第一篇：真菌的分子鑒定

真菌的分子鑒定

內(nèi)生真菌(Endophyticfungi)是指那些在其生活史中的某一段時(shí)期生活在植物組織內(nèi)，對(duì)植物組織沒有引起明顯病害癥狀的真菌，真菌的分子鑒定。近年來的研究表明，內(nèi)生真菌可以產(chǎn)生與宿主相同或相似的代謝產(chǎn)物，對(duì)相應(yīng)的內(nèi)生真菌及其代謝產(chǎn)物的研究已經(jīng)成為尋找藥物來源的一種新途經(jīng)。本文以我國特有藥用植物——喜樹(CamptothecaacuminataDecne.)為實(shí)驗(yàn)材料，對(duì)喜樹內(nèi)生真菌的組織分布及分離方法進(jìn)行初步研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，內(nèi)生真菌分離的表面消毒以75%酒精和0.1%升汞結(jié)合的方法較好。對(duì)喜樹的根部和莖部的升汞消毒時(shí)間以4～5min為宜，喜樹葉子的升汞消毒時(shí)間應(yīng)控制在2min左右。在所試條件下共計(jì)分離得到70株內(nèi)生真菌，主要分布在樹葉(42.9%)和皮部(35.7%)，根部(14.3%)和種子(7.1%)中的內(nèi)生真菌數(shù)目較少，在木質(zhì)部未分離到內(nèi)生真菌。采用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)結(jié)合的方法對(duì)所得菌株進(jìn)行鑒定。應(yīng)用形態(tài)學(xué)方法共鑒定出6株內(nèi)生真菌，分布于6屬。按照培養(yǎng)特征，把所得內(nèi)生真菌歸為27個(gè)形態(tài)類群。選取不同形態(tài)類群中的代表菌株，擴(kuò)增并測(cè)定其rDNAITS區(qū)段的DNA序列，結(jié)合內(nèi)生真菌與GenBank中參考菌株堿基序列相似性和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析，確定其分類地位，鑒定材料《真菌的分子鑒定》。共獲得18株內(nèi)生真菌的ITS序列，分析結(jié)果表明，這18株內(nèi)生真菌分屬于2個(gè)亞門，4綱，8目，8科，14屬;形態(tài)學(xué)鑒定與分子生物學(xué)鑒定結(jié)果一致。鑒定結(jié)果在一定程度上反應(yīng)了喜樹生態(tài)系內(nèi)生真菌的生物多樣性。在本研究中，共分離得到18株擬莖點(diǎn)霉屬(phomopsis)菌株，占25.7%，為優(yōu)勢(shì)菌群，對(duì)其進(jìn)行了基于ITS區(qū)段的系統(tǒng)發(fā)育分析。本文采用薄層層析TLC方法與高效液相色譜HpLC法，從3株內(nèi)生真菌CZ-

14、CZ-

17、CZ-18的發(fā)酵產(chǎn)物中檢出喜樹堿，含量為0.03-0.04mg/g。發(fā)酵產(chǎn)物是以喜樹種子煎汁液體培養(yǎng)基培養(yǎng)。

內(nèi)生真菌(Endophyticfungi)是指那些在其生活史中的某一段時(shí)期生活在植物組織內(nèi)，對(duì)植物組織沒有引起明顯病害癥狀的真菌。近年來的研究表明，內(nèi)生真菌可以產(chǎn)生與宿主相同或相似的代謝產(chǎn)物，對(duì)相應(yīng)的內(nèi)生真菌及其代謝產(chǎn)物的研究已經(jīng)成為尋找藥物來源的一種新途經(jīng)。本文以我國特有藥用植物——喜樹(CamptothecaacuminataDecne.)為實(shí)驗(yàn)材料，對(duì)喜樹內(nèi)生真菌的組織分布及分離方法進(jìn)行初步研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，內(nèi)生真菌分離的表面消毒以75%酒精和0.1%升汞結(jié)合的方法較好。對(duì)喜樹的根部和莖部的升汞消毒時(shí)間以4～5min為宜，喜樹葉子的升汞消毒時(shí)間應(yīng)控制在2min左右。在所試條件下共計(jì)分離得到70株內(nèi)生真菌，主要分布在樹葉(42.9%)和皮部(35.7%)，根部(14.3%)和種子(7.1%)中的內(nèi)生真菌數(shù)目較少，在木質(zhì)部未分離到內(nèi)生真菌。采用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)結(jié)合的方法對(duì)所得菌株進(jìn)行鑒定。應(yīng)用形態(tài)學(xué)方法共鑒定出6株內(nèi)生真菌，分布于6屬。按照培養(yǎng)特征，把所得內(nèi)生真菌歸為27個(gè)形態(tài)類群。選取不同形態(tài)類群中的代表菌株，擴(kuò)增并測(cè)定其rDNAITS區(qū)段的DNA序列，結(jié)合內(nèi)生真菌與GenBank中參考菌株堿基序列相似性和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析，確定其分類地位。共獲得18株內(nèi)生真菌的ITS序列，分析結(jié)果表明，這18株內(nèi)生真菌分屬于2個(gè)亞門，4綱，8目，8科，14屬;形態(tài)學(xué)鑒定與分子生物學(xué)鑒定結(jié)果一致。鑒定結(jié)果在一定程度上反應(yīng)了喜樹生態(tài)系內(nèi)生真菌的生物多樣性。在本研究中，共分離得到18株擬莖點(diǎn)霉屬(phomopsis)菌株，占25.7%，為優(yōu)勢(shì)菌群，對(duì)其進(jìn)行了基于ITS區(qū)段的系統(tǒng)發(fā)育分析。本文采用薄層層析TLC方法與高效液相色譜HpLC法，從3株內(nèi)生真菌CZ-

14、CZ-

17、CZ-18的發(fā)酵產(chǎn)物中檢出喜樹堿，含量為0.03-0.04mg/g。發(fā)酵產(chǎn)物是以喜樹種子煎汁液體培養(yǎng)基培養(yǎng)。

第二篇：真菌鑒定方法

真菌鑒定方法

一般常用的有：

1、直接鑒定法

2、通過篩子檢驗(yàn)

3、比重檢驗(yàn)法

4、染色檢驗(yàn)法

5、洗滌檢驗(yàn)法

6、保濕萌芽檢驗(yàn)

7、分離培養(yǎng)檢驗(yàn)

真菌主要是酵母，霉菌和大型真菌三種，最常用的鑒定方法就是表形觀察，霉菌和大型真菌可以通過菌絲的顏色，孢子的形態(tài)進(jìn)行區(qū)分，輔以23srRNA就基本ok，酵母可以通過發(fā)酵代謝觀察輔以23rRNA進(jìn)行鑒定，真菌鑒定方法。

真菌是細(xì)菌的一種嗎?

隨著生活水平的逐漸提高，人們的衛(wèi)生防病意識(shí)也在不斷加強(qiáng)。大多數(shù)人知道細(xì)菌可以導(dǎo)致疾病，并習(xí)慣用“有病菌”或“有細(xì)菌”來形容一個(gè)臟的環(huán)境或物品。那么，真菌又是怎么回事，是細(xì)菌的一種嗎?的確，真菌也很微小，也能使人生病，但它和細(xì)菌有著本質(zhì)的區(qū)別。

我們知道，植物和動(dòng)物都是由細(xì)胞組成的，細(xì)胞內(nèi)都有細(xì)胞核，鑒定材料《真菌鑒定方法》。而微生物中只有真菌具有真正的細(xì)胞核和完整的細(xì)胞器，故又稱真核細(xì)胞型微生物;細(xì)菌僅有原始核結(jié)構(gòu)，無核膜和核仁，細(xì)胞器很少，屬于原核細(xì)胞型微生物;而病毒則沒有細(xì)胞結(jié)構(gòu)，屬于原生微生物。

真菌在自然界中分布極廣，有十萬多種，其中能引起人或動(dòng)物感染的僅占極少部分，約300種。很多真菌對(duì)人類是有益的，如面粉發(fā)酵，做醬油、醋、酒和霉豆腐等都要用真菌來發(fā)酵。工業(yè)上許多酶制劑、農(nóng)業(yè)上的飼料發(fā)酵都離不開真菌。許多真菌還可食用，如蘑菇、銀耳、香菇、木耳等。真菌還是醫(yī)藥事業(yè)中的寶貴資源，有的可以用于生產(chǎn)抗生素和維生素以及酶類;有的本身就可以入藥用于醫(yī)治疾病，如中藥馬勃、茯苓、冬蟲夏草等。

真菌還可引起動(dòng)、植物和人類的多種疾病，在人類主要有三種類型：①真菌感染;②變-態(tài)反應(yīng)性疾病;③中毒性疾玻

霉菌

亦稱“絲狀菌”。屬真菌。體呈絲狀，叢生，可產(chǎn)生多種形式的孢子。多腐生。種類很多，常見的有根霉、毛霉、曲霉和青霉等。霉菌可用以生產(chǎn)工業(yè)原料(檸檬酸、甲烯琥珀酸等)，進(jìn)行食品加工(釀造醬油等)，制造抗菌素(如青霉素、灰黃霉素)和生產(chǎn)農(nóng)藥(如“920”、白僵菌)等。但也能引起工業(yè)原料和產(chǎn)品以及農(nóng)林產(chǎn)品發(fā)霉變質(zhì)。另有一小部分霉菌可引起人與動(dòng)植物的病害，如頭癬、腳癬及番薯腐爛病等。

酵母菌

屬真菌。體呈圓形、卵形或橢圓形，內(nèi)有細(xì)胞核、液泡和顆粒體物質(zhì)。通常以出芽繁殖;有的能進(jìn)行二等分分-裂;有的種類能產(chǎn)生子囊孢子。廣泛分布于自然界，尤其在葡萄及其他各種果品和蔬菜上更多。是重要的發(fā)酵素，能分解碳水化合物產(chǎn)生酒精和二氧化碳等。生產(chǎn)上常用的有面包酵母、飼料酵母、酒精酵母和葡萄酒酵母等。有些能合成纖維素供醫(yī)藥使用，也有用于石油發(fā)酵的。

啤酒酵母(Saccharomyces)

屬酵母菌屬。細(xì)胞呈圓形、卵形或橢圓形。以出芽繁殖，能形成子囊孢子。在發(fā)酵工業(yè)上，可用來發(fā)酵生產(chǎn)酒精或藥用酵母，也可通過菌體的綜合利用提取凝血質(zhì)、麥角固醇、卵磷脂、輔酶甲與細(xì)胞色素丙等產(chǎn)品。

紅曲霉素(Monascuspurpureus)屬于囊菌綱，曲霉科。菌絲體紫紅色。無性生殖時(shí)，茵絲分枝頂端形成單獨(dú)的或一小串球形或梨形的分生抱子。有性生殖時(shí)，產(chǎn)生球形、橙紅色的閉囊果，內(nèi)生含有八個(gè)子囊孢子的子囊。紅曲霉可制紅曲、釀制紅乳腐和生產(chǎn)糖化酶等

第三篇：真菌培養(yǎng)及鑒定

真菌培養(yǎng)及鑒定

、真菌培養(yǎng)及鑒定

1.采集標(biāo)本 體表真菌的標(biāo)本有毛發(fā)、皮屑、甲屑、痂等，標(biāo)本在分離前常先用75%的乙醇消毒，真菌培養(yǎng)及鑒定。深部真菌的標(biāo)本可根據(jù)情況取痰、尿液、糞便、膿液、口腔或陰-道分泌物、血液、腦脊液、各種穿刺液和活檢組織，采集標(biāo)本應(yīng)注意無菌操作。

2.培養(yǎng)檢查：可提高真菌檢出率，并能確定菌種。標(biāo)本接種于葡萄糖蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基(Sabouraud agar)上，置室溫或37℃培養(yǎng)1～3周。必要時(shí)可行小培養(yǎng)協(xié)助鑒定。菌種鑒定常根據(jù)菌落的形態(tài)及顯微鏡下形態(tài)判斷。對(duì)某些真菌，有時(shí)尚需配合其他鑒別培養(yǎng)基、生化反應(yīng)、分子生物學(xué)方法確定。

真菌培養(yǎng)的方法與直接鏡檢法相比較而言，更能對(duì)大部分真菌感染的灰指甲作出準(zhǔn)確的鑒定，也是診斷灰指甲的一個(gè)很重要的手段。下面我們就從培養(yǎng)基的選擇、培養(yǎng)時(shí)間、菌種鑒定三方面來了解一下灰指甲的真菌培養(yǎng)法。

1.培養(yǎng)基的選擇

通常培養(yǎng)真菌會(huì)同時(shí)選用兩種培養(yǎng)基，如果單用一種培養(yǎng)基，則容易忽略其它種類的真菌診斷。常見的兩種培養(yǎng)基，一種為沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基中加抗菌劑，常為氯霉素和放線菌酮;另一種是沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基中僅加氯霉素，不加放線菌酮。

2.培養(yǎng)時(shí)間

各種真菌的生長速度不同，所以報(bào)告的時(shí)間也不同。一般皮膚癬菌生長較緩慢，在26℃-28℃的環(huán)境下需要培養(yǎng)2-4周才能發(fā)報(bào)告，但是，皮膚癬菌含蓋的菌種較多也需要區(qū)別對(duì)待;酵母菌生長較快，通常2-3就可以發(fā)報(bào)告，如果為陰性則需要觀察1周;霉菌生長也比較快，一般2-4天就可以發(fā)報(bào)告。

3.菌種鑒定

(1)絲狀真菌：包括皮膚癬菌和霉菌，根據(jù)菌落形成所需要的時(shí)間，在不同條件下生長的情況，菌落表面及背面的形態(tài)、色素，培養(yǎng)基中有無色素，培養(yǎng)物用乳酚棉藍(lán)染色后鏡檢找特征性標(biāo)志結(jié)構(gòu)。(2)酵母菌：分為形態(tài)學(xué)鑒定及生化試驗(yàn)，鑒定材料《真菌培養(yǎng)及鑒定》。形態(tài)學(xué)鑒定主要觀察有無假菌絲產(chǎn)生，如有則為念珠菌屬，如無則為念珠菌以外的酵母菌;生化試驗(yàn)最為常用的是ApI系統(tǒng)，用此法鑒定準(zhǔn)確，但價(jià)格較貴。)絲狀真菌：主要是形態(tài)學(xué)的鑒定，如直接涂片觀察，小培養(yǎng)顯微鏡鑒定，誘導(dǎo)形態(tài)觀察(25℃與35℃下雙相型真菌的特征孢子及菌絲的產(chǎn)生和兩種菌落的形成及腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基，KT培養(yǎng)基，KelleyAgar培養(yǎng)基轉(zhuǎn)相誘導(dǎo)，另外常用的還有皮膚癬菌VB1生長刺激，吳氏熒光檢查，毛發(fā)穿孔試驗(yàn)及在特殊情況下進(jìn)行的一些生化鑒定等。其中，小培養(yǎng)顯微鏡檢對(duì)于絲狀真菌的鑒定，特點(diǎn)是動(dòng)態(tài)直觀，易于觀察，且節(jié)約材料。解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院皮膚科馬天

(2)酵母菌鑒定：形態(tài)學(xué)鑒定主要是玉米吐溫誘導(dǎo)下特征菌絲及特征孢子的檢驗(yàn)，血清芽管形成，而在形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)上還必須進(jìn)行生化鑒定：有標(biāo)準(zhǔn)鑒定，自動(dòng)儀器鑒定，顯色鑒定，其中，自動(dòng)儀器鑒定(如ApI20C，ID32C等)，顯色鑒定對(duì)于酵母樣真菌的鑒定，特點(diǎn)是快速簡便;標(biāo)準(zhǔn)鑒定是按傳統(tǒng)雙歧表流程鑒定(包括糖同化試驗(yàn)，糖發(fā)酵試驗(yàn)，CAFC酚氧化酶試驗(yàn)，尿酶試驗(yàn)，KNO3同化試驗(yàn)，脂肪酸需求試驗(yàn))，是真菌鑒定的金標(biāo)準(zhǔn)，系統(tǒng)準(zhǔn)確，缺點(diǎn)是程序繁瑣，耗時(shí)長，與臨床治療不太適應(yīng)。此外，還有血清學(xué)玻片凝集試驗(yàn)，動(dòng)物致病性實(shí)驗(yàn)，分子生物學(xué)鑒定：如核酸雜交，DNA探針雜交，pCR擴(kuò)增序列分析，pCR-SSCp單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析，pCR-RFLp限制性片段長度多態(tài)性分析，pCR-RApD隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性分析，pFCG脈沖電泳核型分析等。

對(duì)于酵母樣真菌首選CHROMagar念珠菌顯色培養(yǎng)基，而顯色培養(yǎng)基不能鑒定的酵母樣真菌可采用自動(dòng)儀器YBC卡進(jìn)行鑒定或ApI板;條件較差的實(shí)驗(yàn)室可采用傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)鑒定法中鑒定值較高的試驗(yàn)，如酚氧化酶鑒定新型隱球菌(+)，尿素區(qū)分毛孢子菌屬(+)，地絲菌屬(-)，念珠菌屬(-)(克柔念珠菌/溶脂念珠菌+)，球擬酵母屬(-)，隱球菌屬(+)，玉米-土溫培養(yǎng)基上產(chǎn)菌絲區(qū)分念珠菌屬(+)與球擬酵母屬(-)，隱球菌屬(-)與毛孢子菌屬(+)，地絲菌屬(+)。而同化試驗(yàn)推薦平皿法，一個(gè)平皿內(nèi)可觀察多種糖類的同化情況，且結(jié)果易于觀察，重復(fù)性好。對(duì)于絲狀真菌及雙相型真菌，可采用小培養(yǎng)法，快速簡便易于觀察。而對(duì)于雙相型真菌還須經(jīng)過腦心浸液培養(yǎng)基轉(zhuǎn)相試驗(yàn)后確證。而血清學(xué)及分子生物學(xué)則主要用于流行病學(xué)和一些難培養(yǎng)難鑒定真菌的檢驗(yàn)，由于成本高或要求技術(shù)難度較高，故而不適合在常規(guī)工作中采

第四篇：分子鑒定

分子鑒定

現(xiàn)代真菌鑒定分型方法

北京大學(xué)第一醫(yī)院(100434)王端禮

真菌 的 鑒 定不僅是臨床的需要，在植物病理學(xué)、生物退化、生物技術(shù)和環(huán)境的研究都很重要，分子鑒定。許多真菌已經(jīng)鑒定到種，但是分類學(xué)家仍在忙于新種的描述和其分類的研究。有些菌種由于經(jīng)濟(jì)學(xué)的關(guān)系或是病理學(xué)的重要性，有深人的研究，其他則需要現(xiàn)代手段來進(jìn)行研究。

一、形 態(tài)學(xué)

用表 型 特 征來進(jìn)行分類鑒定，是過去和現(xiàn)在都普遍應(yīng)用的方法。致病真菌的鑒定，需要光鏡，現(xiàn)在更加上熒光顯微鏡和細(xì)胞化學(xué)，還有各種染色法，如子囊泡子染色法。真菌在宿主體內(nèi)鑒定比較困難，如菌絲只能看到有無分隔，有無色素。需要培養(yǎng)來鑒定菌種。某些病例用種特異性抗體探針非常有用，但此種技術(shù)尚未在醫(yī)真菌學(xué)領(lǐng)域內(nèi)作為常規(guī)技術(shù)使用。合適的培養(yǎng)基培養(yǎng)鑒定菌種，是常用的方法。

醫(yī)學(xué) 真 菌 學(xué)家常見到的是半知菌，要看抱子形態(tài)和抱子發(fā)生，看產(chǎn)抱細(xì)胞，即分生抱子梗。有兩種型，一是芽生抱子發(fā)生，在產(chǎn)抱細(xì)胞上有一小點(diǎn)產(chǎn)生分生抱子，另一是葉狀抱子發(fā)生，整個(gè)細(xì)胞是產(chǎn)抱細(xì)胞，分成一至數(shù)個(gè)細(xì)胞?；诔⒔Y(jié)構(gòu)觀察，有許多詞語，但未能普遍應(yīng)用。有的真菌沒有分生抱子，但仍有一些特征，如菌核(sclerotia)、厚壁抱子和一些特殊的菌絲結(jié)構(gòu)，如皮膚癬菌。在少數(shù)情況下，一些機(jī)會(huì)真菌產(chǎn)生有性結(jié)構(gòu)，有許多特點(diǎn)用于菌種鑒定，如子囊菌、擔(dān)子菌和結(jié)合菌。

電鏡，T EM是觀察菌的斷面，子囊菌酵母和擔(dān)子菌酵母的橫隔不同，SEM在實(shí)際應(yīng)用有許多發(fā)現(xiàn)，如子囊菌的表面結(jié)構(gòu)可以鑒定到種。

現(xiàn) 代 形 態(tài)學(xué)技術(shù)，如自動(dòng)成像分析、電子顆粒體積、分?jǐn)?shù)幾何學(xué)分析形態(tài)學(xué)的特點(diǎn)。

由于 表 型 各種詞語沒有一定的標(biāo)準(zhǔn)，有很大的主觀性，某些表型特征也不穩(wěn)定，受環(huán)境影響，有的不能在人工培養(yǎng)基上生長，有一些真菌尚未分類，分類概念有待近一步建立，鑒定材料《分子鑒定》。

二、分 子 生物學(xué)

表型 分 類 受限，生理生化技術(shù)在絲狀真菌鑒定方面，或是費(fèi)時(shí)費(fèi)事或是結(jié)果不準(zhǔn)。分子生物學(xué)非常適用。有兩種技術(shù)，第一，pCR技術(shù)，可以分析少量真菌細(xì)胞，甚至單個(gè)真菌抱子。第二，選擇通用寡核昔酸對(duì)真菌種特異性引物，測(cè)定其核昔酸序列。分子生物學(xué)的研究目的由于生物多樣性有四個(gè)目的。I)系統(tǒng)發(fā)生研究。2)分類學(xué)的研究，在屬、種水平。3)鑒定應(yīng)用，即決定明確的分類名稱。4)流行病學(xué)和群體的遺傳學(xué)研究。具體方法不再詳述。

三、其 他 :

I，生 理 學(xué) 和生物化學(xué)

在純 培 養(yǎng) 上真菌生長比較快，可以使用生理、生化方法來鑒定菌種。如黑酵母的鑒定。不同的生長溫度也用于鑒定。有性和無性是一個(gè)輔助工具。在一定的培養(yǎng)基上，有對(duì)照，其生長速度也可用于鑒定，如青霉。Ap[系統(tǒng)也用于絲狀真菌的鑒定。

2.次 級(jí) 代謝產(chǎn)物

次級(jí) 代 謝 產(chǎn)物既不是為了生長需要，也不是介導(dǎo)基本代謝，常常發(fā)現(xiàn)它是一個(gè)與分了有關(guān)的混合物，有特殊的和極罕見的化學(xué)結(jié)構(gòu)。常見的是固醇、菇、類堿、香豆素等，某些是真菌毒素。將小量從培養(yǎng)皿切下來的標(biāo)本，直接進(jìn)行層析色譜法檢查，比傳統(tǒng)濃縮抽取提純法簡單易行。此法用于地衣的鑒定較好。很少用于真菌分類，由于對(duì)環(huán)境有一定影響，而且比較難，較少應(yīng)用，但有人用于子囊菌的分類。

3.泛 酉昆 系統(tǒng)

是一 種 初 級(jí)代謝產(chǎn)物，起重要作用。泛釀即輔酶Q，是呼吸系統(tǒng)電子傳播鏈的攜帶者。一些異戊二烯(isoprene)接觸醒核各有不同，對(duì)鑒定到屬或?qū)僖韵滤胶苡袔椭Ｖ饕b定細(xì)菌和酵母，也用于黑酵母和絲狀真菌。

(Ya ma da Y ,e tal.In t.J.Genet 1989;5 6:309 Y ag uchiJ > e tal.M ycoscience 1996;3 7:55)0

4.脂 肪 酸組成此法 在 細(xì) 菌學(xué)方面是常規(guī)應(yīng)用的。一是成分，二是相對(duì)濃度。極少用于真菌分類。使用熱解氣相色譜法、熱解塊狀光譜儀、氣相色譜儀、隔膜水相聚合物雙相系統(tǒng)等，主要應(yīng)用這些方法。近來應(yīng)用氣相色譜法合并多變量統(tǒng)計(jì)分析方法，成功地用于絲狀真菌，包括卵菌、擔(dān)子菌、結(jié)合菌、甚至只有菌絲的真菌。用于種間水平。應(yīng)注意許多變化，如培養(yǎng)狀態(tài)和溫度是最主要的。

5.細(xì) 胞 壁組成子 囊 菌 和擔(dān)子菌含有幾丁質(zhì)和葡萄糖，結(jié)合菌含有脫乙酞幾丁質(zhì)(chitosen)和葡聚糖醛酸。不同的皮膚癬菌含有不同的糖分，醉母細(xì)胞壁或是缺乏或是含有少量其他多糖(如巖藻搪、乳糖、鼠李糖、木搪等)。

6.蛋 白 質(zhì)組成用 電 泳 方法可以產(chǎn)生同工酶，可鑒定到屬或種。電泳、免疫學(xué)方法、蛋白質(zhì)分析等可解決種間特性。同工酶分析是一個(gè)經(jīng)濟(jì)和實(shí)用技術(shù)。等位基因酶(allozyme)通常用于系統(tǒng)發(fā)生的研究。

第五篇：真菌的鑒定

真菌的鑒定

麥曲在黃酒釀造中起著重要的作用，真菌的鑒定。分析微生物在麥曲中的區(qū)系分布和其中微生物菌群的系統(tǒng)發(fā)育，對(duì)于理順麥曲中的微生物與產(chǎn)地環(huán)境的相互關(guān)系、建立麥曲微生物生態(tài)數(shù)據(jù)庫和麥曲品質(zhì)的分子評(píng)價(jià)指標(biāo)，具有重要的指導(dǎo)意義。

不同培養(yǎng)基進(jìn)行真菌平板分離的結(jié)果

文章來源華夏酒報(bào)

為了最大限度地分離出麥曲中的真菌，采用了三種培養(yǎng)基，其中pDA和CpK培養(yǎng)基是用來分離真菌的常用培養(yǎng)基，此外還使用了麥曲浸提液培養(yǎng)基(WQE)，因?yàn)樗臓I養(yǎng)成份近似于微生物最原始的生存環(huán)境。對(duì)于三種培養(yǎng)基進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)，pDA和WQE培養(yǎng)基上的菌落數(shù)在48小時(shí)后達(dá)到最大，菌落數(shù)分別達(dá)到4.7×104cfu/g干曲和8.4×104cfu/g干曲。而在CpK培養(yǎng)基上，由于本身是合成培養(yǎng)基，營養(yǎng)不夠豐富，所以24小時(shí)后開始慢慢形成菌落，56小時(shí)后達(dá)到最大值，僅為1.4×104 cfu/g干曲。

不同培養(yǎng)基的麥曲真菌分布

根據(jù)菌落大孝形態(tài)和顏色等表型特征進(jìn)行初步區(qū)分，共得到24株純種菌株。各個(gè)純株在3種分離培養(yǎng)基上的分布情況見表1。從pDA，CpK和WQE三種培養(yǎng)基上分離得到的純種真菌分別為8種、18種和11種。pDA是營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基，但分離出來的真菌數(shù)目最少。而近似于微生物最原始生存環(huán)境的WQE培養(yǎng)基分離得到的真菌種類，要比預(yù)期的少。在合成培養(yǎng)基CpK上分離獲得的真菌種類最多，暗示在低營養(yǎng)長時(shí)間的培養(yǎng)條件下，能夠較多地回收得到麥曲樣品中的真菌。

將10—5稀釋度以上檢測(cè)到的真菌認(rèn)為是麥曲樣品中的優(yōu)勢(shì)菌。從表中可以看出，不同的培養(yǎng)基分離出來的優(yōu)勢(shì)菌是不一樣的，且每一種培養(yǎng)基都能檢測(cè)到其它培養(yǎng)基所不能檢測(cè)到的優(yōu)勢(shì)菌株，所以必須聯(lián)合使用多種分離培養(yǎng)基，才能準(zhǔn)確解析麥曲中的真菌多樣性。另外，在分離培養(yǎng)基中有必要加入去氧膽酸鈉來抑制菌絲的蔓延。

純種真菌的鑒定

對(duì)分離獲得的24株真菌純株進(jìn)行形態(tài)初步鑒定和基于ITS序列的分子鑒定，具體測(cè)序結(jié)果見表 綜合平板分離和測(cè)序的結(jié)果可以看出，通過大規(guī)模的系統(tǒng)分離培養(yǎng)方法確定麥曲中的優(yōu)勢(shì)真菌為：傘枝犁頭霉(Absidia corymbifera—like)，米曲霉(Aspergillus oryzae)、煙曲霉(Aspergillus fumigatus)、黑曲霉(Aspergillus.niger)、小孢根霉(Rhizopus microsporus)、微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)、季氏畢赤氏酵母(pichia guilliermondii)和異常畢赤酵母(pichia anomala)，鑒定材料《真菌的鑒定》。

本研究分離鑒定出的焦曲霉(Aspergillus ustus)、土曲霉(Aspergillus terreus—like)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、桔青霉(penicillium citrimum)、季氏畢赤酵母、異常畢赤酵母，小孢根霉，多變根毛霉(Rhizomucor variabilis)、球毛殼霉(Chaetomium globasum)、阿姆斯特丹散囊菌(Eurotium amstelodami)和phaeosphaeria fu-ckelii等菌株在以前的研究結(jié)果中均未出現(xiàn)。所用的麥曲是人工腳踏成型，此前公司采用培養(yǎng)法對(duì)機(jī)制麥曲中的真菌進(jìn)行過研究，機(jī)制麥曲中的優(yōu)勢(shì)真菌為傘枝犁頭霉(Absidia corymbifera)、米根霉(Rhizopus oryzae)、微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、煙曲霉(Aspergillus fumigatus)。除了米根霉以外，其余優(yōu)勢(shì)真菌與本文的研究結(jié)果一致。

人工腳踏成型麥曲中的真菌種類比機(jī)械壓制成型麥曲豐富，其原因是人工踩制曲坯能起到提漿作用，賦予曲坯表面較豐富的營養(yǎng)和較好的保溫功能，因而比機(jī)械壓制成型的曲坯更適合微生物的生長繁殖。

對(duì)分離獲得的真菌純株序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)，所分離得到的純種菌株大致分為11個(gè)屬，分別是曲霉屬(Aspergillus)、犁頭霉屬(Absidia)、根霉屬(Rhizopusmucor)、毛霉屬(Rhizopus)、青霉屬(penicillium)、散囊菌屬(Eurotium)、枝孢屬(Cladosporium)、畢赤酵母屬(pichia)、球毛殼屬(Chaetomium)、念珠屬(Candida)和伊薩酵母屬(Issatchenkia)，反映出紹興黃酒成品麥曲中真菌的資源非常豐富。從屬的分類水平來看，在腳踏曲中出現(xiàn)的屬除了散囊菌屬(Eurotium)、畢赤酵母屬(pichia)和球毛殼屬(Chaetomium)外，其它的屬在機(jī)制曲中均有出現(xiàn)。

本文所得到的序列用菌名加代號(hào)表示，來自于GenBank數(shù)據(jù)庫的序列用菌名加登錄號(hào)表示。比例尺代表5%的核酸序列差異性。