第一篇：7單克隆抗體制備教案

單克隆抗體的制備

一、教學(xué)目標(biāo)

知識目標(biāo)：

1、單克隆抗體的概念

2、單克隆抗體的制備過程，以及過程中涉及的具體篩選過程。

3、單克隆抗體的應(yīng)用，和普通抗體相比的優(yōu)點。能力目標(biāo)：

1、學(xué)會從復(fù)雜的制備過程中找出簡單的流程圖

2、注意前后知識點的對比學(xué)習(xí)。情感態(tài)度價值觀：從生物導(dǎo)彈的應(yīng)用了解單克隆抗體目前在抗癌方面的貢獻，并努力掌握更多的相關(guān)知識。

二、教學(xué)的重點難點：

單克隆抗體的制備過程，以及過程中涉及的具體篩選過程。

三、教學(xué)課時：1課時

四、教學(xué)過程：

【一】錨式問題：從“生物導(dǎo)彈”一個新穎而又陌生的畫面入手。引發(fā)學(xué)生的探究熱情。具體結(jié)合材料和圖片來介紹生物導(dǎo)彈。資料：“生物導(dǎo)彈”是免疫導(dǎo)向藥物的形象稱呼，它由單克隆抗體與藥物或放射性同位素配合而成，因帶有單克隆抗體而能自動導(dǎo)向，在生物體內(nèi)與特定目標(biāo)細胞或組織結(jié)合，并由其攜帶的藥物產(chǎn)生治療作用。問題：生物導(dǎo)彈中的關(guān)鍵成分是什么？什么是單克隆抗體？ 【二】自主探究（4分鐘，學(xué)生看課本完成）

1、長期人們怎樣獲得抗體？這樣的抗體有什么缺點？

（給動物反復(fù)注射抗原，然后在動物的血清中提取抗體。抗體產(chǎn)量低、純度低、特異性差）

2、B淋巴細胞在分泌抗體時有什么特點？B淋巴細胞實際指的是什么細胞？（一個或是一種B淋巴細胞只能分泌一種抗體；效應(yīng)B細胞或是漿細胞）

分析：這兩個問題比較簡單，而且在課本中能直接找到答案，學(xué)生迅速閱讀課本就能完成?！救坷^續(xù)探究（10分鐘，學(xué)生看課本，查閱資料，討論合作完成）

1、寫出單克隆抗體制備的過程簡圖（略，見課件）

2、怎么獲得免疫小鼠，目的是什么？

（給小鼠注射特定的抗原，使小鼠發(fā)生特定的體液免疫，產(chǎn)生相應(yīng)的B淋巴細胞）

3、為何選擇B淋巴細胞和骨髓瘤細胞？

（B淋巴細胞能產(chǎn)生特定的抗體，單不能無限增殖；骨髓瘤細胞能無限增殖）

4、過程中大致需要幾次篩選？怎么篩選？目的是什么？（主要是2次。第一次為了篩選出雜交瘤細胞；第二次篩選出能大量產(chǎn)生特定抗體的雜交瘤細胞。）

5、最終獲得單克隆抗體的辦法有幾種？分別是？

（兩種。體內(nèi)在小鼠的腹水中提??；體外在細胞的培養(yǎng)液中提取）

6、單克隆抗體制備過程涉及的技術(shù)及其原理有哪些？

（細胞融合：原理是細胞膜具有流動性；動物細胞培養(yǎng)原理：細胞增殖）

分析：上述的6個問題涉及的內(nèi)容是本節(jié)課的重點和難點，也是考點，需要和學(xué)生一起系統(tǒng)化的梳理，并強調(diào)重點內(nèi)容作好筆記?！舅摹坷^續(xù)探究總結(jié)

1、單克隆抗體的“單”和“克隆”分別指的是什么？

（單：單個能產(chǎn)生大量抗體的雜交瘤細胞；克?。簾o性繁殖即有絲分裂）

2、單克隆抗體的應(yīng)用主要有哪些？

（主要集中在醫(yī)學(xué)方面，診斷疾病，治療疾病等）

3、單克隆抗體的主要優(yōu)點有哪些？

（特異性強、靈敏度高、純度大、可大量制備）【五】運用質(zhì)疑

1、科學(xué)家用小鼠骨髓瘤細胞與某種細胞融合，得到雜交細胞，經(jīng)培養(yǎng)可產(chǎn)生大量的單克隆抗體，與骨髓瘤細胞融合的是(A)A．經(jīng)過免疫的B淋巴細胞 B．不經(jīng)過免疫的T淋巴細胞 C．經(jīng)過免疫的T淋巴細胞 D．不經(jīng)過免疫的B淋巴細胞

2、將小鼠骨髓瘤細胞與一種B淋巴細胞融合，可使融合的細胞經(jīng)培養(yǎng)產(chǎn)生單克隆抗體，下列說法中不正確的是(C)A．動物細胞融合和動物細胞培養(yǎng)技術(shù)是單克隆抗體技術(shù)的基礎(chǔ) B．實驗中雜交瘤細胞從培養(yǎng)基中吸收葡萄糖的方式是主動運輸

C．B淋巴細胞與骨髓瘤細胞直接放入培養(yǎng)液中就能融合為雜交瘤細胞

D．按照培養(yǎng)基的用途分類，實驗中篩選雜交瘤細胞的培養(yǎng)基是選擇培養(yǎng)基

6、單克隆抗體是指（C）

A．單個骨髓瘤細胞增殖產(chǎn)生的抗體

B．單個B淋巴細胞增殖產(chǎn)生的抗體 C．單個雜交瘤細胞增殖產(chǎn)生的抗體

D．單個抗體通過克隆化，產(chǎn)生大量抗體 【六】課外延伸

單克隆抗體是來自誰？如果直接給人注射，會有什么反應(yīng)？請同學(xué)想辦法來解決?。?/p>

第二篇：單克隆抗體的制備論文 (自動保存的)

摘 要

單克隆抗體技術(shù)是現(xiàn)代生命科學(xué)研究的重要工具,在基因和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能研究方面有著不可或缺的作用。近年來,隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,出現(xiàn)了嵌合單克隆抗體和由轉(zhuǎn)基因小鼠、噬菌體展示技術(shù)、核糖體展示技術(shù)及共價展示技術(shù)所產(chǎn)生的單克隆抗體。這些技術(shù)將有效解決單克隆抗體的鼠源性等問題。本文主要講述制備單抗的實驗過程，并對實驗結(jié)果及其影響因素進行分析。

關(guān)鍵詞：抗體，單克隆，腫瘤，細胞融合，淋巴細胞

Abstract

The monoclonal antibody technology is the modern life sciences research important tool, has the indispensable function in the gene and the protein structure and the function research aspect.In recent years, along with the molecular biology technology's development, presented the embedment monoclonal antibody and by the transgene mouse, the bacteriophage demonstrated that the technology, the ribosome demonstrated the technology and the covalence demonstrated the technology produces monoclonal antibody.These technologies effective addressing monoclonal antibody questions and so on mouse source.This article mainly prepares Shan Kang the new technology to the above several kinds to make a summary and analysis of factors.Keywords:antibodi,monoclonal, neoplasms,cell fusion,lymphocyte

目錄

1.前言....................................................................................................................4

1.1國外現(xiàn)代生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)發(fā)展的現(xiàn)狀............................................................4 1.2我國現(xiàn)代生物技術(shù)醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展的現(xiàn)狀.....................................................4 2.文獻綜述.............................................................................................................5

2.1單克隆抗體的概念.....................................................................................5 2.2單克隆抗體的主要特點..............................................................................5 2.3單克隆抗體的應(yīng)用..................................................................................6 3實驗方法.............................................................................................................9

3.1材料和方法：..........................................................................................9

3.1.1材料..............................................................................................9 3.1.2.方法............................................................................................10

4.結(jié)果與討論.......................................................................................................11

4.1細胞融合結(jié)果的差別..............................................................................11 4.2巨噬細胞在培養(yǎng)雜交瘤細胞株的作用...................................................12

4.3加入巨噬細胞的用量和時間..................................................................13 4.4不同源的巨噬細胞.................................................................................14 4.5細胞加入的量.........................................................................................15 4.6骨髓瘤細胞株的比較..............................................................................16 4.7融合劑的比較.........................................................................................17 4.8細胞融合溫度的比較..............................................................................18 4.9各種營養(yǎng)液的比較.................................................................................19 4.10細胞換液的方案...................................................................................20 4.11微量培養(yǎng)...............................................................................................20 4.12無血清培養(yǎng)液.......................................................................................21 5.結(jié)論..................................................................................................................22 6.參考文獻..........................................................................................................24 7.致謝..................................................................................................................2

1.前言

現(xiàn)代生物技術(shù)制藥工業(yè)始于1971年，現(xiàn)已創(chuàng)造出35個重要治療藥物，全球大約有2500多家公司，主要產(chǎn)品有重組蛋白質(zhì)藥品、重組疫苗和診斷、治療用的單克隆機體三大類。我國自80年代在采用現(xiàn)代生物技術(shù)改造傳統(tǒng)生物技術(shù)制藥產(chǎn)業(yè)方面已取得初步成果。但我國生物技術(shù)診斷試劑、酶工程、動植物細胞工程醫(yī)藥產(chǎn)品、現(xiàn)代生物技術(shù)支撐技術(shù)、后處理技術(shù)和制劑技術(shù)等方面與國外還存在差距。

1.1國外現(xiàn)代生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)發(fā)展的現(xiàn)狀

自1971年Cetus公司成立至今，現(xiàn)代生物技術(shù)制藥工業(yè)已走完了二十五年的路程，創(chuàng)造出35個重要的治療藥物，目前已在治療癌癥、多發(fā)性硬化癥、貧血、發(fā)育不良，糖尿病、肝炎、心力衰竭、血友病、囊性纖維變性和一些罕見的遺傳性疾病中取得良好效果。在醫(yī)藥工業(yè)中，傳統(tǒng)生物技術(shù)（包括近代生物技術(shù)）已為人類提供了許多重要藥品，在保障人類生命健康和推動社會進步中發(fā)揮了巨大作用；現(xiàn)代生物技術(shù)以其特有的高新技術(shù)又為人類提供了傳統(tǒng)生物技術(shù)難以獲得的極微量的珍貴藥品。由于這一系列現(xiàn)代生物技術(shù)新型藥物的出現(xiàn)，使過去無法治療的疑難疾病得到了治療。同時，應(yīng)用現(xiàn)代生物技術(shù)DNA重組，細胞融合以及細胞大規(guī)模培養(yǎng)等現(xiàn)代生物技術(shù)發(fā)展和提高傳統(tǒng)生物技術(shù)的生產(chǎn)水平，為抗生素、氨基酸、維生素以及基體激素等藥品的生產(chǎn)，構(gòu)建了高產(chǎn)新菌株，創(chuàng)造新工藝，提高生產(chǎn)能力，降低生產(chǎn)成本，促進生產(chǎn)發(fā)展。

1.2我國現(xiàn)代生物技術(shù)醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展的現(xiàn)狀

現(xiàn)代生物技術(shù)醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)化進程：我國自80年代開始進行現(xiàn)代生物技術(shù)藥品的研究和開發(fā)，雖然起步較晚，基礎(chǔ)較差，但一開始就受到黨和國家的高度重視，并列為“863”計劃和國家重點攻關(guān)項目的主要內(nèi)容，經(jīng)過十多年的努力，特別是近五年來，現(xiàn)代生物技術(shù)醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)有了突破性的進展，到1998年7月底我國已有十四種現(xiàn)代生物技術(shù)藥品和疫苗投入生產(chǎn)，據(jù)初步統(tǒng)計，1997年的工業(yè)總產(chǎn)值約20億（包括采用現(xiàn)代生物技術(shù)改造傳統(tǒng)生物技術(shù)后新增加的產(chǎn)值在內(nèi)）。目前我國己有近200多個現(xiàn)代生物技術(shù)制藥企業(yè)，其中約30家生產(chǎn)企業(yè)已具有不同規(guī)模的生產(chǎn)能力，陸續(xù)投入生產(chǎn)。因此，可以說我國現(xiàn)代生物技術(shù)制藥產(chǎn)業(yè)化已經(jīng)開始。

本文主要介紹了單克隆抗體的制備過程及應(yīng)用。

2.文獻綜述

2.1單克隆抗體的概念

抗體是由B淋巴細胞分化形成的漿細胞合成、分泌的。每一個B淋巴細胞在成熟的過程中通過隨機重排只產(chǎn)生識別一個抗原的抗原受體基因。動物脾臟有上百萬種不同的B淋巴細胞系，重排后具有不同基因不同的B淋巴細胞合成不同的抗體。當(dāng)機體受抗原刺激時，抗原分子上的許多決定簇分別激活各個具有不同基因的B細胞。被激活的B細胞分裂增殖形成效應(yīng)B細胞（漿細胞）和記憶B細胞，大量的漿細胞克隆合成和分泌大量的抗體分子分布到血液、體液中。如果能選出一個制造一種專一抗體的漿細胞進行培養(yǎng)，就可得到由單細胞經(jīng)分裂增殖而形成細胞群，即單克隆。單克隆細胞將合成針對一種抗原決定簇的抗體，稱為單克隆抗體。

2.2單克隆抗體的主要特點

1)由于來于單克隆細胞，所分泌的抗體分子在結(jié)構(gòu)上高度均一，甚至在氨基酸序列及空間構(gòu)型上均相同；

2）由于抗體識別的是抗體分子上單一抗原位區(qū)，且所有抗體分子均相同，由此，單克隆抗體具有高度特異性；

3）產(chǎn)生該抗體的為一無性細胞系，且可長期傳代并保存，為此可持續(xù)穩(wěn)定的生產(chǎn)同一性質(zhì)的抗體。2.3單克隆抗體的應(yīng)用

作為親合層析的配體:單克隆抗體能與其相應(yīng)的抗原特異性結(jié)合，因而能夠從復(fù)雜系統(tǒng)中識別出單個成分。只要得到針對某一成分的單克隆抗體，利用它作為配體，固定在層析柱上，通過親合層析，即可從復(fù)雜的混和物中分離、純化這一特定成分。如用抗人絨毛膜促性腺激素(hCG)親合層析柱，就可從孕婦尿中提取到純的hCG。與其它提取方法(沉淀法、高效疏水色譜法等)相比，具有簡便、快速、經(jīng)濟、產(chǎn)品活性高等優(yōu)點。

作為生物治療的導(dǎo)向武器:脂質(zhì)體是由既親水又親油的兩親磷脂組成的連續(xù)雙分子層微囊，內(nèi)含水相空間，可包裹水溶性物質(zhì)。包有細胞毒劑的脂質(zhì)體膜上偶聯(lián)抗體，可定向攻擊靶細胞，稱為免疫脂質(zhì)體。這種“導(dǎo)向治療”，在動物試驗與體外試驗中已獲得滿意效果。如熱敏免疫脂質(zhì)體，由抗人乳癌細胞抗體經(jīng)疏水長鏈脂肪酸修飾，抗體帶上長的疏水碳鏈，部分插入脂質(zhì)體的脂雙層膜中，抗體Fab段仍暴露在膜表面，因而保持了抗體活性。熱敏免疫脂質(zhì)體可特異識別靶細胞(人乳癌細胞)，并通過相變溫度引起脂質(zhì)體破裂，從而定向釋放藥物。另外，可將化療藥物、細菌毒素、植物毒素或放射性同位素等細胞毒劑與抗腫瘤抗原的單克隆抗體直接交聯(lián)，利用其導(dǎo)向作用，使細胞毒劑定位于腫瘤細胞把它直接殺傷。這不僅提高了抗體的療效，也可降低細胞毒劑對正常細胞的毒性反應(yīng)。如應(yīng)用抗T細胞單抗和柔紅霉素結(jié)合物，在體外對非T淋巴細胞就無殺傷作用。但是，要把這種方法應(yīng)用于臨床，目前還存在不少技術(shù)難關(guān)，包括人體對鼠源單抗的排異問題等。

作為免疫抑制劑:抗人T淋巴細胞單抗(McAb)作為一種新型免疫抑制劑，已廣泛應(yīng)用于臨床治療自身免疫疾病和抗器官移植的排斥反應(yīng)。其作用機理有賴于McAb的種類及其免疫學(xué)特性。注射抗小鼠Thy-1抗原的單抗，可以抑制小鼠同種皮膚移植的排斥反應(yīng)。此外，對用于同種骨髓移植的供體骨髓，在體外經(jīng)抗T細胞單抗加補體處理，能減輕移植物抗宿主病的發(fā)生。作為研究工作中的探針:單克隆抗體只與抗原分子上某一個表位(即抗原決定簇)相結(jié)合，利用這一特性就可把它作為研究工作中的探針。此時，可以從分子、細胞和器官的不同水平上，研究抗原物質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，進而并可從理論上闡明其機理。如用熒光物質(zhì)標(biāo)記單抗作為探針，能方便地確定與其結(jié)合的相應(yīng)生物大分子(蛋白質(zhì)、核酸、酶等)在細胞中的位置和分布。

增強抗原的免疫原性:抗體對抗原免疫原性的增強作用由來已久，60年代就已發(fā)現(xiàn)幼豬對破傷風(fēng)類毒素難以產(chǎn)生抗體，注射相應(yīng)特異性抗體IgG，就能有效地提高對委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒的免疫應(yīng)答。1984年以來，Celis等發(fā)現(xiàn)，抗乙肝病毒(HBs)IgG可增強HBs抗原對特異性人T細胞克隆的刺激增殖，并可誘生干擾素。在小鼠中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)?shù)蛣┝康腍Bs抗原不產(chǎn)生免疫反應(yīng)時，加入抗HBs抗體組成的復(fù)合物，則可有效地誘生免疫反應(yīng)。根據(jù)這一作用，現(xiàn)已研制出乙肝的抗原—抗體復(fù)合物型治療性疫苗。

作為醫(yī)學(xué)檢驗試劑:單克隆抗體作為醫(yī)學(xué)檢驗試劑，更能充分發(fā)揮其優(yōu)勢。單克隆抗體的特異性強，大大提高了抗原—抗體反應(yīng)的特異性，減少了和其它物質(zhì)發(fā)生交叉反應(yīng)的可能性，使試驗結(jié)果可信度更大。單抗的均一性和生物活性的單一性，使抗原—抗體區(qū)應(yīng)結(jié)果便于控制，利于標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)范化。目前已有許多檢驗試劑盒用單抗制成，其主要用途如下：

(1)診斷各類病原體

這是單抗應(yīng)用最多的領(lǐng)域，已有大量診斷試劑商品供選擇。如用于診斷乙肝病毒、丙肝病毒、皰疹病毒、巨細胞病毒、EB病毒和各種微生物、寄生蟲感染的試劑等。單抗所具有的靈敏度高、特異性好的特點，使其在鑒別菌種的型及亞型、病毒變異株，以及寄生蟲不同生活周期的抗原性等方面更具獨特優(yōu)勢。

(2)腫瘤特異性抗原和腫瘤相關(guān)抗原的檢測

用于腫瘤的診斷、分型及定位。盡管目前尚未制備出腫瘤特異性抗原的單抗，但對腫瘤相關(guān)抗原(如甲胎蛋白、腫瘤堿性蛋白和癌胚抗原)的單抗早就用于臨床檢驗。隨著淋巴細胞雜交瘤技術(shù)的應(yīng)用，許多抗人腫瘤標(biāo)記物的雜交瘤細胞株已經(jīng)建立，這為腫瘤的早期診斷及其闡明腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，了解腫瘤細胞的生物學(xué)活性及其定量研究奠定了基礎(chǔ)。用抗腫瘤單抗檢查病理標(biāo)本，可協(xié)助確定轉(zhuǎn)移腫瘤的原發(fā)部位。以放射性核素標(biāo)記單抗可用于體內(nèi)診斷，再結(jié)合X-線斷層掃描技術(shù)，可對腫瘤的大小及其轉(zhuǎn)移灶作出定量診斷。

(3)檢測淋巴細胞表面標(biāo)志

用于區(qū)分細胞亞群和細胞的分化階段。例如檢測CD系列標(biāo)志，有利于了解細胞的分化和T細胞亞群的數(shù)量和質(zhì)量變化，這對多種疾病診斷具有參考意義。細胞表面抗原的檢測，將對白血病患者的疾病分期、治療效果、預(yù)后判斷等方面有指導(dǎo)作用。組織相容性抗原檢測是移植免疫學(xué)的重要內(nèi)容，應(yīng)用單抗對其進行位點檢測可得到更可信的結(jié)果。

(4)機體微量成分的測定

應(yīng)用單抗結(jié)合其它技術(shù)，可對機體的多種微量成分進行測定。如放射免疫分析，即是利用了同位素的靈敏性和抗原-抗體反應(yīng)的特異性而建立起來的方法，它可以測至10-9～10-12g，使原來難以測定的激素能夠進行定量分析。除了激素，還可檢測諸多酶類、維生素、藥物和其它生化物質(zhì)。這對受檢者健康狀態(tài)判斷、疾病檢出、指導(dǎo)診斷和臨床治療均具有實際意義。3實驗方法

3.1材料和方法：

3.1.1材料

a．鹽溶液：將NaCl8克，KClO4克，Na2HPO4·2H2O1.77克，NaH2P04·H 692O0．克，葡萄糖2克，酚紅0.001克，溶于1000ml雙蒸水中，pH7.2。高壓115℃，15分鐘，保存于室溫。

標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)液；RPMI1640，DMEM或者Iscove?s培養(yǎng)液，加入10％滅活血清(馬血清、小牛血清或胎牛血清)，貯存于4℃。在使用前加入2％100×谷酰胺，1％100×丙酮酸鈉，1％100 ×抗菌素(青霉素和鏈霉素各10000單位／m1)，0.05％0.1M硫乙二醇。所有培養(yǎng)液均需于兩天內(nèi)用完。

選擇性培養(yǎng)液：即所謂HAT培養(yǎng)液，100× HAT培養(yǎng)液，100×H：Hypoxanthine次黃嘌呤為10mM，必須在45℃溶解完全。100×A：Aminopterine氨基喋呤為0.04mM．必須在45℃溶解于稀釋NaOH溶液中，然后再用HCI中和。

I00×T；Thymidime胸腺嘧啶，1.6mM，在室溫中溶解。然后各溶液分別除菌過濾，分裝5m1一支，-20℃保存。HAT和HT的營養(yǎng)液都必須在應(yīng)用前配制，方法把100×貯存液按1％加入營養(yǎng)液即成。

細胞凍存液：為9份營養(yǎng)濃加入l份DMSO二甲基亞砜，混勻。此時細胞株必須生長良好[1]。b、骨髓瘤細胞株

BALB／c小鼠骨髓瘤細胞株，經(jīng)過克隆純化P3×63Ag8(簡稱×63)和其衍生株SP—2／0，SP—2／0不產(chǎn)生球蛋白，此兩株細胞均為本研究所Dr、G、Kohler所培育，這些細胞株都適應(yīng)于各種標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)液以及2.5cm2和7.5cm2的塑料培養(yǎng)瓶，分別裝入4ml或12ml營養(yǎng)液，通入氣體為10％CO 2、7％O2和83％N2，37℃恒溫培養(yǎng)。3.1.2.方法

a、小鼠免疫

成年BALB／c小鼠各種性別均可，用流感病毒1000個血凝單位腹腔注射，作為首次免疫。7一12周后，再給200血凝單位病毒腹腔注射，作為加強免疫。

在加強免疫后4—5天，即可進行細胞融合，處死小鼠、無菌取脾，把脾細胞輕輕壓入10m1的鹽溶液中，然后把細胞懸浮液轉(zhuǎn)入15ml離心管中，毛細管吹打，然后至室溫中10分鐘，讓其自然下沉，吸出大約9ml上清液，不要攪動底下的沉淀塊，然后用TURK溶液作白細胞計數(shù)。

b、腹腔內(nèi)巨噬細胞的采取

把成年BALB／c小鼠處死，剝開腹部皮膚，用4—5ml的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)液或0.34M(＝11.6％)的蔗糖溶液注入腹腔，用18號針頭從恥骨聯(lián)合處，直接插入，把針頭朝向肝右葉上方，然后輕輕按摩腹部，再行吸出腹腔液體。每鼠可得1.5—3×105的巨噬細胞(m￠)，這些細胞可收集于塑料管中，用任何一種標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)液洗細胞，并于30分鐘內(nèi)用完。c、大孔培養(yǎng)

24孔培養(yǎng)板，每孔可容2m1培養(yǎng)液，培養(yǎng)于37℃，含7%CO2/DA大氣恒溫箱中。濕度為85—95％。

換營養(yǎng)液時，分別以無菌巴氏吸管聯(lián)接于吸引裝置上，吸出大約lml的血營養(yǎng)液，然后用一個小口的25m1吸管，分別加入預(yù)熱的新鮮營養(yǎng)液。

如果細胞長得很密，可以用2ml吸管吸出培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)種于小瓶中，一般1.5ml細胞懸浮液可接種25㎝2的小瓶，當(dāng)小瓶中細胞長至單層時，即可轉(zhuǎn)種至75cm2的瓶中。以后即可按轉(zhuǎn)種骨髓瘤細胞的方法，維持雜交瘤細胞。d、微量培養(yǎng)法

平底的微量培養(yǎng)板每孔可容納0.25mI的培養(yǎng)液，細胞培養(yǎng)條件與24孔培養(yǎng)板相同。當(dāng)細胞長待很密時，第一步可轉(zhuǎn)入24孔培養(yǎng)板的二個孔中，加入1m1培養(yǎng)液，然后按24孔培養(yǎng)板處理。

4.結(jié)果與討論

通過體內(nèi)單克隆抗體培養(yǎng)的到以下結(jié)果，下面是對細胞融合的實驗結(jié)果進行的分析，并對實驗數(shù)據(jù)進行討論。

4.1細胞融合結(jié)果的差別

用5×107的BALB／c小鼠脾細胞與5×106骨髓瘤細胞進行融合，方法按Kohler和Milstein（1975，1976)的方法，每批細胞融合物分裝到24個培養(yǎng)孔，培養(yǎng)28天，記錄活細胞每孔多余104者為陽性，結(jié)果如表1所示。

表1 各次細胞融合結(jié)果的差別

實驗

脾號

陽性

孔

數(shù)3／24

0／

20／

223／ 22

2／

8／

24／ 2

824／24 3

0／24＋0／24

0／24＋0

／

18／24＋2

／

1／24＋0

／

2表1中融合的結(jié)果波動很大，結(jié)果理想時，所有的培養(yǎng)孔可以都是陽性，而不理想時則為0，而唯一確實可靠的結(jié)論是：只有在巨噬細胞活躍的培養(yǎng)孔中，才能得到抗體陽性的雜交瘤細胞克隆。這些培養(yǎng)孔看起來十分清亮，在最初培養(yǎng)的第一周內(nèi)，很少細胞碎片，而且這些巨噬細胞一直可存活到實驗的結(jié)束。但巨噬細胞的存在并不是唯一的因素，在實驗4、7、8和11中應(yīng)用了每個培養(yǎng)孔加入1×104的巨噬細胞，獲得理想結(jié)果，而相同地在實驗3，12中也應(yīng)用1×104巨噬細胞，結(jié)果卻不理想。

4.2巨噬細胞在培養(yǎng)雜交瘤細胞株的作用

接下去一個實驗，除了在實驗的當(dāng)天給每個培養(yǎng)孔加入2×104的巨噬細胞外，其他方面都按Kohler和Milstein的方案進行，結(jié)果見表2 細胞融合物的準(zhǔn)備，接種和判定都按表1方法進行、本實驗按表2所列于實驗當(dāng)天加入巨噬細胞。

表2 巨噬細胞對雜交細胞的作用

實驗

脾號

陽性孔數(shù)

不加巨噬細胞

加巨噬細胞 2

2／24

24／24

8／23

21／24

24／24

24／24

24／24

24／24 4

0／24＋0／24

23／24

0／24＋0／24

24／24 11

18／24＋21／24

22／24 12

1／24＋0／24

24／24

由表2可得，巨噬細胞的效果十分明顯，表現(xiàn)在相同的脾臟9和10，不加巨噬細胞，沒有雜交單克隆細胞，加入巨噬細胞，結(jié)果大大增加。再如脾5，脾

6、脾12未加巨噬細胞時只有極少數(shù)雜交細胞克隆生長，而加入后幾乎是90—100％都產(chǎn)生了雜交細胞的克隆。另外，在這個實驗中，雖然脾12的細胞融合物在對照組中已加過了104巨噬細胞(參閱表1)但其效果并不理想，而當(dāng)?shù)诙渭尤肓硪粋€小鼠的巨噬細胞時，獲得理想結(jié)果，說明前面的巨噬細胞是無效果的，為了避免遇上無效的巨噬細胞影響結(jié)果，應(yīng)該合并3—4只小鼠的腹腔洗出的巨噬細胞，作為喂養(yǎng)細胞。

4.3加入巨噬細胞的用量和時間

可以將投入實驗的脾細胞的量減少10倍，其他方法則按照K6hler和M11stein(1975，1976)的方法進行。不同劑量的巨噬細胞和不同時期加入的實驗結(jié)果見表3。

表3 影響巨噬細胞的有關(guān)因素

加入日期

每孔加入巨噬細胞量

陽性孔數(shù)

0

33×103

43×104

5-0

0

0

0

0

0

1

0 21

0

1Ca

4

0

0

0

0

2合計

0

--

表3說明按照Kohler和Milstein(1975、1976)的方法，取一只BALB／c小鼠脾細胞5×106和骨留瘤細胞5×108進行融合。融合當(dāng)天稱為“0”天，每天收集小鼠腹腔巨噬細胞，并按各需要量加入培養(yǎng)孔，培養(yǎng)28天后，計算24個培養(yǎng)孔中，活細胞多于104的陽性孔[2]。

4.4不同源的巨噬細胞

巨噬細胞來源于何種品系的動物并不重要，來自不同種動物的腹腔洗液，或者雜交動物的小鼠、甚至大鼠或豚鼠的巨噬細胞都可促使雜交瘤細胞生長，結(jié)果如表4

表4 用不同動物巨噬細胞作為喂養(yǎng)細胞的比較

動物來源

每個培養(yǎng)孔加入巨噬細胞數(shù)

總陽性數(shù)

3×103

3×10

4105

小鼠BALB/c

52117

小鼠C57BL/6

小鼠C3H

0

321

小鼠Outbred(雜種)7

大鼠Rat

121

豚鼠Guinea pig

0

巨噬細胞來自各種動物如表4所列，每種動物各取了3只進行臉皮灌洗，合并其巨噬細胞在細胞融合前一天接種于各培養(yǎng)孔，第25天時計數(shù)24個培養(yǎng)孔的陽性數(shù)、(活細胞多于104者為陽性。)．

另外，還試驗了已經(jīng)建株的巨噬細胞系和在實驗室中長期傳代的巨噬細胞株，這些細胞都來自BALB／c小鼠。

4.5細胞加入的量

脾細胞參加細胞融合的用量，通過脾細胞限量試驗可以得到結(jié)果，結(jié)果見表5。

表5 限量脾細胞雜交試驗

實驗

參加融合的脾細胞數(shù)

2×106

4×106

374 14

由表5可知4×106的脾細胞結(jié)果較好，細胞融合數(shù)較多。取BALB／c小鼠牌細胞，分別用下表所列的脾細胞量與5×106x 63骨朗瘤細胞融合，接種于24孔培養(yǎng)板中，細胞融合的前一天，每孔接種2×104腹腔巨噬細胞。培養(yǎng)24天后，每孔活細胞數(shù)多于104者為陽性孔。4.6骨髓瘤細胞株的比較

細胞融合時脾細胞和骨髓瘤細胞數(shù)如表6所列，接種于24孔塑料板，每孔并含2×104巨噬細胞，第28天記錄活細胞數(shù)大于104者為陽性。

表6 骨髓瘤細胞株的比較

骨髓瘤細胞

參加融合的脾細胞數(shù)

總陽性孔

數(shù)

3×106

X63

3×106

107

3×107

237 Sp2/0

3×108

0

0107

0

43×107

表6說明，選擇合適的骨髓瘤細胞株，產(chǎn)生克隆的幾率較高，但不是都產(chǎn)生同一種抗體的。用骨髓瘤細胞x 63作為細胞融合的親代細胞，后來產(chǎn)生的存活的雜交細胞抹，實際上都帶有親代骨髓細胞瘤細胞基因密碼，因而各雜交細胞株產(chǎn)生的抗體（針對免疫原的)，都是球蛋白分子的混合物，上面帶有一個片段，就是所需要的鏈的結(jié)合物。4.7融合劑的比較

在細胞雜交時用同一種骨髓瘤細胞和同一種小鼠脾細胞，但PEG作用后的雜交細胞存活數(shù)比經(jīng)仙臺病毒作用的存活數(shù)要少，所以我們選用不同廠牌和分子量的PEG作細胞融合試驗，表上所列數(shù)據(jù)，為培養(yǎng)23天后，計數(shù)24孔培養(yǎng)孔中的陽性孔，結(jié)果如表7所示。

表7 PEG聚乙二醇比較表

產(chǎn)品來源

細胞融合方法

總陽性孔

Ⅰ

Ⅱ

Ⅲ

BDH200

0

0 Merck200

0

Serva200

0

0

0

0 Baker1000

0 BDH1000

0

Koch-Light1000 5

3數(shù) Merch1000 GK 12

3Serva1000

1Merck20000

由表7說明，所有低分子的PEG結(jié)果都差，其中有些是明顯有毒性反應(yīng)。但分子量太大陽性數(shù)也會有所下降，因為它們過份地粘稠，甚至加熱至45℃時，也會粘在管壁上，但當(dāng)高壓時加入等量的鹽水則較為穩(wěn)定。4.8細胞融合溫度的比較

脾細胞和骨髓瘤細胞在應(yīng)用前都泡在水浴中，洗細胞時也都用低溫離心機(2℃)。偶爾有一次制備細胞時沒有進行冷處理，而洗脾細胞時離心沉淀也在室溫進行，得到較多的雜交細胞株，這樣重復(fù)試驗，室溫比常規(guī)的4℃和0℃往往結(jié)果好，見表8。

表8 溫度對細胞融合的影響

實驗

0-4℃

20℃

5×106

5×10 6

1/24

8/24

4/24

21/24 2

5/24

27/48

15/48

46/48 3

3/24

15/24

5/24

22/24 4

4/24

14/24

6/24

24/24 總陽性孔數(shù)

113

脾細胞數(shù)如表8所列，分別與5×106FO細胞融合，融合溫度有0℃一4℃和20℃，在培養(yǎng)2l天時，活細胞數(shù)多于104為陽性。4.9各種營養(yǎng)液的比較

各種營養(yǎng)液與血清的比較分成幾個實驗進行，列于表9。

表9 各種營養(yǎng)液的比較

參加細胞

DMEM＋10%血清

RPMI＋10%血清

Iscove`s＋10%血清骨髓瘤細胞 脾細胞 馬

牛

胎牛

馬

牛

胎牛

馬

牛

胎

牛

X63（5×10 6）10 6

0

5×10 6

5×10 6

5×10 6 20

15 17

20

脾細胞(三只小鼠脾細胞混合物)和骨髓瘤細胞的用量如表9所列，接種于24孔培養(yǎng)板，每孔并含有3×104的巨噬細胞，第23天確定陽性培養(yǎng)孔數(shù)，本實驗包括三個內(nèi)容：脾細胞的用量，RPMI培養(yǎng)液和I scove` s培養(yǎng)瓶三種血清的比較。由表9可知：DMEM、RPMI、Iscove` s三種營養(yǎng)液都可得到較多的雜交細胞株，而對Iscove` s營養(yǎng)液比其他培養(yǎng)液要更好些。x 63的融合物在培養(yǎng)液中若用10％馬血清雖然可以，但并不是常常都很理想。為了避免以后需要克隆限制雜交細胞的數(shù)量，我們常規(guī)應(yīng)用Iscove` s培養(yǎng)液，也選用RPMI1840，因為它的緩沖能力較強，不完全依賴于合適的氣體環(huán)境。Sp2/0(2×107)10 6

0

0

0

0

0

FO(5×10 6)10 6

4.10細胞換液的方案

表10 不同細胞換液方案比較

實驗

換液方案

下列各天出現(xiàn)的陽性孔數(shù)

總陽性

6 8 10 12 14 16 20 24 28 Ⅰ

0

0

Ⅱ

0

07

Ⅲ

1數(shù)

Ⅰ

0

0

04

Ⅱ

0

410

1Ⅲ10 14 15

1516 17

表10試驗了在細胞融合后，直接加入HAT選擇培養(yǎng)波，讓其直接暴露于高濃度的氨基喋呤中，比較結(jié)果，把細胞融合物直接接種于HAT培養(yǎng)液中為優(yōu)。

4.11微量培養(yǎng)

表11 在微量培養(yǎng)板上作雜交瘤細胞株選擇培養(yǎng)

細胞融合物

培養(yǎng)板 FO細胞

脾細胞

標(biāo)準(zhǔn)板

微量5×10 6

2×10

板

6×10 6

15×10 6

10 7

2×10 6

6×10 6

15×10

2×10 7

2×10 6

6×10

15×10

表11可知，微量孔培養(yǎng)的雜交細胞數(shù)常多于常規(guī)培養(yǎng)孔，最高可達106，細胞融合混合物為6×106。脾細胞和107FO骨髓瘤細胞，接種整個微量培養(yǎng)板可希望獲得12—16個雜交瘤細胞抹。

高度免疫的BALB／c小鼠脾細胞和FO骨髓瘤細胞融合，用50％PEG 4000作為促進劑，細胞數(shù)皆列于下表，分別接種于24孔培養(yǎng)板(每孔含有2×104巨噬細胞于2mIHAT)和微量培養(yǎng)板(即96孔板，每孔含有3×103巨噬細胞于0.25HAT培養(yǎng)液中。)于第21天計算陽性數(shù)[3]。

4.12無血清培養(yǎng)液

檢測雜交瘤細胞株的產(chǎn)物常規(guī)是應(yīng)用其細胞培養(yǎng)瓶其中含有血清，也有胎牛血清。對檢測工作來說并不希望有這些東西，因為往往會干擾測定，或者對某些測定帶來較高的基礎(chǔ)值，也會造成單克隆產(chǎn)品分離和純化的困難、我們試用了標(biāo)記氨基酸或無血清培養(yǎng)液以取得在這種條件下的單克隆抗體。

用MEM作基礎(chǔ)，加入標(biāo)記物可獲得理想的結(jié)果，可以從商業(yè)購得缺乏亮氨酸的MEM，原液的配制：無亮氨酸的MEM 45ml，加入[14C]亮氨酸5m1[14C]leucinc(250uCi)、lml10％葡萄糖和0.5m120％牛血清蛋白，4℃?zhèn)溆?，在使用前臨時配制應(yīng)用液，即10ml原油十0.2m1100×谷酰胺十0.10m1100×丙酮酸鈉十0.2m1100×V itra—mines十 0.1m1100×抗菌素和0.01ml 0.1M硫乙二醇，接種106活細胞于此培養(yǎng)液中，37℃，過夜，此時最好應(yīng)用玻璃管并加塞[4]。

在實驗中，所有的雜交瘤細胞克隆只在Iscovs`s完全培養(yǎng)液中才能生長旺盛(GuiL—bert and lscove，1976Iscove和M elches，1978)，其中含有轉(zhuǎn)移素transferrin和血清蛋白為唯一的蛋白成份，雖然配制這種培養(yǎng)液比較麻煩，但能支持雜交細胞抹繼續(xù)生長和分泌抗體、每天能產(chǎn)生純抗體10-20mg。

5.結(jié)論

通過小鼠免疫培養(yǎng)，腹腔內(nèi)巨噬細胞的采取，微量培養(yǎng)，大孔培養(yǎng)，可得到一定量的雜交瘤細胞，同時分析了實驗的一些影響因素，結(jié)果如下。

（1）.各次細胞融合結(jié)果的差別，只有在巨噬細胞活躍的培養(yǎng)孔中，才能得到抗體陽性的雜交瘤細胞克隆。

（2）.巨噬細胞對雜交細胞的作用，不加巨噬細胞，沒有雜交單克隆細胞，加入巨噬細胞，結(jié)果大大增加。

（3）.加入巨噬細胞的用量和時間，投入實驗的脾細胞的量減少10倍，培養(yǎng)28天后，活細胞多于104的陽性孔。（4）.用不同動物巨噬細胞作為喂養(yǎng)細胞，巨噬細胞來源于何種品系的動物并不重要，來自不同種動物的腹腔洗液，或者雜交動物的小鼠、甚至大鼠或豚鼠的巨噬細胞都可促使雜交瘤細胞生長

（5）.限量脾細胞雜交試驗可知脾細胞加入量為4×106時，結(jié)果較好，細胞融合數(shù)較多。

（6）.骨髓瘤細胞株的比較中，選擇合適的骨髓瘤細胞株（x63），產(chǎn)生單克隆抗體的幾率較高，但不是都產(chǎn)生同一種抗體的。

（7）.融合劑 PEG聚乙二醇的比較中，所有低分子的PEG結(jié)果都差，其中有些是明顯有毒性反應(yīng)，但分子量太大陽性數(shù)也會有所下降。

（8）.細胞融合溫度的比較中，室溫比常規(guī)的4℃和0℃往往結(jié)果較理想。

（9）.各種營養(yǎng)液的比較，DMEM、RPMI、Iscove` s三種營養(yǎng)液都可得到較多的雜交細胞株，而對Iscove` s營養(yǎng)液比其他培養(yǎng)液要更好些。

（10）.不同細胞換液方案比較中，細胞融合物直接接種于HAT培養(yǎng)液中為優(yōu)。

（11）.在微量培養(yǎng)板上作雜交瘤細胞株選擇培養(yǎng)，可知微量孔培養(yǎng)的雜交細胞數(shù)常多于常規(guī)培養(yǎng)孔。

（12）.在無血清培養(yǎng)液中，所有的雜交瘤細胞克隆只在Iscovs`s完全培養(yǎng)液中才能生長旺盛。

6.參考文獻

[1]齊香君，現(xiàn)代生物制藥工藝學(xué)[M]，化學(xué)工業(yè)出版社，2003.9 [2]甄永蘇等，抗體工程藥物[M]，化學(xué)工業(yè)出版社，2002.5 [3]李元等，現(xiàn)代工程藥物[M]，化學(xué)工業(yè)出版社，2002.5 [4]張和君，單克隆抗體細胞免疫反應(yīng)技術(shù)[M]，云南科技出版社，1985.2 7.致謝

本課題在選題及研究過程中得到杜老師的悉心指導(dǎo)。在杜老師的精心指導(dǎo)下，為我們開拓研究思路，順利完成論文。杜老師一絲不茍的作風(fēng)，嚴謹求實的態(tài)度，踏踏實實的精神，不僅授我以文，而且教我做人，給以我們終生受益無窮之道。對杜老師的感激之情是無法用言語表達的。

第三篇：單克隆抗體藥物綜述

單克隆抗體藥物綜述

摘 要: 通過淋巴細胞雜交瘤技術(shù)或基因工程技術(shù)制備單克隆抗體藥物 ,已經(jīng)成為生物制藥領(lǐng)域的一個重要方面 ,由于單克隆抗體藥物專一性強、療效顯著 ,因此成為近年來研究的熱點藥物之一。此文就單抗藥物的分類、應(yīng)用進行了綜述 ,并對其應(yīng)用前景及存在的不足作了概述。

關(guān)鍵詞:單克隆抗體 抗體藥物 靶向 聯(lián)用

自 1975 年Koeh ler 和M ilstein 首先報道利用小鼠雜交瘤細胞制備單克隆抗體以來, 經(jīng)過近30 年的發(fā)展, 單抗技術(shù)在生命科學(xué)研究及醫(yī)學(xué)實踐方面作出了杰出的貢獻, 已經(jīng)成為了現(xiàn)代生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的支柱之一。

然而, 盡管單抗推動了生物診斷技術(shù)的革命, 但是在將單抗應(yīng)用于人體疾病的治療方面, 卻在長時間內(nèi)遲遲沒有進展。早期的臨床試驗結(jié)果都不盡人意, 這是因為鼠源單抗應(yīng)用于人體有許多限制].現(xiàn)今上市的單抗藥物, 治療的領(lǐng)域主要集中在腫瘤、自身免疫疾病、器官移植排斥及病毒感染等領(lǐng)域。由于單抗具有明確的作用位點, 與靶位點親和力高, 而且通過改造的抗體其免疫原性大大減弱, 這些因素使得單抗在臨床治療中具有特異性強、見效快、副作用較低等優(yōu)點, 因而單抗治療有著廣闊的前景。目前, FDA 批準(zhǔn)上市的 17 個單抗藥物中即有 8 個是用于治療淋巴細胞腫瘤、乳腺癌及結(jié)直腸癌等, 而在開發(fā)階段的單抗也有一半以上是與治療各種癌癥相關(guān)?？梢灶A(yù)見, 在未來幾年來將有更多的治療性單抗藥物上市, 其市場份額將進一步擴大。

目前, 單抗類藥物的市場銷售逐年提升的年均增長幅度在20%以上, 表現(xiàn)強勁。用于治療非霍奇金淋巴瘤的單抗藥物R ituxan 已成為世界第一的抗腫瘤藥物, 2003 年銷售為 14.89億美元, 2002 年為 11.63 億美元, 在 2002 年全球最暢銷前 50位商標(biāo)名處方藥中排名 43 位。用于治療關(guān)節(jié)炎的單抗藥物Rem icade, 2002 年銷售額為 12.97 億美元, 當(dāng)年全球藥物銷售排名第 37 位。2000 年世界單抗藥物的銷售額為 22.05 億美元, 據(jù)F ro st&Sullivan 預(yù)測, 到 2003 年銷售額將達到 47 億美元。

下面就單克隆抗體藥物的研究進展作一綜述。

1單克隆抗體藥物的分類

單抗藥物一般分為:治療疾病(尤其是腫瘤)的單抗藥劑、抗腫瘤單抗偶聯(lián)物、治療其他疾病的單抗。單抗藥劑針對的靶點通常為細胞表面的疾病相關(guān)抗原或特定的受體。如:最早被美國 FDA批準(zhǔn)用于治療腫瘤的單抗藥物利妥昔單抗;抗腫瘤單抗偶聯(lián)物 ,或稱免疫偶聯(lián)物(Immunoconjugate), 由單抗與有治療作用的物質(zhì)(如:放射性核素、毒素和藥物等)兩部分構(gòu)成 ,其中包括放射免疫偶聯(lián)物、免疫毒素、化學(xué)免疫偶聯(lián)物 ,此外還有酶結(jié)合單抗偶聯(lián)物、光敏劑結(jié)合單抗偶聯(lián)物等。

2作為腫瘤治療藥劑的單克隆抗體藥物

表1概括了近年來美國 FDA 批準(zhǔn)上市的 5 個治療腫瘤的單克隆抗體藥物的基本情況 ,下面具體加以介紹。

2.1利妥昔單抗 在自身免疫性疾病形成過程中 ,B 細胞起重要作用。CD20是前B細胞向成熟淋巴細胞分化過程中表達的表面抗原 ,參與調(diào)節(jié)B細胞的生長和分化。利妥昔單抗(美羅華)是一種針對 CD20抗原的人鼠嵌合型單克隆抗體 ,是第一個被FDA批準(zhǔn)用于臨床治療的單抗。進入人體后可與 CD20 特異性結(jié)合導(dǎo)致 B 細胞溶解 ,從而抑制 B 細胞增殖 ,誘導(dǎo)成熟 B細胞凋亡 ,但不影響原始B細胞。它能通過介導(dǎo)抗體依賴的細胞毒性(ADCC)、補體依賴的細胞毒性(CDC)作用和抗體與CD20分子結(jié)合引起的直接效應(yīng) ,包括抑制細胞生長 ,改變細胞周期以及凋亡等方式殺死淋巴瘤細胞[1 ]。

由于利妥昔單抗藥物可以提高腫瘤細胞對化療的敏感性 ,所以利妥昔單抗藥物的優(yōu)勢就在于與其他治療藥物及治療方式配合使用。臨床研究表明美羅華單藥或聯(lián)合化療治療腫瘤具有良好的療效和安全性 ,但還是存在一定的毒副作用。夏忠軍等[2 ]進行的臨床研究:34例確診惰性淋巴瘤的患者接受含利妥昔的方案化療 ,結(jié)果總有效率為 92.3 % ,完全緩解率為60.0 %。主要不良反應(yīng)為骨髓抑制 ,其它不良反應(yīng)包括惡心嘔吐、輕度脫發(fā)和肝功能受損等。張曉艷等[3 ]對 4例 CD20陽性非霍奇金淋巴瘤(NHL)病人進行了5次利妥昔單抗聯(lián)合自體外周血干細胞移植(APBSCT)的治療研究 ,結(jié)果顯示所有病人均對利妥昔單抗耐受良好 ,植入后在 8～11 d內(nèi)達造血重建 ,表明利妥昔單抗聯(lián)合APBSCT治療 CD20陽性NHL 是一種耐受及效果良好的方法。

2.2曲妥珠單抗

曲妥珠單抗為一種針對 HER22/ neu的重組人源化 IgG單克隆抗體 ,能特異性識別 Her22調(diào)控的細胞表面蛋白 HER22 ,使其通過內(nèi)吞噬作用離開胞膜進入核體內(nèi) ,抑制其介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo) ,從而起到治療腫瘤的作用。美國 FDA 于 1999 年批準(zhǔn)其上市 ,2002年在我國上市。大量臨床資料證實曲妥珠單用于乳腺癌的有效率為21 % ,而且它與化療聯(lián)合應(yīng)用明顯提高了生存時間[4 ]。據(jù)報道 ,歐洲曲妥珠單抗輔助治療試驗研究了曲妥珠單抗對 HER22 陽性伴有或不伴有淋巴結(jié)陽性的乳腺癌患者的療效 ,其中 1 組給予 1 年的曲妥珠單抗治療 ,另1組作為對照。曲妥珠單抗治療 1 年組與對照組相比 ,復(fù)發(fā)風(fēng)險減少了46 % ,兩組的整體生存率無明顯區(qū)別 ,說明曲妥珠單抗用于治療輔助化療后的 HER22陽性乳腺癌患者 ,明顯延長了患者的無病生存期[5 ]。我國也對曲妥珠進行了臨床研究 ,沈坤煒等[6 ]對 42 例 Ⅱ～ ⅢA期浸潤性乳腺癌患者紫杉醇聯(lián)合曲妥珠單抗治療 24 周 ,結(jié)果單用新輔助化療組完全緩解率為 26.3 % ,在新輔助化療聯(lián)用曲妥珠單抗組為65.2 % ,可見 ,對于 HER22 過表達的乳腺癌化療聯(lián)用曲妥珠單抗能顯著提高完全緩解率。

2.3阿倫珠單抗 阿倫珠單抗是人源化、非結(jié)合型單抗 ,作用靶點為正常與異常B淋巴細胞的 CD52 抗原 ,CD52 廣泛分布于正常的 B淋巴細胞、T淋巴細胞、單核細胞、巨噬細胞和B 淋巴細胞及T淋巴細胞瘤細胞表面 ,在慢性淋巴細胞白血病細胞表面尤為豐富。它與帶 CD52 的靶細胞結(jié)合后 ,通過宿主效應(yīng)子的補體依賴性細胞毒性(CDC)、抗體依賴性細胞毒性(ADCC)和細胞凋亡等機制導(dǎo)致細胞死亡。阿倫珠單抗作為一種作用機制獨特的單克隆抗體 ,對源于B和 T細胞的各種惡性腫瘤具有很好的治療作用。

英國科學(xué)家應(yīng)用阿倫珠單抗和利妥昔單抗治療復(fù)發(fā)性淋巴瘤患者 ,結(jié)果總反應(yīng)率為 52 % ,其中完全緩解 8 % ,表明聯(lián)合使用阿倫珠單抗和利妥昔單抗是安全可行的。在其它 T細胞惡性腫瘤的治療中:對 22 例 Ⅲ～ Ⅳ期皮膚 T細胞淋巴瘤(蕈樣肉芽腫病和 Sezary綜合征)患者靜脈輸注阿倫珠 12周 ,結(jié)果顯示阿倫珠具有非常好的療效 ,總有效率達 55 %。其中 ,紅皮病患者總有效率達 69 % ,片狀斑或皮膚腫瘤患者達40 %[7 ]。阿倫珠單抗聯(lián)合其他藥物、化療等治療腫瘤具有顯著的效果。但臨床研究表明 ,其還存在一些常見并發(fā)癥 ,如低血壓、寒顫、發(fā)熱、惡心、嘔吐、氣短、支氣管痙攣、皮疹、疲乏、呼吸困難、頭痛、腹瀉、感染等。2.4西妥昔單抗

西妥昔單抗為 IgG 1 單克隆抗體 ,是表皮生長因子受體拮抗劑 ,可與表達于正常細胞和多種腫瘤細胞表面的表皮生長因子受體(EGFR)特異性結(jié)合 ,并競爭性阻斷 EGF和其他配體 ,如α 2轉(zhuǎn)化生長因子(TGF 2 α)的結(jié)合。它通過增加細胞周期抑制因子 p27kip 使得細胞周期停留在 G 1 期;增加 Bax表達和減少 bcl22表達 ,誘導(dǎo)癌細胞的凋亡;它還可減少基質(zhì)金屬蛋白酶和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的產(chǎn)生。相關(guān)實驗表明 ,西妥昔單抗可抑制過度表達 EGFR的腫瘤細胞的增殖 ,但是對缺乏 EGFR表達的腫瘤細胞則沒有抗腫瘤效果 ,還發(fā)現(xiàn)西妥昔與化療聯(lián)用要優(yōu)于單獨化療[8 ]。

在對西妥昔單抗聯(lián)合化療的研究中 ,BOAD 試驗最為著名。576例晚期結(jié)直腸癌(ACRC)患者中 82 %的 EGFR 過表達。治療采取兩個方案 ,第1組用西妥昔單抗聯(lián)合伊立替康治療;第2組單獨用西妥昔單抗單藥治療。西妥昔單抗聯(lián)合伊立替康與單用西妥昔單抗相比 ,聯(lián)用療效優(yōu)于單一使用 ,有效率分別為23 %和11 % ,疾病控制率為 56 %和 32 % ,疾病進展中位時間為4.1和1.5個月 ,中位生存時間為8.6和6.9個月 ,而且西妥昔單抗并沒有增加化療的副作用。以上臨床實驗顯示:西妥昔單抗能夠克服 ACRC患者對伊立替康的耐藥性 ,生存質(zhì)量明顯提高[9 ]。西妥昔單抗的毒副作用包括:痤瘡樣皮疹、虛弱、腹痛、惡心、嘔吐、白細胞減少和過敏反應(yīng)等。其中痤瘡樣皮疹是最常見的不良反應(yīng) ,皮疹主要分布在臉部和軀干上部 ,這可能是由于西妥昔單抗干擾了 EGF的表皮生理作用所致[10 ]。

2.5貝伐單抗

貝伐單抗是抗VEGF的人源化單抗 ,主要通過中和VEGF來阻斷其與內(nèi)皮細胞上的受體結(jié)合 ,使得腫瘤細胞不能得到養(yǎng)分和氧 ,起到治療腫瘤的作用。Presta 等[11 ]將鼠抗人VEGF單克隆抗體(muMAB VEGF)A.4.6.1 的互補決定區(qū)與人 IgG 1的恒定區(qū)框架嵌合 ,并對相應(yīng)氨基酸殘基加以修飾 ,最終形成了人鼠嵌合型 VEGF單抗 ,仍然有 7 %的氨基酸來源于鼠抗體。實驗表明 ,貝伐單抗用于治療腫瘤安全有效。鄭航等[12 ]探究貝伐單抗聯(lián)合伊立替康治療轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌的療效 ,90例患者中給予貝伐單抗聯(lián)合伊立替康治療的一組有效率為43.3 % ,血清腫瘤標(biāo)志物的濃度治療前后有顯著變化。這說明貝伐聯(lián)合伊立替康治療轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌具有更高的疾病控制率。2005 年美國臨床腫瘤學(xué)會年會上報道了貝伐單抗的最新研究結(jié)果 ,采用貝伐單抗聯(lián)合伊立替康和順鉑一線治療轉(zhuǎn)移性胃癌或者胃食管連接部腺癌的患者 ,治療的不良反應(yīng)除了原有伊立替康和順鉑引起的腎髓抑制、胃腸道反應(yīng)等 ,還有貝伐單抗造成的不良反應(yīng)包括栓塞性疾病、胃穿孔等。

3抗腫瘤單抗偶聯(lián)物

3.1放射免疫偶聯(lián)物

放射免疫治療(RIT)是以單克隆抗體為載體 ,以放射性核素為彈頭 ,通過抗體特異性結(jié)合腫瘤細胞相關(guān)抗原 ,將產(chǎn)生高能射線的放射性核素靶向到腫瘤細胞 ,實現(xiàn)對腫瘤的近距離內(nèi)照射治療。RIT利用攜帶放射性核素的單克隆抗體特異地結(jié)合到病灶部位 ,減少了對正常組織的損傷。90Y— ibri2tumomab是第1個被 FDA批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床的放射免疫制劑 ,主要用于復(fù)發(fā)的淋巴瘤患者或?qū)为殤?yīng)用利妥昔單抗療效不佳的患者。

3.2免疫毒素

免疫毒素是用化學(xué)方法或基因工程方法將腫瘤選擇性單抗與經(jīng)修飾的多肽毒素共價連接而成的腫瘤治療藥物。免疫毒素可與腫瘤細胞表面受體或與細胞表面的靶抗原相結(jié)合后內(nèi)化 ,繼而在胞內(nèi)抑制細胞蛋白質(zhì)合成 ,導(dǎo)致腫瘤細胞死亡。毒素有很多種 ,如植物毒素、細菌毒素、動物毒素 , 其中引用最廣泛的是植物毒素中的白喉毒素。美國 FDA已經(jīng)批準(zhǔn)了白喉毒素與白細胞介素 2 重組的免疫毒素 ONTAK(DAB3892I L2),用于治療人皮膚 T細胞淋巴瘤[13214 ]。

3.3化學(xué)免疫偶聯(lián)物 單抗是藥物良好的靶向性載體 ,通過藥物分子上特殊的功能基團如:羥基、巰基、氨基等 ,將治療藥物與單抗相連接而組成化學(xué)免疫偶聯(lián)物 ,避免了藥物對其他正常組織的毒害作用,選擇性地發(fā)揮治療作用。常與單抗進行偶聯(lián)的藥物有阿霉素、柔紅霉素、平陽霉素、博安霉素、絲裂霉素、新制癌菌素、氨甲喋呤等。

4單克隆抗體在其他疾病中的應(yīng)用 單克隆抗體藥物不只在腫瘤的治療中取得了很好療效 ,在其他疾病的治療中也取得了一些療效 ,例如:奧馬珠單抗(omalizumab)通過與游離 IgE結(jié)合而顯著降低游離 IgE的水平,阻斷 IgE與肥大細胞、嗜堿粒細胞結(jié)合 ,防止炎癥介質(zhì)的釋放?？娠@著改善哮喘病人的癥狀、肺功能及生活質(zhì)量 ,減少哮喘惡化的發(fā)作次數(shù) ,減少糖皮質(zhì)激素的用量 ,使用安全 ,具有很好的耐受性[15 ]。Mab03.2C1C2 在體外能抑制白念珠菌芽管的形成 ,從而抑制白念珠菌對上皮細胞、內(nèi)皮細胞的粘附 ,降低白念珠菌的侵襲力。利妥昔單抗對類風(fēng)濕和系統(tǒng)性紅斑狼瘡也有很好的治療作用。英夫利昔單抗對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者疼痛、晨僵、關(guān)節(jié)腫脹等臨床癥狀減輕程度就可達60 %。另有研究顯示 ,輸注英夫利昔單抗可快速、顯著緩解頑固性銀屑病、關(guān)節(jié)炎病人的關(guān)節(jié)和皮損癥狀[16 ]。英利昔單抗對克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎、酒精性肝病等消化系統(tǒng)疾病都有較好療效 ,且在推薦的治療范圍內(nèi)安全性良好[17 ]。

參考文獻 [1 ] 馮潔.介紹幾種抗腫瘤的靶向新藥[J ].中國藥師,2006 ,9(2):1762178.[2 ] 夏忠軍.含美羅華方案治療B細胞性惰性淋巴瘤34例報告[J ].癌癥,2006 ,25(4):4902494.[3 ] 張曉艷.利妥昔單抗聯(lián)合自體外周血干細胞移植治療非霍奇金淋巴瘤[J ].中國新藥與臨床雜志,2006 ,7(19):5412544.[4 ] 吳鳳霞.Herceptin—一種治療乳腺癌的新藥[J ].中國生化藥物雜志,1999 ,20(1):47.[5 ] 董嵩,朱建權(quán),吳一龍.美國臨床腫瘤學(xué)報告[J ].循證醫(yī)學(xué),2006 ,6(2):67273.[6 ] 沈坤煒.紫杉醇序貫表阿霉素新輔助化療聯(lián)合曲妥珠單抗顯著提高病理完全緩解率[J ].循證醫(yī)學(xué),2006 ,4(6):84286.[7 ] 崔銀珠,胡江寧.慢性淋巴細胞白血病治行新藥 alemtuzumab[J ].世界臨床藥物,2004 ,25(5):2922296.[8 ]

Baselga J.The EGFR as a target for anticancer therapy 2 focus on cetux2imab[J ].Eur J Cancer 2001 ,37(4):16222.[9 ]

Nygren P ,S orbye H O ,Sterlund P ,et al.Targeted drugs in metastaticcolorectal cancer with special emphasis on guidelines for the use of be2vacizumab and cetuximab : an Acta Oncologica expert report [J ].ActaOncol ,2005 ,44(3):2032217.[10 ] Busam KJ ,Capodieci P ,Motzer R ,et al.Cutaneous side2effects in can2cer patients treated with the anti epidermal growth factor receptor anti2body C225[J ].Br J Dermatol ,2001 ,144(6):116921176.[11 ] Presta L G,Chen H ,C onnor S J ,et al.Humanization of an anti2vascularendothelial growth factor monoclonal antibody for the therapy of s olid tu2mors and other dis orders[J ].Cancer Res ,1997 ,57(20):459324599.[12 ] 鄭航,陳錦章,廖吐軍,等.貝伐單抗聯(lián)合伊立替康治療轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌的近期療效觀察[J ].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2006 ,2652269.[13 ] 馮仁田,何維.白細胞介素218 的研究進展[J ].中國生化藥物雜志,1999 ,20(2):1012103.[14 ] 裴瑾,楊成君,楊翰儀,等.白細胞介素 2 脂質(zhì)體的制備及其抗腫瘤作用的研究[J ].中國生化藥物雜志,1997 ,18(4):1662169.[15 ] 趙云峰,吳學(xué)玲,羅永艾.奧馬珠單抗對支氣管哮喘的治療作用[J ].中國新藥與臨床雜志,2005 ,24(1):68272.[16 ] 林金盈.生物制劑在風(fēng)濕病治療中的應(yīng)用[J ].廣西醫(yī)學(xué),2006 ,28(1):528.[17 ] 陳墾.英利昔單抗在消化系統(tǒng)疾病中的應(yīng)用狀況及前景[J ].中國醫(yī)院用藥評價與分析,2006 ,6(3):1512153.

第四篇：單克隆抗體藥物概述

單克隆抗體藥物概述

高熹

（2015級 交流學(xué)院 生物技術(shù) 168615140001）

摘要：單克隆抗體藥物作為一種具有獨特優(yōu)勢的生物靶向藥物，具有特異性高、靶向性強和毒副作用低的特點，在治療方面效果顯著。伴隨著抗體技術(shù)的不斷發(fā)展以及新型抗體的不斷出現(xiàn)，單克隆抗體藥物已成為制藥業(yè)發(fā)展最快的領(lǐng)域之一，目前正在研究的生物技術(shù)藥物中有四分之一都是單克隆抗體藥物，期間又涌現(xiàn)出了各種單抗衍生物，包括抗體藥物偶聯(lián)物、小分子抗體、雙特異性抗體等。本文就單克隆抗體藥物的分類、制備、應(yīng)用和發(fā)展等進行綜述。關(guān)鍵詞：單克隆抗體藥物；抗體技術(shù)；單抗衍生物

1975年分子生物學(xué)家G.J.F.克勒和C.米爾斯坦在自然雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上，創(chuàng)建立雜交瘤技術(shù)，他們把可在體外培養(yǎng)和大量增殖的小鼠骨髓瘤細胞與經(jīng)抗原免疫后的純系小鼠B細胞融合，成為雜交細胞系，既具有瘤細胞易于在體外無限增殖的特性，又具有抗體形成細胞的合成和分泌特異性抗體的特點。將這種雜交瘤作單個細胞培養(yǎng)，可形成單細胞系，即單克隆。雜交瘤技術(shù)為規(guī)?；a(chǎn)特異性高、結(jié)構(gòu)和性質(zhì)均一穩(wěn)定的單克隆抗體提空了有力的保障。單克隆抗體藥物的發(fā)展和現(xiàn)狀

1986年，F(xiàn)DA批準(zhǔn)了第一個鼠源單克隆抗體藥物Muromonab-CD3上市，用于預(yù)防腎移植時急性器官排斥。單克隆抗體藥物的發(fā)展因人抗鼠抗體反應(yīng)在1988年到1993年間陷入低谷。之后隨著重組DNA技術(shù)的發(fā)展，各種抗體人緣化技術(shù)迅速發(fā)展，單克隆抗體藥物經(jīng)歷了人鼠嵌合單抗、人源化單抗階段。隨后出現(xiàn)的噬菌體展示文庫技術(shù)和轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)，使全人源單抗的產(chǎn)生成為可能。過去的30年抗體工程的研究主要集中于減弱鼠源抗體的免疫原性和提高產(chǎn)生抗體的能力，如今全人源抗體已成為治療性單抗的主流，2002年第一個全人源抗體阿達木單抗上市。且隨著微生物和哺乳動物細胞等外源蛋白表達系統(tǒng)的技術(shù)進步和表達水平的提高，使治療性單克隆抗體在臨床和商業(yè)上都取得了巨大的成功。盡管如此，單克隆抗體藥物的發(fā)展仍然存在許多挑戰(zhàn)。迄今為止，大多數(shù)FDA 批準(zhǔn)上市的單抗藥物都是未經(jīng)修飾的全長抗體，這是相對分子質(zhì)量在150×103左右的大蛋白分子，這些抗體藥物在臨床應(yīng)用取得巨大成功的同時，本身的局限性也得到越來越多的關(guān)注[1]?，F(xiàn)如今，單抗藥物經(jīng)歷了市場和時間的考驗，已經(jīng)成為生物醫(yī)藥的最重要組成部分，在疾病治療上具有廣闊的應(yīng)用前景，成功用于治療腫瘤、自身免疫性疾病、感染性疾病和移植排斥反應(yīng)等多種疾病。治療性單抗的安全性和有效性很大程度上由其作用的靶點決定，上市和在研的單抗藥物有些靶向相同的靶點，有些有自己獨特的作用靶點，新的作用靶點也在不斷地出現(xiàn)。隨著研究深入、技術(shù)進步，單抗藥物呈現(xiàn)出旺盛的發(fā)展勢頭[2]。

隨著已上市品種的銷售額不斷增長以及新適應(yīng)癥的批準(zhǔn)和新品種的上市，單克隆抗體藥物市場容量迅速攀升。1997-2007年是全球單抗產(chǎn)業(yè)增長的爆發(fā)期，十年間CAGR高達58.6%。2008年-2015年，全球單抗產(chǎn)業(yè)增速放緩明顯，CAGR降至14.8%，但仍要顯著高于全球醫(yī)藥行業(yè)約5%的增速水平。1997年全球單抗藥物銷售額僅3.7億美元，2015年全球單抗藥物的銷售額已超過980億美元。1992-2015 年間，國外共批準(zhǔn)上市了61個原研抗體藥，其中后有6個退市。在現(xiàn)有上市的55個產(chǎn)品（49個單抗產(chǎn)品，6個具有抗體功能的受體-Fc融合蛋白）中，51個是由美國或歐盟首先批準(zhǔn)上市的，數(shù)量占比高達 92.7%，生產(chǎn)企業(yè)方面：羅氏、諾華等10家歐美企業(yè)共開發(fā)和生產(chǎn)了全球70%以上的抗體藥物，歐美國家在全球抗體產(chǎn)業(yè)中居于絕對主導(dǎo)地位。2015年全球最暢銷藥物TOP 10中有5個單抗，分別是阿達木單抗、英夫利昔單抗、利妥昔單抗、貝伐珠單抗和曲妥珠單抗，它們占據(jù)了單抗藥物的半壁江山，銷售額約為426.6億美元，約占2015年全球單克隆抗體藥物總銷售額的44%。根據(jù)預(yù)測，2016-2020 年，全球單抗產(chǎn)業(yè)仍將以9.84%的RAGR快速發(fā)展（同期全球藥品市場CAGR約為 5%），2020年市場規(guī)模有望突破1300億美元。

相比處于上升期的國外單抗產(chǎn)業(yè)，我國單抗產(chǎn)業(yè)仍處于初創(chuàng)期，單抗藥物仍以仿制為主，單抗藥物無論產(chǎn)品種類和銷售規(guī)模都遠低于歐美發(fā)達國家，并且進口單抗藥物占據(jù)了主要市場。2015年中國單抗藥物市場容量約為70多億元人民幣，約80%的市場被外資制藥企業(yè)占據(jù)。在單抗藥物領(lǐng)域，國內(nèi)制藥企業(yè)面臨市場快速增長和進口替代的雙重機遇。單克隆抗體研究已被列入863計劃和國家重點攻關(guān)項目。十三五期間，生物產(chǎn)業(yè)將是國家重點支持的戰(zhàn)略性新興產(chǎn)業(yè)。單抗藥物的研究、開發(fā)和市場應(yīng)用必將吸引一大批制藥企業(yè)的參與和布局。目前全國有100多家企業(yè)在做單抗，除了中信國健、百泰生物、海正藥業(yè)等一些老牌企業(yè)之外，近幾年還涌現(xiàn)出了很多新興企業(yè)，包括麗珠單抗、信達生物等。在2016三生制藥集團媒體開放日活動上，三生制藥集團董事長婁競博士表示三生制藥集團的3萬升生產(chǎn)線建成后將成為中國規(guī)模最大的單克隆抗體生產(chǎn)線，也是從細胞系、培養(yǎng)基、原液到制劑（多種劑型和規(guī)格）的全球最完整生產(chǎn)線之一。單克隆抗體藥物分類

根據(jù)來源的不同.單克隆抗體大體可分為4類,即鼠源化單克隆抗體、人鼠嵌

[3]合體單克隆抗體、人源化單克隆抗體、全人源化單克隆抗體，這也是單克隆抗體發(fā)展的四個重要的階段。2.1 鼠源化單克隆抗體

人用鼠源單抗的生產(chǎn)方法一般分為體內(nèi)法和體外法2種。2.1.1 體內(nèi)法

體內(nèi)法即腹水法。盡管腹水中抗體濃度比較高(2-10mg/ml),但由于所用的BALB/c小鼠必須達到SPF級,繁殖、飼養(yǎng)BALB/c小鼠及生產(chǎn)腹水、純化抗體的廠房必須符合GMP要求,WHO及我國對體內(nèi)法生產(chǎn)的人用鼠源單克隆抗體的質(zhì)檢項目繁多,要求嚴格,因此限制了體內(nèi)法在人用鼠源單抗生產(chǎn)領(lǐng)域的應(yīng)用。2.1.2體外法

體外法(雜交瘤細胞體外培養(yǎng)法)的產(chǎn)品純度高,可以避免鼠類病毒的污染,簡化質(zhì)檢項目,操作具有可控制性,適用于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn),因此是人用鼠源單抗生產(chǎn)方式的主要發(fā)展方向[4]。體外法的制備流程也基本相同，即從超免疫的供體中即抗原免疫的小鼠獲取脾細胞，選育出非分泌免疫球蛋白缺陷型的骨髓瘤細胞，待細胞融合后，對單個細胞進行克隆，體外培養(yǎng)出能分泌單抗的克隆細胞。

但鼠源單抗在臨床應(yīng)用方面存在著很大的弊端，主要是鼠源單抗與NK等免疫細胞表面Fc段受體親和力弱，產(chǎn)生的抗體依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒作用（ADCC）較弱，而且它與補體成分結(jié)合能力低，對腫瘤細胞的殺傷能力較弱，并且鼠源性抗體分子質(zhì)量較大,在人血循環(huán)中的半衰期短，在體內(nèi)穿透血管的能力較差;它發(fā)揮ADCC作用的時間較短；其次鼠單克隆抗體還具有免疫原性，易引起宿主過敏反應(yīng)[5]，產(chǎn)生人抗鼠抗體(HAMAs)，將其清除出體外，因此限制了它的應(yīng)用。2.2 人鼠嵌合單克隆抗體

抗體分子由兩個相同的輕鏈和兩個相同的重鏈組成，具有典型的功能區(qū)結(jié)構(gòu)，其與抗原的結(jié)合完全取決于氨基端的可變區(qū)。恒定區(qū)與抗體抗原結(jié)合無關(guān)，并且恒定區(qū)是抗體分子免疫原性的主要部位，因此可通過用人的恒定區(qū)取代鼠單抗的恒定區(qū)進行人源化，消除其大部分異源性，并能保留親本鼠單抗結(jié)合抗原的特異性和親和力，這種方法得益于DNA重組技術(shù)的發(fā)展。1984年首次應(yīng)用上述方法重組制備了抗半抗原磷酸膽堿的全分子人鼠嵌合抗體[6]。

嵌合抗體可將同一個可變區(qū)與不同類別的恒定區(qū)鏈接在一起，比較在相同特異性情況下不同類別的功能。其制備過程主要包括了可變區(qū)的克隆，表達載體的構(gòu)建及嵌合抗體的表達?？勺儏^(qū)基因的克隆在早期主要從雜交瘤細胞的基因組文庫中克隆出來帶有完整上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列的輕重鏈可變基因DNA片段，組裝到含有人恒定區(qū)的表達載體中。PCR方法的建立和發(fā)展為抗體可變區(qū)基因的克隆提供了簡便有效的方法。接著將控制小鼠抗體重鏈和輕鏈中可變區(qū)的基因片段與人抗體重鏈及輕鏈的不變區(qū)的基因片段在體外鏈接形成重組基因，然后導(dǎo)入真核細胞的某種表達質(zhì)粒中，再將這種含有重組基因的表達載體轉(zhuǎn)化哺乳動物骨髓瘤細胞，篩選能分泌完整抗體的轉(zhuǎn)化子。但嵌合抗體仍保留著30%左右的鼠源序列，并且其常達不到預(yù)期的效果。

嵌合抗體目前主要有3種應(yīng)用形式：嵌合免疫球蛋白G、嵌合Fab和嵌合,F（ab’）2。嵌合免疫球蛋白G因含有人抗體的Fc段，能介導(dǎo)補體及細胞對靶抗原的殺傷和吞噬作用，但因鼠源性成分較多，免疫原性大且組織穿透力差[7]；嵌合 Fab 和嵌合F（ab’）2抗體分子小、穿透力強，可充當(dāng)小分子載體用于放射免疫顯像及放射免疫治療。2.3 人源化單克隆抗體

由于鼠源抗體的可變區(qū)仍殘留一定的免疫原性人緣化單克隆抗體又較嵌合抗體有所改進。由于鼠源性抗體可變區(qū)中的骨架區(qū)仍殘留一定的免疫原性，為了最大限度地減少鼠源成分，用人骨架區(qū)替代鼠骨架區(qū)可形成更為完全的人源化抗體，即在此抗體中除了CDR是鼠源以外，其余全部是人源結(jié)構(gòu)。這一類型的抗體被稱為CDR移植抗體或改型抗體，包括完全CDR移植抗體、部分CDR移植抗體和特異決定區(qū)（SDR）移植抗體[8]。2.3.1 完全CDR移植抗體

完全CDR移植抗體由于鼠源性抗體VR中的骨架區(qū)仍殘留一定的免疫原性，為最大限度的減少鼠源成分，用人FR替代鼠FR可形成更為完全的人源化抗體，即在此抗體中除了３個CDR是鼠源以外，其余全部是人源結(jié)構(gòu)，這一類型的抗體稱為CDR移植抗體或改型抗體。應(yīng)用這一策略，將鼠源McAb的CDR區(qū)完全移植，得到了抗磷脂酰肌醇（蛋白）聚糖嵌合抗體。但隨后多項研究發(fā)現(xiàn)，簡單的CDR移植往往明顯降低抗原－抗體反應(yīng)的親和力，甚至喪失與抗原結(jié)合的能力。其原因在于FR不僅作為骨架對CDR起到支持作用，F(xiàn)R中的某些非CDR區(qū)補充調(diào)控殘基還為CDR的回折構(gòu)象提供必要的支持，其形狀和側(cè)鏈大小協(xié)同決定CDR的基本結(jié)構(gòu)，影響CDR與抗原結(jié)合的特異性和親和力[9-10]。2.3.2 部分CDR移植抗體

在簡單CDR移植的基礎(chǔ)上又相繼發(fā)展了部分CDR移植技術(shù)。研究發(fā)現(xiàn)輕鏈的 CDR1、CDR2和重鏈的CDR3對保證抗體與抗原特異性結(jié)合至關(guān)重要，其余三個CDR的作用則較低[11]。因此只將抗體結(jié)合抗原必須的CDR移植到人抗體的FR骨架上即能獲得對人免疫原性更小的嵌合抗體，這類抗體稱為部分CDR移植抗體。2.3.3 特異決定區(qū)移植抗體

正如并非所有的CDR在抗原抗體反應(yīng)中具有同樣的重要作用，X射線晶體衍射實驗提示具體到一個CDR中,不是所有的蛋白分子都參與抗原的特異性識別。執(zhí)行抗原識別的CDR中的一些特定區(qū)域稱為SDR。由此又產(chǎn)生了SDR移植抗體。該抗體是將McAb中與抗原結(jié)合密切相關(guān)的SDR等少數(shù)殘基移植到人抗體的相關(guān)部位，從而進一步提高抗體的人源化水平。根據(jù)目前的研究，抗體輕鏈的SDR多位于27d、34、50、55、89、96位殘基，而重鏈的SDR多位于31、35b、50、58、95、101位殘基[12]。基于上述兩種策略，部分CDR移植、SDR移植的構(gòu)建方法主要有：（1）模板替換，使用與鼠對應(yīng)部分有較大同源性的人FR替換鼠FR；（2）表面重塑，對鼠 CDR和FR表面殘基進行鑲飾或重塑，使其具有類似于人抗體CDR的輪廓或人FR的形式；（3）補償變換，對起關(guān)鍵作用的殘基進行改變以補償完全的CDR移植；（4）定位保留，人源化McAb以人FR保守序列為模板，但保留了鼠源McAb VR中參與抗原結(jié)合的氨基酸殘基，包括CDR和FR中的一些關(guān)鍵殘基。

2.4 全人源單克隆抗體

由于免疫原性的存在，人們一直在努力制備全人源化的單克隆抗體，目前主要有抗體庫技術(shù)和人源性抗體轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)兩種。2.4.1 抗體庫技術(shù)

抗體庫技術(shù)的主導(dǎo)思想是將某種動物的所有抗體可變區(qū)基因克隆在質(zhì)粒或噬菌體中表達，利用不同的抗原篩選出攜帶特異抗體基因的克隆，從而獲得相應(yīng)的特異性抗體?？贵w庫技術(shù)不僅可以模擬動物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體的過程，還具有許多獨特的優(yōu)點，令雜交瘤技術(shù)難以相比。抗體庫技術(shù)無需免疫，從理論上講，106-108的庫容就可能包容所有的抗體。利用抗原即可直接從非免疫動物抗體庫中篩選出特異性抗體，?并能篩選到針對該物種自身抗原的抗體。從人的抗體庫中可以得到完全是人源的McAb，?克服了難以用雜交瘤技術(shù)獲得人源McAb的障礙。此外，由于細菌細胞增殖快，培養(yǎng)成本低廉，利于大量制備高純度抗體。抗體庫技術(shù)主要包括了噬菌體抗體庫和核糖體展示技術(shù)。

噬菌體抗體庫技術(shù)：從免疫或未被免疫的B細胞中分離抗體可變區(qū)基因;PCR 擴增抗體全套基因片段(如VH、VL)，將體外擴增的VH、VL基因片段隨機克隆入相應(yīng)載體,形成組合文庫;將基因組合文庫插入噬菌體編碼膜蛋白的基因Ⅲ(g3)或基因Ⅷ(g8)的先導(dǎo)系列的緊靠下游，使外源基因表達的多肽以融合蛋白的形式展示在外殼蛋白gpⅢ或gpⅧ的N端。用固相化抗原經(jīng)“親和結(jié)合—洗脫—擴增”數(shù)個循環(huán)直接、方便、簡捷、高效地篩選出表達特異性好、親和力強的抗體噬菌體庫。

核糖體展示技術(shù)：將基因型和表型聯(lián)系在一起，編碼蛋白的DNA在體外進行轉(zhuǎn)錄與翻譯，由于對DNA進行了特殊的加工與修飾，如去掉3′末端終止密碼子，核糖體翻譯到mRNA末端時，由于缺乏終止密碼子，停留在mRNA 的3′末端不脫離，從而形成蛋白質(zhì)-核糖-2mRNA三聚體，將目標(biāo)蛋白特異性的配基固相化，如：固定在ELISA 微孔或磁珠表面，含有目標(biāo)蛋白的核糖體三聚體就可在ELISA 板孔中或磁珠上被篩選出，對篩選分離得到的復(fù)合物進行分解，釋放出的mRNA 進行逆轉(zhuǎn)錄酶鏈聚合反應(yīng)(RT-PCR)，PCR產(chǎn)物進入下一輪循環(huán)，經(jīng)過多次循環(huán)，最終可使目標(biāo)蛋白和其編碼的基因序列得到富集和分離。2.4.2 人源性抗體轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)

適宜基因工程改造的小鼠成為親和力成熟全人源抗體產(chǎn)生的強勁引擎，其體內(nèi)免疫系統(tǒng)自然選擇與成熟機制促使產(chǎn)生的抗體具備成為藥物的天然優(yōu)勢，包括高效與特異性、低免疫原性與可工藝性等。產(chǎn)生的系列抗體包括針對全新靶點的全新作用機制的抗體藥物，也包括針對經(jīng)典靶點的升級抗體藥物[13]。構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠，目的是用人的抗體基因轉(zhuǎn)入小鼠相應(yīng)基因，產(chǎn)生分泌人抗體的轉(zhuǎn)基因小鼠。在轉(zhuǎn)基因小鼠的基礎(chǔ)上，產(chǎn)生分泌抗體的轉(zhuǎn)基因小鼠。在目前FDA批準(zhǔn)上市的全人源單抗中，技術(shù)來源除了噬菌體抗體庫技術(shù)外，有三種轉(zhuǎn)基因小鼠平臺技術(shù)，即HuMAb-Mouse、XcnoMouse和VelocImmuneTM。

HuMAb-Mouse：HUMab轉(zhuǎn)基因小鼠整合入人抗體基因450kb(200kbIgH；230kb Igk，約占人類IgGκ的50％)，免疫該小鼠可以產(chǎn)生0.1-5nmol／L的抗體。雖然該小鼠轉(zhuǎn)入的人抗體基因組還是比較小，但仍獲得巨大成功。

XcnoMouse:XenoMouse轉(zhuǎn)基因小鼠也是目前最為成功、應(yīng)用最廣的轉(zhuǎn)基因小鼠之一。該轉(zhuǎn)基因小鼠整合入大部分人抗體VH和Vκ基因，大小分別為1020kb和800kb。重鏈包含34個V區(qū)基因、所有的重鏈D區(qū)和J區(qū)，以及Cγ

2、Cμ和Cδ基因，共66個功能基因；輕鏈包含18個V區(qū)基因、所有的5個J區(qū)和Cκ基因，共32個功能基因。該轉(zhuǎn)基因小鼠XMG2-KL可以產(chǎn)生全人IgM和IgG2，親和力可以達0.1～1nmol／L。

VelocImmuneTM：不同于以往的轉(zhuǎn)基因小鼠抗體篩選平臺，VelocImmuneTM產(chǎn)生人可變區(qū)與鼠恒定區(qū)組成的反向嵌合抗體。小鼠Ig H恒定區(qū)通過B細胞胞質(zhì)區(qū)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)域(如Igα與Igβ)傳遞天然的免疫信號，并通過與其他類型免疫細胞上的Fc受體的結(jié)合促使小鼠產(chǎn)生強大的免疫反應(yīng)，并提供半衰期長且親和力高的抗體。該類轉(zhuǎn)基因小鼠免疫后產(chǎn)生的抗體可變區(qū)編碼序列通過基因克隆技術(shù)與人源恒定區(qū)編碼序列進行構(gòu)建，反向嵌合抗體即可轉(zhuǎn)變?yōu)檫m宜藥用的全人源抗體。

另外轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)還有TC MouseTM、KM MouseTM和Five-feature mouse，但它們都還未經(jīng)過市場的檢驗。單克隆抗體衍生物

為了更好地發(fā)揮抗體藥物的治療效果，人們構(gòu)建各種形式的工程抗體來改善它們的特性和效能。例如，制備抗體和藥物的偶聯(lián)物，增加對靶細胞的殺傷；改變抗體分子大小，構(gòu)建小分子抗體，使之有較好的腫瘤/血液比；制備雙特異性抗體，同時結(jié)合兩個不同的抗原表位；增加抗體的親和力；改進抗體ADCC或CDC效應(yīng)；改變抗體的藥代動力學(xué)，使半衰期延長。3.1 抗體藥物偶聯(lián)物

抗體藥物偶聯(lián)物(ADC)是通過一個化學(xué)鏈接將具有生物活性的小分子藥物連接到單抗上，單抗作為載體將小分子藥物靶向運輸?shù)侥繕?biāo)細胞中[14]。單抗和小分子本身都是藥物，都可以單獨用來治療疾病，ADC的設(shè)計思路是利用兩者的長處來彌補可能的不足或者缺陷。單抗具有很高的專一性，但是通常藥效不強，往

往需要與小分子藥物治療并用；小分子藥物活性強，缺點是專一性較差，從而可能存在毒性，受副作用和劑量的影響較大；有些小分子藥物，特別是肽類藥物在血液中的半衰期過短，通過和單抗結(jié)合，可以改善這方面的缺陷。ADC 將兩者結(jié)合，在到達目標(biāo)細胞時將小分子藥物釋放出來，這不僅能靈敏地區(qū)分出健康和疾病組織，限制與非目標(biāo)細胞的作用，降低毒性，還能夠明顯改善藥代動力學(xué)和向目標(biāo)組織的傳遞[15]。

構(gòu)建抗體偶聯(lián)物主要有三個步驟：選擇合適的抗體、選擇合適的藥物和選擇合適的鏈接方式。這樣構(gòu)建的抗體偶聯(lián)物需要具有以下的特性：（1）穩(wěn)定性，鏈接需要在血液循環(huán)中保持穩(wěn)定，避免過早發(fā)生裂解，造成對健康組織器官損傷；（2）分特異性免疫反應(yīng)，即藥物結(jié)合到單抗不能破壞單抗本身的特異結(jié)合能力；（3）內(nèi)化和藥物的釋放，一般ADC都是通過單抗與目標(biāo)細胞結(jié)合后再內(nèi)化，將小分子藥物在細胞內(nèi)釋放，因此需要控制藥物的數(shù)量，以發(fā)揮最大的效果；（4）藥物作用，釋放出的藥物需要在很低的濃度（皮摩爾級）發(fā)揮效果，因此需考慮藥物的活性。3.2 小分子抗體

小分子抗體具有分子量小、穿透性強、抗原性低、可在原核系統(tǒng)表達及易于基因工程操作等優(yōu)點。常見的單價小分子抗體有Fab段、ScFv段、FV段、二硫鍵穩(wěn)定的Fv段、單域抗體和超變區(qū)等；多價小分子有雙鏈抗體、三鏈抗體和微型抗體等；特殊類型的小分子抗體有雙特異抗體和催化抗體等[16]。當(dāng)前，常用于生產(chǎn)小分子抗體片段的表達系統(tǒng)通常有大腸桿菌（E．coli）表達系統(tǒng)、酵母表達系統(tǒng)、昆蟲細胞表達系統(tǒng)和哺乳動物細胞表達系統(tǒng)四種[17]。小分子抗體的優(yōu)勢在于不需要糖基化修飾，可以在原核細胞中表達，操作方便。因此這四種表達系統(tǒng)的成本是依次增加的，但翻譯后的加工精確性和準(zhǔn)確度卻是依次遞減的。3.2.1 Fab抗體

Fab抗體由一條完整的輕鏈和重鏈Fd段通過一個鏈間二硫鍵連接組成一個異二聚體，大小為完整抗體的三分之一，但其仍保持了親本抗體的fv段結(jié)構(gòu)和與抗原結(jié)合的特異性與活性的能力。并且分子結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定具有穿透力強、免疫原性低，可與多種藥物及放射性同位素偶聯(lián)，可與多種毒素和酶結(jié)合，用作藥物的導(dǎo)向治療載體和顯影等特點。3.2.2 單鏈抗體

在DNA水平上用一段 適當(dāng)?shù)墓丫酆塑账嶙鳛檫B接肽（linker）將VH和VL連在一起，使之表達成為一條單一肽鏈，即為單鏈抗體（ScFv）。單鏈抗體大小僅為全抗體的六分之一，抗原性低，是具有完整抗原結(jié)合部位的最小片段,但有時構(gòu)建的ScFv其親和力明顯低于親本抗體，并常有聚集的傾向。3.2.3 單域抗體

由抗體輕、重鏈可變區(qū)基因（VH、VL）間通過一段連接肽基因拼接后表達形成的重組蛋白，大小為全抗體的六分之一，抗原性低，是具有完整抗原結(jié)合部位的最小片段。其分子量更小，具有一定的可溶性和穩(wěn)定性特點，相較于其它的抗體分子，單域抗體更容易進入細胞。3.2.4 雙特異性抗體

雙特異性抗體是含有2種特異性抗原結(jié)合位點的人工抗體，一個位點可與靶細胞表面抗原結(jié)合，另一個位點則可與載荷物如毒素、酶、細胞因子、放射毒素等耦合，能在靶細胞和功能分子（細胞）之間架起橋梁，激發(fā)具有導(dǎo)向性的免疫反應(yīng)，其靶向性的特點可以減少載荷物的毒副作用。單克隆抗體的應(yīng)用

隨著單克隆抗體的完善與推廣，單克隆抗體在農(nóng)業(yè)、食品、治療疾病等方面的應(yīng)用越來越廣泛，并取得了良好的效果。4.1 農(nóng)業(yè)和食品 由于單克隆抗體的高特異性和高靈敏性，單克隆抗體農(nóng)業(yè)和食品的應(yīng)用主要集中在了檢測方面。在食品中對動物性食品中β興奮劑、抗生素和激素等的檢測，植物性食品中農(nóng)藥殘留物的檢測，還可以檢測儲存食品中的微生物含量。在農(nóng)業(yè)中，單克隆抗體可以對牲畜的細菌、病毒和寄生蟲的患病情況進行篩選。在植物中，除了對病蟲害的診斷應(yīng)用以外，單克隆抗體還在藥用植物活性成分定性定量分析、成分分離、培植育種中得到了廣泛的應(yīng)用。4.2 醫(yī)學(xué)

單克隆抗體主要應(yīng)用在醫(yī)學(xué)方面，不僅為基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)提供了有價值的載體，更在臨床醫(yī)學(xué)得到了廣泛的應(yīng)用，如治療腫瘤、移植排斥、自身免疫病、心血管疾病、病毒感染等。4.2.1 治療腫瘤

近20年來，抗腫瘤抗體藥物已成為治療癌癥的重要方法，是治療癌癥最成功的的策略之一。據(jù)PharmaprojectsV5數(shù)據(jù)庫統(tǒng)計，目前上市與臨床在研的約500種抗體藥物中，約有50%用于腫瘤治療，臨床在研的抗腫瘤抗體藥物共約20多種，針對70多個靶點[18]。目前，銷量排名前五的抗體類藥物，其中有三個都是用于治療腫瘤，其中貝伐珠單抗用于治療轉(zhuǎn)移性癌癥，曲妥珠單抗通過附著在Her2上來阻止人體表皮生長因子在Her2上的附著，從而阻斷癌細胞的生長，利妥昔適用于復(fù)發(fā)或耐藥的濾泡性中央型淋巴瘤的治療。截止2015年底，F(xiàn)DA共批準(zhǔn)了21個抗腫瘤類藥物，2016年新批準(zhǔn)了用于膀胱癌靶向治療的Tecentriq和治療軟組織肉瘤的Lartruvo。近年來，利用單克隆抗體靶向治療腫瘤已經(jīng)成為全球靶向治療藥物的主流，免疫檢驗點靶向抗體藥物的研發(fā)更是極大地推動腫瘤免疫治療，是目前腫瘤治療的最熱點所在[19]。同時抗體治療聯(lián)合其他治療策略也成為了必然的發(fā)展趨勢，聯(lián)用型治療適用性更廣，臨床效果更持久，不良反應(yīng)更少，病灶去除更徹底，有效防止腫瘤的復(fù)發(fā)，顯著提高了存活率。4.2.2 器官移植

移植排斥是器官移植失敗的重要因素之一，而單克隆抗體可以有效地改善移植排斥反應(yīng)，其應(yīng)用也在不斷增長，目前的研究和應(yīng)用主要集中于清除不同種類的白細胞分化抗原（CD），例如采用抗CD154單克隆抗體阻斷免疫細胞活化信號傳導(dǎo)途徑,主要應(yīng)用于胰腺、心臟、皮膚等多個器官的移植，證明抗CD154單抗能有效地抑制移植排斥反應(yīng)，延長移植物的存活時間[20]。4.2.3 自身免疫病

自身免疫性疾病的治療通常采用的糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等,雖然有一定療效,但長期使用都會產(chǎn)生嚴重的不良反應(yīng),而且都只能減緩病情的發(fā)展,并不能根治疾病[21]。而單克隆抗體可以有效地改善和治療自身免疫病，主要有以下的三種作用機制。（1）封閉細胞因子和生長因子的單克隆抗體藥物，其中最成功的便是TNF抑制劑，包括伊納西普、英孚利昔、阿達木、賽妥珠和戈利木，適用于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、青少年關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、結(jié)腸炎、脊柱炎和銀屑病等；（2）受體阻滯和受體調(diào)節(jié)的單克隆抗體藥物，即單抗結(jié)合受體，阻斷配體和受體相互作用，下調(diào)細胞表面目標(biāo)受體的表達，這些抗體包括治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的IL-6受體抗體tocilizumab,重組非糖基化的人IL-1受體拮抗劑阿那白滯素(anakin-ra)等；（3）耗竭異常免疫細胞及介導(dǎo)細胞信號的單克隆抗體藥物，通過結(jié)合細胞表面抗原,如CD20,CD22、CD80和CD52,通過FcγR介導(dǎo)的ADCC作用和CDC作用殺傷異常的淋巴細胞，有治療1型糖尿病的otelixizumab、治療多發(fā)性硬化癥的阿倫和治療慢性淋巴細胞白血病ofatumumab等一系列單抗藥物。4.2.4 抗感染

細菌和病毒等病原體感染機體的機制復(fù)雜,由于單克隆抗體只能識別單一抗原表位,限制了抗體藥物的抗感染效果?？垢腥绢I(lǐng)域的抗體藥物發(fā)展緩慢，目前僅有抗呼吸道合胞病毒的帕利珠單抗以及抗炭疽桿菌的瑞西巴庫單抗兩個品種上市[22]。目前抗感染的單克隆抗體的研究熱點集中于埃博拉病毒抗體、抗呼吸道合胞病毒抗體、抗炭疽桿菌抗體等，2014年西非大規(guī)模埃博拉病毒疫情爆發(fā)后，實驗性抗體藥物ZMapp第一個被用于臨床治療，中國研制的抗體藥物MIL77也成功用于治療，抗體藥物再次顯示了在抗感染領(lǐng)域的應(yīng)用前景。單克隆抗體藥物可能存在的問題

單克隆抗體導(dǎo)致的不良發(fā)應(yīng)主要有皮膚及附件損害、全身反應(yīng)、心血管損害等，具體表現(xiàn)為皮疹、瘙癢、寒戰(zhàn)、發(fā)熱、心慌、心跳加快等，嚴重可導(dǎo)致急性呼吸衰竭、多器官功能衰竭、嚴重出血、腦梗死、過敏性休克等。單克隆抗體可能的不良反應(yīng)也許與以下3個機理之一有關(guān):所用mAb的異源性,特別是當(dāng)給予mAb而無相關(guān)的免疫抑制劑時；生理功能的抑制以及mAb的特異性；mAb與靶點結(jié)合后炎癥細胞或介導(dǎo)物的活性[23]。從發(fā)生人群來看，患者的年齡集中在兒童和老人，這可能是由于兒童的器官/系統(tǒng)發(fā)育不完善，使得個體對藥物的吸收、分布、代謝相對緩慢，藥物在體內(nèi)滯留的時間較長；而老人往往患有心血管疾病、高血壓、糖尿病等，這些可能都會引起不良反應(yīng)的發(fā)生。因此，臨床中使用單克隆抗體藥物是應(yīng)注意：（1）重視患者人群，注意防范兒童或老年患者不良反應(yīng)的發(fā)生。（2）注意首次用藥，初次靜脈滴注單克隆抗體時，應(yīng)控制滴速。（3）詢問患者藥物過敏史和既往病史。（4）使用前建議預(yù)防使用抗過敏藥物。（5）對具有肝炎病史的患者，注意對肝功能和病毒的檢測，避免肝病復(fù)發(fā)。（6）按照說明書使用單克隆抗體藥物，避免超說明書用藥。（7）單克隆抗體制劑應(yīng)保存在2-8℃的環(huán)境中，避免凍結(jié)。（8）輸注藥液的過程中，加強巡視，嚴密觀察藥物引起的不良反應(yīng)，及時給予相應(yīng)的處理，保證患者的用藥安全[24]。展望

單克隆抗體藥物這些特征使它成為了生物醫(yī)藥領(lǐng)域一顆耀眼的明珠。過去的30年中，隨著研究的不斷突破，單克隆抗體從鼠源發(fā)展到人緣，提高了單克隆抗體的藥效和安全性。雖然單抗藥物還存在一些尚未解決的問題，最突出的問題是如何降低單抗的免疫原性，單抗的異源性所引起的抗體反應(yīng)，不但降低了單抗的效價，而且會給患者帶來嚴重的后果。但是我們可以相信隨著研究的不斷深入；生產(chǎn)工藝的不斷成熟；檢測技術(shù)不斷的完善，現(xiàn)有的問題會逐一地解決，并且必將出現(xiàn)更高靶向性和藥效更強的單克隆抗體藥物，單克隆抗體藥物將在治愈疾病中顯示出它獨特的效果，為患者帶來更大的希望。

未來伴隨著生物技術(shù)制藥的發(fā)展，單克隆抗體將在其中占有更重要的地位，并逐漸成為生物醫(yī)藥領(lǐng)域發(fā)展的主要方向。目前單克隆抗體藥物快速擴大的市場已經(jīng)成為制藥業(yè)爭奪的焦點，為制藥公司提供了發(fā)展的契機。我國企業(yè)雖然進入該領(lǐng)域較晚，但在仿制單克隆抗體藥物的規(guī)模化、產(chǎn)業(yè)化的基礎(chǔ)上，積極探索、開發(fā)和創(chuàng)新，相信很快會在國際市場上占有一席之地。

參考文獻

[1]王志明, 楊立霞, 賈寅星,等.基于新興技術(shù)的單克隆抗體藥物的研究進展[J].中國新藥雜志, 2012(18):2149-2155.[2]王志明,高健,李耿.治療性單克隆抗體藥物的現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢[J].中國生物工程雜志,2013,33(6):117-124.[3]姜倩倩, 劉京貞, 蘇瑞強.單克隆抗體藥物進展[J].藥物生物技術(shù), 2005, 12(4):270-274.[4]王祥斌, 孔健.體外培養(yǎng)雜交瘤細胞生產(chǎn)人用鼠源單克隆抗體[J].中國生物制品學(xué)雜志, 2002,15(5):315-316.[5]Galun E;Terrauit N A;Eren R Clinical evaluation of a human monoclonal antibody against hepatitis C virus:safety andantiviral activity 2007.[6]BoulianneGL,HozumiN, Shulman MJ.Production of functionalchimaeric mouse/human antibody[J].Nature, 1984, 312(5995):643-646.[7]Siddiqui MZ.Monoclonal antibodies as diagnostics:an appraisal[J].Indian J Pharm Sci,2010,72（1）:12-17.[8]涂少華,陶嶸,沈江帆.單克隆抗體人源化技術(shù)研究進展[J].國際放射醫(yī)學(xué)核醫(yī)學(xué)雜志, 2014,38(5):328-331.[9] Herren W U, William D A, Melissa D.HUMANIZATION OF ANTIBODIES[J].Frontiers in Bioscience, 2008, 13(5):1619-33.[10]沈倍奮, 陳志南, 劉民培.重組抗體[J].2005(14):1544-1544.[11]Harding F A, Stickler M M, Razo J, et al.The immunogenicity of humanized and fully human antibodies: Residual immunogenicity resides in the CDR regions[J].Mabs, 2010, 2(3):256-265.[12]Sehlin D, Hedlund M, Lord A, et al.Heavy-Chain Complementarity-Determining Regions Determine ConformationSelectivity of Anti-AβAntibodies[J].Neurodegenerative Diseases, 2010, 8(3):117-23.[13] 王志明.轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)在全人源抗體藥物研發(fā)中的應(yīng)用[J].中國新藥雜志, 2016（22）：2596-2602.[14] Ornes S.Antibody-drug conjugates.[J].Mabs, 2014, 110(4):15-17.[15] Goldmacher V S, Kovtun Y V.Antibody-drug conjugates: using monoclonal antibodies for delivery of cytotoxic payloads to cancer cells.[J].Therapeutic Delivery, 2011, 2(3):397-416.[16]鄧寧, 向軍儉, 黃峙.小分子抗體技術(shù)研究進展[J].生物學(xué)通報, 2004, 39(8):1-3.[17]陳麗娟, 張麗華, 李杰,等.小分子抗體制備技術(shù)及臨床應(yīng)用進展[J].實用醫(yī)藥雜志, 2014(3):263-265.[18]陳雪靜, 常亮, 高健.抗腫瘤抗體藥物的研究進展[J].中國生物制品學(xué)雜志, 2015, 28(1):84-90.[19]張敏, 李佳, 俞德超.單克隆抗體藥物在腫瘤治療中的研究進展[J].實用腫瘤雜志, 2015, 30(6):495-500.[20]Margolles-Clark E, Jacques-Silva M C, Ganesan L, et al.Suramin inhibits the CD40–CD154 costimulatory interaction: A possible mechanism for immunosuppressive effects[J].Biochemical Pharmacology, 2009, 77(7):1236-45.[21]陳鏡宇, 魏偉.單克隆抗體治療自身免疫性疾病的研究進展[J].中國新藥雜志, 2011(8):697-703.[22]李新穎, 呂明.抗體藥物在抗感染領(lǐng)域的應(yīng)用[J].藥學(xué)學(xué)報, 2015(12):1527-1533.[23]安富榮, 施安國, 王平全.單克隆抗體的臨床用途及不良反應(yīng)[J].中國藥房, 2001, 12(3):181-183.[24]楊澍, 史海雯, 高秀清,等.單克隆抗體藥物致不良反應(yīng)132例文獻分析[J].中國藥房, 2015(23):3223-3225.

第五篇：氫氧化鐵的制備小教案

小教案

姓名：農(nóng)瑞嬌 學(xué)號：201010900006 姓名：梁艷榮 學(xué)號：201010900019

二氧化硫小教案

教學(xué)過程

【提出問題】SO2是一種大氣污染物，它是形成硫酸型酸雨的“罪魁禍?zhǔn)住保敲船F(xiàn)在就讓我們一起來探究SO2的實驗室制備方法和其化學(xué)性質(zhì)?！景鍟慷趸虻闹苽渑c性質(zhì)研究

【演示實驗】在玻璃皿中放蓋住小藥匙底部的少量亞硫酸鈉，將玻璃皿放在燒杯中。將分別滴加、品紅溶液、高錳酸鉀溶液、硫化鈉溶液的三張濾紙貼在漏斗內(nèi)壁，將漏斗倒扣在燒杯中，使玻璃皿在漏斗內(nèi)部。在漏斗的頸部上連接吸有幾滴濃硫酸的膠頭滴管。沿著燒杯避倒入適量的氫氧化鈉溶液，使液面漫過漏斗邊沿，但低于玻璃皿上沿。滴加濃硫酸，觀察漏斗壁上濾紙顏色的變化?！緦嶒灛F(xiàn)象板書】

（1）滴有 KMnO4 溶液的濾紙 褪色。

（2）滴有品紅溶液的濾紙褪色，加熱濾紙，后顏色重新變紅。（3）滴有 Na2S 溶液的濾紙變?yōu)辄S色?！菊砺?lián)系】

（1）滴有 KMnO4 溶液的濾紙

褪色，說明 SO2具有還原性，易被 KMnO4 所氧化。

（2）品紅溶液褪色，說明 SO2 具有漂白性；加熱已褪色的濾紙后濾紙變紅，說明SO2 的漂白性不穩(wěn)定。

（3）滴有 Na2S 溶液的濾紙變?yōu)辄S色，說明SO2 具有氧化性，易將-2價硫氧化為0價?！窘Y(jié)論板書】

二氧化硫的實驗室制法：H2SO4(濃)+Na2SO3=Na2SO4+SO2↑+H2O SO2具有還原性、氧化性、酸性、漂白性，且漂白性不穩(wěn)定。

二氧化氮的裝備及其性質(zhì)教案

1.教學(xué)目標(biāo)

（1）了解二氧化氮的物理性質(zhì)（2）掌握二氧化氮化學(xué)性質(zhì)

（3）通過觀察思考等過程訓(xùn)練科學(xué)的學(xué)習(xí)方法 2.教學(xué)重點

實驗原理和二氧化氮的化學(xué)性質(zhì) 3.課前準(zhǔn)備

所用實驗用品：50mL注射器，小燒杯三個（分別盛水，氫氧化鈉溶液，一個空的），大燒杯一個，大橡膠塞一個，表面皿一個，藍色石蕊試紙

所用藥品：銅片，濃硝酸，氫氧化鈉溶液，水 4.實驗演示過程

[提出問題]我們已經(jīng)學(xué)過二氧化氮的物理性質(zhì)和一些化學(xué)性質(zhì)以及它的制備原理，那在實驗中我們?nèi)绾蝸頇z驗它的一些化學(xué)性質(zhì)呢，由于二氧化氮是有毒氣體，在實驗中希望制備盡量少的氣體，又能完成性質(zhì)的檢驗，那我們用什么樣的實驗來實現(xiàn)我們的目的呢，下面就讓我們來看有關(guān)二氧化氮的制備和性質(zhì)檢驗的微型實驗。

[介紹媒體]我們這個實驗用的儀器很簡單，和一氧化氮的制備與性質(zhì)檢驗相似，用注射器做為反應(yīng)裝置，另外用到橡膠塞作為密封裝置。[實驗探究] 實驗原理： Cu﹢4HNO3（濃）﹦ Cu(NO3)2﹢2NO2↑+ H2O

相應(yīng)裝置（或?qū)嶒炑b置）

儀器藥品

注射器，小燒杯三個（分別盛水，氫氧化鈉溶液，一個空的），大燒杯一個，大橡膠塞一個，表面皿一個，藍色石蕊試紙

銅片，濃硝酸，氫氧化鈉溶液，水

實驗步驟

（1）在注射器中放入兩片銅片（約0.5克），將注射器推到底部（2）將輸液管插入濃硝酸中，吸入0.5ml后，將注射器插到橡膠塞上（3）待反應(yīng)停止后，看見紅棕色氣體，壓注射器活塞，引導(dǎo)學(xué)生觀察氣體顏色變淡還是變濃還是不變，取一張藍色石蕊試紙濕潤放在干凈的表面皿上，拔出注射器，讓藍色溶液流到大燒杯中，將試紙靠近針頭，試紙變紅色

（4）吸入6ml水在注射器中，看見紅棕色氣體變無色，讓水流出，吸入空氣，引導(dǎo)學(xué)生觀察那一瞬間出現(xiàn)紅棕色，（因為注射器中有水，二氧化氮溶于水所以紅棕色很快消失）實驗結(jié)束，將氣體推到氫氧化鈉溶液中。5.板書設(shè)計

二氧化氮的制備及其性質(zhì)檢驗

實驗原理：Cu﹢4HNO3（濃）﹦ Cu(NO3)2﹢2NO2↑+ H2O 化學(xué)性質(zhì)

現(xiàn)象：壓活塞，氣體顏色變淺 性質(zhì)：2NO2

N2O4 藍色石蕊試紙變紅 性質(zhì)：NO2為酸性氣體

吸入水后紅棕色氣體變成 無色溶液和無色氣體

氧化性，3 NO2﹢H2O﹦ NO ﹢2HNO3