第一篇：細胞工程實驗小結(jié)

細胞工程實驗小結(jié)

專業(yè)：生物技術(shù) 班級：0801 姓名：勵丹 學號：30804305

在本次暑期短學期的細胞工程實驗課上，我們做了細胞工程中基礎(chǔ)的幾個實驗——飼養(yǎng)層細胞的制備、動物細胞的原代培養(yǎng)（組織塊法培養(yǎng)小鼠肝臟細胞，消化法培養(yǎng)小鼠腎臟細胞）、免疫脾細胞的制備、免疫脾細胞與骨髓瘤細胞的融合、細胞的超低溫凍存與復(fù)蘇及活性測定（MTT法檢測）、抗體IgG的檢測（ELISA法），讓我受益菲淺。其中很多知識在平時的學習中都是無法學習到的，其中很多實驗都開闊了我們的視野，讓我們獲得了許多平時課堂上得不到的知識。在細胞工程實驗課即將結(jié)束的時候，我對這個短學期的學習進行總結(jié)，總結(jié)細胞工程課程試驗來的收獲與不足。

這次的實驗分成了8個小組，因為細胞工程的實驗都須在無菌室內(nèi)進行，而無菌室較小，所以各小組輪流進無菌室進行實驗操作，故沒輪到進無菌室的小組在外面的實驗室進行簡單的操練，所以較為輕松。

我們中的大多數(shù)人都是第一次進無菌室，對無菌室充滿了好奇。而進無菌室也需要一重重地滅菌，以確保無菌室內(nèi)的安全。首先需要用新吉爾滅溶液對需要帶進無菌室的物品及我們的手進行消毒滅菌，然后進入緩沖間穿戴無菌服、帽、手套及口罩。在進入無菌室后還需要用酒精棉擦拭手、超凈臺以及一些物品。在無菌室內(nèi)的操作都需在超凈臺上進行，而且需要在酒精燈邊上進行，不可以遠離超凈臺，否則可能使培養(yǎng)的細胞或培養(yǎng)液等受到污染，從而造成實驗失敗。

我們小組在細胞培養(yǎng)的實驗中較為成功，細胞生長狀態(tài)良好，沒有出現(xiàn)染菌現(xiàn)象。在進行細胞超低溫凍存于復(fù)蘇實驗時，我們組將兩只小鼠的細胞混在一起，是的細胞數(shù)增加，相對的在凍存中損傷的細胞數(shù)也增多，這個實驗應(yīng)該算不成功的。

通過9天的細胞工程實驗，我發(fā)現(xiàn)實驗是細胞工程學學的實踐，我們學到的許多理論都會最終作用于實驗，也學到了許多其他專業(yè)課上沒有教到的理論。很多實驗都是需要花費許多心思去學習的，也是非常復(fù)雜的。我們學習理科的同學，更加要重視實驗課，因為理論與實際結(jié)合是最重要。在每次實驗之后，我們都要做實驗報告，通過實驗講義和自己參閱資料，得知本次實驗的目的、原理、所需儀器、實驗步驟、實驗中的要求及注意事項等問題。實驗操作當然是細胞工程實驗的核心。

經(jīng)過了這次的實驗，我發(fā)現(xiàn)做實驗有許多需要注意的地方，掌握了這些技巧才能讓實驗結(jié)果變的更加準確和方便。做實驗的時候，一定要集中精神，尤其是細胞培養(yǎng)的實驗都需要在無菌室內(nèi)進行，操作不當就容易造成污染，使得實驗失敗，甚至會感染別組的實驗，因此集中注意力是相當重要的。其次，做實驗時要有足夠的耐心和定力，不能毛毛草草敷衍了事。最后，一定要知道實驗的注意事項，什么是不能做的，在做實驗時候我們就不能過于自私，把材料全部浪費完致使后面的同學無法試驗。更重要的是要學會團隊精神要學會照顧別人的感受。當然做完 實驗之后一定要還原好試驗環(huán)境，不能做完了就拍拍屁股走人，這是一名大學生應(yīng)有的素質(zhì)?？傊趯嶒炛行枰⒁獾氖虑檫€有很多。實驗完成之后自然是數(shù)據(jù)處理和實驗報告。實驗數(shù)據(jù)是對實驗分析的依據(jù)，切不可因為相多得幾分就偽造虛填試驗結(jié)果。不光要真實的填寫試驗結(jié)果，還要對試驗結(jié)果進行反思和總結(jié)。

當然，我也發(fā)現(xiàn)了我存在的很多不足。我的動手能力還不夠強。當有些實驗需要比較強的動手能力的時侯我還不能從容應(yīng)對，實驗就是為了讓你動手做，去探索一些你未知的或是你尚不是深刻理解的東西。現(xiàn)在，大學生的動手能力越來越被人們重視，光會背書是遠遠不夠的，我們的學習方式還有待改善。和老師的交談中我也了解了很多信息，有很多的感慨，這是讓我受益的另一方面。

總之，這9天的細胞工程實驗課讓我收獲頗豐，也發(fā)現(xiàn)了自身的許多不足的地方。我會將在實驗中學習到的東西發(fā)揮到更多的地方去，也將在今后的學習和工作中不斷提高、完善自我。在今后的學習、工作中取得更大的收獲，在將來畢業(yè)的時候能夠成為一個對社會有更大貢獻的人才。

第二篇：植物細胞工程實驗題

1、高壓滅菌鍋的工作原理和注意事項？

答：工作原理：在密閉的高壓滅菌鍋內(nèi)，其中的蒸氣不能外溢，壓力不斷上升，使水的沸點不斷提高，從而鍋內(nèi)溫度也隨之增加。在0.1MPa的壓力下，鍋內(nèi)溫度達121℃。在此蒸氣溫度下，持續(xù)15—30分鐘，可殺滅各種微生物及高度耐熱的芽孢。

注意事項：

a 待滅菌的物品放置不宜過緊；

b 堆放滅菌包時應(yīng)注意安全閥放汽孔位置必須留出空氣，保障其暢通，否則易造成鍋體爆裂事故。

c 必須將冷空氣充分排除，否則鍋內(nèi)溫度達不到規(guī)定溫度，影響滅菌效果； d 滅菌完畢后，不可放氣減壓，否則瓶內(nèi)液體會劇烈沸騰，沖掉瓶塞而外溢甚至導(dǎo)致容器爆裂。須待滅菌器內(nèi)壓力降至與大氣壓相等后才可開蓋。

2、超凈工作臺的工作原理是什么？

答：鼓風機送入的空氣先通過一個前置過濾器，濾掉大部分塵埃，再經(jīng)過一個高效過濾器，除去了大于0.3um的塵埃、真菌和細菌孢子等。從而形成連續(xù)不斷的無塵無菌的超凈空氣層流，其流速為24~30m/min，這樣的流速不會妨礙酒精燈的燃燒，同時工作人員在這樣的無菌條件下操作可保持無菌材料在轉(zhuǎn)接過程中不受污染。

3、母液配制的注意事項。

答：1）配制母液所需藥品應(yīng)采用分析純或化學純試劑。

2）配制母液用水為蒸餾水或去離子水，試劑可以通過加熱或磁力攪拌器加熱溶解。

3）母液保存時間不宜過長，如發(fā)現(xiàn)母液有混濁或沉淀現(xiàn)象發(fā)生，則棄之不用。

4）母液濃度不能過高，否則易產(chǎn)生結(jié)晶，影響試驗效果。

5）在配制大量元素母液時，混合、溶解各種無機鹽時要注意先后順序，盡量把Ca2+，SO42-,PO43-等離子錯開分別溶解，同時稀釋濃度要大些，并要慢慢地邊混合邊攪拌。

4、培養(yǎng)基配制過程中應(yīng)注意哪些因素？培養(yǎng)基為什么要煮沸后再分裝？

答：培養(yǎng)基配制過程中應(yīng)注意PH和滅菌；①PH影響外植體和培養(yǎng)材料對離子的吸收，過酸過堿的培養(yǎng)基影響培養(yǎng)材料的生長；此外，瓊脂培養(yǎng)基的PH值還影響到培養(yǎng)基的凝固狀況。②滅菌，植物組織培養(yǎng)必須在無菌環(huán)境中進行。培養(yǎng)基煮沸后再分裝的原因：因為含瓊脂的培養(yǎng)基會在40℃左右時凝固，因為要先在水浴中加熱，使其成為均勻液態(tài)時在尚未冷卻情況下盡快分裝。

5、培養(yǎng)基的滅菌過程。

答：①檢查滅菌鍋外層鍋內(nèi)水位，水量過少時應(yīng)加水。把分裝好的培養(yǎng)基及其他需滅菌的各種器具和蒸餾水放入滅菌鍋的消毒桶內(nèi)。

②蓋上鍋蓋，注意按照說明操作并確定已蓋好，設(shè)置好溫度和時間參數(shù)，開啟電源加熱滅菌。

③滅菌時間到后，先切斷電源，讓滅菌鍋內(nèi)溫度自然下降，待滅菌鍋壓力表指針降到0時，打開排氣閥，旋松螺栓，開啟鍋蓋，取出已滅菌的培養(yǎng)基。④剛滅過菌的培養(yǎng)基成液體狀，取出時不要用力搖動，否則會導(dǎo)致部分培養(yǎng)基沾附在瓶壁。放置在水平桌面上自然冷卻。在室溫下放置1-2天，觀察有無微生物生長，以確定培養(yǎng)基是否徹底滅菌。經(jīng)檢查沒有雜菌生長的方可使用。

6、調(diào)節(jié)pH值應(yīng)該調(diào)高0.2-0.3個單位，為什么？

答：因為在高壓滅菌過程中，培養(yǎng)基的某些成分會發(fā)生分解氧化，常使培養(yǎng)基的pH值發(fā)生一定幅度的變化，pH值的變化方向和幅度取決于多種因素，如培養(yǎng)基的成分，濃度，滅菌時間及溫度等，因此在設(shè)定培養(yǎng)基pH值時應(yīng)根據(jù)實際情況做適當調(diào)整。

7、哪些因素影響培養(yǎng)基的凝固？

答：1）pH值調(diào)節(jié)不準確，偏酸 ；

2）滅菌時間過長，破壞了瓊脂的結(jié)構(gòu)； 3）瓊脂質(zhì)量及用量的問題。

8、1mol/L HCl和NaOH的配制方法？

答：如要1mol/L HCl 配制1L（36%鹽酸密度 1.18g/mL，37%鹽酸密度 1.19g/mL，）

方法一：須配制1mol/L × 1L= 1mol HCl，則 1 × 36.5÷ 36% ÷1.18 =85.9mL。

方法二：1.18 × 1000 × 36% ÷ 36.5 = 11.64 mol/L，根據(jù)m1*v1=m2*v2，v1=（1mol/L × 1L）÷ 11.64 mol/L = 85.9 mL。即取36%鹽酸溶液85.9 mL定容于1L的蒸餾水水中。1mol/L NaOH的配制方法：取40g NaOH固體溶解于蒸餾水中，最后定容至1L。

9、為什么常在消毒液中加入1～2滴表面活性劑如吐溫80？

答：吐溫80作為一種表面活性劑，具有乳化、擴散、增溶、穩(wěn)定等作用。在消毒液中加入1～2滴吐溫80可以促使消毒液更充分地濕潤整個外植體組織，進而將消毒液滲透、擴散到菌團內(nèi)部，達到更好的消毒效果。

10.在接種過程中，通過哪些措施來防止雜菌對接種工具、接種材料的污染？ ? 污染原因歸結(jié)為3個方面: 1）是組織培養(yǎng)室或接種室的清潔問題;2）是外植體自身帶菌;3）是組織培養(yǎng)過程各環(huán)節(jié)操作不適宜或不嚴格。

11、胡蘿卜切塊滅菌后為什么要反復(fù)清洗？在接種時為什么一定要切割胡蘿卜塊的外圍？切割多大接種才最合適？被接種的部位一定要含有哪種組織，為什么？

增殖率=（增殖的外植體數(shù)量/接種外植體數(shù)量）*100%；

增殖系數(shù)（倍數(shù)）= 繼代培養(yǎng)后產(chǎn)生的莖芽總數(shù)/繼代接種時的外植體個數(shù)； 污染率=（污染的外植體數(shù)量/接種外植體數(shù)量）*100%；

誘導(dǎo)率(%)=(分化出叢生芽的外植體數(shù)量/接種外植體數(shù)量)*100%； 注：增殖率，誘導(dǎo)率的計算均應(yīng)除去污染的外植體。

第三篇：細胞工程

正交試驗設(shè)計過程

對于單因素或兩因素試驗，因其因素少，試驗的設(shè)計、實施與分析都比較簡單。但在實際工作中，常常需要同時考察3個或3個以上的試驗因素，若進行全面試驗，則試驗的規(guī)模將很大，往往因?qū)嶒灄l件的限制而難于實施。正交試驗設(shè)計就是安排多因素試驗、尋求最優(yōu)水平組合的一種高效率試驗設(shè)計方法。

一、正交試驗設(shè)計的概念及原理

1、正交試驗設(shè)計的基本概念

正交試驗設(shè)計是利用正交表來安排與分析多因素試驗的一種設(shè)計方法。它是由試驗因素的全部水平組合中，挑選部分有代表性的水平組合進行試驗的，通過對這部分試驗結(jié)果的分析了解全面試驗的情況，找出最優(yōu)的水平組合。

2、正交試驗設(shè)計的基本原理

在試驗安排中，每個因素在研究的范圍內(nèi)選幾個水平，就好比在選優(yōu)區(qū)內(nèi)打上網(wǎng)格，如果網(wǎng)上的每個點都做試驗，就是全面試驗。如上例中，3個因素的選優(yōu)區(qū)可以用一個立方體表示（圖10-1），3個因素各取3個水平，把立方體劃分成27個格點。若27個網(wǎng)格點都試驗，就是全面試驗。3因素3水平的全面試驗水平組合數(shù)為33=27，4因素3水平的全面試驗水平組合數(shù)為34=81，5因素3水平的全面試驗水平組合數(shù)為35=243，這在科學試驗中是有可能做不到的。正交設(shè)計就是從選優(yōu)區(qū)全面試驗點（水平組合）中挑選出有代表性的部分試驗點來進行試驗。

3、正交表及其基本性質(zhì)

3.1 正交表

由于正交設(shè)計安排試驗和分析試驗結(jié)果都要用到正交表，因此，我們先對正交表作一介紹。常用的正交表已由數(shù)學工作者制定出來，供進行正交設(shè)計師選用（詳見有關(guān)參考書）。正交表記號為La（bc），其中L代表正交表，a表示試驗的次數(shù)即行數(shù)，b表示因素的水平數(shù)，c表示因素的個數(shù)即列數(shù)。

3.2 正交表的基本性質(zhì)

3.2.1正交性

?任一列中，各水平都出現(xiàn)，且出項的次數(shù)相等；

? 任兩列之間各種不同水平的所有可能組合都出現(xiàn)，且出現(xiàn)的次數(shù)相等；

3.2.2代表性

? 一方面，任一列的各水平都出現(xiàn)，使得部分試驗中包括了所有因素的所有水平；任兩列的所有水平組合都出現(xiàn)，使任意兩因素間的試驗組合為全面試驗。另一方面，由于正交表的正交性，正交試驗的試驗點必然均衡地分布在全面試驗點中，具有很強的代表性。因此，部分試驗尋找的最優(yōu)條件與全面試驗所找的最優(yōu)條件，應(yīng)有一致的趨勢。

3.2.3綜合可比性

任一列的各水平出現(xiàn)的次數(shù)相等；任兩列間所有水平組合出現(xiàn)次數(shù)相等，使得任一因素各水平的試驗條件相同。這就保證了在每列因素各水平的效果中，最大限度地排除了其他因素的干擾。從而可以綜合比較該因素不同水平對試驗指標的影響情況。

根據(jù)以上特性，我們用正交表安排的試驗，具有均衡分散和整齊可比的特點。?所謂均衡分散，是指用正交表挑選出來的各因素水平組合在全部水平組合中的分布是均勻的。

所謂均衡分散，是指用正交表挑選出來的各因素水平組合在全部水平組合中的分布是均勻的5、試驗結(jié)果分析

? 分清各因素及其交互作用的主次順序，分清哪個是主要因素，哪個是次要因素； 判斷因素對試驗指標影響的顯著程度； 找出試驗因素的優(yōu)水平和試驗范圍內(nèi)的最優(yōu)組合，即試驗因素各取什么水平時，試驗指標最好； 分析因素與試驗指標之間的關(guān)系，即當因素變化時，試驗指標是如何變化的。找出指標隨因素變化的規(guī)律和趨勢，為進一步試驗指明方向； 了解各因素之間的交互作用情況； 估計試驗誤差的大小。

5.1直觀分析法——極差分析法

計算簡便，直觀，簡單易懂，是正交試驗結(jié)果分析最常用方法。

Rj為第j列因素的極差，反映了第j列因素水平波動時，試驗指標的變動幅度。Rj越大，說明該因素對試驗指標的影響越大。根據(jù)Rj大小，可以判斷因素的主次順序。

Kjm為第j列因素m水平所對應(yīng)的試驗指標和，kjm為Kjm平均值。由kjm大小可以判斷第j列因素優(yōu)水平和優(yōu)組合。

5.1.1確定試驗因素的優(yōu)水平和最優(yōu)水平組合分析A因素各水平對試驗指標的影響。根據(jù)正交設(shè)計的特性，對A1、A2、A3、A4來說，四組試驗的試驗條件是完全一樣的（綜合可比性），可進行直接比較。如果因素A對試驗指標無影響時，那么kA1、kA2、kA3、kA4應(yīng)該相等。如果kA1、kA2、kA3、kA4不相等。說明，A因素的水平變動對試驗結(jié)果有影響。因此，根據(jù)kA1、kA2、kA3、kA4的大小可以判斷A1、A2、A3、A4對試驗指標的影響大小。由于試驗指標為產(chǎn)率，若kA2>kA3>kA1>kA4，所以可斷定A2為A因素的優(yōu)水平。

同理，可以計算并確定B、C、D因素的優(yōu)水平。

5.1.1確定試驗因素的優(yōu)水平和最優(yōu)水平組合分析A因素各水平對試驗指標的影響。根據(jù)正交設(shè)計的特性，對A1、A2、A3、A4來說，四組試驗的試驗條件是完全一樣的（綜合可比性），可進行直接比較。如果因素A對試驗指標無影響時，那么kA1、kA2、kA3、kA4應(yīng)該相等。如果kA1、kA2、kA3、kA4不相等。說明，A因素的水平變動對試驗結(jié)果有影響。因此，根據(jù)kA1、kA2、kA3、kA4的大小可以判斷A1、A2、A3、A4對試驗指標的影響大小。由于試驗指標為產(chǎn)率，若kA2>kA3>kA1>kA4，所以可斷定A2為A因素的優(yōu)水平。

同理，可以計算并確定B、C、D因素的優(yōu)水平。

5.1.2確定因素的主次順序

根據(jù)極差Rj的大小，可以判斷各因素對試驗指標的影響主次。極差越大的，該因素對產(chǎn)率的影響越大，反之越小。

5.1.3繪制因素與指標趨勢圖

以各因素水平為橫坐標，試驗指標的平均值（kjm）為縱坐標，繪制因素與指標趨勢圖。由因素與指標趨勢圖可以更直觀地看出試驗指標隨著因素水平的變化而變化的趨勢，可為進一步試驗指明方向。

最后得出試驗的最優(yōu)組合和次優(yōu)組合。

5.2方差分析

極差分析法簡單明了，通俗易懂，計算工作量少便于推廣普及。但這種方法不能將試驗中由于試驗條件改變引起的數(shù)據(jù)波動同試驗誤差引起的數(shù)據(jù)波動區(qū)分開來，也就是說，不能區(qū)分因素各水平間對應(yīng)的試驗結(jié)果的差異究竟是由于因素水平不同引起的，還是由于試驗誤差引起的，無法估計試驗誤差的大小。此外，各因素對試驗結(jié)果的影響大小無法給以精確的數(shù)量

估計，不能提出一個標準來判斷所考察因素作用是否顯著。為了彌補極差分析的缺陷，可采用方差分析。

方差分析基本思想是將數(shù)據(jù)的總變異分解成因素引起的變異和誤差引起的變異兩部分，構(gòu)造F統(tǒng)計量，作F檢驗，即可判斷因素作用是否顯著。

方差分析基本思想是將數(shù)據(jù)的總變異分解成因素引起的變異和誤差引起的變異兩部分，構(gòu)造F統(tǒng)計量，作F檢驗，即可判斷因素作用是否顯著

5.2.1 偏差平方和

1616

nS總?（y?

n?1

2?y）?2

j2?n?12jyn?CT?IV2j2CT?G21616,G??n?1yn,f總?16?1?15S因素?Ij?II?III4?CT

Ij、IIj、IIIj、IVj分別表示第j列中1,2,3,4水平對應(yīng)的試驗結(jié)果之和。

總偏差平方和＝各列因素偏差平方和+誤差偏差平方和。

5.2.2自由度

f總=試驗的次數(shù)-1；f因=因素的水平數(shù)-1。

5.2.3方差

A因素的方差=A因素的偏差平方和/A因素的自由度

誤差的方差=誤差的偏差平方和/誤差的自由度

5.2.4構(gòu)造F統(tǒng)計量

5.2.5列方差分析表，作F檢驗

? 當FA>F0.01(f1，f2)時，說明該因子水平的改變，對試驗結(jié)果有高度顯著地影響，記作**。當F0.01(f1,f2)>FA>F0.05(f1,f2)時，說明該因子水平的改變，對試驗結(jié)果有顯著地影響，記作*。當F0.05(f1,f2)>FA>F0.10(f1,f2)時，說明該因子水平的改變，對試驗結(jié)果有一定的影響，記作*-。

查表可得F0.01(f1，f2)、F0.05(f1,f2)、F0.10(f1,f2)的值。

6、驗證試驗結(jié)果

經(jīng)結(jié)果分析得出最優(yōu)生產(chǎn)條件，進行最優(yōu)試驗條件的驗證。

7、結(jié)論

通過了驗證試驗，最后可以得出結(jié)論。

1] 唐宗祥等.小麥成熟胚離體培養(yǎng)研究[J].植物學報,2003,5-6.[2] 騰世云,王殿久.小麥幼胚組織培養(yǎng)及其再生植株移栽條件的研究[J].植物生物學學報,1990,1：49-55.[3] 王亞馥,崔凱榮,陳克明,等.小麥幼胚培養(yǎng)中體細胞胚發(fā)生和植株再生[J].植物學通報增刊,1992,：29.[4] Larkin PJ,Pyan SA,Brettell RIS,et al.Heritable Sornaclonal Variation

in Wheat.Theor.Appl.Genet.1984,67：443-445.[5] Maddock SE.VA Lancaster,R,Risiott,et al,Plant Regeneration From Cultered Immature Embryos and Inflorescences of 25 Cultivars of Wheat.Journal of Erperimental Botany,1983,34(144):915-926.[6] 楊淑慎,郭振,徐虹.小麥胚愈傷組織的誘導(dǎo)和植株再生[J].西北農(nóng)業(yè)學

報,2002,11(4):46-48.[7] 陳漳，來秀英.水稻種胚離體培養(yǎng)的遺傳研究[J].植物學報,l992,11:850-855.[8] 潘向群，梁海曼.大麥成熟胚培養(yǎng)的培養(yǎng)基研究[J].作物學報.1991.4:267-272.[9] 周洪生.甜玉米胚愈傷組織誘導(dǎo)、繼代、植株再生的研究[J].作物學

報,1993,1:55-61.[10] 柳建軍,于洪欣,馮兆禮.小麥成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)及分化的研究[J].山東農(nóng)業(yè)

大學學報,1996,4:451-456.[11] 梁竹青，高明尉.不同小麥基因型對體細胞組織培養(yǎng)的反應(yīng)[J].中國農(nóng)業(yè)科

學,1986,2:42-48.[12] 王大元.經(jīng)濟作物組織培養(yǎng)[M].北京:科學出版社,1988:73-78.[作者簡介] 孫百虎（1981-）男，陜西西安人，助教，天津大學在讀碩士，研究方向：生物技術(shù)。

S因素

F因素?f因素S誤差

f誤差

第四篇：細胞工程說課稿

《細胞工程》說課稿

各位專家、領(lǐng)導(dǎo)下午好！

今天我就《細胞工程》的教學向各位作一簡單匯報。

一、講教材

《細胞工程》我們采用的教材是國家高職高?！笆晃濉币?guī)劃教材，是在掌握“生物化學、細胞生物學、分子生物學、普通生物學”等的基礎(chǔ)上進行教學的?！凹毎こ獭笔乾F(xiàn)代生物技術(shù)的重要組成部分，同時也是現(xiàn)代生物學研究的重要技術(shù)工具。所以通過本課程的學習，學生要掌握生物組織、器官及其細胞離體培養(yǎng)的原理與技術(shù)，為從事生物學領(lǐng)域的相關(guān)研究及其與細胞工程有關(guān)的生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)奠定良好的理論和技術(shù)基礎(chǔ)。

本課程共分三大篇，第一篇為細胞工程的基本知識，第二篇為植物細胞工程，第三篇為動物細胞工程。整個課程是以“細胞全能性”為基本理論，“無菌操作”為主要操作技能，“定方案-配培養(yǎng)基-選擇外植體-培養(yǎng)”為基本流程。1.教學目標：理論知識方面，重點掌握本學科的基本原理和基本技術(shù)即：細胞全能性學說在細胞工程中的指導(dǎo)作用；掌握不同組織、器官的培養(yǎng)特點和控制方法。了解細胞工程的各類技術(shù)在現(xiàn)代生物學與生物技術(shù)領(lǐng)域的應(yīng)用途徑與發(fā)展?jié)摿Α?/p>

實踐技能方面，重點掌握細胞工程的基本操作技術(shù)—無菌操作；掌握外植體選擇、愈傷組織和胚狀體誘導(dǎo)、器官發(fā)生調(diào)控等基本技術(shù)；

2.教學重點難點：掌握”細胞全能性“理論的指導(dǎo)下，不同組織、器官和細胞培

養(yǎng)的調(diào)控方式。

3.情感態(tài)度：通過了解“細胞工程”技術(shù)在國民生活生產(chǎn)中的重要意義，來激發(fā)

學生的學習熱情和動力。同時在實驗操作中，培養(yǎng)學生的團結(jié)互助精神。

二、講教法

主要通過已有的生物的基礎(chǔ)知識和生活中的實例來引出學生的參與。

《細胞工程》有三大篇組成，第一篇是基礎(chǔ)知識部分，主要內(nèi)容圍繞“基本儀器的功能，配制培養(yǎng)基和創(chuàng)造無菌環(huán)境”展開。利用學生掌握的生物知識，根據(jù)培養(yǎng)基的功能讓學生嘗試著回答出“培養(yǎng)基的主要組成成分”。講到創(chuàng)造無菌環(huán)境部分，用家庭中開水燙容器和大型餐廳用紫外消毒柜給餐具消毒的事例引出所用儀器設(shè)備以及環(huán)境消毒的原則和方法。第二篇和第三篇以同一種模式講解，多“以舊帶新”的方式講，在掌握植物組織培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，整個講課環(huán)節(jié)都可以在共性的基礎(chǔ)“選擇培養(yǎng)材料→選擇培養(yǎng)基→在合適條件下培養(yǎng)”上，然后根據(jù)每一章節(jié)的特殊之處進行詳細講解。例如“莖尖脫毒技術(shù)”中，除植物組織培養(yǎng)流程之外，需要補充到病毒的檢測和脫毒的預(yù)處理，同時莖尖剝離技術(shù)也是需要掌握的重點技能。在課堂講操作原則，實踐課上進行具體的操作。

三、講學法

學生在掌握基本知識和操作技能的基礎(chǔ)上，通過老師的提示，在課堂上回答新的

第五篇：題庫細胞工程

2

細胞工程：以生物細胞、組織或器官為研究對象，運用工程學原理，按照預(yù)定目標，改變生物性狀,生產(chǎn)生物產(chǎn)品，為人類生產(chǎn)或生活服務(wù)的科學。

2

培養(yǎng)基母液：把培養(yǎng)基中的各種大量元素用量擴大l0倍，微量元素、有機元素和激素等用量擴大l00倍，分別或混合溶解制成濃縮液，這種濃縮液稱為母液 2

植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)：調(diào)節(jié)植物生長的物質(zhì)，以極微小的量影響到植物細胞的分裂、分化、發(fā)育，影響植物的形態(tài)建成、開花、結(jié)實、成熟、脫落、衰老和休眠、萌發(fā)等許許多多的生理生化活動，包括植物激素和人工合成的植物生長調(diào)節(jié)劑

2

離體培養(yǎng)：指從植物體分離出符合需要的組織、器官、細胞或原生質(zhì)體等，通過無菌操作，在人工控制條件下進行培養(yǎng)以獲得再生的完整植株或生產(chǎn)具有經(jīng)濟價值的其他產(chǎn)品的技術(shù)

2

細胞全能性：是指細胞具有發(fā)育成完整個體的遺傳潛能。也可以指個體某個器官或組織已經(jīng)分化的細胞在適宜的條件下再生成完整個體的遺傳潛能。

2

外植體：指用于離體培養(yǎng)的活的植物器官、組織、細胞和原生質(zhì)體等

2

愈傷組織：自然條件下，植物在受傷之后，創(chuàng)傷部位的細胞脫分化不斷增殖，形成松散排列、無特定結(jié)構(gòu)的非器官化組織

組織培養(yǎng)中，人工培養(yǎng)基上由外植體細胞經(jīng)脫分化產(chǎn)生的一團不定形的、疏松排列的、沒有分化的薄壁細胞

2

極性：通常是指在器官、組織甚至細胞中，在不同的軸向上存在某種形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理生化上的梯度差異。

2

細胞分化：由發(fā)育起始狀態(tài)的合子沿個體發(fā)育方向不斷分化出形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理功能不同的細胞、組織、器官而最終形成完整植株的過程

2

細胞去分化：一個成熟細胞回復(fù)到分生狀態(tài)或胚性細胞狀態(tài)的現(xiàn)象，即失去已分化細胞的典型特征的過程

2

細胞再分化：脫分化的分生細胞重新恢復(fù)分化能力，沿著正常的發(fā)育途徑，形成具有特定結(jié)構(gòu)和功能的細胞的過程

2

胚狀體：經(jīng)體細胞胚發(fā)生形成類似合子胚的結(jié)構(gòu)

2

次生胚：有些植物從體細胞胚的細胞中又可產(chǎn)生體細胞胚，這一過程稱為重復(fù)體細胞胚胎發(fā)生，形成的體細胞胚稱為次生胚 2

胚性細胞：又稱體胚原始細胞，一類獨特的細胞，它與分生細胞相似，通常較小，近圓形，具較大的核和核仁，并能高度染色，胞質(zhì)濃厚

2

看護培養(yǎng)：用一塊活躍生長的愈傷組織塊來看護單個細胞使其生長和增殖 2

人工種子：將植物離體培養(yǎng)中產(chǎn)生的胚狀體（體胚）或者能發(fā)育成完整植株的分生組織（不定芽、小鱗莖、短枝、毛狀根、愈傷組織等），包裹在有養(yǎng)分和具有保護功能的物質(zhì)中形成的類似于天然植物種子的結(jié)構(gòu)，并在適宜條件下發(fā)芽出苗的顆粒體。

2

原生質(zhì)體：去除細胞壁后存活的植物細胞

2

細胞系：經(jīng)過再培養(yǎng)后而形成的具有增殖能力、特性專

一、類型均勻的培養(yǎng)細胞 2

細胞融合：是在自發(fā)或人工誘導(dǎo)下，兩個不同基因型的細胞或原生質(zhì)體融合形成一個雜種細胞。

2

體細胞雜交:采用細胞融合的方法，使原來不能或很難進行有性雜交的兩種生物，通過體細胞融合將它們的染色體核基因共存于一個雜交細胞 2

體細胞變異：非性細胞產(chǎn)生的遺傳變異或表觀遺傳變異

體細胞無性系變異：植物外植體經(jīng)組織、細胞培養(yǎng)的脫分化和再分化過程，表現(xiàn)于再生植株中的變異

2

突變體：是指發(fā)生突變的個體，具有與野生型不同的表型的特點。由于基因或染色體的DNA序列發(fā)生改變，導(dǎo)致細胞或生物體獲得了不同于野生型（原始、未突變）的新表型

2

異核體：不同種屬或同一種屬的不同生物個體的親本細胞發(fā)生融合所形成的含有不同細胞核的融合細胞

2

成批培養(yǎng)：將一定量的細胞或細胞團分散在一定量的液體培養(yǎng)基中進行密封培養(yǎng)看賣弄

2

原代培養(yǎng)：也稱初代培養(yǎng)期。從體內(nèi)取出組織接種在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)到第一次傳代前階段，一般持續(xù)1-4周。

繼代培養(yǎng)：是指愈傷組織在培養(yǎng)基上生長一段時間后，營養(yǎng)物枯竭，水分散失，并已經(jīng)積累了一些代謝產(chǎn)物，此時需要將這些組織轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基上，這種轉(zhuǎn)移稱為繼代培養(yǎng)或傳代培養(yǎng) 接觸抑制：當細胞在基質(zhì)上分裂增殖，逐漸匯合成片即每個細胞與其周圍的細胞相互接觸時，細胞就停止增殖，即細胞密度不再增加

【簡答題】：

1.簡述細胞工程在生物技術(shù)領(lǐng)域中的地位。

細胞工程是細胞水平上的生物工程，是現(xiàn)代生物技術(shù)的橋梁與紐帶，也是該領(lǐng)域中最直接應(yīng)用于生產(chǎn)實踐并取得顯著效益的應(yīng)用科學。它與其他相關(guān)學科理論（基因工程、發(fā)酵工程、生化工程等）交叉發(fā)展，必須與其它生物技術(shù)相結(jié)合才能更好地發(fā)揮作用

2.目前，常用的植物細胞培養(yǎng)基種類有哪些？各有什么特點？

1）MS培養(yǎng)基

特點是無機鹽和離子濃度較高，是較穩(wěn)定的平衡溶液。養(yǎng)分的數(shù)量和比例較合適

2）B5培養(yǎng)基

其主要特點是含有較低的銨，這是因為銨對不少培養(yǎng)物的生長有抑制作用。

3）White培養(yǎng)基

其特點是無機鹽數(shù)量較低，適于生根培養(yǎng)

4）N6培養(yǎng)基

其特點是成分較簡單，KNO3和（NH4）2SO4含量高。5）KM8P培養(yǎng)基

其特點是有機成分較復(fù)雜，它包括了所有的單糖和維生素，廣泛用于原生質(zhì)融合培養(yǎng)。

3.配制培養(yǎng)基時，為什么要先配母液？如何配制母液？

1）培養(yǎng)基中含有的元素很多，每次配制培養(yǎng)基時，要對所有的元素一個個進行稱量、溶解，非常繁瑣。特別是微量元素用量很少，用普通天平很難稱量準確。配制母液不但可以保證各物質(zhì)成分的準確性及配制時的快速移取，而且還便于低溫保藏，可多次利用

2）確定培養(yǎng)基----按照擴大倍數(shù)稱量----溶解----按順序混合----定容----母液分裝----貼標簽----保存于冰箱

大量元素應(yīng)配成濃度為10倍的母液，一般將微量元素配制成100倍的母液，使用時再稀釋100倍

配置時化合物應(yīng)分別稱量，分別溶解；混合時注意先后順序，防止產(chǎn)生沉淀；混合時要邊攪拌邊混合

4.例舉三種常用的物理滅菌方式，簡述其原理和優(yōu)缺點。

濕熱滅菌：在密閉的蒸鍋內(nèi)，蒸汽不能外溢，壓力不斷上升，使水的沸點不斷提高，從而鍋內(nèi)溫度也隨之增加。在0.1MPa的壓力下，鍋內(nèi)溫度達到121℃。在此蒸汽溫度下，可以很快殺死各種細菌及其高度耐熱的芽孢（穿透力強）干熱滅菌：利用烘箱烘烤滅菌，溫度與滅菌時間成反比，一般設(shè)定160℃，滅菌時間2-3h，主要用于玻璃器皿的滅菌

過濾滅菌：用細菌不能通過致密具孔濾材的原理以除去氣體或液體中微生物的方法。常用于氣體、熱不穩(wěn)定的藥品溶液或原料的除菌

5.常用的滅菌方法有哪些，各有哪些優(yōu)缺點？

1）濕熱滅菌（高壓蒸汽滅菌）優(yōu)點：高溫高壓蒸汽對生物材料有良好的穿透力，能造成蛋白質(zhì)變性凝固而使微生物死亡，是一種最有效的滅菌方法。缺點：如果是對培養(yǎng)基或液體溶液滅菌，滅菌時間與需要滅菌的培養(yǎng)基或液體溶液的體積密切相關(guān)，時間不足達不到滅菌效果，時間過長培養(yǎng)基內(nèi)的化學物質(zhì)遭到破壞，影響培養(yǎng)基成分。

2）過濾除菌 優(yōu)點：有些滅菌的材料不能受熱，可以用過濾法來滅菌，可以濾除絕大多數(shù)微生物的營養(yǎng)細胞 缺點：易污染，過濾法的最大缺點是不能濾除病毒.多數(shù)濾器具吸附性

3）干熱滅菌 優(yōu)點：在干熱條件下可將細菌殺死，方便，不易污染，殺菌效果較理想 缺點：干熱滅菌存在能源消耗大、浪費時間、安全性差問題；在干燥狀態(tài)下，熱穿透力弱，溫度不宜均勻

4）紫外線滅菌 優(yōu)點：具有較高的殺菌效率，運行安全可靠；對隱孢子蟲和賈第蟲有特效消毒效果；不產(chǎn)生有毒有害產(chǎn)物；操作簡單 缺點：由于紫外線穿透物質(zhì)的能力很弱，所以只適于空氣中和物體表面的滅菌，而且要求距照射物質(zhì)以不超過1.2m為宜。

5）藥劑滅菌 優(yōu)點：方法簡便，只需要藥劑噴灑在要消毒的空間或材料表面即可，殺菌又除塵 缺點：濃度太高，可能有腐蝕作用

6.配制培養(yǎng)基時，加入一定量的植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，它們在離體培養(yǎng)過程中有哪些作用？

包括植物生長調(diào)節(jié)劑與植物激素，是植物細胞生長的調(diào)節(jié)物質(zhì)，以極微小的量起作用。它能誘導(dǎo)細胞分裂、愈傷組織再分化以及胚狀體發(fā)育。植物激素主要包括生長素類、細胞分裂素類和赤霉素類，有時也使用脫落酸、乙烯等物質(zhì)。

生長素類：用于誘導(dǎo)愈傷組織的形成、根的分化以及細胞的分裂和伸長，誘導(dǎo)胚狀體產(chǎn)生

細胞分裂素類：促進細胞分裂和分化，誘導(dǎo)胚狀體和不定芽形成，延緩組織的衰老并增強蛋白質(zhì)的合成

赤霉素：加速細胞的伸長生長，也促進細胞分裂。

大多數(shù)情況下對組培中器官和胚狀體的形成表現(xiàn)抑制作用，但對已形成器官和胚狀體的生長通常有促進作用 脫落酸：適量的ABA可提高體細胞胚發(fā)生的頻率和質(zhì)量，抑制異常體細胞胚的發(fā)生

7.試述植物細胞全能性的含義和應(yīng)用。

含義：植物細胞無論是體細胞還是生殖細胞均具有該物種的全套遺傳信息；只有在適宜的條件下，植物細胞才具有發(fā)育成完整植株的能力；植物每個細胞均具有發(fā)育成完整植株的能力

應(yīng)用：無性系的快速繁殖；培養(yǎng)無病毒種苗；新品種的選育（花培和單倍體育種、離體胚培養(yǎng)和雜種植株的獲得、體細胞誘變和突變體篩選、細胞融合和雜種植株的獲得）；人工種子；藥用植物和次生物質(zhì)的工業(yè)化生產(chǎn)

8.實現(xiàn)植物細胞全能性的條件是什么？

具有較強全能性的細胞從植物組織抑制性影響下解脫出來，使其處于獨立發(fā)育的離體條件下；賦予離體細胞一定刺激，包括營養(yǎng)物質(zhì)、植物激素、光周期、溫度、酸堿度等

9.優(yōu)良愈傷組織有何生長特性？

（1）高度的胚性或再分化能力，以便從這些愈傷組織得到再生植物

（2）容易散碎，以便用這些愈傷組織建立優(yōu)良的懸浮系，并且在需要時能從中分離出全能性的原生質(zhì)體

（3）旺盛的自我增殖能力，以便用這些愈傷組織建立大規(guī)模的愈傷組織無性系（4）經(jīng)過長期繼代保存而不喪失胚性，便有可能對它們進行各種遺傳操作 10.何為胚狀體？胚狀體和合子胚有何異同？

胚狀體 離體培養(yǎng)條件下，沒有經(jīng)過受精過程，但是經(jīng)過了胚胎發(fā)育過程所形成的胚狀類似物，此現(xiàn)象無論在體細胞培養(yǎng)還是生殖細胞培養(yǎng)中均可以看到，因而統(tǒng)稱為體細胞胚或胚狀體。

異：胚狀體起源于非合子細胞，是體細胞體外培養(yǎng)而來，不同于合子胚，合子胚是經(jīng)過受精發(fā)育而來的

與合子胚相比，體細胞胚子葉不規(guī)范、胚小、含水量高、對脫水敏感、沒有休眠

相同點：都含有一整套遺傳信息,都可以發(fā)育成新一代生物個體。胚狀體的維管束與合子胚一樣,是獨立產(chǎn)生的,與母體維管束不相連 11.影響胚狀體發(fā)生的主要因素有哪些？

因素：氮源【NH4+與NO3-的相對和絕對量都影響體細胞胚的發(fā)生，誘導(dǎo)培養(yǎng)基中還原態(tài)氮的存在與否最為關(guān)鍵】

生長素【內(nèi)源IAA含量上升或維持在相對高水平是誘導(dǎo)胚性細胞發(fā)生的基礎(chǔ)，胚性愈傷組織內(nèi)源生長素的含量遠高于非胚性愈傷組織】

組織起源【對于距活體胚胎發(fā)育較近的組織和成熟及未成熟的胚胎在離體條件下可能更利于體細胞胚的誘導(dǎo)】

供體植物的基因型、培養(yǎng)物的生理狀況、培養(yǎng)基中的外源激素、天然提取物和活性炭等都可影響胚狀體的發(fā)生

12.如何區(qū)分離體培養(yǎng)條件下的不定芽和胚狀體？

體細胞胚經(jīng)過了胚胎發(fā)育過程，具有胚根、胚芽和胚軸的完整結(jié)構(gòu)

體細胞胚最根本的特征為兩極性，即在發(fā)育的早期階段從方向相反的兩端分化出莖端和根端；不定芽是在器官發(fā)生方式分化的單極性特征下形成的。體細胞胚的維管組織分布是獨立的“Y”字形結(jié)構(gòu)，與外植體組織無結(jié)構(gòu)上的聯(lián)系；而愈傷組織上分化的不定芽一般在愈傷組織表面，與外植體或愈傷組織的維管組織相聯(lián)系

13.目前研制的人工種子結(jié)構(gòu)是怎樣的？

人工種子由以下三部分組成：

①具有良好發(fā)育的體細胞胚，并能發(fā)育成正常完整植株：廣義的體細胞胚由組織培養(yǎng)中獲得的體細胞胚即胚狀體、愈傷組織、原球莖、不定芽、頂芽、腋芽或小鱗莖等繁殖體組成。②人工胚乳，一般由含有供應(yīng)胚狀體養(yǎng)分的膠囊組成，養(yǎng)分包括礦質(zhì)元素、維生素、碳源及激素等。③膠囊之外的包膜稱之為人工種皮，有防止機械損傷及水分干燥等保護作用。

14.控制胚性細胞同步化的方法有哪些？

①抑制劑法促進細胞同步分裂；培養(yǎng)初期加入DNA合成抑制劑，使DNA合成暫時停止，當除去DNA合成抑制劑，細胞開始進行同步分裂 ②低溫處理促進細胞同步分裂；抑制了細胞分裂，一段時間后再恢復(fù)正常培養(yǎng)溫度

③滲透壓控制同步化法；不同發(fā)育階段的胚，具有不同的滲透壓要求，通過調(diào)節(jié)滲透壓來控制胚的發(fā)育，使其停留在某一階段，然后同步發(fā)育 ④同步胚的分段收集篩選法；用不同孔徑的尼龍網(wǎng)或采用密度梯度離心來選擇不同發(fā)育階段的胚，然后再轉(zhuǎn)入適宜它們發(fā)育的培養(yǎng)基上，使幼胚繼續(xù)發(fā)育。⑤通氣法。乙烯的產(chǎn)生與細胞分裂密切相關(guān)，在細胞分裂達到高峰前，有一個乙烯合成高峰，在培養(yǎng)基中通入乙烯或氮氣，控制細胞同步分裂 15.植物離體無性繁殖主要適用于哪些植物？與常規(guī)無性繁殖相比有什么優(yōu)勢？

植物離體無性繁殖主要適用于園藝觀賞植物、農(nóng)作物、藥用植物及經(jīng)濟林木的種苗生產(chǎn)。（1）周期短，便于控制培養(yǎng)條件。繁殖速度快，經(jīng)濟效益高。（2）占用空間小，不受地區(qū)、季節(jié)限制。（3）繁殖珍稀、瀕臨苗木和突變體，是優(yōu)良品種培養(yǎng)的有效途徑。（4）利物保持原來品種的特性。

16.分離植物單細胞的方法有哪些？

有以下三種：

(一)機械法:主要通過機械磨碎、切割植物體從而獲得游離的單細胞。

(二)酶解法：主要是根據(jù)植物細胞壁的組成特點選用某一專一性水解酶，在溫和條件下將壁物質(zhì)分解掉，從而釋放出細胞。

(三)愈傷組織誘導(dǎo)法：通過組織培養(yǎng)獲得callus，由于細胞結(jié)構(gòu)松散，可通過高頻振動使單個細胞分離處理

17.植物單細胞培養(yǎng)的方法有哪些？各有何特點？

1、平板培養(yǎng)法

特點：單細胞在培養(yǎng)基中分布均勻，便于定點觀察，易篩選；通氣差，排泄物易積累造成細胞毒害

2、看護培養(yǎng)

特點：簡便、成功率高；不能在顯微鏡下直接觀察.3、飼養(yǎng)層培養(yǎng)

特點：操作簡便；不能在顯微鏡下追蹤細胞的分裂和細胞團的形成

4、微室培養(yǎng)法

特點：在培養(yǎng)過程中可連續(xù)進行顯微鏡觀察；由于培養(yǎng)基少，水分難以保持，培養(yǎng)基的成分及pH等也易于變動，細胞短期培養(yǎng)后往往不能再生長。

5、液體淺層靜置培養(yǎng)法

特點: 易于補加新鮮培養(yǎng)基、可以鏡檢

6懸浮培養(yǎng)法

特點：能提供大量同步分裂的細胞，且細胞增殖速度快，可用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)

7雙層濾紙植板法：在飼養(yǎng)細胞層與靶細胞層之間放兩層濾紙，上面一層濾紙用于把靶細胞轉(zhuǎn)移到其它培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)。

8條件培養(yǎng):含有植物細胞培養(yǎng)上清液或靜止細胞；在平板培養(yǎng)和看護培養(yǎng)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的；看護培養(yǎng)中愈傷組織可以提供單細胞生長繁殖所需的物質(zhì)；植物細胞上清液或靜止細胞也有相同效果 18.什么叫細胞的懸浮培養(yǎng)？分批培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)各有何特點？

細胞的懸浮培養(yǎng)：將游離的單細胞或細胞團按照一定的細胞密度懸浮在液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)的方法。

分批培養(yǎng)特點：培養(yǎng)系統(tǒng)基本處于封閉狀態(tài)，要及時更換培養(yǎng)液進行繼代培養(yǎng)；細胞數(shù)量隨著培養(yǎng)時間的變化呈S形曲線；操作簡單，重復(fù)性好，往往能獲得理想的培養(yǎng)效果；特別適合于突變體的篩選、遺傳轉(zhuǎn)化等研究

連續(xù)培養(yǎng)特點：培養(yǎng)過程中培養(yǎng)液不斷得到更換；設(shè)備復(fù)雜，但便與自動化，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定；營養(yǎng)物利用率低于分批培養(yǎng)，菌種易退化，易污染，因此連續(xù)時間有限

19.在細胞懸浮培養(yǎng)中，如何進行細胞生長量的計算？

（1）細胞計數(shù)：通常用血球計數(shù)器計數(shù)，計算較大的細胞數(shù)量時，可以使用特制的計數(shù)盤；（2）細胞密實體積（PCV）：以每毫升培養(yǎng)液中細胞總體積的毫升數(shù)表示，測定時，將細胞 離心于離心管內(nèi)，測定細胞層所占的體積。

（3）細胞鮮重：將懸浮培養(yǎng)物倒在下面架有漏斗的已知重量的濕尼龍網(wǎng)上，用水洗去培養(yǎng)基，真空抽濾以除去細胞上沾著的多余水分，稱重

（4）細胞干重：用以知質(zhì)量的干尼龍網(wǎng)依上法收集細胞，在60°C下烘箱內(nèi)烘12h，細胞干重恒定后再稱重

（5）有絲分裂指數(shù)：指在一個細胞群體中，處于有絲分裂的細胞占總細胞的百分數(shù)。通過富爾根染色法對愈傷組織染色，再在載玻片上制片并鏡檢，隨機檢查500個細胞，統(tǒng)計處于有絲分裂各個時期的細胞數(shù)。指數(shù)越高，表明細胞分裂速度越快

20.懸浮培養(yǎng)細胞同步化的方法主要有哪些？

1、物理方法

(1)分選法: 細胞體積大小分級，直接將處于相同周期的細胞利用一定大小的篩網(wǎng)過濾分選，然后將同一狀態(tài)的細胞繼代培養(yǎng)于同一培養(yǎng)體系中

(2)冷處理法: 收集細胞,在4℃溫度下處理數(shù)天,添加新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng).2、化學方法

(1)饑餓法：先對細胞斷絕供應(yīng)一種進行細胞分裂所必需的營養(yǎng)成分或激素，使細胞停滯在G1期或G2期，經(jīng)過一段時間的饑餓之后，當重新在培養(yǎng)基中加入這種限制因子時，靜止細胞就會同步進入分裂。

(2)抑制法：通過向培養(yǎng)基中添加尿苷(1μg/ml),5-氟脫氧尿苷(2 μg/ml)等化學抑制劑抑制細胞分裂,可使培養(yǎng)細胞同步化。(3)有絲分裂抑制法:在指數(shù)生長期的細胞懸浮培養(yǎng)物中加入一定濃度的秋水仙素

21.在植物細胞培養(yǎng)中如何提高植物次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量？

（一）篩選得到高產(chǎn)細胞系（株）常用方法有：

1、克隆選擇（有相同遺傳基因的細胞群）

指通過單細胞克隆技術(shù)和細胞團克隆技術(shù)，將培養(yǎng)細胞中能夠積累較多次生代謝物且具有相同遺傳基因的細胞群挑選出來，并加以適當?shù)呐囵B(yǎng)形成高產(chǎn)細胞系。

2、抗性選擇

指在選擇壓力下，通過直接或間接的方法得到抗性變異的細胞系。

3、誘導(dǎo)選擇

是通過化學誘變或紫外線照射等各種物理化學方法誘變產(chǎn)生比原親本細胞全成能力高的細胞系（株）

（二）培養(yǎng)條件 1適宜溫度

2、不斷調(diào)節(jié)PH

3、營養(yǎng)成分：一方面要滿足植物細胞的生長所需，另一方面要使每個細胞都能合成和積累次生代謝產(chǎn)物。

4、光：包括光強、光質(zhì)和光照時間對細胞生長和次生代謝產(chǎn)物合成都有一定影響。

5、通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速

6、前體飼喂

7、誘導(dǎo)子的應(yīng)用：誘導(dǎo)子是指能引起植物細胞某些代謝強度或代謝途徑的物質(zhì)，可分為生物誘導(dǎo)子和非生物誘導(dǎo)子。不同誘導(dǎo)子作用于不同植物可以產(chǎn)生多種多樣的次生代謝產(chǎn)物。

8培養(yǎng)方法:兩步培養(yǎng)法、兩相培養(yǎng)法（有利于代謝物的分離提取，促進胞內(nèi)代謝物的分泌）等

22.簡述細胞活力鑒定的方法。

1、相差顯微鏡觀察法：觀察細胞質(zhì)環(huán)流和正常細胞核的存在

2、FDA染色法 ：在活細胞內(nèi)FDA可以被酯酶裂解，將能發(fā)熒光的極性部分（熒光素）釋放出來。熒光素不能自由地穿越細胞質(zhì)膜，能在完整的活細胞中積累，紫外線照射下發(fā)綠色熒光

3、伊凡藍染色法：只有活力受損傷的細胞和死細胞能夠攝取這種染料

4氧電極法：活細胞光合作用放出氧氣

23.簡述細胞計數(shù)的方法

24.影響原生質(zhì)體分離效果的因素有哪些？試做分析。

（1）材料種類和生理狀況：植物幼苗或新生枝的完全伸展葉片的葉肉組織是分離原生質(zhì)體的最方便、最合適的植物材料。用于分離原生質(zhì)體的愈傷組織或懸浮細胞應(yīng)當處于生長早期或指數(shù)生長期

（2）酶解溫度：溫度高、得率高，但存活率低（3）酶解時間：過短得率小、過長存活率低（4）滲透壓穩(wěn)定劑的種類和濃度：因種而異

（5）氧氣：酶解時盡量采用振蕩，使細胞得到足夠的氧氣進行呼吸作用（6）黑暗：抑制原生質(zhì)體形成細胞壁（7）酶液活力：儲存時間過長會使酶液失活

25.制備原生質(zhì)體時為何要在等滲或稍高滲溶液中進行？

只有培養(yǎng)在等滲或稍高滲培養(yǎng)基中植物才能正常生長 如果植物的原生質(zhì)體培養(yǎng)在非等滲或低滲或高滲培養(yǎng)液中植物有可能會因為濃度差而吸水或是失水從而導(dǎo)致植物的死亡，所以植物的原生質(zhì)體要培養(yǎng)在等滲或稍高滲培養(yǎng)基中。

26.原生質(zhì)體再生植株的基本過程。（1）細胞壁再生

（2）細胞分裂：分裂前細胞質(zhì)增加、色素體擴大、顏色加深

（3）再生植株：直接分裂形成苗（第一次分裂便表現(xiàn)極性）；通過愈傷組織形成苗；通過球狀體再生成苗（原生質(zhì)體---細胞---表面光滑的球狀體或盤狀體---通過出芽方式形成小苗）27.簡述原生質(zhì)體培養(yǎng)的意義。

研究細胞壁的再生過程和植株的再生過程；為植物細胞融合掃平了障礙，特別是為制造新雜種（種間雜種）開辟了道路；原生質(zhì)體可攝入外源DNA、細胞器、細菌或病毒顆粒，這些特性可與植物全能性相結(jié)合，為植物遺傳修飾打下基礎(chǔ)；獲得細胞無性系和選育突變體的優(yōu)良起始材料

28.原生質(zhì)體的培養(yǎng)方法有哪些？各有何優(yōu)缺點？

⑴液體淺層培養(yǎng)法： 優(yōu)點：

原生質(zhì)體在液體環(huán)境中有較強的吸收營養(yǎng)物質(zhì)的能力，表現(xiàn)出較強的細胞分裂能力。操作簡單，對原生質(zhì)體的損傷小，且易于添加新鮮培養(yǎng)基和轉(zhuǎn)移培養(yǎng)物。缺點：

原生質(zhì)體分布不均勻，常常發(fā)生原生質(zhì)體之間的粘連現(xiàn)象而影響其進一步的生長和發(fā)育。此外，難以跟蹤觀察某一個細胞的發(fā)育情況。⑵雙層培養(yǎng)法——液體-固體雙層培養(yǎng)法：

? 優(yōu)點：

固體培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)可以緩慢放到液體培養(yǎng)基中，如果在下層固體培養(yǎng)基中添加一定量的活性炭，則還可能吸附培養(yǎng)物產(chǎn)生的一些有害物質(zhì)，促進原生質(zhì)體的分裂和細胞團的形成。

? 缺點：

不易觀察細胞的發(fā)育過程。⑶固體平板培養(yǎng)法

? 優(yōu)點：

使原生質(zhì)體處于固定位置，避免了細胞間有害代謝產(chǎn)物的影響，有利于對單個原生質(zhì)體的細胞壁再生及細胞團形成的全過程進行定點觀察。

?

缺點：操作要求比較嚴格，溫度對原生質(zhì)體與培養(yǎng)基混合有一定影響；另外，固體中單細胞生活能力弱，通氣狀況不良，第一次細胞分裂時間會推遲2d左右。

（4）瓊脂糖珠培養(yǎng)：

優(yōu)點：搖床震蕩培養(yǎng)，改善了培養(yǎng)物的通氣和營養(yǎng)環(huán)境，從而促進了原生質(zhì)體的分裂和細胞團的形成

29.原生質(zhì)體融合要經(jīng)過哪些過程？

30.PEG融合與電融合各有何特點？兩種方法的原理和關(guān)鍵技術(shù)是什么？

PEG法特點：（1）融合率10%左右，融合較繁瑣（2）具有一定毒害作用；容易形成由2個以上原生質(zhì)體融合形成的融合體

電融合特點：(1)效率高（70 %以上），但存活率低；對原生質(zhì)體傷害性小(2)裝置精巧、方便簡單、可在顯微鏡下觀察或錄像觀察融合過程。(3)免去PEG誘導(dǎo)后的洗滌過程、誘導(dǎo)過程可控制性強等。

PEG誘導(dǎo)融合法原理：PEG為多聚化合物，其分子具有輕微的負極性，可與具有正極性基團的水、蛋白質(zhì)和糖類等形成氫鍵，在原生質(zhì)體之間形成分子橋，從而使原生質(zhì)體發(fā)生粘連。當用培養(yǎng)基將與膜相連的PEG分子洗掉后，膜上電荷發(fā)生紊亂而重配。

電融合的原理：①交流電場使原生質(zhì)體表面電荷偶極化，沿著電極排列，形成串珠。②施加直流電場后，形成串珠的原生質(zhì)體在質(zhì)膜接觸處發(fā)生穿孔，開始遺傳物質(zhì)的交流?！纠蠋焢pt 在直流電脈沖的誘導(dǎo)下，細胞膜表面的氧化還原電位發(fā)生改變，使異種細胞粘合并發(fā)生質(zhì)膜瞬間破裂，進而質(zhì)膜開始連接，直到閉和成完整的膜，形成融合體】

31.原生質(zhì)體融合產(chǎn)物有哪些類型？ 雜種細胞：原生質(zhì)和核都融合

異核體：細胞質(zhì)融合，細胞核沒有融合 同核體：同一親本的原生質(zhì)體融合產(chǎn)生

非對稱雜種：由于人工處理或其它原因造成某一親本的染色體部分丟失 細胞質(zhì)雜種：某一親本染色體全部丟失而細胞質(zhì)融合

32.體細胞雜交有何意義？

（1）實現(xiàn)遠緣雜交，形成新的物種。

克服常規(guī)有性遠緣雜交存在的生殖隔離和雜交不親和的障礙，為廣泛重組遺傳物質(zhì)、形成新的物種開辟的新途徑

（2）創(chuàng)造細胞質(zhì)雜種。融合了雙親的細胞質(zhì)，可將細胞質(zhì)基因重組，將雙親細胞質(zhì)基因遺傳給子代

（3）培育作物新種質(zhì)和新品種。通過近緣種內(nèi)或種間的體細胞雜交可獲得穩(wěn)定的具有雙親兩套染色體的體細胞雜種植株。往往可育，能作為育種的新材料通過常規(guī)育種獲得新品種

33.什么是植物體細胞無性系變異？引起或影響植物體細胞無性系變異的因素有哪些？

植物細胞、組織、器官在無菌條件下進行離體人工培養(yǎng)，經(jīng)過脫分化和再分化過程，重新形成愈傷組織和完整植株時所產(chǎn)生的變異 稱為植物體細胞無性系變異

因素：（1）自發(fā)突變，與培養(yǎng)物的遺傳背景、外植體類型及培養(yǎng)類型有關(guān)，同時也受培養(yǎng)時間、培養(yǎng)成分等因素的影響

（2）人工誘變，包括物理誘變和化學誘變。物理誘變就是利用X射線、γ射線、β射線、中子、激光、電子束、離子束、紫外線等物理因素輻射誘發(fā)變異?；瘜W誘變是利用化學試劑誘發(fā)的變異。誘變劑包括堿基類似物，烷化劑，DNA分子結(jié)構(gòu)插入物三大類。

34.試述植物體細胞無性系變異的遺傳學基礎(chǔ)。

體細胞無性系變異的遺傳基礎(chǔ)：

（1）染色體組型變異，如出現(xiàn)多倍體和非整倍體。

（2）染色體結(jié)構(gòu)變異，由染色體重排造成的基因丟失，或“關(guān)閉”一個能使其相應(yīng)隱性基因產(chǎn)生表現(xiàn)型效應(yīng)的顯性等位基因等。（3）基因突變

（4）DNA總量變異和DNA重復(fù)序列拷貝數(shù)的變異（5）基因丟失（6）DNA堿基修飾

（7）轉(zhuǎn)座子的激活，由轉(zhuǎn)座引起突變。（8）基因重排

35.試述農(nóng)桿菌Ti質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)化的原理。

農(nóng)桿菌是普遍存在于土壤中的一種革蘭氏陰性細菌G-，它能在自然條件下趨化性地感染大多數(shù)雙子葉植物的受傷部位，并誘導(dǎo)產(chǎn)生冠癭瘤或發(fā)狀根

根癌農(nóng)桿菌中含有Ti質(zhì)粒，其上有一段T-DNA，農(nóng)桿菌通過侵染植物傷口進入細胞后，可將T-DNA插入到植物基因組中。因此可以將目的基因插入到經(jīng)過改造的T-DNA區(qū)，然后借助農(nóng)桿菌的感染實現(xiàn)外源基因向植物細胞的轉(zhuǎn)移與整合，通過細胞和組織培養(yǎng)技術(shù)，再生出轉(zhuǎn)基因植株

36.植物基因轉(zhuǎn)化的方法有哪些？各自的特點是什么？

1）農(nóng)桿菌介導(dǎo)法：受體類型廣泛，簡單易行、周期短、轉(zhuǎn)化頻率高，轉(zhuǎn)化體常出現(xiàn)“嵌合”現(xiàn)象，影響轉(zhuǎn)化頻率的因素相對較少等。

2）病毒介導(dǎo)法：特點是 病毒增殖水平較高、增殖速度快，基因組較小，宿主范圍廣，易于純化等。

3）基因槍轉(zhuǎn)化法：適用范圍廣、無宿主限制、靶受體類型廣泛、可控度高、操作簡便、快速等。

4）電擊法 特點是 對細胞不產(chǎn)生毒性，但對細胞損傷較大 5）PEG介導(dǎo)法：特點是成本低廉、效果穩(wěn)定

6）花粉管通道法： 特點是方便易行，不需專門儀器和昂貴藥品，直接得到轉(zhuǎn)化的種子，受季節(jié)限制。

7）顯微注射法：特點是轉(zhuǎn)化效率高，轉(zhuǎn)化細胞的培養(yǎng)過程無需特殊的選擇系統(tǒng)。

【老師ppt】

（1）農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法：優(yōu)： 轉(zhuǎn)化效率高；能夠插入非重排的外源DNA長片段；DNA片段主要以單拷貝或低拷貝形式插入；不需要特殊的專用設(shè)備

缺：轉(zhuǎn)化的寄主范圍有限，特別是對許多單子葉植物不適用；外源的轉(zhuǎn)基因只能以T-DNA插入的方式被導(dǎo)入寄主細胞（2）基因槍介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法

與農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化相比，基因槍法轉(zhuǎn)化的一個主要優(yōu)點是不受受體植物范圍的限制（3）花粉管通道法：

優(yōu)：不依賴組織培養(yǎng)人工再生植株，技術(shù)簡單，不需要裝備精良的實驗室，常規(guī)育種工作者易于掌握

缺：不同作物導(dǎo)入DNA的最佳時間有較大差異，要針對不同的植物作出相應(yīng)的改動

(4)DNA直接轉(zhuǎn)換法：適用對農(nóng)桿菌感染不敏感的植物(5)化學藥劑誘導(dǎo)法：在沒有載體的情況下可使用，但轉(zhuǎn)化率低(6)電擊法：對細胞不產(chǎn)生毒性，但對細胞損傷較大(7)顯微注射法：適合大細胞操作，主要用于動物細胞

(8)低能離子束法、激光束法、超聲波法、脂質(zhì)體介導(dǎo)、病毒介導(dǎo)、轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)等

37.試述轉(zhuǎn)基因植物在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用。

在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用主要有：1.抗除草劑轉(zhuǎn)基因植物；2.抗蟲轉(zhuǎn)基因植物；3.抗病轉(zhuǎn)基因植物；4.抗逆轉(zhuǎn)基因植物；5.改良作物營養(yǎng)質(zhì)的轉(zhuǎn)基因植物。

【問答題】：

1.離體無性繁殖一般可分為哪幾個階段？簡述其操作的一般程序。

離體無性繁殖一般可分為5個階段。

1、植株的準備：供體植株應(yīng)生長旺盛、健壯、不病蟲害，并盡可能生長在干凈的環(huán)境中。

2、無菌培養(yǎng)物的建立：獲得無菌材料并誘導(dǎo)外植體生長和發(fā)育。包括從供體植株上采取外植體進行消毒、接種及啟動外植體生長等程序。

3培養(yǎng)物的增殖：通過反復(fù)培養(yǎng)使第一階段獲得的數(shù)量有限的嫩枝、芽苗、胚狀體或原球莖等培養(yǎng)物的總量增加。

4生根培養(yǎng)：將增殖階段形成的無根芽苗轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上誘導(dǎo)產(chǎn)生不定根，獲得健壯的具有根、芽、莖的完整小植株。

5試管苗的移栽及鑒定：移栽是將具根試管苗轉(zhuǎn)移到土壤中的過程，是試管苗從離體培養(yǎng)逐步適應(yīng)溫室或田間生長環(huán)境的過程

2.簡述植物細胞大規(guī)模培養(yǎng)反應(yīng)器的類型及原理。機械攪拌式反應(yīng)器：利用機械攪動使細胞得以懸浮和通氣

鼓泡式反應(yīng)器：從反應(yīng)器底部通入無菌空氣產(chǎn)生大量氣泡，帶動培養(yǎng)液循環(huán) 氣升式反應(yīng)器：利用通入反應(yīng)器的無菌空氣帶動培養(yǎng)液循環(huán)

光生物反應(yīng)器：植物體內(nèi)的多種酶需要光照的刺激和誘導(dǎo)才能合成或表現(xiàn)較高的生理活性

轉(zhuǎn)鼓式反應(yīng)器：通常是通過轉(zhuǎn)盤或轉(zhuǎn)鼓的旋轉(zhuǎn)達到混合的目 3.簡述植物細胞固定化的幾種方法。

1、包埋法：將細胞包埋在多孔載體內(nèi)部

包括：凝膠包埋法 以各種多孔凝膠為載體，將細胞包埋在凝膠的微孔內(nèi)，固定后細胞被限制在凝膠的微孔內(nèi)進行生長、繁殖和新陳代謝 使用的載體：海藻酸鈣凝膠、角叉菜膠、明膠、聚丙烯酰胺凝膠、光交聯(lián)樹脂、瓊脂等

半透膜包埋法 將細胞包埋在由各種高分子聚合物制成的小球內(nèi)

2、吸附法 ：使用固體吸附劑（惰性材料），將細胞吸附在其表面而使細胞固定化的方法

包括：物理吸附法（physical adsorption）作用力：氫鍵、疏水鍵。離子結(jié)合法 作用力：離子鍵

3、共價結(jié)合法：細胞表面上功能團和固相支持物表面的反應(yīng)基團之間形成化學共價鍵連接，從而形成為固定化細胞

4、交聯(lián)法：利用雙功能或多功能試劑，直接與細胞表面的反應(yīng)基團（如氨基酸、羥基、咪唑基等）發(fā)生反應(yīng)，使其彼此交聯(lián)形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的固定化細胞，其結(jié)合力是共價鍵

4.試述原生質(zhì)體分離的方法和步驟。

(1)機械法：在高滲溶液中細胞質(zhì)壁分離的狀態(tài)下，用利刀切割細胞壁,使原生質(zhì)體流出或釋放出來

高滲溶液預(yù)處理----輕微質(zhì)壁分離----利刀切割或機械磨損組織

(2)酶解法：常用的制備原生質(zhì)體的酶包括；果膠酶、蝸牛酶、纖維素酶等。實際應(yīng)用中需要根據(jù)不同的細胞來源選擇合適的酶。酶解法分：

順序法（兩步法）：先用果膠酶預(yù)處理，再用纖維素酶 直接法（一步法）：直接用果膠酶和纖維素酶 優(yōu)點：獲得量大，適用廣泛。

缺點：商品酶制劑均含有核酸酶、蛋白酶、過氧化物酶以及酚類物質(zhì)。會影響所獲原生質(zhì)體的活力。

【ppt】

（1）取生長旺盛的植物細胞

（2）懸浮于有滲透壓穩(wěn)定劑的高滲溶液中

（3）加入適量的細胞壁水解酶，在一定條件下使細胞壁解體（4）分離除去細胞壁碎片等雜質(zhì)（5）得到原生質(zhì)體

5.植物體細胞無性系突變體篩選的方法有哪些？

（一）從再生植株中直接篩選有用突變株（常規(guī)育種）

（二）對離體培養(yǎng)物的篩選 1.直接篩選法

（1）正選擇法：在離體培養(yǎng)基中加入對正常細胞有害的化學物質(zhì)，使正常表型細胞死亡（一步、多步）

(2)負選擇法：使用特定培養(yǎng)基使突變體細胞受到抑制不分裂呈休眠狀態(tài)，然后用一種對休眠態(tài)突變細胞無害，而能毒害正常生長細胞的藥物淘汰掉正常型細胞，最后用正常培養(yǎng)基恢復(fù)突變細胞的生長（主要適用于營養(yǎng)缺陷型或溫度敏感型突變體的篩選）2.間接篩選法：借助與突變表現(xiàn)型有關(guān)的性狀作為選擇指示或篩選壓的方法

（三）綠島法：利用已分化組織進行篩選的方法。例如，一些除草劑只作用于綠色光合細胞，可以對整棵植株用除草劑，使抗性細胞存活下來，形成局部綠色斑點（綠島），然后切下該部位細胞進行培養(yǎng)，再分化形成抗性植株

6.成批培養(yǎng)（batch culture）細胞的生長曲線包括哪幾個時期？各時期有何特點？ 延遲期：細胞很少分裂、數(shù)目不增加

對數(shù)生長期：細胞開始分裂，數(shù)目開始大量增加 直線生長期：細胞生長旺盛，數(shù)目大增 減慢期：細胞分裂速度減慢 靜止期：細胞停止分裂

死亡期：細胞開始死亡，數(shù)量減少