第一篇：學(xué)習(xí)做切片

形態(tài)學(xué)方法 免疫組織化學(xué)

實(shí)驗(yàn)對(duì)象：冰凍切片

步驟

1、室溫下復(fù)溫30min，0.01MPBS清洗5min×3；

2、加入配好的0.3% Triton X100（30% Triton X100＋0.01MPBS 100ml）30min，以增加細(xì)胞的通透性，0.01MPBS清洗5min×3； 3、5%小牛血清封閉1h0.01MPBS清洗5min×3；

3、加入用血清稀釋液（牛血清白蛋白 1.00g＋0.01MPBS 100ml)稀釋的一抗，4℃存放24-48h；吸去抗體，0.01MPBS洗5min×3；

4、加入配好的0.3%的過氧化氫甲醇溶液（甲醇80ml＋0.01MKPBS 100ml＋30%過氧化氫）30min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的影響，0.01MPBS清洗5min×3；

5、加入0.01MPBS稀釋的的二抗，室溫孵育2h。0.01MKPBS洗5min×3；

6、加入ABC復(fù)合物之類的抗體，室溫孵育2h，0.01MPBS洗5min×3；蒸餾水迅速?zèng)_三次；

7、加入顯色液，進(jìn)行免疫組織化學(xué)顯色，時(shí)間一般不超過30min，可不時(shí)在顯微鏡下進(jìn)行觀察，待細(xì)胞著色而背底顏色較淡時(shí)馬上吸去顯色液，用蒸餾水迅速?zèng)_三次后加入0.01MKPBS終止反應(yīng)；

8、梯度酒精脫水之后，封片，拍照。

細(xì)節(jié)將消除內(nèi)源性過氧化物酶這一步放在后面，能避免雙氧水對(duì)目的蛋白的影響

1）實(shí)驗(yàn)技術(shù)大類： 形態(tài)學(xué)

（2）具體實(shí)驗(yàn)技術(shù)名稱： 冰凍切片

（3）實(shí)驗(yàn)對(duì)象： 腦組織

（4）簡(jiǎn)要實(shí)驗(yàn)步驟

1.經(jīng)心臟生理鹽水灌注取腦，對(duì)半切開，4%多聚甲醛浸泡固定（4℃）2.20％、30％蔗糖/0.1M PB溶液梯度脫水、直至標(biāo)本在標(biāo)本瓶中沉底。3.標(biāo)本在30％蔗糖/0.1 mol/L PB溶液脫水至沉底后取出，濾紙吸干表面水分。4.標(biāo)本經(jīng)OCT包埋劑包埋，連續(xù)冠狀位切片（5）我的經(jīng)驗(yàn)或者心得體會(huì)：

1.腦組織相對(duì)于其它器官含水量尤其豐富，冰凍切片時(shí)冷凍的速度要快，凍結(jié)的速度越慢，冰晶形成越多。

2.切片時(shí)的溫度很重要，對(duì)于一般的組織切片，切頭最適宜的溫度在-22℃左右，但腦組織不宜太低，溫度設(shè)置為：切頭溫度-19℃，機(jī)身溫度為-21℃。

3.包埋的時(shí)候要在冰凍切片機(jī)內(nèi)操作。先預(yù)冷切片的底座，然后再將標(biāo)本放在底座上預(yù)冷，由于標(biāo)本表面含有水分，自然就會(huì)與底座粘緊。預(yù)冷至標(biāo)本表面長(zhǎng)白霜，所需時(shí)間長(zhǎng)短不一，1cm3大小的標(biāo)本，約需5min。

4.包埋時(shí)，由下到上，盡量均勻涂抹，不要留空隙，特別是底部，螺旋狀向上盤旋。標(biāo)本周圍包埋劑的厚度在1-2mm之間，底部3-4mm為宜。

5.OCT包埋劑不能包的太多或太少。太多，切出來的腦組織切片容易卷曲；太少，容易卷曲之外，標(biāo)本底部的包埋劑過少，會(huì)導(dǎo)致固定不穩(wěn)，標(biāo)本容易與底座分離 1）實(shí)驗(yàn)技術(shù)大類： 形態(tài)學(xué)

（2）具體實(shí)驗(yàn)技術(shù)名稱： 冰凍切片裱片方法（3）實(shí)驗(yàn)對(duì)象： 組織切片

（4）簡(jiǎn)要實(shí)驗(yàn)步驟

將組織切片標(biāo)本貼附于載玻片上

我的經(jīng)驗(yàn)或者心得體會(huì)： 裱片常用有兩種方法：

1.漂浮法。切出來的腦標(biāo)本先轉(zhuǎn)移到0.01mol/L的PBS中，然后在裱到載玻片上，此法需要的時(shí)間精力太多，標(biāo)本容易在裱的過程中損壞。如果切片平面太多，則無法一一辨認(rèn)清楚，更難以按切片的順序連續(xù)裱片。

2.直接裱片法。一般的同學(xué)切下組織后，直接就拿載玻片往標(biāo)本上面粘，結(jié)果很多都是皺巴巴的，不平整，根本無法進(jìn)行后面的實(shí)驗(yàn)。我的經(jīng)驗(yàn)是先在載玻片上要裱片的部位預(yù)先涂上0.01mol/L的PBS，掀起冰凍切片機(jī)中壓片的擋板，迅速將沾有PBS的區(qū)域直接去貼切下的標(biāo)本?？梢杂^察到，切片像是受到一股吸引力一樣，自動(dòng)貼在載玻片上并且自然展開，遇到有小皺折的地方，可以用小毛筆，蘸少許PBS溶液，涂抹在標(biāo)本上，由于上下均有一層PBS液，可以自由的移動(dòng)到你想要調(diào)整的切片部位和形態(tài)。調(diào)整好后，掃掉多余的PBS液，晾干切片備用。

（1）實(shí)驗(yàn)技術(shù)大類： 形態(tài)學(xué)

（2）具體實(shí)驗(yàn)技術(shù)名稱： 組織切片封片

（3）實(shí)驗(yàn)對(duì)象： 組織切片

（4）簡(jiǎn)要實(shí)驗(yàn)步驟

免疫組織化學(xué)或者免疫熒光染色后的切片最后的封片

我的經(jīng)驗(yàn)或者心得體會(huì)：

無論是經(jīng)脫水透明還是直接干燥的切片，最后都需要用中性樹膠或者甘油封片。在封片時(shí)，為了避免組織被顆粒污染，盡量用新的或干凈的棉簽棒/玻璃棒，這樣可以避免將桌上的粉塵帶入到中性樹膠或者甘油中，并最后帶入切片中。另外在封片前盡量不要搖晃封片劑產(chǎn)生小的氣泡。封片時(shí)可以將封片劑沿著蓋玻片的邊緣遞成一條線，然后將切片先垂直靠近載波片滴有封片劑的一邊，慢慢傾斜45度左右，可發(fā)現(xiàn)載波片與蓋波片慢慢的合在一起，最后輕輕的復(fù)位至垂直即可。

1）實(shí)驗(yàn)技術(shù)大類： 形態(tài)學(xué)

（2）具體實(shí)驗(yàn)技術(shù)名稱： 冰凍切片保存（3）實(shí)驗(yàn)對(duì)象： 腦組織（4）簡(jiǎn)要 實(shí)驗(yàn)步驟

1.0.01MPBS及4%多聚甲醛經(jīng)心灌注取腦，4%多聚甲醛4℃后固定過夜 2.30％蔗糖脫水兩次、直至標(biāo)本在標(biāo)本瓶中沉底。3.OCT包埋切片

（5）我的經(jīng)驗(yàn)或者心得體會(huì)：

1.第一次脫水時(shí)可以用30%的蔗糖，當(dāng)組織沉底后，換第二次30%的蔗糖時(shí)，不要丟棄第一次的蔗糖，由于已經(jīng)有組織內(nèi)的水進(jìn)入到蔗糖中去了，所以實(shí)際上蔗糖的濃度一定低于30%，可以將這部分糖收集起來作為下次沉糖的第一次脫水用糖，這樣可以減少糖的耗費(fèi)，對(duì)組織沒喲任何影響。

2.為了減少冰晶的存在，在冰凍組織時(shí)，可以將經(jīng)OCT包埋劑包埋好的標(biāo)本放在一個(gè)小的塑料平皿中，倒入事先放置在-80度保存的2 甲基丁烷（不要蔓進(jìn)組織就行），讓組織速凍，可以減少冰晶，同時(shí)也可以保持直接接觸底座的組織底部平整，并減少修組織時(shí)的切片浪費(fèi)。3.為了避免傷害切片機(jī)用的刀片，從-80度冰箱取出的組織需要先放置在冰凍切片機(jī)中復(fù)溫半小時(shí)，以避免組織及包埋劑太硬而傷害刀片。

（1）實(shí)驗(yàn)技術(shù)大類： 形態(tài)學(xué)

（2）具體實(shí)驗(yàn)技術(shù)名稱： 冰凍超薄切片裱片方法（3）實(shí)驗(yàn)對(duì)象： 組織切片

（4）簡(jiǎn)要實(shí)驗(yàn)步驟

將超薄的組織冰凍切片標(biāo)本貼附于載玻片上

我的經(jīng)驗(yàn)或者心得體會(huì)：

對(duì)于沒有confocal的實(shí)驗(yàn)室，要想做出很漂亮的熒光雙標(biāo)圖片，可以考慮將切片切得非常薄，最薄可以達(dá)到6-8微米，當(dāng)然這也對(duì)貼片技術(shù)提出了挑戰(zhàn)。

首先組織必須固定好，固定好的組織切成薄片不會(huì)散開，而固定不好的組織薄片很快就散開。建議對(duì)這種薄片，采取漂浮法來貼片，直接裱片容易不平整。切出的標(biāo)本放入0.01mol/L的PBS中（注意不要有triton x-100）。陳放的器皿直徑也最好要大一些。切片進(jìn)入到PBS時(shí)要盡量的輕，盡量讓組織薄片漂浮在水面，切不可將組織薄片插入到水面以下，甚至還攪幾下，也就是說盡量得讓組織薄片顯示為展開的狀態(tài)而不是折疊得很厲害的狀態(tài)。貼片時(shí)，小心的用一個(gè)頭上是彎勾樣的玻璃棒挑出組織，手要輕，再小心的讓組織漂在不含triton x-100 的0.01mol/L PBS中，盡可能的保持當(dāng)時(shí)在陳放器皿中的狀態(tài)，如果組織直接是展開的狀態(tài)是最好貼的。如果組織有部分皺褶在上，可以先將沒有皺褶的部分貼在玻片上，調(diào)整玻片的方向，利用玻片在提起來時(shí)產(chǎn)生的水流來幫助折疊的切片順著水流方向鋪平，當(dāng)然如果折疊的部分是向下的，則可以在貼片的過程中輕輕的撥動(dòng)玻片產(chǎn)生小幅度的水流，結(jié)合細(xì)尖的毛筆來幫助向下折疊的組織與原來接觸組織脫離并隨著水流鋪平。

形態(tài)學(xué)方法 免疫組織化學(xué)

實(shí)驗(yàn)對(duì)象：石蠟切片

步驟：

①石蠟切片脫蠟和水化后，用PBS沖洗3次，每次5 min。②組織抗原修復(fù)，修復(fù)完自然放置至室溫。

③每張切片加1滴或50 μl過氧化酶阻斷劑(試劑A)，室溫下孵育10 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性。PBS沖洗3次，每次5 min。④除去PBS液，每張切片加1滴或50 μl正常非免疫動(dòng)物血清(試劑，室溫下孵育10 min。

⑤每張切片加1滴或50 μl 0.1%的Triton X-100破膜，室溫下孵育10 min。

⑥除去血清，每張切片加1滴或50 μl的一抗體(稀釋濃度為1：100)，4℃孵育過夜。PBS沖洗3次，每次5 min。

⑦除去PBS液，每張切片加1滴或50 μl生物素標(biāo)記的第二抗體(試劑C)，室溫下孵育10 min。PBS沖洗3次，每次5 min。

⑧除去PBS液，每張切片加1滴或50 μl鏈霉素抗生物素-過氧化物酶溶液(試劑D)，室溫下孵育10 min。PBS沖洗3次，每次5 min。

⑨除去PBS液，用PBST溶液漂洗切片3次，每次10 min。

⑩除去PBS液，每張切片加2滴或100 μl新鮮配制的DAB溶液，顯微鏡下觀察1～3 min。?自來水沖洗，蘇木素復(fù)染，PBS或自來水沖洗返藍(lán)。?梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明。?中性樹膠封固。?數(shù)碼相機(jī)拍照保存。

一方面有人認(rèn)為：5）我的竅門或者心得體會(huì)：以上我寫的是常規(guī)的免疫組化的步驟，但其實(shí)我試過在蘇木素復(fù)燃，氨水返藍(lán)后不用再繁瑣的進(jìn)行梯度酒精脫水以及二甲苯透明的這些步驟，直接將玻片放在晾片板上自然晾干即可封片拍照觀察，而且效果也很好，因?yàn)樘荻染凭淖饔镁褪敲撍?，跟你自然晾干作用一樣；中性樹膠里面本身就有二甲苯，因?yàn)樵谀撤N程度上可以起到透明的作用。這樣一來，整個(gè)免疫組化每次就可以節(jié)省一個(gè)小時(shí)的時(shí)間了。大家可以試試看。有人提出了對(duì)上一位的看法：對(duì)這位兄弟的心得體會(huì)有點(diǎn)疑問，理論上來說你的竅門也不是不可行，但我覺得還是不嚴(yán)謹(jǐn)，我們做免疫組化脫水透明這些步驟加在一起也就20-30分鐘，所以也不存在節(jié)省一個(gè)小時(shí)的問題。省掉脫水透明的步驟其實(shí)不利于片子的長(zhǎng)期保存，如果僅僅是做實(shí)驗(yàn)留個(gè)照片的話也無所謂了，但如果是在醫(yī)院的話也就不行了。晾得時(shí)間長(zhǎng)了片子不好看，短了水分殘留與二甲苯不相溶，整個(gè)片子就模糊了。中性樹膠是用二甲苯溶的是沒錯(cuò)，但每個(gè)實(shí)驗(yàn)室加的量是隨意的，加的少的話透明不徹底，時(shí)間長(zhǎng)了片子就不能看了。這個(gè)我是有教訓(xùn)的。所以個(gè)人覺得還是老老實(shí)實(shí)脫水透明吧，并不浪費(fèi)時(shí)間，即使多花個(gè)幾分鐘那也是有好處的。呵呵，一家之言，歡迎討論。

5）過程中需要注意的事項(xiàng)或技巧：

1.在進(jìn)行第一步的脫蠟至水，其實(shí)最好先進(jìn)行空白片的烘烤，把空白片放在58度左右的烤箱中進(jìn)行烘烤，大概4~6小時(shí)，這樣有兩個(gè)目的：第一，可使玻片上的組織與玻片貼的更緊；第二，可以盡可能的除去玻片上的石蠟，這樣就可減少后續(xù)染色過程中的非特異背景染色。

2.過程中的“用PBS沖洗3次，每次5 min”我見過有同學(xué)是用那種塑料的免疫組化盒子，然后把玻片放進(jìn)架子上，用手拿著架子在免疫組化盒中進(jìn)行不停得上下提拉，以達(dá)到充分漂洗的目的，這樣效果會(huì)很不錯(cuò)，但太累人了，每一次都要不停得提拉15分鐘。我的做法是，把放有玻片的架子放進(jìn)免疫組化盒中后，再把免疫組化盒放在做WESTERN BLOT 的搖床上，調(diào)整適當(dāng)?shù)乃俣?，這樣放在架子上的玻片就會(huì)隨著搖床的搖擺而來回?fù)u擺，達(dá)到漂洗的目的。3.每次滴加試劑時(shí)盡可能的超出標(biāo)本的邊緣稍許，以防止邊緣沒有液體覆蓋增加非特異染色；另外除去液體，繼續(xù)滴加下一種液體時(shí)動(dòng)作一定要快，不然也是會(huì)干片，增加非特異染色。4.抗原修復(fù)首選高壓修復(fù)，效果最好。其次是微波修復(fù)。EDTA修復(fù)液效果最好，檸檬酸效果其次。

5.第四步中你可以看到，沒有“PBS沖洗3次，每次5 min?！边@樣的說明，對(duì)了，這一步是達(dá)到用非免疫動(dòng)物血清封閉非特異抗原的目的，如果你沖洗了，則整個(gè)實(shí)驗(yàn)就白做了，這一步切忌。6.如果抗原時(shí)表達(dá)在包膜的，則破膜與否不是太重要；但如果抗原是表達(dá)在胞漿的，則最好破膜。7.一抗孵育最好選擇4度過夜，抗原抗體反應(yīng)比較溫和；

8.DAB染色時(shí)間把握，可以采取鏡控。滴完DAB后迅速在顯微鏡下觀察，最佳的時(shí)間點(diǎn)是，你要觀察部位的胞漿出現(xiàn)了橙黃色，而其他背景還沒有開始變黃。9.還是不用梯度酒精和二甲苯作用，直接晾干，封片，觀察拍照。也有人認(rèn)為：這位兄臺(tái)說的大部分我都認(rèn)同。有幾點(diǎn)與你共同討論

1..關(guān)于脫水透明的問題，在主題的其他貼里我表達(dá)了自己的觀點(diǎn)，這里不累述。關(guān)于抗原修復(fù)的問題，有點(diǎn)不同看法?？乖迯?fù)不存在哪種方法最好，哪種方法其次的問題。每一張抗原都有不同的修復(fù)方法，有的高壓修復(fù)做出來是陰性，但用胰酶消化就是陽性了。理論上即使兩種抗原修復(fù)方法相同，例如都是微波修復(fù)，但作用的時(shí)間和方式可能也不一定一樣。有點(diǎn)直接煮15分鐘好，有點(diǎn)20分鐘好，有的可能要每次煮5分鐘，稍冷卻再煮5分鐘，重復(fù)好幾次。具體的原理我也不是很明白，是實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)的總結(jié)。關(guān)于破膜與否的問題，免疫組化切片一般就4各微米，細(xì)胞都已經(jīng)被切開了，還用破膜嗎？相反，如果你破膜時(shí)間和濃度掌握不好，可能還會(huì)造成染色定位不準(zhǔn)。該膜陽性的弄成膜和漿都陽性了。如果你認(rèn)為出現(xiàn)陰性是沒破膜的話，個(gè)人感覺還是從其他方面找原因。當(dāng)然，如果你做的是細(xì)胞爬片的免疫組化，那就需要破膜了。

形態(tài)學(xué)方法

載玻片處理（免疫組化用）實(shí)驗(yàn)對(duì)象：載玻片

（一）我們大學(xué)多個(gè)實(shí)驗(yàn)室用的載玻片處理方法：

1.普通的載玻片（例如： 帆船牌），將其排列在玻片架上，置于熱水中，加洗衣粉，煮沸30分鐘

2.傾去洗衣粉水，自來水沖洗2遍，把洗衣粉沖干凈 3.超聲清洗（65w，10min）4.酸缸內(nèi)浸泡過夜

5.自酸缸內(nèi)取出，自來水沖洗 6.超聲清洗（65w，10min）7.雙蒸水沖洗，烘干 8.75%酒精浸泡過夜 9.雙蒸水沖洗，烘干 10.過明膠（3次）

（二）我改良的載玻片處理方法： 1.購買潔凈度高的載玻片（例如：世泰）2.置架排列后，75%酒精中浸泡過夜 3.取出后，雙蒸水洗滌，烘干 4.過明膠（3次）

我的竅門或心得體會(huì)：

1.經(jīng)改良后的步驟簡(jiǎn)單快捷，節(jié)省大量時(shí)間。舊方法最起碼要4天時(shí)間，新方法2天就完成了。當(dāng)處理少量載玻片可能不覺得有多大差異，但如果你主要研究形態(tài)學(xué)的話，處理幾百張載玻片的時(shí)候，就可以體驗(yàn)到這兩種方法的差別。

2.很多人用多聚賴氨酸處理載玻片，個(gè)人覺得還是明膠可靠，很少掉片，比較過自己用多聚賴氨酸處理的載玻片或者是直接從公司購買的多聚賴氨酸處理的載玻片，都有不同程度的掉片現(xiàn)象，做石蠟切片的可能相對(duì)還好一些，但是冰凍切片，個(gè)人感覺明膠處理的的載玻片明顯優(yōu)于多聚賴氨酸處理的載玻片。并且，明膠經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，非常便宜，而多聚賴氨酸很貴；過明膠可以用個(gè)大燒杯批量處理，過多聚賴氨酸的時(shí)候那可是細(xì)活。

（1）實(shí)驗(yàn)技術(shù)大類：分子生物學(xué)

（2）具體實(shí)驗(yàn)技術(shù)名稱：western blot（3）實(shí)驗(yàn)對(duì)象：動(dòng)物心肌組織/細(xì)胞蛋白（4）簡(jiǎn)要步驟：凝膠配置及蛋白樣品前處理

（5）心得體會(huì)：

1．配膠: 該部分較為重要的是配制凝膠時(shí)要充分混勻，此外應(yīng)保證試劑的新鮮。常出現(xiàn)的問題有：A.凝膠出現(xiàn)花紋：此時(shí)應(yīng)檢查原料中過硫酸銨（AP）粉末是否受潮

B.凝膠聚合時(shí)間較長(zhǎng)：聚合時(shí)間由AP以及TEMED決定，通常在30min左右，AP不新鮮會(huì)導(dǎo)致聚合變慢：此外還需注意環(huán)境的溫度也很重要，氣溫較低時(shí)膠是會(huì)凝得慢一些，必要時(shí)可適當(dāng)增加AP以及TEMED的量，但通常不會(huì)超過1h，若超過1h甚至更長(zhǎng)仍未聚合，應(yīng)檢查配制的操作有無錯(cuò)誤。

2．處理蛋白樣品：該部分蛋白樣品本身很關(guān)鍵，若蛋白提取過程存在問題或蛋白發(fā)生降解則很難進(jìn)行好之后的實(shí)驗(yàn)，也就很難做出好的結(jié)果了；除此之外loading buffer的作用也不容忽視，切莫使用不新鮮的上樣緩沖液，同時(shí)在處理時(shí)將樣品與loading buffer混合均勻也應(yīng)注意。詳722926

見

：http://protein.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=15722926&sty=1&tpg=1&ppg=1&age=0#15

（1）實(shí)驗(yàn)技術(shù)大類： 免疫測(cè)定與診斷技術(shù)

（2）具體實(shí)驗(yàn)技術(shù)名稱： ELISA（3）實(shí)驗(yàn)對(duì)象： 腫瘤病人血清標(biāo)本

（4）簡(jiǎn)要步驟:① 包被：用包被緩沖液將MBP/OY-TES-1稀釋至1.0μg/ml，取100μl/孔包被酶標(biāo)板，4℃濕盒過夜。1×PBS-T洗板3次（室溫靜止30sec/次），甩去液體，用紙吸干； ② 封閉：5%脫脂奶（200μl/孔）37℃封閉30min，1×PBS-T洗板4次，甩去液體，用紙吸干； ③ 上血清：加入待檢稀釋血清（1:400）、陽性對(duì)照和空白對(duì)照各100μl/孔，37℃濕盒孵育1h，1×PBS-T洗板4次，甩去液體，用紙吸干；

④ 上二抗：加入Biotin-綿羊抗人IgG單克隆抗體（1:1000），37℃濕盒溫育1h，1×PBS-T洗板4次，甩去液體，用紙吸干；

⑤ 上標(biāo)記物：加入Avidin-HRP（1:1000），37℃濕盒溫育30min，1×PBS-T洗板4次，甩去液體，用紙吸干；

⑥ 顯色：TMB避光顯色15min，加1N H2SO4終止反應(yīng)； ⑦ 酶標(biāo)儀OD450與OD630雙波長(zhǎng)讀數(shù)。

（5）我的竅門或者心得體會(huì)：1.我沒用試劑盒做（尚未有商業(yè)化試劑盒開發(fā)），所以一切數(shù)據(jù)都要自己計(jì)算，包括包被蛋白濃度，一抗?jié)舛?，二抗?jié)舛龋?jì)算時(shí)務(wù)必不能出錯(cuò)，要不就會(huì)功虧一簣。

2.用任何試劑前都要把試劑混勻，因?yàn)榈鞍资呛苋菀壮恋淼摹?.用固定的幾把移液器，這樣可以盡可能的較少誤差。

4.濕盒孵育前要先把濕盒放在37°進(jìn)行溫度平衡，這樣可以減少達(dá)到平衡的時(shí)間，而且也可以避免符合試驗(yàn)溫度的孵育時(shí)間不夠。

5.等板底的水珠揮發(fā)以后再讀數(shù)，要不會(huì)出現(xiàn)負(fù)值。

6.實(shí)驗(yàn)時(shí)盡量少開口說話（因?yàn)榇蟛糠肿龅氖堑鞍椎臏y(cè)定，口水避免不了會(huì)使所測(cè)蛋白降解的啊，呵呵）

第二篇：課程切片

課程切片

05:00管理類綜合能力測(cè)試邏輯推理課程 考察能力理解、分析、綜合 判斷、推理、論證

并不是對(duì)于邏輯專業(yè)知識(shí)的考察，也不是對(duì)試題中可能涉及的自然科學(xué)、認(rèn)為科學(xué)等方面專業(yè)知識(shí)的考察

同學(xué)們都有拿到教材了，那教材很厚，但是內(nèi)容很容易，抓住概念理解透了，這部分的目標(biāo)是不丟分，這是我們的一個(gè)理想狀態(tài)，分為三個(gè)篇幅

基礎(chǔ)篇有概念、判斷、推理、論證

對(duì)于概念這部分，有同學(xué)問了啥是概念那? 概念就是詞，就是你認(rèn)識(shí)一個(gè)對(duì)象你需要了解的兩個(gè)層次的含義：第一個(gè)層次：你要知道所指對(duì)象的概念的特征和內(nèi)涵；第二個(gè)層次：你要知道這個(gè)對(duì)象的范圍。內(nèi)涵和外延這部分內(nèi)涵是啥外延是啥都說清楚 二者啥關(guān)系同時(shí)加入一個(gè)生動(dòng)的例子。15:00概念種類、概念之間的關(guān)系

種類包括正概念負(fù)概念、單獨(dú)概念普遍概念、集合概念非集合概念

正概念負(fù)概念是相對(duì)來說的，不能死教條的去理解他，比如不好的也可能是正概念，如果讓你說出他的負(fù)概念你要知道按照原命題否命題的方式，去理解，單獨(dú)概念普遍概念就看是反映一個(gè)事物還是反映的兩個(gè)以上的事物，這里重點(diǎn)講解下集合概念和非集合概念，從定義上就能夠區(qū)分這兩個(gè)概念，二者區(qū)分標(biāo)準(zhǔn)就是這兩個(gè)概念是否為一個(gè)不可分割的集合體，能分割就是非集合概念，不能分割就是集合概念，其實(shí)用常識(shí)就很容易理解，集合你就想象是密不可分的集體當(dāng)然不能夠去分割他，分割的化就是意思會(huì)發(fā)生變化，這里講解幾道習(xí)題 年輕人積極向上，這里年輕人這個(gè)概念反映的對(duì)象是集合還是非集合，我們就在年輕人前面加入每一個(gè)三個(gè)字，加入之后每一個(gè)年輕人都應(yīng)該積極向上，意思并沒有發(fā)生變化，那么這里年輕人的概念就是非集合概念，那如果我說人民，只有人民才是創(chuàng)造歷史的真正動(dòng)力，這里如果在人民前面加上每一個(gè)之后，人民作為整體才能夠發(fā)揮創(chuàng)造歷史的作用，但是人民前面加上每一個(gè)之后，每一個(gè)人民是能夠創(chuàng)造歷史的動(dòng)力，這樣的說法顯然是不對(duì)的，所以我們掌握這個(gè)加入每一個(gè)這仨字的方法就能夠成功的區(qū)分集合概念和非集合概念。這里我們講過了概念相關(guān)的一些知識(shí)點(diǎn)，那這里重點(diǎn)給大家介紹一下之后我們考試中可能經(jīng)常會(huì)考到的一些容易犯的邏輯錯(cuò)我，那我們剛說的這個(gè)內(nèi)涵和外延來說，兩個(gè)概念如果相等必須要內(nèi)涵和外延都相等才能夠兩個(gè)概念是一致的，那么有這樣一個(gè)例子，說某些學(xué)校缺乏體育鍛煉方面的經(jīng)費(fèi)，學(xué)生缺乏體育鍛煉，某些領(lǐng)導(dǎo)說，沒有關(guān)系，學(xué)生上課做做操就行，還要什么體育鍛煉，在家里做家務(wù)也是鍛煉。這里犯了一個(gè)什么邏輯錯(cuò)誤呢，我們來看同樣是鍛煉，體育鍛煉和在家里做家務(wù)鍛煉，字面意思是一樣的，可是鍛煉前面的限定條件不同，這就使得兩種鍛煉的內(nèi)涵是不同的，體育鍛煉內(nèi)涵是通過體育運(yùn)動(dòng)使得身體強(qiáng)壯，培養(yǎng)同學(xué)勇敢、機(jī)智和團(tuán)隊(duì)合作等方面的品德和精神，而在家干活也是鍛煉則是混淆了體育鍛煉和在家里做家務(wù)，犯了偷換概念的錯(cuò)誤，這里，要想判斷是否出現(xiàn)偷換概念的邏輯錯(cuò)誤，主要考察字面相同的兩個(gè)概念在不同的語境中所反映對(duì)象的外延是否發(fā)生變化，如果你列出項(xiàng)下子元素二者出現(xiàn)不同，那么這里就是混淆了兩種概念。

20:00關(guān)于概念之間的關(guān)系我們?cè)趯W(xué)習(xí)的時(shí)候要配合歐拉圖，學(xué)一種關(guān)系我們就按照把符合這種關(guān)系的歐拉圖畫出來，這樣我們之后在做題的時(shí)候就可以幫助我們做題，那么概念之間的關(guān)系有同一關(guān)系、交叉關(guān)系、包含關(guān)系、矛盾關(guān)系、反對(duì)關(guān)系。首先我們來看，啥是同一關(guān)系，兩個(gè)或者多個(gè)關(guān)系之間外延相同，具有同一關(guān)系的概念就叫同一概念，比如我們小時(shí)候可能媽媽爸爸可能會(huì)給起小名，上學(xué)的時(shí)候有可能被人起外號(hào)，那我們說的小名外號(hào)，這些反映的對(duì)象都是指的我們自己對(duì)吧，所以這里小名啊 外號(hào)啊就是同一概念，這里面還是，容易出現(xiàn)的邏輯謬誤就是不當(dāng)同一替代，就像我們知道魯迅 原名周樹人，有同學(xué)說老師他不浙江人嗎，我們需要有點(diǎn)文學(xué)常識(shí)好吧，那有的人可能不知道不知道魯迅原名周樹人，知道狂人日記是魯迅寫的，那說周樹人寫了狂人日記可能不知道，再來舉一個(gè)例子，巴金就是李堯棠，那我們都知道巴金是作家，但很少有人知道李堯棠是作家，這個(gè)時(shí)候就出現(xiàn)了一個(gè)什么問題呢，就是出現(xiàn)邏輯上的描述不一致，那怎么解釋這個(gè)問題呢，所有人都知道巴金是作家，但是很少有人知道李堯棠是作家，那巴金和李堯棠是同一概念，有些人存在二者認(rèn)識(shí)的差異，只知其一，那么就很好的解釋了這種描述不一致的問題。

那接下來包含關(guān)系很容易理解了，比如碩士研究生，和研究生，研究生還有博士研究生，所以這里，研究生的概念外延更大一些，包含著碩士研究生，而碩士研究生包含于研究生。交叉關(guān)系，意思就是二者存在交集，我們講的以上三種關(guān)系都是屬于相容關(guān)系。接下來要講的矛盾關(guān)系和反對(duì)關(guān)系。這兩個(gè)我們不僅要講啥事矛盾關(guān)系啥事反對(duì)關(guān)系，還會(huì)給大家對(duì)這兩種概念進(jìn)行區(qū)分，兩個(gè)概念他們互相排斥，但他們加起來又等于一個(gè)整體，反對(duì)關(guān)系呢說的是兩個(gè)概念他們是排斥的，但是加到一起呢有是屬于一個(gè)整體，但是整體出來這兩個(gè)概念有會(huì)存在其他的，就是說整體排除了這兩個(gè)概念之后不是空集。所以總結(jié)一句話就是矛盾概念兩個(gè)概念的外延和等于屬概念的外延，而反對(duì)關(guān)系兩個(gè)概念的外延和小于屬概念的外延，這里容易出現(xiàn)什么樣的邏輯謬誤呢，就是非黑即白的錯(cuò)誤，就是本來是反對(duì)關(guān)系但是當(dāng)成矛盾關(guān)系處理。

30:00這里有一個(gè)習(xí)題需要給大家講一下，教材翻到39頁這里習(xí)題九，講的是除非像機(jī)動(dòng)車一樣，你闖了紅燈給你開罰單，否則對(duì)于騎行者來說禁止闖紅燈這項(xiàng)交通法規(guī)是沒意義的，為什么呢，這里說了他的論證過程，因?yàn)橐豁?xiàng)交通法規(guī)要想有意義必須要能夠有效的制止他所禁止的行為，而對(duì)于騎行者來說，經(jīng)常闖紅燈的你不開罰單的話你這項(xiàng)交通法規(guī)是無意義的，那對(duì)于遵守交通法規(guī)的人來說，你又不需要，所以材料中下了結(jié)論，禁止騎自行車闖紅燈是沒意義的，這里面出現(xiàn)了什么樣的邏輯漏洞呢，我們來看，這段材料有一個(gè)特殊句式，就是除非什么什么否則什么什么，那我們?cè)趺窗阉麚Q一種更好理解的說法呢，就是如果不像給機(jī)動(dòng)車一樣開罰單的話，那么禁止闖紅燈的交通法規(guī)對(duì)于騎自行車的人來說是無意義的，分析這段材料我們揪出他所涉及的對(duì)象，有闖紅燈的有機(jī)動(dòng)車的，那之后論述的時(shí)候出現(xiàn)了經(jīng)常闖紅燈的，以及遵守交通法規(guī)禁止闖紅燈這項(xiàng)要求的不闖紅燈的，我們一分析，戲更多的是騎行者這一塊，那我們就來分析一下，騎行者，他在交通系統(tǒng)中可能出現(xiàn)幾種情況，經(jīng)常闖紅燈的，以及偶爾闖紅燈的，還有不闖紅燈的，那論證中對(duì)于經(jīng)常闖紅燈的他說你不開罰單是交通法規(guī)是無意義的，而遵守的你不需要，然后他下定義交通法規(guī)是無意義，他論證的缺陷在哪，就是對(duì)于可能出現(xiàn)偶爾闖紅燈的人，沒有做出判斷，而交通法規(guī)禁止闖紅燈的意義有可能就是針對(duì)這部分人的。35:0我們講了矛盾關(guān)系講了反對(duì)關(guān)系，我們來總結(jié)一下二者區(qū)別，你就記住矛盾關(guān)系非真即假，而反對(duì)關(guān)系呢有可能同真同假，也可能一真一假，那集合來說，矛盾關(guān)系是屬于A集合那一定不屬于B集合，而反對(duì)關(guān)系是屬于A集合一定不屬于B集合，而不屬于A集合，就不一定屬于B集合，從肯定否定上來說呢，矛盾關(guān)系肯定A就一定否定B，反對(duì)關(guān)系是肯定比否定，否定不一定。進(jìn)入下一個(gè)知識(shí)點(diǎn) 定義

定義說的是對(duì)概念內(nèi)涵進(jìn)行界定的邏輯方式，包含著被定義項(xiàng)、定義項(xiàng)、定義聯(lián)項(xiàng)。我們回憶一下學(xué)習(xí)生涯學(xué)過很多定義，有沒有全部還給老師，商品的定義、自然數(shù)的定義等等，那我們對(duì)于商品是怎么進(jìn)行定義的呢，商品是用來交換的勞動(dòng)產(chǎn)品，這里商品是被定義項(xiàng)，勞動(dòng)產(chǎn)品是定義項(xiàng)，而是這里是定義聯(lián)項(xiàng)，這里有一個(gè)需要非常注意的地方是定義項(xiàng)和被定義項(xiàng)一定要外延相等，否則容易出現(xiàn)什么問題呢，就是定義過窄或是過寬的問題，比如說剛剛的商品的定義，商品是用來交換的勞動(dòng)產(chǎn)品，這里了我如果給用來交換前面加個(gè)限定詞，商品是用貨幣來交換的勞動(dòng)產(chǎn)品，此時(shí)定義項(xiàng)的外延范圍縮小了，那這個(gè)就不能稱之為定義了，我們分析一下商品是用貨幣來交換的勞動(dòng)產(chǎn)品，我們說在貨幣產(chǎn)生之前我們還有物物交換呢，那物物交換的話商品就不是商品了嗎，所以定義項(xiàng)外延縮小就不能稱之為定義，再給大家舉個(gè)例子商品是勞動(dòng)產(chǎn)品，這類我們把用來交換的限定詞去掉了，此時(shí)是否定義成立呢，商品確實(shí)是勞動(dòng)產(chǎn)品，但是勞動(dòng)產(chǎn)品如果不是用來交換的話也不能稱之為商品，這個(gè)就是犯了什么錯(cuò)誤呢就是定義過寬的錯(cuò)誤，那除了我們剛剛給大家講的定義過寬和定義過窄的問題，還會(huì)出現(xiàn)同語反復(fù)和語序重復(fù)的問題，這兩種情況就是，舉個(gè)例子有人問你學(xué)什么的，啊 我是學(xué)區(qū)域經(jīng)濟(jì)學(xué)的，那給我介紹哦一下，區(qū)域經(jīng)濟(jì)學(xué)就是研究區(qū)域內(nèi)的經(jīng)濟(jì)學(xué)，這里就是出現(xiàn)了定義項(xiàng)包含被定義項(xiàng)，那我們是不是沒有說清楚概念的內(nèi)涵，我有解釋清楚這個(gè)區(qū)域經(jīng)濟(jì)學(xué)是啥嗎，沒有，什么樣的是對(duì)這個(gè)區(qū)域經(jīng)濟(jì)學(xué)概念正規(guī)的解釋呢，比如說范圍是區(qū)域空間，通過研究比較不同區(qū)域空間經(jīng)濟(jì)發(fā)展差異，經(jīng)濟(jì)發(fā)展問題，來進(jìn)行一定的區(qū)域經(jīng)濟(jì)發(fā)展政策的研究，那定義項(xiàng)包含被定義項(xiàng)就是犯了同語反復(fù)的毛病，下一個(gè)語序重復(fù)呢就有點(diǎn)像是繞口令了，問什么是戰(zhàn)爭(zhēng)，……

還有容易出現(xiàn)在這個(gè)知識(shí)點(diǎn)這的邏輯錯(cuò)誤是定義中不能出現(xiàn)負(fù)概念，以及比喻，這個(gè)都是很容易發(fā)現(xiàn)，接下來我們來看幾道習(xí)題

進(jìn)入下一個(gè)知識(shí)點(diǎn)劃分，劃分是針對(duì)某一概念對(duì)他外延進(jìn)行揭示，他所列出的項(xiàng)下子元素，既不能多出也不能少，什么意思呢，說讓你羅列出直系親屬都包括哪些，父母子女愛人，兄弟，姐妹，這里兄弟姐妹愛人都不是直系親屬，所以不能作為直系親屬列出……

劃分還有的常見的邏輯謬誤是其所劃分出的子項(xiàng)不能相容，就像人分為男人、女人、壞人、好人，那壞人好人中都有男有女，這里就是犯了子項(xiàng)相容的問題，同樣是這個(gè)例子，還犯了標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一的問題，劃分標(biāo)準(zhǔn)混淆，是按照性別啊 還是按照人的品質(zhì)啊，最后是容易出現(xiàn)的問題是越級(jí)劃分，所列子項(xiàng)一定要是同一級(jí)別，

第三篇：“板書設(shè)計(jì)”教學(xué)切片

畫龍要點(diǎn)睛

——“板書設(shè)計(jì)”切片分析

濮陽縣第二中學(xué) 王桂玲 一節(jié)課，要上得精彩，高效，必須經(jīng)過教師的精心設(shè)計(jì)，如果把一節(jié)精心設(shè)計(jì)的課比作畫成的一條龍，那么，板書，無疑是教學(xué)設(shè)計(jì)點(diǎn)睛的那一筆。那什么是板書呢？

板書是教學(xué)設(shè)計(jì)的一個(gè)重要組成部分，顧名思義，簡(jiǎn)言之，就是教師在黑板上的書寫內(nèi)容。我在這里，跟大家從兩個(gè)方面來進(jìn)行解讀。從動(dòng)態(tài)的角度理解，它是教師上課時(shí)在黑板上書寫的文字、符號(hào)以傳遞教學(xué)信息、教書育人的一種言語活動(dòng)方式。從靜態(tài)的角度理解，它是教師在教學(xué)過程中，為幫助學(xué)生理解掌握知識(shí)，而利用黑板以凝練、簡(jiǎn)潔的文字、符號(hào)、圖表等呈現(xiàn)的教學(xué)信息的總稱。這其中，學(xué)生也是可以參與板書的，其實(shí)，我們也鼓勵(lì)學(xué)生參與。

由板書的概念可以得知，板書的內(nèi)容主要包括三點(diǎn)，一是本節(jié)課的教學(xué)內(nèi)容的內(nèi)在邏輯結(jié)構(gòu)；再就是教學(xué)的重點(diǎn)和難點(diǎn)；另外還有教學(xué)內(nèi)容的補(bǔ)充知識(shí)。

根據(jù)學(xué)生年齡的特點(diǎn)以及不同學(xué)科的特點(diǎn)，業(yè)內(nèi)人員，通常把板書劃分成六類。提綱式板書，線索式板書，詞語式板書，分析綜合式板書，圖畫式板書。思維導(dǎo)圖式板書。

各種類型的板書都有有所側(cè)重，要結(jié)合學(xué)生的特點(diǎn)和教材內(nèi)容的需要進(jìn)行安排，比如低學(xué)段的文科板書要盡量采取圖畫式的，引起孩子的興趣，高學(xué)段的理科板書設(shè)計(jì)，盡量低要采用具有邏輯性強(qiáng)的板書設(shè)計(jì)。

這里，我要對(duì)思維導(dǎo)圖式板書多做些交流。這類板書在我國是近幾年比較流行的，我在教學(xué)過程中運(yùn)用最多的就是這種板書，既美觀又具有比較強(qiáng)的邏輯性，最主要的是著這一過程中，吧對(duì)知識(shí)的學(xué)習(xí)變成了學(xué)生積 極參與的做事性學(xué)習(xí)。學(xué)生根據(jù)所學(xué)內(nèi)容，結(jié)合自己的想法，能夠在老師的帶動(dòng)下繪制創(chuàng)造性的思維導(dǎo)圖，對(duì)學(xué)生知識(shí)的梳理，系統(tǒng)化，網(wǎng)絡(luò)化大有幫助，而且能夠培養(yǎng)學(xué)生的發(fā)散思維。

總之，板書設(shè)計(jì)要有利于知識(shí)傳授，有利于學(xué)生智力開發(fā)、能力培養(yǎng)，有利于學(xué)生情操陶冶，有利于活躍課堂氣氛，有利于學(xué)生記憶知識(shí)。

但是，實(shí)際教學(xué)中，教師對(duì)板書設(shè)計(jì)的重視程度怎樣呢，情況并不理想。通常有以下幾種情況。

一部分教師，特別是剛?cè)肼毜那嗄杲處?，沒有認(rèn)識(shí)到板書的意義和價(jià)值，對(duì)板書沒有設(shè)計(jì)，講到哪里寫到哪里，講完了，寫完了，滿滿的一大板，橫的豎的，亂七八糟，看不出條理，看不出重點(diǎn)。甚至于一版寫不完，就唰唰唰擦掉，粉筆末四濺，再接著寫。隨意性很強(qiáng)，布局不合理，重點(diǎn)不突出不醒目，起不到板書應(yīng)起的作用。

另一部分教師，板書是經(jīng)過設(shè)計(jì)了，可是字體不美觀，書寫潦草，沒有規(guī)范意識(shí)，忘記了自己的角色，老師的示范作用，身教的教育作用要大于言傳，老師是學(xué)生模仿的對(duì)象，不理想的板書，對(duì)學(xué)生影響也不好。

最后一部分教師，可能是因?yàn)闀鴮懟竟Σ惶硐?，根本不板書。另外，現(xiàn)在老師上課時(shí)基本上都用到課件，干脆就制作在課件上，一展示就行了，倒是便捷。但是筆者認(rèn)為，這樣一來，板書教育的附加值，就會(huì)消失殆盡。

可見，課件板書設(shè)計(jì)并沒有真正引起執(zhí)教教師的重視。大多數(shù)老師只是在公開課的時(shí)候才會(huì)用心設(shè)計(jì)板書，我多么希望板書設(shè)計(jì)成為教師課堂教學(xué)的常態(tài)化，落實(shí)到每一節(jié)課堂教學(xué)中。這也是今天我對(duì)做客教師出色的板書設(shè)計(jì)特別關(guān)注的原因之一。

今天，楊慶春老師這節(jié)課的板書設(shè)計(jì)激發(fā)了我莫大的興趣。板書最后形成了一部書的圖形，一頁是課題“背影”，另一頁是對(duì)父愛的定性評(píng)價(jià)： 2 關(guān)懷備至，體貼入微，真摯深切。書脊上書寫的是“父愛”。父親就是一本書，一本厚厚的書，父愛是書的內(nèi)容，這愛，是關(guān)懷備至的，是體貼入微的，是真摯深切的，二這些，都凝聚在父親肥胖，佝僂的背影里。板書的這個(gè)創(chuàng)意，生動(dòng)形象，直觀地再現(xiàn)了文本的主旨，不愧為課堂的點(diǎn)睛之筆。這使我想起了曾在百度上看到的《秋天的懷念》的板書設(shè)計(jì)，板書整體有兩個(gè)紅色的心交疊組成，疊合的部分寫著“愛“字，兩邊分別寫著愧疚、懷念和堅(jiān)強(qiáng)、無私，不言而喻，這分別是母親和兒子的兩顆心。了了幾個(gè)關(guān)鍵詞，點(diǎn)出了文本的主旨。由此看來，這兩個(gè)板書設(shè)計(jì)有著異曲同工之妙。我又在網(wǎng)上搜集了大量獲獎(jiǎng)的板書設(shè)計(jì)，如下圖：

.這些優(yōu)秀的板書設(shè)計(jì)都具備了一些共性特點(diǎn)：

1.板書簡(jiǎn)潔扼要，語言凝練，只板書核心詞，言簡(jiǎn)而義豐

2.板書圖文結(jié)合，完備美觀，給人以美的享受，能激發(fā)審美體驗(yàn)。3.板書有啟發(fā)性。邏輯性強(qiáng)，留下思維的空間。

結(jié)合楊老師的課例，我建議，板書完全形成之后，教師要把板書設(shè)計(jì)的意圖，用優(yōu)美精煉的語言表述出來，有助于學(xué)生進(jìn)一步理解教師的設(shè)計(jì)意圖，進(jìn)一步深刻理解文本的核心內(nèi)容。給整個(gè)一節(jié)課畫上一個(gè)圓滿的句 號(hào)。另外，板書和學(xué)習(xí)進(jìn)度要保持同步。

因此，我們可以進(jìn)一步提出，優(yōu)秀板書設(shè)計(jì)要遵循的基本原則與操作要求：

（一）科學(xué)性原則。板書設(shè)計(jì)，是發(fā)端于文本，源自于學(xué)者，形成于黑板的，是課堂教學(xué)中很重要的一環(huán)。板書“要反映教材特點(diǎn)，突出教材重點(diǎn)，揭示教學(xué)內(nèi)容的難點(diǎn)和關(guān)鍵。

（二）美觀性原則

板書設(shè)計(jì)還要合符審美的原則，圖文結(jié)合，激發(fā)學(xué)生的審美意識(shí)。

（三）實(shí)用性原則

板書設(shè)計(jì)，不論是教材內(nèi)容，還是技法，都要字字露旨，從實(shí)用有效著眼。

（四）生成性原則

板書設(shè)計(jì)是一個(gè)動(dòng)態(tài)生成的過程，板書構(gòu)思，要契合教學(xué)程序，根據(jù)課堂的生成，及時(shí)調(diào)整，展現(xiàn)出一幅動(dòng)態(tài)的教學(xué)流程，也是文本精髓的不斷生成。

總之，板書師教學(xué)設(shè)計(jì)中不可或缺的一部分，對(duì)一節(jié)課起到畫龍點(diǎn)睛的作用，也是大型的正規(guī)的教學(xué)競(jìng)賽中重要的一部分內(nèi)容，說課，微課等形式中，都對(duì)板書設(shè)計(jì)有所要求。作為任課教師一定要重視。

參考文獻(xiàn)：百度文庫 百度百科

2016-10-17 4

第四篇：組織切片技術(shù)

南京農(nóng)大康海泓整理，Email:snai1621@126.com 組織切片技術(shù)注意事項(xiàng)

程序步驟

1、取材

2、固定（固定24h—1W）

3、包埋

石蠟切片：流水沖洗組織塊>>75%酒精1h>>85%酒精1h>>95%酒精1h>>100%酒精（1）1h>>100酒精（2）1h>>二甲苯8-20min>>石蠟2h>>包埋

冰凍切片：固定后的組織>>OCT包埋>>切片或-20度保存；

液氮中的組織>>轉(zhuǎn)入-20度>>OCT包埋>>切片或保存

4、切片

切片>>展片（40~50度）>>貼片>>干燥（37度過夜或者50~60度2h）

5、HE染色

干燥后的切片>>二甲苯（1）10min>>二甲苯（2）10min>>100%酒精(1)1min>>100%酒精(2)1min>>95%酒精1min>>85%酒精1min>>75%酒精1min>>蒸餾水3min>>蘇木精染色30s—5min>>自來水涮洗>>蒸餾水>>75%酒精1min>>85%酒精1min>>伊紅染色>>85%酒精涮洗>>95%酒精1min>>100%酒精(1)1min>>100%酒精（2）1min>>二甲苯（1）10min>>二甲苯（2）10min>>中性樹膠封片

6、免疫組化（ABC法）

（1）干燥后的石蠟或冰凍切片（冰凍切片需要緩慢復(fù)溫）脫蠟至水；

（2）雙氧水（1%濃度左右）封閉內(nèi)源性過氧化物酶；

（3）PBS洗滌3×5min；

（4）5%BSA封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)，不洗；

（5）滴加適當(dāng)稀釋度的一抗；4度孵育過夜或37度2h；（6）同上洗滌；滴加二抗，37度1h；

（7）同上洗滌；滴加ABC復(fù)合物，37度1h；（8）洗滌5遍，每次5min；

（9）配制顯色液（DAB顯色試劑盒），顯微鏡下觀察顯色；（10）切片浸泡于蒸餾水中終止顯色；（11）蘇木精復(fù)染，脫水，封片。

南京農(nóng)大康海泓整理，Email:snai1621@126.com

注意事項(xiàng)

取材

1.組織越新鮮越好，最好于動(dòng)物處死后10~20min完成取材，時(shí)間過久后組織自溶和腐敗會(huì)影響組織形態(tài)。

2.取材組織塊不宜過大，一般為5nm以下，2~3nm為宜。如果試驗(yàn)要求采取大塊組織，最好采樣前注射固定液預(yù)固定或采取灌流固定（比如取腦時(shí)需灌流固定）。

3.取材使動(dòng)作輕柔，避免用力夾、捏和拉扯組織，盡可能保持組織原有形態(tài)。操作時(shí)可用鑷子夾取組織的一個(gè)邊角，避免主要組織損傷。

4.如果是大批量取材，取材時(shí)沒有時(shí)間對(duì)組織塊大小進(jìn)行修正，可將組織（可稍大，但不宜過大）先放在固定液中固定，2~4h后進(jìn)行修塊，即用鋒利的刀片（刮胡刀片）把組織切至適宜大小。注意不能用剪刀等進(jìn)行鈍性分離。5.如果對(duì)不同處理或不同動(dòng)物的組織進(jìn)行比較研究，應(yīng)對(duì)所有動(dòng)物在同一解剖學(xué)位置取材（比如十二指腸距胃3cm處，或空腸距胃10cm處）。

6.取材時(shí)注意組織的不同斷面，可將組織的一面用刀片切平作為標(biāo)示，以便包埋和切片時(shí)選取的斷面正確（比如肌肉組織，應(yīng)區(qū)分好橫斷面和縱斷面）。7.一般情況下宰殺動(dòng)物應(yīng)放血干凈，取材時(shí)除去組織周圍的附屬物，比如筋膜、脂肪等。

8.取得的組織立即固定。冰凍切片組織可先固定后凍存，也可直接凍存，直接凍存一般采取液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)入-20度保存，凍存組織應(yīng)避免反復(fù)凍融，且盡快進(jìn)行切片或用OCT包埋（包埋后可放置較長(zhǎng)時(shí)間）。未包埋的組織在-20度長(zhǎng)期保存的組織會(huì)逐漸脫水（比如肌肉），影響形態(tài)學(xué)觀察。

9.理論上免疫組化的組織采取冰凍切片，一般運(yùn)用4%多聚甲醛固定24~48h后用OCT包埋凍存。但對(duì)于抗原表達(dá)量大且較易檢測(cè)的免疫組化，可以采取石蠟切片，但固定時(shí)間不能過長(zhǎng)，控制在1周以內(nèi)，長(zhǎng)時(shí)間固定會(huì)引起抗原表位的醛基化和抗原表位構(gòu)象變化，導(dǎo)致免疫組化檢測(cè)靈敏度降低。

固定與包埋

1.選擇合適的固定液，原則是在良好固定組織并保持形態(tài)的前提下盡可能的減小對(duì)組織的影響。常用固定液為福爾馬林、4%多聚甲醛和Bouin氏液，其中后兩者最為常用，效果也較好。

南京農(nóng)大康海泓整理，Email:snai1621@126.com 2.固定液需新鮮配制，新配的固定液固定效果較好。3.固定液體積理論上應(yīng)為組織體積的20倍以上。

4.一般組織理論固定時(shí)間為4~24h，即以固定液完全滲透進(jìn)入組織的最短時(shí)間為宜，實(shí)際操作中可延長(zhǎng)至數(shù)天，但一般控制在1周以內(nèi)。

5.如果是冰凍切片，固定后的組織最好及時(shí)用OCT包埋，能更好的維持組織形態(tài)，包埋后的組織可于-20度保存數(shù)月。固定后的組織可用蔗糖溶液脫水，方法為直接將組織置于30%蔗糖溶液中，每天換新鮮蔗糖溶液，2-3天組織在蔗糖中沉底即可。一般來說，先固定，然后脫水，再用OCT包埋效果比較理想。6.冰凍切片可以采取后固定的方法。即采得的組織經(jīng)液氮速凍后直接放入-20度保存，OCT包埋，冰凍切片后用丙酮等對(duì)切片上的組織進(jìn)行固定。但丙酮固定較為強(qiáng)烈，容易發(fā)生掉片。

7.石蠟切片時(shí)，固定后的組織包埋前一般對(duì)組織進(jìn)行洗滌，通常用自來水沖洗，洗掉組織中的固定液，因?yàn)闅埩粼诮M織中的固定液可能對(duì)染色產(chǎn)生影響。洗滌為可選步驟，我們實(shí)驗(yàn)室通常不洗滌，將固定后的組織直接包埋，并不影響HE染色效果。

8.二甲苯透明時(shí)間是影響包埋效果的最關(guān)鍵因素，需根據(jù)組織種類、組織大小、室溫以及二甲苯的新舊程度綜合考量，必要的時(shí)候需要設(shè)置時(shí)間梯度進(jìn)行摸索。此外，組織是否脫水完全、是否浸蠟完全也直接影響包埋效果，原則上在能夠完全脫水和浸蠟的前提下，組織在各溶劑中的浸泡時(shí)間越短越好。

切片

1.切片成功與否很大程度上取決于組織固定和包埋的好壞。

2.切片厚度：HE等組織學(xué)染色一般4~5微米（4微米差不多是石蠟切片的極限），如果切片困難，可適當(dāng)增加切片厚度（20微米以內(nèi)越厚越好切），但切片厚度的增加會(huì)使得細(xì)胞層數(shù)增多，影響觀察和美觀。免疫組化中石蠟切片一般切片5~10微米，冰凍切片大約8~14微米，特別是在檢測(cè)表達(dá)量較少的抗原時(shí)，較厚的切片可以增加陽性物質(zhì)的出現(xiàn)概率。

3.較好的石蠟切片呈均勻連續(xù)狀，沒有空洞和破損，組織完整不碎裂。4.切片角度和刀片新舊程度對(duì)切片效果的影響較大，切片角度視切片機(jī)型號(hào)而異；新刀片容易切出完好的切片。刀片應(yīng)從一段開始使用，發(fā)現(xiàn)刀痕時(shí)逐漸移動(dòng)，以最大限度使用刀片。

5.冰凍切片的主要影響因素有：切片機(jī)箱體溫度（一般為-25度左右），防卷器位置（太往前切不動(dòng)，太往后起不到防卷效果）。

6.對(duì)免疫組化切片而言，需對(duì)玻片進(jìn)行包被（一般為使其帶正電荷，組織帶負(fù)

南京農(nóng)大康海泓整理，Email:snai1621@126.com 電荷，通過靜電吸附增加粘附力），增加其粘附性。包被太淺起不到粘附效果，包被太深會(huì)導(dǎo)致免疫組化非特異性染色。

展片和貼片（撈片）：

1.燒杯中裝蒸餾水，置于水浴鍋中，溫度一般40~45度，溫度太低片子展不開，溫度太高石蠟會(huì)融化。

2.冰凍切片不需要展片，直接將玻片輕靠在組織上，組織便會(huì)自動(dòng)吸附到玻片上。

3.撈片時(shí)選取完全展平的片子撈起，寧缺毋濫。一張玻片上可以貼多個(gè)組織，最后選染色效果好的封片，增加成功率。

4.未包被過的玻片可重復(fù)使用，包被過的玻片貼片后組織很難掉下，不可重復(fù)使用。

干燥：

1.干燥可以讓組織貼的更結(jié)實(shí)。石蠟切片37度干燥過夜，或者45~60度干燥數(shù)小時(shí)。冰凍切片室溫晾干（夏天一般5~10min），但不可涼太干，太干也容易掉片，判定標(biāo)準(zhǔn)為組織表面沒有明顯的液體為宜，如果組織變白說明干燥時(shí)間過長(zhǎng)。

2.干燥后的石蠟切片可放切片盒中室溫保存，如果天氣炎熱可以放置4度保存；冰凍切片于切片盒中密封后置-20度保存，短期內(nèi)試驗(yàn)可以放4度保存。

染色（以HE染色為例）：

1.液體置換要徹底，特別是脫蠟和脫水步驟。

2.伊紅一般用醇溶性配方，蘇木精配方有很多種，如果用氧化汞方法配制使用前要過濾，因?yàn)橐后w表面容易聚集一層金屬離子薄膜，對(duì)染色產(chǎn)生影響。3.新鮮配制的伊紅染色時(shí)間1秒即可，存放時(shí)間長(zhǎng)的染液可以適當(dāng)增加染色時(shí)間。

4.封片時(shí)中性樹膠的量要適度。根據(jù)組織的大小選擇大小合適的蓋玻片，蓋玻片以能覆蓋住組織為前提，越小越好，太大的蓋玻片溶液不平整，顯微鏡觀察時(shí)組織可能不在一個(gè)平面，需要反復(fù)調(diào)整焦距。

5.蘇木精和伊紅染色時(shí)，最好摸索染色時(shí)間，以尋求最合適和漂亮的顏色搭配，不同的組織染色能力有所差異，比如淋巴組織內(nèi)淋巴細(xì)胞較多，細(xì)胞核比較大，染出來可能藍(lán)色居多，肌肉組織中肌顯微和細(xì)胞質(zhì)比例高，染出來紅色

南京農(nóng)大康海泓整理，Email:snai1621@126.com 居多。

6.總體原則是染色寧愿偏淺不要偏深，偏深的染色難以判別細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)。

免疫組化注意事項(xiàng)：

1.免疫組化一般以冰凍切片為主，但石蠟切片也可以做免疫組化。

2.冰凍切片一般采取先固定（4%多聚甲醛），然后用OCT包埋（冰凍包埋）。3.免疫組化步驟繁瑣，時(shí)間較長(zhǎng)，因此用包被過的切片來防止掉片。常用的包埋劑有APES，多聚賴氨酸和明膠等。包被過程相對(duì)簡(jiǎn)單，可購公司的商品包被試劑盒，按照說明書操作。

4.石蠟切片的免疫組化有時(shí)需要抗原修復(fù)。原因：固定液會(huì)對(duì)組織的抗原性產(chǎn)生影響，示抗原表位發(fā)生構(gòu)象變化，可以通過化學(xué)處理和熱處理來還原組織的抗原性。常用的修復(fù)液為枸櫞酸鈉緩沖液，一般采取熱修復(fù)，即把切片放置在緩沖液中然后加熱至沸騰。

5.免疫組化切片厚度一般為8~12微米。6.選擇合適的抗體（單抗、多抗）。

7.預(yù)實(shí)驗(yàn)確定合適的H2O2、封閉液和抗體作用濃度和時(shí)間。8.選用包被過的玻片，動(dòng)作輕柔，防止掉片。9.設(shè)置陽性、陰性和空白對(duì)照。

10.顯微鏡下控制顯色，放置顯色過淺或過深。

11.復(fù)染時(shí)蘇木精濃度可稀釋，時(shí)間縮短，避免染色過深。

12.遇到問題逐項(xiàng)排除，尋找原因。詳細(xì)的問題解決和相關(guān)技術(shù)貼可參照丁香園論壇或生物秀論壇，搜素“免疫組化”可以找到相關(guān)資料。

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溶液配制

固定液

4%多聚甲醛：4g多聚甲醛粉末加入100ml 0.1M PBS，邊加入邊加熱攪拌，滴加0.2M NaOH溶液并60度水浴促進(jìn)粉末溶解，完全溶解后HCl調(diào)PH至7.4，4度保存。

Bouin氏液：75ml 飽和苦味酸溶液，25ml多聚甲醛，5ml冰醋酸；使用前三者混在一起，混勻。

染液

伊紅染液：1%醇溶性伊紅配方為1g伊紅加入到100ml 80%酒精中，溶解。

蘇木精染液：

1.哈里新（Harris）蘇木紫液：甲液：蘇木紫Ig，無水乙醇10ml。乙液：硫酸鋁鉀（或銨）20g，蒸餾水200ml，加溫溶解。甲、乙二液分別溶解后混合，加熱煮佛，沸后去火，待溶液不翻騰時(shí)即加入氧化汞0.5g（此時(shí)有大量氣泡生成，故容器宜大，以免液體溢出）。然后染液迅速冷卻，冷卻后過濾，即可位應(yīng)用。用時(shí)每100ml加冰醋酸4ml；

2.邁爾（Mayer）蘇木紫液：將蘇木柴0.1g放入蒸餾水100ml中煮沸溶解，再加入硫酸鋁鉀5g，和碘酸鈉0.02g，攪動(dòng)直到全部溶解，加入水合氯醛5g和枸椽酸0.1g，加煮沸5min，冷卻、過濾，放置過夜，即可應(yīng)用。染色時(shí)間約10~20min；

3.歐立區(qū)（Ehrlich）蘇木紫：將蘇木紫2g溶于無水乙醇100ml中；將硫酸鋁鉀15g溶于蒸餾水100ml中，加入甘油100ml，將二液混合，最后加入冰醋酸10ml，充分混勻后，盛于無色小口瓶?jī)?nèi)，暴露于日光下，使其自然成熟，約需3個(gè)月。染色時(shí)間約5~20min。此液貯存愈久，染色力愈強(qiáng)。若在其中加入碘酸鈉300mg，使人工成熟，配成后即可應(yīng)用；

4.卡拉茲（Carrazzi）蘇木紫：將蘇木紫0.5g溶解于甘油100ml中，將硫酸鋁鉀25g溶解于蒸餾水350ml中溶解后將二液慢慢混合，并充分搖勻。將碘化鉀0.1g放于蒸餾水50ml中，加微溫溶解，然后加入蘇木紫液中，充分搖勻，翌日可用。

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免疫組化

0.3%~1%雙氧水：

商品化30%雙氧水溶甲醇稀釋到適當(dāng)濃度。

1~5%BSA（羊血清、脫脂乳）： 0.01M PBS配制。

Triton-PBS：

100微升Triton-100加入到100ml 0.01PBS中，混勻。

第五篇：組織切片必看

1.組織的取材

取材時(shí)要注意及時(shí)快速固定，避免剪刀鑷子損傷組織，組織要取全。全盤考慮進(jìn)行病理切片的組織類型，病變可能累及的部位，組織包埋需要的剖面。2.組織的固定

在組織病理學(xué)中，不管是組織切片乃至電鏡還是大體標(biāo)本的保存，都必須進(jìn)行及時(shí)的適當(dāng)?shù)暮陀行У墓潭?。組織只有經(jīng)過固定，才能完成隨后的一系列的制作，直至切片的最后完成。

固定的作用：從組織學(xué)的角度其簡(jiǎn)單的定義是，保持細(xì)胞、組織的固有形態(tài)和結(jié)構(gòu)，使之盡量保持細(xì)胞、組織的固有形態(tài)和結(jié)構(gòu)，而從免疫組化技術(shù)的角度，固定的作用不僅是使細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)凝固，盡量減少或終止外源性酶和內(nèi)源性酶的反應(yīng)；防止細(xì)胞的自溶，以免使抗原擴(kuò)散至組織間質(zhì)；以保持組織的固有形態(tài)和結(jié)構(gòu)；更重要的是保持組織或細(xì)胞的抗原性，不但要使抗原不導(dǎo)致失活，而且不使抗原發(fā)生彌散的現(xiàn)象，才能在免疫組化染色時(shí)，不產(chǎn)生過深的背景，影響對(duì)陽性物的判斷。

固定的目的

①能防止細(xì)菌的腐蝕和組織的自溶。細(xì)菌無處不存在，它們隨時(shí)都可污染腐蝕未經(jīng)處理的組織。固定液可以固定任何蛋白質(zhì)，凡有生命的東西，都由蛋白質(zhì)組成，蛋白質(zhì)被固定，生命就停止，細(xì)菌也就失去了活力。另者，在日常生活中，人們?？膳龅竭@樣的問題，一塊肉不經(jīng)處理放了幾天后就會(huì)變質(zhì)，這是為什么呢？除了細(xì)菌參與外，其本身也是很重要的。因?yàn)榻M織離體后，供應(yīng)這此組織的血液隨之消失，細(xì)胞缺氧，細(xì)胞內(nèi)溶酶體膜的結(jié)構(gòu)受到破壞，破壞后釋放出溶酶體酶，日常生活中常碰到的肉變質(zhì)，就是細(xì)菌污染加組織自溶的結(jié)果。

②保存細(xì)胞固有的物質(zhì)，能凝固或沉淀細(xì)胞內(nèi)或組織液，糖元等，使細(xì)胞或組織基本上保持與生活時(shí)的物質(zhì)一樣。細(xì)胞的固有物質(zhì)，即細(xì)胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、高爾基器、溶酶體、過氧體，細(xì)胞骨架，組織液，抗原、糖元等。這些物質(zhì)，如果不將其及時(shí)固定，是很容易喪失的，尤其是溶酶體，很容易受到破壞，因此應(yīng)特別小心。

③使組織硬化，便于切塊。剛離體的組織，除了胃組織以外，都是柔軟的組織，尤其是胃腸道的組織，如果在沒有固定時(shí)就取材，效果就很差，不是取材不規(guī)整，就是厚薄不均，粘膜和肌層很容易分開，因此，要取得規(guī)整標(biāo)致的材料，就必須將組織徹底固定，再行取材。

④對(duì)某些具有傳染性的標(biāo)本，能防止疾病的擴(kuò)散。病理標(biāo)本、種類繁多，成份復(fù)雜，各種病例都有，具有傳染性的病種也不少，如結(jié)核、肝炎、麻風(fēng)、性病等等。對(duì)于此類標(biāo)本，應(yīng)進(jìn)行徹底的固定后，再行取材，如結(jié)核球，固定時(shí)間應(yīng)在3-5天。

⑤可增強(qiáng)染色的作用。組織經(jīng)過及時(shí)的固定，最終可見到切片有鮮艷的染色，而些時(shí)如果有一批未經(jīng)及時(shí)固定的組織，將看到最終的結(jié)果是，核染色不清楚，灰淡色，由此可得結(jié)論，固定可以增強(qiáng)染色的作用。

固定的注意事項(xiàng)：

①組織固定越新鮮越好。組織一經(jīng)離體，就能及時(shí)地固定，這是最好的。根據(jù)實(shí)驗(yàn)，如果要獲得某些酶的染色，固定最好在組織離體后30秒至1分鐘。對(duì)于其它達(dá)不到些要求是越快越好。原則上動(dòng)物死亡后半個(gè)小時(shí)內(nèi)取完并及時(shí)固定組織。

②組織固定，組織塊不宜過大。凡是需要固定的組織，都不應(yīng)該太大太厚，這是因?yàn)樗械墓潭ㄒ捍┩噶Σ粔驈?qiáng)，浸透度不夠快的緣故。如果較大厚的組織，不經(jīng)處理就進(jìn)行固定，那么待固定液進(jìn)入至中間對(duì)可能這些組織早就發(fā)生自溶了。因此，對(duì)于較大的組織，必須先進(jìn)行處理，切成制片材料再行固定，這是最佳的處理方法，如遇到胃腸的器官，則應(yīng)將其剪開，放平后，再行固定，若非特急病例，最好在固定后才取材，因這類組織、粘膜和肌層容易分開，沒固定時(shí)，難以取得最佳制片材料，對(duì)于產(chǎn)酶類的器官如肝、腎、脾等，更要處理好，否則更容易出現(xiàn)自溶現(xiàn)象。

③對(duì)不同類型的組織應(yīng)適當(dāng)合理地選擇固定液。固定劑的種類繁多，成份復(fù)雜，對(duì)組織的作用不盡相同。在我們的日常工作科研中，對(duì)于組織的固定，應(yīng)有針對(duì)性的選擇，方能獲得滿意的效果。對(duì)于腎，睪丸等泌尿系統(tǒng)和新生仔鼠應(yīng)選擇Bouin氏固定液。免疫組化可以選擇多聚甲醛和中性緩沖甲醛；我病理室一般選擇中性緩沖甲醛，它可以兼顧常規(guī)染色和免疫組織化學(xué)。

④組織固定，時(shí)間不宜太短，也不宜太長(zhǎng)。固定時(shí)間應(yīng)根據(jù)取材大小、性質(zhì)以及類型有關(guān)，視具體情況而定；時(shí)間太短，就不能很多的固定組織，因?yàn)椴还芙M織大小，固定液浸入組織之中，都需要有一定的時(shí)間，時(shí)間太短，就會(huì)影響組織固定的效果，對(duì)以后一系列關(guān)系的處理都有影響，切片質(zhì)量難以保證，固定時(shí)間太長(zhǎng)，也不好。組織長(zhǎng)時(shí)間的固定，福爾馬林會(huì)產(chǎn)生一種酸，影響核的染色。對(duì)于固定很長(zhǎng)時(shí)間的陳列性標(biāo)本制片后切片染色不鮮艷，顯得非常陳舊。另外，長(zhǎng)時(shí)間的固定往往會(huì)出現(xiàn)福爾馬林色素，尤其是造血器官的標(biāo)本，更應(yīng)注意。固定時(shí)間過長(zhǎng)，可降低抗原的活性。一般小鼠組織固定24h即可。

⑤固定液的量要充分。固定液量的足夠與否決定著組織固定的成敗。一般固定液和組織體積比為10：1~20：1之間。

⑥特殊病例或特殊物質(zhì)應(yīng)選擇特殊的固定液。一般的病例標(biāo)本，如沒特殊的要求，都可以應(yīng)用甲醛配成的各種固定液來固定。但是，如果要顯示狂犬病毒的包含體時(shí)，應(yīng)用上述的的固定液就不行了，必須采用丙酮來固定，顯示糖元，可選擇無水酒精或丙酮來固定組織。

3.常規(guī)石蠟切片制片過程

組織經(jīng)系列酒精的脫水，經(jīng)透明劑的作用，經(jīng)熔化的石蠟的浸漬，包埋后所切成的切片稱為石蠟切片。制片過程的每一步每一環(huán)節(jié)處理不好都會(huì)影響切片質(zhì)量。

組織脫水：

把含于組織內(nèi)或細(xì)胞內(nèi)的水份用脫水劑把其置換出來的過程稱組織脫水。不管是正常的組織，還是有病變的組織，都含有不同程度量的水分。據(jù)測(cè)定，人體的物質(zhì)組成約含水55~67%，蛋白質(zhì)15~18%，脂類10~15%，無機(jī)鹽3~4%及糖類1~2%[14]。如果不把這些水分脫去，石蠟切片將無法進(jìn)行，因?yàn)槭灪退荒芑旌显谝黄穑猿ソM織中的水分成為制片中的關(guān)鍵，至今為止，國內(nèi)常用的都是酒精。因它不管在什么樣比例的情況下都能和水混合，所以它可以慢慢地將水從組織中置換出來。酒精脫水力強(qiáng)，對(duì)組織又有硬化和易脆的不良影響。在使用時(shí)，通常是從低濃度至高濃度，濃度系列通常是70%、80%、90%、95%和100%，組織經(jīng)過這一系列處理后，基本可達(dá)到脫水的目的。

每一步的組織脫水都需要控制好脫水時(shí)間，一般根據(jù)組織塊大小和組織類型而定。短了脫水不干凈，長(zhǎng)了會(huì)使組織切片時(shí)易脆。組織的透明：

組織脫水后，要經(jīng)過一個(gè)浸蠟前的中間溶劑透明過程；才能進(jìn)行浸蠟。透明的目的：組織經(jīng)脫水后、浸蠟前必須經(jīng)過某些既能與脫水劑相混合又能溶解石蠟的中間溶劑處理。組織在中間溶劑時(shí)，組織間隙內(nèi)存留的脫水劑完全為中間溶劑所取代時(shí)，組織就呈現(xiàn)透明狀態(tài)，此時(shí)即可進(jìn)行浸蠟。透明液多采用二甲苯，組織經(jīng)無水乙醇脫水后轉(zhuǎn)入二甲苯透明，組織的大小、厚薄不同，透明時(shí)間也不同。透明時(shí)間短了，透明不完全，導(dǎo)致切不了片，透明時(shí)間長(zhǎng)了，透明過度，導(dǎo)致切片易粉易碎。組織浸蠟：

用于浸蠟的石蠟最好是熔點(diǎn)稍低（56～58℃），低溫浸蠟對(duì)保存組織細(xì)胞內(nèi)的抗原免疫活性，避免組織收縮和變硬變脆有幫助，以盡量清除二甲苯蠟滲透到組織中起支撐作用，切片時(shí)才能把完整的組織和蠟一起完整切下來。不同大小和厚薄的組織浸蠟時(shí)間有所不同，一般為1～3小時(shí)。浸蠟溫度過高，浸蠟時(shí)間過長(zhǎng)或不夠均可導(dǎo)致組織收縮，變硬變脆，難以切出理想切片。組織包埋：

組織經(jīng)浸蠟后即可進(jìn)行包埋。包埋時(shí)，包埋石蠟的溫度要比組織高（約3~5℃），否則包埋冷凝后組織與包埋石蠟分離，特別是在冷天包埋時(shí)，動(dòng)作更要迅速，否則容易導(dǎo)致組織與石蠟融合不好，影響切片。包埋時(shí)把組織最大最平切面或所需的病灶切面向下，對(duì)皮膚、腸管和囊壁等層次清楚的組織其切面應(yīng)包含有各層組織。組織包埋要選擇所需要的組織切面。組織切片：

組織切片厚薄要適宜，薄的切片細(xì)胞不會(huì)重疊，易于觀察。切片的厚度應(yīng)為3～4μ，組織蠟塊過硬，切片刀或蠟塊沒固定好，會(huì)出現(xiàn)跳刀、切片成一截厚一截薄的現(xiàn)象。優(yōu)質(zhì)的組織切片要求切片較薄，平整，無刀痕，皺褶。切片太厚或呈波浪狀厚薄不勻。貼片烤片：

烤片時(shí)間短，會(huì)造成染色時(shí)切片從載玻片上脫落或脫蠟不凈，染的切片會(huì)著色淺、不上色或灰染；烤片時(shí)間長(zhǎng)，會(huì)造成對(duì)組織的損傷。染色：

染色染色的程度包括脫蠟、浸水、染色、分化、促藍(lán)、脫水、透明等過程。切片經(jīng)過脫蠟至水，HE染色后，要徹底脫水透明，才能用中性樹膠封蓋。如果脫水不徹底，封片后呈白色霧狀，鏡下觀察模糊不清，且容易褪色。要求組織結(jié)構(gòu)清晰，色彩鮮艷，細(xì)胞核/細(xì)胞質(zhì)對(duì)比分明。

組織病理切片質(zhì)量的影響因素

2009-08-19 編輯： 【打印】 【關(guān)閉】