第一篇：基因工程實驗小結

基因工程實驗小結

基因工程實驗同以前的實驗有所不同，它有很明顯的特點。首先是微量操作，所有的實驗藥品和試劑都是在1.5ml和0.5ml的離心管中進行，轉移、加樣都是使用移液器進行操作。其次是反應條件要求比較嚴格。冰浴是實驗的關鍵操作步驟，對于DNA等具有生物活性的物質均需冰浴低溫保證其不失活；實驗中所用試劑均需較高的純度，實驗中的痕量污染、空氣污染等都會影響實驗結果，尤其是PCR反應，它對DNA濃度和純度均有嚴格的要求。另外，此次的實驗是綜合實驗，每個基礎實驗聯(lián)系在一起才有意義，每個實驗的結果好壞直接影響下一個實驗的結果。而且有些實驗的結果并不能直接觀察，需要在下一個實驗中體現(xiàn)證實。實驗所用部分儀器也是以前從未接觸過的，如電泳儀，PCR擴增儀，高速冷凍離心機，恒溫搖床等。

此次實驗主要完成的實驗有：大腸桿菌DNA提取，PCR擴增，質粒的連接，感受態(tài)細胞制備與轉化和α-互補篩選細菌克隆。其中前一個實驗的結果均為下一個實驗的材料，前兩個實驗通過瓊脂糖凝膠電泳鑒定產物，后三個實驗通過特定平板培養(yǎng)的菌落形態(tài)鑒定實驗結果。由于實驗起初對各種儀器和操作不熟悉，導致DNA的SDS法分離純化結果不佳，PCR產物凝膠成像不是很清楚，經(jīng)過進一步的分析和操作熟悉，后面的實驗結果均良好。由于影響實驗結果的因素很多，所以實驗中必須每一步都應仔細認真完成。

通過此次實驗，完成了基因工程中的基本操作，使我們在學習完《基因工程》理論知識后對抽象的概念、儀器、步驟等有了具體的認識，加深了記憶和理解。

第二篇：基因工程實驗方案

實驗

一、大腸桿菌質粒的提取與電泳檢測

一、實驗目的

學習質粒DNA提取的基本原理，理解各種試劑的作用，掌握質粒最常用的提取方法，為基因工程提供載體原料。

二、實驗原理

將一個有用的目的DNA片段通過重組DNA技術，送進受體細胞中去進行繁殖或表達的工具較載體。細菌質粒是重組DNA技術中最常用的載體。質粒是一種獨立于染色體外的穩(wěn)定的遺傳因子，為雙鏈、閉環(huán)的DNA分子，并以超螺旋狀態(tài)存在于宿主細胞總，大小從1—200kb不等。質粒主要發(fā)現(xiàn)于細菌、放線菌和真菌細胞中，它具有自主復制和轉錄能力，能在子代細胞中保持恒定的拷貝數(shù)，并表達所攜帶的遺傳信息。質粒的復制和轉錄依賴于宿主細胞編碼的某些酶和蛋白質，如離開宿主細胞則不能復制，而宿主即使沒有質粒也可以正常存活。但質粒的存在使得宿主細胞具有一些額外的特性，如對抗生素的抗性等。常用的質粒載體大小在2.7—10kb之間。如pBR32、pUC系列、pGEM系列和pBluescript(簡稱pBS)等。

細菌質粒的提取是根據(jù)環(huán)狀質粒DNA分子具有相對分子質量小，易于復性的特點進行的。在熱或堿性條件下DNA分子雙鏈解開，若此時將溶液置于復性條件，由于變性的質粒分子能在較短時間內復性而染色體DNA不能復性。用堿變性方法提取質粒就是利用離子型表明活性劑SDS溶解細胞膜上的脂肪及蛋白，在pH高達12.6的堿性條件下染色體DNA氫鍵斷裂，雙螺旋結構解開而變性，成了雜亂無章的片段。而相對分子質量較小的質粒 DNA的大部分氫鍵也斷裂，但超螺旋共價閉合環(huán)狀結構的兩條互補鏈不完全分離，當pH4.8的NaAc或KAc高鹽緩沖液調節(jié)pH至中性時，變性的質粒DNA可以完全形成互補鏈，又恢復到原來的構型。而染色體DNA不能恢復而形成纏連的網(wǎng)狀結構，變性DNA與菌體的蛋白質凝聚成塊。經(jīng)過離心，出去的沉淀是變性的染色體DNA和蛋白質雜質，而上清液中的質粒DNA分子，則利用無水乙醇與鹽凝聚形成沉淀。由于乙醇沉淀的時候，不光DNA還有性質相似的RNA也一起被沉淀下來。為了除去RNA，可以利用RNA酶進行處理，其后采用苯酚使RNA酶失活。出去RNA酶活性往往會采用一些復合物如苯酚、氯仿等，并且苯酚不僅使RNA酶失活，還能有效去除菌體的蛋白質等物質。因為只用無水乙醇沉淀，樣品中還是混有蛋白質。所以為了獲得高純度質粒，應在無水乙醇沉淀前，先用苯酚進行處理，以便除去其中的蛋白質。

三、實驗試劑

1.含質粒的大腸桿菌菌株

LB培養(yǎng)基：1%蛋白胨、0.5%酵母粉、1%Nacl、調pH7.2 抗生素：氨芐青霉素：母液100mg/mL，工作濃度100ug/mL 溶液I：50 mmol.L-1Tris-HCl，pH7.5，10 mmol.L-1 EDTA，pH8.0，高壓滅菌后室溫保存。

溶液II：0.2 M/LNaOH，1% SDS（以2M NaOH和10% SDS母液現(xiàn)用現(xiàn)配）溶液III：1.32 M KAc（pH4.8），(3mol/L NaAc)高壓滅菌后室溫保存。TE緩沖液（pH=8.0）：10mmol/LTris-Hcl/1mmol/LEDTA 2mg/mLRNase A溶解于10mmol/LTris-Hcl(pH7.5)、15mmol/LNacl 3mol/LNaAc(pH5.2 苯酚/氯仿/異戊醇（PCI）、冰冷無水乙醇、冰冷70%乙醇 堿裂解法小量提取質粒DNA步驟如下：

（a）挑單菌落接種于含相應抗生素的LB培養(yǎng)基中，37℃搖菌過夜。（b）每管取1ml菌液然后12,000 g離心30 秒，集菌。（c）加200 ?l溶液I，用振蕩器劇烈振蕩懸浮菌體。（d）加300 ?l新配制的溶液II，溫和顛倒混勻5次以上。

（e）溶液澄清后立即加入300 ?l預冷的溶液III，混勻后冰上放置5分鐘。（f）4℃、12000 g離心10（或5）分鐘。

（g）取上清，加入等體積的氯仿，顛倒混勻后，4℃、12000 g離心10 分鐘沉淀蛋白。

（h）吸取上清，加等體積異丙醇，混勻。室溫放置10分鐘。

（i）12000 g離心10 分鐘，棄上清，再用75%(v/v)乙醇洗滌沉淀，12000 g離心5分鐘。

(k)沉淀在37 ℃干燥后后溶于適量水或TE（50ul），（-20°C）保存?zhèn)溆谩Ｙ|粒DNA的檢測:取5ul的質粒與2ul的6×上樣緩沖液混合后，在0.7%凝膠上電泳檢測。

溶液I：50 mmol.L-1Tris-HCl，pH7.5，10 mmol.L-1 EDTA，pH8.0，高壓滅菌后室溫保存。溶液I的作用：

１、任何生物化學反應，首先要控制好溶液的pH，因此可用適當濃度和適當pH值的Tris-HCl溶液。

２、大家知道EDTA是Ca2+和Mg2+等二價金屬離子的螯合劑，配在分子生物學試劑中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生長。在溶液I中加入高達10 mM的EDTA，無非就是要把大腸桿菌細胞中的所有二價金屬離子都螯合掉。

溶液II：0.2 M/LNaOH，1% SDS（以2M NaOH和10% SDS母液現(xiàn)用現(xiàn)配）用新鮮的0.4 N的NaOH和2％的SDS等體積混合后使用的。要新從濃NaOH稀釋制備0.4N的NaOH，無非是為了保證NaOH沒有吸收空氣中的CO2而減弱了堿性。其實破細胞的主要是堿，而不是SDS，所以才叫堿法抽提。事實上NaOH是最佳的溶解細胞的試劑，不管是大腸桿菌還是哺乳動物細胞，碰到了堿都會幾乎在瞬間就溶解，這是由于細胞膜發(fā)生了從bilayer（雙層膜）結構向micelle（微囊）結構的相變化所導致。

既然是NaOH溶解的細胞，那為什么要加SDS呢？那是為下一步操作做的鋪墊。這一步要記住兩點：第一，時間不能過長，千萬不要這時候去接電話，因為在這樣的堿性條件下基因組DNA片斷會慢慢斷裂；第二，必須溫柔混合不然基因組DNA也會斷裂?；蚪MDNA的斷裂會帶來麻煩，溶液III：1.32 M KAc（pH4.8），(3mol/L NaAc)高壓滅菌后室溫保存。加入溶液III后出現(xiàn)大量沉淀，這與SDS的加入有關系。這其實是十二烷基硫酸鈉遇到鉀離子后變成了十二烷基硫酸鉀（potassium dodecylsulfate, PDS），而PDS是水不溶的，因此發(fā)生了沉淀。如此看來，溶液III加入后的沉淀實際上是鉀離子置換了SDS中的鈉離子形成了不溶性的PDS，而高濃度的鹽，使得沉淀更完全。大家知道SDS專門喜歡和蛋白質結合，平均兩個氨基酸上結合一個SDS分子，鉀鈉離子置換所產生的大量沉淀自然就將絕大部分蛋白質沉淀了，讓人高興的是大腸桿菌的基因組DNA也一起被共沉淀了。這個過程不難想象，因為基因組DNA太長了，長長的DNA自然容易被PDS給共沉淀了，盡管SDS并不與DNA分子結合。

瓊脂糖電泳進行鑒定質粒DNA時，多數(shù)情況下你能看到三條帶。其實這三條帶以電泳速度的快慢排序，分別是超螺旋、開環(huán)和復制中間體（即沒有復制完全的兩個質粒連在了一起）。如果你不小心在溶液II加入后過度振蕩，會有第四條帶，這條帶泳動得較慢，遠離這三條帶，是20-100kb的大腸桿菌基因組DNA的片斷。

實驗

二、DNA片段（PCR或者酶切）的體外連接感受態(tài)細胞的制備重組質粒的轉化陽性克隆的篩選（抗性篩選、藍白斑篩選）

大腸桿菌質粒DNA的提?。▔A裂解法）

此方法適用于小量質粒DNA的提取提取的質粒DNA可直接用于酶切PCR擴增。1.取1.5ml細菌培養(yǎng)物于EP管中，4000rpm離心1分鐘，棄上清液，使細菌沉 淀盡量干燥；

2.將細菌沉淀重懸于用冰預冷的100μl 溶液I(50mmol/L葡萄糖，10mmol/L EDTApH8.0，25mmol/LTris-HClpH8.0)中，劇烈振蕩；

3.加入200μl 新配制的溶液II(0.2mol/LNaOH，1％SDS（m/v）)，蓋緊EP管 口，快速顛倒離心管5次，以混合混合物，確保離心管的整個內表面與溶液 II接觸，不要渦旋，置于冰浴中；

4.加入150μl預冷溶液III(每100ml的溶液III中含60ml5mol/L乙酸鉀，11.5 ml冰乙酸，28.5mlH2O)，蓋緊EP管口，反復顛倒數(shù)次，使溶液III在粘稠 的細菌裂解物中分散均勻，之后將管置于冰上3~5分鐘； 5.在最大轉速下離心5min，取上清液于另一新EP管；

6.用兩倍體積的乙醇室溫沉淀雙鏈DNA，振蕩混合于室溫放置2分鐘，最大轉 速離心5分鐘；

7.小心吸去上清液，將離心管倒置于濾紙上，以使所有液體都流出，在將附于管壁的液滴除盡；

8.加1ml70％乙醇洗滌沉淀，振蕩混合，用12,000g離心2分鐘，棄上清，將 開口的EP管置于室溫使乙醇揮發(fā)，直至EP管中內沒有可見的液體存在（5～ 10分鐘），用適量的ddH2O溶解；

9.用0.5μl的RNase37℃溫育5~10分鐘； 10.電泳鑒定。

乙醇沉淀DNA 1.加入1/10體積的乙酸鈉（3mol?L，PH=5.2）于DNA溶液中充分混勻，使其 最終濃度為0.3mol?L；

2.加入2倍體積用冰預冷的乙醇混合后再次充分混勻置于-20℃中15~30分鐘； 3.12,000g離心10分鐘，小心移出上清液，吸去管壁上所有的液滴；

4.加入1/2離心管容量的70％乙醇，12000g離心2分鐘，小心移出上清液，吸 去管壁上所有的液滴；

5.于室溫下將開蓋的EP管的置于實驗桌上以使殘留的液體揮發(fā)至干； 6.加適量的ddH2O溶解DNA沉淀。

酶切

1.酶切前確定待切樣品的濃度, 并選擇合適的限制性內切酶和配套Buffer。2.在離心管中加入如下成分： 10×Buffer 1μl 待切樣品xμl 酶 0.5-1μl 加水補足10μl 3.混勻樣品并短暫離心使樣品沉于管底。

4.將離心管置于37℃中溫育1-3hr，若待切樣品為PCR產物，則可將反應時間 適當延長。

5.用未酶切的質粒作為對照，瓊脂糖電泳鑒定酶切結果。注：當酶切樣品用于回收而不是鑒定時，可按比例適當加大反應體積。雙酶 切可選用二者活性都較高的Buffer或者通用Buffer，但要注意不能有星反應。）

連接

1.連接前先電泳確定待連接載體與片段的濃度。2.在離心管中加入如下成分： 10×連接Buffer1μl 待連接的樣品（膠回收產物或PCR產物，載體與片段的mol比為1∶3-5）連接酶0.5-1μl 加水補足10μl 3.混勻樣品并短暫離心使樣品全部沉于管底。

4.將離心管置于連接酶要求的溫度孵育適當?shù)臅r間（根據(jù)不同公司的酶的要求 而定，一般為22℃1-3hr或16℃連接過夜）。

連接完的樣品可直接用于轉化，也可放4℃冰箱短期保存。

感受態(tài)細胞的制備

1.挑取適當菌株的E.coli單菌落接種于2mlSOB培養(yǎng)液中，37℃搖床過夜。2.取0.5-1ml過夜培養(yǎng)的菌液轉種到50mlSOB中，18℃劇烈震蕩，直到A600 達到0.6。

3.將培養(yǎng)物轉移到50ml離心管中，4℃4,000rpm/min 離心10min。同時在冰浴 上配置TB溶液。

4.棄上清，將離心管倒置于濾紙上，使培養(yǎng)液被吸干。

5.取1ml剛配的TB溶液打散菌體沉淀，再加入15mlTB（1/3體積的起始培養(yǎng) 液），冰浴10-15min，4℃4,000rpm/min 離心10min。

6.棄上清，沉淀重懸于4mlTB（1/12.5體積的起始培養(yǎng)液），冰浴10min。

7.加入280μl DMSO，緩緩滴入并輕輕搖晃，使其充分混合均勻，冰浴10min。8.將菌液分裝于EP管中，-80℃或液氮凍存。

9.取兩管感受態(tài)細胞分別加入1μl無菌ddH2O（陰性對照）和1μl純質粒（陽性對照）進行轉化（見后），以檢測感受態(tài)的質量。陰性對照平板上應該無菌落 生長，陽性對照平板上菌落數(shù)目的多少顯示感受態(tài)效率的高低。

注：上述溶液均需高壓蒸汽滅菌處理 0.1MK-Pipes(pH=6.7)的配制：

稱取3.02gPipes粉末溶于80mlddH2O中，此時粉末不能完全溶解，用10N KOH或KOH固體調節(jié)PH值，只有當PH接近6.7時粉末才能完全溶解，此時 當小心少量地加入KOH直至達到所需PH值。

轉化

1.取100μl感受態(tài)細胞于冰浴上融化。

2.加入1μl純質?；蜻B接產物，輕輕吹打混勻，冰浴30min。3.將菌液放入42℃水浴中熱激90秒，立即放入冰浴中2min。4.加入0.9mlSOC，于37℃恒溫搖床上200rpm×1hr溫育。

5.將菌液4000rpm/min離心3min，留200μl上清將菌體打散，均勻涂布于含適當

抗生素的瓊脂平板表面，平板于37℃倒置培養(yǎng)過夜。

i.注：新倒的平板可于37℃培養(yǎng)箱中預先放置數(shù)小時至過夜干燥。ii.當轉化的是TA克隆連接產物時可在菌液中加入8μl 1MIPTG 和40μl 20mg/mlX-gal以進行藍白斑篩選。

重組子的篩選和鑒定

重組子可通過酶切進行鑒定，也可以利用擴增引物通過PCR進行鑒定，陽 性重組子能切出所需要的片段或得到相應片段的PCR產物。

1.用牙簽挑取平板上的菌落接種于2ml含適當抗生素的LB培養(yǎng)基中，37℃搖 床培養(yǎng)過夜。

2.次日取菌液0.2-0.5ml，13,000rpm×3min離心，棄上清，加入20μl ddH2O和 20μl 酚/氯仿，震蕩混勻，13,000rpm×5min離心。

3.取上清進行瓊脂糖電泳，加入載體質粒DNA作為陰性對照，根據(jù)質粒大小 初步篩選重組子，重組子的泳動速度應該慢于載體質粒。4.用堿法小量制備可能是重組子的質粒DNA。

5.選取適當?shù)拿?，對重組子進行酶切分析，酶切體積均為10μl體系。酶切樣品 進行瓊脂糖電泳鑒定是否有所需片段。

6.酶切分析正確的重組子分成兩份，一份進行測序反應，另外一份保種。7.若用PCR法鑒定，則在第2步時每個樣本取0.5-1.0μl 菌液為模板進行PCR 反應，每管反應體系最低可少至10μl，PCR產物電泳，能得到所需條帶的樣 本進一步提取質粒酶切鑒定或送樣品測序。

第三篇：基因工程

寧波大學科學技術學院考核答題紙

（2011--2012學年第 學期）

課號：:EK5G04A00

課程名稱：現(xiàn)代生物技術概論

閱卷教師：

班級：10級生物工程

學號：104177306

姓名：郭兆峰

成績：

基因工程

摘要：基因工程是20世紀70年代在分子遺傳學、細胞生物學基礎上發(fā)展起來的，是一種可以按照人們的意愿設計、改造和組建生物品種的新技術。包括它通過基因操作，將目的基因活DNA片段與合適的載體連接轉入目標生物細胞，通過復制、轉錄、翻譯外源目的基因以及蛋白質的活性表達，使轉基因生物獲得新的遺傳性狀。

關鍵詞：生物技術；基因工程

一、基因工程的誕生：

從20世紀40年代開始，受分子生物學、分子遺傳學發(fā)展的影響，基因分子生物學取得巨大進步，為基因工程的誕生奠定了基礎。現(xiàn)在人們公認的誕生日期是1973年，其中現(xiàn)代分子生物學領域上的三大發(fā)現(xiàn)及技術上的三大發(fā)明起了決定性作用。

理論上的三大發(fā)現(xiàn)包括：第一，20世紀40年代，Avery 在美國的一次學術會上報道了肺炎球菌的轉化，證明了遺傳信息的攜帶者是DNA而不是蛋白質；第二，1953年，Watson 和 Crick 提出的DNA分子的雙螺旋結構以及半保留復制機理，解決了基因的自我復制和傳遞問題；第三，20世紀50年代末的“中心法則”，60年代由Monod 和 Jacob 提出的操縱分子學說，并成功的由一批科學家破譯了遺傳密碼從而闡明了遺傳信息的流向和表達問題。

以上問題的解決使得人們自主改造生物遺傳性狀從理論上成為現(xiàn)實。

技術上的三大發(fā)明：第一，1967年發(fā)現(xiàn)的DNA連接酶，以及1979年發(fā)現(xiàn)的具有更高活性的T4 DNA連接酶。在1970年Smith和 Wilcox從流感嗜血桿菌中分離并純化的限制性核酸內切酶HindⅡ和1972年發(fā)現(xiàn)的EcoRⅠ核酸內切酶。后來發(fā)現(xiàn)的大量的限制性核酸內切酶。第二，一些病毒、質粒和噬菌體等載體技術的發(fā)現(xiàn)使把目的基因的導入更加容易。第三，DNA分子序列分析及瓊脂糖凝膠電泳、Southern雜交技術的發(fā)展使得基因工程的誕生越來越近。1973年，斯坦福大學將抗四環(huán)素質粒和抗新霉素的質粒用限制性內切酶切割并連接成重組質粒導入到大腸桿菌中是基因工程誕生的標志。

二、基因工程有幾個重要特征：（1）、打破了物種的界限，實現(xiàn)跨物種的基因轉移；（2）、通過已知功能基因的遺傳轉化，進行物種的定向改良；（3）、創(chuàng)造出自然界中本來不存在的物種。

三、基因工程技術流程包括：（1）、目的基因克隆，即從特定生物基因組和cDNA中分離提純和擴大繁殖目的基因；（2）、選擇合適的載體，并對載體DNA進行克??；（3）、將目的基因與載體寧波大學科學技術學院考核答題紙

（2011--2012學年第 學期）

課號：:EK5G04A00

課程名稱：現(xiàn)代生物技術概論

閱卷教師：

班級：10級生物工程

學號：104177306

姓名：郭兆峰

成績：

連接；（4）、將重組DNA導入到大腸桿菌或酵母菌體內培養(yǎng)；（5）、利用載體上的標記基因進行篩選，獲得轉目的基因的細胞或植株。

四、基因工程的應用：

（1）基因工程應用于農業(yè)生產方面：農業(yè)領域是目前轉基因技術應用最為廣泛的領域之一。農作物生物技術的目的是提高作物產量，改善品質，增強作物抗逆性、抗病蟲害的能力。基因工程在這些領域已取得了令人矚目的成就。

（2）基因工程應用于醫(yī)藥方面：目前，以基因工程藥物為主導的基因工程應用產業(yè)已成為全球發(fā)展最快的產業(yè)之一，發(fā)展前景廣闊?；蚬こ趟幬镏饕毎蜃印⒖贵w、疫苗、激素和核苷酸藥物等。它們對預防人類的腫瘤、心血管疾病、遺傳病、糖尿病、包括艾滋病在內的各種傳染病、類風濕疾病等有重要作用。在很多領域特別是疑難病癥上，基因工程工程藥物起到了傳統(tǒng)化學藥物難以達到的作用。我們最為熟悉的干擾素(IFN)就是一類利用基因工程技術研制成的多功能細胞因子，在臨床上已用于治療白血病、乙肝、丙肝、多發(fā)性硬化癥和類風濕關節(jié)炎等多種疾病。

（3）基因工程應用于環(huán)保方面：基因工程技術可提高微生物凈化環(huán)境的能力。美國利用DNA重組技術把降解芳烴、萜烴、多環(huán)芳烴、脂肪烴的4種菌體基因鏈接，轉移到某一菌體中構建出可同時降解4種有機物的“超級細菌”，用之清除石油污染，在數(shù)小時內可將水上浮油中的2/3烴類降解完，而天然菌株需要1年之久。也有人把Bt蛋白基因、球形芽孢桿菌、且表達成功。它能釘死蚊蟲與害蟲，而對人畜無害，不污染環(huán)境?，F(xiàn)已開發(fā)出的基因工程菌有凈化農藥的DDT的細菌、降解水中的染料、環(huán)境中有機氯苯類和氯酚類、多氯聯(lián)苯的工程菌、降解土壤中的TNT炸藥的工程菌及用于吸附無機有毒化合物(鉛、汞、鎘等)的基因工程菌及植物等。90年代后期問世的DNA改組技術可以創(chuàng)新基因，并賦予表達產物以新的功能，創(chuàng)造出全新的微生物，如可將降解某一污染物的不同細菌的基因通過PCR技術全部克隆出來，再利用基因重組技術在體外加工重組，最后導入合適的載體，就有可能產生一種或幾種具有非凡降解能力的超級菌株，從而大大地提高降解效率。

五、基因工程的安全性問題：

自基因工程誕生以來，基因工程的安全性問題就受到人們極大的關注，關于重組DNA潛在的危險性問題的爭論，在基因工程還處于醞釀階段的時候就已經(jīng)開始。爭論的焦點是擔心基因工程寧波大學科學技術學院考核答題紙

（2011--2012學年第 學期）

課號：:EK5G04A00

課程名稱：現(xiàn)代生物技術概論

閱卷教師：

班級：10級生物工程

學號：104177306

姓名：郭兆峰

成績：的雜種生物會從實驗室溢出，在自然界造成難以抑制的災難，有害的雜種菌或病毒與化學物質不同，它們會在自然界不斷繁殖，造成的危害更大。

在1975年2月，美國國立衛(wèi)生研究院（NIH）在加利福尼亞州的Asilomar 會議中心內，160名來自美國和16個國家的專家學者對重組DNA的危害辯論，雖然與會代表分歧挺大，但最后也達成了一些重要的共識，在1976年6月23日美國NIH制定并公布了《重組DNA研究準則》。為了避免可能造成的危害，除了規(guī)定禁止若干類型的重組DNA實驗外，還制定了許多具體的規(guī)定條文。

六、基因工程的前景展望：基因工程技術是繼工業(yè)革命、信息革命之后 對人類社會產生深遠影響的一場革命。它在基因制藥、基因診斷、基因治療、基因芯片和基因克隆等技術方面取得的革命性成果，將極大地改變人類生命和生活面貌。

參考文獻：

1、基因工程/樓士林，楊盛昌，龍敏南等主編.—北京：科學出版社，2002

2、基因工程技術/鐘衛(wèi)鴻主編.—北京：化學工業(yè)出版社，2007.6

3、基因工程/何水林主編.—北京：科學出版社，2008

4、基因工程原理與技術/劉志國主編.—2版.—北京：化學工業(yè)出版社，2010,12

5、基因工程：原理、方法與應用/徐煜泉等編著.—北京：北京大學出版社，2008.12

第四篇：基因工程

《基因工程論文》

嗜熱解烴基因工程菌SL-21的構建

學

院：生命科學學院 班

級：生物技術12-2 學

號：7011208209 姓

名：陳 昆 任課教師：張銳

嗜熱解烴基因工程菌SL-21的構建

摘要﹕從以C15—C36直鏈烷烴為惟一碳源生長的解烴菌———地芽孢桿菌MD-2細胞中獲得了1個新的烴降解基因———烷烴單加氧酶基因sladA。將基因sladA克隆到質粒pSTE33上,構建了重組質粒pSTalk。通過電轉化將pSTalk轉化入嗜熱脫氮土壤芽孢桿菌ZJ-3內,構建了基因工程菌SL-21。SL-21兼具嗜熱和解烴的功能,在70℃條件下,14d后對原油的降解率達75.08%。研究結果表明,可以通過體外重組的方式向嗜熱菌中引入烴降解基因,從而構建嗜熱解烴基因工程菌。關鍵詞:微生物采油;烴類降解菌;嗜熱解烴基因;質粒;基因工程菌

微生物降解原油是微生物提高原油采收率的主要機理之一。研究結果表明,在解烴菌作用下原油的族組分發(fā)生變化,輕質組分增加,粘度下降,改善了原油的流動性;同時,解烴菌還可以將烴類分子轉化成有機溶劑、表面活性劑、酸和氣體等驅油物質。迄今為止,從自然界篩選的高效解烴菌絕大多數(shù)為嗜溫微生物,最適合生長溫度一般為20-45℃,很難適應油藏的高溫環(huán)境。筆者從1株解烴菌細胞中分離出1個新的烴降解基因———烷烴單加氧酶基因sladA,并采用基因工程手段將此基因轉化到另外1株最適合生長溫度為70℃的嗜熱菌體內,構建了嗜熱解烴基因工程菌SL-21。該基因工程菌既具有高效的解烴功能,又能適應油藏高溫環(huán)境,在微生物采油中具有良好的應用前景。1.1 實驗材料

實驗材料包括限制性內切酶EcoRⅠ和XhoⅠ;UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒、PCR片斷回收試劑盒;大腸桿菌感受態(tài)細胞E.coliDH5α;pGEM-T easy載體;質粒pSTE33 kanr,Ampr,EcoRⅠ/XhoⅠ;異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、氨芐青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)。LB培養(yǎng)基按文獻配制。無機鹽培養(yǎng)基組成:Na2HPO40.06g;KH2PO40.02g;NaNO30.2g;CaCl20.001g;FeSO40.001g;MgSO4 0.03g;蒸餾水100mL;pH值為7.2。嗜熱脫氮土壤芽孢桿菌ZJ-3,分離自勝利油區(qū)孤島油田中一區(qū)館3區(qū)塊采出液,最適合生長溫度為70℃;地芽孢桿菌MD-2,以C15—C36直鏈烷烴為惟一碳源生長,分離自勝利油區(qū)原油污染土壤。1.2 實驗方法

DNA的操作 基因組DNA小量提取,利用聚合酶鏈式反應(PCR)對DNA擴增、PCR產物的回收、酶切與連接,質粒DNA提取和基因序列測定等均按文獻[13-14]方法進行。菌株培養(yǎng) 所涉及到的菌株培養(yǎng)均在溫度為70℃,轉速為180r/min的條件下進行振蕩培養(yǎng)?；蚬こ叹臉嫿ê秃Y選方法 ZJ-3感受態(tài)細胞的制備按文獻[13-14]方法進行。用構建的重組質粒pSTalk在最佳條件下電轉化ZJ-3感受態(tài)細 胞構建基因工程菌。在含有50μg/mL Kan的LB瓊脂平板上挑選10個陽性克隆接種到5mL LB培養(yǎng)基中,培養(yǎng)過夜,獲得種子液。將該種子液接種到200mL以液蠟為惟一碳源的無機鹽培養(yǎng)基中,培養(yǎng)5d后用CCl4抽提剩余的液蠟,用紅外測油儀測定烴的剩余量,根據(jù)菌株降解液蠟的速率篩選出目的基因工程菌。基因工程菌的誘導表達及SDS-PAGE檢測挑取陽性克隆接種于含100μg/mL Amp的10mL的LB液體培養(yǎng)基中,180r/min下振蕩培養(yǎng)至光密度值達到0.6(檢測光波波長為600nm),加誘導物IPTG至終濃度為1mmol/L,振蕩培養(yǎng)8h,收集表達菌體,加SDS上樣緩沖液,于100℃水浴10min后上樣,用12%的SDS-PAGE電泳檢測。基因工程菌降油能力測試 將基因工程菌接入20mL LB培養(yǎng)基中,培養(yǎng)12h,以5 000r/min的速度離心5min收集菌體,用無菌生理鹽水洗滌菌體1次,加20mL無菌生理鹽水懸浮,作為菌株利用烷

烴生長的種子液。取菌懸液按1%接種量接入200mL無機鹽培養(yǎng)基中,加入2%孤島油田中一區(qū)館3區(qū)塊原油或2%的液體石蠟作為惟一碳源培養(yǎng),取樣稀釋涂布計數(shù)。原油降解實驗 在無機鹽培養(yǎng)基中添加2%的原油,按1%接種量接入基因工程菌,培養(yǎng)14d。用正己烷萃取降解后的原油,用氣相色譜儀測定原油飽和烴組分的降解情況。原油降解率為菌株降解前、后原油量的差值與菌株降解前原油量的比值。2 實驗結果與分析

2.1 MD-2基因組DNA的檢測

對MD-2基因組進行提取和純化。提取后的染色體DNA經(jīng)0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測,相對分子質量不小于23kb,說明提取的DNA完好。在檢測光波波長為260280nm條件下分別測出DNA的光密度,其比值為1.95,換算出DNA的質量濃度為1 400g/mL,表明DNA純度較好,無蛋白、RNA、酚和多糖物質的干擾。2.2 烷烴單加氧酶基因的克隆與序列分析依據(jù)美國國立衛(wèi)生研究院基因序列數(shù)據(jù)庫(Genbank)中的烷烴單加氧酶基因開放閱讀框兩端保守序列,設計了一對兼并引物以MD-2基因組DNA為模板進行PCR擴增,將約1.3kb的PCR產物回收后連接到pGEM-T easy載體上,轉入E.coliDH5α,挑取陽性克隆質粒進行測序。測序結果經(jīng)Genbank檢索,表明該DNA序列是個新的烷烴單加氧酶基因,命名為sladA。2.3 基因工程菌的構建及篩選

通過PCR擴增sladA后,將PCR產物用EcoRⅠ或XhoⅠ消化,分離純化出1 329bp的片斷,與經(jīng)EcoRⅠ或XhoⅠ消化的pSTE33質粒連接,構建成含sladA的重組質pSTalk。經(jīng)電泳鑒定表明(圖1),重組質粒構建成功。

2.4 基因sladA在基因工程菌SL-21中的誘導表達

由基因工程菌SL-21全蛋白的SDS-PAGE圖譜可見(圖2),在烷烴單加氧酶基因sladA對應蛋白大小的地方掃描到高信號強度,表明sladA基因在SL-21中得以表達。2.5 基因工程菌SL-21碳源生長

基因工程菌SL-21在以原油和液體石蠟為惟一碳源的無機鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng),在70℃和180r/min條件下,經(jīng)過3d的延滯期后進入對數(shù)期,菌體數(shù)增加。17d后,菌體數(shù)為接菌初期的5倍,表明SL-21能夠利用原油或液體石蠟作為惟一碳源生長。2.6 對原油的降解作用

由原油飽和烴組分的降解情況可看出(圖3),基因工程菌對原油有很明顯的降解效果,幾乎將飽和烴降解完全。經(jīng)對氣相色譜各峰面積對比,計算出各峰面積的含

量和飽和烴組分降解率(表2)。基因工程菌SL-21對原油的降解率為75.08%。

實驗結果表明,烴類降解菌地芽孢桿菌MD-2細胞提取的烷烴單加氧酶基因sladA可以在嗜熱脫氮土壤芽孢桿菌ZJ-3中表達。但不同的基因工程菌株中烷烴單加氧酶基因sladA表達的效率不同,需要通過菌株對原油的降解評價進一步篩選。獲得的對原油降解速率最高的基因工程菌SL-21能在70℃高溫條件下生長,并且對原油降解效果明顯。因此以體外重組方式向嗜熱菌中引入烴類降解基因構建嗜熱解烴基因工程菌在技術上是可行的。3 結論

以地芽孢桿菌MD-2為目標菌株,克隆和表達了降解長鏈烷烴的單加氧酶基因sladA,并在嗜熱脫氮土壤芽孢桿菌ZJ-3中正確表達了基因sladA,構建了基因工程菌SL-21?；蚬こ叹鶶L-21在70℃條件下,能以原油或液體石蠟為惟一碳源生長。14d對原油的降解率為75.08%,對原油飽和烴組分均有明顯的降解效果。該基因工程菌既可以用于微生物驅油技術,又可以用于高溫油田污水的生物處理。利用基因工程的方法可以獲得既能耐受極端環(huán)境,又具有良好功能的基因工程菌株,是石油微生物菌種選育的重要方向。參考文獻: [1] 周金葵,王大威,廖明清,等.一株石油烴降解菌的篩選及性能研究[J].大慶石油地質與開發(fā),2007,26(6):119-123.[2] 汪衛(wèi)東,汪竹,耿雪麗,等.美國微生物采油技術現(xiàn)場應用效果分析[J].油氣地質與采收率,2002,9(6):75-76.[3] 袁長忠,宋永亭,段傳慧.微生物采油用營養(yǎng)物質在石英砂上的靜態(tài)和動態(tài)吸附規(guī)律[J].油氣地質與采收率,2009,16(4):74-76.[4] 修建龍,董漢平,俞理,等.微生物提高采收率數(shù)值模擬研究現(xiàn)狀[J].油氣地質與采收率,2009,16(4):86-89.[5] 路璐,向廷生,黑花麗.本源微生物降解原油的飽和烴色譜分析[J].油氣地

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第五篇：基因工程

基因工程技術的程序與應用

【摘要】基因工程技術是一項正在蓬勃發(fā)展的技術，它將給人類社會帶來一場深刻的變革，我們有必要了解基因工程的概念、原理、技術程序，以及基因工程在農業(yè)、工業(yè)、醫(yī)藥等方面的應用和進展情況。

【關鍵詞】基因工程技術程序應用進展

基因工程（genetic engineering）又稱基因拼接技術和DNA重組技術，是以分子遺傳學為理論基礎，以分子生物學和微生物學的現(xiàn)代方法為手段，在分子水平上對基因進行復雜的操作，將不同來源的基因按預先設計的藍圖，在體外構建雜種DNA分子，然后導入活細胞，使這個基因能在受體細胞內復制、轉錄、翻譯表達，以改變生物原有的遺傳特性、獲得新品種、生產新產品。它是用人為的方法將所需要的某一供體生物的遺傳物質——DNA大分子提取出來，在離體條件下用適當?shù)墓ぞ呙高M行切割后，把它與作為載體的DNA分子連接起來，然后與載體一起導入某一更易生長、繁殖的受體細胞中，以讓外源物質在其中“安家落戶”，進行正常的復制和表達，從而獲得新物種的一種嶄新技術。它克服了遠緣雜交的不親和障礙?；蚬こ碳夹g為基因的結構和功能的研究提供了有力的手段。

一 基因工程的技術程序

基因工程的基本原理是在體外將不同來源的DNA進行剪切和重組，形成鑲嵌DNA分子，然后將之導入宿主細胞，使其擴增表達，從而使宿主細胞獲得新的遺傳特性，形成新的基因產物。它有3個基本的步驟：①從合適材料分離或制備目的基因或DNA片段。②目的基因或DNA片段與載體連接作成重組DNA分子。③重組DNA分子引入宿主細胞，在其中擴增和表達。不同種類生物的生物學特性不同，其基因工程在操作上和具體技術上必然有所差異，但技術核心都是DNA的重組，即利用一系列的DNA限制性內切酶、連接酶等分子手術工具，在某種生物DNA鏈上切下某個目標基因或特殊的DNA片段，然后根據(jù)設計要求，將其接合到受體生物DNA鏈上。

一個完整的用于生產生產目的的基因工程技術程序包括的基本內容有：①外源目標基因的分離、克隆以及目標基因的結構與功能研究。②適合轉移、表達載體的構建或目標基因的表達調控結構重組。③外源基因的導入。④外源基因在宿主基因組上的整合、表達及檢測與轉基因生物的篩選。⑤外源基因表達產物的生理功能的檢定。⑥轉基因新品系的選育和建立以及轉基因新品系的效益分析。⑦生態(tài)與進化安全保障機制的建立。⑧消費安全評價。

（一）外源目標基因的分離、克隆及功能結構分析

獲合乎人類某種需要的取目的基因是實施基因工程的第一步，也是開展一項基因工程的前提和全部工作的核心。目前人們已經(jīng)能夠通過多種途徑和方法來獲取目標基因，其中主要有兩條途徑：一條是從供體細胞的DNA中直接分離基因；另一條是人工合成基因。

直接分離基因最常用的方法是“鳥槍法”，又叫“散彈射擊法”。鳥槍法的具體做法是：用限制酶將供體細胞中的DNA切成許多片段，將這些片段分別載入運載體，然后通過運載體分別轉入不同的受體細胞，讓供體細胞提供的DNA（即外源DNA）的所有片段分別在各個受體細胞中大量復制（在遺傳學中叫做擴增），1

從中找出含有目的基因的細胞，再用一定的方法把帶有目的基因的DNA片段分離出來。如許多抗蟲抗病毒的基因都可以用上述方法獲得。用鳥槍法獲得目的基因的優(yōu)點是操作簡便，缺點是工作量大，具有一定的盲目性。又由于真核細胞的基因含有不表達的DNA片段，一般使用人工合成的方法。

目前人工合成基因的方法主要有兩條。一條途徑是以目的基因轉錄成的信使RNA為模版，反轉錄成互補的單鏈DNA，然后在酶的作用下合成雙鏈DNA，從而獲得所需要的基因。另一條途徑是根據(jù)已知的蛋白質的氨基酸序列，推測出相應的信使RNA序列，然后按照堿基互補配對的原則，推測出它的基因的核苷酸序列，再通過化學方法，以單核苷酸為原料合成目的基因。如人的血紅蛋白基因胰島素基因等就可以通過人工合成基因的方法獲得。

（二）構建能在受體生物細胞中表達的重組目標基因

要使一個外源目標基因能整合到受體細胞的基因組中并能在整合后在受體基因組的調控下有效地轉錄和翻譯，就必須事先對目標基因的功能結構用DNA重組技術進行適當?shù)男揎?，也就是將目標基因與一種特別的DNA分子重組，這種特別的DNA分子稱為基因載體，目前所用的載體主要有以下幾類：質粒、λ噬菌體、柯斯質粒、病毒載體、YAC載體等，各類載體具有獨特的生物學特性，可用于不同的目標基因。

（三）外源重組目標基因的導入

將重組的外源目標基因轉入到宿主細胞中的過程稱為基因導入或基因轉移。接受外源基因的細胞稱為受體細胞。由于受體生物學特征的不同以及基因工程目的不同，外源基因導入的方法也不同，有的是用載體導入，有的是直接用物理的方法導入。目前使用的有轉化、轉染、電穿孔導入法、基因槍射入法、顯微注射法、脂質體介導法等，向細菌等微生物中導入外源目標基因常用質粒轉化和噬菌體轉染方法；向植物細胞中導入外源基因常用基因槍注入法和Ti質粒導入法；能由原生質體再生出植株的植物細胞還可以用電穿孔導入法及脂質體融合法；動物的受精卵一般通過人工顯微鏡注射法導入外源基因；動物的體細胞可用電穿孔法和病毒轉染法導入外源基因，但對用于生產目的的基因工程常常避免用病毒轉染法。

（四）轉基因細胞或個體的鑒別和篩選

在對宿主的細胞進行了外源目標基因導入處理以后，有些細胞可能并沒有外源基因的進入，另有一些細胞可能在外源基因進入后因各種原因而不能使外源基因表達，因此必須對被進行了基因轉移處理的細胞或個體進行鑒別，以篩選出導入外源目標基因的轉基因細胞或個體。鑒別和篩選轉基因生物一般在兩個層面上進行：一是檢測目標基因是否表達，二是檢測目標基因是否整合到了宿主的染色體上和能否穩(wěn)定傳代。表達檢測的方法主要有轉錄產物的印跡雜交法、免疫印跡檢測法、免疫組織化學檢測法等。整合檢測可通過DNA分子雜交來確定。

（五）轉基因品系的效益分析。

一個生產性能優(yōu)越的轉基因品系，首要的條件是目標基因的表達產物必須有正常的生理功能，另一個必要標志是其目標基因必須有適度的高效表達特性和可持續(xù)生產能力。

（六）生態(tài)與進化安全保障

由于轉基因生物與其他生物一樣具有可遺傳、易擴散及自主的特性，而且人類對生命、生態(tài)系統(tǒng)、生物的演化實際上還知之甚少，對不同物種間基因的人工組合，外源基因對受體生物進化的可能影響，轉基因生物對生態(tài)系統(tǒng)的長期影響

等都無法進行評估，因此如果人們不事先采取控制措施，轉基因生物一旦進入到自然環(huán)境中就可能打破生態(tài)平衡，破壞生態(tài)環(huán)境和自然種質資源。對轉基因生物的控制措施有物理的方法和生物的方法：物理的方法就是通過各種嚴格的管理措施和物理屏障盡量使轉基因生物不能從實驗室逃逸進入到自然環(huán)境里去；生物的方法一般就是造成轉基因生物與非轉基因生物之間的生殖隔離，如利用三倍體不育的特性將用于生產的轉基因動物或植物變成三倍體等。

（七）消費安全評價

消費安全評價一般要考慮以下一些主要的方面：①導入外源目標基因本身編碼的產物是否安全。②外源目標基因是否穩(wěn)定。③使用的載體是否安全。④使用的報道基因（就是能產生很容易觀察的性狀的基因）是否會產生有害物質。⑤外源基因導入后是否會誘導受體生物產生新的有害遺傳性狀或不利于健康的成分。為了保護人類的健康，許多國家都已通過立法或其他形式對轉基因產品進行消費安全評價和嚴格的管理，對進口轉基因食品嚴格限制。

二 基因工程的應用

基因工程在醫(yī)藥業(yè)中的應用。許多藥品的生產是從生物組織中提取的。受材料來源限制產量有限，其價格往往十分昂貴。微生物生長迅速，容易控制，適于大規(guī)模工業(yè)化生產。若將生物合成相應藥物成分的基因導入微生物細胞內，讓它們產生相應的藥物，不但能解決產量問題，還能大大降低生產成本。如基因工程胰島素、干擾素、人造血液、白細胞介素、乙肝疫苗等通過基因工程實現(xiàn)工業(yè)化生產，均為解除人類的病苦，提高人類的健康水平發(fā)揮了重大的作用。

基因診斷與基因治療。遺傳病是長期困擾人類的一類不治之癥，迄今已發(fā)現(xiàn)的有3000多種。其根源于遺傳基因存在缺陷，主要特征是可隨生育而傳代?；蛑委熓前颜；驅氩∪梭w內，使該基因的表達產物發(fā)揮功能，從而達到治療疾病的目的，這是治療遺傳病的最有效的手段?；痉椒ㄊ牵夯蛑脫Q、基因修復、基因增補和基因失活等。如運用基因工程設計制造的“DNA探針”檢測肝炎病毒等病毒感染及遺傳缺陷，不但準確而且迅速。通過基因工程給患有遺傳病的人體內導入正常基因可“一次性”解除病人的疾苦。

基因工程在農牧業(yè)、食品工業(yè)上的應用。運用基因工程技術，不但可以培養(yǎng)優(yōu)質、高產、抗性好的農作物及畜、禽新品種，還可以培養(yǎng)出具有特殊用途的動、植物。如轉基因魚（生長快、耐不良環(huán)境、肉質好），轉基因牛（乳汁中含有人生長激素），轉黃瓜抗青枯病基因的甜椒，轉魚抗寒基因的番茄，轉黃瓜抗青枯病基因的馬鈴薯，不會引起過敏的轉基因大豆，抗蟲棉等。

基因工程在環(huán)境保護工業(yè)方面的應用?；蚬こ套龀傻腄NA探針能夠十分靈敏地檢測環(huán)境中的病毒、細菌等污染。利用基因工程培育的指示生物能十分靈敏地反映環(huán)境污染的情況，卻不易因環(huán)境污染而大量死亡，甚至還可以吸收和轉化污染物。如有一種超級細菌，能快速分解石油，可用于清除被石油污染的海域。這種超級菌是美國科學家用基因工程方法，把降解不同石油化合物的基因移植到一個菌株內而產生的。

總之，基因工程的發(fā)展將會給人類社會帶來巨大的變化。

三 基因工程的進展狀況

基因工程技術是一項正在蓬勃發(fā)展的技術，而且也已經(jīng)取得了許多重要的應用成果，但我們也應該看到，基因工程技術不是一項已經(jīng)成熟的技術，仍然還很粗糙和原始，在許多方面尚需完善和改進。

1．基因工程在技術上存在一定的不確定性和盲目性。目前的基因工程在技術上有很多的不確定性。這種不確定性表現(xiàn)在兩個方面，一是技術方面的不穩(wěn)定性，二是由于對不同生物的生理特性的了解不很深入，如我們將魚類抗凍蛋白基因轉移到不抗寒的羅非魚等熱帶魚中，雖然抗凍蛋白基因得到表達，但并沒有使受體魚產生預期的抗寒效果。目前我們所進行的基因工程基本上只能對簡單的、單基因控制的性狀進行設計和改造，操作對象只限于一些比較簡單的單因子基因。但生物絕大部分的重要性狀是由多個基因共同控制的，對這些多基因控制的性狀，現(xiàn)有的基因工程技術幾乎仍然是束手無策。我們對活的生物體中基因表達調控的機制知之甚少，有關的知識僅限于對啟動子和增強子有所了解，對生物體整體的調節(jié)復雜性的認識還剛剛開始。

2．在安全性方面存在著不確定性。對社會大眾來說，最主要和最關心的是基因工程的安全性問題，基因工程的安全性問題包括兩個方面：一是基因工程產品的消費安全問題，二是轉基因生物的生態(tài)安全問題。目前用轉基因技術生產出來的食品因其成分的某些改變是否會對人類的健康產生不良的影響，這需要實驗和時間來驗證。有著某種生存優(yōu)勢的轉基因生物如果進入到自然生態(tài)系統(tǒng)，就有可能排擠自然種群，降低生態(tài)系統(tǒng)里物種的多樣性，打破生態(tài)平衡。

所以我們在大力發(fā)展轉基因技術的同時，必須高度重視對轉基因動物、植物及微生物品種的生物控制和控制技術的研究。在轉基因品種的安全性沒有進行全面的評估和沒有可靠的生物控制措施之前，應嚴格禁止其進行生產和進入開放的自然生態(tài)系統(tǒng)，只有其生態(tài)安全性達到了傳統(tǒng)育種方法培育的新品種時，或無生殖能力的轉基因動物和植物才能允許進入自然界進行生產，也只有這樣才是有益于人類和社會進步的。

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