第一篇：冰凍切片技術(shù)經(jīng)驗(yàn)總結(jié)

冰凍切片制作技巧

1.從鋒利的刀片開始

我發(fā)現(xiàn)使用新的鋒利的刀片時(shí)常常做出高質(zhì)量的片子。我覺(jué)得在醫(yī)療場(chǎng)合中某些盡量省錢的做法顯得有些因小失大。一般我對(duì)每位患者的標(biāo)本都使用一組新的刀片，當(dāng)片子的質(zhì)量開始下降時(shí)，我會(huì)立刻更換刀片。某些組織如質(zhì)地較硬的膠原和鈣化組織會(huì)使刀片很快變鈍，因此，經(jīng)常更換刀片顯得很有必要，有時(shí)候我在切片過(guò)程中要連續(xù)更換2-3次刀片。

2.坐著還是站著

我切片時(shí)總是坐在一張凳子上。要學(xué)會(huì)把刷子作為一種便捷的輔助工具來(lái)操作，從而精細(xì)地控制顯微厚薄程度的片子。切片時(shí)俯身彎腰，頸部過(guò)伸的姿勢(shì)有些不妥，要盡量處于放松和舒適的姿勢(shì)以便能最大程度控制你的左手。

3.刷子

我是一位刷子的使用者。我相信要想切好片子首先學(xué)會(huì)使用刷子。刷子的作用就在于粘住片子并把片子弄到臺(tái)子上。冷凍的片子會(huì)自發(fā)的卷縮并從刷子上脫離下來(lái)，因此，我使用一把有硬毛、夾取面寬的刷子。我發(fā)現(xiàn)來(lái)自中國(guó)的野豬毛十分堅(jiān)硬，非常管用。你可以花3美元從工藝店買一把1/4英寸長(zhǎng)的#2號(hào)扁平無(wú)色的刷子，把毛削成一個(gè)角度。由于是個(gè)有角的頭端，加上握持刷子成一定的角度，這樣刷子與組織接觸時(shí)就會(huì)象掃帚一樣的平。我不能理解為什么有人使用脆弱的駱駝毛刷子，組織片很容易從這些柔軟的毛上掉下來(lái)。

4.握持刷子

左手象拿筆一樣握持刷子，將第五指輕壓于臺(tái)面上以穩(wěn)定握筆的手(或根據(jù)手和切片機(jī)尺寸的大小置于你感覺(jué)合適的地方)，這樣可以保證操作者動(dòng)作的靈活及可控性。我把刷子削成一個(gè)角度，大致與左手握持刷子的角度相同，這樣使刷子平著接觸組織的1/4。

5.搖柄的旋轉(zhuǎn)

以連續(xù)均勻的力量轉(zhuǎn)動(dòng)切片機(jī)的搖柄，且要毫不猶豫。我看到很多冰凍切片者手握著刷子在開始切片時(shí)總要停一下，緩慢的抓取組織，然后再開始轉(zhuǎn)動(dòng)搖柄。依我的經(jīng)驗(yàn)看來(lái)，這種動(dòng)作增加了起始切片假象的可能，會(huì)使片子的厚度不均勻，也增加了處理脂肪類組織的難度。我切片時(shí)，象前面所說(shuō)的那樣手握刷子，以一種連續(xù)的動(dòng)作抓取組織，這個(gè)動(dòng)作與刀片接觸組織同時(shí)開始并貫穿于整個(gè)過(guò)程。

6.刷子的移動(dòng)

組織塊移向刀片時(shí)刷子也要同步地向下移動(dòng)，當(dāng)組織塊剛好接觸刀片時(shí)刷子輕輕停在其底部2mm處并迅速抽離。正是刷子的向下移動(dòng)使你能連續(xù)地抓取組織，當(dāng)開始的幾毫米組織穿過(guò)刀片時(shí)便有自發(fā)卷曲的現(xiàn)象，這時(shí)，運(yùn)動(dòng)中的刷子立刻粘住其游離的邊緣部分并水平地拖向切片者。刷子的運(yùn)動(dòng)路徑是一個(gè)朝下的“肘”形，然后再朝向你自己，連續(xù)不斷。但要注意有時(shí)候把組織壓向臺(tái)面時(shí)會(huì)使組織粘在臺(tái)面上，可能會(huì)導(dǎo)致碎片，應(yīng)盡量避免。當(dāng)然預(yù)先將組織包埋起來(lái)可以使刷子不用接觸到組織，切片也容易多了。

7.貼片

可以從切片機(jī)的臺(tái)面上也可直接從組織塊面粘貼組織片，我一般采用前者。片子切好后，手持玻片在片子上方，向下以一個(gè)角度粘住片子的一角，在靜電作用下片子會(huì)吸附在玻片上并迅速融化。當(dāng)然在周圍涂一些包埋物對(duì)貼片有利，這種多余的包埋物可以保護(hù)片子的邊緣免受皺縮的損壞。有時(shí)候碰到貼片困難，我會(huì)在切到最后2mm包埋物的時(shí)候停下來(lái)，讓片子留在組織塊上，然后倒轉(zhuǎn)搖柄，使組織塊退離刀片，再用刷子從邊緣把組織片攤平，這樣就可以從組織塊面貼片了，這對(duì)卷曲的片子或者脂肪組織非常管用。

8.快速固定

我右手轉(zhuǎn)動(dòng)搖柄也同時(shí)拿著玻片，片子一切好，立刻粘起片子并將它浸沒(méi)于固定液中。固定液需置于方便夠到的地方，我一般將染色架放在染色缸的旁邊，先將片子置于95%的乙醇溶液中固定，然后插于染色架上。如果組織固定延遲會(huì)出現(xiàn)風(fēng)干的假象，我的經(jīng)驗(yàn)是組織片還在切片機(jī)的臺(tái)面時(shí)，風(fēng)干效應(yīng)很小，當(dāng)組織片粘在有溫度的玻片上時(shí)就會(huì)出現(xiàn)明顯的風(fēng)干假象，表現(xiàn)為核的細(xì)節(jié)丟失及胞漿液的溢出。下面幾張圖片是延遲15秒固定和立刻固定的相同組織的比較，差異非常明顯。

9.切片的厚度

對(duì)于一般的手術(shù)病理我推薦切6um厚，這種厚度使染色更加飽滿，層次清晰，病理學(xué)家通常在2x 和 4x的放大倍數(shù)下可以獲得更多的信息。太薄的片子在這種放大倍數(shù)下顯得蒼白，容易忽略一些細(xì)節(jié)。6um的片子可以有更多的時(shí)間去避免風(fēng)干假象，也會(huì)減少冰晶所造成的細(xì)胞核空洞。當(dāng)然特殊情況下可能需要更厚或更薄的片子。

10.為什么會(huì)掉片

我不能確定組織片粘附到玻片的具體機(jī)制，但我相信可能與組織內(nèi)的液體與玻片發(fā)生分子交聯(lián)有關(guān)。下面我例出幾種染色過(guò)程中組織片脫落的情況： 1）本身非常干燥或過(guò)度脫水的組織；

2）組織片的周長(zhǎng)與面積比過(guò)大，象細(xì)條形的組織容易受染色缸內(nèi)液體渦旋應(yīng)力的影響而脫落，同樣包括薄的纖維囊腫及不規(guī)則的壞死組織，太厚的組織也不例外； 3）返藍(lán)用的氨水濃度太高；

4）少數(shù)情況需要使用100%的乙醇固定；

5）一張玻片貼多個(gè)片子時(shí)，片子周圍的包埋物相互重疊。

組織塊的準(zhǔn)備

1.調(diào)整好組織與刀片的方向

這是冰凍切片準(zhǔn)備中極為重要的方面，使用一些包埋物可以使這項(xiàng)工作變得簡(jiǎn)單，在我的工作中我總結(jié)出一些經(jīng)驗(yàn)可供參考。

a.脂肪放在最后切。脂肪由于硬度不夠，對(duì)絕大多數(shù)組織均合適的溫度卻切不好脂肪組織，如果一刀下去，組織中的脂肪先接觸刀片，就會(huì)破碎并使整個(gè)片子損壞。如果脂肪最后接觸刀片，則切片過(guò)程不受干擾。最糟糕的情況是脂肪部分先接觸刀片而沒(méi)有包埋物的保護(hù)，包埋物可以給片子提供一個(gè)起始的緩沖，如果沒(méi)有包埋，脂肪就會(huì)切碎并把整個(gè)片子破壞。當(dāng)切片過(guò)程中由于脂肪的出現(xiàn)而影響質(zhì)量時(shí)，我要么把搖柄轉(zhuǎn)回去盡量避免，要么把脂肪挖出來(lái)。

b.組織與刀片垂直或成角是關(guān)鍵。讓我們假設(shè)組織由起始端、中間部分及末尾端三部分構(gòu)成，起始端容易卷縮，或受到刷子的損害，還可能由于操作者的猶豫而引起片子的厚薄不均，這些都增加了假象的風(fēng)險(xiǎn)。末尾端在貼片時(shí)容易拉長(zhǎng)，最好的是中間部分，最不可能出現(xiàn)假象，并且組織學(xué)上最干凈，這是片子中最理想的部分。

非常堅(jiān)實(shí)的組織容易產(chǎn)生橫皺，切片時(shí)應(yīng)包埋成角且盡可能的加溫。成角包埋就像坐著船沖浪一樣，如果你直線行駛，就會(huì)承受波浪線上最大的沖擊，如果成角行駛，波浪線就會(huì)拉伸，所受的顛簸也會(huì)減小。跟公路上的減速脊一樣的原理。

上皮和粘膜貼附的組織如皮膚，胃腸，膀胱，子宮，頸部等，應(yīng)當(dāng)使上皮面垂直于刀片。

2.組織塊的溫度

任何組織都有一個(gè)理想的切片溫度，在此溫度下切片，組織片以平滑均一的形式流過(guò)刀片，幾乎沒(méi)有卷縮。當(dāng)溫度、組織類型、刀片均處于理想狀態(tài)時(shí)，切片十分流暢，幾乎不用刷子。如果溫度太低，片子容易卷曲和破碎；如果溫度太高，片子就會(huì)皺成一堆。如果需要加溫，只需要把大拇指置于組織塊面幾秒鐘；如果需要降溫，可以使用機(jī)子的精確低溫包埋系統(tǒng)，簡(jiǎn)單的做法就是把過(guò)凍的凍臺(tái)放在組織面上幾秒鐘，大多數(shù)的冰凍切片機(jī)都有一種熱吸收器可以使用。

3.組織塊的填涂——基本的修復(fù)

填涂可以解決組織塊自身的缺陷，下面我舉幾個(gè)具體的例子。

扁平包埋組織的填涂 包埋扁平的組織時(shí)，只有一層薄薄的包埋物貼附在底面，而且包埋物會(huì)輕微地收縮與組織塊分離，如果想以最小的休整開始切片，那么收縮的空間必須填涂上包埋物，如果不填涂，切片時(shí)組織便會(huì)與包埋物分離，從而很難獲得一張完整的片子。下面這個(gè)簡(jiǎn)單的技巧可以使你獲得一個(gè)整齊的組織面。

針頭的移除

在工作中經(jīng)常會(huì)收到布滿針頭的標(biāo)本，有時(shí)候針頭會(huì)穿過(guò)整個(gè)組織，導(dǎo)致刀片的損壞并使片子一分為二，下面有一種簡(jiǎn)單的解決辦法。

縫線的移除

同樣的方法移除組織塊中的縫合線

挖鑿的技術(shù)

當(dāng)組織塊中某些部分不需要或阻礙我們獲得高質(zhì)量的切片時(shí)，我們就可以將它挖除掉。最好的例子就是脂肪組織干擾切片，常見于切除的淋巴瘤用于檢查是否癌轉(zhuǎn)移。如果脂肪先于組織塊中的其他部分接觸刀片，你首先可以試著轉(zhuǎn)動(dòng)組織塊，如果不行，就可以將它挖掉，然后用包埋物填充。

學(xué)會(huì)看片子

這里指的是片子滑過(guò)刀片時(shí)就要辨別出質(zhì)量的好壞，如果到鏡下才發(fā)現(xiàn)片子的缺陷那就無(wú)法挽救。

1.觀察片子的厚薄

盡管冰凍切片機(jī)可以設(shè)置厚度，但人為辨別片子的厚度是否合適仍然很重要。片子太薄看起來(lái)象半透明的鏡紙，片子太厚看起來(lái)混濁、柔性差，對(duì)我來(lái)說(shuō)，5-6um的片子較合適，象一張薄的打印紙。

2.片子破裂

這種假象往往是組織塊冷凍過(guò)度所致，可以通過(guò)升溫來(lái)解決，含水量多的組織切片很容易破裂，必須升高到一個(gè)合適的溫度使裂開程度降到最小。水腫或血液組織經(jīng)常有這種問(wèn)題，活檢的腦組織也很明顯。下面的片子來(lái)源于腎腫瘤，含水量豐富，破裂也比較明顯，我覺(jué)得水性的腫瘤組織在常規(guī)溫度下冷凍將會(huì)變得異常的堅(jiān)硬。

我覺(jué)得組織破裂的過(guò)程同一塊濕布結(jié)冰一樣的道理，當(dāng)你用刀去挑這塊濕布時(shí)它會(huì)自然彎曲，當(dāng)濕布已經(jīng)結(jié)冰時(shí)刀會(huì)將冰片弄裂。下面有6張片子，上面的3張破裂很明顯，底部的3張很輕微，你必須仔細(xì)看才能發(fā)現(xiàn)，如果在切片時(shí)你集中注意力，你能感覺(jué)到甚至聽到碎裂的聲音。

3.片子上的條紋

垂直于刀片的細(xì)條紋為刀片缺口所致，這往往是切到鈣化組織、針頭或縫線的結(jié)果。寬條紋，組織破碎或突然無(wú)法解釋的切片困難往往意味著組織粘在刀片下面了，這在脂肪組織比較常見，這時(shí)刀片需要取下來(lái)清洗干凈，注意清洗刀片時(shí)不要傷到自己。

4.波浪線樣的橫皺

這是切片機(jī)零件松動(dòng)的征象，可能需要修理，切片時(shí)刀片有移動(dòng)或支撐刀片的機(jī)子有移動(dòng)時(shí)，往往有這種規(guī)則的條紋出現(xiàn)。為了獲得干凈整齊的片子，所有固定刀片、刀架、支撐臺(tái)、支撐栓子及切片機(jī)的旋鈕、螺釘、軸承都必須上緊，并且不帶有垃圾殘骸，支撐臺(tái)或刀片下面有一點(diǎn)包埋物都會(huì)影響切片的質(zhì)量。

脂肪組織的處理

脂肪組織無(wú)疑是冰凍切片者的絆腳石，道理很簡(jiǎn)單脂肪不會(huì)結(jié)冰，把溫度降低讓脂肪變硬可以切出較薄的片子，但是這個(gè)溫度對(duì)同一組織中的其他成分來(lái)說(shuō)顯得太低而不合適切片，當(dāng)脂肪破碎影響切片時(shí)這個(gè)問(wèn)題就變得明顯，下面是一些我的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)。

1.盡可能的削掉不需要的脂肪組織

當(dāng)我準(zhǔn)備切淋巴結(jié)時(shí)，我會(huì)先檢查一遍，小心翼翼地除掉表面及髓內(nèi)的脂肪，結(jié)內(nèi)的脂肪用解剖刀刮擦掉，被膜線附近的脂肪用刀切除，這樣就不需要切開整個(gè)淋巴結(jié)被膜。有人會(huì)說(shuō)，我把一些組織去掉后，可能導(dǎo)致漏判一些陽(yáng)性的淋巴結(jié)，但我的經(jīng)驗(yàn)是好的干凈的片子比含有太多脂肪的差片子更容易獲得陽(yáng)性的結(jié)果。當(dāng)你在休整組織或切片的過(guò)程中脂肪組織意外出現(xiàn)時(shí)，你也可以使用前面的挖鑿技術(shù)。

2.調(diào)整組織塊的方向使脂肪最后接觸刀片

切片時(shí)盡量避免脂肪先接觸刀片，因?yàn)橹緯?huì)脫離包埋物，在切片上留下一個(gè)洞，如果不能避免，也要在其周圍加上包埋物，讓包埋物先接觸刀片。

3.保證刀片、臺(tái)面的干凈及組織塊的冷凍程度

切片機(jī)的臺(tái)面和刀片必須保持干凈，假如你弄碎了一張片子必須即時(shí)用一塊干紗布清理干凈，但要防止刀片割手，如果你發(fā)現(xiàn)切出來(lái)的片子有條紋或者堆積成束，可能是組織粘著在刀片的下方了，必須除掉刀片上的組織，并將刀片清理干凈。

組織塊越冷就越容易切脂肪，只是其他非脂肪組織就變得堅(jiān)硬難切，同時(shí)水性的組織會(huì)裂開，這就有必要在切片溫度的最冷端和最溫端取一個(gè)二者兼顧的中間值，以使脂肪和非脂肪組織都能切好。我一般將組織塊凍在-24度，可以獲得滿意的結(jié)果，冷凍噴霧劑有用，但要注意先清掉切片機(jī)內(nèi)的污穢。

4.靈活地轉(zhuǎn)動(dòng)搖柄而不猶豫

假如組織塊是脂肪和結(jié)締組織的混合物，那要好切于純脂肪組織，有時(shí)候按照我前面所講的技巧來(lái)做，片子會(huì)出乎意料的好。用運(yùn)動(dòng)的刷子快速粘住組織片并把它拖上臺(tái)面，不要把刷子和組織片壓上臺(tái)面，以免粘在一起使切片完全中斷。同樣，好的刀片也很重要，如果你能用刷子敏捷地做出這套動(dòng)作，那你肯定也能對(duì)脂肪組織切出理想的片子，脂肪在片子上會(huì)留下空的間隙，但它們之間的纖維條卻保存完好。下面這塊乳腺癌及其周圍有數(shù)毫米覆蓋著墨水的脂肪組織，假如你調(diào)整好組織塊的方向使脂肪邊緣垂直于刀片，腫瘤組織就切得好，脂肪切片的角度會(huì)有變動(dòng)，也會(huì)留下空隙，但總有一條墨跡線指示著邊緣的所在。很多時(shí)候我都用這種方法來(lái)區(qū)別腫瘤和脂肪組織。

5.試著對(duì)脂肪過(guò)多的組織切厚些

厚的片子對(duì)閱讀薄片上的細(xì)節(jié)也是一種輔助，厚片可以通過(guò)各種方法獲得，我先試著按一下切片機(jī)上的精細(xì)前進(jìn)按鈕，如果組織塊保持完整，我繼續(xù)嘗試按一下粗前進(jìn)按鈕，這樣會(huì)切出很厚的片子。你也可以調(diào)節(jié)機(jī)子的厚度刻度盤，或者讓搖柄轉(zhuǎn)兩次，先向前1/4圈，再向后，再向前，采用這些技巧會(huì)切出厚度不一的片子。如果你連續(xù)均與地轉(zhuǎn)動(dòng)搖柄并配合使用刷子，你最后會(huì)在玻片上貼出良好的片子，后面的固定和染色還是一樣的，只是時(shí)間可能要加倍或翻兩番，染液中的片子輕拿輕放，不要?jiǎng)×覕噭?dòng)。費(fèi)盡全力后最后回報(bào)給你的是一張有三維立體感染色優(yōu)良的片子，而且脂肪組織也變得相當(dāng)?shù)耐该髑逦?，你可以看到沿各個(gè)方向走行的毛細(xì)血管，我還可以幸運(yùn)地識(shí)別非脂肪部分的結(jié)構(gòu)，這種用墨跡標(biāo)記組織邊緣的方式包含于整個(gè)組織面，有助于解讀脂肪邊緣有缺損的薄片，粉刺癌中高度惡性的細(xì)胞核和壞死同樣可以識(shí)別。在切脂肪組織的過(guò)程中，如果你連做了兩三次而沒(méi)做好，你可能會(huì)耗盡了一些寶貴的組織標(biāo)本，可以在切那些乳腺癌組織之前用正常的脂肪練練手。

冰凍切片的局限 1.時(shí)間的限制

確實(shí)在冰凍切片室經(jīng)常受到快速出結(jié)果的壓力，我的經(jīng)驗(yàn)是欲速則不達(dá)，急躁和慌亂容易出錯(cuò)。我們最好的辦法就是樹立自信，良好的態(tài)度及教育外科醫(yī)生，受到加快制片的催促時(shí)應(yīng)當(dāng)學(xué)會(huì)從各方面抵制壓力，假如你是一位專業(yè)的受過(guò)良好訓(xùn)練的冰凍切片家，從切片到染出一張片子只需要幾分鐘，如果你對(duì)組織的處理很粗糙，這個(gè)過(guò)程可能要幾分鐘到十分鐘，碰到比較大的復(fù)雜的組織需要多重染色則需要的時(shí)間會(huì)更多，對(duì)病理學(xué)家來(lái)說(shuō)，閱片需要幾秒到數(shù)十秒的時(shí)間，有時(shí)候需要搜尋一些細(xì)小的線索，翻閱書籍，或向同行咨詢等，所需時(shí)間會(huì)更多?？紤]到外科醫(yī)生的處境，我們必須動(dòng)作迅速，但是當(dāng)所做的結(jié)論會(huì)更改手術(shù)的進(jìn)程時(shí)，我們會(huì)顯得格外謹(jǐn)慎。我們會(huì)要求提供患者的詳細(xì)資料以便得到正確的答案，即使耽誤幾分鐘，總比重做手術(shù)或提供錯(cuò)誤的結(jié)論所付出的代價(jià)小很多，如果連續(xù)碰到幾例患者，或復(fù)雜的病例，多個(gè)標(biāo)本，那我們只有尋求幫助，當(dāng)然，在手術(shù)不過(guò)急的依賴冰凍切片的結(jié)果時(shí)，這些事情盡量不做。不要粗糙地準(zhǔn)備和閱讀片子，這是最可能出錯(cuò)的地方，同時(shí)，也要識(shí)別超出你個(gè)人能力的處境，很多需要尋求外界咨詢的場(chǎng)合，我象一根樹樁一樣站在那里閱片，幾分鐘都無(wú)法得出結(jié)論，就象看到一只從來(lái)沒(méi)有在后院出現(xiàn)過(guò)的老虎一樣。這個(gè)時(shí)候我會(huì)不顧一切的尋找就近的幫助，并且告訴我的外科醫(yī)生要耐心的等待。2.特殊染色的局限

這個(gè)問(wèn)題討論起來(lái)很難，我們只能面對(duì)，當(dāng)今時(shí)代如果沒(méi)有免疫過(guò)氧化物酶染色和基因突變的檢測(cè)，仍然無(wú)法對(duì)淋巴瘤和肉瘤及其他類似的疾病進(jìn)行分類，也許不久的將來(lái)能有快捷的方法用于冰凍切片，但是現(xiàn)在，確實(shí)是一個(gè)缺陷。

3.冰凍假象

這是水的特性，水在結(jié)冰時(shí)因氫鍵的交聯(lián)而膨脹，正是這個(gè)原因，冰塊才能浮在水面上。我相信組織在冰凍時(shí)候的變化與水結(jié)冰膨脹是密切相關(guān)的，在此，我會(huì)盡量解釋冰凍片子和石蠟片子的差異。象處理其他病理假象一樣，正確的識(shí)別這些冰凍假象有助于我們不至于誤判。

冰晶的形成

含水量特別多的組織冷凍時(shí)會(huì)出現(xiàn)肥皂泡樣的空隙，我認(rèn)為當(dāng)組織中的水分凝固時(shí)形成球形的冰晶，擠壓纖維組織條而產(chǎn)生泡沫樣的形狀。下面的冰凍對(duì)照顯示當(dāng)組織片進(jìn)一步處理時(shí)泡沫樣的水分又重新分布于間質(zhì)，而未曾冷凍的組織顯示出間質(zhì)的水腫。這些水分巨多的組織在切片時(shí)很難保證不裂開，應(yīng)盡可能高切片的溫度。

擠壓假象

細(xì)胞實(shí)性的組織會(huì)受到冰泡膨脹的擠壓，這在水腫組織非常明顯，下面的腎細(xì)胞癌提供了一個(gè)很好的例子，中間的圖片顯示腎小管被透明的冰晶所擠壓，右邊的圖片為來(lái)源于同一組織的非冷凍切片。

核性的冰晶

細(xì)胞核產(chǎn)生冰晶的趨勢(shì)不一，根據(jù)我的觀察，這似乎跟組織的類型及狀態(tài)有關(guān)，我注意到在損傷的組織出現(xiàn)較多，從道理上講也是如此，燒傷的組織或缺血損傷的組織由于失去了滲透壓的平衡從而導(dǎo)致眾多數(shù)量的核水腫，同時(shí)，囊狀的核越多，核冰晶形成的可能性越大。我也注意到：片子切得越薄，這種冰晶越容易留下空洞，下面的例子可以很好的說(shuō)明我的觀點(diǎn)。

核染色質(zhì)的改變

中間這張片子先前冷凍過(guò)，顯示染色質(zhì)特別明顯，與左邊冰凍后立刻固定的圖片相比，核的密度更大，更深染，注意到冰凍片中胞漿含有較多的空泡，也是冷凍假象的一種。探討如何合理的保養(yǎng)冰凍切片機(jī)

技術(shù)員除了要做好冰凍切片之外，合理的保養(yǎng)冰凍切片機(jī)也至關(guān)重要，合理的保養(yǎng)有利于工作順利地進(jìn)行，同時(shí)又能延長(zhǎng)冰凍切片機(jī)的壽命。

1、冰凍切片機(jī)對(duì)電壓穩(wěn)定性要求較高-------安裝穩(wěn)壓電源。

2、為了保證工作人員的安全及設(shè)備安全可靠運(yùn)行，設(shè)備安裝時(shí)應(yīng)有接地。

3、應(yīng)注意機(jī)箱周圍通風(fēng)網(wǎng)清理避免阻塞，不可使機(jī)器緊靠墻壁，應(yīng)保證空氣的自由流通。

4、冰凍切片機(jī)對(duì)環(huán)境的溫度要求較高，特別是夏天所在的房間應(yīng)安裝空調(diào)，以減少氣溫過(guò)高引起的壓縮機(jī)連續(xù)運(yùn)轉(zhuǎn)。

5、設(shè)備應(yīng)專人使用和保養(yǎng)，嚴(yán)格遵守操作規(guī)程，非專業(yè)人員不準(zhǔn)操作機(jī)器。

6、因停電或其它原因停機(jī)后再啟動(dòng)一定要間隔十分鐘后進(jìn)行。

7、有機(jī)玻璃窗開啟時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)。

8、及時(shí)清理冷室內(nèi)的組織碎屑，保證室內(nèi)外清潔。

9、移動(dòng)機(jī)器后應(yīng)注意使機(jī)器著地平穩(wěn)。

10、設(shè)備不可帶故障使用，出現(xiàn)問(wèn)題時(shí)及時(shí)修理。

11、冰凍量大的醫(yī)院，建議購(gòu)置兩臺(tái)冰凍切片機(jī)。

12、關(guān)機(jī)時(shí)，CT溫度和OT溫度下調(diào)10度，關(guān)閉OT的壓縮機(jī)，然后再關(guān)機(jī)。

冰凍切片機(jī)的使用

1.切片前先安裝好刀片，調(diào)整切片厚度及切片角度，確認(rèn)標(biāo)本組織類型，根據(jù)不同組織類型調(diào)整好最佳切片溫度。

2.盡可能快地取新鮮活體標(biāo)本，不經(jīng)任何試劑處理，切成2.0cm×2.0cm×0.2cm大小的組織塊放到組織托上，涂敷包埋劑后即放到冷臺(tái)上冷凍，待包埋劑稍凝后(以組織塊不流動(dòng)為宜)，迅速固定到冷凍頭上急凍。一般在取材后就要立刻對(duì)組織塊進(jìn)行速凍，使組織溫度驟降，縮短降溫的時(shí)間，減少冰晶的形成。

3.待組織塊凍好后用快進(jìn)鍵將其移近刀口，利用按鈕修片，修好后即可放下防卷板切片。切片時(shí)，低溫室內(nèi)溫度以-15℃～-20℃為宜，溫度過(guò)低組織易破碎，根據(jù)各種組織的軟硬度來(lái)掌握切片速度，軟組織切片速度較慢，較硬的組織切片速度快。

4.調(diào)節(jié)防卷板。防卷板的位置及角度要適當(dāng)，載玻片附貼組織切片時(shí)，切勿上下移動(dòng)。5.將切好的切片附貼在載玻片上，固定、染色、脫水、封固。冰凍切片制作完成。

第二篇：術(shù)中快速冰凍切片技術(shù)工作制度

術(shù)中快速冰凍切片技術(shù)工作制度

手術(shù)中快速冷凍切片病理診斷（以下簡(jiǎn)稱“冷凍”）是將手術(shù)切下的病變組織在冷凍切片機(jī)中迅速冷凍后制成切片，進(jìn)行病理診斷。一般在30分鐘左右得出診斷意見，為臨床手術(shù)提供參考。冷凍是一種高技術(shù)、高難度、高風(fēng)險(xiǎn)的病理項(xiàng)目。其主要作用：⑴確定送檢標(biāo)本組織是否有病變存在；⑵確定病變或腫瘤的性質(zhì)；⑶確定手術(shù)切緣有否腫瘤；⑷確定送檢組織有否癌浸潤(rùn)或轉(zhuǎn)移等。但由于取材局限、標(biāo)本冰晶及時(shí)間短等問(wèn)題，冷凍切片質(zhì)量不能達(dá)到常規(guī)石蠟切片的精確度，診斷準(zhǔn)確率受到影響?？梢猿霈F(xiàn)以下情況： ⑴只能做良、惡性鑒別，為臨床提供一個(gè)參考性意見；（2）診斷困難，允許發(fā)延遲報(bào)告或等待石蠟切片診斷，發(fā)出最終報(bào)告；（3）冷凍診斷與常規(guī)石蠟診斷不符時(shí)，以石蠟切片報(bào)告為準(zhǔn)。“三甲”醫(yī)院要求冷凍診斷的準(zhǔn)確率≥96%。為減少和防止醫(yī)療差錯(cuò)和糾紛，有利于此項(xiàng)工作的規(guī)范化開展，特制定該制度。

1.“冷凍”預(yù)約規(guī)定：需做術(shù)中快速冷凍病理診斷時(shí)，各手術(shù)科室提前1～2天詳細(xì)填寫冷凍申請(qǐng)單（可用普通病理申請(qǐng)單代替）送病理科。要求盡可能填全各項(xiàng)內(nèi)容，注明做冷凍的具體年、月、日、時(shí)，以便病理科做好準(zhǔn)備；除填臨床診斷外，請(qǐng)?zhí)岢鲆鉀Q的問(wèn)題，如確定“病變性質(zhì)”、“切緣有否浸潤(rùn)”、”淋巴結(jié)有否轉(zhuǎn)移“等等。一般不提倡急診“冷凍”申請(qǐng)。如確需急診冷凍時(shí)，要及時(shí)與病理科主任聯(lián)系，說(shuō)明情況。病理科盡量創(chuàng)造條件，滿足臨床需要。2.病理科實(shí)行“冷凍查房“制度：病理各級(jí)醫(yī)師在手術(shù)前1日應(yīng)下病房查病人、看病歷或請(qǐng)病人來(lái)病理科接受查體，與主管醫(yī)師交換意見，全面了解有關(guān)冷凍方面的病人情況。

3.實(shí)行“手術(shù)中快速冷凍病理診斷知情同意書”（樣本附后）簽字制度。術(shù)前由臨床醫(yī)師向病人及其家屬談話，交代冷凍有關(guān)事項(xiàng)，征得其理解、同意并簽字。最后將知情同意書放入病歷中。4.單件標(biāo)本的冰凍切片制片應(yīng)在15分鐘內(nèi)完成。

5.冷凍病理報(bào)告實(shí)行三級(jí)醫(yī)師檢診及雙簽字制度。初級(jí)醫(yī)師參與取材閱片、中級(jí)醫(yī)師診斷、高級(jí)醫(yī)師復(fù)診。報(bào)告由中、高級(jí)醫(yī)師雙簽字。一般30分鐘左右發(fā)報(bào)告，遇特殊情況時(shí)間可以適當(dāng)延長(zhǎng)。6.遇到冷凍病理診斷中的交界性病變及“灰色病變”難以確診時(shí)，首先在科內(nèi)討論，如意見仍難以統(tǒng)一，不能勉強(qiáng)發(fā)報(bào)告。要及時(shí)向手術(shù)醫(yī)師通報(bào)情況，可向醫(yī)務(wù)處報(bào)告，協(xié)助派車去外院會(huì)診；或允許延緩出報(bào)告，必要時(shí)待常規(guī)石蠟切片后再診斷。臨床醫(yī)師和/或病理醫(yī)師要向患者及家屬講明情況，取得理解并記錄于病歷中。

7.建立冷凍報(bào)告登記及隨診制度：冷凍切片剩余組織，一律做石蠟切片對(duì)照。對(duì)與最后診斷不符的報(bào)告要組織相關(guān)醫(yī)師討論和隨診，以利提高診斷水平。

第三篇：冰凍切片中常見問(wèn)題分析

冰凍切片中常見問(wèn)題分析

鄭則欽

龐瑾昱

陳斌

【摘要】 目的 探討冰凍切片技術(shù)在臨床病理診斷中的應(yīng)用。方法 收集外科手術(shù)中冰凍診斷病例，應(yīng)用快速冰凍切片法、快速冰凍染色法等對(duì)冰凍診斷病例進(jìn)行分析。結(jié)論 冰凍切片技術(shù)中常見的問(wèn)題及改進(jìn)；影響冰凍切片質(zhì)量的因素；冰凍切片在病理診斷中的作用。

【關(guān)鍵詞】 冰凍切片； 病理診斷

冰凍切片是借助低溫使組織凍結(jié)達(dá)到一定的硬度進(jìn)行切片的一種方法，是手術(shù)過(guò)程中采取活體標(biāo)本，進(jìn)行快速的組織學(xué)診斷的方法，其便捷的優(yōu)點(diǎn)，利于術(shù)中確診病變性質(zhì)，決定手術(shù)范圍，但由于各種原因，影響冰凍切片的質(zhì)量，拖延病理報(bào)告發(fā)出的時(shí)間，直接影響著病理診斷的及時(shí)性、準(zhǔn)確性，間接影響病人的預(yù)后。

材料與方法

1.材料：收集外科手術(shù)中冰凍診斷病例

2.方法：應(yīng)用快速冰凍切片法、快速冰凍染色法等

結(jié)

果 組織取材大小要適宜，約為1.5×1.5㎝,厚2㎜。2 壞死組織影響冰凍切片的完整性。3 冰凍時(shí)間根據(jù)組織的大小及性質(zhì)所決定。4 冰凍溫度一般設(shè)置在－18～－20℃。5 染液的酸堿度要適宜。1 組織取材對(duì)制片的影響 組織取材大?。航M織塊大小要適宜，冷凍切片機(jī)內(nèi)切片刀移動(dòng)的范圍有一定的限制，超出其范圍時(shí)，易致切片不全。一般情況下，冰凍切片的組織大小為1.5×1.5㎝,厚2㎜。但卵巢腫瘤及脂肪組織可稍微大些。組織塊過(guò)大，切片時(shí)阻力過(guò)大，易產(chǎn)生皺折，刀痕，組織易崩碎，增加制片難度，影響診斷。如需在同一標(biāo)本托上放大于兩塊組織時(shí)，應(yīng)盡量?jī)龀梢粋€(gè)平面，與刀鋒平齊，以防切片不完整，發(fā)生漏診。若送檢組織過(guò)小，請(qǐng)預(yù)先速凍一冷臺(tái)面，再行包埋，利于制片。另外，包埋時(shí)，應(yīng)將組織平放在凍頭的中央。組織內(nèi)含過(guò)多的脂肪或壞死組織：脂肪或壞死組織較一般的組織冷凍的溫度要低些，當(dāng)活組織達(dá)到所需的溫度時(shí)，其還比較軟，從而影響切片的完整性和拖延冷凍報(bào)告發(fā)出的時(shí)間。組織塊過(guò)冷：組織冷凍過(guò)度易致切片破碎或呈粉沫狀，不能制作一張完整的切片。組織塊冷凍不均勻：在配合使用液氮時(shí)，組織塊放入液氮時(shí)不能保持水平狀態(tài)且液氮量不足的情況下，可產(chǎn)生此現(xiàn)象。凍頭的溫度不足：冷凍切片時(shí)要求凍頭的溫度保持在－25℃～－30℃左右，凍頭的溫度達(dá)不到要求時(shí)，組織很快回軟，也不能保證切片的完整。冷凍時(shí)間對(duì)制片的影響：根據(jù)組織塊的大小、性質(zhì)，確定冷凍時(shí)間，一般13～17s（使用液氮者），若組織較大或脂肪組織時(shí)間可適當(dāng)長(zhǎng)些，而甲狀腺、腦組織和淋巴組織等冷凍的時(shí)間相對(duì)要短些。冷凍時(shí)間要嚴(yán)格掌握，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，切片易脆碎，其處理方法是：切出完整平面后用戴乳膠手套的拇指按壓回溫，直到切片完整為止，反之，時(shí)間過(guò)短，則需繼續(xù)冷凍，直到組織不粘刀片出現(xiàn)完整切片為基準(zhǔn)。冷凍箱體工作溫度對(duì)制片的影響：一般組織設(shè)定為－18～－20℃。但對(duì)一些較特殊的組織標(biāo)本，溫度應(yīng)適當(dāng)調(diào)整，如脂肪成分較多的組織以－30～－35℃為宜，纖維腺瘤，子宮等為－20℃，淋巴結(jié)，甲狀腺為－18℃，切片時(shí)，表面玻璃機(jī)器蓋子不要打開過(guò)大，以免箱體回溫過(guò)快，影響制片。保持凍箱的溫度，做到每次做完冷凍切片應(yīng)關(guān)好冷凍箱的蓋子。染色對(duì)制片的影響：尤以細(xì)胞核的染色最為關(guān)鍵，在寒冷的冬季，室溫過(guò)低時(shí)，影響核的著色，可適當(dāng)加溫，用以增色，蘇木素的酸堿度應(yīng)適宜，經(jīng)常觀察其染液的ph值，過(guò)堿時(shí)應(yīng)及時(shí)更換，鹽酸酒精分化適度，時(shí)間控制到位，否則易造成核著色不佳，染色質(zhì)不清晰，影響診斷的準(zhǔn)確性。冰晶的形成對(duì)制片的影響：此原因主要取決于組織含水量的大小，尤以組織細(xì)胞水腫，淋巴結(jié)，縱隔腫瘤，卵巢腫瘤為甚，送檢取材過(guò)程中接觸水源，速凍過(guò)程中使用的液氮時(shí)間尚未控制好，同是造成冰晶形成的原因，其解決方法為，使用液氮時(shí)間上控制到位，保證一次凍透標(biāo)本，組織送檢取材時(shí)，盡量避開水源，如遇含水量高的標(biāo)本時(shí)，應(yīng)盡量用干紗布吸干水分后再行冷凍，避免由于冰晶形成出現(xiàn)診斷上的失誤。操作者的動(dòng)作應(yīng)迅速。6 切片皺縮或卷縮：這也是影響切片質(zhì)量的重要因素之一。常見的原因有：①刀鋒變鈍。② 防卷板粘有異物，防卷板的作用是防止切片卷縮，但若粘有異物，切片時(shí)組織會(huì)被擠壓而縮在一起。③ 防卷板與刀鋒的位置不平行、不協(xié)調(diào)。④ 組織塊包埋不完全，缺乏支撐作用。

預(yù)防與處理的方法：① 注意檢查刀具，及時(shí)更換刀口，定期磨刀。② 保持防卷板的清潔，每做一例冷凍切片，均應(yīng)將刀口及防卷板拭擦干凈，防止切片的污染和切片皺縮。③ 調(diào)整刀、防卷板的位置，保證兩者平行，且防卷板比刀鋒前0.2㎜左右。④ 包埋組織應(yīng)完全，沒(méi)法切片者再滴加包埋膠。7 切片脫落：冷凍切片是利用溫度差（即玻片與組織切片的溫度差）將切片粘貼在玻片上，然后進(jìn)行固定、染色。下面幾種情況下可影響切片粘貼的牢固程度，而導(dǎo)致切片脫落：① 組織內(nèi)含過(guò)多的壞死組織。組織細(xì)胞壞死崩解后，局部的滲透壓升高，吸收水分，切片一經(jīng)固定，水分逸出，壞死組織失去支撐作用，染色時(shí)組織容易脫落。② 固定液濃度過(guò)低，這是最常見的原因。③ 載玻片不干凈。④ 切片太厚。

預(yù)防及處理方法：避免組織內(nèi)帶有壞死組織，條件允許者重新取材；若沒(méi)有組織可代替，切片固定時(shí)間長(zhǎng)些，經(jīng)95％乙醇雙重固定后，用電吹風(fēng)將切片吹干（溫度不能過(guò)高，以防破壞組織結(jié)構(gòu)）然后再進(jìn)行染色且動(dòng)作應(yīng)輕柔。② 定期更換固定液。一般每周更換一次，例數(shù)較多者，適當(dāng)增加次數(shù)；另外，每次做完冷凍，應(yīng)及時(shí)將盛固定液的瓶蓋蓋好，以防固定液揮發(fā)而降低其濃度。③ 保持載玻片干凈，平時(shí)應(yīng)將玻片蓋好，防止灰塵或其它異物的污染。若新購(gòu)買的玻片較臟，洗滌過(guò)后才使用。④ 調(diào)好切片的厚度，切片厚度以5～7um較為合適（脂肪組織可稍為厚些）。組織塊脫落：冷凍切片一般要求在30min內(nèi)發(fā)出病理報(bào)告，以便手術(shù)醫(yī)生能盡快選擇手術(shù)方式。但若組織塊脫落，會(huì)拖延病理報(bào)告發(fā)出的時(shí)間，而耽誤病人的手術(shù)時(shí)間。常見原因有：① 凍頭在冷凍機(jī)內(nèi)放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，致使包埋膠還來(lái)不及滲到凍頭的底部便凝固了，導(dǎo)致包埋膠與凍頭粘連不緊，稍受外力的作用便脫落；② 凍頭上的包埋膠沖洗不干凈。

總之，對(duì)于冰凍切片的質(zhì)量因素主要有以上幾點(diǎn)。如果能正確對(duì)待以上幾方面的問(wèn)題，冰凍切片的質(zhì)量方可得到保證，且能制備出一張質(zhì)量?jī)?yōu)秀的切片，為明確病理診斷提供較為便利的客觀條件。

第四篇：組織切片技術(shù)

組織切片技術(shù)

姓名：許莎

班級(jí)：生技1學(xué)號(hào)：12772018

組織切片技術(shù)是研究生物組織或細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)的重要技術(shù)，對(duì)于促進(jìn)細(xì)胞生物學(xué)和遺傳學(xué)等研究的發(fā)展起著重要作用。最早的制片技術(shù)是徒手切片技術(shù)，以后發(fā)展了利用石蠟進(jìn)行包埋和切片的制片技術(shù)，即石蠟切片技術(shù)，該技術(shù)由于成本低，操作簡(jiǎn)單，目前仍在應(yīng)用，該技術(shù)被越來(lái)越多的研究工作者應(yīng)用于發(fā)育學(xué)、植物細(xì)胞學(xué)、胚胎學(xué)、解剖學(xué)等研究領(lǐng)域。

1組織切片技術(shù)原理

1.1原理

組織切片技術(shù)是研究組織形態(tài)學(xué)最常用的一項(xiàng)基本技術(shù)，在制作胚胎或組織切片時(shí)，由于細(xì)胞或組織是柔軟的或局部的軟硬不均，這樣制作厚薄均勻的切片很困難。為了能清晰地觀察到組織結(jié)構(gòu)及細(xì)胞形態(tài)，必須先經(jīng)過(guò)一系列步驟將組織內(nèi)滲入某些支持物質(zhì)，使組織變硬然后利用切片機(jī)將組織切成薄片。根據(jù)所用支持劑的種類不同，主要分為石蠟切片、冰凍切片、振動(dòng)切片、火棉膠切片、塑料切片、碳蠟切片等。

1.2分類

1.2.1石蠟切片

該技術(shù)是最重要、最常用的組織切片技術(shù)之一，起始于18世紀(jì)。此法是用石蠟作為包埋劑，將材料經(jīng)過(guò)固定、脫水、透明后包埋在石蠟中，然后連同石蠟用切片機(jī)一同進(jìn)行切片。石蠟切片的主要優(yōu)點(diǎn)是不僅可以把材料制成薄的切片，而且還能制成連續(xù)切片，這是其他制片技術(shù)難以做到的。它的缺點(diǎn)是操作步驟比較復(fù)雜，而且材料在脫水、透明過(guò)程中會(huì)收縮、[1]變硬、變脆，以致不易切片。1.2.2冰凍切片

冰凍切片是利用干冰或液氮等速凍劑使組織迅速冷凍硬化，將組織在冷凍狀態(tài)下直接用切片機(jī)切片的一項(xiàng)技術(shù)。它實(shí)際上是以水為包埋劑，將組織進(jìn)行冰凍至堅(jiān)硬后切片的。由于此法不需要經(jīng)過(guò)各級(jí)乙醇的脫水、二甲苯的透明和浸蠟等步驟，因而較適合子脂肪、神經(jīng)組織和一些組織化學(xué)的制片，并作為快速切片的方法應(yīng)用在臨床診斷冰凍切片是酶組織化學(xué)和免疫組織化學(xué)染色中最常用的一種切片方法。此種切片的優(yōu)點(diǎn)是能較好的保存組織的RNA穩(wěn)定性、較完好地保存細(xì)胞膜表面和細(xì)胞內(nèi)多種酶活性以及抗原的免疫活性，缺點(diǎn)是需要較高的設(shè)備要求;切片較厚，導(dǎo)致組織結(jié)構(gòu)顯示欠佳;通常不能進(jìn)行連續(xù)切片。其主要操作技術(shù)和方法與石蠟切片過(guò)程和類似。1.2.3振動(dòng)切片

是用振動(dòng)切片機(jī)把新鮮的組織切成厚20-100pm的切片。此類切片的優(yōu)缺點(diǎn)類似于冰凍切片。通常在切片后進(jìn)行免疫染色然后再進(jìn)行電鏡切片,以此來(lái)彌補(bǔ)結(jié)構(gòu)顯示不清的不足。振動(dòng)切片機(jī)主要用于新鮮或經(jīng)過(guò)固定的動(dòng)、植物標(biāo)本的制片，切片時(shí)組織標(biāo)本不需冰凍或包埋。因此.樣品片既避免了冰晶破壞，又能保持其活性和細(xì)胞良好形態(tài)為免疫細(xì)胞化學(xué)研究以及脊髓和腦薄片的神經(jīng)生物學(xué)研究提供了良好條件。振動(dòng)式切片機(jī)可以對(duì)不同的材料進(jìn)行切片，在應(yīng)用范圍上補(bǔ)充了使用傳統(tǒng)切片機(jī)的不足，是當(dāng)代電鏡、解剖、組胚、生理、醫(yī)院化工等實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)最理想的快速制樣切片儀器。1.2.4火棉膠切片

是以火棉膠為包埋劑浸入包埋組織。優(yōu)點(diǎn)是可以切較硬的組織，缺點(diǎn)是操作比較麻煩費(fèi)時(shí),切片較厚,不能連續(xù)切片。1.2.5塑料切片

用干硬度大的組織標(biāo)本的包埋。由于塑料包埋組織細(xì)胞收縮程度小，切片薄，有利于組織細(xì)胞細(xì)微結(jié)構(gòu)的觀察，加之新型塑料包埋劑的出現(xiàn)和聚合方法的改進(jìn)使塑料包埋技術(shù)得到了更為廣泛的應(yīng)用。塑料包埋使用的包埋劑是各種樹脂，未聚合的樹脂為勤稠的液體.通過(guò)標(biāo)本組織塊的沒(méi)潤(rùn)，樹脂可滲透到組織間隙中。自發(fā)或在催化劑和加速劑的作用下，發(fā)生分子回的連接形成支架，支撐組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)，聚合完成后形成固體硬塊。其優(yōu)點(diǎn)是可以切出薄至0.5-2nm的切片，適用于同時(shí)作光鏡和電鏡檢測(cè)。缺點(diǎn)是處理程序繁多,抗原活性易丟失。1.2.6碳蠟切片

以碳蠟為包埋劑，優(yōu)點(diǎn)是組織固定水洗后不需脫水透明,可以直接浸碳蠟包埋,切片方法于石蠟切片相同，缺點(diǎn)是夏季溫度較高時(shí)切片困難。

1.3制備方法

以石蠟切片為例，介紹切片標(biāo)本的制備方法。

1.取材：根據(jù)科研和教學(xué)目的選擇新鮮材料，然后進(jìn)行適當(dāng)?shù)那腥?、分割。樣品塊要盡量小，以便于下一步固定。

2.固定：將選取的新鮮材料立即投人到固定液中，迅速殺死細(xì)胞以保持組織及細(xì)胞的原有結(jié)構(gòu)。一般固定液的最少用量為所固定材料總體積的20倍。固定液的選擇視材料的性質(zhì)及制片的目的而定，一般要求盡快殺死并固定細(xì)胞和組織。石蠟切片常用的固定液有FAA固定液、卡諾固定液，此外，還有多聚甲醛、戊二醛、乙醇、乙酸等。

3.洗滌：材料固定后，用洗滌劑將材料中的固定液洗掉，以便進(jìn)行切片的染色或制片，常用的洗滌劑有水或乙醇。

4.脫水：因?yàn)楣潭ê拖礈旌蟮牟牧虾写罅康乃?，而水和透明劑、包埋?石蠟)不相溶，所以必須經(jīng)過(guò)脫水逐步、徹底除去材料中的水分，才能進(jìn)行透明和包埋。常用的脫水劑是乙醇，另外還有乙醇、正丁醇、丙酮、環(huán)氧丙烷等。脫水過(guò)程應(yīng)由低濃度到高濃度逐級(jí)進(jìn)行，不可太快。否則會(huì)使細(xì)胞收縮或材料損壞。

5.透明：透明是脫水與浸蠟、脫水與封藏之間的橋梁。材料經(jīng)脫水后，組織內(nèi)部已沒(méi)有水分，但脫水劑不能與石蠟相溶，致使石蠟不能進(jìn)人細(xì)胞與組織。因此，需要一種既能與脫水劑混合又能與包埋劉石蠟相混合的溶劑來(lái)處理。透明在制片中很重要。如果組織不透明，表明脫水不徹底，必須重新返工，但返工效果往往不好，常用的透明劑有二甲苯、氯仿、冬青油等。

6.浸蠟：浸蠟是將石蠟包埋劑慢慢溶于浸有材料的透明劑中，溶解在透明劑中的石蠟逐漸滲人到材料的組織細(xì)胞中，最后使透明劑被石蠟取代。進(jìn)人組織細(xì)胞中的石蠟，在熔點(diǎn)以下很快凝固成固體，凝固后的石蠟起支撐作用，使切片后的細(xì)胞組織固定在原位。

7.包埋:將透蠟的組織連同熔化的石蠟，一起倒入包埋盒內(nèi)，然后包埋盒底部接觸冷水中，使其立刻降溫凝固成蠟塊。操作過(guò)程：包埋時(shí)，將紙盒放在已經(jīng)加熱的溫臺(tái)上，從溫箱中取出盛放純石蠟的蠟杯，倒入包埋用的紙盒中，取出存放材料的蠟杯，迅速輕輕地用鑷子夾取材料平放于紙盒底部（注意切面朝下放置），再用溫鑷子輕輕撥動(dòng)材料，使之排列整齊。待石蠟完全凝固（約30min）后即可取出備用。

8.切片:已包埋好的石蠟材料，在進(jìn)行切片之前需先進(jìn)行修快、固著。修塊：切片前需修整蠟塊，即將包埋好的一大塊蠟塊切開，使每一小塊都含有一塊組織，從切面看組織周圍的石蠟相等。固著：將修好的蠟塊粘在大小適宜的樣品臺(tái)上，以便于固定在切片機(jī)上。切片：一手持毛筆，一手轉(zhuǎn)動(dòng)切片機(jī)，切片的蠟片連成一長(zhǎng)條蠟帶。切下的蠟帶放在干凈黑紙上。切片操作時(shí)應(yīng)注意隨時(shí)關(guān)好停刀軋，不能對(duì)著蠟帶講話以免吹散蠟帶;切片完畢，將刀取下擦凈。涂上潤(rùn)滑油，放人盒內(nèi)保存。9.粘片、展片：通過(guò)粘貼劑把合格蠟帶貼在載玻片上，在貼的同時(shí)，借助水的張力使蠟帶完全伸展、平貼在載玻片上，粘片和展片是在載玻片上同時(shí)完成的步驟。常用的粘貼劑有蛋白粘貼劑和明膠甘油粘貼劑兩種

10.脫蠟、透明：在染色之前，需要用脫蠟劑溶去組織和細(xì)胞的石蠟，進(jìn)一步清洗脫掉的石蠟，使細(xì)胞、組織透明清晰，用于脫蠟和透明的試劑是二甲苯。

11.染色：為了使植物組織和細(xì)胞各部分顯像清楚，必須進(jìn)行染色。運(yùn)用不同的染色方法和選用不同的染色劑，使組織或細(xì)胞某一部分染上顏色，另一部分不染上顏色成為背景;或?qū)⒉煌糠秩境刹煌念伾?，可使組織細(xì)胞在光學(xué)顯微鏡中顯像清晰，便于觀察。

12封片：切片染色后用膠類物質(zhì)將其封固，以利于長(zhǎng)期保存。

2切片技術(shù)的應(yīng)用

2.1石蠟切片技術(shù)的應(yīng)用

石蠟切片雖然是經(jīng)典的方法但隨著新的儀器和研究技術(shù)的不斷問(wèn)世，出現(xiàn)了與其他新的[2]技術(shù)方法相結(jié)合，從而開辟了許多新領(lǐng)域，增加了許多新的研究、觀察內(nèi)容，使組織學(xué)的觀察研究從簡(jiǎn)單的形態(tài)結(jié)構(gòu)深入到各種成分的定性觀察，定量計(jì)測(cè)，使細(xì)胞組織的形態(tài)、功能及代謝三結(jié)合，從而達(dá)到定性可靠、定位準(zhǔn)確及定量可測(cè)，最終闡述了生命活動(dòng)的最基本規(guī)律。

2.1.1三維重建

重建技術(shù)在闡明生物體組織結(jié)構(gòu)與生理功能之間的關(guān)系以及在形態(tài)學(xué)、比較解剖學(xué)、細(xì)胞化學(xué)定位等領(lǐng)域的研究中有著重要的意義。早在1958年，Sjostrand就論證了這種方法的[3]可行性和可靠性，是最早報(bào)道利用組織切片進(jìn)行骨二維重建的學(xué)者，隨后LUCZ也用同樣的方法進(jìn)行了嘗試，但是，由于當(dāng)時(shí)的切片技術(shù)和計(jì)算機(jī)技術(shù)都較落后，故效果不如人意。4]直到2000年Mason[再次用同樣的方法進(jìn)行了三維重建。隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)的不斷發(fā)展，這項(xiàng)技術(shù)在國(guó)際上正在繼續(xù)進(jìn)行廣泛深入的研究，在國(guó)內(nèi)也引起了廣泛的研究興趣，例如對(duì)血

[5]管大鼠松質(zhì)骨、中國(guó)虛擬人行切片后三維重建，同時(shí)也對(duì)方法進(jìn)行了很多研究。特別是目前正在研究的“中國(guó)虛擬人1號(hào)”，表明我國(guó)是繼美、韓之后世界上第三個(gè)用人體切片合成虛擬人的國(guó)家。2.1.2免疫組化

組織制片技術(shù)與免疫學(xué)技術(shù)結(jié)合構(gòu)成免疫組織化學(xué)技術(shù)，利用抗原與抗體的特異性結(jié)合原理，檢測(cè)組織切片中細(xì)胞組織的多肽及蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)的定性和定位觀察研究。冰凍切片手續(xù)簡(jiǎn)便，制片過(guò)程中抗原活性丟失少，但組織細(xì)胞形態(tài)較差;石蠟切片步驟繁多。一般石蠟包埋的組織切片用于檢測(cè)胞漿或核內(nèi)的抗原，不宜做表面抗原染色，乙醇、丙酮等固定劑對(duì)抗原破壞較輕，但結(jié)構(gòu)保存較差。2.1.3原位雜交

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，在Southern blot, Northern blot等分子雜交技術(shù)基礎(chǔ)上建立了原位雜交技術(shù)。原位雜交技術(shù)具有高度的準(zhǔn)確性和敏感性，它能在細(xì)胞甚至亞細(xì)胞的水平上定位特異性核酸分子序列。因而，這一技術(shù)是目前研究分子細(xì)胞生物學(xué)、發(fā)育學(xué)等方面的重要[6][7]手段。例如，在心肌石蠟切片中檢測(cè)克山病(KSD)RNA ,在乳腺癌石蠟切片中檢測(cè)ER mRNA, [8][9][10] PR mRNA，在骨組織石蠟切片中檢測(cè)整合素R 1-mRNA，在肝組織中檢測(cè)丙型肝炎病毒RNA2.1.4原位PCR

原位PCR技術(shù)是直接在細(xì)胞或組織標(biāo)本上原位擴(kuò)增目的DNA或RNA片斷，并在原位檢測(cè)其擴(kuò)增產(chǎn)物的技術(shù)，它兼有PCR的敏感性和原位雜交的特異性。2.1.5組織芯片

組織芯片是將成百上千的小組織整齊排列在某一載件上從而組成的微縮組織切片。該技術(shù)利用并行化處理原則、微量化檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)，結(jié)合分子生物學(xué)和形態(tài)學(xué)原理，具有經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便快捷、信息量大的特點(diǎn)，能夠在DNA,RNA和蛋白質(zhì)水平檢測(cè)基因表達(dá)。2.1.6檢測(cè)凋亡

檢測(cè)凋亡的方法很多，形態(tài)學(xué)觀察是判斷細(xì)胞凋亡的基本方法?？捎糜隗w內(nèi)外細(xì)胞凋亡的研究，既可用于組織切片的原位檢測(cè)，也可對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞涂片或切片的檢測(cè)，特別是在常規(guī)石蠟組織切片中，可對(duì)凋亡細(xì)胞進(jìn)行原位檢測(cè)，監(jiān)測(cè)某一或某些處理因素引起體內(nèi)組織細(xì)胞凋亡的動(dòng)態(tài)變化。

2.1.7石蠟包埋組織流式細(xì)胞儀DNA含量分析

石蠟包理組織切片與流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合使用來(lái)測(cè)量DNA含量及倍體分析。由于制備樣品技術(shù)的原因，過(guò)去許多流式分析資料僅限于采用鮮組織標(biāo)本，Hedley等1983年首先報(bào)導(dǎo)了FCM分析石蠟包埋組織切片制備分散細(xì)胞懸液技術(shù)來(lái)進(jìn)行DNA含量的檢測(cè)，從組織切片中能獲得足夠數(shù)量的單個(gè)細(xì)胞，且與新鮮組織分離獲得的單個(gè)細(xì)胞在形態(tài)及DNA含量組方圖上均極為相似，目前國(guó)內(nèi)也在逐步開展這方面的研究。

2.2塑料切片技術(shù)的應(yīng)用

2.2.1塑料切片技術(shù)在水稻生殖發(fā)育研究中的應(yīng)用

利用塑料切片技術(shù)對(duì)水稻花粉、胚囊發(fā)育、受精和胚胎發(fā)生、胚乳發(fā)育以及突變體等進(jìn)行深人研究，例如，以7022LR為包埋劑，塑料切片技術(shù)觀察水稻IR36的胚胎發(fā)育過(guò)程。

參考文獻(xiàn)：

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第五篇：組織切片技術(shù)

南京農(nóng)大康海泓整理，Email:snai1621@126.com 組織切片技術(shù)注意事項(xiàng)

程序步驟

1、取材

2、固定（固定24h—1W）

3、包埋

石蠟切片：流水沖洗組織塊>>75%酒精1h>>85%酒精1h>>95%酒精1h>>100%酒精（1）1h>>100酒精（2）1h>>二甲苯8-20min>>石蠟2h>>包埋

冰凍切片：固定后的組織>>OCT包埋>>切片或-20度保存；

液氮中的組織>>轉(zhuǎn)入-20度>>OCT包埋>>切片或保存

4、切片

切片>>展片（40~50度）>>貼片>>干燥（37度過(guò)夜或者50~60度2h）

5、HE染色

干燥后的切片>>二甲苯（1）10min>>二甲苯（2）10min>>100%酒精(1)1min>>100%酒精(2)1min>>95%酒精1min>>85%酒精1min>>75%酒精1min>>蒸餾水3min>>蘇木精染色30s—5min>>自來(lái)水涮洗>>蒸餾水>>75%酒精1min>>85%酒精1min>>伊紅染色>>85%酒精涮洗>>95%酒精1min>>100%酒精(1)1min>>100%酒精（2）1min>>二甲苯（1）10min>>二甲苯（2）10min>>中性樹膠封片

6、免疫組化（ABC法）

（1）干燥后的石蠟或冰凍切片（冰凍切片需要緩慢復(fù)溫）脫蠟至水；

（2）雙氧水（1%濃度左右）封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；

（3）PBS洗滌3×5min；

（4）5%BSA封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)，不洗；

（5）滴加適當(dāng)稀釋度的一抗；4度孵育過(guò)夜或37度2h；（6）同上洗滌；滴加二抗，37度1h；

（7）同上洗滌；滴加ABC復(fù)合物，37度1h；（8）洗滌5遍，每次5min；

（9）配制顯色液（DAB顯色試劑盒），顯微鏡下觀察顯色；（10）切片浸泡于蒸餾水中終止顯色；（11）蘇木精復(fù)染，脫水，封片。

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注意事項(xiàng)

取材

1.組織越新鮮越好，最好于動(dòng)物處死后10~20min完成取材，時(shí)間過(guò)久后組織自溶和腐敗會(huì)影響組織形態(tài)。

2.取材組織塊不宜過(guò)大，一般為5nm以下，2~3nm為宜。如果試驗(yàn)要求采取大塊組織，最好采樣前注射固定液預(yù)固定或采取灌流固定（比如取腦時(shí)需灌流固定）。

3.取材使動(dòng)作輕柔，避免用力夾、捏和拉扯組織，盡可能保持組織原有形態(tài)。操作時(shí)可用鑷子夾取組織的一個(gè)邊角，避免主要組織損傷。

4.如果是大批量取材，取材時(shí)沒(méi)有時(shí)間對(duì)組織塊大小進(jìn)行修正，可將組織（可稍大，但不宜過(guò)大）先放在固定液中固定，2~4h后進(jìn)行修塊，即用鋒利的刀片（刮胡刀片）把組織切至適宜大小。注意不能用剪刀等進(jìn)行鈍性分離。5.如果對(duì)不同處理或不同動(dòng)物的組織進(jìn)行比較研究，應(yīng)對(duì)所有動(dòng)物在同一解剖學(xué)位置取材（比如十二指腸距胃3cm處，或空腸距胃10cm處）。

6.取材時(shí)注意組織的不同斷面，可將組織的一面用刀片切平作為標(biāo)示，以便包埋和切片時(shí)選取的斷面正確（比如肌肉組織，應(yīng)區(qū)分好橫斷面和縱斷面）。7.一般情況下宰殺動(dòng)物應(yīng)放血干凈，取材時(shí)除去組織周圍的附屬物，比如筋膜、脂肪等。

8.取得的組織立即固定。冰凍切片組織可先固定后凍存，也可直接凍存，直接凍存一般采取液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)入-20度保存，凍存組織應(yīng)避免反復(fù)凍融，且盡快進(jìn)行切片或用OCT包埋（包埋后可放置較長(zhǎng)時(shí)間）。未包埋的組織在-20度長(zhǎng)期保存的組織會(huì)逐漸脫水（比如肌肉），影響形態(tài)學(xué)觀察。

9.理論上免疫組化的組織采取冰凍切片，一般運(yùn)用4%多聚甲醛固定24~48h后用OCT包埋凍存。但對(duì)于抗原表達(dá)量大且較易檢測(cè)的免疫組化，可以采取石蠟切片，但固定時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng)，控制在1周以內(nèi)，長(zhǎng)時(shí)間固定會(huì)引起抗原表位的醛基化和抗原表位構(gòu)象變化，導(dǎo)致免疫組化檢測(cè)靈敏度降低。

固定與包埋

1.選擇合適的固定液，原則是在良好固定組織并保持形態(tài)的前提下盡可能的減小對(duì)組織的影響。常用固定液為福爾馬林、4%多聚甲醛和Bouin氏液，其中后兩者最為常用，效果也較好。

南京農(nóng)大康海泓整理，Email:snai1621@126.com 2.固定液需新鮮配制，新配的固定液固定效果較好。3.固定液體積理論上應(yīng)為組織體積的20倍以上。

4.一般組織理論固定時(shí)間為4~24h，即以固定液完全滲透進(jìn)入組織的最短時(shí)間為宜，實(shí)際操作中可延長(zhǎng)至數(shù)天，但一般控制在1周以內(nèi)。

5.如果是冰凍切片，固定后的組織最好及時(shí)用OCT包埋，能更好的維持組織形態(tài)，包埋后的組織可于-20度保存數(shù)月。固定后的組織可用蔗糖溶液脫水，方法為直接將組織置于30%蔗糖溶液中，每天換新鮮蔗糖溶液，2-3天組織在蔗糖中沉底即可。一般來(lái)說(shuō)，先固定，然后脫水，再用OCT包埋效果比較理想。6.冰凍切片可以采取后固定的方法。即采得的組織經(jīng)液氮速凍后直接放入-20度保存，OCT包埋，冰凍切片后用丙酮等對(duì)切片上的組織進(jìn)行固定。但丙酮固定較為強(qiáng)烈，容易發(fā)生掉片。

7.石蠟切片時(shí)，固定后的組織包埋前一般對(duì)組織進(jìn)行洗滌，通常用自來(lái)水沖洗，洗掉組織中的固定液，因?yàn)闅埩粼诮M織中的固定液可能對(duì)染色產(chǎn)生影響。洗滌為可選步驟，我們實(shí)驗(yàn)室通常不洗滌，將固定后的組織直接包埋，并不影響HE染色效果。

8.二甲苯透明時(shí)間是影響包埋效果的最關(guān)鍵因素，需根據(jù)組織種類、組織大小、室溫以及二甲苯的新舊程度綜合考量，必要的時(shí)候需要設(shè)置時(shí)間梯度進(jìn)行摸索。此外，組織是否脫水完全、是否浸蠟完全也直接影響包埋效果，原則上在能夠完全脫水和浸蠟的前提下，組織在各溶劑中的浸泡時(shí)間越短越好。

切片

1.切片成功與否很大程度上取決于組織固定和包埋的好壞。

2.切片厚度：HE等組織學(xué)染色一般4~5微米（4微米差不多是石蠟切片的極限），如果切片困難，可適當(dāng)增加切片厚度（20微米以內(nèi)越厚越好切），但切片厚度的增加會(huì)使得細(xì)胞層數(shù)增多，影響觀察和美觀。免疫組化中石蠟切片一般切片5~10微米，冰凍切片大約8~14微米，特別是在檢測(cè)表達(dá)量較少的抗原時(shí)，較厚的切片可以增加陽(yáng)性物質(zhì)的出現(xiàn)概率。

3.較好的石蠟切片呈均勻連續(xù)狀，沒(méi)有空洞和破損，組織完整不碎裂。4.切片角度和刀片新舊程度對(duì)切片效果的影響較大，切片角度視切片機(jī)型號(hào)而異；新刀片容易切出完好的切片。刀片應(yīng)從一段開始使用，發(fā)現(xiàn)刀痕時(shí)逐漸移動(dòng)，以最大限度使用刀片。

5.冰凍切片的主要影響因素有：切片機(jī)箱體溫度（一般為-25度左右），防卷器位置（太往前切不動(dòng)，太往后起不到防卷效果）。

6.對(duì)免疫組化切片而言，需對(duì)玻片進(jìn)行包被（一般為使其帶正電荷，組織帶負(fù)

南京農(nóng)大康海泓整理，Email:snai1621@126.com 電荷，通過(guò)靜電吸附增加粘附力），增加其粘附性。包被太淺起不到粘附效果，包被太深會(huì)導(dǎo)致免疫組化非特異性染色。

展片和貼片（撈片）：

1.燒杯中裝蒸餾水，置于水浴鍋中，溫度一般40~45度，溫度太低片子展不開，溫度太高石蠟會(huì)融化。

2.冰凍切片不需要展片，直接將玻片輕靠在組織上，組織便會(huì)自動(dòng)吸附到玻片上。

3.撈片時(shí)選取完全展平的片子撈起，寧缺毋濫。一張玻片上可以貼多個(gè)組織，最后選染色效果好的封片，增加成功率。

4.未包被過(guò)的玻片可重復(fù)使用，包被過(guò)的玻片貼片后組織很難掉下，不可重復(fù)使用。

干燥：

1.干燥可以讓組織貼的更結(jié)實(shí)。石蠟切片37度干燥過(guò)夜，或者45~60度干燥數(shù)小時(shí)。冰凍切片室溫晾干（夏天一般5~10min），但不可涼太干，太干也容易掉片，判定標(biāo)準(zhǔn)為組織表面沒(méi)有明顯的液體為宜，如果組織變白說(shuō)明干燥時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。

2.干燥后的石蠟切片可放切片盒中室溫保存，如果天氣炎熱可以放置4度保存；冰凍切片于切片盒中密封后置-20度保存，短期內(nèi)試驗(yàn)可以放4度保存。

染色（以HE染色為例）：

1.液體置換要徹底，特別是脫蠟和脫水步驟。

2.伊紅一般用醇溶性配方，蘇木精配方有很多種，如果用氧化汞方法配制使用前要過(guò)濾，因?yàn)橐后w表面容易聚集一層金屬離子薄膜，對(duì)染色產(chǎn)生影響。3.新鮮配制的伊紅染色時(shí)間1秒即可，存放時(shí)間長(zhǎng)的染液可以適當(dāng)增加染色時(shí)間。

4.封片時(shí)中性樹膠的量要適度。根據(jù)組織的大小選擇大小合適的蓋玻片，蓋玻片以能覆蓋住組織為前提，越小越好，太大的蓋玻片溶液不平整，顯微鏡觀察時(shí)組織可能不在一個(gè)平面，需要反復(fù)調(diào)整焦距。

5.蘇木精和伊紅染色時(shí)，最好摸索染色時(shí)間，以尋求最合適和漂亮的顏色搭配，不同的組織染色能力有所差異，比如淋巴組織內(nèi)淋巴細(xì)胞較多，細(xì)胞核比較大，染出來(lái)可能藍(lán)色居多，肌肉組織中肌顯微和細(xì)胞質(zhì)比例高，染出來(lái)紅色

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6.總體原則是染色寧愿偏淺不要偏深，偏深的染色難以判別細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)。

免疫組化注意事項(xiàng)：

1.免疫組化一般以冰凍切片為主，但石蠟切片也可以做免疫組化。

2.冰凍切片一般采取先固定（4%多聚甲醛），然后用OCT包埋（冰凍包埋）。3.免疫組化步驟繁瑣，時(shí)間較長(zhǎng)，因此用包被過(guò)的切片來(lái)防止掉片。常用的包埋劑有APES，多聚賴氨酸和明膠等。包被過(guò)程相對(duì)簡(jiǎn)單，可購(gòu)公司的商品包被試劑盒，按照說(shuō)明書操作。

4.石蠟切片的免疫組化有時(shí)需要抗原修復(fù)。原因：固定液會(huì)對(duì)組織的抗原性產(chǎn)生影響，示抗原表位發(fā)生構(gòu)象變化，可以通過(guò)化學(xué)處理和熱處理來(lái)還原組織的抗原性。常用的修復(fù)液為枸櫞酸鈉緩沖液，一般采取熱修復(fù)，即把切片放置在緩沖液中然后加熱至沸騰。

5.免疫組化切片厚度一般為8~12微米。6.選擇合適的抗體（單抗、多抗）。

7.預(yù)實(shí)驗(yàn)確定合適的H2O2、封閉液和抗體作用濃度和時(shí)間。8.選用包被過(guò)的玻片，動(dòng)作輕柔，防止掉片。9.設(shè)置陽(yáng)性、陰性和空白對(duì)照。

10.顯微鏡下控制顯色，放置顯色過(guò)淺或過(guò)深。

11.復(fù)染時(shí)蘇木精濃度可稀釋，時(shí)間縮短，避免染色過(guò)深。

12.遇到問(wèn)題逐項(xiàng)排除，尋找原因。詳細(xì)的問(wèn)題解決和相關(guān)技術(shù)貼可參照丁香園論壇或生物秀論壇，搜素“免疫組化”可以找到相關(guān)資料。

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溶液配制

固定液

4%多聚甲醛：4g多聚甲醛粉末加入100ml 0.1M PBS，邊加入邊加熱攪拌，滴加0.2M NaOH溶液并60度水浴促進(jìn)粉末溶解，完全溶解后HCl調(diào)PH至7.4，4度保存。

Bouin氏液：75ml 飽和苦味酸溶液，25ml多聚甲醛，5ml冰醋酸；使用前三者混在一起，混勻。

染液

伊紅染液：1%醇溶性伊紅配方為1g伊紅加入到100ml 80%酒精中，溶解。

蘇木精染液：

1.哈里新（Harris）蘇木紫液：甲液：蘇木紫Ig，無(wú)水乙醇10ml。乙液：硫酸鋁鉀（或銨）20g，蒸餾水200ml，加溫溶解。甲、乙二液分別溶解后混合，加熱煮佛，沸后去火，待溶液不翻騰時(shí)即加入氧化汞0.5g（此時(shí)有大量氣泡生成，故容器宜大，以免液體溢出）。然后染液迅速冷卻，冷卻后過(guò)濾，即可位應(yīng)用。用時(shí)每100ml加冰醋酸4ml；

2.邁爾（Mayer）蘇木紫液：將蘇木柴0.1g放入蒸餾水100ml中煮沸溶解，再加入硫酸鋁鉀5g，和碘酸鈉0.02g，攪動(dòng)直到全部溶解，加入水合氯醛5g和枸椽酸0.1g，加煮沸5min，冷卻、過(guò)濾，放置過(guò)夜，即可應(yīng)用。染色時(shí)間約10~20min；

3.歐立區(qū)（Ehrlich）蘇木紫：將蘇木紫2g溶于無(wú)水乙醇100ml中；將硫酸鋁鉀15g溶于蒸餾水100ml中，加入甘油100ml，將二液混合，最后加入冰醋酸10ml，充分混勻后，盛于無(wú)色小口瓶?jī)?nèi)，暴露于日光下，使其自然成熟，約需3個(gè)月。染色時(shí)間約5~20min。此液貯存愈久，染色力愈強(qiáng)。若在其中加入碘酸鈉300mg，使人工成熟，配成后即可應(yīng)用；

4.卡拉茲（Carrazzi）蘇木紫：將蘇木紫0.5g溶解于甘油100ml中，將硫酸鋁鉀25g溶解于蒸餾水350ml中溶解后將二液慢慢混合，并充分搖勻。將碘化鉀0.1g放于蒸餾水50ml中，加微溫溶解，然后加入蘇木紫液中，充分搖勻，翌日可用。

南京農(nóng)大康海泓整理，Email:snai1621@126.com

免疫組化

0.3%~1%雙氧水：

商品化30%雙氧水溶甲醇稀釋到適當(dāng)濃度。

1~5%BSA（羊血清、脫脂乳）： 0.01M PBS配制。

Triton-PBS：

100微升Triton-100加入到100ml 0.01PBS中，混勻。