè)生物學(xué)過(guò)程，我們也不知道這些蛋白是否或怎樣與復(fù)合體相互作用以實(shí)現(xiàn)它們的功能。蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)作用譜圖提供了蛋白質(zhì)相互作用的詳細(xì)信息因此提供復(fù)合體組織的精確信息。

本章綜述了在基因組規(guī)模上蛋白質(zhì)相互作用的研究方法。包括如酵母雙雜交系統(tǒng)的在體方法和一些體外方法，如質(zhì)譜、噬菌體展示和蛋白芯片等。10.2 開(kāi)放閱讀框的高通量克隆

測(cè)定基因組規(guī)模的蛋白功能的功能基因組研究依賴(lài)于開(kāi)放閱讀框的高效克隆。開(kāi)放閱讀框必須被克隆到可以大規(guī)模表達(dá)或便利地對(duì)編碼蛋白進(jìn)行功能性分析的質(zhì)粒載體。由于所有蛋白不可能在一個(gè)系統(tǒng)中得到一樣好的表達(dá)，對(duì)所感興趣的基因應(yīng)構(gòu)建到多個(gè)蛋白表達(dá)系統(tǒng)。例如，用各種細(xì)菌的啟動(dòng)子測(cè)定可以確定哪個(gè)系統(tǒng)最適合表達(dá)。此外，對(duì)于功能分析，將感興趣的基因插入載體用于噬菌體展示、雙雜交分析或谷胱苷肽S轉(zhuǎn)移酶（GST）融合。如果我們使用傳統(tǒng)的采用限制性?xún)?nèi)切酶和DNA連接酶的克隆技術(shù)，構(gòu)建這樣一套載體所用的時(shí)間和費(fèi)用將是不可想象的。但是，替代的新方法已可以便利地快速克隆PCR產(chǎn)物。10.2.1 λ噬菌體att重組克隆 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 λ噬菌體位點(diǎn)專(zhuān)一重組系統(tǒng)已被用于創(chuàng)建有效的克隆系統(tǒng)。λ噬菌體具有裂解和溶源循環(huán)。在溶源循環(huán)，噬菌體不復(fù)制而將DNA整合到宿主的染色體上（Ptashne，1992）。一旦λ噬菌體感染后，溶源過(guò)程馬上開(kāi)始，λDNA環(huán)化、Int蛋白啟動(dòng)環(huán)狀DNA整合入染色體。Int蛋白催化λ噬菌體結(jié)合位點(diǎn)（aatP）和E.coli結(jié)合位點(diǎn)(aatB)的位點(diǎn)專(zhuān)一的重組。一個(gè)稱(chēng)為整合宿主因子（IHF）的E.coli宿主蛋白對(duì)λDNA的整合也是必需的（Landy,1989）。整合反應(yīng)具有高度的序列專(zhuān)一性，沒(méi)有任何核苷酸的冗余與缺少。這個(gè)位點(diǎn)專(zhuān)一的重組并非同源重組，因?yàn)閍ttB和attP有很大差異。這個(gè)位點(diǎn)有15個(gè)堿基對(duì)的核心序列5＇-GCTTTTTTATACTAA。由于同源的區(qū)域很小，在沒(méi)有Int蛋白時(shí)重組無(wú)法進(jìn)行。attB和attP 重組后的位點(diǎn)稱(chēng)為attL和attR（圖10.1）(Landy,1989).λ噬菌體DNA 保持為前噬菌體狀態(tài)直到宿主細(xì)胞被損壞（Ptashne，1992）。DNA損傷引發(fā)λint和xis基因的表達(dá)。Int和Xis表達(dá)產(chǎn)物催化細(xì)菌染色體上λDNA的剪切。在aatL和aatR位點(diǎn)的剪切產(chǎn)生aatB和aatP位點(diǎn)。剪切反應(yīng)并非整合反應(yīng)的簡(jiǎn)單的逆向反應(yīng)，除了Int和IHF蛋白還需要Xis蛋白（Landy，1989）。所以，利用適當(dāng)?shù)闹亟M蛋白可以控制重組反應(yīng)的方向。

λ重組克隆系統(tǒng)方法就是將兩端帶有att重組位點(diǎn)的DNA和載體與整合蛋白一起保溫使DNA片段插入載體（Hartley等，2000）。這個(gè)系統(tǒng)被稱(chēng)為重組克隆(RC)（Hartley等，2000）。此系統(tǒng)可被用于直接將PCR片段克隆到載體而無(wú)需DNA連接酶。插入PCR片段的反應(yīng)是attB＋attP>attL＋attR，與λ噬菌體插入相似也是被另加的Int和IHF蛋白催化。反應(yīng)底物是帶有attB位點(diǎn)的PCR片段和兩端帶有attP的選擇性標(biāo)記的質(zhì)粒（圖10.1）。與λ噬菌體插入不同的是，此反應(yīng)用了兩個(gè)attB 和兩個(gè)attP，此外，att位點(diǎn)被突變使attB1只能與attP1而非attP2重組。att位點(diǎn)的改造使得PCR片段可以直接克隆到載體（圖10.1）(Hartley等，2000)。

以RC法克隆PCR片段的最后結(jié)果是載體帶有兩端含attL位點(diǎn)的標(biāo)記基因。此質(zhì)粒被稱(chēng)為起始克隆(Entry clone)，因?yàn)樗梢酝ㄟ^(guò)重組反應(yīng)來(lái)產(chǎn)生各種功能載體（Hartley等，2000）。用于載體轉(zhuǎn)換的反應(yīng)是attL+attR>attB+attP, 類(lèi)似于λ噬菌體被Int、Xis和IHF蛋白剪切（Landy，1989）。通過(guò)對(duì)兩種載體和Int、Xis及IHF蛋白的共同溫育，起始克隆的基因被轉(zhuǎn)到帶轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子和蛋白標(biāo)簽的60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 目的載體。該反應(yīng)不同于λDNA從染色體的切除，因?yàn)槠鹗伎寺蓚€(gè)attL位點(diǎn)且目的載體帶兩個(gè)attR位點(diǎn)（Hartley等，2000）。att位點(diǎn)被突變以保證只在attL1和attR1 及attL2與attR2之間發(fā)生重組。重組反應(yīng)通過(guò)形成一個(gè)復(fù)合體來(lái)進(jìn)行，而且最終將形成一個(gè)帶有感興趣的基因及啟動(dòng)子和標(biāo)簽序列的目的載體圖10.1)。

RC 系統(tǒng)最近被用于幾個(gè)大規(guī)模克隆工程。例如，從Caenorhabditis elegans中克隆基因以酵母雙雜交系統(tǒng)構(gòu)建用于蛋白質(zhì)表達(dá)和分析蛋白質(zhì)相互作用的載體（walhout等，2000）。到最近為止已用此系統(tǒng)克隆了超過(guò)12000個(gè)C.elegans的基因（Reboul等，2003）。此外，大于100個(gè)人cDNA已用此法克隆創(chuàng)建了一套起始克隆。這些克隆以適合的載體轉(zhuǎn)為GFP融合載體，測(cè)定了這些cDNA表達(dá)的蛋白的細(xì)胞定位（Simpson等，2000）。10.2.2 拓?fù)洚悩?gòu)酶法克隆

痘病毒拓?fù)洚悩?gòu)酶I載體

另一條避免DNA連接酶的克隆途徑是拓?fù)洚悩?gòu)酶介導(dǎo)的克隆。此法利用痘病毒DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I以很高的序列專(zhuān)一性切斷和連接DNA鏈（Shuman，1992a,b）。反應(yīng)時(shí)，酶識(shí)別5’-CCCTT序列并在末尾的T切開(kāi)，在斷開(kāi)鏈的3’磷酸基團(tuán)與酶分子的酪氨酸殘基之間形成共價(jià)鍵（圖10.2）。共價(jià)復(fù)合物可以與帶5’羧基并與復(fù)合物的尾部互補(bǔ)的異源受體DNA形成重組分子（Shuman，1994）。

拓?fù)洚悩?gòu)酶I克隆利用上述的反應(yīng)將DNA片段連接到帶5’羧基并可與拓?fù)洚悩?gòu)酶共價(jià)結(jié)合的受體質(zhì)粒。反應(yīng)只在有自由的5’羧基的DNA存在時(shí)才會(huì)發(fā)生，這很有利于克隆PCR產(chǎn)物，因?yàn)楫?dāng)用不帶5’磷酸的引物擴(kuò)增的產(chǎn)物都不帶5’磷酸基團(tuán)（Shuman，1994）。最近這個(gè)方法被用于從釀酒酵母克隆了6035個(gè)開(kāi)放讀碼框到一個(gè)酵母蛋白表達(dá)質(zhì)粒和一個(gè)哺乳動(dòng)物表達(dá)載體（Heyman等，1999）。原始的拓?fù)洚悩?gòu)酶克隆方法的缺點(diǎn)是PCR產(chǎn)物可以任意方向插入?？寺∠到y(tǒng)最近被改進(jìn)可以對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行定向克隆（圖10.2）。該系統(tǒng)僅需要在設(shè)計(jì)引物時(shí)在引物的5’末端加入5’CACC。5’CACC序列與質(zhì)粒－拓?fù)洚悩?gòu)酶復(fù)合體的5’端互補(bǔ)，由此控制PCR產(chǎn)物的插入方向（圖10.2）。此系統(tǒng)被用于從梅毒病源Treponema pallidum的基因組克隆了99％的開(kāi)放讀碼框（McKevitt等，2003）。拓?fù)洚悩?gòu)酶I克隆方法提高了克隆的效率，可以將大量的開(kāi)放讀碼框插入到質(zhì)粒89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 載體。

10.2.3 酵母的在體重組克隆

通過(guò)轉(zhuǎn)化克隆

上述的λ重組克隆系統(tǒng)利用體外重組然后轉(zhuǎn)化到E.coli細(xì)胞。替代的體內(nèi)方法利用酵母高效的同源重組機(jī)制克隆了大于99％的釀酒酵母基因（～6000）（Uetz等，2000）。這用兩步PCR完成，首先，一套大約6000個(gè)引物對(duì)從釀酒酵母中擴(kuò)增它的開(kāi)放讀碼框,每個(gè)正向引物有特定開(kāi)放讀碼框的序列和5’端22堿基的所有引物相同的序列，反向引物有特定開(kāi)放讀碼框序列和20堿基的共有序列（圖10.3）。6000個(gè)開(kāi)放讀碼框隨后被分別擴(kuò)增得到一套PCR產(chǎn)物。第二套PCR反應(yīng)引物以第一套PCR所用引物中的共有序列為基礎(chǔ)。正向引物取22堿基共有序列，反向引物取20堿基共有序列，另外還帶有50堿基與作為受體質(zhì)粒的酵母載體克隆位點(diǎn)兩側(cè)的序列同源的序列（Hudson等，1997；Uetz等，2000）。PCR產(chǎn)物將在兩端各帶有70堿基的序列，它們與受體載體的克隆位點(diǎn)兩側(cè)的70堿基同源。

每個(gè)PCR產(chǎn)物與被限制性?xún)?nèi)切酶在克隆位點(diǎn)切開(kāi)而線性化的受體載體一起轉(zhuǎn)化到酵母（圖10.3）。在PCR產(chǎn)物的兩端70堿基的同源序列足以使酵母的同源重組系統(tǒng)將PCR插入到載體中（Hudson等，1997；Ma等1987）。10.2.4 重組克隆系統(tǒng)的優(yōu)缺點(diǎn)

每個(gè)重組克隆方法都是將PCR產(chǎn)物克隆入期望的載體序列的有效手段。拓?fù)洚悩?gòu)酶克隆的主要優(yōu)點(diǎn)是對(duì)擴(kuò)增每個(gè)ORF所用的引物的5’端所需要的額外序列最小。只需要在正向引物5’端加四個(gè)堿基即可有效地進(jìn)行定向克隆，而不需在反向引物添加額外核苷酸。但以λ重組克隆系統(tǒng)克隆PCR產(chǎn)物卻需要在正向和反向引物都加25個(gè)額外的核苷酸（Hartley等，2000）。

以酵母重組克隆PCR產(chǎn)物的主要優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)單易行。但是由于需要在PCR產(chǎn)物的兩端帶有至少50bp的與載體的序列同源的序列，因此需要進(jìn)行兩輪的PCR反應(yīng)。多輪PCR反應(yīng)會(huì)增加PCR產(chǎn)物的序列發(fā)生突變的可能性。此外，第一輪PCR反應(yīng)的引物在每個(gè)ORF之外又額外增加了20到22個(gè)堿基序列，這將會(huì)增加引物合成的成本。

總之，重組的克隆方法極大地便利了大量的開(kāi)放讀碼框的高通量克隆。而這又使下面討論的功能基因組實(shí)驗(yàn)變得可行。118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 10.3 酵母雙雜交選擇系統(tǒng)

酵母雙雜交系統(tǒng)是研究蛋白質(zhì)相互作用的有力工具。它是基于位點(diǎn)專(zhuān)一的轉(zhuǎn)錄激活子的模塊特性（Fields和Song，1989）。雜交蛋白由蛋白X 與DNA結(jié)合域的融合及蛋白Y與轉(zhuǎn)錄激活域的融合組成。如果蛋白X和蛋白Y發(fā)生相互作用，將會(huì)重建轉(zhuǎn)錄因子并導(dǎo)致報(bào)告基因的表達(dá)（圖10.4）。DNA結(jié)合域常被稱(chēng)為“誘餌”，而激活域被稱(chēng)為“陷阱”。

數(shù)個(gè)不同版本的雙雜交系統(tǒng)被廣泛地使用。大多使用DNA結(jié)合域與Gal4轉(zhuǎn)錄因子的融合。另一個(gè)版本利用將E.coli LexA的DNA結(jié)合域融合到感興趣的蛋白的氨基端來(lái)創(chuàng)建‘陷阱’。這個(gè)系統(tǒng)需要在報(bào)告基因的上游設(shè)置一個(gè)LexA結(jié)合位點(diǎn)。陷阱由Gal4激活域或另外的酸性激活域組成，如E.coli序列的B42。這個(gè)陷阱可以與Gal4或LexA的DNA結(jié)合域“誘餌”搭配（Brent和Finley，1997）。各種誘餌的常用的報(bào)告基因是E.coli的lacZ基因，它編碼半乳糖苷酶。Gal4或LexA的結(jié)合位點(diǎn)設(shè)置于lacZ基因的上游。蛋白的相互作用以激活域與DNA結(jié)合域共同激活lacZ基因的轉(zhuǎn)錄進(jìn)行檢測(cè)（Fields和Song，1989）?；蚣せ羁赏ㄟ^(guò)β半乳糖苷酶的產(chǎn)物使克隆在X－Gal平板上顯藍(lán)色來(lái)檢測(cè)。

使用雙雜交系統(tǒng)的難點(diǎn)在于消除假陽(yáng)性。假陽(yáng)性克隆來(lái)自于誘餌和陷阱蛋白的非專(zhuān)一的結(jié)合所導(dǎo)致的報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄的激活。例如，任何誘餌蛋白的自我激活轉(zhuǎn)錄就會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性。但自我激活轉(zhuǎn)錄可以通過(guò)用構(gòu)建的誘餌克隆篩選報(bào)告基因的激活而消除。某些報(bào)告系統(tǒng)具有很高的假陽(yáng)性背景（James等，1996）。為克服這些問(wèn)題，新版的雙雜交系統(tǒng)使用多個(gè)表型的報(bào)告基因檢測(cè)基因的激活。在一個(gè)新的版本中，使用了HIS3、ADE2和lacZ為報(bào)告基因（James等，1996）。此外，此系統(tǒng)利用不同的Gal4啟動(dòng)子，使HIS3處于Gal1的啟動(dòng)子的控制之下，ADE2處于Gal2啟動(dòng)子控制，LacZ處于Gal7啟動(dòng)子控制。蛋白質(zhì)相互作用以酵母在缺乏組氨酸的平板上的生長(zhǎng)來(lái)鑒定。假陽(yáng)性通過(guò)用克隆顏色篩選來(lái)評(píng)定腺嘌呤和lacZ標(biāo)記來(lái)消除（James等，1996）。使用受不同啟動(dòng)子控制的多報(bào)告基因可以提供高靈敏度和低假陽(yáng)性背景值（Brent和Finley，1997;James等，1996）。雙雜交法最流行的用途就是從與LexA和Gal4的融合誘餌作用的激活域文庫(kù)中分離新蛋白。激活域文庫(kù)可由從插在激活域C末端的cDNA或基因組DNA片段組成。新的相互作用蛋白通過(guò)將激活域文庫(kù)引入含有融合到DNA結(jié)合域的感興147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 趣的蛋白的酵母株中并以上述的報(bào)告系統(tǒng)分離克隆來(lái)進(jìn)行鑒定（Bai和Elledge，1997）。許多實(shí)驗(yàn)室使用了此方法并鑒定了很多新的相互作用蛋白（Schwikowski等，2000）。

10.3.1 酵母中基因組范圍的蛋白質(zhì)相互作用分析

高通量酵母雙雜交篩選

釀酒酵母全基因組序列的公布推動(dòng)了在基因組范圍用雙雜交方法和從所有酵母ORF擴(kuò)增克隆的基因來(lái)繪制蛋白質(zhì)相互作用譜（Hudson等，1997;Uetz等，2000）。已大規(guī)模實(shí)施了兩類(lèi)雙雜交實(shí)驗(yàn)。用芯片法，融合到Gal4的DNA結(jié)合域或激活域的每個(gè)ORF被排列到芯片上，與其作用的反向融合分別以芯片進(jìn)行篩選以鑒定相互作用克隆。而復(fù)雜的文庫(kù)篩選方法用一套克隆的ORF創(chuàng)建融合文庫(kù)，每個(gè)ORF融合與文庫(kù)雜交來(lái)鑒定相互作用克隆。

在第一個(gè)大規(guī)模芯片實(shí)驗(yàn)中，一套大約6000個(gè)基因分別被克隆融合到GAL4激活域（Hudson等，1997）并轉(zhuǎn)化入雙雜交報(bào)告株。每個(gè)菌株分別接入384孔板的一個(gè)孔內(nèi)，16個(gè)這種板裝有大約6000株克隆并組成了一個(gè)活的蛋白矩陣（Uetz等，2000）。一套192個(gè)酵母基因分別被融合到Gal4 DNA結(jié)合域并轉(zhuǎn)化到相反雜交型的報(bào)告株，以此作為激活域克隆系列。192個(gè)誘餌株的每一個(gè)與約6000個(gè)陷阱株分別在芯片上進(jìn)行交配以系統(tǒng)地篩選蛋白質(zhì)相互作用（Uetz等，2000）（圖10.5）。發(fā)現(xiàn)192個(gè)DNA結(jié)合域融合中有87個(gè)參與了蛋白質(zhì)相互作用，一共有281個(gè)作用對(duì)。

最早實(shí)施的復(fù)雜文庫(kù)篩選將6000個(gè)克隆的Gal4激活域融合分別地收集入單個(gè)的池（pool）（Uetz等，2000）。然后6000個(gè)酵母基因分別融合入Gal4 DNA 結(jié)合域。成組的激活域融合與6000個(gè)Gal4 DNA 結(jié)合蛋白融合分別進(jìn)行雜交（圖10.5）?？赡艿南嗷プ饔靡詧?bào)告基因鑒定，12個(gè)產(chǎn)生相互作用的克隆測(cè)定了序列以對(duì)激活域融合進(jìn)行鑒定。在692個(gè)蛋白質(zhì)相互作用對(duì)中共發(fā)現(xiàn)817個(gè)ORF參與（Uetz等，2000）。有趣的是，192個(gè)蛋白中的45％在蛋白芯片實(shí)驗(yàn)中發(fā)生相互作用，而5345個(gè)可能的ORF中只有8％在用6000個(gè)陷阱高通量篩選時(shí)發(fā)現(xiàn)了相互作用。因此，盡管芯片篩選為低通量，它可產(chǎn)生相對(duì)更多的相互作用子。這可能是由于在高通量實(shí)驗(yàn)當(dāng)中，把所有的激活域克隆都用于篩選相互作用時(shí)，其中也包括了生長(zhǎng)遲緩和交配能力降低的細(xì)胞（Uetz等，2000）。結(jié)果表明，兩176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 種方法篩選鑒定得到的相互作用系列有所不同，具有方法上的差異性。Ito和他的同事（2001）提出一個(gè)高通量復(fù)雜文庫(kù)篩選方法。構(gòu)建了酵母6000個(gè)ORF的DNA結(jié)合域融合和激活域融合（圖10.6）。DNA結(jié)合域和激活域融合轉(zhuǎn)化到相反交配型的酵母受體株并組成62套每套96個(gè)ORF的融合。為測(cè)定可能的相互作用，在DNA激活域和結(jié)合域間實(shí)施了3844個(gè)（62×62）交配反應(yīng)。交配后，包含相互作用的蛋白的二倍體以多個(gè)報(bào)告基因進(jìn)行篩選。PCR擴(kuò)增DNA結(jié)合域與激活域融合的插入片段，測(cè)序后鑒定相互作用的克隆。結(jié)果總共發(fā)現(xiàn)了3268個(gè)酵母蛋白參與了4549對(duì)相互作用（Ito等，2001）。當(dāng)作者只考慮那些至少出現(xiàn)三次的相互作用時(shí)，構(gòu)成一個(gè)由797個(gè)蛋白和806對(duì)相互作用對(duì)的核心群組（Ito等，2001）。

對(duì)上述的高通量文庫(kù)篩選法鑒定的相互作用的比較顯示驚人的少的重復(fù)。只有大約20％的相互作用是相同的（Ito等，2001；Uetz等，2000）。缺乏重復(fù)說(shuō)明文庫(kù)的篩選實(shí)驗(yàn)方法還不成熟。所選擇的克隆組不能發(fā)現(xiàn)高比例的潛在的相互作用，這并不奇怪。要篩選所有可能的ORF間的相互作用需要測(cè)試6000×6000=36×107對(duì)組合。即使我們已知很多蛋白具有多個(gè)相互作用，實(shí)際的相互作用的數(shù)目可能還要遠(yuǎn)大于此。

計(jì)算機(jī)輔助的雙雜交篩選

僅通過(guò)鑒定盤(pán)繞的蛋白線團(tuán)介導(dǎo)的相互作用的計(jì)算機(jī)輔助篩選進(jìn)一步證明酵母基因組雙雜交篩選低估了總的相互作用（Newman等，2000）。盤(pán)繞的線團(tuán)是一種由兩個(gè)或更多α螺旋相互盤(pán)繞組成的蛋白質(zhì)相互作用（Cohen和Parry，1994）?？梢孕纬蔁o(wú)規(guī)線團(tuán)的序列以簡(jiǎn)單的重復(fù)模式為特征，由此設(shè)計(jì)了可以通過(guò)蛋白序列的一級(jí)結(jié)構(gòu)鑒定無(wú)規(guī)線團(tuán)的電腦程序（Berger等，1995；Wolf等，1997）。以這些程序在酵母ORF中鑒定無(wú)規(guī)線團(tuán)，發(fā)現(xiàn)基因組編碼的大約300個(gè)蛋白為兩條鏈的無(wú)規(guī)線團(tuán)，另250個(gè)蛋白有三條鏈的無(wú)規(guī)線團(tuán)（Newman等，2000）。也即大約每11個(gè)酵母蛋白中有一個(gè)就有無(wú)規(guī)線團(tuán)。Newman和他同事（2000）用雙雜交系統(tǒng)檢查了162個(gè)預(yù)測(cè)的無(wú)規(guī)線團(tuán)區(qū)之間的相互作用?？偣?6×16＝26244對(duì)測(cè)試鑒定出來(lái)自77個(gè)不同蛋白的213對(duì)相互作用，其中100對(duì)為無(wú)規(guī)線團(tuán)。

奇怪的是用無(wú)規(guī)線團(tuán)方法鑒定的相互作用無(wú)一可用前述的雙雜交實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)。此結(jié)果說(shuō)明雙雜交篩選存在很高的假陽(yáng)性。這個(gè)結(jié)果與前述的結(jié)果相似，當(dāng)用激活域205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 文庫(kù)克隆進(jìn)行配對(duì)雙雜交篩選實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)相互作用的頻率很高（Uetz等，2000）。除配對(duì)篩選外，由于只有酵母蛋白的無(wú)規(guī)線團(tuán)區(qū)被用于篩選，無(wú)規(guī)線團(tuán)實(shí)驗(yàn)可能也鑒定出更多的相互作用子。雙雜交實(shí)驗(yàn)使用全長(zhǎng)蛋白可能掩蓋一些只有用蛋白質(zhì)片段才能發(fā)現(xiàn)的相互作用子。例如，全長(zhǎng)蛋白可能包含被遮蔽的相互作用位點(diǎn)，只有當(dāng)發(fā)生構(gòu)象變化時(shí)才可以暴露出來(lái)（Hu，2000）?？傊?，實(shí)驗(yàn)表明只用雙雜交測(cè)定的酵母相互作用子是被低估了的。而計(jì)算機(jī)輔助篩選，如無(wú)規(guī)線團(tuán)篩選可能提供文庫(kù)篩選得不到的信息。

酵母蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)

將雙雜交方法在基因組規(guī)模測(cè)定的酵母蛋白質(zhì)相互作用的分析結(jié)果與生物化學(xué)方法測(cè)定的相互作用結(jié)合起來(lái)可顯示出整個(gè)蛋白組的更復(fù)雜的相互作用譜。Schwikowki及其同事（2000）分析了2709個(gè)已發(fā)表且可在公共數(shù)據(jù)庫(kù)和大規(guī)模雙雜交實(shí)驗(yàn)中獲得的相互作用，其中包括2039個(gè)酵母蛋白。他們發(fā)現(xiàn)了一個(gè)包括1548個(gè)蛋白構(gòu)成的2358對(duì)相互作用的大網(wǎng)絡(luò)及幾個(gè)小網(wǎng)絡(luò)（Schwikowki等，2000）。

相互作用蛋白網(wǎng)絡(luò)有很多有趣的特性。首先，相似功能的蛋白在網(wǎng)絡(luò)內(nèi)趨于聚為簇。例如，89％的已注釋為染色質(zhì)相關(guān)的蛋白都定位在染色質(zhì)相關(guān)的蛋白簇內(nèi)（Schwikowki等，2000）。總計(jì)63％的相互作用發(fā)生在一般常用功能蛋白之間。其次，一般亞細(xì)胞定位的蛋白在網(wǎng)絡(luò)內(nèi)趨于聚為簇（Schwikowki等，2000）。第三，相互作用網(wǎng)絡(luò)揭示一些相互作用與細(xì)胞過(guò)程關(guān)聯(lián)，這揭示了細(xì)胞組件之間的互作。例如，細(xì)胞周期控制蛋白展示了大部分的細(xì)胞過(guò)程之間的相互連接。測(cè)定了細(xì)胞周期控制簇的蛋白、有絲分裂相關(guān)蛋白、蛋白降解、交配反應(yīng)、DNA合成、轉(zhuǎn)錄、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及其它過(guò)程相關(guān)的蛋白的相互作用（Schwikowki等，2000）。這些相互聯(lián)系反應(yīng)了細(xì)胞周期控制蛋白在調(diào)節(jié)細(xì)胞其它過(guò)程中的作用。最后，網(wǎng)絡(luò)還提供了一些未知功能的蛋白質(zhì)的信息。網(wǎng)絡(luò)方法進(jìn)行功能預(yù)測(cè)，如鑒定未知蛋白的相互作用伙伴的最一般功能、假定感興趣的蛋白具有相同或相關(guān)的功能（Mayer和Hieter，2000;Schwikowki等，2000）。確定相互作用伙伴的蛋白功能的限制性因素是缺少基因組內(nèi)蛋白功能的知識(shí)。例如，Schwikowki及其同事（2000）發(fā)現(xiàn)的大網(wǎng)絡(luò)中未知功能的554個(gè)蛋白中只有69個(gè)有2或多個(gè)已知功能的伙伴。當(dāng)對(duì)某機(jī)體的蛋白質(zhì)功能的認(rèn)識(shí)提高后，可以從相互作用網(wǎng)絡(luò)分析得到的蛋白功能將會(huì)隨之增加。234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258 259 260 261 262 蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)的組織

酵母蛋白質(zhì)相互作用的大網(wǎng)絡(luò)的組織已有詳細(xì)的研究(Jeong等,2001;Maslov and Sneppen,2002)。已分析的網(wǎng)絡(luò)由大于1500個(gè)蛋白組成并由大于2000個(gè)相互作用聯(lián)結(jié)在一起。這些研究的一個(gè)目的是測(cè)定網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)是否可由一致指數(shù)拓?fù)鋵W(xué)(Uniform exponential topology)(即所有蛋白都與其它蛋白具有相同數(shù)目的連接)或異質(zhì)無(wú)標(biāo)度拓?fù)鋵W(xué)(蛋白質(zhì)連接顯示出極大的差異)來(lái)描述。相互作用的可能性的分析表明了一個(gè)高度異源的無(wú)極網(wǎng)絡(luò)，少數(shù)高度連接的蛋白在介導(dǎo)大量的低連接蛋白間的相互作用中發(fā)揮重要的作用（Jeong等，2001）。這種網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)正如其它復(fù)雜的系統(tǒng)（如互聯(lián)網(wǎng)和代謝網(wǎng)絡(luò)）一樣，都遵循能量分布規(guī)律（Barabasi和Albert，1999；Jeong等，2000）。蛋白網(wǎng)絡(luò)的另一個(gè)特性是高度連接的蛋白主要都與低連接性的蛋白連接在一起（Maslov和Sneppen，2002）。這種組織方式降低了細(xì)胞不同功能模塊間的相互對(duì)話的可能性，而通過(guò)定位有害突變的效應(yīng)增加了網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)固性（Maslov和Sneppen，2002）。

網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)表明它們可以允許隨機(jī)的突變，因?yàn)榇蟛糠值膫梢园l(fā)生在與其它蛋白沒(méi)有太多聯(lián)系的蛋白上（Jeong等，2001）。然而，位于節(jié)點(diǎn)的高連接蛋白一旦突變這個(gè)網(wǎng)絡(luò)將異常脆弱。此想法通過(guò)用根據(jù)所有相互作用蛋白所具有的連接數(shù)確定的級(jí)別，并將它們的級(jí)別與從基因組刪除相應(yīng)基因的表型效應(yīng)進(jìn)行關(guān)聯(lián)（Jeong等，2001）。從系統(tǒng)的酵母基因刪除實(shí)驗(yàn)獲得的大規(guī)模數(shù)據(jù)表明了它們的相關(guān)性（Ross-Macdonald 等，1999；Winzeler等，1999）。實(shí)驗(yàn)表明蛋白質(zhì)去除對(duì)細(xì)胞的致死的可能性是與該蛋白具有的連接數(shù)相關(guān)的（Jeong等，2001）。例如，93％的酵母蛋白是具有5個(gè)或更少相互作用的蛋白質(zhì)，我們有它們的基因去除數(shù)據(jù)，只有21％的蛋白是必需的。相反，只有0.7%的酵母蛋白具有15個(gè)以上的連接，但其中62％的蛋白的去除對(duì)細(xì)胞是致死的（Jeong等，2001）。因此，在網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中高連接的蛋白比連接較少的蛋白更為關(guān)鍵。10.3.2 對(duì)其他生物基因組范圍的酵母雙雜交分析

病毒系統(tǒng)中蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用的雙雜交分析

已經(jīng)利用病毒、細(xì)菌和動(dòng)物基因組的ORFs（開(kāi)放閱讀框）對(duì)雙雜交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了全面、廣泛的演示（Bartel et al.，1996；McCraith et al.，2000；Rain et al.，2001；Walhout et al.，2000）。在病毒系統(tǒng)中，T7噬菌體和牛痘病毒的基因組已經(jīng)被檢測(cè)過(guò)了。使用病毒基因組263 264 265 266 267 268 269 270 271 272 273 274 275 276 277 278 279 280 281 282 283 284 285 286 287 288 289 290 291 的好處是可以系統(tǒng)的檢測(cè)所有可能的兩兩相互作用。例如，一組266個(gè)來(lái)自牛痘病毒的潛在ORFs與Gal4的激活區(qū)域及DNA結(jié)合區(qū)域分別融合后進(jìn)行了克?。∕cCraith et al.，2000）。利用每個(gè)與DNA結(jié)合區(qū)域的相連的融合子與由266個(gè)與激活區(qū)域相連的融合子芯片進(jìn)行配對(duì)，來(lái)檢驗(yàn)蛋白間70756種兩兩結(jié)合的所有可能。總共只檢測(cè)到37個(gè)蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)的相互作用，其中有28個(gè)是以前所未知的（McCraith et al.，2000）。正如McCraith及他的同事所指出的那樣，這些作用可能只是病毒感染過(guò)程中的一小部分。這種低數(shù)量的相互作用的一個(gè)理由可能是大量的牛痘蛋白都是膜相關(guān)蛋白。這些蛋白質(zhì)都是以全長(zhǎng)的ORFs表達(dá)的，因此不可能到達(dá)酵母的核中來(lái)參與雙雜交作用（McCraith et al.，2000）。全長(zhǎng)ORFs的表達(dá)可能也屏蔽了某些特定的作用，導(dǎo)致了高幾率的假陰性反應(yīng)（Hu，2000）。從這些實(shí)驗(yàn)中獲得的重要信息是即使一個(gè)膜上所有的蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)兩兩相互結(jié)合已經(jīng)飽和，僅使用雙雜交篩選很難把其中很大比例的相互作用檢測(cè)出來(lái)。細(xì)菌中蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用的雙雜交分析

幽門(mén)螺桿菌的基因組的大小為2Mb，它編碼了1742個(gè)ORFs。用這些ORFs進(jìn)行雙雜交獲得的文庫(kù)和上面所說(shuō)的酵母實(shí)驗(yàn)不同，在那個(gè)實(shí)驗(yàn)中所使用的GAL4激活區(qū)域文庫(kù)包含超過(guò)1千萬(wàn)個(gè)隨機(jī)的基因組片斷（Rain et al.,2001）。因此，降低了全長(zhǎng)的ORFs屏蔽蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)作用的潛在問(wèn)題?？偣灿昧?61個(gè)ORFs來(lái)和GAL4的DNA結(jié)合區(qū)域進(jìn)行融合來(lái)作為餌。這些ORFs的選擇都避開(kāi)那些無(wú)法進(jìn)入酵母核內(nèi)的疏水性蛋白（Rain et al.,2001）。261個(gè)含DNA結(jié)合區(qū)域的融合子激活結(jié)構(gòu)域的文庫(kù)進(jìn)行配對(duì)來(lái)檢測(cè)蛋白間的相互作用?？偣茶b定了1200個(gè)相互作用，將近是基因組的50％。這個(gè)方法似乎可以非常有效的防止ORF配對(duì)篩選中出現(xiàn)的問(wèn)題。另外，從激活結(jié)構(gòu)域文庫(kù)中檢測(cè)到的反應(yīng)子中的片斷序列的數(shù)據(jù)積累起來(lái)了。片斷的配對(duì)使得我們可以定位蛋白質(zhì)的作用區(qū)域（Rain et al.,2001）。

線蟲(chóng)中蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用的雙雜交分析

相對(duì)于病毒和細(xì)菌系統(tǒng)，線蟲(chóng)的基因組比較大，大概編碼了20000個(gè)預(yù)測(cè)的ORFs。這些所有的ORFs的兩兩配對(duì)需要4×108次匹配，這在目前的技術(shù)條件下是不可行的。然而，已做過(guò)一個(gè)直接的檢測(cè)，使用了27個(gè)已知的參與vulval發(fā)展過(guò)程的蛋白質(zhì)與GAL4的DNA結(jié)合域融合，線蟲(chóng)的cDNA文庫(kù)與GAL4 的292 293 294 295 296 297 298 299 300 301 302 303 304 305 306 307 308 309 310 311 312 313 314 315 316 317 318 319 320 激活域融合（Walhout et al.,2000）。這個(gè)雙雜交鑒定了包含124個(gè)不同蛋白的148個(gè)相互作用。為了測(cè)定已鑒定的相互作用的生物學(xué)關(guān)系，作者從其他生物中搜尋同源蛋白中的保守相互作用。這樣的保守相互作用用interlogs標(biāo)記，這代表了一種增加相互作用有效性和可信度的新方法。另外，Walhout和他的同事還用了一個(gè)系統(tǒng)的聚類(lèi)分析來(lái)搜尋形成閉合環(huán)的網(wǎng)狀的相互作用，說(shuō)明在這個(gè)環(huán)中的ORFs在生物學(xué)重要相互作用中有更高的相似性（Walhout et al.,2000）。

從來(lái)自幾個(gè)生物的大量的數(shù)據(jù)可以明顯的看出雙雜交是一種高效自動(dòng)的、也是高通量的在基因組范圍內(nèi)檢測(cè)蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用的有效的方法。然而，高比例的假陽(yáng)性和假陰性也始終難以避免。事實(shí)上，以功能無(wú)關(guān)的蛋白和來(lái)自細(xì)胞不同部分的蛋白的關(guān)聯(lián)頻率來(lái)評(píng)估，估計(jì)目前所有的高通量的相互作用預(yù)測(cè)方法的預(yù)測(cè)結(jié)果都有超過(guò)一半是假的（von Mering et al.,2002）。因此，其他鑒定蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用的方法都要求同時(shí)做雙雜交數(shù)據(jù)的有效性分析和新的相互作用的鑒定。

10.4 使用噬菌體展示來(lái)檢測(cè)蛋白質(zhì)－配體的相互作用 10.4.1 在M13纖維狀噬菌體中展示蛋白

噬菌體展示已成為一種強(qiáng)大的蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用和蛋白質(zhì)－配體相互作用研究的工具（reviewed in Smith and Petrenko,1997）。這個(gè)方法最基本的操作是把肽鏈或蛋白質(zhì)融合到纖維狀噬菌體的外殼蛋白上。肽鏈和蛋白質(zhì)一般都是融合到噬菌體的III或VIII蛋白的N末端的（Smith,1985）。III蛋白是一個(gè)低拷貝的外殼蛋白（大約3～5個(gè)拷貝），它位于噬菌體的頂部，負(fù)責(zé)噬菌體感染細(xì)菌的過(guò)程中使噬菌體吸附到F菌毛上（Riechmann and Holliger,1997）。VIII蛋白是一種主要外殼蛋白，每個(gè)噬菌體微粒大概有2700個(gè)拷貝(Rasched and Oberer,1986)。因?yàn)榛蚓幋a的融合蛋白是包裝在同一個(gè)噬菌體微粒上的，所以各種表現(xiàn)型（也就是展示蛋白和這個(gè)展示蛋白的基因序列的配體結(jié)合特征）之間具有直接的聯(lián)系。這就允許隨機(jī)氨基酸序列的多肽的大文庫(kù)能夠快速篩選特定的配體結(jié)合特征（Fig.10.7）（Smith,1985）。另外，也可以從大量展示蛋白的突變體中篩選配體結(jié)合特征發(fā)生改變的突變體（Katz,1997）。

噬菌體展示的一個(gè)重要應(yīng)用是繪制蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用的位點(diǎn)。例如，隨機(jī)的多肽文庫(kù)用來(lái)鑒定單克隆抗體的抗原決定簇和多克隆抗體（Felici et 321 322 323 324 325 326 327 328 329 330 331 332 333 334 335 336 337 338 339 340 341 342 343 344 345 346 347 348 349 al.,1993;Folgori et al.,1994;Yao et al.,1995）。根據(jù)他們結(jié)合抗體的能力，從隨機(jī)序列的噬菌體展示多肽中進(jìn)行選擇，選擇的多肽通過(guò)DNA測(cè)序進(jìn)行鑒定。經(jīng)常會(huì)發(fā)現(xiàn)一些序列和一些感興趣的抗原區(qū)域結(jié)合。這種方法的一個(gè)變種是利用DNAseI對(duì)感興趣的蛋白的基因隨機(jī)酶切后構(gòu)建多肽的文庫(kù)，然后用霰彈法(shotgun)把這些小片段基因克隆到噬菌體展示載體上（Petersen et al.,1995）。這個(gè)方法的優(yōu)點(diǎn)是如果結(jié)合的多肽是已知的，它們就會(huì)結(jié)合到我們感興趣的蛋白區(qū)域。這個(gè)方法已經(jīng)用來(lái)繪制除了抗體－抗原以外其他的一些相互作用了。例如，用來(lái)定位β內(nèi)酰胺酶抑制蛋白的結(jié)合決定區(qū)，這個(gè)區(qū)域?qū)Y(jié)合到β內(nèi)酰胺酶上非常重要（Rudgers and Palzkill,2001）。另外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在某些時(shí)候這個(gè)方法可以以構(gòu)象特征鑒定結(jié)合域（Williamson et al.,1998）。

用Shotgun克隆打斷的基因到噬菌體展示載體中已經(jīng)擴(kuò)展到了細(xì)菌的全基因組（Jacobsson and Frykberg,1995,1996;Jacobsson et al.,1997）。在檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，Staphylococcus aureus的全基因組DNA用超聲波破碎后克隆到了基因III和基因VIII的噬菌體展示載體上。這個(gè)方法的潛力在實(shí)驗(yàn)中得到了驗(yàn)證，通過(guò)固定的IgG蛋白的結(jié)合富集噬菌體從Staphylococcus aureus基因組文庫(kù)中選擇編碼蛋白A的基因片段（Jacobsson and Frykberg,1995,1996）。這個(gè)系統(tǒng)也已經(jīng)被用來(lái)從Staphylococcus epidermidis中克隆纖維蛋白結(jié)合蛋白（Nilsson et al.,1998），還有來(lái)自結(jié)合α巨球蛋白、血清蛋白和IgG的C群鏈球菌的表面蛋白（Jacobsson et al.,1997）。這個(gè)方法的一個(gè)局限性是DNA的隨機(jī)片斷必須在信號(hào)序列和基因III編碼的蛋白（g3p）或基因VIII編碼的蛋白（g8p）間克隆。因此，只有1/18的克隆將含有一個(gè)有正確方向的融合子及同時(shí)含有信號(hào)序列和噬菌體外殼蛋白。標(biāo)準(zhǔn)的噬菌體展示系統(tǒng)也不合適用來(lái)構(gòu)建真核生物cDNA文庫(kù)，因?yàn)樵赾DNA中基因編碼末端的終止子的存在排除了它與外殼蛋白的結(jié)合的可能。這個(gè)問(wèn)題利用在裂解噬菌體的外殼蛋白上展示蛋白或片段就可以避免。10.4.2 T7噬菌體的蛋白展示

使用裂解噬菌體載體，如λ（Maruyama et al.,1994;Santini et al.,1998），T4（Ren et al.,1996），T7（Rosenberg et al.,1996）的噬菌體展示系統(tǒng)的發(fā)展已經(jīng)提供了一種不依賴(lài)E.coli分泌機(jī)制的替代法。所有這些系統(tǒng)的額外的優(yōu)點(diǎn)是克隆的蛋白是融合在噬菌體外殼蛋白的C端的，這樣方便了基因組和cDNA文庫(kù)的350 351 352 353 354 355 356 357 358 359 360 361 362 363 364 365 366 367 368 369 370 371 372 373 374 375 376 377 378 構(gòu)建。在T7 上展示cDNA文庫(kù)最近已經(jīng)被用來(lái)鑒定信號(hào)蛋白在EFG－受體信號(hào)通路中的作用了（Zozulya et al.,1999）。另外，利用cDNA文庫(kù)，T7系統(tǒng)已經(jīng)被用來(lái)鑒定蛋白質(zhì)和小分子間的相互作用。這些研究說(shuō)明噬菌體展示可以用作高通量的蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用的研究。

基因組或cDNA噬菌體展示文庫(kù)的一個(gè)優(yōu)勢(shì)是同一個(gè)文庫(kù)可以用來(lái)分離很多不同配體的結(jié)合蛋白。另外，用來(lái)掃描的配體并不局限于其它蛋白，任何可以被固定的分子都可能作為一個(gè)測(cè)試的目標(biāo)。這使得文庫(kù)能用來(lái)搜索那些可以結(jié)合DNA、RNA、蛋白質(zhì)、糖、氨基酸或其他小分子物質(zhì)的蛋白質(zhì)。多肽噬菌體展示文庫(kù)甚至已經(jīng)被用來(lái)探索活的動(dòng)物的脈管系統(tǒng)（Pasqualini and Ruoslahti,1996）。這就是把噬菌體庫(kù)注射到小鼠的循環(huán)系統(tǒng)中，等一段時(shí)間后收集感興趣的器官和組織，利用勻漿混合物感染E.coli來(lái)擴(kuò)增結(jié)合在這些組織上的噬菌體（Pasqualini and Ruoslahti,1996）。這個(gè)方法已經(jīng)被用來(lái)鑒定對(duì)不同組織和腫瘤的脈管系統(tǒng)特異性的多肽（Arap et al.,2002;Pasqualini and Ruoslahti,1996;Rajotte et al.,1998）。結(jié)果表明大部分組織的脈管系統(tǒng)表現(xiàn)出組織特有的標(biāo)記。利用來(lái)自病原微生物的基因組或cDNA文庫(kù)來(lái)做這個(gè)體內(nèi)噬菌體展示實(shí)驗(yàn)，以檢查由微生物的ORFs介導(dǎo)的目標(biāo)組織將是非常有意思的。

鑒定很多種配體的結(jié)合蛋白的能力將使噬菌體展示成為蛋白質(zhì)組學(xué)的一個(gè)有用的工具?；蚪M測(cè)序已經(jīng)鑒定很多沒(méi)有功能的開(kāi)放閱讀框?；蚪M噬菌體展示文庫(kù)可以被用來(lái)利用結(jié)合功能對(duì)ORFs進(jìn)行分類(lèi)。例如，基因組DNA可以被固定到小珠上，就可以從基因組噬菌體展示文庫(kù)中篩選出一組DNA結(jié)合蛋白。使用不同類(lèi)型的配體就可能根據(jù)結(jié)合能力把大量的ORFs進(jìn)行分門(mén)別類(lèi)。10.4.3 酵母雙雜交和噬菌體展示相結(jié)合

酵母雙雜交和噬菌體展示系統(tǒng)都共同具有的一個(gè)缺點(diǎn)是都產(chǎn)生高比例的假陽(yáng)性數(shù)據(jù)。因?yàn)檫@兩個(gè)技術(shù)相當(dāng)不同，即酵母雙雜交系統(tǒng)是一個(gè)體內(nèi)的分析，而噬菌體展示是體外的，因此結(jié)合這兩種方法可能會(huì)產(chǎn)生更有用的生物學(xué)數(shù)據(jù)。該途徑的強(qiáng)大能力最近已經(jīng)被含有SH3結(jié)構(gòu)域的酵母蛋白的研究很好的闡明了（Tone et al.,2003）。SH3結(jié)構(gòu)域是蛋白質(zhì)識(shí)別分子，它介導(dǎo)很多參與特殊生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)的相互作用（Pawson and Scott,1997）。為了鑒定和酵母中發(fā)現(xiàn)的SH3結(jié)構(gòu)域發(fā)生作用的蛋白質(zhì)，總共在E.coli中表達(dá)了24個(gè)和谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移379 380 381 382 383 384 385 386 387 388 389 390 391 392 393 394 395 396 397 398 399 400 401 402 403 404 405 406 407 酶融合并以可溶狀態(tài)出現(xiàn)的SH3結(jié)構(gòu)域（Tone et al.,2002）。這些蛋白被用作噬菌體展示的目標(biāo)來(lái)從隨機(jī)氨基酸序列的九肽文庫(kù)中選擇SH3結(jié)構(gòu)域的配體。在多方面富集多肽配體之后，對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，分析了20個(gè)不同的SH3結(jié)構(gòu)域的結(jié)合配體的一致序列（Tone et al.,2002）。這些相同的序列就被用來(lái)搜尋酵母蛋白組中潛在的天然SH3配體。發(fā)現(xiàn)含有天然SH3 結(jié)合位點(diǎn)的蛋白質(zhì)形成了一個(gè)網(wǎng)狀的相互作用。為了證明這個(gè)發(fā)現(xiàn)，以18個(gè)不同的SH3結(jié)構(gòu)域和幾個(gè)富含脯氨酸的目標(biāo)為餌進(jìn)行一系列的雙雜交后建立了第二個(gè)蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)作用網(wǎng)絡(luò)（Tone et al.,2002）。最后，利用噬菌體展示和酵母雙雜交相互作用網(wǎng)絡(luò)中的交叉點(diǎn)找到了它們的共有組分。總共有59個(gè)噬菌體展示網(wǎng)絡(luò)中的相互作用在酵母雙雜交相互作用網(wǎng)也得到印證（Tone et al.,2002）。其中的一些作用已經(jīng)用免疫共沉淀在體內(nèi)進(jìn)行了證明。利用來(lái)自多種試驗(yàn)方法得到的多組試驗(yàn)數(shù)據(jù)是一種評(píng)估一種特定辦法的產(chǎn)生偏差的有用的辦法。10.5 在蛋白片段互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)中檢驗(yàn)相互作用 10.5.1 簡(jiǎn)介

蛋白片段互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)是以酶的重裝配策略為基礎(chǔ)的：蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)的相互作用能促進(jìn)有效的再折疊和酶片段互補(bǔ)來(lái)恢復(fù)成為活性酶。這個(gè)方法起初是用復(fù)原的泛素作為蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用傳感器。泛素是一種由76個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，獨(dú)立或與其它蛋白共價(jià)連接存在于細(xì)胞中（Johnsson and Varshavsky,1994）。泛素與其他蛋白的融合蛋白會(huì)很快的被泛素特異性蛋白酶降解，這個(gè)酶識(shí)別泛素的折疊構(gòu)象。如果泛素和一個(gè)報(bào)告蛋白一起融合表達(dá)，那么降解反應(yīng)后就能在體內(nèi)釋放報(bào)告子（Johnsson and Varshavsky,1994）。然而，泛素的C末端片段與報(bào)告子的融合蛋白和泛素的N末端片段在同一個(gè)細(xì)胞中分別表達(dá)，這種降解將不會(huì)發(fā)生。如果兩個(gè)相互作用的蛋白質(zhì)分別與泛素的C端片段和N端片段融合，并在同一細(xì)胞表達(dá)，則完整的泛素將會(huì)被復(fù)原，降解效應(yīng)將發(fā)生（Fig.10.8）。因此蛋白質(zhì)的相互作用可以在體內(nèi)把他們分別融合到泛素的C端片段和N端片段并測(cè)定報(bào)告蛋白的釋放來(lái)檢測(cè)。就像下面討論的那樣，這個(gè)方法已經(jīng)被擴(kuò)展到了其他系統(tǒng)，現(xiàn)在已經(jīng)成為酵母雙雜交和噬菌體展示的可行的替代方法在體內(nèi)檢測(cè)蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)的相互作用。

10.5.2 利用二氫葉酸還原酶的蛋白片段的互補(bǔ) 408 409 410 411 412 413 414 415 416 417 418 419 420 421 422 423 424 425 426 427 428 429 430 431 432 433 434 435 436 二氫葉酸還原酶參與了一碳化合物的代謝，是原核細(xì)胞和真核細(xì)胞生存所必須的。這個(gè)酶催化從二氫葉酸到四氫葉酸還原反應(yīng)，這個(gè)過(guò)程是絲氨酸、蛋氨酸、嘌呤、胸苷酸生物合成所必須的。老鼠的二氫葉酸還原酶（mDHFR）是一個(gè)較小的（21KD）單體酶，它和E.coli中的酶同源性很高（29％的序列一致性）（Pelletier et al.,1998）。DHFR的三位結(jié)構(gòu)說(shuō)明它由F[1]、F[2]、F[3]三個(gè)結(jié)構(gòu)片段組成（Gegg et al.,1997）。

E.coli的DHFR被抗生素甲氧芐氨嘧啶選擇性抑止。mDHFR和甲氧芐氨嘧啶的親和系數(shù)要比細(xì)菌的DHFR小12000倍。因此表達(dá)mDHFR的E.coli能在存在甲氧芐氨嘧啶時(shí)生長(zhǎng)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)mDHFR的F[1,2]、F[3]三個(gè)結(jié)構(gòu)域與寡聚亮氨酸拉鏈融合后分別表達(dá)，在體內(nèi)的重組導(dǎo)致了甲氧芐氨嘧啶抗性的E.coli細(xì)胞的產(chǎn)生（Pelletier et al.,1998）。該重組是由于亮氨酸拉鏈序列的相互作用拉近了mDHFR的F[1,2]、F[3]的片段使它們能夠折疊成單個(gè)有功能的酶。潛在蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)的相互作用可以用下述方法來(lái)檢測(cè)：把一個(gè)蛋白與F[1,2]域融合并讓該蛋白的已知結(jié)合伙伴與F[3]融合，然后測(cè)試包含融合結(jié)構(gòu)的E.coli細(xì)胞的甲氧芐氨嘧啶抗性。這個(gè)系統(tǒng)與上面所描述的泛素系統(tǒng)比較類(lèi)似。

mDHFR蛋白片段互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)的使用已經(jīng)擴(kuò)展到了哺乳動(dòng)物細(xì)胞中。哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中的mDHFR活性的恢復(fù)用缺少DHFR的細(xì)胞在缺失核苷酸中的生長(zhǎng)來(lái)檢測(cè)（Remy and Michnick,1999）。這些細(xì)胞的生長(zhǎng)必須要有一個(gè)有活性的mDHFR酶，因?yàn)镈HFR的活性是合成嘌呤和嘧啶所必須的（Remy and Michnick,1999）。第二種在細(xì)胞培養(yǎng)中檢測(cè)mDHFR重組的方法是以熒光實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)的，檢測(cè)在體內(nèi)熒光標(biāo)記的甲氨蝶呤（fMTX）結(jié)合到重組的mDHFR上。這個(gè)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)是當(dāng)mDHFR在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生重組，它就會(huì)以高親和力與fMTX結(jié)合生成1：1的復(fù)合物。結(jié)合了的fMTX會(huì)停留在細(xì)胞中，未結(jié)合的則排出細(xì)胞外。因此重組的mDHFR存在與否可以利用熒光顯微鏡、FACS或光譜進(jìn)行檢測(cè)（Remy and Michnick,1999）。

mDHFR蛋白互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)已經(jīng)被用來(lái)繪制原核生物翻譯起始的信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)（Remy and Michnick,2001）?？偣卜治隽?5對(duì)全長(zhǎng)的蛋白質(zhì)，利用細(xì)胞在缺少核苷酸時(shí)存活的選擇性鑒定了14個(gè)相互作用。另外，利用fMTX試劑結(jié)合熒光顯微鏡來(lái)定位蛋白復(fù)合物在細(xì)胞中的位置（Remy and Michnick,2001）。mDHFR437 438 439 440 441 442 443 444 445 446 447 448 449 450 451 452 453 454 455 456 457 458 459 460 461 462 463 464 465 蛋白互補(bǔ)系統(tǒng)相對(duì)于酵母雙雜交系統(tǒng)在檢測(cè)蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用中有潛在的優(yōu)勢(shì)。例如，mDHFR系統(tǒng)可以在E.coli或哺乳動(dòng)物細(xì)胞中使用（Pelletier et al.,1998;Remy and Michnick,1999）。當(dāng)試驗(yàn)哺乳動(dòng)物蛋白相互作用時(shí)，可能使用陰性系統(tǒng)更為有利。另外利用MTX試劑結(jié)合熒光顯微鏡在細(xì)胞中定位相互作用的能力提供了酵母雙雜交系統(tǒng)所無(wú)法提供的重要信息。因此，這種技術(shù)可能會(huì)在未來(lái)的蛋白組學(xué)研究中有很廣泛的應(yīng)用。

10.5.3 用β－半乳糖苷酶互補(bǔ)來(lái)檢測(cè)蛋白質(zhì)的相互作用

β－半乳糖苷酶廣泛的被用作基因表達(dá)的報(bào)告子，因?yàn)樗到猱a(chǎn)色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-Gal）來(lái)產(chǎn)生藍(lán)色產(chǎn)物的能力。以經(jīng)典的內(nèi)部順?lè)醋踊パa(bǔ)的細(xì)菌基因表型為基礎(chǔ)，發(fā)展出了蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用實(shí)驗(yàn)（Mohler and Blau,1996）。在E.coli中去掉lacZ的N端或C端會(huì)產(chǎn)生一個(gè)沒(méi)有活性的酶，但是缺少不同末端的無(wú)活性酶共表達(dá)后互補(bǔ)。利用把缺失片段裝配到一個(gè)穩(wěn)定的八聚蛋白中產(chǎn)生互補(bǔ)，這個(gè)蛋白含有野生型所有的必須的結(jié)構(gòu)域（Mohler and Blau,1996）。參與互補(bǔ)的存在于突變體中的N端和C端結(jié)構(gòu)域就是我們所知的а和ω區(qū)域。相互作用的實(shí)驗(yàn)是基于這樣一個(gè)基礎(chǔ)上的，即當(dāng)缺少а結(jié)構(gòu)域（△а）和ω結(jié)構(gòu)域（△ω）的β-半乳糖苷酶共表達(dá)時(shí)互補(bǔ)產(chǎn)生有活性酶的效率是很高的（Mohler and Blau,1996）。當(dāng)△а和△ω的β-半乳糖苷酶突變體分別和相互作用的蛋白質(zhì)融合時(shí)，有利于△а和△ω片段的靠近，這樣就能產(chǎn)生高效的互補(bǔ)作用。因此，潛在的蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用可以利用把感興趣的蛋白質(zhì)分別融合到△а和△ω的β-半乳糖苷酶突變體上，然后檢測(cè)酶利用X-Gal的活性（Mohler and Blau,1996;Rossi et al.,2000）。

β－半乳糖苷酶互補(bǔ)作用實(shí)驗(yàn)已經(jīng)被應(yīng)用到了哺乳動(dòng)物細(xì)胞（Rossi et al.,1997）。熒光標(biāo)記的β－半乳糖苷酶的底物使得能夠用熒光顯微鏡和FACS來(lái)分析表達(dá)感興趣的融合蛋白的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。因此，類(lèi)似于mDHFR系統(tǒng)，β-半乳糖苷酶互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)可能會(huì)發(fā)展成為在基因組范圍內(nèi)研究哺乳動(dòng)物細(xì)胞中蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用的有用的工具。

10.6利用質(zhì)譜儀研究蛋白質(zhì)－蛋白相互作用的圖譜 10.6.1概論

蛋白質(zhì)的快速鑒定可以通過(guò)直接搜索蛋白質(zhì)和核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中的數(shù)據(jù)來(lái)獲得，466 467 468 469 470 471 472 473 474 475 476 477 478 479 480 481 482 483 484 485 486 487 488 489 490 491 492 493 494 這些數(shù)據(jù)庫(kù)是由質(zhì)譜儀所產(chǎn)生的多肽質(zhì)量數(shù)據(jù)構(gòu)成的。鑒定蛋白復(fù)合物的組成是質(zhì)譜在蛋白－蛋白相互作用圖譜中最普遍的應(yīng)用。這些實(shí)驗(yàn)可以通過(guò)應(yīng)用親和方法來(lái)分離完整的蛋白復(fù)合體來(lái)實(shí)現(xiàn)（圖.10.9）。而這通常需要了解蛋白質(zhì)復(fù)合物中至少一個(gè)蛋白的特性。這個(gè)蛋白可以通過(guò)親和處理來(lái)標(biāo)記，比如谷胱甘肽S－轉(zhuǎn)移酶、多聚組氨酸重復(fù)或者抗體的抗原決定簇如Flag 標(biāo)記。標(biāo)記蛋白可以在細(xì)胞中過(guò)量表達(dá)，在非變性條件下進(jìn)行親和純化過(guò)程中與標(biāo)記蛋白相互作用的蛋白也一同被純化。復(fù)合物進(jìn)行洗提，蛋白組分用SDS－PAGE分離，條帶從凝膠中切割下來(lái)并進(jìn)行蛋白酶解，肽的精確的質(zhì)量可由質(zhì)譜儀來(lái)確定。搜索肽質(zhì)量數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)行比對(duì)可以鑒定復(fù)合物中的蛋白。這種常規(guī)的方法文獻(xiàn)中已有很多例子，包括研究核孔復(fù)合體、酵母Arp2/3復(fù)合體、TATA－結(jié)合蛋白關(guān)聯(lián)因子、酵母紡錘體復(fù)合物、剪切體組份以及結(jié)合到分子伴侶 GroEL的蛋白等。10.6.2 鑒定E.coli 的GroEL作用底物

分子伴侶 GroEL和它的輔因子GroES是E.coli生長(zhǎng)所必須的。GroEL的作用是通過(guò)限制聚合作用來(lái)促進(jìn)折疊。GroEL是一個(gè)由14個(gè)亞單位構(gòu)成的有2個(gè)大空穴的圓柱形的同源低聚體，底物蛋白通過(guò)GroEL復(fù)合物疏水表面結(jié)合在圓柱體空穴中間。GroES隨后結(jié)合在圓柱體的頂點(diǎn)表面上使底物被捕獲在阻止聚合作用的空穴內(nèi)。細(xì)胞中大概10％的新的翻譯的蛋白可以與GroEL相互作用，這一點(diǎn)是明確的，但是這些底物蛋白的身份知之甚少。

GroEL首選底物可通過(guò)脈沖－追蹤標(biāo)記生長(zhǎng)的E.coli細(xì)胞來(lái)鑒定的。在不同的追蹤時(shí)間，GroEL-底物復(fù)合物可以用 anti-GroEL 抗體免疫沉淀反應(yīng)分離出。沉淀下來(lái)的蛋白可通過(guò)雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，通過(guò)胰酶對(duì)斑點(diǎn)進(jìn)行消化，隨后用MALLDA－TOF質(zhì)譜儀分析肽－質(zhì)量指紋就可以實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白的鑒定。利用這種方法，總共鑒定出了52個(gè)不同的GroEL的底物蛋白。分析這些蛋白與GroEL的相互作用為基礎(chǔ)的共同結(jié)構(gòu)模塊。發(fā)現(xiàn)GroEL底物比其它E.coli蛋白多具有幾個(gè)αβ域。這些試驗(yàn)說(shuō)明質(zhì)譜方法可以來(lái)確定蛋白－蛋白的相互作用。10.6.3啤酒酵母蛋白復(fù)合物的鑒定

質(zhì)譜儀最近用來(lái)系統(tǒng)分析酵母中蛋白－蛋白相互作用。這些研究與上述的雙雜交實(shí)驗(yàn)類(lèi)似，很重要的不同在于質(zhì)譜儀是研究蛋白復(fù)合物，而雙雜交方法是來(lái)檢測(cè)兩者間的相互作用。在一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，TAP用來(lái)純化589個(gè)蛋白復(fù)合物。TAP495 496 497 498 499 500 501 502 503 504 505 506 507 508 509 510 511 512 513 514 515 516 517 518 519 520 521 522 523 方法利用兩個(gè)親和標(biāo)記的結(jié)合來(lái)純化蛋白復(fù)合物。復(fù)合物在單向SDS－PAGE中分離，單個(gè)蛋白用MALDI－TOF質(zhì)譜儀來(lái)鑒定。589個(gè)純化的TAP標(biāo)記蛋白中，78％存在與之相結(jié)合的蛋白，表明這種方法可以有效純化復(fù)合物?？偣?45個(gè)純化復(fù)合物與酵母中98個(gè)已知的蛋白復(fù)合物是一致的，這證明了此方法的可靠性。另外242個(gè)純化復(fù)合物中鑒定出了134新的復(fù)合物。這些數(shù)據(jù)表明兩種不同的純化方法檢測(cè)到相同蛋白的可能性大概為70％。因此30% 的結(jié)果可能是有問(wèn)題的。.酵母中的蛋白復(fù)合物第二個(gè)系統(tǒng)研究是在餌蛋白上應(yīng)用單親和標(biāo)記來(lái)純化感興趣的復(fù)合物。在這些實(shí)驗(yàn)中，752種蛋白標(biāo)記為餌，相關(guān)的復(fù)合物被純化。復(fù)合物中的蛋白在SDS－PAGE中分離，從凝膠中挖出，用胰蛋白酶消化，然后利用串聯(lián)質(zhì)譜儀來(lái)鑒定。研究鑒定了1578個(gè)不同相互作用的蛋白，它們代表了25％的酵母蛋白質(zhì)組。

一個(gè)重要的問(wèn)題是數(shù)據(jù)的獲得是否是從高通量質(zhì)譜儀實(shí)驗(yàn)和利用雙雜交試驗(yàn)相交合的數(shù)據(jù)中獲得的。研究利用TAP標(biāo)記產(chǎn)生的數(shù)據(jù)，只有7％是與雙雜交是重疊的。用兩種試驗(yàn)來(lái)檢測(cè)相互作用的類(lèi)型表明是互補(bǔ)的。雙雜交方法不適用于檢測(cè)蛋白的復(fù)合物，它僅鑒定二元的作用。然而雙雜交試驗(yàn)對(duì)于鑒定兩者間的作用以及低親和力很有用。

10.7蛋白表達(dá)譜以及相互作用中的蛋白質(zhì)芯片

蛋白質(zhì)芯片分析是另外一個(gè)新出現(xiàn)的熱點(diǎn)，針對(duì)檢測(cè)蛋白表達(dá)及相互作用的高通量技術(shù)?？梢跃哂胁煌姆绞降牡鞍踪|(zhì)芯片，如一套抗體可以排列于濾光器或者載玻片上，用來(lái)檢測(cè)蛋白表達(dá)的水平。另外一種方法包括來(lái)源于組織的蛋白直接放于玻璃載片、尼龍濾網(wǎng)或者微量滴定孔。這個(gè)方法可以用來(lái)定位蛋白－蛋白相互作用或者蛋白催化作用。

蛋白質(zhì)芯片試驗(yàn)的難點(diǎn)在于蛋白不如核酸那樣的均一。蛋白功能依賴(lài)于精確的脆弱的三維結(jié)構(gòu)，這在試驗(yàn)中很難保持。另外相互作用的強(qiáng)度和穩(wěn)定性不如核酸那樣標(biāo)準(zhǔn)。每個(gè)蛋白－蛋白相互反應(yīng)是專(zhuān)一的可以呈現(xiàn)一個(gè)寬范圍的親和力。目前蛋白表達(dá)的分析幾乎完全依賴(lài)雙向電泳以及質(zhì)譜儀。然而蛋白試驗(yàn)的發(fā)展，需要另外有力方法以便在更廣的基因范圍內(nèi)研究蛋白表達(dá)和蛋白－蛋白相互作用。524 525 526 527 528 529 530 531 532 533 534 535 536 537 538 539 540 541 542 543 544 545 546 547 548 549 550 551 552 10.7.1蛋白表達(dá)圖譜抗體試驗(yàn)

蛋白組學(xué)的一個(gè)目標(biāo)是檢測(cè)組織之內(nèi)或者之間蛋白表達(dá)水平。長(zhǎng)期以來(lái)抗體被用來(lái)檢測(cè)蛋白，如western雜交和ELISA等方法。然而檢測(cè)成千上萬(wàn)的蛋白用這種方法就很麻煩。一個(gè)替代的方法是抗體的芯片，待測(cè)組織中每種蛋白的專(zhuān)一抗體被置于濾膜或者玻片上。蛋白表達(dá)測(cè)定首先通過(guò)在目的組織中獲得天然蛋白裂解物并將蛋白用熒光標(biāo)記。蛋白混合物結(jié)合抗體芯片，目的組織中表達(dá)的蛋白在芯片上結(jié)合他們的同類(lèi)抗體。將非特異的蛋白洗掉，通過(guò)測(cè)定結(jié)合蛋白熒光來(lái)檢測(cè)結(jié)合蛋白類(lèi)型。這個(gè)方法本質(zhì)上是高通量 ELISA試驗(yàn)。這個(gè)試驗(yàn)的優(yōu)點(diǎn)在于芯片結(jié)合之前不需要天然蛋白的分餾。另外可以實(shí)現(xiàn)應(yīng)用自動(dòng)化程序?qū)Χ喾N樣品進(jìn)行平行檢測(cè)。顯然這種方法的限制是需要對(duì)每一個(gè)蛋白專(zhuān)一抗體的研究。

對(duì)于大量的蛋白利用免疫處理動(dòng)物并純化蛋白來(lái)獲得抗體可能會(huì)比較困難且費(fèi)用昂貴。一個(gè)替代的方法是利用噬菌體展示庫(kù)分離專(zhuān)一的抗體?？贵w的噬菌體展示庫(kù)已經(jīng)廣泛的運(yùn)用于篩選單克隆抗體而不需要傳統(tǒng)的雜交技術(shù)。從單個(gè)噬菌體展示庫(kù)中眾多蛋白中分離專(zhuān)一抗體的技術(shù)已可以自動(dòng)化，因此在更廣的基因組范圍的項(xiàng)目中有很大的潛力來(lái)提供抗體。10.7.2 運(yùn)用肽、蛋白質(zhì)和小分子芯片進(jìn)行功能分析

蛋白質(zhì)芯片技術(shù)的目的之一是將基因組翻譯的所有蛋白排成芯片用于功能研究。對(duì)于蛋白質(zhì)功能的全局分析，過(guò)去已經(jīng)通過(guò)文庫(kù)篩選方法有所研究了。對(duì)于cDNA表達(dá)文庫(kù)等文庫(kù)篩選，可以成批地對(duì)某一種期望的生物學(xué)特性進(jìn)行檢測(cè)。例如，從λ噬菌體的噬菌斑中篩選出表達(dá)蛋白已經(jīng)被運(yùn)用了很多年了（Young and Davis，1983）。在這些實(shí)驗(yàn)中，一個(gè)cDNA文庫(kù)插入到一個(gè)λ噬菌體載體中，這樣編碼的蛋白以一個(gè)與E.coli β－半乳糖苷酶融合蛋白的形式表達(dá)出來(lái)。噬菌體文庫(kù)感染E.coli后，在瓊脂平板上形成λ噬菌斑。每一個(gè)λ噬菌斑表達(dá)一種不同的融合蛋白，然后運(yùn)用這些蛋白質(zhì)特異抗體探查出這些噬菌斑中特異蛋白的存在（Young and Davis，1983）。挑出確定的陽(yáng)性噬菌斑，檢測(cè)插入片段的DNA序列從而確定相關(guān)的基因。通過(guò)這種方法，基于抗體－抗原的相互作用篩選并克隆基因成為可能。

蛋白質(zhì)芯片比文庫(kù)方法可能會(huì)有更多的優(yōu)點(diǎn)。芯片方式提供了一種精確的，空間定向的格子，允許芯片上的所有蛋白質(zhì)能夠并行的對(duì)比從而篩選出來(lái)。這種553 554 555 556 557 558 559 560 561 562 563 564 565 566 567 568 569 570 571 572 573 574 575 576 577 578 579 580 581 空間結(jié)構(gòu)也能夠確定出芯片中的一個(gè)克隆，該克隆是根據(jù)芯片中其所在的位點(diǎn)測(cè)試出為陽(yáng)性的。因此，這種方法確定蛋白質(zhì)相互作用中的一個(gè)蛋白質(zhì)比文庫(kù)篩選要省力。但是，蛋白質(zhì)芯片也有一個(gè)缺點(diǎn)，即與文庫(kù)（～109）相比，所能排列和篩選的蛋白質(zhì)較少（～104）。同樣，純化所要排列的成千上百個(gè)單個(gè)蛋白質(zhì)種類(lèi)也是一個(gè)技術(shù)上的挑戰(zhàn)。因此，可以有效測(cè)定的蛋白數(shù)目限制了蛋白質(zhì)芯片的應(yīng)用。

肽芯片

最早應(yīng)用芯片形式的是肽芯片。例如，合成肽的大頭針式方法就是在一個(gè)96微孔板內(nèi)平行合成肽。運(yùn)用Fluoenylmethoxycarbonyl（Fmoc）標(biāo)記氨基酸保護(hù)機(jī)制，肽在直徑為4mm的經(jīng)氨活化的聚乙烯大頭針上合成（Geysen et al，1984，1986）。每一個(gè)合成循環(huán)中，這些大頭針被浸入一種氨基酸溶液中。因?yàn)殡氖窃诠腆w支持相上合成的，因此在循環(huán)之間未反應(yīng)的多余氨基酸可以被完全洗脫下來(lái)，增加最后結(jié)果的純度。這種方法起初被用于檢測(cè)口蹄疫病毒VP1衣殼蛋白的抗原決定簇的結(jié)構(gòu)圖譜。存在于有218個(gè)氨基酸的VP1序列中的所有208種可能的重復(fù)的六肽通過(guò)與抗體的相互作用被合成并制成芯片。該方法中檢測(cè)出一個(gè)免疫結(jié)構(gòu)域，進(jìn)而通過(guò)將單核苷酸依次替代肽所在的區(qū)域產(chǎn)生較好的圖譜。這是第一個(gè)使用高通量方法確定蛋白與蛋白之間的關(guān)系。

SPOT合成方法是另一種同時(shí)的、平行的在固相支持上合成肽的方法。這種方法運(yùn)用Fmoc化學(xué)保護(hù)法，但使用在纖維素膜上的羥基作為合成的固相支持（Frank，1992）。當(dāng)一小滴液體滲入多孔膜時(shí)，液體就會(huì)被吸收，形成一個(gè)圓點(diǎn)。通過(guò)使用一種包含合適反應(yīng)物的低揮發(fā)的溶劑，那么在逐步添加活性氨基酸至固定在支持膜上的化學(xué)基團(tuán)時(shí)每一個(gè)點(diǎn)就會(huì)形成一個(gè)開(kāi)放的反應(yīng)器（Frank，1992）。通過(guò)一個(gè)αN-Fmoc保護(hù)的氨基酸與纖維素膜上的羥基之間的酯化作用及隨后的Fmoc切除來(lái)為完成肽的組裝提供錨點(diǎn)（Frank and Overwin，1996）。Fmoc-β-丙氨酸是最常用的膜上的反應(yīng)物。去保護(hù)之后，β－丙氨酸游離的氨基部分可以作為肽芯片合成的模板（Frank，1992；Gausepohl et al，1992）。這種方法已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于描繪抗體－抗原的相互作用，同時(shí)也用于蛋白-DNA，蛋白-金屬，其他蛋白-蛋白之間的相互關(guān)系（Reineke et al，2001）。582 583 584 585 586 587 588 589 590 591 592 593 594 595 596 597 598 599 600 601 602 603 604 605 606 607 608 609 610

SPOT合成法最多的應(yīng)用是為確定線性B細(xì)胞抗原決定簇而制備肽芯片。如果抗原蛋白已知，那么包含整個(gè)序列的一系列重復(fù)的肽就可以很容易的合成并通過(guò)結(jié)合抗體進(jìn)行測(cè)定（Reineke et al，1999a）。對(duì)于結(jié)合起關(guān)鍵作用的單個(gè)殘基可以通過(guò)肽的SPOT合成法及氨基酸替代而被確定。該方法曾用于檢測(cè)抗李斯特菌細(xì)胞溶解素（listeriolysin）產(chǎn)生的六個(gè)單克隆抗體（MAbs）的抗原決定簇結(jié)合位點(diǎn)，李斯特菌細(xì)胞溶解素是由病原菌Listeria monocytogenes產(chǎn)生的一種毒素（Darji et al，1996）。MAbs的結(jié)合位點(diǎn)通過(guò)SPOT合成法產(chǎn)生重復(fù)的肽而確定，這些肽可以覆蓋李斯特菌細(xì)胞溶解素分子的整個(gè)氨基酸序列。一共有166個(gè)肽，每個(gè)肽含12個(gè)氨基酸及一條含3個(gè)氨基酸的支鏈，在芯片中以點(diǎn)的形式合成（Darji et al，1996）。通過(guò)將一個(gè)MAb與固定化的肽孵育并用過(guò)氧化物酶連接的二抗檢測(cè)抗體的方法來(lái)檢測(cè)肽的結(jié)合。纖維素膜在洗脫掉結(jié)合抗體后可以重復(fù)使用數(shù)次。通過(guò)這種方法，六個(gè)MAb中的每一個(gè)含6～8個(gè)氨基酸的結(jié)合位點(diǎn)就可以被定位了（Darji et al，1996）。除此之外，有報(bào)道通過(guò)將抗體與每個(gè)MAb上已確定的結(jié)合位點(diǎn)相關(guān)的可溶的肽進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)的方法，可以阻斷MAbs與膜的結(jié)合。

SPOT合成法也用于為繪制抗原決定簇圖譜，建立組合的肽文庫(kù)。例如，可以通過(guò)組合文庫(kù)確定被鼠抗p24的HIV-1單克隆IgG2a抗體CB4－1識(shí)別的肽抗原決定簇（Kramer et al，1997）。對(duì)于這些實(shí)驗(yàn)，需要合成一個(gè)由68590個(gè)肽的混合物組成的復(fù)雜組合肽文庫(kù)XXXX[B1,B2,B3,B3,X1,X2,X3]XXXX。這個(gè)庫(kù)由10個(gè)含有不同六肽核心的亞庫(kù)組成，六肽核心分別為[XXB1B2B3XX],[XB1XB2B3X],[XB1B2XB3X],[XB1XXB2B3],[XB1XB2XB3], [XB1B2XXB3],[B1XXXB2B3],[B1XXB2XB3],[B1XB2XXB3],[B1B2XXXB3]，這些核心對(duì)應(yīng)于三個(gè)確定位點(diǎn)所有可能的距離模式(Kramer et al，1997）。根據(jù)與CB4－1的結(jié)合篩選纖維素結(jié)合位點(diǎn)篩選組合文庫(kù)，結(jié)果從68590個(gè)點(diǎn)上檢測(cè)到225個(gè)肽的混合物。將篩選出來(lái)的肽混合物去掉其隨機(jī)化的位點(diǎn)，確定了一條與p24有關(guān)的序列的肽段，同時(shí)還確定了三條完全不同的肽段(Kramer et al，1997）。肽結(jié)合的親和力及競(jìng)爭(zhēng)力實(shí)驗(yàn)顯示所有的肽可以結(jié)合到單克隆抗體的同一位點(diǎn)，但是親和力各有不同。另外，每一個(gè)肽段的替代分析清楚的顯示抗體識(shí)別的分子基礎(chǔ)對(duì)每一個(gè)確定的肽段是特異且唯一的（Kramer et al，1997）。這種替代分析611 612 613 614 615 616 617 618 619 620 621 622 623 624 625 626 627 628 629 630 631 632 633 634 635 636 637 638 639 也被用于確定supertope序列，該方法建立在氨基酸替代的基礎(chǔ)上，替代的氨基酸與p24單克隆抗體的結(jié)合位點(diǎn)相一致。例如，其中一條肽段的序列是GATPEDLNQKLAGN, 但是使用SPOT合成法進(jìn)行系統(tǒng)的氨基酸替代得到的的supertope序列為XXXXX[DE]L[HKNR]XX[IL]XXX, X為任意氨基酸（Kramer et al，1997）。與supertope一致的序列與SWISSPROT蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)后，發(fā)現(xiàn)5517個(gè)配對(duì)的蛋白質(zhì)。其中一些已確定的蛋白質(zhì)純化后可與p24 單克隆抗體結(jié)合。這些實(shí)驗(yàn)證實(shí)了P24MAb的多特異性，表明SPOT合成法也可以用于產(chǎn)生及尋找無(wú)偏的組合隨機(jī)序列文庫(kù)。

繪制非連續(xù)的抗原決定簇的結(jié)構(gòu)圖更要困難，因?yàn)榭贵w結(jié)合到來(lái)自抗原蛋白的不同區(qū)域的肽的親和力較低。SPOT合成法的一個(gè)有趣的應(yīng)用是繪制與IL－10結(jié)合的中性抗IL－10抗體即CB/RS/1結(jié)合位點(diǎn)的圖譜（Reineke et al，1999b）。IL－10序列上一段重復(fù)的肽段通過(guò)將一段15mer的肽段上的一個(gè)氨基酸替換掉而得到。肽芯片通過(guò)使用CB/RS/1抗體進(jìn)行探測(cè)，而結(jié)合抗體可以通過(guò)使用鼠IgG過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗體而檢測(cè)到。發(fā)現(xiàn)CB/RS/1抗體與代表著蛋白質(zhì)兩個(gè)不同區(qū)域的肽段結(jié)合，這兩個(gè)區(qū)域在一級(jí)結(jié)構(gòu)中是分開(kāi)的，而在高級(jí)結(jié)構(gòu)中是連續(xù)的（Reineke et al，1999b）。那些結(jié)合在抗體上的肽段上的氨基酸殘基位點(diǎn)隨后被系統(tǒng)的一一替換，并通過(guò)點(diǎn)合成而排成芯片。對(duì)于與CB/RS/1抗體的結(jié)合很重要的肽段上的各個(gè)位點(diǎn)又可以通過(guò)檢測(cè)而確定。大量的替代可以增加抗體的結(jié)合。展示抗體結(jié)合能力的兩個(gè)區(qū)域位于同一條肽鏈，并且這條單個(gè)肽鏈與替代增加結(jié)合能力相適應(yīng)。然后用半胱氨酸替換這條單個(gè)肽鏈上的氨基酸形成二硫鍵，二硫鍵可能通過(guò)降低肽鏈的空間構(gòu)象而增加結(jié)合能力。這些多點(diǎn)合成實(shí)驗(yàn)的最終結(jié)果是得到一個(gè)在IL-10與CB/RS/1抗體之間的非連續(xù)結(jié)合位點(diǎn)上的緊密結(jié)合的32氨基酸的虛擬肽段（Reineke et al，1999b）。這個(gè)研究也證明了SPOT合成法對(duì)于快速構(gòu)建及測(cè)試肽芯片的巨大作用。

SPOT合成法還用于其他很多研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用上。這些相互作用包括與信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)的蛋白質(zhì)之間的作用，如PDZ結(jié)構(gòu)域（Schultz等，1998）、SH3域（Cestra等，1999）和腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子（TRAFs）（Pullen等，1999）。此外，該法被用于確定細(xì)菌伴侶蛋白SecB的底物專(zhuān)一性（Knoblauch等，1999）。此研究極其有趣，因?yàn)榘閭H蛋白具有寬松的底物結(jié)合專(zhuān)一性，因此640 641 642 643 644 645 646 647 648 649 650 651 652 653 654 655 656 657 658 659 660 661 662 663 664 665 666 667 668 與大量的蛋白結(jié)合。SecB通過(guò)在翻譯中或翻譯后與新合成的前體蛋白聯(lián)系，協(xié)助前體蛋白穿過(guò)細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)膜，因而使這些前體蛋白保持一種可以轉(zhuǎn)移的狀態(tài)。但是SecB的底物特異性的決定因子還未確定（Knoblauch et al，1999）。為了解決這個(gè)問(wèn)題，合成并篩選出與SecB結(jié)合的來(lái)自23種不同蛋白質(zhì)的總數(shù)為2688條肽鏈（Knoblauch et al，1999）。這一系列蛋白質(zhì)包括已知的SecB的底物以及很多未知的蛋白。這個(gè)大的數(shù)據(jù)庫(kù)可以對(duì)被SecB識(shí)別的底物模體進(jìn)行可靠的統(tǒng)計(jì)分析。所有被篩選出來(lái)的肽鏈根據(jù)它們與SecB的親和力（高、中度、低、無(wú)親和力）被分為四組。親和力由合成的點(diǎn)的強(qiáng)度來(lái)決定（Knoblauch et al，1999）。與SecB結(jié)合和不與SecB結(jié)合的肽鏈其氨基酸分布存在著很大的差異。高親和力SecB結(jié)合肽富含基本氨基酸殘基（Arg和Lys）以及芳香族殘基（Phe，Tyr，Trp），而酸性殘基（Asp，Glu）卻非常少（Knoblauch et al，1999）。該結(jié)果可用于鑒定識(shí)別模塊，它又能夠準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)SecB結(jié)合肽。這些實(shí)驗(yàn)代表了SPOT合成法的應(yīng)用向蛋白組范圍上篩選結(jié)合特異性邁進(jìn)了一步。包含一個(gè)細(xì)菌的蛋白組所有重復(fù)的肽的SPOT芯片很快也將產(chǎn)生。這種芯片將會(huì)成為在蛋白組學(xué)水平上研究抗體－抗原及蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用的強(qiáng)有力的工具。

最近，SPOT法被推廣到產(chǎn)生一個(gè)包含837個(gè)不同的hYAP WW蛋白功能域的肽芯片（Toepert et al，2001）。之所以選擇WW結(jié)構(gòu)域作為模型，是因?yàn)樗挥写蠹s40個(gè)氨基酸長(zhǎng)度。WW結(jié)構(gòu)域在很多具有不同功能的蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)，例如酵母、線蟲(chóng)、哺乳動(dòng)物的結(jié)構(gòu)蛋白、調(diào)節(jié)蛋白及信號(hào)蛋白中（Chen et al，1997a）。WW結(jié)構(gòu)域與富含脯氨酸序列的短片段結(jié)合來(lái)介導(dǎo)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用。WW結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)是已知的，一些定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并證實(shí)了對(duì)其結(jié)構(gòu)和功能重要的殘基（Chen et al，1997）。WW結(jié)構(gòu)域的44個(gè)殘基的每一個(gè)逐一被19個(gè)L－氨基酸所替代（Toepert et al，2001）。結(jié)果與早先的突變實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致，該結(jié)果是建立在結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，應(yīng)該是合理的。固相合成44個(gè)氨基酸的肽鏈有一個(gè)值得擔(dān)憂的是，一個(gè)點(diǎn)內(nèi)合成的肽鏈中有很大部分是不完全的產(chǎn)物?？梢允褂觅|(zhì)譜來(lái)確認(rèn)已合成的肽段的大小（Toepert et al，2001）。另外，所有可能的單個(gè)氨基酸的缺失都被合成在芯片中，與含有各種不同的全長(zhǎng)的肽段的突變體芯片不同，幾乎所有的缺失都是無(wú)活性的。這些結(jié)果提示在一個(gè)點(diǎn)里合成的大部分肽鏈都是全長(zhǎng)的（Toepert et al，2001）。該研究結(jié)合蛋白質(zhì)化學(xué)669 670 671 672 673 674 675 676 677 678 679 680 681 682 683 684 685 686 687 688 689 690 691 692 693 694 695 696 697 698 合成的快速發(fā)展，提示著SPOT法將會(huì)成為使用固相合成產(chǎn)生蛋白質(zhì)芯片的一種方法。

盡管SPOT合成法具有很大的實(shí)用性，但是濾膜上點(diǎn)的密度與DNA芯片或玻璃板上列的順序不同（Brown and Botstein，1999）。但是，有結(jié)果表明影印照相術(shù)可大大增加芯片上肽的密度（Fodor，1991）。這種方法與構(gòu)建高密度寡核苷酸芯片方法相似。光敏保護(hù)基團(tuán)被用于肽的合成。通過(guò)使用只允許光照射那些只加某種氨基酸的肽鏈的過(guò)濾罩，這樣肽鏈可以被選擇性的去保護(hù)。通過(guò)這種技術(shù)，肽的密度可達(dá)到250000/cm2（Fodor，1991）。上述所說(shuō)的芯片可以通過(guò)直接在固體支持相上合成肽鏈而構(gòu)建。目前，由于產(chǎn)物純化以及連接效率的困難，使得SPOT法局限于合成30～40個(gè)氨基酸的肽鏈（Molina et al，1996）。因此，通過(guò)直接合成構(gòu)建蛋白質(zhì)芯片是不可能的。相反，蛋白質(zhì)必須在芯片中表達(dá)、純化隨后使用。重組蛋白能夠在E.coli或S.cerevisiae 等一些有機(jī)體內(nèi)表達(dá)，或者通過(guò)組織培養(yǎng)得到。蛋白質(zhì)也可以選擇在體外轉(zhuǎn)錄、翻譯產(chǎn)生。這些方法的困難是獲得用于芯片上的穩(wěn)定高級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)。不正確的折疊及聚合是重組蛋白在異源系統(tǒng)內(nèi)表達(dá)存在的普遍問(wèn)題。另外，蛋白質(zhì)體外表達(dá)缺乏特異的伴侶蛋白，也會(huì)導(dǎo)致一些不正確的折疊結(jié)構(gòu)的形成。這個(gè)問(wèn)題是蛋白質(zhì)芯片不同于DNA或寡核苷酸芯片的一個(gè)主要因素。所以，蛋白質(zhì)芯片發(fā)展的進(jìn)程一直以來(lái)都比DNA芯片慢。但無(wú)論如何，近年來(lái)的發(fā)展提示蛋白質(zhì)芯片還是可行的。

歸組的重組蛋白芯片

蛋白芯片發(fā)展中的第一個(gè)難題就是由生物體開(kāi)放閱讀框編碼的蛋白質(zhì)的大規(guī)模表達(dá)和純化。關(guān)于S.cerevisiae(Martzen et al., 1999)的工作表明了這種方法的可行性。在這些實(shí)驗(yàn)中，建立起一個(gè)由6,144個(gè)酵母菌株組成的芯片，每個(gè)菌株都包含一個(gè)質(zhì)粒，該質(zhì)粒在Pcup1啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制下表達(dá)不同的GST-ORF融合。因?yàn)榧兓?,144單個(gè)蛋白相當(dāng)困難，所以菌株被集中在64個(gè)組（pool），每個(gè)組有96個(gè)不同的GST融合菌株。每個(gè)組的GST融合蛋白用谷胱甘肽瓊脂糖樹(shù)脂為分離介質(zhì)進(jìn)行分批親和層析純化(Martzen et al., 1999)。然后這些組用作蛋白質(zhì)功能的生化測(cè)定。舉例來(lái)說(shuō)，GST融合組的測(cè)試證明了酵母中兩個(gè)預(yù)先知道的tRNA剪接反應(yīng)中的每一個(gè)只會(huì)基于ORF數(shù)量在預(yù)期組中出現(xiàn)。當(dāng)某組監(jiān)測(cè)出具有某種生化功能時(shí)，這個(gè)單獨(dú)的導(dǎo)致反應(yīng)的菌株需要進(jìn)行測(cè)定，699 700 701 702 703 704 705 706 707 708 709 710 711 712 713 714 715 716 717 718 719 720 721 722 723 724 725 726 727 由適當(dāng)?shù)?6孔板中制備和測(cè)定GST融合蛋白(Martzen et al., 1999)。運(yùn)用此法，生化檢驗(yàn)定出三個(gè)先前未知基因編碼的蛋白質(zhì)的假定功能，包括兩種涉及tRNA處理的環(huán)磷酸二酯酶和一個(gè)可修飾細(xì)胞色素c的轉(zhuǎn)甲基酶(Martzen et al., 1999)。原則上，如果我們假定融合蛋白是可溶的、折疊的和功能性的，成組的GST融合蛋白能用來(lái)識(shí)別任何生化反應(yīng)相關(guān)的蛋白。這個(gè)方法有個(gè)獨(dú)到的優(yōu)勢(shì)，那就是一旦GST融合克隆建立起來(lái)，這就是一項(xiàng)快速的技術(shù)。Martzen和同事宣稱(chēng)只要兩周就能純化64個(gè)組，同時(shí)檢驗(yàn)工作一天就能完成(Martzen et al., 1999)。此外，這個(gè)方法也是很靈敏的，因?yàn)橐淮沃挥?6個(gè)重組蛋白被測(cè)定而相比之下，用細(xì)胞溶解產(chǎn)物的話，溶液中會(huì)有成千上萬(wàn)的蛋白質(zhì)。這個(gè)方法使得每個(gè)蛋白有更高的濃度，因此大大地促進(jìn)生化反應(yīng)的檢測(cè)(Martzen et al., 1999)。

成組GST融合蛋白方法的強(qiáng)大能力可以推出新生化反應(yīng)劑和測(cè)定方法。生物過(guò)程的化學(xué)探針（又稱(chēng)化學(xué)生物學(xué)）的開(kāi)發(fā)是一個(gè)快速發(fā)展的領(lǐng)域。例如，化學(xué)合成一種活性位點(diǎn)指向的探針，可以用來(lái)識(shí)別絲氨酸水解酶家族成員，近來(lái)已經(jīng)有人描述過(guò)此過(guò)程了（Liu et al，1999）。探針的活性由絲氨酸水解酶的有效抑制和不可逆抑制決定的，抑制劑為熒光磷酸(FP)衍生物，如比二異丙基熒光磷酸。這個(gè)探針組成有一個(gè)生物素化的長(zhǎng)鏈熒光磷酸，稱(chēng)作FP-生物素（Liu et al.，1999）。FP-生物素已在來(lái)自各種大鼠器官的粗組織提取物上試驗(yàn)過(guò)了。這些實(shí)驗(yàn)顯示此試劑能與粗提取物中的大量絲氨酸水解物反應(yīng)，也能探測(cè)飛摩爾級(jí)（10-15 mol）的酶（Liu et al.，1999）。顯然，F(xiàn)P-生物素之類(lèi)試劑將能與成組GST融合物更好地反應(yīng)，因?yàn)槌山MGST融合物的蛋白濃度高于粗提取物的蛋白濃度（Martzen et al.，1999)。此類(lèi)化學(xué)探針很可能將在今后幾年內(nèi)得到發(fā)展。

蛋白微芯片 成組GST融合蛋白的運(yùn)用使得生化反應(yīng)的測(cè)試成為可能，但也不僅限于蛋白－蛋白或蛋白－小分子交互作用的識(shí)別。因?yàn)榇四康?，有必要固定蛋白于固體支撐基質(zhì)上，使得非結(jié)合蛋白能夠被洗去。同時(shí)也有必要讓蛋白連接到固體支撐基質(zhì)上后仍能保留它的折疊構(gòu)象。

已經(jīng)有一種方法可以高空間密度連接蛋白到玻片上(MacBeath and Schreiber,2000）。這樣的微芯片制做系統(tǒng)使用高精準(zhǔn)自動(dòng)機(jī)械臂來(lái)傳遞納升體積的樣品到玻片上，密度達(dá)到每平方厘米1,600個(gè)點(diǎn)。用含醛硅烷試劑預(yù)處理玻728 729 730 731 732 733 734 735 736 737 738 739 740 741 742 743 744 745 746 747 748 749 750 751 752 753 754 755 756 片蛋白質(zhì)才能共價(jià)連接其上(MacBeath and Schreiber,2000）。醛很容易與賴(lài)氨酸殘基以及蛋白質(zhì)N端的a氨基酸等主鏈胺反應(yīng)。因?yàn)橘?lài)氨酸通常會(huì)出現(xiàn)在蛋白質(zhì)表面的多個(gè)位點(diǎn)，所以該蛋白能以多個(gè)方位連接。

高密度蛋白芯片是用來(lái)檢驗(yàn)蛋白－蛋白交互作用，三個(gè)已知會(huì)相互反應(yīng)的蛋白作用對(duì)被使用：蛋白G和IgG；p50和IkBa；以及FKBP12雷帕霉素結(jié)合域（FRB）和FKBP12(MacBeath and Schreiber,2000)。每一個(gè)此類(lèi)實(shí)驗(yàn)，兩結(jié)合蛋白中的一個(gè)被固定了，而另一個(gè)蛋白則用熒光標(biāo)記，可以結(jié)合到玻片上。清洗以后，被結(jié)合的蛋白可以通過(guò)滯留的熒光標(biāo)記檢測(cè)出(MacBeath and Schreiber,2000)。這些實(shí)驗(yàn)證實(shí)微芯片能用來(lái)有效地檢測(cè)極小樣品量的蛋白－蛋白交互作用。固化的蛋白以每毫升100ug的濃度分布。因?yàn)榻Y(jié)合反應(yīng)在納升體積中發(fā)生，所以需要檢測(cè)結(jié)合的溶液相蛋白的數(shù)量是很小的。例如，特定的結(jié)合能用pg量的FKBP12檢測(cè)FRB-FKBP12的相互作用(MacBeath and Schreiber,2000)。MacBeath和Schreiber（2000）提到，因?yàn)榻Y(jié)合所必要的溶液相蛋白的濃度相當(dāng)?shù)?，所以有可能在?xì)胞溶解產(chǎn)物中用熒光標(biāo)簽標(biāo)記蛋白，也可以用芯片來(lái)定量溶解物中特定蛋白的總量。因此，蛋白芯片能夠用作蛋白表達(dá)作圖和檢測(cè)蛋白－蛋白相互作用(MacBeath and Schreiber,2000)。通過(guò)相似的方法，研究顯示微芯片上小分子與蛋白的結(jié)合能被有效的檢測(cè)出。但是固定化的蛋白組分有多少還保留折疊結(jié)構(gòu)，對(duì)此仍不很清楚，但是基于預(yù)實(shí)驗(yàn)的判斷，蛋白微芯片在高通量蛋白測(cè)定方面很有應(yīng)用潛力。

蛋白微芯片也被用作研究蛋白－蛋白相互作用的特異性(Newman and Keating,2003)。bZIP轉(zhuǎn)錄因子是真核生物中DNA結(jié)合蛋白的重要一類(lèi)，其中無(wú)規(guī)線團(tuán)的二聚化作用在結(jié)合特異性方面起著重要的作用。人基因組中編碼了大量的bZIP無(wú)規(guī)線團(tuán)，我們使用蛋白芯片分析了這些模塊的組合結(jié)合特異性。這些實(shí)驗(yàn)通過(guò)表達(dá)和純化每個(gè)結(jié)構(gòu)域以及連接蛋白到一個(gè)醛包被的玻璃平板上，構(gòu)造出由49個(gè)人bZIP無(wú)規(guī)線團(tuán)結(jié)構(gòu)域組成的亮氨酸拉鏈芯片（Newman and Keating,2003）。然后49個(gè)蛋白中的每一個(gè)都用熒光標(biāo)記，每一個(gè)都單獨(dú)用作探針結(jié)合到芯片上去。用這種方法，總共有492個(gè)反應(yīng)能迅速評(píng)估出來(lái)。這些實(shí)驗(yàn)的重要特點(diǎn)就是交互實(shí)驗(yàn)>90%的一致性，也就是說(shuō)，一個(gè)結(jié)構(gòu)域固定化或作為溶液探針結(jié)合了相同的一套結(jié)構(gòu)域（Newman and Keating,2003）。這項(xiàng)結(jié)果預(yù)示了因?yàn)榈鞍讜?huì)在固757 758 759 760 761 762 763 764 765 766 767 768 769 770 771 772 773 774 775 776 777 778 779 780 781 782 783 784 785 體支持物和其他表面化學(xué)人工合成物上去折疊，而這樣的人工合成物不會(huì)成為此法的主要限制因素。這個(gè)方法也適用于檢驗(yàn)其他蛋白家族中二元交互作用組。蛋白芯片在蛋白質(zhì)組尺度范圍內(nèi)的應(yīng)用，由構(gòu)建的含有代表93.5%的酵母蛋白質(zhì)組的5,800種不同酵母蛋白芯片所展現(xiàn)（Zhu et al.,2001）。該研究中5,800個(gè)酵母ORF被克隆到一個(gè)酵母高拷貝表達(dá)載體，融合了谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶和多組氨酸（polyhistidine）（GST-HisX6）（Zhu et al.,2001）。蛋白在酵母中表達(dá)以促進(jìn)適當(dāng)?shù)恼郫B和整合一些修飾作用。依照96孔板規(guī)格，一次純化了1,152個(gè)樣品，所有5,800個(gè)蛋白純化以后，樣品以高密度分散點(diǎn)在鎳包被的玻片上（Zhu el al.,2001）。蛋白微芯片通過(guò)用生物素化的鈣調(diào)蛋白（鈣離子存在的條件下）探測(cè)玻片，來(lái)測(cè)試蛋白－蛋白交互作用。鈣調(diào)蛋白是一種高度保守的鈣結(jié)合蛋白，這種蛋白涉及到很多鈣調(diào)控的細(xì)胞過(guò)程，同時(shí)也有很多已知的配合物（Hook and Means,2001）。這些實(shí)驗(yàn)分辨出六種已知鈣調(diào)蛋白的靶蛋白還有另外33個(gè)潛在的結(jié)合伙伴（Zhu et al.,2001）。因?yàn)榕c鈣調(diào)蛋白的相互作用需要精確的三級(jí)結(jié)構(gòu)，研究表明玻片上大部分的蛋白質(zhì)折疊呈功能狀態(tài)。

酵母蛋白組微芯片也被用來(lái)測(cè)試不能被體內(nèi)方式檢測(cè)的相互作用。特別是，蛋白質(zhì)－脂質(zhì)相互作用也能用磷酸肌醇(PI)結(jié)合蛋白篩選法檢測(cè)（Zhu et al.,2001）。PI是重要的細(xì)胞膜組成成分，也作為第二信使廣泛地調(diào)控細(xì)胞過(guò)程。蛋白芯片用脂質(zhì)體探測(cè)，這些脂質(zhì)體包括了5種不同類(lèi)型的PI，還有含脂質(zhì)體的卵磷脂(PC)。每個(gè)脂質(zhì)體也含有一個(gè)生物素化的脂，這種脂用來(lái)探測(cè)連接到微芯片上蛋白質(zhì)的脂質(zhì)體（Zhu et al.,2001）。這六種脂質(zhì)體辨識(shí)出總共150種不同蛋白靶體，該靶體產(chǎn)生的信號(hào)遠(yuǎn)高于背景（Zhu et al.,2001）。這些蛋白中52個(gè)為非特性蛋白質(zhì)。剩下蛋白中，45個(gè)與膜有關(guān)，包括整合膜蛋白和脂修飾蛋白（Zhu et al.,2001）。另外，很多激酶連接到脂分子上。為了確認(rèn)芯片上的相互作用，幾個(gè)蛋白以不同的濃度固定到硝化纖維素濾膜上，顯示出對(duì)脂的結(jié)合具有濃度依賴(lài)性（Zhu et al.,2001）。

酵母蛋白組芯片研究表明蛋白芯片比其他鑒別蛋白－脂相互作用的方法方面有一定的優(yōu)勢(shì)。例如，采用酵母雙雜交方法，核內(nèi)能檢測(cè)到的相互作用數(shù)目有限。反過(guò)來(lái)，因?yàn)榈鞍仔酒Y(jié)合實(shí)驗(yàn)?zāi)茉隗w外做，蛋白的本地化限制就不是一個(gè)問(wèn)題了。體外檢測(cè)相互作用的另外一個(gè)優(yōu)勢(shì)是可以檢測(cè)很多不同類(lèi)型的配體。因786 787 788 789 790 791 792 793 794 795 796 797 798 799 800 801 802 803 804 805 806 807 808 809 810 811 812 813 814 此，諸如蛋白-脂、蛋白-小分子、或者蛋白-核酸酸性相互作用能被檢測(cè)出來(lái)。小分子芯片 遺傳學(xué)對(duì)生物學(xué)的進(jìn)步貢獻(xiàn)很大。它借助突變等位基因來(lái)增加對(duì)有興趣的途徑的認(rèn)識(shí)。在化學(xué)遺傳學(xué)方面，小分子而不是遺傳變異，被用作有條件地或臨時(shí)地調(diào)控蛋白質(zhì)的功能，因此許多生物學(xué)過(guò)程才得以發(fā)現(xiàn)（Mitchison,1994）。這些方法有使用秋水仙堿發(fā)現(xiàn)了微管蛋白（Borisy and Taylor,1967）；河豚毒素的發(fā)現(xiàn)，使得動(dòng)作電位的解剖成為可能（Narahashi et al.,1964）；過(guò)氧化物酶體增殖活化受體γ拮抗劑的辨識(shí)，增進(jìn)了對(duì)脂肪生成調(diào)節(jié)的理解（Lehmann et al.,1995）。發(fā)展化學(xué)遺傳學(xué)作為一項(xiàng)技術(shù)的關(guān)鍵點(diǎn)就是高效的合成大量的多樣的小分子和簡(jiǎn)單地篩選大量的小分子的方法。合成多樣化小分子的重要過(guò)程可通過(guò)以下方法：多樣性定向合成（Schreiber,2000）、固相純化（Merrifield,1963）和分離池合成策略（Furka et al.,1991）。近來(lái)，描繪了一個(gè)具有分離池和以高容量微球?yàn)閱蝹€(gè)反應(yīng)器的多樣化定向合成的技術(shù)平臺(tái)（Blackwell et al.,2001）。每個(gè)微球傳送大約5mM合成儲(chǔ)液到測(cè)定板做化合物解離和重懸浮（Blackwell et al.,2001）。這個(gè)產(chǎn)物量足以做大量生物學(xué)檢驗(yàn)?；瘜W(xué)遺傳學(xué)的另一重要方法就是有效的篩選影響感興趣的過(guò)程的分子。表型的和蛋白質(zhì)結(jié)合的測(cè)試被成功的利用。例如，基于雙表型篩選的組合，有一個(gè)是基于特定轉(zhuǎn)錄后修飾，另一個(gè)是可視的微管和染色質(zhì)，被用來(lái)篩選影響有絲分裂的化合物（Mayer et al.,1999）。其中一個(gè)化合物monastrol通過(guò)與有絲分裂的驅(qū)動(dòng)蛋白Eg5相互作用，阻止了哺乳動(dòng)物的有絲分裂。Monastrol是第一個(gè)被識(shí)別的不通過(guò)結(jié)合微管蛋白而影響有絲分裂的化合物。

基于蛋白質(zhì)結(jié)合分析的小分子篩選是有意義的，因?yàn)樗锌赡馨l(fā)展成高通量篩選。蛋白質(zhì)結(jié)合分析能從不同的蛋白質(zhì)篩選大量的小分子，從而有效地識(shí)別有用的小分子。已有報(bào)道用硫醇捕獲反應(yīng)建立由含硫醇的小分子組成的芯片（MacBeath et al.,1999），和通過(guò)亞硫酰二氯活化的玻璃載玻片表面制作含乙醇的小分子微芯片（Hergenrother et al.,2000）。這個(gè)方法被用來(lái)制作一種高密度的微芯片，此芯片有3,780結(jié)構(gòu)復(fù)雜的產(chǎn)生自多樣化定向的合成的1,3-二氧六環(huán)小分子（Kuruvilla el al.,2002）。此類(lèi)微芯片的應(yīng)用包括用熒光標(biāo)記的酵母蛋白Ure2p作為芯片的探針。這個(gè)蛋白是酵母氮代謝系列基因的中心抑制物。一個(gè)結(jié)合到Ure2p的化合物uretupamine，被識(shí)別出來(lái)用做干擾葡萄糖敏感轉(zhuǎn)錄過(guò)815 816 817 818 819 820 821 822 823 824 825 826 827 828 829 830 831 832 833 834 835 836 837 838 839 840 841 842 843 程，這個(gè)過(guò)程在Ure2p形成的下游過(guò)程出現(xiàn)（Kuruvilla et al.,2002）。新信息表明，因?yàn)閡retupamine只調(diào)控部分Ure2p功能，因此它的功效比單純URE2基因的敲除更專(zhuān)一。研究表明小分子微芯片提供了一種系統(tǒng)化的方法，獲得能調(diào)控不同方面蛋白功能的小分子探針，由此使破壞特定蛋白參與的生物學(xué)過(guò)程更容易。

以上描述的SPOT合成方法，往往用在合成某種芯片模式的膜結(jié)合肽鏈。然而，此方法廣泛運(yùn)用于高效合成膜表面的小型有機(jī)分子的芯片（Scharn et al.,2000）。Trisamino-和amino-oxy-1,3,5-triazine需要通過(guò)應(yīng)用SPOT技術(shù)平行連接到纖維素膜和聚丙烯膜。完成這個(gè)過(guò)程需要用氨基酸和酚鹽離子作為結(jié)構(gòu)單元，還需一個(gè)以三氟乙酸蒸汽裂解的連接系統(tǒng)（Scharn et al.,2000）。為了識(shí)別抗原決定簇類(lèi)似物，總共合成了8,000個(gè)纖維素結(jié)合的1,3,5-三嗪，連接到抗變形生長(zhǎng)因子-α單克隆抗體Tab2，做成平行探針（Scharn et al.,2000）。這些研究預(yù)示了SPOT合成也是一種創(chuàng)建小分子芯片的有效方法。因此，小分子芯片很可能成為將來(lái)蛋白組學(xué)研究的重要工具，用來(lái)探測(cè)生物學(xué)過(guò)程的蛋白質(zhì)功能。蛋白芯片和質(zhì)譜 MALDI-TOF質(zhì)譜結(jié)合蛋白質(zhì)芯片的方法曾用在分析組織培養(yǎng)細(xì)胞分泌的淀粉樣蛋白β肽鏈變體（Davis et al.,1999）。在Alzheimer癥病人的腦組織中常見(jiàn)的老年斑中具有4-kDa淀粉樣β肽鏈的聚集態(tài)（Selkoe,1998）。臨床藥品中識(shí)別出大量肽鏈的變體，因此很需要有效識(shí)別變體的方法。為此，以在芯片表面封固淀粉樣β肽鏈的抗體的方法構(gòu)建了蛋白芯片（Davies et al.,1999）。芯片表面上放1μl介質(zhì)來(lái)捕獲培養(yǎng)細(xì)胞分泌的淀粉樣β肽鏈變體，然后清洗芯片，結(jié)合肽鏈被抽提出來(lái)用于MALDI-TOF質(zhì)譜分析（Davies et al.,1999）。質(zhì)譜的高敏感性和高精確度使數(shù)種淀粉樣β肽鏈蛋白可以被精確識(shí)別。此外，一種對(duì)照的牛IgG固定到芯片上不同位置，結(jié)果顯示淀粉樣肽鏈的抗體有捕獲介質(zhì)中的變體的能力（Davies et al.,1999）。這項(xiàng)研究證明了結(jié)合蛋白質(zhì)芯片與質(zhì)譜是識(shí)別組成上細(xì)微差別的肽鏈的有效方法。

蛋白芯片－質(zhì)譜方法已被擴(kuò)大到很多感興趣的分子的固定化平臺(tái)。因此，分子能為親和方法所捕獲，例如抗體或其他有陰離子交換、陽(yáng)離子交換、金屬親和和反相色譜等色譜特性的芯片表面（Fung et al.,2001）。這類(lèi)芯片能被用來(lái)將蛋白質(zhì)的復(fù)雜混合物純化成具有共同特性的一組蛋白，然后用于質(zhì)譜分析。從概念上講，這個(gè)方法與液相色譜（LC）和第九章介紹的串聯(lián)質(zhì)譜方法相似（Link et 844 845 846 847 848 849 850 851 852 853 854 855 856 857 858 859 860 861 862 863 864 865 866 867 868 869 870 871 872 al.,1999）。兩個(gè)方法的目的都是為了降低蛋白質(zhì)的復(fù)雜度，變成一些能準(zhǔn)確檢測(cè)的蛋白。給定色譜分離方法所給出的蛋白譜，代表了蛋白抽提出來(lái)時(shí)細(xì)胞狀態(tài)的指紋印記。舉例來(lái)說(shuō)，蛋白質(zhì)芯片方法被用來(lái)研究正常狀態(tài)下和癌癥前期的樣品的蛋白質(zhì)表達(dá)的概貌，通過(guò)該方法可以發(fā)現(xiàn)疾病狀態(tài)的蛋白質(zhì)標(biāo)記特征（Wright et al.,2000）。商業(yè)化蛋白質(zhì)芯片－質(zhì)譜平臺(tái)業(yè)已開(kāi)發(fā)出來(lái)，也發(fā)表了一些應(yīng)用（Fung et al.,2001的評(píng)論）。

使用DNA芯片研究蛋白質(zhì)功能 DNA芯片通過(guò)測(cè)量mRNA的水平廣泛用于研究基因表達(dá)（Brown and Botstein,1999）。一個(gè)有趣的額外功能是用這些芯片研究轉(zhuǎn)錄因子蛋白的DNA結(jié)合特異性。已發(fā)展了基于DNA芯片對(duì)特征化DNA序列專(zhuān)一性的鋅指蛋白識(shí)別的方法（Bulyk et al.,2001）。說(shuō)到序列特異性DNA結(jié)合，鋅指轉(zhuǎn)錄因子是最好理解的家族之一。小鼠Zif268轉(zhuǎn)錄因子被用做這些研究的模型系統(tǒng)。這個(gè)實(shí)驗(yàn)需要在M13線性噬菌體表面上展示Zif268蛋白，通過(guò)誘變和噬菌體展示篩選技術(shù)，利用不同的結(jié)合特異性分離一些變體。野生型和變異型Zif268蛋白的結(jié)合特異性就這樣運(yùn)用DNA微芯片確定下來(lái)。

Zif268蛋白包含三種鋅指（F1,F2,F3），每種鋅指與三堿基對(duì)序列相互作用（Pavletich和Pabo，1991）。F2指中的氨基酸通過(guò)噬菌體展示技術(shù)誘變和篩選，來(lái)分離結(jié)合的變體。有人建立起了一個(gè)包含所有64種可能的F2鋅指3堿基對(duì)結(jié)合區(qū)的組合并在側(cè)翼具有野生型F1和F3識(shí)別序列的DNA芯片（Bulyk et al.,2001）(圖10.13)。讓噬菌體展示的野生型或者變異型Zif268蛋白去與芯片上的DNA序列結(jié)合；非結(jié)合物質(zhì)都給沖洗走了，結(jié)合的噬菌體能用包含熒光標(biāo)記抗M13抗體探測(cè)到(Bulyk et al.2001)。結(jié)合測(cè)定是高度平行的，因此，一個(gè)芯片試驗(yàn)就有可能全面描述每個(gè)突變體的結(jié)合特異性。

如果改進(jìn)DNA芯片結(jié)合實(shí)驗(yàn)，就可以用來(lái)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的整個(gè)基因組分析。Bulyk和其同事們用12,000個(gè) 1-kb序列的可以包容Saccharomyces cerevisiae 基因組的芯片來(lái)描述S.cerevisiae 轉(zhuǎn)錄因子的序列特異性（Bulyk et al.,2001）。這些芯片也可以預(yù)測(cè)從未描述過(guò)的轉(zhuǎn)錄因子的功能和發(fā)現(xiàn)新的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（Bulyk et al.,2001）。

10.8 表面胞質(zhì)基因組共振生物傳感器分析

表面胞質(zhì)基因組共振（SPR）生物傳感器已確定為測(cè)定分子間相互作用的方法。873 874 875 876 877 878 879 880 881 882 883 884 885 886 887 888 889 890 891 892 893 894 895 896 897 898 899 900 901 SPR生物傳感器實(shí)驗(yàn)包括在表面固定一個(gè)反應(yīng)物并監(jiān)測(cè)它與溶液中的其它分子的相互作用。SPR描述的是復(fù)雜的合成與分解過(guò)程導(dǎo)致表面附近的溶液光折射系數(shù)發(fā)生改變時(shí)測(cè)到的光現(xiàn)象（Jonsson et al.,1991）(圖 10.14)。SPR信號(hào)表達(dá)為共振單位（RU），它與溶液中和固定配體相互作用的分子質(zhì)量成比例。所以標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)包括固定低分子量的配體和探測(cè)配對(duì)分子不停地流過(guò)固相表面時(shí)信號(hào)的改變（Schuck,1997）。SPR的一個(gè)優(yōu)勢(shì)是可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)結(jié)合反應(yīng)，而不需要標(biāo)記配體。因此，SPR可以用來(lái)研究蛋白、碳水化合物、核酸、脂肪和小分子之間的相互作用。

10.8.1用SPR探測(cè)生物分子的相互作用

關(guān)于用SPR生物感應(yīng)大分子之間相互作用的數(shù)百篇論文已在不同的領(lǐng)域發(fā)表（Rich 和Myszka,2000）。許多研究關(guān)注于探測(cè)和定量蛋白-蛋白相互作用。典型的實(shí)驗(yàn)是將一種蛋白共價(jià)結(jié)合到傳感器表面。已有許多表面材料在市場(chǎng)上供應(yīng)，如羧甲基葡聚糖，羧甲基葡聚糖衍生后給出許多功能基團(tuán)可用于固定化（Schuck,1997）。其他表面還有捕獲生物素化的streptavidin分子和捕獲組氨酸標(biāo)記蛋白的鎳鰲合物表面等（Rich and Myszka,2000）。可溶性蛋白結(jié)合到固相蛋白給出的SPR信號(hào)是實(shí)時(shí)的，可以用來(lái)監(jiān)測(cè)結(jié)合動(dòng)力學(xué)。無(wú)蛋白的緩沖液流過(guò)結(jié)合體可以探測(cè)分解動(dòng)力學(xué)。通過(guò)動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)（Ka,Kd）得到平衡常數(shù)（KD）(Morton and Myszka,1998)。近年來(lái)SPR儀器的發(fā)展已有可能實(shí)現(xiàn)蛋白間相互作用的高通量分析。例如，BIACORE已發(fā)展了分析96孔板上的樣品的儀器。所以，SPR可能對(duì)基因組水平的蛋白-蛋白相互作用的描述作出重大貢獻(xiàn)。

固相表面的發(fā)展使SPR傳感器可用于監(jiān)測(cè)蛋白與脂質(zhì)表面及膜相關(guān)蛋白之間的作用。商業(yè)化（BIACORE）的疏水親脂的傳感器表面已可構(gòu)建穩(wěn)定的膜表面。已有顯示這種疏水傳感器表面可以用來(lái)形成脂質(zhì)單層（Evans and MacKenzie,1999）。這個(gè)單層表面又可以用來(lái)檢測(cè)蛋白-脂質(zhì)相互作用。例如，有一生物傳感器被用來(lái)檢測(cè)Src同源域與磷脂雙層上的磷脂肌醇的結(jié)合（Surdo et al.,1999）。另外，親脂的傳感器表面被用來(lái)捕獲脂質(zhì)體和形成像生物膜一樣的脂質(zhì)雙層。

疏水傳感器表面上脂質(zhì)單層的一個(gè)有意思的應(yīng)用是主要組織相容性復(fù)合物（MHC）以特定的方向結(jié)合到表面（Celia et al.,1999）。這是因?yàn)橹|(zhì)體在極性902 903 904 905 906 907 908 909 910 911 912 913 914 915 916 917 918 919 920 921 922 923 924 925 926 927 928 929 930 一端連接了一個(gè)經(jīng)化學(xué)修飾的帶有鎳鹽的脂質(zhì)的作用（Celia et al.,1999）。含有鎳脂質(zhì)的脂質(zhì)體包被疏水傳感器表面形成單脂層。實(shí)驗(yàn)用的重組MHC分子在跨膜區(qū)域含多組氨酸標(biāo)記。電子顯微鏡顯示組氨酸標(biāo)記的MHC分子結(jié)合到脂質(zhì)體的表面。SPR度量顯示組氨酸標(biāo)記的MHC分子特異性結(jié)合到脂質(zhì)雙層的表面（Celia et al.,1999）。更進(jìn)一步，SPR實(shí)驗(yàn)表明MHC蛋白與單脂層在特定的方向上相互作用。觀察到MHC分子與抗微球 抗體結(jié)合卻不與抗組氨酸標(biāo)記抗體結(jié)合的現(xiàn)象可以推斷上述結(jié)論（Celia et al.,1999）?？菇M氨酸標(biāo)記抗體不與MHC分子結(jié)合可能因?yàn)榭臻g位阻，因?yàn)榻M氨酸標(biāo)記在單脂層表面上結(jié)合了鎳脂質(zhì)。最后，Celia和同事們通過(guò)將熒光標(biāo)記的脂質(zhì)結(jié)合到單脂層，發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)在單脂層里橫向流動(dòng)（Celia et al.,1999）。這樣，精密的SPR應(yīng)用發(fā)展起來(lái)用于模擬體外膜蛋白的相互作用。膜及傳感器表面膜蛋白構(gòu)建技術(shù)的進(jìn)步對(duì)蛋白組學(xué)的研究將會(huì)做出重大貢獻(xiàn)?；蚪M中將近三分之一的開(kāi)放閱讀框被認(rèn)為是編碼膜相關(guān)蛋白的。所以，測(cè)定和定量膜內(nèi)蛋白之間相互作用的能力對(duì)在基因組水平研究蛋白-蛋白相互作用的蛋白組學(xué)起關(guān)鍵性作用。10.8.2 SPR生物傳感器與質(zhì)譜的聯(lián)合

正如上面講到的，SPR生物傳感器被用來(lái)監(jiān)測(cè)和定量蛋白-蛋白相互作用而不需要標(biāo)記任何一方結(jié)合物。此方法還用于探測(cè)來(lái)自包括細(xì)胞溶解物和條件媒介物在內(nèi)的復(fù)雜混合物的蛋白作用。稱(chēng)為配基釣魚(yú)的方法是將已知蛋白固定作為功能魚(yú)餌，釣出復(fù)雜混合物中的未知的結(jié)合伙伴（Lackman et al.,1996;Nelson et al.,2000）。困難在于當(dāng)潛在的結(jié)合物從復(fù)雜混合物中釣出來(lái)后，在氨基酸測(cè)序以確定身份之前必須用標(biāo)準(zhǔn)的生物化學(xué)方法將該蛋白純化（Lackman et al.,1996）。生物傳感器聯(lián)合質(zhì)譜能更直接地鑒定結(jié)合伙伴。生物傳感器為質(zhì)譜和蛋白鑒定提供了微量純化的平臺(tái)（Williams and Addona,2000）。從SPR生物傳感器表面回收的蛋白量非常少（毫微摩爾），但用靈敏的MALDI-TOF或隨機(jī)質(zhì)譜方法鑒定已足夠了（Nelson et al.,2000;Williams and Addona,2000）。

SPR與質(zhì)譜聯(lián)用的潛力曾被谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST）和抗-GST抗體模型系統(tǒng)證實(shí)（Nelson et al.,1997）。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，抗-GST抗體聯(lián)結(jié)到羧甲基葡聚糖芯片，GST注入芯片與抗體結(jié)合。反應(yīng)結(jié)束后，芯片從儀器上移開(kāi)，以基質(zhì)材料包被含有結(jié)合蛋白的芯片區(qū)域并用于MALDI分析（Nelson et al.,1997）。接931 932 933 934 935 936 937 938 939 940 941 942 943 944 945 946 947 948 949 950 951 952 953 954 955 956 957 958 959 著用MALDI-TOF質(zhì)譜儀分析此芯片，質(zhì)譜圖顯示結(jié)果與GST蛋白質(zhì)量相一致。這個(gè)方法又經(jīng)改進(jìn)，包括了以單個(gè)芯片上多流細(xì)胞的方法進(jìn)行樣品的蛋白水解消化。如抗人白細(xì)胞介素α（anti-IL-1α）抗體固定在傳感器芯片上的流動(dòng)池1中，胃蛋白酶固定在流動(dòng)池2（Nelson et al.,2000）。含IL-1α的溶液進(jìn)入到流動(dòng)池1，在那里，SPR測(cè)量?jī)x顯示IL-1α結(jié)合到抗IL-1α抗體的情況。洗去非特異性結(jié)合的蛋白，然后從表面洗脫IL-1α，IL-1α再?gòu)牧鲃?dòng)池1進(jìn)入流動(dòng)池2。經(jīng)足夠時(shí)間的固定化胃蛋白酶的蛋白水解消化后，MALDI-TOF質(zhì)譜分析儀分析流動(dòng)池2的表面。結(jié)果肽質(zhì)量譜清楚地反映IL-1α的存在（Nelson et al.,2000）。

上述試驗(yàn)表明聯(lián)結(jié)SPR和質(zhì)譜的技術(shù)是可行的。這些方法對(duì)蛋白相互作用的描述是有用的。例如，固定蛋白被用作餌，在活體條件下釣出復(fù)雜蛋白混合物中的相應(yīng)的蛋白結(jié)合物。復(fù)合技術(shù)的使用不僅能快速鑒別蛋白相互作用，而且提供了作用的動(dòng)力學(xué)參數(shù)信息。此方法可以作為體內(nèi)技術(shù)比如酵母雙雜交系統(tǒng)的絕佳的輔助手段。10.9總結(jié)

有效的高通量的蛋白-蛋白和蛋白-配體相互作用的檢測(cè)對(duì)蛋白組研究起著越來(lái)越重要的作用。鑒別結(jié)合伙伴的最常用的方法是酵母雙雜交系統(tǒng)。這是依賴(lài)于通過(guò)由蛋白質(zhì)的相互作用以DNA結(jié)合域回收轉(zhuǎn)錄激活域，而使其功能重構(gòu)的體內(nèi)探測(cè)方法。雙雜交法已被用于研究酵母蛋白的相互作用及數(shù)以千計(jì)的蛋白構(gòu)成的精細(xì)網(wǎng)絡(luò)的鑒定。分析表明在這些高度異源的無(wú)級(jí)網(wǎng)絡(luò)中少數(shù)緊密聯(lián)系的蛋白介導(dǎo)著大量的鏈接較少的蛋白間的相互作用。這種類(lèi)型的網(wǎng)絡(luò)框架在很多復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)中非常普遍，如英特網(wǎng)絡(luò)、代謝網(wǎng)絡(luò)等。以雙雜交法還發(fā)現(xiàn)在其它類(lèi)型的生物中也存在復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，如病毒、細(xì)菌、動(dòng)物系統(tǒng)等。噬菌體展示也為發(fā)現(xiàn)很多蛋白－配基相互作用做出了貢獻(xiàn)。特別有用的是噬菌體展示和雙雜交數(shù)據(jù)的結(jié)合可以減少假陽(yáng)性相互作用的數(shù)量。蛋白質(zhì)片段互補(bǔ)研究的相互作用數(shù)據(jù)的使用很可能增強(qiáng)蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)庫(kù)，在蛋白組規(guī)模提供更為精確的相互作用譜。

以蛋白質(zhì)芯片鑒定蛋白－配基相互作用很具有挑戰(zhàn)性，蛋白質(zhì)固定到固體支持物時(shí)需要保持三維結(jié)構(gòu)的完整。蛋白間的相互作用用肽和蛋白芯片來(lái)檢測(cè)和解析。SPOT合成已大量用于合成肽芯片，這種芯片主要用于鑒定抗體抗原決定部位和解析蛋白相互作用的結(jié)合部位。蛋白質(zhì)芯片也被用于研究蛋白間和蛋白－配960 961 962 963 964 965 966 967 968 969 970 971 972 973 974 975 976 977 978 979 980 981 982 983 984 985 986 987 988 989 990 991 992 993 基間相互作用。最近，構(gòu)建了一個(gè)含90％酵母蛋白組（5800個(gè)蛋白）的蛋白質(zhì)芯片，用它鑒定了鈣調(diào)素結(jié)合蛋白和脂結(jié)合蛋白。這些使用表明，蛋白質(zhì)可以在芯片上保持它的高級(jí)結(jié)構(gòu)，這預(yù)示著蛋白質(zhì)芯片的廣闊未來(lái)。研制了小分子芯片用于在化學(xué)遺傳學(xué)中快速鑒定小分子探針。小分子在解析復(fù)雜生物學(xué)過(guò)程中具體的蛋白的作用是一個(gè)非常有用的工具。蛋白和小分子芯片可以用熒光標(biāo)記分子檢測(cè)芯片表面的相互作用。一個(gè)比熒光檢測(cè)方法更細(xì)致和定量化的方法是表面胞質(zhì)基因組共振，該法原理是當(dāng)配體結(jié)合到固定在芯片表面的靶體蛋白時(shí)引起的折射系數(shù)的變化。此法的優(yōu)勢(shì)在于可以測(cè)定相互作用分子對(duì)的結(jié)合率、解離率和平衡常數(shù)，因此該法在高通量的蛋白－配基相互作用的檢測(cè)中發(fā)展快速而且很可能將廣泛應(yīng)用（Protomics，T.Palzkill, 2002）。

圖例

圖10.1 重組克隆.(a)以attB＋attP>attL+attR反應(yīng)克隆PCR產(chǎn)物受Int 和IHF蛋白催化。結(jié)果展示了可以構(gòu)建功能載體的起始克隆。（b）以Int、Xis和IHF蛋白催化通過(guò)attB＋attP>attL+attR反應(yīng)將起始克隆轉(zhuǎn)變?yōu)楣δ茌d體。利用編碼適當(dāng)?shù)膯?dòng)子和標(biāo)簽的目的載體可以構(gòu)建多樣的功能載體。（引自Protomics，T.Palzkill, 2002）

圖10.2 PCR產(chǎn)物的定向克隆策略。定向拓?fù)洚悩?gòu)酶介導(dǎo)的對(duì)PCR產(chǎn)物的克隆在其5’末端需要5’-CACC序列。本例中CACC序列緊靠在插入基因的起始密碼子ATG之前。（引自Proteomics，T.Palzkill, 2002）

圖10.3 酵母的重組克隆。進(jìn)行兩個(gè)連續(xù)的PCR反應(yīng)。每套引物的5’端都含有額外序列，這些序列最終使PCR產(chǎn)物可與線性化載體進(jìn)行同源重組。（引自Proteomics，T.Palzkill, 2002）

圖10.4 酵母雙雜交系統(tǒng)。報(bào)告基因上游的蛋白X和Y的相互作用導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄激活。蛋白X做為融合蛋白通過(guò)DNA結(jié)合域（DBD）結(jié)合在報(bào)告基因的上游位點(diǎn)，蛋白Y是帶有轉(zhuǎn)錄激活域（Act）的融合蛋白。蛋白X和Y的相互作用使激活域置于994 995 996 997 998 999 1000 1001 1002 1003 1004 1005 1006 1007 1008 1009 1010 1011 1012 1013 1014 1015 1016 1017 1018 1019 1020 1021 1022 1023 1024 1025 1026 1027 1028 1029 1030 1031 1032 1033 1034 1035 1036 1037 報(bào)告基因的附近并刺激它的轉(zhuǎn)錄。（引自Proteomics，T.Palzkill, 2002）

圖10.5 雙雜交蛋白相互作用的高通量配型測(cè)定。含有‘餌’和‘阱’的酵母菌株放在多孔板的孔內(nèi)雜交。以轉(zhuǎn)錄報(bào)告基因篩選二倍體并用以測(cè)定蛋白－蛋白相互作用。（引自Proteomics，T.Palzkill, 2002）

圖10.6 酵母雙雜交‘餌’和‘阱’的系統(tǒng)雜交.酵母的每ORF分別被克隆為DNA結(jié)合域融合（餌）和DNA激活域融合（阱）.DNA結(jié)合域融合導(dǎo)入到MATa株，DNA激活域融合導(dǎo)入到MATa株.它們分別構(gòu)成62套每套96克隆的組；組間進(jìn)行系統(tǒng)的雜交（62×62共3844個(gè)組合）.選擇相互作用的克隆，PCR擴(kuò)增插入片段并切測(cè)序鑒定。（引自Proteomics，T.Palzkill, 2002）

圖10.7 絲狀噬菌體展示。隨機(jī)序列的多態(tài)或者是不同的蛋白質(zhì)被融合到噬菌體M13的衣殼蛋白的基因III上。目標(biāo)配體被固定在固相上。噬菌體所展示的蛋白利用與目標(biāo)之間的親和力被富集并純化，這個(gè)過(guò)程叫做Panning。經(jīng)過(guò)多輪的Panning后，噬菌體被用來(lái)感染E.coli，然后這個(gè)被選擇出來(lái)的插入片斷的成分通過(guò)DNA測(cè)序來(lái)鑒定。（引自Proteomics，T.Palzkill, 2002）

圖10.8 開(kāi)裂的泛素作為蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用的傳感器。蛋白A被融合到了泛素N末端區(qū)域，蛋白B則融合到了它的C末端。蛋白A與蛋白B的相互作用會(huì)重新組成一個(gè)完整的，折疊了的泛素。折疊了的蛋白質(zhì)能夠被一種特別的蛋白酶識(shí)別，酶切后釋放一種報(bào)告蛋白。（引自Proteomics，T.Palzkill, 2002）

圖10.9 鑒定復(fù)合物內(nèi)蛋白相互作用的一般方法。利用一個(gè)與復(fù)合物種一個(gè)已知蛋白相互作用的標(biāo)簽序列把復(fù)合物從細(xì)胞中分離出來(lái)?；蛘呃冕槍?duì)這個(gè)復(fù)合物中的某個(gè)蛋白的抗體進(jìn)行免疫沉淀來(lái)分離復(fù)合物。這些蛋白質(zhì)用聚丙烯酰胺電泳，水解來(lái)分析，水解產(chǎn)生的碎片可以通過(guò)質(zhì)譜來(lái)鑒定?；蛘呤堑鞍踪|(zhì)水解后用液相色譜處理。然后，多肽片斷用質(zhì)譜鑒定，然后通過(guò)與數(shù)據(jù)庫(kù)的比對(duì)來(lái)鑒定蛋白的成分。（引自Proteomics，T.Palzkill, 2002）

圖10.10 利用抗體芯片來(lái)繪制蛋白表達(dá)圖譜。這個(gè)抗體芯片是由針對(duì)一組感興趣的生物體內(nèi)蛋白的特異性的單克隆抗體固定到膜上而成的。為了鑒定一種蛋白在測(cè)試條件下是否有表達(dá)，先要獲得粗裂解物，然后對(duì)裂解物內(nèi)的蛋白要進(jìn)行熒光標(biāo)記。裂解液加到膜上，使蛋白質(zhì)與相應(yīng)的抗體結(jié)合。結(jié)合了的蛋白可以通過(guò)熒光標(biāo)記看到。（引自Proteomics，T.Palzkill, 2002）

圖10.11 利用點(diǎn)合成法構(gòu)建多肽芯片。β丙氨酸被共價(jià)連接到作為平面支持的纖維膜上。然后以β丙氨酸為起點(diǎn)通過(guò)Fmoc化學(xué)法合成多肽。多肽通過(guò)羧基末端與膜相連。（引自Proteomics，T.Palzkill, 2002）

圖10.12 從成組的酵母菌株中純化蛋白質(zhì)。每個(gè)酵母的ORF都被以蛋白表達(dá)載體中與谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶融合而克隆并構(gòu)建了6144個(gè)酵母株。所有酵母株被分成64組，每組96株。每組培養(yǎng)后批量純化96個(gè)融合蛋白。然后測(cè)定每組的生1038 1039 1040 1041 1042 1043 1044 1045 1046 1047 1048 1049 1050 1051 1052 1053 化功能（Martzen等，1999）。將功能陽(yáng)性的菌株歸并為新的組。（引自Proteomics，T.Palzkill, 2002）

圖10.13 用DNA微芯片確定轉(zhuǎn)錄因子的特異性結(jié)合位點(diǎn)。（A）含有Zif168-結(jié)合位點(diǎn)的DNA片斷的 固定。F2指針的結(jié)合位點(diǎn)表示為圖中NNN,N指任一核苷酸。(B)構(gòu)建了一個(gè)64孔微芯片，每孔由圖A顯示的含有3堿基對(duì)的F2結(jié)合位點(diǎn)的序列組成，然后噬菌體展示的各種不同的Zif268蛋白結(jié)合到這個(gè)芯片上。（C）被結(jié)合的噬菌體用抗M13抗體檢測(cè)。噬菌體的結(jié)合位點(diǎn)決定了不同Zif268蛋白的底物特異性（Bulyk et al.2001）。（引自Proteomics，T.Palzkill, 2002）

圖10.14 表面胞質(zhì)基因組共振生物傳感器的示意圖.一種結(jié)合伙伴固定在感應(yīng)器表面.使用BIACORE儀器，可溶性分子可以流過(guò)固定的分子．可溶性分子的結(jié)合導(dǎo)致傳感芯片表面的溶液的折光系數(shù)發(fā)生改變.折光系數(shù)改變的大小與可溶性分子被結(jié)合的數(shù)量存在相關(guān)性.（引自Proteomics，T.Palzkill, 2002）

第五篇：蛋白質(zhì)的知識(shí)點(diǎn)總結(jié)

導(dǎo)語(yǔ)：蛋白質(zhì)是組成人體一切細(xì)胞、組織的重要成分。機(jī)體所有重要的組成部分都需要有蛋白質(zhì)的參與。下面是由小編整理的關(guān)于蛋白質(zhì)的知識(shí)點(diǎn)總結(jié)。歡迎閱讀！

篇一：蛋白質(zhì)的知識(shí)點(diǎn)總結(jié)

一個(gè)通式-兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)-三個(gè)數(shù)量關(guān)系--四個(gè)原因--五大功能

(1)一個(gè)通式：是指組成蛋白質(zhì)的基本單位氨基酸；氨基酸的通式只有1個(gè)，即

(形象記憶：碳周?chē)兴膫€(gè)鄰居，三個(gè)固定鄰居即-H、-COOH、-NH2，一個(gè)變動(dòng)鄰居即-R基)。不同的氨基酸分子，具有不同的-R基。

(2)兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)：是指判斷組成蛋白質(zhì)的氨基酸必須同時(shí)具備的標(biāo)準(zhǔn)有2個(gè)：一是數(shù)量標(biāo)準(zhǔn)，即每種氨基酸分子至少都含有一個(gè)氨基(-NH2)和一個(gè)羧基(-COOH)；二是位置標(biāo)準(zhǔn)，即都是一個(gè)氨基和一個(gè)羧基連接在同一個(gè)碳原子上。

(3)三個(gè)數(shù)量關(guān)系：是指蛋白質(zhì)分子合成過(guò)程中的3個(gè)數(shù)量關(guān)系(氨基酸數(shù)、肽鍵數(shù)或脫水分子數(shù)、肽鏈數(shù))，它們的關(guān)系為：當(dāng)m個(gè)氨基酸縮合成一條肽鏈時(shí)，脫水分子數(shù)為(m-1)，形成(m-1)個(gè)肽鍵，即脫去的水分子數(shù)=肽鍵數(shù)=氨基酸數(shù)-1；當(dāng)m個(gè)氨基酸形成n條肽鏈時(shí)，肽鍵數(shù)=脫水分子數(shù)=m-n。

(4)四個(gè)原因：是指蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)多樣性的原因有4個(gè)：

①組成蛋白質(zhì)的氨基酸分子的種類(lèi)不同；

②組成蛋白質(zhì)的氨基酸分子的數(shù)量成百上千；

③組成蛋白質(zhì)的氨基酸分子的排列次序變化多端；

④蛋白質(zhì)分子的空間結(jié)構(gòu)不同。

(5)五大功能：是指蛋白質(zhì)分子主要有5大功能(由分子結(jié)構(gòu)的多樣性決定)：

①有些蛋白質(zhì)是構(gòu)成細(xì)胞和生物體的重要物質(zhì)，如人和動(dòng)物的肌肉主要是蛋白質(zhì)；

②有些蛋白質(zhì)有催化作用，如參與生物體各種生命活動(dòng)的絕大多數(shù)酶；

③有些蛋白質(zhì)有運(yùn)輸作用，如細(xì)胞膜上的載體、紅細(xì)胞中的血紅蛋白；

④有些蛋白質(zhì)有調(diào)節(jié)作用，如胰島素和生長(zhǎng)激素都是蛋白質(zhì)，能夠調(diào)節(jié)人體的新陳代謝和生長(zhǎng)發(fā)育；

⑤有些蛋白質(zhì)有免疫(包括細(xì)胞識(shí)別)作用，如動(dòng)物和人體的抗體能清除外來(lái)蛋白質(zhì)對(duì)身體生理功能的干擾，起著免疫作用。

篇二：蛋白質(zhì)的知識(shí)點(diǎn)總結(jié)

1.蛋白質(zhì)：

以氨基酸為基本單位構(gòu)成的生物大分子。氨基酸分子以脫水縮合的方式相互結(jié)合：一個(gè)氨基酸分子的羧基（—COOH）和另一個(gè)氨基酸分子的氨基（—NH2）相連接,同時(shí)脫去一分子的水。

如圖所示：

肽鍵：連接兩個(gè)氨基酸分子的化學(xué)鍵,如圖中虛框內(nèi)所示。

二肽：由兩個(gè)氨基酸分子縮合而成的化合物。

多肽：由多個(gè)氨基酸分子縮合而成的、含有多個(gè)肽鍵的化合物。

2.蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的多樣性

蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的多樣性可以從以下四個(gè)層次加以理解：

(1)氨基酸的種類(lèi)不同；

(2)氨基酸的數(shù)量不同；

(3)氨基酸的排列順序不同；

(4)肽鏈的數(shù)目和空間結(jié)構(gòu)不同。