第一篇：組織切片的制作

組織切片的制作

1．取材組織取材的方法是制作切片的一個(gè)重要程序，根據(jù)教學(xué)、科研及外檢的具體要求取自人體（外科手術(shù)切除標(biāo)本、活檢標(biāo)本、尸檢標(biāo)本）或動(dòng)物，并確定取材的部位和方法。取材者需要掌握解剖學(xué)、組織學(xué)、病理學(xué)的基本理論知識(shí)，還要掌握實(shí)際操作技術(shù)，每個(gè)組織器官的取材都有一定的部位和方法，不能任意切取組織作為制片材料，不然，無法達(dá)到教學(xué)、科研和臨床診斷的目的，具體要求如下：

(1)材料新鮮：取材組織愈新鮮愈好，人體組織一般在離體后，動(dòng)物組織在處死后迅速固定，以保證原有的形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)。

(2)組織塊的大小：所取組織塊較理想的體積為2.0cm×2.0cm×0.3cm，以使固定液能迅速而均勻地滲入組織內(nèi)部，但根據(jù)制片材料和目的不同，組織塊的較理想體積也不同，如制作病理外檢、科研切片，其組織塊可以薄取0.1～0.2cm即可，這樣可以縮短固定脫水透明的時(shí)間，若制作教學(xué)切片厚取0.3 ～0.5cm，這樣可以同一蠟塊制作出較多的教學(xué)切片。

(3)勿擠壓組織塊: 切取組織塊用的刀剪要鋒利，切割時(shí)不可來回銼動(dòng)。夾取組織時(shí)切勿過緊，以免因擠壓而使組織、細(xì)胞變形。

(4)規(guī)范取材部位: 要準(zhǔn)確地按解剖部位取材，病理標(biāo)本取材按照各病變部位、性質(zhì)的不同，根據(jù)要求規(guī)范化取材。

(5)選好組織塊的切面:根據(jù)各器官的組織結(jié)構(gòu)，決定其切面的走向?？v切或橫切往往是顯示組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵，如長(zhǎng)管狀器官以橫切為好。

(6)保持材料的清潔:組織塊上如有血液、污物、粘液、食物、糞便等，可用水沖洗干凈后再放入固定液中。(7)保持組織的原有形態(tài):新鮮組織固定后，或多或少會(huì)產(chǎn)生收縮現(xiàn)象，有時(shí)甚至完全變形。為此可將組織展平，以盡可能維持原形。

2．固定

(1)小塊組織固定法：這是最常用的方法，從人體或動(dòng)物體取下的小塊組織，須立即置入液態(tài)固定劑中進(jìn)行固定，通常，標(biāo)本與固定液的比例為1:4～20，但組織塊不宜過大過厚，否則固定液不能迅速滲透。故取組織塊的大小一般為2.0cm×2.0cm×0.3cm。

(2)注射、灌注固定法：某些組織塊由于體積過大或固定液極難滲入內(nèi)部，或需要對(duì)整個(gè)臟器或整個(gè)動(dòng)物體進(jìn)行固定。這時(shí)宜采用注射固定或灌注固定法。將固定液注入血管，經(jīng)血管分支到達(dá)整個(gè)組織和全身，從而得到充分的固定。

(3)蒸汽固定法：比較小而厚的標(biāo)本，可采用鋨酸或甲醛蒸汽固定法。如血液涂片，則應(yīng)在血片未干燥前采用鋨酸或甲醛蒸汽接觸固定。

最常用的固定液有10%甲醛固定液和95%乙醇固定液。3．脫水透明標(biāo)本經(jīng)過固定和沖洗后，組織中含有較多的水分，必須將組織塊內(nèi)的水分置換出來，這一過程叫做脫水。無論是用石蠟切片，還是用火棉膠切片，都必須除去組織中所含水分，因含水組織與石蠟、火棉膠等包埋材料不相容，常用的脫水劑為一系列不同濃度的乙醇。

脫水的步驟是：80%、90%、95%、100%各種濃度乙醇2小時(shí)，此過程可用脫水機(jī)自控完成。

丙酮也是一種脫水能力很強(qiáng)的脫水劑，但因其脫水能力很強(qiáng)，對(duì)組織有劇烈收縮作用，在制作科研、教學(xué)切片時(shí)一般不用該試劑。因乙醇、丙酮等不溶于石蠟，還要經(jīng)過一個(gè)能溶于石蠟的溶劑替代過程稱為透明。常用的透明劑有二甲苯、三氯甲烷、水楊酸甲酯等。

4．浸蠟、包埋

(1)使石蠟浸入組織中，取代組織中含有的透明劑。

(2)包埋：將浸蠟后的組織置于融化的固體石蠟中，石蠟?zāi)毯?，組織即被包在其中，稱蠟塊，此過程稱為包埋。5．切片和貼片

(1)修整蠟塊：可視其組織的大小，在組織邊緣約0.1～0.2cm處，切去余蠟部分，否則易造成組織皺縮不平。(2)準(zhǔn)備好切片用具：切片刀、毛筆、眼科鑷子（彎）、漂烘溫控儀(3)安裝蠟塊：將修好的蠟塊安裝在金屬或木制持蠟器上。

(4)安裝切片刀：將切片刀安裝在切片機(jī)的刀臺(tái)上，把刀臺(tái)上的緊固螺絲旋緊，使切片時(shí)不產(chǎn)生振動(dòng)，能保持一定的切片厚度。

(5)切片的厚度：切片機(jī)的厚度調(diào)節(jié)器上刻有0～50μm或0～25μm，可任意選擇其厚度，石蠟切片的厚度一般在4～6μm。

(6)切片

(7)鋪片：用眼科鑷子鑷起蠟帶輕輕平鋪在40～45℃的水面上，借水的張力和水的溫度，將略皺的蠟帶自然展平。(8)貼片、烘片：待切片在恒溫水面上充分展平后，將蠟片撈到載玻片的中段處傾去載玻片上的余水，置入60～65℃恒溫箱內(nèi)或切片漂烘溫控儀的烘箱內(nèi)烤片15～30分鐘，脫去溶化組織間隙的石蠟。

6．染色和封片常用的染色方法是蘇木素-伊紅（Hematoxylin-Eosin）染色法，簡(jiǎn)稱H.E染色法。這種方法對(duì)任何固定液固定的組織和應(yīng)用各種包埋法的切片均可使用。蘇木素是一種堿性染料,可使組織中的嗜堿性物質(zhì)染成藍(lán)色，如細(xì)胞核中的染色質(zhì)等；伊紅是一種酸性染料，可使組織中的嗜酸性物質(zhì)染成紅色，如多數(shù)細(xì)胞的胞質(zhì)、核仁等在H.E染色的切片中均呈紅色。

H.E染色程序如下:脫蠟、脫苯、復(fù)水、染色、脫水、透明、封固

常規(guī)蘇木素染色中的對(duì)比染色是用伊紅,近年來在英、美國(guó)家的一些實(shí)驗(yàn)室則采用焰紅（phloxine）,此外也有用桔黃G（OrangeG）、比布里希猩紅(Biebrich scarlet)、波爾多紅(Bordeaux red)等作為對(duì)比染色。伊紅為染胞質(zhì)、膠原纖維、肌纖維、嗜酸性顆粒等常用的染料。

第二篇：病理組織切片制作技術(shù)

病理組織切片制作技術(shù)

病理組織切片常用的制作方法有三種。即石蠟切片法，冰凍切片法和火棉膠切片法。以石蠟切片法為代表，切片的基本制作過程是：

組織取材→固定→沖洗→脫水→透明→浸蠟→組織包埋→組織切片→展片附貼→切片脫蠟→染色→脫水→染片透明→封固。

以上基本過程是互相聯(lián)系的，任何一環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題，都將使整個(gè)切片制作歸于失敗。因此應(yīng)細(xì)致、耐心、認(rèn)真負(fù)責(zé)，并事先做好計(jì)劃安排。

一、取材

采取病料，要刀剪銳利，剪切時(shí)不可擠壓，扯拉病料，以防人為損傷。切取的工具要清潔。采取病料越新鮮越好，一般不超過死后24小時(shí)。應(yīng)選擇病變部與可疑病變部切取，切取時(shí)要由表及里，有淺入深并包括周圍正常組織一部分。特殊病料應(yīng)根據(jù)器官的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)切取。管狀，囊狀和皮膚組織應(yīng)注意垂直切取（橫切）。帶有薄膜的組織，要防止切時(shí)薄膜分離和脫落。

切取組織塊大小，以1.5×1.5×0.3厘米為宜，最厚不宜超過0.5厘米。組織塊病變一面應(yīng)平整光滑，另一面可不平整，以便包埋時(shí)辨認(rèn)。切取后，放入事先準(zhǔn)備好的裝有固定液的磨口玻璃廣口瓶中，并做好標(biāo)記。

二、固定

固定的目的是迅速將組織細(xì)胞殺死，使細(xì)胞中的蛋白質(zhì)，糖，脂肪等凝固，從而保持與活組織相似的結(jié)構(gòu)狀態(tài)。材料取下后，應(yīng)迅速固定。固定液數(shù)量應(yīng)為病理組織塊的5到20倍。由于一般把組織塊浸入固定液后數(shù)小時(shí)，固定液滲入組織液的深度只達(dá)2到3厘米。因此，可以放置冰箱內(nèi)固定，使組織內(nèi)酶失去作用，細(xì)菌也能停止滋生。

最常用的固定液是10%的福爾馬林溶液：使用時(shí)，用40%的甲醛飽和水溶液10毫升，加水90毫升配成。

三、沖洗

固定后的組織塊，應(yīng)將固定液洗去。一般均用流水（自來水）沖洗12到24小時(shí)左右。及時(shí)沖洗尚有停止固定的作用，防止固定過度，有利于制片染色。

沖洗時(shí)如不方便用流水沖洗，也可用較大容器盛裝水浸洗，每隔相當(dāng)時(shí)間換水一次。整個(gè)浸洗時(shí)間比流水沖洗應(yīng)稍長(zhǎng)一些。酒精固定的組織材料不需沖洗。

四、脫水

經(jīng)過固定的組織，沖洗后要進(jìn)行脫水。脫水的目的在于將組織內(nèi)的水分用酒精或其他溶劑置換出來，為石蠟等其他包埋劑浸入組織創(chuàng)造條件。常用的脫水劑為酒精。由于酒精可以任何比例與水結(jié)合，對(duì)組織穿透力強(qiáng)，又能使組織硬化，因而不能將組織從水中直接移入濃度高的酒精中，應(yīng)從低濃度逐漸到高濃度。脫水必須充分，否則給浸蠟造成困難。

除用酒精作脫水劑外，還可以用正丁醇（N—Butyla alcohol）。正丁醇微溶于水，能與各種濃度酒精混合，也能直接溶解石蠟。故組織經(jīng)正丁醇脫水后，不須經(jīng)二甲苯透明。用正丁醇作脫水劑，組織塊收縮減低，也不會(huì)過硬，故比酒精優(yōu)越。

五、透明

透明的目的是將組織內(nèi)的酒精用礦物油或植物油置換出來，并溶解石蠟，幫助石蠟浸透組織。由于經(jīng)過透明劑處理的組織塊用肉眼觀察呈透明狀，故稱這一過程為透明。常用的透明劑為二甲苯（Xylol），因其穿透力較強(qiáng)，因而組織在二甲苯中停留時(shí)間不宜過長(zhǎng)，一般透明時(shí)間在30分鐘左右即可。

六、浸蠟 浸蠟是指組織經(jīng)過透明作用以后，放入溶化的石蠟中浸滲，使石蠟浸入組織塊中，冷卻后，才能進(jìn)行切片。

通常選擇熔點(diǎn)在52～56℃之間的石蠟，并視切片時(shí)環(huán)境的氣溫而選擇。室溫高則選用熔點(diǎn)稍高的石蠟，反之，則選用熔點(diǎn)較低的石蠟，這樣可防止切片時(shí)石蠟太軟或易碎裂。浸蠟的過程是：

二甲苯石蠟混合液（1：1）

1小時(shí) 二甲苯石蠟混合液（1：2）

1小時(shí)

石蠟（1）

1小時(shí)30分 石蠟（2）

1小時(shí)30分

上述過程可在56℃～58℃恒溫箱中進(jìn)行，含二甲苯的混合液可用磨口小瓶盛裝。

七、包埋

包埋就是將已浸滲好的組織包埋于浸滲劑中。根據(jù)需要，包埋的方法常有石蠟包埋法和火棉膠包埋法。石蠟包埋法：

（1）先將熔化的石蠟倒入包埋框，用加熱的鑷子將欲包埋的組織塊在蠟液內(nèi)放置好。注意各組織塊之間的距離和每個(gè)組織塊的位置和方向。

（2）迅速第二次往平皿內(nèi)傾倒蠟液，淹沒組織塊。待蠟液出現(xiàn)凝固層后，即輕輕放入冷水盆中或冰箱中使其凝固。石蠟完全凝固后，倒出冷縮的蠟塊片，用加熱的外科刀，按組織塊位置修整蠟片待用。

對(duì)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物（狗和兔等）組織，一般的脫水透明和浸蠟時(shí)間如下： 處理步驟處理時(shí)間（min）處理步驟處理時(shí)間（min）① 75%酒精長(zhǎng)短不定二甲苯Ⅰ、Ⅱ⑥ 30 ② 85%酒精 120－300 二甲苯Ⅲ⑦ 60

③ 95%酒精Ⅰ和Ⅱ 120－300 56－58℃石蠟⑧ 30 ④無水酒精Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 30 56－58℃石蠟⑨ 60－120 ⑤無水酒精Ⅲ 60－120 56－58℃石蠟⑩ 120－180

注：摘自病理學(xué)技術(shù)，人民衛(wèi)生出版社，王伯，李玉松，黃高，張遠(yuǎn)強(qiáng)主編。

八、組織切片

不同的切片制備方法，其切片方法也有較大差別，組織切片法包括石蠟切片法、冰凍切片法、火棉膠切片法、石蠟包埋半薄切片法、樹脂包埋薄切片法和大組織石蠟切片法等。常用的切片工具包括組織切片機(jī)、切片刀和自動(dòng)磨刀儀器等。以下分別加以敘述。

（一）石蠟切片法

組織經(jīng)石蠟包埋后制成的蠟塊，用切片機(jī)制成切片的過程稱為石蠟切片法。為現(xiàn)在病理診斷常用的制作切片的方法。在切片前應(yīng)先切去標(biāo)本周圍過多的石蠟（此過程稱為修塊）但也不能留得太少，否則易造成組織破壞，連續(xù)切片時(shí)分片困難。一般切4－6μm的切片，特殊情況可切1－2μm。要觀察病變的連續(xù)性，可制作連續(xù)切片。除此之外，石蠟包埋的組織便于長(zhǎng)期保存，因此石蠟切片仍是目前各種切片制作方法中最常用，最普遍的一種方法。

1．切片前的準(zhǔn)備

（1）固定后的標(biāo)本經(jīng)脫水、透明、浸蠟和包埋后，制成蠟塊。高質(zhì)量的蠟塊和鋒利的切片刀是保證切片質(zhì)量的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。檢查切片刀是否鋒利，簡(jiǎn)便的方法是用頭發(fā)在刀鋒上碰一下，如一碰即斷，說明刀鋒鋒利。用顯微鏡觀察可確定刀口是否平整，有無缺口。

（2）準(zhǔn)備充足的經(jīng)過處理的清潔載玻片和恒溫烤片裝置，大中號(hào)優(yōu)質(zhì)狼毫毛筆和鉛筆（用于在載玻片的粗糙端寫號(hào)），如用普通載玻片，可用碳素墨水和蛋白甘油按3：1體積混合后書寫。

2．切片制作過程

（1）將預(yù)先修好的組織塊先在冰箱中冷卻，而后裝在切片機(jī)固定裝置上。將切片刀裝在刀架上，刀刃與蠟塊表面呈5℃夾角。將蠟塊固定，調(diào)整蠟塊與刀至合適位置，并移動(dòng)刀架或蠟塊固定裝置，使蠟塊與刀刃接觸。

（2）切片多使用輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)，使用時(shí)左手執(zhí)毛筆，右手旋轉(zhuǎn)切片機(jī)轉(zhuǎn)輪。先修出標(biāo)本，直到組織全部暴露于切面為止，但小標(biāo)本注意不要修得太多，以免無法切出滿意的用于診斷的切片，標(biāo)本應(yīng)注意切全。切出蠟片后，用毛筆輕輕地托起，爾后用眼科鑷夾起，正面向上放入展片箱（展片溫度根據(jù)作用的石蠟熔點(diǎn)進(jìn)行調(diào)整，一般低于蠟熔點(diǎn)10～12℃），待切片展平后，即可進(jìn)行分片和撈片。切片經(jīng)30%的酒精初展后，再用載玻片撈起放入展片箱更易展平。為減少切片刀與組織塊在切片過程中產(chǎn)生的熱量，使石蠟保持合適的硬度，切片時(shí)可經(jīng)常用冰塊冷卻切片刀和組織塊，尤其在夏季高溫季節(jié)更為必要。（3）輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)切取組織，是由下向上切，為得到完整的切片，防止組織出現(xiàn)刀紋裂縫，應(yīng)將組織硬脆難切的部分放在上端（如皮膚組織，應(yīng)將表皮部分向上。而胃腸等組織，應(yīng)將漿膜面朝上）。

（4）撈片時(shí)注意位置，要留出貼標(biāo)簽的空間，并注意整齊美觀。撈起切片后，立即寫上編號(hào)。

（5）切片撈起后，在空氣中略微干燥后即可烤片。一般在60℃左右烤箱內(nèi)烤30min即可，也可用烤片器烤片。血凝塊和皮膚組織應(yīng)及時(shí)烤片。但對(duì)腦組織待完全晾干后，才能進(jìn)行烤片。否則，可能產(chǎn)生氣泡影響染色。

3．注意事項(xiàng)

（1）組織的取材和固定 取材時(shí)，組織塊的大小厚薄應(yīng)適當(dāng)，過大、過厚的組織，固定液不易滲透，易引起固定不良。過小、過薄的組織，在固定和脫水的過程中易變硬或產(chǎn)生彎曲扭轉(zhuǎn)，同樣影響切片質(zhì)量。陳舊、腐敗和干枯的組織不宜制作切片。用陳腐組織制成的切片，往往核漿共染，染色模糊，組織結(jié)構(gòu)不清，無法進(jìn)行觀察。固定不及時(shí)和固定不當(dāng)?shù)慕M織，染色時(shí)常出現(xiàn)核質(zhì)著色較淺，輪廓不清，出現(xiàn)不同程度的片狀發(fā)白區(qū)。組織固定時(shí)，固定液的量應(yīng)充足，至少要在4倍以上，同時(shí)注意組織塊不要與容器粘連。至于組織固定的時(shí)間，根據(jù)具體情況加以掌握。有關(guān)固定時(shí)應(yīng)注意的事項(xiàng)，可參見有關(guān)章節(jié)。（2）組織脫水、透明和浸蠟組織脫水用的各級(jí)酒精，應(yīng)保證相應(yīng)濃度，以便組織脫水徹底。但無水酒精中，組織塊放置時(shí)間不宜過長(zhǎng)，否則組織過硬，切片困難。遇到此情況，可將組織浸在香柏油中軟化，用二甲苯洗去香柏油后，再重新浸蠟和包埋。脫水酒精，尤其是無水酒精中混有水分，則組織脫水不干凈。經(jīng)二甲苯時(shí)，組織也無法透明，呈現(xiàn)渾濁。此時(shí)應(yīng)將組織在新的酒精中重新脫水。二甲苯透明也應(yīng)充分，否則不利于石蠟的浸透。但組織在二甲苯內(nèi)的時(shí)間應(yīng)嚴(yán)格掌握，時(shí)間過長(zhǎng)組織易碎，也無法切出好的切片。時(shí)間不足，則石蠟不易浸透。浸蠟的溫度也不宜過高，時(shí)間長(zhǎng)短也應(yīng)加以控制?？傊M織脫水、透明和浸蠟對(duì)于切片質(zhì)量都有一定影響，組織脫水、透明和浸蠟過度，組織塊變硬變脆，因此對(duì)于小塊組織或小動(dòng)物標(biāo)本應(yīng)注意時(shí)間。但若時(shí)間不夠，組織塊硬化不夠，也不利于切片和染色，因此，應(yīng)注意各具體環(huán)節(jié)的操作，并注意保證各種試劑的質(zhì)量。

（3）切片切片刀要求鋒利且無缺口，切片自行卷起多由切片刀不鋒利所致，切片刀有缺口時(shí)，易造成切片斷裂破碎和不完整。骨組織切片時(shí)，用重型刀較好。全鋼刀或單面鎢刀也適合石蠟或火棉膠包埋的骨組織。

（4）切片刀和切片機(jī)切片刀放置的傾角以20－30℃為好。傾角過大切片上卷，不能連在一起。過小則切片皺起。應(yīng)注意維護(hù)切片機(jī)，防止因螺絲松動(dòng)產(chǎn)生震動(dòng)，切片時(shí)會(huì)造成切片厚薄不均。遇硬化過度的肝、腦、脾等組織時(shí)，應(yīng)輕輕切削，防止由于震動(dòng)產(chǎn)生空洞現(xiàn)象。（5）特殊要求切片的制作 石蠟切片雖然有很多優(yōu)點(diǎn)，但制片過程中要經(jīng)過酒精和二甲苯等有機(jī)溶劑處理，因此很易造成組織內(nèi)抗原性的喪失，在用于免疫組織化學(xué)染色時(shí)影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。因而有人采用冷凍干燥包埋法，即將新鮮組織低溫速凍，利用冷凍干燥機(jī)在真空和低溫條件下除去組織內(nèi)的水分，然后用甲醛蒸汽固定干燥后的組織，而后在進(jìn)行浸蠟、包埋和切片。此法可保存組織內(nèi)的可溶性物質(zhì)，防止蛋白質(zhì)變性和酶的失活，減少抗原的丟失。用于免疫熒光標(biāo)記、免疫酶標(biāo)記和放射自顯影。

（二）冰凍切片法

冰凍切片在組織學(xué)技術(shù)中應(yīng)用廣泛，對(duì)臨床快速病理診斷尤其具有重要意義。另外，因冰凍切片制作時(shí)不經(jīng)各級(jí)酒精的脫水，二甲苯的透明等過程，因此對(duì)脂肪和類脂的保存較好，在進(jìn)行脂肪染色和神經(jīng)組織髓鞘的染色常用。冰凍切片多用于新鮮組織，甲醛固定的組織和低溫冰箱冷藏的組織塊等。組織不經(jīng)任何包埋劑而直接放在制冷臺(tái)上冷卻后進(jìn)行切片。

1．恒冷箱切片 將組織塊在恒冷箱的切片機(jī)上切片。恒冷箱切片機(jī)的種類較多，可根據(jù)實(shí)際情況加以選用。一般調(diào)節(jié)溫度為－25℃左右。箱內(nèi)溫度下降后，打開觀察窗，將組織固著器放置到速凍臺(tái)上，先放少量OCT或羧甲基纖維素，待凍結(jié)后將組織塊放上，并在其周圍加適量包埋劑，將組織塊包埋。組織凍結(jié)后，將組織固著器裝到切片機(jī)上，調(diào)整組織的切面與刀刃平行并貼近刀刃，將厚度調(diào)至適當(dāng)位置后，關(guān)閉觀察窗。初步修出組織切面后，放下抗卷板，開始切片。切出切片用載玻片貼附后，進(jìn)行吹干或固定。這種切片用于科研和教學(xué)的連續(xù)切片，效果較好。在切片前，應(yīng)預(yù)先啟動(dòng)進(jìn)行預(yù)冷，同時(shí)準(zhǔn)備多個(gè)冷卻臺(tái)，用于多塊組織切片。

2．半導(dǎo)體制冷冰凍切片法 組織塊放置在半導(dǎo)體制冷臺(tái)上，加少許蒸餾水，調(diào)好切片的厚度。接通循環(huán)流水后，再接通電源，而且在使用的全過程中流水不能中斷，關(guān)閉電路后，才能停水。還應(yīng)注意電源正負(fù)極不能接反，用整流電源控制溫度。冰凍組織周圍的水不宜過多，用手檢查組織塊的硬度，當(dāng)可切成厚薄一致的切片時(shí)，即可切片。切片用毛筆展平后，立即用載玻片貼附，待切片剛要融化時(shí)，即刻入固定液內(nèi)固定1min。已固定的組織切片，收集于清水中。根據(jù)目的進(jìn)行染色。暫時(shí)不染色的切片，用載玻片吸附。

3．甲醇制冷器 制冷箱為附有帶導(dǎo)管的制冷臺(tái)和制冷刀的甲醇循環(huán)裝置，其冷卻速度較快，屬開放式，做一般常規(guī)冰凍切片用。

4．二氧化碳冰凍法 將組織塊用蒸餾水洗后，放在冰凍切片機(jī)的冷凍臺(tái)上，加蒸餾水少許。打開冷凍臺(tái)的二氧化碳開關(guān)，二氧化碳?xì)怏w噴出，待組織出現(xiàn)冷霜時(shí)，關(guān)閉二氧化碳，即可切片。組織冷凍過硬易碎，若冷凍不夠，組織塊硬度不足，切片呈粥糜狀，無法成片，應(yīng)用間歇冷卻法繼續(xù)冷卻。硬度一般在剛開始解凍時(shí)最適合，應(yīng)迅速切片。

5．冰凍切片粘片法冰凍切片粘片法基本按石蠟切片的粘片處理，但烤片溫度不宜超過40℃?？靖珊罅⒓慈〕觯瑴囟冗^高，時(shí)間過長(zhǎng)，則切片易碎。烤干后用70%酒精和自來水略洗后即可染色。

九、蘇木精－伊紅染色方法

蘇木精-伊紅染色方法，簡(jiǎn)稱HE染色方法，是生物學(xué)和醫(yī)學(xué)的細(xì)胞與組織學(xué)最廣泛應(yīng)用的染色方法。在病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室中稱為常規(guī)染色方法。病理細(xì)胞和組織學(xué)的診斷，教學(xué)和研究都是用HE染色方法觀察正常和病變組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)。因此病理學(xué)工作者必需學(xué)習(xí)和掌握這種染色方法。

（一）HE染色的基本原理

1．細(xì)胞核染色的原理

細(xì)胞核內(nèi)的染色質(zhì)主要是去氧核糖核酸（DNA），DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)中，兩條鏈上的磷酸基向外，帶負(fù)電荷，呈酸性，很容易與帶正電荷的蘇木精鹼性染料以離子鍵或氫鍵結(jié)合而染色。蘇木精在堿性染料中呈藍(lán)色，所以細(xì)胞核被染成藍(lán)色。

2．細(xì)胞漿染色的原理

細(xì)胞漿內(nèi)主要成分是蛋白質(zhì)，在染液中加入醋酸使胞漿帶正電荷（陽離子），就可被帶負(fù)電荷（陰離子）的染料染色。伊紅Y是一種化學(xué)合成的酸性染料，在水中離解成帶負(fù)電荷的陰離子，與蛋白質(zhì)的氨基正電荷（陽離子）結(jié)合而使細(xì)胞漿染色，細(xì)胞漿、紅細(xì)胞、肌肉、結(jié)締組織、嗜伊紅顆粒等被染成不同程度的紅色或粉紅色，與藍(lán)色的細(xì)胞核形成鮮明的對(duì)比。伊紅是細(xì)胞漿的良好染料。

隨著科學(xué)技術(shù)快速發(fā)展和電子計(jì)算機(jī)的廣泛應(yīng)用，染色自動(dòng)儀器的出現(xiàn)，許多實(shí)驗(yàn)室已用全自動(dòng)染色機(jī)代替人工染色。

（二）人工操作蘇木精伊紅染色方法

1．染色步驟 二甲苯I脫蠟10min.二甲苯II脫蠟5min。

無水乙醇洗去二甲苯1min×2次。

95%酒精1min。

90%酒精1min。

85%酒精1min。自來水洗2min。

蘇木精染色1min至5min。自來水洗1min。

1%鹽酸酒精分化20s。自來水洗1min。

稀氨水（1%）反藍(lán)30s。自來水洗或蒸餾水洗1min。伊紅染色20s至5min。自來水洗30s。

85%酒精脫水20s。

90%酒精30s。

95%I酒精1min。

95%II酒精1min。無水乙醇I 2min。無水乙醇II 2min。二甲苯I 2min。二甲苯II 2min。二甲苯III 2min。

中性樹膠或加拿大樹膠封片。

2．染色結(jié)果

細(xì)胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞漿、肌肉、結(jié)締組織、紅細(xì)胞和嗜伊紅顆粒呈不同程度的紅色。鈣鹽和各種微生物也可染成藍(lán)色或紫藍(lán)色。

（三）自動(dòng)染色機(jī)蘇木精伊紅染色程序

1．二甲苯I 10min。

2．二甲苯II 10min。

3．無水乙醇1min。

4．無水乙醇1min。

5．95%酒精I(xiàn) 1min。

6．95%酒精I(xiàn)I 1min。

7．90%酒精I(xiàn) 1min。

8．80%酒精1min。

9．自來水洗1min。

10．蘇木精染色1至5min。

11．自來水洗1min。

12．1%鹽酸酒精分化30s。

13．自來水洗5min。

14．伊紅染色30s至5min。

15．自來水洗30s。

16．85%酒精20s。

17．90%酒精30s。

18．95%酒精1min。

19．95%酒精1min。

20．無水乙醇I 2min。

21．無水乙醇II 2min。

22．二甲苯I 2min。

23．二甲苯II 2min。

24．二甲苯III 2min。

25．中性樹膠或加拿大樹膠封片。

（四）冰凍切片蘇木精伊紅染色

1．恒冷箱冰凍切片，粘貼在載玻片上，用95%酒精95ml和冰醋酸5ml的混合固定液固定1min。自來水洗。

2．蘇木精染色1～2min。

3．自來水洗30s。

4．1%鹽酸酒精分化20s。

5．自來水洗20s。

6．稀氨水30s。

7．自來水洗20s。

8．伊紅染色20s～1min。

9．自來水洗10s。

10．85%酒精20s。

11．90%酒精30s。

12．95%酒精1min。

13．無水乙醇I 1min。

14．無水乙醇II 2min。

15．二甲苯I 1min。

16．二甲苯II 2min。

17．二甲苯III 2min。

18．中性樹膠或加拿大樹膠封片。

（五）染色液的配制

1．蘇木精（素）

蘇木精是一種純天然染料，是從蘇木素樹提煉出來的，蘇木樹主產(chǎn)墨西哥的坎偑切，蘇木精的染色性能差，經(jīng)過一百多年精心加工配制，現(xiàn)用的蘇木精配方，染色性能好，保持時(shí)間長(zhǎng)，是世界上唯一的常規(guī)細(xì)胞核染料，2．蘇木精的配制

蘇木精的配方很多，可根據(jù)不同需要選用，Harris配方最常用。（1）Harris蘇木精的配制 蘇木精1g 硫酸鋁鉀15g 無水乙醇10ml 蒸餾水200ml

先用蒸餾水加熱溶解硫酸鋁鉀，用無水乙醇溶解蘇木精再倒入已溶解的硫酸鋁鉀蒸餾水中，煮沸1min后，稍冷卻，慢慢加入紅色氧化汞0.5g，繼續(xù)加熱至染液變?yōu)樽霞t色，用紗布蓋瓶口，用前濾紙過濾后每100ml加冰醋酸5ml。（2）Mayer蘇木精改良配法

A液 蘇木精2g

無水乙醇40ml

B液

硫酸鋁鉀100g 蒸餾水600ml

稍加熱使硫酸鋁鉀在水中溶解，將蘇木精溶于酒精中，再將A液與B液混合煮沸2min。用蒸餾水補(bǔ)足600ml，加入400mg碘酸鈉充分混勻，蘇木精染液呈紫紅色。（3）Gill改良蘇木精染液的配制 蘇木精2g

無水乙醇250ml 硫酸鋁鉀17g 蒸餾水750ml 碘酸鈉0.2g 冰醋酸20ml

先將蘇木精溶于無水乙醇，再將硫酸鋁鉀溶于蒸餾水中。兩液溶解后將其混合，加入碘酸鈉待蘇木精氧化成紫紅色，再加入冰醋酸。

3．伊紅溶液的配制（1）水溶性伊紅 伊紅Y0.5－1g 蒸餾水100ml

先將水溶性伊紅加入蒸餾水中，用玻璃棒將伊紅攪起泡沫后過濾，每100ml加冰醋酸1滴。（2）乙醇性伊紅液的配制 伊紅Y 0.5～1g

90%酒精100ml

先將伊紅溶于酒精中，用玻璃棒研碎溶解后，每100ml加冰醋酸1滴。用乙醇性伊紅液染細(xì)胞漿后不可經(jīng)水洗直接用85%酒精脫水。

4．鹽酸酒精分化液的配制 濃鹽酸0.5～1ml

75%酒精99ml

此液用一段時(shí)間后需要延長(zhǎng)或更換液體，新液分化時(shí)間要短。

5．染色中注意事項(xiàng)（1）脫蠟 石蠟切片必需經(jīng)過脫蠟后才能染色，脫蠟前切片要經(jīng)烘烤，這樣使組織與玻璃片粘貼牢固。組織切片脫蠟應(yīng)徹底，脫蠟好壞主要取決于二甲苯的溫度和時(shí)間，所有的時(shí)間都是指新的二甲苯在室溫25℃以下時(shí)，如果二甲苯是用過一段時(shí)間，切片又比較厚，室溫低應(yīng)增加脫蠟時(shí)間，脫蠟不凈是影響染色不良的重要原因之一。（2）染色

石蠟切片經(jīng)水洗后放入Harris蘇木精染色，一般情況下在新配的蘇木精溶液中只需要染1min左右，應(yīng)根據(jù)染片的多少，逐步把染色時(shí)間延長(zhǎng)。蘇木精染色后，不宜在水中和鹽酸酒精停留過長(zhǎng)，切片分化程度應(yīng)在鏡下觀察，分化過度，應(yīng)水洗后重新在蘇木精中染色，再水洗分化和使切片在自來水或稀氨水中充分變藍(lán)。

新配的伊紅染色快，切片染色不宜過長(zhǎng)，應(yīng)根據(jù)染切片的多少逐步延長(zhǎng)染色時(shí)間，切片經(jīng)伊紅染后，水洗時(shí)間要短。（3）脫水

切片經(jīng)過染色后，通過各級(jí)酒精脫水，首先從低濃度到高濃度，低濃度酒精對(duì)伊紅有分化作用，切片經(jīng)過低濃度時(shí)間要短，向高濃度時(shí)逐步延長(zhǎng)脫水時(shí)間；脫水不徹底，使切片發(fā)霧，在顯微鏡下組織結(jié)構(gòu)模糊不清。（4）透明與封片

石蠟組織切片染色經(jīng)過脫水后必須經(jīng)二甲苯處理，使切片透明，才能用樹膠封片。常用切片封片膠有國(guó)產(chǎn)的中性樹膠，光學(xué)樹膠，加拿大樹膠和合成樹脂（DPX）。在封片時(shí)，樹膠不能太稀或太稠，不能滴加的太多或太少，太稀或太少切片容易空泡，樹膠也不可太多，不要使樹膠溢出玻片四周太多。標(biāo)簽要附貼牢固。封片中不能對(duì)著切片呼氣。（5）常規(guī)石蠟切片和HE染色標(biāo)本的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（全國(guó)統(tǒng)一評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)）①切片完整，厚度4－6um，薄厚均勻，無褶無刀痕。②染色核漿分明，紅藍(lán)適度，透明潔凈，封裱美觀。

第三篇：組織切片技術(shù)

南京農(nóng)大康海泓整理，Email:snai1621@126.com 組織切片技術(shù)注意事項(xiàng)

程序步驟

1、取材

2、固定（固定24h—1W）

3、包埋

石蠟切片：流水沖洗組織塊>>75%酒精1h>>85%酒精1h>>95%酒精1h>>100%酒精（1）1h>>100酒精（2）1h>>二甲苯8-20min>>石蠟2h>>包埋

冰凍切片：固定后的組織>>OCT包埋>>切片或-20度保存；

液氮中的組織>>轉(zhuǎn)入-20度>>OCT包埋>>切片或保存

4、切片

切片>>展片（40~50度）>>貼片>>干燥（37度過夜或者50~60度2h）

5、HE染色

干燥后的切片>>二甲苯（1）10min>>二甲苯（2）10min>>100%酒精(1)1min>>100%酒精(2)1min>>95%酒精1min>>85%酒精1min>>75%酒精1min>>蒸餾水3min>>蘇木精染色30s—5min>>自來水涮洗>>蒸餾水>>75%酒精1min>>85%酒精1min>>伊紅染色>>85%酒精涮洗>>95%酒精1min>>100%酒精(1)1min>>100%酒精（2）1min>>二甲苯（1）10min>>二甲苯（2）10min>>中性樹膠封片

6、免疫組化（ABC法）

（1）干燥后的石蠟或冰凍切片（冰凍切片需要緩慢復(fù)溫）脫蠟至水；

（2）雙氧水（1%濃度左右）封閉內(nèi)源性過氧化物酶；

（3）PBS洗滌3×5min；

（4）5%BSA封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)，不洗；

（5）滴加適當(dāng)稀釋度的一抗；4度孵育過夜或37度2h；（6）同上洗滌；滴加二抗，37度1h；

（7）同上洗滌；滴加ABC復(fù)合物，37度1h；（8）洗滌5遍，每次5min；

（9）配制顯色液（DAB顯色試劑盒），顯微鏡下觀察顯色；（10）切片浸泡于蒸餾水中終止顯色；（11）蘇木精復(fù)染，脫水，封片。

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注意事項(xiàng)

取材

1.組織越新鮮越好，最好于動(dòng)物處死后10~20min完成取材，時(shí)間過久后組織自溶和腐敗會(huì)影響組織形態(tài)。

2.取材組織塊不宜過大，一般為5nm以下，2~3nm為宜。如果試驗(yàn)要求采取大塊組織，最好采樣前注射固定液預(yù)固定或采取灌流固定（比如取腦時(shí)需灌流固定）。

3.取材使動(dòng)作輕柔，避免用力夾、捏和拉扯組織，盡可能保持組織原有形態(tài)。操作時(shí)可用鑷子夾取組織的一個(gè)邊角，避免主要組織損傷。

4.如果是大批量取材，取材時(shí)沒有時(shí)間對(duì)組織塊大小進(jìn)行修正，可將組織（可稍大，但不宜過大）先放在固定液中固定，2~4h后進(jìn)行修塊，即用鋒利的刀片（刮胡刀片）把組織切至適宜大小。注意不能用剪刀等進(jìn)行鈍性分離。5.如果對(duì)不同處理或不同動(dòng)物的組織進(jìn)行比較研究，應(yīng)對(duì)所有動(dòng)物在同一解剖學(xué)位置取材（比如十二指腸距胃3cm處，或空腸距胃10cm處）。

6.取材時(shí)注意組織的不同斷面，可將組織的一面用刀片切平作為標(biāo)示，以便包埋和切片時(shí)選取的斷面正確（比如肌肉組織，應(yīng)區(qū)分好橫斷面和縱斷面）。7.一般情況下宰殺動(dòng)物應(yīng)放血干凈，取材時(shí)除去組織周圍的附屬物，比如筋膜、脂肪等。

8.取得的組織立即固定。冰凍切片組織可先固定后凍存，也可直接凍存，直接凍存一般采取液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)入-20度保存，凍存組織應(yīng)避免反復(fù)凍融，且盡快進(jìn)行切片或用OCT包埋（包埋后可放置較長(zhǎng)時(shí)間）。未包埋的組織在-20度長(zhǎng)期保存的組織會(huì)逐漸脫水（比如肌肉），影響形態(tài)學(xué)觀察。

9.理論上免疫組化的組織采取冰凍切片，一般運(yùn)用4%多聚甲醛固定24~48h后用OCT包埋凍存。但對(duì)于抗原表達(dá)量大且較易檢測(cè)的免疫組化，可以采取石蠟切片，但固定時(shí)間不能過長(zhǎng)，控制在1周以內(nèi)，長(zhǎng)時(shí)間固定會(huì)引起抗原表位的醛基化和抗原表位構(gòu)象變化，導(dǎo)致免疫組化檢測(cè)靈敏度降低。

固定與包埋

1.選擇合適的固定液，原則是在良好固定組織并保持形態(tài)的前提下盡可能的減小對(duì)組織的影響。常用固定液為福爾馬林、4%多聚甲醛和Bouin氏液，其中后兩者最為常用，效果也較好。

南京農(nóng)大康海泓整理，Email:snai1621@126.com 2.固定液需新鮮配制，新配的固定液固定效果較好。3.固定液體積理論上應(yīng)為組織體積的20倍以上。

4.一般組織理論固定時(shí)間為4~24h，即以固定液完全滲透進(jìn)入組織的最短時(shí)間為宜，實(shí)際操作中可延長(zhǎng)至數(shù)天，但一般控制在1周以內(nèi)。

5.如果是冰凍切片，固定后的組織最好及時(shí)用OCT包埋，能更好的維持組織形態(tài)，包埋后的組織可于-20度保存數(shù)月。固定后的組織可用蔗糖溶液脫水，方法為直接將組織置于30%蔗糖溶液中，每天換新鮮蔗糖溶液，2-3天組織在蔗糖中沉底即可。一般來說，先固定，然后脫水，再用OCT包埋效果比較理想。6.冰凍切片可以采取后固定的方法。即采得的組織經(jīng)液氮速凍后直接放入-20度保存，OCT包埋，冰凍切片后用丙酮等對(duì)切片上的組織進(jìn)行固定。但丙酮固定較為強(qiáng)烈，容易發(fā)生掉片。

7.石蠟切片時(shí)，固定后的組織包埋前一般對(duì)組織進(jìn)行洗滌，通常用自來水沖洗，洗掉組織中的固定液，因?yàn)闅埩粼诮M織中的固定液可能對(duì)染色產(chǎn)生影響。洗滌為可選步驟，我們實(shí)驗(yàn)室通常不洗滌，將固定后的組織直接包埋，并不影響HE染色效果。

8.二甲苯透明時(shí)間是影響包埋效果的最關(guān)鍵因素，需根據(jù)組織種類、組織大小、室溫以及二甲苯的新舊程度綜合考量，必要的時(shí)候需要設(shè)置時(shí)間梯度進(jìn)行摸索。此外，組織是否脫水完全、是否浸蠟完全也直接影響包埋效果，原則上在能夠完全脫水和浸蠟的前提下，組織在各溶劑中的浸泡時(shí)間越短越好。

切片

1.切片成功與否很大程度上取決于組織固定和包埋的好壞。

2.切片厚度：HE等組織學(xué)染色一般4~5微米（4微米差不多是石蠟切片的極限），如果切片困難，可適當(dāng)增加切片厚度（20微米以內(nèi)越厚越好切），但切片厚度的增加會(huì)使得細(xì)胞層數(shù)增多，影響觀察和美觀。免疫組化中石蠟切片一般切片5~10微米，冰凍切片大約8~14微米，特別是在檢測(cè)表達(dá)量較少的抗原時(shí)，較厚的切片可以增加陽性物質(zhì)的出現(xiàn)概率。

3.較好的石蠟切片呈均勻連續(xù)狀，沒有空洞和破損，組織完整不碎裂。4.切片角度和刀片新舊程度對(duì)切片效果的影響較大，切片角度視切片機(jī)型號(hào)而異；新刀片容易切出完好的切片。刀片應(yīng)從一段開始使用，發(fā)現(xiàn)刀痕時(shí)逐漸移動(dòng)，以最大限度使用刀片。

5.冰凍切片的主要影響因素有：切片機(jī)箱體溫度（一般為-25度左右），防卷器位置（太往前切不動(dòng)，太往后起不到防卷效果）。

6.對(duì)免疫組化切片而言，需對(duì)玻片進(jìn)行包被（一般為使其帶正電荷，組織帶負(fù)

南京農(nóng)大康海泓整理，Email:snai1621@126.com 電荷，通過靜電吸附增加粘附力），增加其粘附性。包被太淺起不到粘附效果，包被太深會(huì)導(dǎo)致免疫組化非特異性染色。

展片和貼片（撈片）：

1.燒杯中裝蒸餾水，置于水浴鍋中，溫度一般40~45度，溫度太低片子展不開，溫度太高石蠟會(huì)融化。

2.冰凍切片不需要展片，直接將玻片輕靠在組織上，組織便會(huì)自動(dòng)吸附到玻片上。

3.撈片時(shí)選取完全展平的片子撈起，寧缺毋濫。一張玻片上可以貼多個(gè)組織，最后選染色效果好的封片，增加成功率。

4.未包被過的玻片可重復(fù)使用，包被過的玻片貼片后組織很難掉下，不可重復(fù)使用。

干燥：

1.干燥可以讓組織貼的更結(jié)實(shí)。石蠟切片37度干燥過夜，或者45~60度干燥數(shù)小時(shí)。冰凍切片室溫晾干（夏天一般5~10min），但不可涼太干，太干也容易掉片，判定標(biāo)準(zhǔn)為組織表面沒有明顯的液體為宜，如果組織變白說明干燥時(shí)間過長(zhǎng)。

2.干燥后的石蠟切片可放切片盒中室溫保存，如果天氣炎熱可以放置4度保存；冰凍切片于切片盒中密封后置-20度保存，短期內(nèi)試驗(yàn)可以放4度保存。

染色（以HE染色為例）：

1.液體置換要徹底，特別是脫蠟和脫水步驟。

2.伊紅一般用醇溶性配方，蘇木精配方有很多種，如果用氧化汞方法配制使用前要過濾，因?yàn)橐后w表面容易聚集一層金屬離子薄膜，對(duì)染色產(chǎn)生影響。3.新鮮配制的伊紅染色時(shí)間1秒即可，存放時(shí)間長(zhǎng)的染液可以適當(dāng)增加染色時(shí)間。

4.封片時(shí)中性樹膠的量要適度。根據(jù)組織的大小選擇大小合適的蓋玻片，蓋玻片以能覆蓋住組織為前提，越小越好，太大的蓋玻片溶液不平整，顯微鏡觀察時(shí)組織可能不在一個(gè)平面，需要反復(fù)調(diào)整焦距。

5.蘇木精和伊紅染色時(shí)，最好摸索染色時(shí)間，以尋求最合適和漂亮的顏色搭配，不同的組織染色能力有所差異，比如淋巴組織內(nèi)淋巴細(xì)胞較多，細(xì)胞核比較大，染出來可能藍(lán)色居多，肌肉組織中肌顯微和細(xì)胞質(zhì)比例高，染出來紅色

南京農(nóng)大康海泓整理，Email:snai1621@126.com 居多。

6.總體原則是染色寧愿偏淺不要偏深，偏深的染色難以判別細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)。

免疫組化注意事項(xiàng)：

1.免疫組化一般以冰凍切片為主，但石蠟切片也可以做免疫組化。

2.冰凍切片一般采取先固定（4%多聚甲醛），然后用OCT包埋（冰凍包埋）。3.免疫組化步驟繁瑣，時(shí)間較長(zhǎng)，因此用包被過的切片來防止掉片。常用的包埋劑有APES，多聚賴氨酸和明膠等。包被過程相對(duì)簡(jiǎn)單，可購(gòu)公司的商品包被試劑盒，按照說明書操作。

4.石蠟切片的免疫組化有時(shí)需要抗原修復(fù)。原因：固定液會(huì)對(duì)組織的抗原性產(chǎn)生影響，示抗原表位發(fā)生構(gòu)象變化，可以通過化學(xué)處理和熱處理來還原組織的抗原性。常用的修復(fù)液為枸櫞酸鈉緩沖液，一般采取熱修復(fù)，即把切片放置在緩沖液中然后加熱至沸騰。

5.免疫組化切片厚度一般為8~12微米。6.選擇合適的抗體（單抗、多抗）。

7.預(yù)實(shí)驗(yàn)確定合適的H2O2、封閉液和抗體作用濃度和時(shí)間。8.選用包被過的玻片，動(dòng)作輕柔，防止掉片。9.設(shè)置陽性、陰性和空白對(duì)照。

10.顯微鏡下控制顯色，放置顯色過淺或過深。

11.復(fù)染時(shí)蘇木精濃度可稀釋，時(shí)間縮短，避免染色過深。

12.遇到問題逐項(xiàng)排除，尋找原因。詳細(xì)的問題解決和相關(guān)技術(shù)貼可參照丁香園論壇或生物秀論壇，搜素“免疫組化”可以找到相關(guān)資料。

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溶液配制

固定液

4%多聚甲醛：4g多聚甲醛粉末加入100ml 0.1M PBS，邊加入邊加熱攪拌，滴加0.2M NaOH溶液并60度水浴促進(jìn)粉末溶解，完全溶解后HCl調(diào)PH至7.4，4度保存。

Bouin氏液：75ml 飽和苦味酸溶液，25ml多聚甲醛，5ml冰醋酸；使用前三者混在一起，混勻。

染液

伊紅染液：1%醇溶性伊紅配方為1g伊紅加入到100ml 80%酒精中，溶解。

蘇木精染液：

1.哈里新（Harris）蘇木紫液：甲液：蘇木紫Ig，無水乙醇10ml。乙液：硫酸鋁鉀（或銨）20g，蒸餾水200ml，加溫溶解。甲、乙二液分別溶解后混合，加熱煮佛，沸后去火，待溶液不翻騰時(shí)即加入氧化汞0.5g（此時(shí)有大量氣泡生成，故容器宜大，以免液體溢出）。然后染液迅速冷卻，冷卻后過濾，即可位應(yīng)用。用時(shí)每100ml加冰醋酸4ml；

2.邁爾（Mayer）蘇木紫液：將蘇木柴0.1g放入蒸餾水100ml中煮沸溶解，再加入硫酸鋁鉀5g，和碘酸鈉0.02g，攪動(dòng)直到全部溶解，加入水合氯醛5g和枸椽酸0.1g，加煮沸5min，冷卻、過濾，放置過夜，即可應(yīng)用。染色時(shí)間約10~20min；

3.歐立區(qū)（Ehrlich）蘇木紫：將蘇木紫2g溶于無水乙醇100ml中；將硫酸鋁鉀15g溶于蒸餾水100ml中，加入甘油100ml，將二液混合，最后加入冰醋酸10ml，充分混勻后，盛于無色小口瓶?jī)?nèi)，暴露于日光下，使其自然成熟，約需3個(gè)月。染色時(shí)間約5~20min。此液貯存愈久，染色力愈強(qiáng)。若在其中加入碘酸鈉300mg，使人工成熟，配成后即可應(yīng)用；

4.卡拉茲（Carrazzi）蘇木紫：將蘇木紫0.5g溶解于甘油100ml中，將硫酸鋁鉀25g溶解于蒸餾水350ml中溶解后將二液慢慢混合，并充分搖勻。將碘化鉀0.1g放于蒸餾水50ml中，加微溫溶解，然后加入蘇木紫液中，充分搖勻，翌日可用。

南京農(nóng)大康海泓整理，Email:snai1621@126.com

免疫組化

0.3%~1%雙氧水：

商品化30%雙氧水溶甲醇稀釋到適當(dāng)濃度。

1~5%BSA（羊血清、脫脂乳）： 0.01M PBS配制。

Triton-PBS：

100微升Triton-100加入到100ml 0.01PBS中，混勻。

第四篇：組織切片必看

1.組織的取材

取材時(shí)要注意及時(shí)快速固定，避免剪刀鑷子損傷組織，組織要取全。全盤考慮進(jìn)行病理切片的組織類型，病變可能累及的部位，組織包埋需要的剖面。2.組織的固定

在組織病理學(xué)中，不管是組織切片乃至電鏡還是大體標(biāo)本的保存，都必須進(jìn)行及時(shí)的適當(dāng)?shù)暮陀行У墓潭?。組織只有經(jīng)過固定，才能完成隨后的一系列的制作，直至切片的最后完成。

固定的作用：從組織學(xué)的角度其簡(jiǎn)單的定義是，保持細(xì)胞、組織的固有形態(tài)和結(jié)構(gòu)，使之盡量保持細(xì)胞、組織的固有形態(tài)和結(jié)構(gòu)，而從免疫組化技術(shù)的角度，固定的作用不僅是使細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)凝固，盡量減少或終止外源性酶和內(nèi)源性酶的反應(yīng)；防止細(xì)胞的自溶，以免使抗原擴(kuò)散至組織間質(zhì)；以保持組織的固有形態(tài)和結(jié)構(gòu)；更重要的是保持組織或細(xì)胞的抗原性，不但要使抗原不導(dǎo)致失活，而且不使抗原發(fā)生彌散的現(xiàn)象，才能在免疫組化染色時(shí)，不產(chǎn)生過深的背景，影響對(duì)陽性物的判斷。

固定的目的

①能防止細(xì)菌的腐蝕和組織的自溶。細(xì)菌無處不存在，它們隨時(shí)都可污染腐蝕未經(jīng)處理的組織。固定液可以固定任何蛋白質(zhì)，凡有生命的東西，都由蛋白質(zhì)組成，蛋白質(zhì)被固定，生命就停止，細(xì)菌也就失去了活力。另者，在日常生活中，人們?？膳龅竭@樣的問題，一塊肉不經(jīng)處理放了幾天后就會(huì)變質(zhì)，這是為什么呢？除了細(xì)菌參與外，其本身也是很重要的。因?yàn)榻M織離體后，供應(yīng)這此組織的血液隨之消失，細(xì)胞缺氧，細(xì)胞內(nèi)溶酶體膜的結(jié)構(gòu)受到破壞，破壞后釋放出溶酶體酶，日常生活中常碰到的肉變質(zhì)，就是細(xì)菌污染加組織自溶的結(jié)果。

②保存細(xì)胞固有的物質(zhì)，能凝固或沉淀細(xì)胞內(nèi)或組織液，糖元等，使細(xì)胞或組織基本上保持與生活時(shí)的物質(zhì)一樣。細(xì)胞的固有物質(zhì)，即細(xì)胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、高爾基器、溶酶體、過氧體，細(xì)胞骨架，組織液，抗原、糖元等。這些物質(zhì)，如果不將其及時(shí)固定，是很容易喪失的，尤其是溶酶體，很容易受到破壞，因此應(yīng)特別小心。

③使組織硬化，便于切塊。剛離體的組織，除了胃組織以外，都是柔軟的組織，尤其是胃腸道的組織，如果在沒有固定時(shí)就取材，效果就很差，不是取材不規(guī)整，就是厚薄不均，粘膜和肌層很容易分開，因此，要取得規(guī)整標(biāo)致的材料，就必須將組織徹底固定，再行取材。

④對(duì)某些具有傳染性的標(biāo)本，能防止疾病的擴(kuò)散。病理標(biāo)本、種類繁多，成份復(fù)雜，各種病例都有，具有傳染性的病種也不少，如結(jié)核、肝炎、麻風(fēng)、性病等等。對(duì)于此類標(biāo)本，應(yīng)進(jìn)行徹底的固定后，再行取材，如結(jié)核球，固定時(shí)間應(yīng)在3-5天。

⑤可增強(qiáng)染色的作用。組織經(jīng)過及時(shí)的固定，最終可見到切片有鮮艷的染色，而些時(shí)如果有一批未經(jīng)及時(shí)固定的組織，將看到最終的結(jié)果是，核染色不清楚，灰淡色，由此可得結(jié)論，固定可以增強(qiáng)染色的作用。

固定的注意事項(xiàng)：

①組織固定越新鮮越好。組織一經(jīng)離體，就能及時(shí)地固定，這是最好的。根據(jù)實(shí)驗(yàn)，如果要獲得某些酶的染色，固定最好在組織離體后30秒至1分鐘。對(duì)于其它達(dá)不到些要求是越快越好。原則上動(dòng)物死亡后半個(gè)小時(shí)內(nèi)取完并及時(shí)固定組織。

②組織固定，組織塊不宜過大。凡是需要固定的組織，都不應(yīng)該太大太厚，這是因?yàn)樗械墓潭ㄒ捍┩噶Σ粔驈?qiáng)，浸透度不夠快的緣故。如果較大厚的組織，不經(jīng)處理就進(jìn)行固定，那么待固定液進(jìn)入至中間對(duì)可能這些組織早就發(fā)生自溶了。因此，對(duì)于較大的組織，必須先進(jìn)行處理，切成制片材料再行固定，這是最佳的處理方法，如遇到胃腸的器官，則應(yīng)將其剪開，放平后，再行固定，若非特急病例，最好在固定后才取材，因這類組織、粘膜和肌層容易分開，沒固定時(shí)，難以取得最佳制片材料，對(duì)于產(chǎn)酶類的器官如肝、腎、脾等，更要處理好，否則更容易出現(xiàn)自溶現(xiàn)象。

③對(duì)不同類型的組織應(yīng)適當(dāng)合理地選擇固定液。固定劑的種類繁多，成份復(fù)雜，對(duì)組織的作用不盡相同。在我們的日常工作科研中，對(duì)于組織的固定，應(yīng)有針對(duì)性的選擇，方能獲得滿意的效果。對(duì)于腎，睪丸等泌尿系統(tǒng)和新生仔鼠應(yīng)選擇Bouin氏固定液。免疫組化可以選擇多聚甲醛和中性緩沖甲醛；我病理室一般選擇中性緩沖甲醛，它可以兼顧常規(guī)染色和免疫組織化學(xué)。

④組織固定，時(shí)間不宜太短，也不宜太長(zhǎng)。固定時(shí)間應(yīng)根據(jù)取材大小、性質(zhì)以及類型有關(guān)，視具體情況而定；時(shí)間太短，就不能很多的固定組織，因?yàn)椴还芙M織大小，固定液浸入組織之中，都需要有一定的時(shí)間，時(shí)間太短，就會(huì)影響組織固定的效果，對(duì)以后一系列關(guān)系的處理都有影響，切片質(zhì)量難以保證，固定時(shí)間太長(zhǎng)，也不好。組織長(zhǎng)時(shí)間的固定，福爾馬林會(huì)產(chǎn)生一種酸，影響核的染色。對(duì)于固定很長(zhǎng)時(shí)間的陳列性標(biāo)本制片后切片染色不鮮艷，顯得非常陳舊。另外，長(zhǎng)時(shí)間的固定往往會(huì)出現(xiàn)福爾馬林色素，尤其是造血器官的標(biāo)本，更應(yīng)注意。固定時(shí)間過長(zhǎng)，可降低抗原的活性。一般小鼠組織固定24h即可。

⑤固定液的量要充分。固定液量的足夠與否決定著組織固定的成敗。一般固定液和組織體積比為10：1~20：1之間。

⑥特殊病例或特殊物質(zhì)應(yīng)選擇特殊的固定液。一般的病例標(biāo)本，如沒特殊的要求，都可以應(yīng)用甲醛配成的各種固定液來固定。但是，如果要顯示狂犬病毒的包含體時(shí)，應(yīng)用上述的的固定液就不行了，必須采用丙酮來固定，顯示糖元，可選擇無水酒精或丙酮來固定組織。

3.常規(guī)石蠟切片制片過程

組織經(jīng)系列酒精的脫水，經(jīng)透明劑的作用，經(jīng)熔化的石蠟的浸漬，包埋后所切成的切片稱為石蠟切片。制片過程的每一步每一環(huán)節(jié)處理不好都會(huì)影響切片質(zhì)量。

組織脫水：

把含于組織內(nèi)或細(xì)胞內(nèi)的水份用脫水劑把其置換出來的過程稱組織脫水。不管是正常的組織，還是有病變的組織，都含有不同程度量的水分。據(jù)測(cè)定，人體的物質(zhì)組成約含水55~67%，蛋白質(zhì)15~18%，脂類10~15%，無機(jī)鹽3~4%及糖類1~2%[14]。如果不把這些水分脫去，石蠟切片將無法進(jìn)行，因?yàn)槭灪退荒芑旌显谝黄?，所以除去組織中的水分成為制片中的關(guān)鍵，至今為止，國(guó)內(nèi)常用的都是酒精。因它不管在什么樣比例的情況下都能和水混合，所以它可以慢慢地將水從組織中置換出來。酒精脫水力強(qiáng)，對(duì)組織又有硬化和易脆的不良影響。在使用時(shí)，通常是從低濃度至高濃度，濃度系列通常是70%、80%、90%、95%和100%，組織經(jīng)過這一系列處理后，基本可達(dá)到脫水的目的。

每一步的組織脫水都需要控制好脫水時(shí)間，一般根據(jù)組織塊大小和組織類型而定。短了脫水不干凈，長(zhǎng)了會(huì)使組織切片時(shí)易脆。組織的透明：

組織脫水后，要經(jīng)過一個(gè)浸蠟前的中間溶劑透明過程；才能進(jìn)行浸蠟。透明的目的：組織經(jīng)脫水后、浸蠟前必須經(jīng)過某些既能與脫水劑相混合又能溶解石蠟的中間溶劑處理。組織在中間溶劑時(shí)，組織間隙內(nèi)存留的脫水劑完全為中間溶劑所取代時(shí)，組織就呈現(xiàn)透明狀態(tài)，此時(shí)即可進(jìn)行浸蠟。透明液多采用二甲苯，組織經(jīng)無水乙醇脫水后轉(zhuǎn)入二甲苯透明，組織的大小、厚薄不同，透明時(shí)間也不同。透明時(shí)間短了，透明不完全，導(dǎo)致切不了片，透明時(shí)間長(zhǎng)了，透明過度，導(dǎo)致切片易粉易碎。組織浸蠟：

用于浸蠟的石蠟最好是熔點(diǎn)稍低（56～58℃），低溫浸蠟對(duì)保存組織細(xì)胞內(nèi)的抗原免疫活性，避免組織收縮和變硬變脆有幫助，以盡量清除二甲苯蠟滲透到組織中起支撐作用，切片時(shí)才能把完整的組織和蠟一起完整切下來。不同大小和厚薄的組織浸蠟時(shí)間有所不同，一般為1～3小時(shí)。浸蠟溫度過高，浸蠟時(shí)間過長(zhǎng)或不夠均可導(dǎo)致組織收縮，變硬變脆，難以切出理想切片。組織包埋：

組織經(jīng)浸蠟后即可進(jìn)行包埋。包埋時(shí)，包埋石蠟的溫度要比組織高（約3~5℃），否則包埋冷凝后組織與包埋石蠟分離，特別是在冷天包埋時(shí)，動(dòng)作更要迅速，否則容易導(dǎo)致組織與石蠟融合不好，影響切片。包埋時(shí)把組織最大最平切面或所需的病灶切面向下，對(duì)皮膚、腸管和囊壁等層次清楚的組織其切面應(yīng)包含有各層組織。組織包埋要選擇所需要的組織切面。組織切片：

組織切片厚薄要適宜，薄的切片細(xì)胞不會(huì)重疊，易于觀察。切片的厚度應(yīng)為3～4μ，組織蠟塊過硬，切片刀或蠟塊沒固定好，會(huì)出現(xiàn)跳刀、切片成一截厚一截薄的現(xiàn)象。優(yōu)質(zhì)的組織切片要求切片較薄，平整，無刀痕，皺褶。切片太厚或呈波浪狀厚薄不勻。貼片烤片：

烤片時(shí)間短，會(huì)造成染色時(shí)切片從載玻片上脫落或脫蠟不凈，染的切片會(huì)著色淺、不上色或灰染；烤片時(shí)間長(zhǎng)，會(huì)造成對(duì)組織的損傷。染色：

染色染色的程度包括脫蠟、浸水、染色、分化、促藍(lán)、脫水、透明等過程。切片經(jīng)過脫蠟至水，HE染色后，要徹底脫水透明，才能用中性樹膠封蓋。如果脫水不徹底，封片后呈白色霧狀，鏡下觀察模糊不清，且容易褪色。要求組織結(jié)構(gòu)清晰，色彩鮮艷，細(xì)胞核/細(xì)胞質(zhì)對(duì)比分明。

組織病理切片質(zhì)量的影響因素

2009-08-19 編輯： 【打印】 【關(guān)閉】

第五篇：組織切片課程設(shè)計(jì)

生物制片技術(shù)課程論文—

—鯉魚脾臟組織結(jié)構(gòu)

摘要：組織切片方法是教學(xué)、科研、病理檢驗(yàn)工作中廣泛應(yīng)用的一種實(shí)驗(yàn)技術(shù),所謂組織切片，即取動(dòng)物某一實(shí)體器官上的組織塊用包埋劑包埋，然后進(jìn)行切片及染色的制片過程。在整個(gè)制片過程中，包括有取材與固定，脫水與透明，浸蠟與包埋，切片與粘片，染色與封固五大步驟。石蠟切片是組織切片方法中最為簡(jiǎn)單和常用的切片方法，本實(shí)驗(yàn)選擇石蠟切片法制作鯉魚肝臟組織切片。制作時(shí)需對(duì)每一步都必須認(rèn)真對(duì)待，否則將達(dá)不到預(yù)期效果，甚至導(dǎo)致制片工作的徹底失敗。本文就傳統(tǒng)的石蠟組織切片方法進(jìn)行了全面地改進(jìn)試驗(yàn)研究，使組織固定完全，脫水徹底，透明適度，浸蠟充分，切片較薄，染色良好；不僅縮短時(shí)間，簡(jiǎn)化程序，節(jié)省藥液，而且提高了組織切片的質(zhì)量。

關(guān)鍵詞：動(dòng)物組織；HE染色；石蠟切片

Production and observation of the spleen tissue of fish Abstract: Tissue slice method is a kind of experimental technology.which widely used in teaching, scientific research and pathological examination.So called tissue slices, that is, the body of a solid organ on the tissue piece with paraffin embedded, and then slice and dyeing of the production process.In the entire production process, including the material and the fixation, dehydration and the transparency, the immersion wax and the embedding, the slicing and the sticky piece, the dye and the seal five big steps.Production, every step must be taken seriously, otherwise it will not achieve the desired results, and even lead to the failure of the production work.In this paper, the traditional method of tissue slicing has been comprehensively improved, which makes the tissue fixed, dehydrated, transparent and appropriate, the dip wax is sufficient, the slice is thin, and the dyeing is good.Key words: animal tissue;HE staining;Paraffin slice

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

1,、通過對(duì)鯉魚的結(jié)構(gòu)觀察，了解魚類的主要特征以及魚類適應(yīng)于水生生活的形態(tài)特征。

2、了解生物制片主要方法；

3、掌握石蠟切片和H·E染色技術(shù)?；驹O(shè)備及常用試劑

二、基本設(shè)備

1、顯微鏡：光學(xué)顯微鏡

2、切片機(jī)：輪轉(zhuǎn)式、滑動(dòng)式（平推式）、冰凍式、振動(dòng)式。均有三組部件安裝在牢固穩(wěn)定的切片機(jī)身上：①刀架。②組織塊夾具。③微動(dòng)調(diào)節(jié)器。

3、恒溫箱或干燥箱

恒溫箱是切片不可缺少的設(shè)備，主要供浸蠟、烤片、烘烤清洗后的玻璃器皿及某些需要加溫60℃以上時(shí)應(yīng)用

4、冰箱 用于保存染液、試劑和藥品并提供切片用冰

5、離心機(jī)

可供脫落細(xì)胞及染色體技術(shù)用

6、切片刀、天平、酸度計(jì)、定時(shí)鐘、一般手術(shù)器械、染色缸、染色架、載玻片、蓋玻片、常用玻璃器皿、毛筆、酒精燈等。

三、常用試劑

1、洗液

重鉻酸鉀300g 濃硫酸 300ml 自來水 3000ml，即重鉻酸鉀、硫酸與自來水之比為1：1：10。

先將重鉻酸鉀溶于水，如加熱須待冷后，再緩緩加入濃硫酸，邊加邊攪。不準(zhǔn)將水倒入濃硫酸內(nèi)！另外，清潔液只能用于玻璃儀器的清洗，不能浸泡金屬器械。

2、蛋白甘油：蛋清打泡，靜置、過慮，加入等量甘油，充分混合，加入1%麝香草酚或樟腦防腐。

3、鹽酸-酒精：作分色用，100ml的70%酒精加入0.5或1ml濃鹽酸。

4、酒精稀釋液：用95%酒精稀釋使用。如將95%酒精稀為70%酒精時(shí)，可取70ml的95%酒精加水至95ml即成，依次類推。

5、堿性水：0.1%氨水或1%碳酸鋰水溶液6、10%福爾馬林：

商品甲醛 10ml

水 90ml

7、蘇木精溶液： 甲液：蘇木精2g

無水酒精20ml 乙液：甲礬40g

蒸餾水400ml 丙液：高錳酸鉀1g

蒸餾水16ml 三液分別溶化，然后將甲液注入乙液，再加丙液6ml，時(shí)時(shí)攪拌，加溫至煮沸0.5-1 min，使速冷卻后即可使用。

四、實(shí)驗(yàn)步驟

實(shí)驗(yàn)材料：新鮮的鯉魚一條

1.殺死與取材：用手術(shù)刀和鑷子按要求迅速找到魚的脾臟，然后取出，要求動(dòng)作迅速。

2.固定：使用小塊組織固定法，取下的小塊組織，立即置入10%福爾馬林固定液中進(jìn)行固定。

3.洗滌：因?yàn)樾〗M織可不沖洗，所以本實(shí)驗(yàn)需要多次換水浸泡即可。4.脫水：先放入70%酒精中30min，然后80%酒精30min，95%酒精30min, 95%酒精30min, 無水酒精30min, 無水酒精30min，5.透明：比例為1:1的無水酒精和二甲苯混合（30min），二甲苯20min, 二甲苯10min.6.浸蠟與包埋：比例比1:1二甲苯和石蠟（30min）,石蠟30min，石蠟30min，包埋。

7.切片：將熔化好的石蠟倒入包埋框或包埋盒，用加溫的鑷子將組織塊切面朝下放入，做好標(biāo)記，冷卻。完全凝固后，修整蠟塊。將切片機(jī)準(zhǔn)備好，調(diào)整好角度，固定好刀架、刀片和蠟塊，切片厚度：6-8μm；轉(zhuǎn)速：40至50次/min。8.染色：二甲苯（5 '）→1:1二甲苯+無水酒精（5'）→無水酒精（2'）→95%酒精（2'）→80%酒精（2'）→70%酒精（2'）→蘇木精（15'）→自來水洗（2'）→1%鹽酸酒精（30''）→自來水藍(lán)化（15'）→蒸餾水（2'）→70%酒精（2'）→80%酒精（2'）→伊紅（1'）→95%酒精（2'）→95%酒精（2'）→無水酒精（2'）→無水酒精（2'）→二甲苯（2'）→二甲苯（2'）

9.封固：切片經(jīng)染色透明后，取出切片，滴一滴中性樹膠，將蓋玻片蓋于切片上。貼上標(biāo)簽注明名稱、編號(hào)。10.觀察

五、總結(jié)與討論

石蠟切片實(shí)驗(yàn)是細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的重要部分，迄今為止石蠟切片仍然是疾病診斷，尤其是病變性質(zhì)判斷的重要手段。石蠟切片過程中，最易受到操作人員實(shí)驗(yàn)技術(shù)影響的步驟是浸蠟、包埋，而且包埋效果直接影響到實(shí)驗(yàn)結(jié)果的好壞。正確應(yīng)用動(dòng)物組織切片技術(shù)與完成動(dòng)物組織切片染色標(biāo)本的制作好壞關(guān)系重大。

六、參考文獻(xiàn)

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