第一篇：單克隆抗體生產(chǎn)的雜交瘤技術(shù)

Hybridoma Technology for the Generation of Monoclonal Antibodies(mAbs)單克隆抗體生成的雜交瘤技術(shù) Abstract 1 Introduction 2 Materials

2.1 Preparation of splenocytes 2.1 脾細胞制備 spleens from immunized mice 免疫小鼠的脾臟 RPMI-1640 medium(Serum-free cell freezing medium)無血清細胞凍存培養(yǎng)基 無血清細胞凍存培養(yǎng)基 3 Petri dishes 有蓋培養(yǎng)皿 Sterile surgical instruments,including microdissecting scissors and forceps,for collecting animal samples 用于收集動物樣品的無菌手術(shù)器械，包括顯微解剖剪和鉗子，5 sterile microscope glass slide with frosted ends 磨砂的的無菌顯微玻片 6 15-ml conical tubes 15-ml 錐形瓶

2.2 Preparation of myeloma cells as the fusion partner 作為融合頭（融合標簽）的骨髓瘤細胞的制備 2.3 cell fusion 細胞融合

2.4 hybridoma screening by FACS 2.5 hybridoma screening by ELISA 通過ELISA進行雜交瘤篩選 2.6 hybridoma screening by IHC 2.7 hybridoma subcloning 2.8 hybridoma cryopreservation 低溫保存雜交瘤細胞 2.9 antibody isotyping 抗體同型

2.10 thawing and growth of hybridoma cells 雜交瘤細胞的融化和生長methods 3.1 preparation of splenocytes from the immunized mouse 來自免疫鼠的脾細胞的制備 3.2 preparation of myeloma cells 骨髓瘤細胞的制備 3.3 cell fusion 細胞融合

3.4 hybridoma screening using flow cytometry 通過流式細胞儀進行雜交瘤篩選 3.5 hybridoma screening by ELISA 通過ELISA進行雜交瘤篩選 3.6 hybridoma screening by IHC 通過免疫組化進行雜交瘤篩選 3.7 hybridoma subcloning 雜交瘤亞克隆

3.8 hybridoma cryopreservation 雜交瘤低溫保存 3.9 antibody isotyping 抗體同型

3.10 Thawing and growth of hybridoma cells 雜交瘤細胞的融化和生長 4 小記 參考文獻

第二篇：單克隆抗體技術(shù)個人總結(jié)

單克隆抗體技術(shù)個人總結(jié)

制備單克隆抗體

1975年，Kohler和Milstein發(fā)現(xiàn)將小鼠骨髓瘤細胞和綿羊紅細胞免疫的小鼠脾細胞進行融合，形成的雜交細胞既可產(chǎn)生抗體，又可無限增殖，從而創(chuàng)立了單克隆抗體雜交瘤技術(shù)。這一技術(shù)上的突破不僅為醫(yī)學與生物學基礎(chǔ)研究開創(chuàng)了新紀元，也為臨床疾病的診、防、治提供了新的工具。

制備單克隆抗體包括動物免疫、細胞融合、選擇雜交瘤、檢測抗體、雜交瘤細胞的克隆化、凍存以及單克隆抗體的大量生產(chǎn)，要經(jīng)過幾個月的一系列實驗步驟，下面按照制備單克隆抗體的流程順序，逐一介紹其實驗方法。

一、細胞融合前準備

(一)免疫方案

選擇合適的免疫方案對于細胞融合雜交的成功，獲得高質(zhì)量的McAb至關(guān)重要。一般要在融合前兩個月左右確立免疫方案開始初次免疫，免疫方案應(yīng)根據(jù)抗原的特性不同而定。

1.顆粒性抗原免疫性較強，不加佐劑就可獲得很好的免疫效果。下面以細胞性抗原為例的免疫方案:

初次免疫1×10７／0.5ml ip(腹腔內(nèi)注射)

↓ 2～3周后

第二次免疫1×10７／0.5ml ip

↓ 3周后

加強免疫(融合前三天)1×10７／0.5ml ip或iv(靜脈內(nèi)注射)↓

取脾融合2.可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐劑，常用佐劑：福氏完全佐劑，福氏不完全佐劑。要求抗原和佐劑等體積混合在一起，研磨成油包水的乳糜狀，放一滴在水面上不易馬上擴散呈小滴狀表明已達到油包水的狀態(tài)。商品化福氏完全佐劑在使用前須振搖，使沉淀的分枝桿菌充分混勻。

初次免疫Ag

～50μg 加福氏完全佐劑皮下多點注射

│(一般0.8～1ml 0.2ml／點)

↓3周后

第二次免疫 劑量同上，加福氏不完全佐劑皮下或ip

│(ip劑量不宜超過0.5ml)

↓3周后

第三次免疫 劑量同上，不加佐劑，ip

│(5～7天后采血測其效價，檢測免疫效果)

↓2～3周后

加強免疫，劑量50～500μg

宜，ip或iv

↓3天后

取脾融合目前，用于可溶性抗原(特別是一些弱抗原)的免疫方案也不斷有所更新，如①將可溶性抗原顆?；蚬滔嗷?，一方面增強了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。②改變抗原注入的途徑，基礎(chǔ)免疫可直接采用脾內(nèi)注射。③使用細胞因子作為佐劑，提高機體的 1

免疫應(yīng)答水平，促進免疫細胞對抗原反應(yīng)性。

(二)飼養(yǎng)細胞

在制備單克隆抗體過程中，許多環(huán)節(jié)需要加飼養(yǎng)細胞，如：在雜交瘤細胞篩選、克隆化和擴大培養(yǎng)過程中，加入飼養(yǎng)細胞是十分必要的。常用的飼養(yǎng)細胞有：小鼠腹腔巨噬細胞(較為常用)、小鼠脾臟細胞或小鼠胸腺細胞，也有人用小鼠成纖維細胞系3T3經(jīng)放射線照射后作為飼養(yǎng)細胞，使用比較方便，照射后可放入液氮罐長期保存，隨用隨復蘇。

小鼠腹腔巨噬細胞的制備

小鼠采用與免疫小鼠相同的品系，常用BaLb／c小鼠6～10周齡

↓

拉頸處死 浸泡于75％酒精，消毒3～5分鐘

↓

用無菌剪刀剪開皮膚，暴露腹膜

↓

用無菌注射器注入6～8ml培養(yǎng)液

↓

反復沖洗，吸出沖洗液

↓

放入10ml離心管，1200轉(zhuǎn)／分離心5～6分鐘

↓

用20％小牛血清(NCS)或胎牛血清(FCS)的培養(yǎng)液混懸，調(diào)整細胞數(shù)1× 0５／ml

↓

加入96孔板，100μl／孔

↓

放入37℃ CO2孵箱培養(yǎng)

一般飼養(yǎng)細胞在融合前一天制備，一只小鼠可獲得5～8×106腹腔巨噬細胞，若用小鼠胸腺細胞作為飼養(yǎng)細胞時，細胞濃度為5×106／ml，小鼠脾細胞為1×106／ml，小鼠的成纖維細胞(3T3)1×105／ml，均為100μl／孔。

(三)骨髓瘤細胞

骨髓瘤細胞系應(yīng)和免疫動物屬于同一品系，這樣雜交融合率高，也便于接種雜交瘤細胞在同一品系小鼠腹腔內(nèi)產(chǎn)生大量 McAb

常用骨髓瘤細胞系有：NS1、SP2／0、X63 Ag8.653等。

骨髓瘤細胞的培養(yǎng)適合于一般的培養(yǎng)液，如RPMI1640，DMEM培養(yǎng)基。小牛血清的濃度一般在10～20％，細胞的最大密度不得超10６／ml，一般擴大培養(yǎng)以1∶10稀釋傳代，每3～5天傳代一次。細胞的倍增時間為16～20小時，上述三株骨髓瘤細胞系均為懸浮或輕微貼壁生長，只用彎頭滴管輕輕吹打即可懸起細胞。

一般在準備融合前的兩周就應(yīng)開始復蘇骨髓瘤細胞，為確保該細胞對HAT的敏感性，每3～6月應(yīng)用8～AG(8氮雜鳥嘌呤)篩選一次，以防止細胞的突變。

保證骨髓瘤細胞處于對數(shù)生長期，良好的形態(tài)，活細胞計數(shù)高于95％，也是決定細胞融合的關(guān)鍵。

(四)免疫脾細胞指的是處于免疫狀態(tài)脾臟中B淋巴母細胞棗漿母細胞。一般取最后一次加強免疫3天以后的脾臟，制備成細胞懸液，由于此時B淋巴母細胞比例較大，融合的成功率較高。

脾細胞懸液的制備：在無菌條件下取出脾臟，用不完全的培養(yǎng)液洗一次，置平皿中不銹鋼篩網(wǎng)上，用注射器針芯研磨成細胞懸液后計數(shù)。一般免疫后脾臟體積約是正常鼠脾臟體積的２倍，細胞數(shù)為２×10８左右。

二、細胞融合，選擇雜交瘤

(一)細胞融合流程

(1)取對數(shù)生長的骨髓瘤細胞SP2／0，1000rpm離心5分鐘，棄上清，用不完全培養(yǎng)液混懸細胞后計數(shù)，取所需的細胞數(shù)，用不完全培養(yǎng)液洗滌2次。

(2)同時制備免疫脾細胞懸液，用不完全培養(yǎng)液洗滌2次。

(3)將骨髓瘤細胞與脾細胞按1∶10或1∶5的比例混合在一起，在50ml

料離心管內(nèi)用不完全培養(yǎng)液洗1次，1200rpm,8分鐘。

(4)棄上清，用滴管吸凈殘留液體，以免影響PEG的濃度。

(5)輕輕彈擊離心管底，使細胞沉淀略加松動。

(6)在室溫下融合:

① 30秒內(nèi)加入預熱的1ml45％PEG(Merek,分子量4000)含5％DMSO，邊加邊攪拌。② 作用90秒鐘，若冬天室溫較低時可延長至120秒鐘。

③ 加預熱的不完全培養(yǎng)液，終止PEG作用，每隔２分鐘分別加入

1ml，2ml，3ml，4ml，5ml和10ml。

(7)離心，800rpm，6分鐘。

(8)棄上清，先用6ml左右20％小牛血清RPMI1640輕輕混懸，切記不能用力吹打，以免使融合在一起的細胞散開。

(9)根據(jù)所用96孔培養(yǎng)板的數(shù)量，補加完全培養(yǎng)液，10ml一塊96孔板。

(10)將融合后細胞懸液加入含有飼養(yǎng)細胞的96孔板，100μl／孔，37℃、5％CO2孵箱培養(yǎng)。

一般一塊96孔板含有1×

107脾細胞。

(二)HAT選擇雜交瘤

應(yīng)用HAT 選擇培養(yǎng)液篩選雜交瘤細胞的原理已在研究生專題講座第六專題中已經(jīng)提到，這里主要介紹加HAT選擇培養(yǎng)的時間和濃度。

一般在融合24小時后，加HAT選擇培養(yǎng)液。HT和HAT均有商品化試劑50×貯存，用時1ml加入50ml20％小牛血清完全培養(yǎng)液中。

因為在培養(yǎng)板內(nèi)已加入飼養(yǎng)細胞、融合后的細胞，200μl／孔。所以在加選擇培養(yǎng)液時應(yīng)加3倍量的HAT。我們認為，融合后最初補加的量可用全量的2／3進行選擇，可得到滿意的篩選結(jié)果。

50×HAT

H: 5×10-3M

A: 2×10-5M

T: 8×10-4M

一般選擇HAT選擇培養(yǎng)液維持培養(yǎng)兩周后，改用HT培養(yǎng)液，再維持培養(yǎng)兩周，改用一般培養(yǎng)液。

三、抗體的檢測

篩選雜交瘤細胞通過選擇性培養(yǎng)而獲得雜交細胞系中，僅少數(shù)能分泌針對免疫原的特異性抗體。一般在雜交瘤細胞布滿孔底1／10面積時，即可開始檢測特異性抗體，篩選出所需要的雜交瘤細胞系。

檢測抗體的方法應(yīng)根據(jù)抗原的性質(zhì)、抗體的類型不同，選擇不同的篩選方法，一般以快

速、簡便、特異、敏感的方法為原則。

常用的方法有:

1.ELISA用于可溶性抗原(蛋白質(zhì))、細胞和病毒等McAb的檢測。

2.RIA用于可溶性抗原、細胞McAb的檢測。

FACS(熒光激活細胞分類儀)用于檢查細胞表面抗原的McAb檢測。

4.IFA用于細胞和病毒McAb的檢測。

上述方法均為一般實驗室的常規(guī)方法，故在此不介紹具體的實驗過程。

可靠的篩選方法必須在融合前建立，避免由于方法不當貽誤整個篩選時機。

四、雜交瘤的克隆化和凍存

克隆化一般是指將抗體陽性孔進行克隆化。犚r為經(jīng)過HAT篩選后的雜交瘤克隆不能保證一個孔內(nèi)只有一個克隆。在實際工作中，可能會有數(shù)個甚至更多的克隆，可能包括抗體分泌細胞、抗體非分泌細胞；所需要的抗體(特異性抗體)分泌細胞和其它無關(guān)抗體分泌細胞。要想將這些細胞彼此分開，就需要克隆化。克隆化的原則是，對于檢測抗體陽性的雜交克隆應(yīng)盡早進行克隆化，否則抗體分泌的細胞會被抗體非分泌的細胞所抑制，因為抗體非分泌細胞的生長速度比抗體分泌的細胞生長速度快，二者競爭的結(jié)果會使抗體分泌的細胞丟失。即使克隆化過的雜交瘤細胞也需要定期的再克隆，以防止雜交瘤細胞的突變或染色體丟失，從而喪失產(chǎn)生抗體的能力。

(一)克隆化方案

用克隆化的方法很多，而最常用就是有限稀釋和軟瓊脂平板法。

1.有限稀釋法的程序

① 制備飼養(yǎng)細胞懸液(同融合前準備)

② 陽性孔細胞的計數(shù)，并調(diào)細胞數(shù)在1～5×10３／ml

③ 取130個細胞放入6.5ml含飼養(yǎng)細胞完全培養(yǎng)液，即20個細胞／ml，100μl／孔加

A、B、C三排為每孔2個細胞。余下2.9ml細胞懸液補加2.9ml含飼養(yǎng)細胞的完全培養(yǎng)液,細胞數(shù)為10個／ml，100μl／孔加D、E、F三排，為每孔1個細胞。余下2.2ml細胞懸液補加2.2ml含飼養(yǎng)細胞的完全培養(yǎng)液，細胞數(shù)5個／ml，100μl／孔，加G、H

排，為每孔0.5個細胞。

④ 培養(yǎng)4～5天后，在倒置顯微鏡上可見到小的細胞克隆，補加完全培養(yǎng)液200μl／孔。

⑤ 第8～9天時，肉眼可見細胞克隆，及時進行抗體檢測。

注:初次克隆化的雜交瘤細胞需要在完全培養(yǎng)液中加HT。

2.軟瓊脂法

① 軟瓊脂的配制

含20％FCS(小牛血清)的2倍濃縮的RPMI1640

1％瓊脂水溶液：高壓滅菌，42℃預熱。

0.5％瓊脂：由

份1％瓊脂加1份含20％小牛血清的2倍濃縮的RPMI1640配制而成。置42℃保溫。

② 用上述0.5％瓊脂液(含有飼養(yǎng)細胞)15ml傾注于直徑為9cm的平皿中，在室溫中待凝固后作為基底層備用。

③ 按100／ml，500／ml或5000／ml等濃度配制需克隆的細胞懸液。

④ 1ml 0.5％瓊脂液(42℃預熱)在室溫中分別與1ml不同濃度的細胞懸液相混合。⑤ 混勻后立即傾注于瓊脂基底層上，在室溫中10分鐘，使其凝固，孵育于 37℃，5％CO2孵箱中。

⑥ 4～5天后即可見針尖大小白色克隆，7～10天后，直接移種至含飼養(yǎng)細胞的24孔

板中進行培養(yǎng)。

⑦ 檢測抗體，擴大培養(yǎng)，必要時再克隆化。

(二)雜交瘤細胞的凍存

及時凍存原始孔的雜交瘤細胞、每次克隆化得到的亞克隆細胞是十分重要的。因為在沒有建立一個穩(wěn)定分泌抗體的細胞系的時候，細胞的培養(yǎng)過程中隨時可能發(fā)生細胞的污染、分泌抗體能力的喪失等等。如果沒有原始細胞的凍存，則因為上述的意外而全功盡棄。

雜交瘤細胞的凍存方法同其他細胞系的凍存方法一樣，原則上細胞應(yīng)在每支安瓿含1×106以上，但對原始孔的雜交瘤細胞可以因培養(yǎng)環(huán)境不同而改變，在24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，當長滿孔底時，一孔就可以凍一支安瓿。

細胞凍存液:

50％小牛血清

40％不完全培養(yǎng)液

10％ DMSO(二甲亞砜)

凍存液最好預冷，操作動作輕柔、迅速。凍存時從室溫可立即降到0℃，再降溫時一般按每分鐘降溫2～3℃，待降至-70℃可放入液氮中。或細胞管降至0℃ 后放-70℃超低溫冰箱，次日轉(zhuǎn)入液氮中。也可以用細胞凍存裝置進行凍存。凍存細胞要定期復蘇，檢查細胞的活性和分泌抗體的穩(wěn)定性，在液氮中細胞可保存數(shù)年或更長時間。

五、單克隆抗體的大量生產(chǎn)

大量生產(chǎn)單克隆抗體的方法主要有兩種：

1.體外使用旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)管大量培養(yǎng)雜交瘤細胞，從上清中獲取單克隆抗體。但此方法產(chǎn)量低，一般培養(yǎng)液含量為10～60μg／ml，如果大量生產(chǎn)，費用較高。

2.體內(nèi)接種雜交瘤細胞，制備腹水或血清。

① 實體瘤法 對數(shù)生長期的雜交瘤細胞按1～3×107／ml接種于小鼠背部皮下，每處注射

.2 ml, 共2～4點。待腫瘤達到一定大小后(一般10～20天)則可采血，從血清中獲得單克隆抗體含量可達到1-10mg／ml。但采血量有限。

② 腹水的制備 常規(guī)是先腹腔注射0.5mlPristane(降植烷)或液體石臘于BaLb／c鼠，1～2周后腹腔注射1×106個雜交瘤細胞，接種細胞7～10天后可產(chǎn)生腹水，密切觀察動物的健康狀況與腹水征象，待腹水盡可能多，而小鼠頻于死亡之前，處死小鼠，用滴管將腹水吸入試管中，一般一只小鼠可獲1～10ml腹水。也可用注射器抽取腹水，可反復收集數(shù)次。腹水中單克隆抗體含量可達5-20mg/ml，這是目前最常用的方法，還可將腹水中細胞凍存起來，復蘇后轉(zhuǎn)種小鼠腹腔則產(chǎn)生腹水快、量多。

六、單克隆抗體的鑒定

對制備的McAb進行系統(tǒng)的鑒定是十分必要的。應(yīng)對其做如下方面的鑒定:

.抗體特異性的鑒定：除用免疫原(抗原)進行抗體的檢測外，還應(yīng)用與其抗原成分相關(guān)的其它抗原進行交叉試驗，方法可用ELISA、IFA法。例如①制備抗黑色素瘤細胞的McAb，除用黑色素瘤細胞反應(yīng)外，還應(yīng)用其它臟器的腫瘤細胞和正常細胞進行交叉反應(yīng)，以便挑選腫瘤特異性或腫瘤相關(guān)抗原的單克隆抗體。② 制備抗重組的細胞因子的單克隆抗體，應(yīng)首先考慮是否與表達菌株的蛋白有交叉反應(yīng)，其次是與其它細胞因子間有無交叉。

2.McAb的Ig類與亞類的鑒定：一般在用酶標或熒光素標記的第二抗體進行篩選時，已經(jīng)基本上確定了抗體的Ig類型。如果用的是酶標或熒光素標記的兔抗鼠IgG或IgM，則檢測出來的抗體一般是IgG類或IgM類。至于亞類則需要用標準抗亞類血清系統(tǒng)作雙擴或夾心ELISA來確定McAb的亞類。在作雙擴試驗時，如加入適量的PEG(3％)，將有利于沉

淀線的形成。

3.McAb中和活性的鑒定：用動物的或細胞的保護實驗來確定McAb的生物學活性。例如如果確定抗病毒McAb的中和活性，則可用抗體和病毒同時接種于易感的動物或敏感的細胞，來觀察動物或細胞是否得到抗體的保護。

4.McAb識別抗原表位的鑒定：用競爭結(jié)合試驗、測相加指數(shù)的方法，測定McAb所識別抗原位點，來確定McAb

識別的表位是否相同。

5.McAb親和力的鑒定：用ELISA或RIA競爭結(jié)合試驗來確定McAb與相應(yīng)抗原結(jié)合的親和力。

七、影響因素、失敗原因分析

由于制備McAb的實驗周期長，環(huán)節(jié)多，所以影響因素就比較多，稍不注意就會造成失敗。

其主要失敗原因和影響因素有:

1.污染：包括細菌、霉菌和支原體的污染。這是雜交瘤工作中最辣手的問題。一旦發(fā)現(xiàn)有霉菌污染就應(yīng)及早將污染板棄之，以免污染整個培養(yǎng)環(huán)境。支原體的污染主要來源于牛血清，此外，其它添加劑、實驗室工作人員及環(huán)境也可能造成支原體污染。在有條件的實驗室，要對每一批小牛血清和長期傳代培養(yǎng)的細胞系進行支原體的檢查，查出污染源應(yīng)及時采取措施處理。對于污染的雜交瘤細胞可以采取生物學的過濾方法，將污染的雜交瘤細胞注射于BALB／c小鼠的腹腔，待長出腹水或?qū)嶓w瘤時，犖^菌取出分離雜交瘤細胞，一般可除去支原體污染。

2.融合后雜交瘤不生長：在保證融合技術(shù)沒有問題的前提下主要考慮下列因素①PEG有毒性或作用時間過長。②牛血清的質(zhì)量太差，用前沒有進行嚴格的篩選。③骨髓瘤細胞污染了支原體。④HAT有問題，主要是A含量過高或HT含量不足。

3.雜交瘤細胞不分泌抗體或停止分泌抗體

① 融合后有細胞生長，但無抗體產(chǎn)生，可能是HAT中A失效或骨髓瘤細胞發(fā)生突變，變成A抵抗細胞所致。

② 有可能是免疫原抗原性弱，免疫效果不好。

③ 對于原分泌抗體的雜交瘤細胞變?yōu)殛幮?，可能是細胞支原體污染，或非抗體分泌細胞克隆競爭性生長，從而抑制了抗體分泌細胞的生長。也可能發(fā)生染色體丟失。Goding91982)曾提出“三要”“三不要”，可能是防止抗體停止分泌的有效措施。

三要:

要大量保持和補充液氮凍存的細胞原管。

要應(yīng)用倒置顯微鏡經(jīng)常檢查細胞的生長狀況。

要定期進行再克隆。

三不要:

不要讓細胞“過度生長”。因為非分泌的雜交瘤細胞將成為優(yōu)勢，壓倒分泌抗體的雜交瘤細胞。

不要讓培養(yǎng)物不加檢查地任其連續(xù)培養(yǎng)幾周或幾個月。

不要不經(jīng)克隆化而使雜交瘤在機體內(nèi)以腫瘤生長形式連續(xù)傳好幾代。

.雜交瘤細胞難以克隆化

可能與小牛血清質(zhì)量、雜交瘤細胞的活性狀態(tài)有關(guān)，或由于細胞有支原體污染，使克隆化難以成功。若是融合后的早期克隆化，應(yīng)在培養(yǎng)液加HT。

第三篇：單克隆抗體藥物綜述

單克隆抗體藥物綜述

摘 要: 通過淋巴細胞雜交瘤技術(shù)或基因工程技術(shù)制備單克隆抗體藥物 ,已經(jīng)成為生物制藥領(lǐng)域的一個重要方面 ,由于單克隆抗體藥物專一性強、療效顯著 ,因此成為近年來研究的熱點藥物之一。此文就單抗藥物的分類、應(yīng)用進行了綜述 ,并對其應(yīng)用前景及存在的不足作了概述。

關(guān)鍵詞:單克隆抗體 抗體藥物 靶向 聯(lián)用

自 1975 年Koeh ler 和M ilstein 首先報道利用小鼠雜交瘤細胞制備單克隆抗體以來, 經(jīng)過近30 年的發(fā)展, 單抗技術(shù)在生命科學研究及醫(yī)學實踐方面作出了杰出的貢獻, 已經(jīng)成為了現(xiàn)代生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的支柱之一。

然而, 盡管單抗推動了生物診斷技術(shù)的革命, 但是在將單抗應(yīng)用于人體疾病的治療方面, 卻在長時間內(nèi)遲遲沒有進展。早期的臨床試驗結(jié)果都不盡人意, 這是因為鼠源單抗應(yīng)用于人體有許多限制].現(xiàn)今上市的單抗藥物, 治療的領(lǐng)域主要集中在腫瘤、自身免疫疾病、器官移植排斥及病毒感染等領(lǐng)域。由于單抗具有明確的作用位點, 與靶位點親和力高, 而且通過改造的抗體其免疫原性大大減弱, 這些因素使得單抗在臨床治療中具有特異性強、見效快、副作用較低等優(yōu)點, 因而單抗治療有著廣闊的前景。目前, FDA 批準上市的 17 個單抗藥物中即有 8 個是用于治療淋巴細胞腫瘤、乳腺癌及結(jié)直腸癌等, 而在開發(fā)階段的單抗也有一半以上是與治療各種癌癥相關(guān)?？梢灶A見, 在未來幾年來將有更多的治療性單抗藥物上市, 其市場份額將進一步擴大。

目前, 單抗類藥物的市場銷售逐年提升的年均增長幅度在20%以上, 表現(xiàn)強勁。用于治療非霍奇金淋巴瘤的單抗藥物R ituxan 已成為世界第一的抗腫瘤藥物, 2003 年銷售為 14.89億美元, 2002 年為 11.63 億美元, 在 2002 年全球最暢銷前 50位商標名處方藥中排名 43 位。用于治療關(guān)節(jié)炎的單抗藥物Rem icade, 2002 年銷售額為 12.97 億美元, 當年全球藥物銷售排名第 37 位。2000 年世界單抗藥物的銷售額為 22.05 億美元, 據(jù)F ro st&Sullivan 預測, 到 2003 年銷售額將達到 47 億美元。

下面就單克隆抗體藥物的研究進展作一綜述。

1單克隆抗體藥物的分類

單抗藥物一般分為:治療疾病(尤其是腫瘤)的單抗藥劑、抗腫瘤單抗偶聯(lián)物、治療其他疾病的單抗。單抗藥劑針對的靶點通常為細胞表面的疾病相關(guān)抗原或特定的受體。如:最早被美國 FDA批準用于治療腫瘤的單抗藥物利妥昔單抗;抗腫瘤單抗偶聯(lián)物 ,或稱免疫偶聯(lián)物(Immunoconjugate), 由單抗與有治療作用的物質(zhì)(如:放射性核素、毒素和藥物等)兩部分構(gòu)成 ,其中包括放射免疫偶聯(lián)物、免疫毒素、化學免疫偶聯(lián)物 ,此外還有酶結(jié)合單抗偶聯(lián)物、光敏劑結(jié)合單抗偶聯(lián)物等。

2作為腫瘤治療藥劑的單克隆抗體藥物

表1概括了近年來美國 FDA 批準上市的 5 個治療腫瘤的單克隆抗體藥物的基本情況 ,下面具體加以介紹。

2.1利妥昔單抗 在自身免疫性疾病形成過程中 ,B 細胞起重要作用。CD20是前B細胞向成熟淋巴細胞分化過程中表達的表面抗原 ,參與調(diào)節(jié)B細胞的生長和分化。利妥昔單抗(美羅華)是一種針對 CD20抗原的人鼠嵌合型單克隆抗體 ,是第一個被FDA批準用于臨床治療的單抗。進入人體后可與 CD20 特異性結(jié)合導致 B 細胞溶解 ,從而抑制 B 細胞增殖 ,誘導成熟 B細胞凋亡 ,但不影響原始B細胞。它能通過介導抗體依賴的細胞毒性(ADCC)、補體依賴的細胞毒性(CDC)作用和抗體與CD20分子結(jié)合引起的直接效應(yīng) ,包括抑制細胞生長 ,改變細胞周期以及凋亡等方式殺死淋巴瘤細胞[1 ]。

由于利妥昔單抗藥物可以提高腫瘤細胞對化療的敏感性 ,所以利妥昔單抗藥物的優(yōu)勢就在于與其他治療藥物及治療方式配合使用。臨床研究表明美羅華單藥或聯(lián)合化療治療腫瘤具有良好的療效和安全性 ,但還是存在一定的毒副作用。夏忠軍等[2 ]進行的臨床研究:34例確診惰性淋巴瘤的患者接受含利妥昔的方案化療 ,結(jié)果總有效率為 92.3 % ,完全緩解率為60.0 %。主要不良反應(yīng)為骨髓抑制 ,其它不良反應(yīng)包括惡心嘔吐、輕度脫發(fā)和肝功能受損等。張曉艷等[3 ]對 4例 CD20陽性非霍奇金淋巴瘤(NHL)病人進行了5次利妥昔單抗聯(lián)合自體外周血干細胞移植(APBSCT)的治療研究 ,結(jié)果顯示所有病人均對利妥昔單抗耐受良好 ,植入后在 8～11 d內(nèi)達造血重建 ,表明利妥昔單抗聯(lián)合APBSCT治療 CD20陽性NHL 是一種耐受及效果良好的方法。

2.2曲妥珠單抗

曲妥珠單抗為一種針對 HER22/ neu的重組人源化 IgG單克隆抗體 ,能特異性識別 Her22調(diào)控的細胞表面蛋白 HER22 ,使其通過內(nèi)吞噬作用離開胞膜進入核體內(nèi) ,抑制其介導的信號轉(zhuǎn)導 ,從而起到治療腫瘤的作用。美國 FDA 于 1999 年批準其上市 ,2002年在我國上市。大量臨床資料證實曲妥珠單用于乳腺癌的有效率為21 % ,而且它與化療聯(lián)合應(yīng)用明顯提高了生存時間[4 ]。據(jù)報道 ,歐洲曲妥珠單抗輔助治療試驗研究了曲妥珠單抗對 HER22 陽性伴有或不伴有淋巴結(jié)陽性的乳腺癌患者的療效 ,其中 1 組給予 1 年的曲妥珠單抗治療 ,另1組作為對照。曲妥珠單抗治療 1 年組與對照組相比 ,復發(fā)風險減少了46 % ,兩組的整體生存率無明顯區(qū)別 ,說明曲妥珠單抗用于治療輔助化療后的 HER22陽性乳腺癌患者 ,明顯延長了患者的無病生存期[5 ]。我國也對曲妥珠進行了臨床研究 ,沈坤煒等[6 ]對 42 例 Ⅱ～ ⅢA期浸潤性乳腺癌患者紫杉醇聯(lián)合曲妥珠單抗治療 24 周 ,結(jié)果單用新輔助化療組完全緩解率為 26.3 % ,在新輔助化療聯(lián)用曲妥珠單抗組為65.2 % ,可見 ,對于 HER22 過表達的乳腺癌化療聯(lián)用曲妥珠單抗能顯著提高完全緩解率。

2.3阿倫珠單抗 阿倫珠單抗是人源化、非結(jié)合型單抗 ,作用靶點為正常與異常B淋巴細胞的 CD52 抗原 ,CD52 廣泛分布于正常的 B淋巴細胞、T淋巴細胞、單核細胞、巨噬細胞和B 淋巴細胞及T淋巴細胞瘤細胞表面 ,在慢性淋巴細胞白血病細胞表面尤為豐富。它與帶 CD52 的靶細胞結(jié)合后 ,通過宿主效應(yīng)子的補體依賴性細胞毒性(CDC)、抗體依賴性細胞毒性(ADCC)和細胞凋亡等機制導致細胞死亡。阿倫珠單抗作為一種作用機制獨特的單克隆抗體 ,對源于B和 T細胞的各種惡性腫瘤具有很好的治療作用。

英國科學家應(yīng)用阿倫珠單抗和利妥昔單抗治療復發(fā)性淋巴瘤患者 ,結(jié)果總反應(yīng)率為 52 % ,其中完全緩解 8 % ,表明聯(lián)合使用阿倫珠單抗和利妥昔單抗是安全可行的。在其它 T細胞惡性腫瘤的治療中:對 22 例 Ⅲ～ Ⅳ期皮膚 T細胞淋巴瘤(蕈樣肉芽腫病和 Sezary綜合征)患者靜脈輸注阿倫珠 12周 ,結(jié)果顯示阿倫珠具有非常好的療效 ,總有效率達 55 %。其中 ,紅皮病患者總有效率達 69 % ,片狀斑或皮膚腫瘤患者達40 %[7 ]。阿倫珠單抗聯(lián)合其他藥物、化療等治療腫瘤具有顯著的效果。但臨床研究表明 ,其還存在一些常見并發(fā)癥 ,如低血壓、寒顫、發(fā)熱、惡心、嘔吐、氣短、支氣管痙攣、皮疹、疲乏、呼吸困難、頭痛、腹瀉、感染等。2.4西妥昔單抗

西妥昔單抗為 IgG 1 單克隆抗體 ,是表皮生長因子受體拮抗劑 ,可與表達于正常細胞和多種腫瘤細胞表面的表皮生長因子受體(EGFR)特異性結(jié)合 ,并競爭性阻斷 EGF和其他配體 ,如α 2轉(zhuǎn)化生長因子(TGF 2 α)的結(jié)合。它通過增加細胞周期抑制因子 p27kip 使得細胞周期停留在 G 1 期;增加 Bax表達和減少 bcl22表達 ,誘導癌細胞的凋亡;它還可減少基質(zhì)金屬蛋白酶和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的產(chǎn)生。相關(guān)實驗表明 ,西妥昔單抗可抑制過度表達 EGFR的腫瘤細胞的增殖 ,但是對缺乏 EGFR表達的腫瘤細胞則沒有抗腫瘤效果 ,還發(fā)現(xiàn)西妥昔與化療聯(lián)用要優(yōu)于單獨化療[8 ]。

在對西妥昔單抗聯(lián)合化療的研究中 ,BOAD 試驗最為著名。576例晚期結(jié)直腸癌(ACRC)患者中 82 %的 EGFR 過表達。治療采取兩個方案 ,第1組用西妥昔單抗聯(lián)合伊立替康治療;第2組單獨用西妥昔單抗單藥治療。西妥昔單抗聯(lián)合伊立替康與單用西妥昔單抗相比 ,聯(lián)用療效優(yōu)于單一使用 ,有效率分別為23 %和11 % ,疾病控制率為 56 %和 32 % ,疾病進展中位時間為4.1和1.5個月 ,中位生存時間為8.6和6.9個月 ,而且西妥昔單抗并沒有增加化療的副作用。以上臨床實驗顯示:西妥昔單抗能夠克服 ACRC患者對伊立替康的耐藥性 ,生存質(zhì)量明顯提高[9 ]。西妥昔單抗的毒副作用包括:痤瘡樣皮疹、虛弱、腹痛、惡心、嘔吐、白細胞減少和過敏反應(yīng)等。其中痤瘡樣皮疹是最常見的不良反應(yīng) ,皮疹主要分布在臉部和軀干上部 ,這可能是由于西妥昔單抗干擾了 EGF的表皮生理作用所致[10 ]。

2.5貝伐單抗

貝伐單抗是抗VEGF的人源化單抗 ,主要通過中和VEGF來阻斷其與內(nèi)皮細胞上的受體結(jié)合 ,使得腫瘤細胞不能得到養(yǎng)分和氧 ,起到治療腫瘤的作用。Presta 等[11 ]將鼠抗人VEGF單克隆抗體(muMAB VEGF)A.4.6.1 的互補決定區(qū)與人 IgG 1的恒定區(qū)框架嵌合 ,并對相應(yīng)氨基酸殘基加以修飾 ,最終形成了人鼠嵌合型 VEGF單抗 ,仍然有 7 %的氨基酸來源于鼠抗體。實驗表明 ,貝伐單抗用于治療腫瘤安全有效。鄭航等[12 ]探究貝伐單抗聯(lián)合伊立替康治療轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌的療效 ,90例患者中給予貝伐單抗聯(lián)合伊立替康治療的一組有效率為43.3 % ,血清腫瘤標志物的濃度治療前后有顯著變化。這說明貝伐聯(lián)合伊立替康治療轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌具有更高的疾病控制率。2005 年美國臨床腫瘤學會年會上報道了貝伐單抗的最新研究結(jié)果 ,采用貝伐單抗聯(lián)合伊立替康和順鉑一線治療轉(zhuǎn)移性胃癌或者胃食管連接部腺癌的患者 ,治療的不良反應(yīng)除了原有伊立替康和順鉑引起的腎髓抑制、胃腸道反應(yīng)等 ,還有貝伐單抗造成的不良反應(yīng)包括栓塞性疾病、胃穿孔等。

3抗腫瘤單抗偶聯(lián)物

3.1放射免疫偶聯(lián)物

放射免疫治療(RIT)是以單克隆抗體為載體 ,以放射性核素為彈頭 ,通過抗體特異性結(jié)合腫瘤細胞相關(guān)抗原 ,將產(chǎn)生高能射線的放射性核素靶向到腫瘤細胞 ,實現(xiàn)對腫瘤的近距離內(nèi)照射治療。RIT利用攜帶放射性核素的單克隆抗體特異地結(jié)合到病灶部位 ,減少了對正常組織的損傷。90Y— ibri2tumomab是第1個被 FDA批準應(yīng)用于臨床的放射免疫制劑 ,主要用于復發(fā)的淋巴瘤患者或?qū)为殤?yīng)用利妥昔單抗療效不佳的患者。

3.2免疫毒素

免疫毒素是用化學方法或基因工程方法將腫瘤選擇性單抗與經(jīng)修飾的多肽毒素共價連接而成的腫瘤治療藥物。免疫毒素可與腫瘤細胞表面受體或與細胞表面的靶抗原相結(jié)合后內(nèi)化 ,繼而在胞內(nèi)抑制細胞蛋白質(zhì)合成 ,導致腫瘤細胞死亡。毒素有很多種 ,如植物毒素、細菌毒素、動物毒素 , 其中引用最廣泛的是植物毒素中的白喉毒素。美國 FDA已經(jīng)批準了白喉毒素與白細胞介素 2 重組的免疫毒素 ONTAK(DAB3892I L2),用于治療人皮膚 T細胞淋巴瘤[13214 ]。

3.3化學免疫偶聯(lián)物 單抗是藥物良好的靶向性載體 ,通過藥物分子上特殊的功能基團如:羥基、巰基、氨基等 ,將治療藥物與單抗相連接而組成化學免疫偶聯(lián)物 ,避免了藥物對其他正常組織的毒害作用,選擇性地發(fā)揮治療作用。常與單抗進行偶聯(lián)的藥物有阿霉素、柔紅霉素、平陽霉素、博安霉素、絲裂霉素、新制癌菌素、氨甲喋呤等。

4單克隆抗體在其他疾病中的應(yīng)用 單克隆抗體藥物不只在腫瘤的治療中取得了很好療效 ,在其他疾病的治療中也取得了一些療效 ,例如:奧馬珠單抗(omalizumab)通過與游離 IgE結(jié)合而顯著降低游離 IgE的水平,阻斷 IgE與肥大細胞、嗜堿粒細胞結(jié)合 ,防止炎癥介質(zhì)的釋放?？娠@著改善哮喘病人的癥狀、肺功能及生活質(zhì)量 ,減少哮喘惡化的發(fā)作次數(shù) ,減少糖皮質(zhì)激素的用量 ,使用安全 ,具有很好的耐受性[15 ]。Mab03.2C1C2 在體外能抑制白念珠菌芽管的形成 ,從而抑制白念珠菌對上皮細胞、內(nèi)皮細胞的粘附 ,降低白念珠菌的侵襲力。利妥昔單抗對類風濕和系統(tǒng)性紅斑狼瘡也有很好的治療作用。英夫利昔單抗對類風濕性關(guān)節(jié)炎患者疼痛、晨僵、關(guān)節(jié)腫脹等臨床癥狀減輕程度就可達60 %。另有研究顯示 ,輸注英夫利昔單抗可快速、顯著緩解頑固性銀屑病、關(guān)節(jié)炎病人的關(guān)節(jié)和皮損癥狀[16 ]。英利昔單抗對克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎、酒精性肝病等消化系統(tǒng)疾病都有較好療效 ,且在推薦的治療范圍內(nèi)安全性良好[17 ]。

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第四篇：美成功用雞生產(chǎn)全功能人單克隆抗體

美成功用雞生產(chǎn)全功能人單克隆抗體

美國奧利基因（Origen）治療公司今天宣布，他們首次用雞蛋生產(chǎn)出全功能人單克隆抗體。這種抗體僅在雞輸卵管中表達，并以每枚雞蛋產(chǎn)出1至3毫克的抗體沉淀在蛋白里，同用傳統(tǒng)細胞培養(yǎng)方法產(chǎn)生的治療用抗體相比，用這種新方法生產(chǎn)的抗體，有比傳統(tǒng)方法生產(chǎn)抗體大10至100倍的殺滅癌細胞能力。

為了培育生產(chǎn)抗體的雞，研究人員首先在雞胚胎干細胞中插入為抗體編碼的基因，然后該干細胞被導入雞胚胎內(nèi)。在發(fā)育階段，胚胎干細胞對正在成長的雞起著極大的作用。所產(chǎn)生的混種雞下的蛋包含毫克數(shù)量的抗體，將這些抗體同蛋白的蛋白質(zhì)分離，即產(chǎn)生被提純的單克隆抗體。

奧利基因公司副總裁埃特喬斯說：“用這種方法生產(chǎn)出的抗體與用細胞培養(yǎng)法生產(chǎn)的抗體有極類似的物理和生物學特性。此外，雞體內(nèi)產(chǎn)生的抗體沒有糖殘余物———巖藻糖，因此具有增強殺滅癌細胞的活力。目前，美政府已批準25種以上的單克隆抗體用于臨床治療。我們預期對抗癌單克隆抗體會有更多需求，用現(xiàn)有的細胞培育法不僅遠遠不能滿足需求，也不利于降低成本，采用以雞為基礎(chǔ)的生產(chǎn)技術(shù)，將會實現(xiàn)工業(yè)化大量生產(chǎn)治療用抗體?！?/p>

該公司總裁羅伯特?凱說：“我們相信，同植物系統(tǒng)或其它轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)單克隆抗體系統(tǒng)相比，用雞生產(chǎn)單克隆抗體是最有效的方法。用雞蛋生產(chǎn)抗體所需鑒別時間可短至8個月，而用山羊或牛來生產(chǎn)單克隆抗體的鑒別時間則需18個月至3年。此外，雞蛋是無菌和穩(wěn)定的，對分離和提純感興趣的蛋白質(zhì)來說，它提供了良好的起始材料。

這項研究得到了美國家衛(wèi)生研究院的資助，研究成果發(fā)表在9月期《自然生物技術(shù)》雜志上，并在9月期《自然醫(yī)學》上發(fā)表對這一新技術(shù)的評論。

第五篇：單克隆抗體藥物概述

單克隆抗體藥物概述

高熹

（2015級 交流學院 生物技術(shù) 168615140001）

摘要：單克隆抗體藥物作為一種具有獨特優(yōu)勢的生物靶向藥物，具有特異性高、靶向性強和毒副作用低的特點，在治療方面效果顯著。伴隨著抗體技術(shù)的不斷發(fā)展以及新型抗體的不斷出現(xiàn)，單克隆抗體藥物已成為制藥業(yè)發(fā)展最快的領(lǐng)域之一，目前正在研究的生物技術(shù)藥物中有四分之一都是單克隆抗體藥物，期間又涌現(xiàn)出了各種單抗衍生物，包括抗體藥物偶聯(lián)物、小分子抗體、雙特異性抗體等。本文就單克隆抗體藥物的分類、制備、應(yīng)用和發(fā)展等進行綜述。關(guān)鍵詞：單克隆抗體藥物；抗體技術(shù)；單抗衍生物

1975年分子生物學家G.J.F.克勒和C.米爾斯坦在自然雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上，創(chuàng)建立雜交瘤技術(shù)，他們把可在體外培養(yǎng)和大量增殖的小鼠骨髓瘤細胞與經(jīng)抗原免疫后的純系小鼠B細胞融合，成為雜交細胞系，既具有瘤細胞易于在體外無限增殖的特性，又具有抗體形成細胞的合成和分泌特異性抗體的特點。將這種雜交瘤作單個細胞培養(yǎng)，可形成單細胞系，即單克隆。雜交瘤技術(shù)為規(guī)模化生產(chǎn)特異性高、結(jié)構(gòu)和性質(zhì)均一穩(wěn)定的單克隆抗體提空了有力的保障。單克隆抗體藥物的發(fā)展和現(xiàn)狀

1986年，F(xiàn)DA批準了第一個鼠源單克隆抗體藥物Muromonab-CD3上市，用于預防腎移植時急性器官排斥。單克隆抗體藥物的發(fā)展因人抗鼠抗體反應(yīng)在1988年到1993年間陷入低谷。之后隨著重組DNA技術(shù)的發(fā)展，各種抗體人緣化技術(shù)迅速發(fā)展，單克隆抗體藥物經(jīng)歷了人鼠嵌合單抗、人源化單抗階段。隨后出現(xiàn)的噬菌體展示文庫技術(shù)和轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)，使全人源單抗的產(chǎn)生成為可能。過去的30年抗體工程的研究主要集中于減弱鼠源抗體的免疫原性和提高產(chǎn)生抗體的能力，如今全人源抗體已成為治療性單抗的主流，2002年第一個全人源抗體阿達木單抗上市。且隨著微生物和哺乳動物細胞等外源蛋白表達系統(tǒng)的技術(shù)進步和表達水平的提高，使治療性單克隆抗體在臨床和商業(yè)上都取得了巨大的成功。盡管如此，單克隆抗體藥物的發(fā)展仍然存在許多挑戰(zhàn)。迄今為止，大多數(shù)FDA 批準上市的單抗藥物都是未經(jīng)修飾的全長抗體，這是相對分子質(zhì)量在150×103左右的大蛋白分子，這些抗體藥物在臨床應(yīng)用取得巨大成功的同時，本身的局限性也得到越來越多的關(guān)注[1]?，F(xiàn)如今，單抗藥物經(jīng)歷了市場和時間的考驗，已經(jīng)成為生物醫(yī)藥的最重要組成部分，在疾病治療上具有廣闊的應(yīng)用前景，成功用于治療腫瘤、自身免疫性疾病、感染性疾病和移植排斥反應(yīng)等多種疾病。治療性單抗的安全性和有效性很大程度上由其作用的靶點決定，上市和在研的單抗藥物有些靶向相同的靶點，有些有自己獨特的作用靶點，新的作用靶點也在不斷地出現(xiàn)。隨著研究深入、技術(shù)進步，單抗藥物呈現(xiàn)出旺盛的發(fā)展勢頭[2]。

隨著已上市品種的銷售額不斷增長以及新適應(yīng)癥的批準和新品種的上市，單克隆抗體藥物市場容量迅速攀升。1997-2007年是全球單抗產(chǎn)業(yè)增長的爆發(fā)期，十年間CAGR高達58.6%。2008年-2015年，全球單抗產(chǎn)業(yè)增速放緩明顯，CAGR降至14.8%，但仍要顯著高于全球醫(yī)藥行業(yè)約5%的增速水平。1997年全球單抗藥物銷售額僅3.7億美元，2015年全球單抗藥物的銷售額已超過980億美元。1992-2015 年間，國外共批準上市了61個原研抗體藥，其中后有6個退市。在現(xiàn)有上市的55個產(chǎn)品（49個單抗產(chǎn)品，6個具有抗體功能的受體-Fc融合蛋白）中，51個是由美國或歐盟首先批準上市的，數(shù)量占比高達 92.7%，生產(chǎn)企業(yè)方面：羅氏、諾華等10家歐美企業(yè)共開發(fā)和生產(chǎn)了全球70%以上的抗體藥物，歐美國家在全球抗體產(chǎn)業(yè)中居于絕對主導地位。2015年全球最暢銷藥物TOP 10中有5個單抗，分別是阿達木單抗、英夫利昔單抗、利妥昔單抗、貝伐珠單抗和曲妥珠單抗，它們占據(jù)了單抗藥物的半壁江山，銷售額約為426.6億美元，約占2015年全球單克隆抗體藥物總銷售額的44%。根據(jù)預測，2016-2020 年，全球單抗產(chǎn)業(yè)仍將以9.84%的RAGR快速發(fā)展（同期全球藥品市場CAGR約為 5%），2020年市場規(guī)模有望突破1300億美元。

相比處于上升期的國外單抗產(chǎn)業(yè)，我國單抗產(chǎn)業(yè)仍處于初創(chuàng)期，單抗藥物仍以仿制為主，單抗藥物無論產(chǎn)品種類和銷售規(guī)模都遠低于歐美發(fā)達國家，并且進口單抗藥物占據(jù)了主要市場。2015年中國單抗藥物市場容量約為70多億元人民幣，約80%的市場被外資制藥企業(yè)占據(jù)。在單抗藥物領(lǐng)域，國內(nèi)制藥企業(yè)面臨市場快速增長和進口替代的雙重機遇。單克隆抗體研究已被列入863計劃和國家重點攻關(guān)項目。十三五期間，生物產(chǎn)業(yè)將是國家重點支持的戰(zhàn)略性新興產(chǎn)業(yè)。單抗藥物的研究、開發(fā)和市場應(yīng)用必將吸引一大批制藥企業(yè)的參與和布局。目前全國有100多家企業(yè)在做單抗，除了中信國健、百泰生物、海正藥業(yè)等一些老牌企業(yè)之外，近幾年還涌現(xiàn)出了很多新興企業(yè)，包括麗珠單抗、信達生物等。在2016三生制藥集團媒體開放日活動上，三生制藥集團董事長婁競博士表示三生制藥集團的3萬升生產(chǎn)線建成后將成為中國規(guī)模最大的單克隆抗體生產(chǎn)線，也是從細胞系、培養(yǎng)基、原液到制劑（多種劑型和規(guī)格）的全球最完整生產(chǎn)線之一。單克隆抗體藥物分類

根據(jù)來源的不同.單克隆抗體大體可分為4類,即鼠源化單克隆抗體、人鼠嵌

[3]合體單克隆抗體、人源化單克隆抗體、全人源化單克隆抗體，這也是單克隆抗體發(fā)展的四個重要的階段。2.1 鼠源化單克隆抗體

人用鼠源單抗的生產(chǎn)方法一般分為體內(nèi)法和體外法2種。2.1.1 體內(nèi)法

體內(nèi)法即腹水法。盡管腹水中抗體濃度比較高(2-10mg/ml),但由于所用的BALB/c小鼠必須達到SPF級,繁殖、飼養(yǎng)BALB/c小鼠及生產(chǎn)腹水、純化抗體的廠房必須符合GMP要求,WHO及我國對體內(nèi)法生產(chǎn)的人用鼠源單克隆抗體的質(zhì)檢項目繁多,要求嚴格,因此限制了體內(nèi)法在人用鼠源單抗生產(chǎn)領(lǐng)域的應(yīng)用。2.1.2體外法

體外法(雜交瘤細胞體外培養(yǎng)法)的產(chǎn)品純度高,可以避免鼠類病毒的污染,簡化質(zhì)檢項目,操作具有可控制性,適用于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn),因此是人用鼠源單抗生產(chǎn)方式的主要發(fā)展方向[4]。體外法的制備流程也基本相同，即從超免疫的供體中即抗原免疫的小鼠獲取脾細胞，選育出非分泌免疫球蛋白缺陷型的骨髓瘤細胞，待細胞融合后，對單個細胞進行克隆，體外培養(yǎng)出能分泌單抗的克隆細胞。

但鼠源單抗在臨床應(yīng)用方面存在著很大的弊端，主要是鼠源單抗與NK等免疫細胞表面Fc段受體親和力弱，產(chǎn)生的抗體依賴性細胞介導的細胞毒作用（ADCC）較弱，而且它與補體成分結(jié)合能力低，對腫瘤細胞的殺傷能力較弱，并且鼠源性抗體分子質(zhì)量較大,在人血循環(huán)中的半衰期短，在體內(nèi)穿透血管的能力較差;它發(fā)揮ADCC作用的時間較短；其次鼠單克隆抗體還具有免疫原性，易引起宿主過敏反應(yīng)[5]，產(chǎn)生人抗鼠抗體(HAMAs)，將其清除出體外，因此限制了它的應(yīng)用。2.2 人鼠嵌合單克隆抗體

抗體分子由兩個相同的輕鏈和兩個相同的重鏈組成，具有典型的功能區(qū)結(jié)構(gòu)，其與抗原的結(jié)合完全取決于氨基端的可變區(qū)。恒定區(qū)與抗體抗原結(jié)合無關(guān)，并且恒定區(qū)是抗體分子免疫原性的主要部位，因此可通過用人的恒定區(qū)取代鼠單抗的恒定區(qū)進行人源化，消除其大部分異源性，并能保留親本鼠單抗結(jié)合抗原的特異性和親和力，這種方法得益于DNA重組技術(shù)的發(fā)展。1984年首次應(yīng)用上述方法重組制備了抗半抗原磷酸膽堿的全分子人鼠嵌合抗體[6]。

嵌合抗體可將同一個可變區(qū)與不同類別的恒定區(qū)鏈接在一起，比較在相同特異性情況下不同類別的功能。其制備過程主要包括了可變區(qū)的克隆，表達載體的構(gòu)建及嵌合抗體的表達?？勺儏^(qū)基因的克隆在早期主要從雜交瘤細胞的基因組文庫中克隆出來帶有完整上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列的輕重鏈可變基因DNA片段，組裝到含有人恒定區(qū)的表達載體中。PCR方法的建立和發(fā)展為抗體可變區(qū)基因的克隆提供了簡便有效的方法。接著將控制小鼠抗體重鏈和輕鏈中可變區(qū)的基因片段與人抗體重鏈及輕鏈的不變區(qū)的基因片段在體外鏈接形成重組基因，然后導入真核細胞的某種表達質(zhì)粒中，再將這種含有重組基因的表達載體轉(zhuǎn)化哺乳動物骨髓瘤細胞，篩選能分泌完整抗體的轉(zhuǎn)化子。但嵌合抗體仍保留著30%左右的鼠源序列，并且其常達不到預期的效果。

嵌合抗體目前主要有3種應(yīng)用形式：嵌合免疫球蛋白G、嵌合Fab和嵌合,F（ab’）2。嵌合免疫球蛋白G因含有人抗體的Fc段，能介導補體及細胞對靶抗原的殺傷和吞噬作用，但因鼠源性成分較多，免疫原性大且組織穿透力差[7]；嵌合 Fab 和嵌合F（ab’）2抗體分子小、穿透力強，可充當小分子載體用于放射免疫顯像及放射免疫治療。2.3 人源化單克隆抗體

由于鼠源抗體的可變區(qū)仍殘留一定的免疫原性人緣化單克隆抗體又較嵌合抗體有所改進。由于鼠源性抗體可變區(qū)中的骨架區(qū)仍殘留一定的免疫原性，為了最大限度地減少鼠源成分，用人骨架區(qū)替代鼠骨架區(qū)可形成更為完全的人源化抗體，即在此抗體中除了CDR是鼠源以外，其余全部是人源結(jié)構(gòu)。這一類型的抗體被稱為CDR移植抗體或改型抗體，包括完全CDR移植抗體、部分CDR移植抗體和特異決定區(qū)（SDR）移植抗體[8]。2.3.1 完全CDR移植抗體

完全CDR移植抗體由于鼠源性抗體VR中的骨架區(qū)仍殘留一定的免疫原性，為最大限度的減少鼠源成分，用人FR替代鼠FR可形成更為完全的人源化抗體，即在此抗體中除了３個CDR是鼠源以外，其余全部是人源結(jié)構(gòu)，這一類型的抗體稱為CDR移植抗體或改型抗體。應(yīng)用這一策略，將鼠源McAb的CDR區(qū)完全移植，得到了抗磷脂酰肌醇（蛋白）聚糖嵌合抗體。但隨后多項研究發(fā)現(xiàn)，簡單的CDR移植往往明顯降低抗原－抗體反應(yīng)的親和力，甚至喪失與抗原結(jié)合的能力。其原因在于FR不僅作為骨架對CDR起到支持作用，F(xiàn)R中的某些非CDR區(qū)補充調(diào)控殘基還為CDR的回折構(gòu)象提供必要的支持，其形狀和側(cè)鏈大小協(xié)同決定CDR的基本結(jié)構(gòu)，影響CDR與抗原結(jié)合的特異性和親和力[9-10]。2.3.2 部分CDR移植抗體

在簡單CDR移植的基礎(chǔ)上又相繼發(fā)展了部分CDR移植技術(shù)。研究發(fā)現(xiàn)輕鏈的 CDR1、CDR2和重鏈的CDR3對保證抗體與抗原特異性結(jié)合至關(guān)重要，其余三個CDR的作用則較低[11]。因此只將抗體結(jié)合抗原必須的CDR移植到人抗體的FR骨架上即能獲得對人免疫原性更小的嵌合抗體，這類抗體稱為部分CDR移植抗體。2.3.3 特異決定區(qū)移植抗體

正如并非所有的CDR在抗原抗體反應(yīng)中具有同樣的重要作用，X射線晶體衍射實驗提示具體到一個CDR中,不是所有的蛋白分子都參與抗原的特異性識別。執(zhí)行抗原識別的CDR中的一些特定區(qū)域稱為SDR。由此又產(chǎn)生了SDR移植抗體。該抗體是將McAb中與抗原結(jié)合密切相關(guān)的SDR等少數(shù)殘基移植到人抗體的相關(guān)部位，從而進一步提高抗體的人源化水平。根據(jù)目前的研究，抗體輕鏈的SDR多位于27d、34、50、55、89、96位殘基，而重鏈的SDR多位于31、35b、50、58、95、101位殘基[12]?；谏鲜鰞煞N策略，部分CDR移植、SDR移植的構(gòu)建方法主要有：（1）模板替換，使用與鼠對應(yīng)部分有較大同源性的人FR替換鼠FR；（2）表面重塑，對鼠 CDR和FR表面殘基進行鑲飾或重塑，使其具有類似于人抗體CDR的輪廓或人FR的形式；（3）補償變換，對起關(guān)鍵作用的殘基進行改變以補償完全的CDR移植；（4）定位保留，人源化McAb以人FR保守序列為模板，但保留了鼠源McAb VR中參與抗原結(jié)合的氨基酸殘基，包括CDR和FR中的一些關(guān)鍵殘基。

2.4 全人源單克隆抗體

由于免疫原性的存在，人們一直在努力制備全人源化的單克隆抗體，目前主要有抗體庫技術(shù)和人源性抗體轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)兩種。2.4.1 抗體庫技術(shù)

抗體庫技術(shù)的主導思想是將某種動物的所有抗體可變區(qū)基因克隆在質(zhì)粒或噬菌體中表達，利用不同的抗原篩選出攜帶特異抗體基因的克隆，從而獲得相應(yīng)的特異性抗體。抗體庫技術(shù)不僅可以模擬動物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體的過程，還具有許多獨特的優(yōu)點，令雜交瘤技術(shù)難以相比。抗體庫技術(shù)無需免疫，從理論上講，106-108的庫容就可能包容所有的抗體。利用抗原即可直接從非免疫動物抗體庫中篩選出特異性抗體，?并能篩選到針對該物種自身抗原的抗體。從人的抗體庫中可以得到完全是人源的McAb，?克服了難以用雜交瘤技術(shù)獲得人源McAb的障礙。此外，由于細菌細胞增殖快，培養(yǎng)成本低廉，利于大量制備高純度抗體?？贵w庫技術(shù)主要包括了噬菌體抗體庫和核糖體展示技術(shù)。

噬菌體抗體庫技術(shù)：從免疫或未被免疫的B細胞中分離抗體可變區(qū)基因;PCR 擴增抗體全套基因片段(如VH、VL)，將體外擴增的VH、VL基因片段隨機克隆入相應(yīng)載體,形成組合文庫;將基因組合文庫插入噬菌體編碼膜蛋白的基因Ⅲ(g3)或基因Ⅷ(g8)的先導系列的緊靠下游，使外源基因表達的多肽以融合蛋白的形式展示在外殼蛋白gpⅢ或gpⅧ的N端。用固相化抗原經(jīng)“親和結(jié)合—洗脫—擴增”數(shù)個循環(huán)直接、方便、簡捷、高效地篩選出表達特異性好、親和力強的抗體噬菌體庫。

核糖體展示技術(shù)：將基因型和表型聯(lián)系在一起，編碼蛋白的DNA在體外進行轉(zhuǎn)錄與翻譯，由于對DNA進行了特殊的加工與修飾，如去掉3′末端終止密碼子，核糖體翻譯到mRNA末端時，由于缺乏終止密碼子，停留在mRNA 的3′末端不脫離，從而形成蛋白質(zhì)-核糖-2mRNA三聚體，將目標蛋白特異性的配基固相化，如：固定在ELISA 微孔或磁珠表面，含有目標蛋白的核糖體三聚體就可在ELISA 板孔中或磁珠上被篩選出，對篩選分離得到的復合物進行分解，釋放出的mRNA 進行逆轉(zhuǎn)錄酶鏈聚合反應(yīng)(RT-PCR)，PCR產(chǎn)物進入下一輪循環(huán)，經(jīng)過多次循環(huán)，最終可使目標蛋白和其編碼的基因序列得到富集和分離。2.4.2 人源性抗體轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)

適宜基因工程改造的小鼠成為親和力成熟全人源抗體產(chǎn)生的強勁引擎，其體內(nèi)免疫系統(tǒng)自然選擇與成熟機制促使產(chǎn)生的抗體具備成為藥物的天然優(yōu)勢，包括高效與特異性、低免疫原性與可工藝性等。產(chǎn)生的系列抗體包括針對全新靶點的全新作用機制的抗體藥物，也包括針對經(jīng)典靶點的升級抗體藥物[13]。構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠，目的是用人的抗體基因轉(zhuǎn)入小鼠相應(yīng)基因，產(chǎn)生分泌人抗體的轉(zhuǎn)基因小鼠。在轉(zhuǎn)基因小鼠的基礎(chǔ)上，產(chǎn)生分泌抗體的轉(zhuǎn)基因小鼠。在目前FDA批準上市的全人源單抗中，技術(shù)來源除了噬菌體抗體庫技術(shù)外，有三種轉(zhuǎn)基因小鼠平臺技術(shù)，即HuMAb-Mouse、XcnoMouse和VelocImmuneTM。

HuMAb-Mouse：HUMab轉(zhuǎn)基因小鼠整合入人抗體基因450kb(200kbIgH；230kb Igk，約占人類IgGκ的50％)，免疫該小鼠可以產(chǎn)生0.1-5nmol／L的抗體。雖然該小鼠轉(zhuǎn)入的人抗體基因組還是比較小，但仍獲得巨大成功。

XcnoMouse:XenoMouse轉(zhuǎn)基因小鼠也是目前最為成功、應(yīng)用最廣的轉(zhuǎn)基因小鼠之一。該轉(zhuǎn)基因小鼠整合入大部分人抗體VH和Vκ基因，大小分別為1020kb和800kb。重鏈包含34個V區(qū)基因、所有的重鏈D區(qū)和J區(qū)，以及Cγ

2、Cμ和Cδ基因，共66個功能基因；輕鏈包含18個V區(qū)基因、所有的5個J區(qū)和Cκ基因，共32個功能基因。該轉(zhuǎn)基因小鼠XMG2-KL可以產(chǎn)生全人IgM和IgG2，親和力可以達0.1～1nmol／L。

VelocImmuneTM：不同于以往的轉(zhuǎn)基因小鼠抗體篩選平臺，VelocImmuneTM產(chǎn)生人可變區(qū)與鼠恒定區(qū)組成的反向嵌合抗體。小鼠Ig H恒定區(qū)通過B細胞胞質(zhì)區(qū)的信號轉(zhuǎn)導區(qū)域(如Igα與Igβ)傳遞天然的免疫信號，并通過與其他類型免疫細胞上的Fc受體的結(jié)合促使小鼠產(chǎn)生強大的免疫反應(yīng)，并提供半衰期長且親和力高的抗體。該類轉(zhuǎn)基因小鼠免疫后產(chǎn)生的抗體可變區(qū)編碼序列通過基因克隆技術(shù)與人源恒定區(qū)編碼序列進行構(gòu)建，反向嵌合抗體即可轉(zhuǎn)變?yōu)檫m宜藥用的全人源抗體。

另外轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)還有TC MouseTM、KM MouseTM和Five-feature mouse，但它們都還未經(jīng)過市場的檢驗。單克隆抗體衍生物

為了更好地發(fā)揮抗體藥物的治療效果，人們構(gòu)建各種形式的工程抗體來改善它們的特性和效能。例如，制備抗體和藥物的偶聯(lián)物，增加對靶細胞的殺傷；改變抗體分子大小，構(gòu)建小分子抗體，使之有較好的腫瘤/血液比；制備雙特異性抗體，同時結(jié)合兩個不同的抗原表位；增加抗體的親和力；改進抗體ADCC或CDC效應(yīng)；改變抗體的藥代動力學，使半衰期延長。3.1 抗體藥物偶聯(lián)物

抗體藥物偶聯(lián)物(ADC)是通過一個化學鏈接將具有生物活性的小分子藥物連接到單抗上，單抗作為載體將小分子藥物靶向運輸?shù)侥繕思毎衃14]。單抗和小分子本身都是藥物，都可以單獨用來治療疾病，ADC的設(shè)計思路是利用兩者的長處來彌補可能的不足或者缺陷。單抗具有很高的專一性，但是通常藥效不強，往

往需要與小分子藥物治療并用；小分子藥物活性強，缺點是專一性較差，從而可能存在毒性，受副作用和劑量的影響較大；有些小分子藥物，特別是肽類藥物在血液中的半衰期過短，通過和單抗結(jié)合，可以改善這方面的缺陷。ADC 將兩者結(jié)合，在到達目標細胞時將小分子藥物釋放出來，這不僅能靈敏地區(qū)分出健康和疾病組織，限制與非目標細胞的作用，降低毒性，還能夠明顯改善藥代動力學和向目標組織的傳遞[15]。

構(gòu)建抗體偶聯(lián)物主要有三個步驟：選擇合適的抗體、選擇合適的藥物和選擇合適的鏈接方式。這樣構(gòu)建的抗體偶聯(lián)物需要具有以下的特性：（1）穩(wěn)定性，鏈接需要在血液循環(huán)中保持穩(wěn)定，避免過早發(fā)生裂解，造成對健康組織器官損傷；（2）分特異性免疫反應(yīng)，即藥物結(jié)合到單抗不能破壞單抗本身的特異結(jié)合能力；（3）內(nèi)化和藥物的釋放，一般ADC都是通過單抗與目標細胞結(jié)合后再內(nèi)化，將小分子藥物在細胞內(nèi)釋放，因此需要控制藥物的數(shù)量，以發(fā)揮最大的效果；（4）藥物作用，釋放出的藥物需要在很低的濃度（皮摩爾級）發(fā)揮效果，因此需考慮藥物的活性。3.2 小分子抗體

小分子抗體具有分子量小、穿透性強、抗原性低、可在原核系統(tǒng)表達及易于基因工程操作等優(yōu)點。常見的單價小分子抗體有Fab段、ScFv段、FV段、二硫鍵穩(wěn)定的Fv段、單域抗體和超變區(qū)等；多價小分子有雙鏈抗體、三鏈抗體和微型抗體等；特殊類型的小分子抗體有雙特異抗體和催化抗體等[16]。當前，常用于生產(chǎn)小分子抗體片段的表達系統(tǒng)通常有大腸桿菌（E．coli）表達系統(tǒng)、酵母表達系統(tǒng)、昆蟲細胞表達系統(tǒng)和哺乳動物細胞表達系統(tǒng)四種[17]。小分子抗體的優(yōu)勢在于不需要糖基化修飾，可以在原核細胞中表達，操作方便。因此這四種表達系統(tǒng)的成本是依次增加的，但翻譯后的加工精確性和準確度卻是依次遞減的。3.2.1 Fab抗體

Fab抗體由一條完整的輕鏈和重鏈Fd段通過一個鏈間二硫鍵連接組成一個異二聚體，大小為完整抗體的三分之一，但其仍保持了親本抗體的fv段結(jié)構(gòu)和與抗原結(jié)合的特異性與活性的能力。并且分子結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定具有穿透力強、免疫原性低，可與多種藥物及放射性同位素偶聯(lián)，可與多種毒素和酶結(jié)合，用作藥物的導向治療載體和顯影等特點。3.2.2 單鏈抗體

在DNA水平上用一段 適當?shù)墓丫酆塑账嶙鳛檫B接肽（linker）將VH和VL連在一起，使之表達成為一條單一肽鏈，即為單鏈抗體（ScFv）。單鏈抗體大小僅為全抗體的六分之一，抗原性低，是具有完整抗原結(jié)合部位的最小片段,但有時構(gòu)建的ScFv其親和力明顯低于親本抗體，并常有聚集的傾向。3.2.3 單域抗體

由抗體輕、重鏈可變區(qū)基因（VH、VL）間通過一段連接肽基因拼接后表達形成的重組蛋白，大小為全抗體的六分之一，抗原性低，是具有完整抗原結(jié)合部位的最小片段。其分子量更小，具有一定的可溶性和穩(wěn)定性特點，相較于其它的抗體分子，單域抗體更容易進入細胞。3.2.4 雙特異性抗體

雙特異性抗體是含有2種特異性抗原結(jié)合位點的人工抗體，一個位點可與靶細胞表面抗原結(jié)合，另一個位點則可與載荷物如毒素、酶、細胞因子、放射毒素等耦合，能在靶細胞和功能分子（細胞）之間架起橋梁，激發(fā)具有導向性的免疫反應(yīng)，其靶向性的特點可以減少載荷物的毒副作用。單克隆抗體的應(yīng)用

隨著單克隆抗體的完善與推廣，單克隆抗體在農(nóng)業(yè)、食品、治療疾病等方面的應(yīng)用越來越廣泛，并取得了良好的效果。4.1 農(nóng)業(yè)和食品 由于單克隆抗體的高特異性和高靈敏性，單克隆抗體農(nóng)業(yè)和食品的應(yīng)用主要集中在了檢測方面。在食品中對動物性食品中β興奮劑、抗生素和激素等的檢測，植物性食品中農(nóng)藥殘留物的檢測，還可以檢測儲存食品中的微生物含量。在農(nóng)業(yè)中，單克隆抗體可以對牲畜的細菌、病毒和寄生蟲的患病情況進行篩選。在植物中，除了對病蟲害的診斷應(yīng)用以外，單克隆抗體還在藥用植物活性成分定性定量分析、成分分離、培植育種中得到了廣泛的應(yīng)用。4.2 醫(yī)學

單克隆抗體主要應(yīng)用在醫(yī)學方面，不僅為基礎(chǔ)醫(yī)學提供了有價值的載體，更在臨床醫(yī)學得到了廣泛的應(yīng)用，如治療腫瘤、移植排斥、自身免疫病、心血管疾病、病毒感染等。4.2.1 治療腫瘤

近20年來，抗腫瘤抗體藥物已成為治療癌癥的重要方法，是治療癌癥最成功的的策略之一。據(jù)PharmaprojectsV5數(shù)據(jù)庫統(tǒng)計，目前上市與臨床在研的約500種抗體藥物中，約有50%用于腫瘤治療，臨床在研的抗腫瘤抗體藥物共約20多種，針對70多個靶點[18]。目前，銷量排名前五的抗體類藥物，其中有三個都是用于治療腫瘤，其中貝伐珠單抗用于治療轉(zhuǎn)移性癌癥，曲妥珠單抗通過附著在Her2上來阻止人體表皮生長因子在Her2上的附著，從而阻斷癌細胞的生長，利妥昔適用于復發(fā)或耐藥的濾泡性中央型淋巴瘤的治療。截止2015年底，F(xiàn)DA共批準了21個抗腫瘤類藥物，2016年新批準了用于膀胱癌靶向治療的Tecentriq和治療軟組織肉瘤的Lartruvo。近年來，利用單克隆抗體靶向治療腫瘤已經(jīng)成為全球靶向治療藥物的主流，免疫檢驗點靶向抗體藥物的研發(fā)更是極大地推動腫瘤免疫治療，是目前腫瘤治療的最熱點所在[19]。同時抗體治療聯(lián)合其他治療策略也成為了必然的發(fā)展趨勢，聯(lián)用型治療適用性更廣，臨床效果更持久，不良反應(yīng)更少，病灶去除更徹底，有效防止腫瘤的復發(fā)，顯著提高了存活率。4.2.2 器官移植

移植排斥是器官移植失敗的重要因素之一，而單克隆抗體可以有效地改善移植排斥反應(yīng)，其應(yīng)用也在不斷增長，目前的研究和應(yīng)用主要集中于清除不同種類的白細胞分化抗原（CD），例如采用抗CD154單克隆抗體阻斷免疫細胞活化信號傳導途徑,主要應(yīng)用于胰腺、心臟、皮膚等多個器官的移植，證明抗CD154單抗能有效地抑制移植排斥反應(yīng)，延長移植物的存活時間[20]。4.2.3 自身免疫病

自身免疫性疾病的治療通常采用的糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等,雖然有一定療效,但長期使用都會產(chǎn)生嚴重的不良反應(yīng),而且都只能減緩病情的發(fā)展,并不能根治疾病[21]。而單克隆抗體可以有效地改善和治療自身免疫病，主要有以下的三種作用機制。（1）封閉細胞因子和生長因子的單克隆抗體藥物，其中最成功的便是TNF抑制劑，包括伊納西普、英孚利昔、阿達木、賽妥珠和戈利木，適用于類風濕關(guān)節(jié)炎、青少年關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、結(jié)腸炎、脊柱炎和銀屑病等；（2）受體阻滯和受體調(diào)節(jié)的單克隆抗體藥物，即單抗結(jié)合受體，阻斷配體和受體相互作用，下調(diào)細胞表面目標受體的表達，這些抗體包括治療類風濕關(guān)節(jié)炎的IL-6受體抗體tocilizumab,重組非糖基化的人IL-1受體拮抗劑阿那白滯素(anakin-ra)等；（3）耗竭異常免疫細胞及介導細胞信號的單克隆抗體藥物，通過結(jié)合細胞表面抗原,如CD20,CD22、CD80和CD52,通過FcγR介導的ADCC作用和CDC作用殺傷異常的淋巴細胞，有治療1型糖尿病的otelixizumab、治療多發(fā)性硬化癥的阿倫和治療慢性淋巴細胞白血病ofatumumab等一系列單抗藥物。4.2.4 抗感染

細菌和病毒等病原體感染機體的機制復雜,由于單克隆抗體只能識別單一抗原表位,限制了抗體藥物的抗感染效果。抗感染領(lǐng)域的抗體藥物發(fā)展緩慢，目前僅有抗呼吸道合胞病毒的帕利珠單抗以及抗炭疽桿菌的瑞西巴庫單抗兩個品種上市[22]。目前抗感染的單克隆抗體的研究熱點集中于埃博拉病毒抗體、抗呼吸道合胞病毒抗體、抗炭疽桿菌抗體等，2014年西非大規(guī)模埃博拉病毒疫情爆發(fā)后，實驗性抗體藥物ZMapp第一個被用于臨床治療，中國研制的抗體藥物MIL77也成功用于治療，抗體藥物再次顯示了在抗感染領(lǐng)域的應(yīng)用前景。單克隆抗體藥物可能存在的問題

單克隆抗體導致的不良發(fā)應(yīng)主要有皮膚及附件損害、全身反應(yīng)、心血管損害等，具體表現(xiàn)為皮疹、瘙癢、寒戰(zhàn)、發(fā)熱、心慌、心跳加快等，嚴重可導致急性呼吸衰竭、多器官功能衰竭、嚴重出血、腦梗死、過敏性休克等。單克隆抗體可能的不良反應(yīng)也許與以下3個機理之一有關(guān):所用mAb的異源性,特別是當給予mAb而無相關(guān)的免疫抑制劑時；生理功能的抑制以及mAb的特異性；mAb與靶點結(jié)合后炎癥細胞或介導物的活性[23]。從發(fā)生人群來看，患者的年齡集中在兒童和老人，這可能是由于兒童的器官/系統(tǒng)發(fā)育不完善，使得個體對藥物的吸收、分布、代謝相對緩慢，藥物在體內(nèi)滯留的時間較長；而老人往往患有心血管疾病、高血壓、糖尿病等，這些可能都會引起不良反應(yīng)的發(fā)生。因此，臨床中使用單克隆抗體藥物是應(yīng)注意：（1）重視患者人群，注意防范兒童或老年患者不良反應(yīng)的發(fā)生。（2）注意首次用藥，初次靜脈滴注單克隆抗體時，應(yīng)控制滴速。（3）詢問患者藥物過敏史和既往病史。（4）使用前建議預防使用抗過敏藥物。（5）對具有肝炎病史的患者，注意對肝功能和病毒的檢測，避免肝病復發(fā)。（6）按照說明書使用單克隆抗體藥物，避免超說明書用藥。（7）單克隆抗體制劑應(yīng)保存在2-8℃的環(huán)境中，避免凍結(jié)。（8）輸注藥液的過程中，加強巡視，嚴密觀察藥物引起的不良反應(yīng)，及時給予相應(yīng)的處理，保證患者的用藥安全[24]。展望

單克隆抗體藥物這些特征使它成為了生物醫(yī)藥領(lǐng)域一顆耀眼的明珠。過去的30年中，隨著研究的不斷突破，單克隆抗體從鼠源發(fā)展到人緣，提高了單克隆抗體的藥效和安全性。雖然單抗藥物還存在一些尚未解決的問題，最突出的問題是如何降低單抗的免疫原性，單抗的異源性所引起的抗體反應(yīng)，不但降低了單抗的效價，而且會給患者帶來嚴重的后果。但是我們可以相信隨著研究的不斷深入；生產(chǎn)工藝的不斷成熟；檢測技術(shù)不斷的完善，現(xiàn)有的問題會逐一地解決，并且必將出現(xiàn)更高靶向性和藥效更強的單克隆抗體藥物，單克隆抗體藥物將在治愈疾病中顯示出它獨特的效果，為患者帶來更大的希望。

未來伴隨著生物技術(shù)制藥的發(fā)展，單克隆抗體將在其中占有更重要的地位，并逐漸成為生物醫(yī)藥領(lǐng)域發(fā)展的主要方向。目前單克隆抗體藥物快速擴大的市場已經(jīng)成為制藥業(yè)爭奪的焦點，為制藥公司提供了發(fā)展的契機。我國企業(yè)雖然進入該領(lǐng)域較晚，但在仿制單克隆抗體藥物的規(guī)?；?、產(chǎn)業(yè)化的基礎(chǔ)上，積極探索、開發(fā)和創(chuàng)新，相信很快會在國際市場上占有一席之地。

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