第一篇：黃秋葵功能成分提取技術(shù)的研究進(jìn)展論文

摘 要：黃秋葵是一種富含蛋白質(zhì)，維生素，黃酮及碳水化合物等營養(yǎng)與功能成分的綠色新型保健蔬菜，具有極高的食用和藥用價值。本文綜述了黃秋葵功能成分物質(zhì)的提取方法與技術(shù)，為其綜合開發(fā)利用提供科學(xué)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：黃秋葵;功能成分;提取;研究進(jìn)展

黃秋葵(Abelmoschus esculentus)，俗名羊角豆、咖啡秋葵、毛茄、補腎果等，為錦葵科、秋葵屬一年生草本植物，性喜溫暖，原產(chǎn)于非洲，素有蔬菜王之稱，其嫩莢富含果膠及多糖組成的粘性物質(zhì)，其莖、葉、芽、花、種子富含蛋白質(zhì)、維生素及礦物鹽等活性成分物質(zhì)，具有極高的營養(yǎng)食用價值和經(jīng)濟價值，而且還能作為一種園林綠化觀賞植物，因此，近幾年在國內(nèi)越來越受歡迎[1]。

由于黃秋葵功能活性成分具有極大的應(yīng)用價值，筆者就提取其多糖、果膠和黃酮等功能成分的方法與技術(shù)進(jìn)行綜述，旨在為黃秋葵功能性成分的開發(fā)與利用奠定基礎(chǔ)。黃秋葵功能成分作用

黃秋葵多糖可作為營養(yǎng)強化劑、增稠劑、懸浮劑和澄清助劑，具有增強體質(zhì)和抗疲勞等保健作用[2]。其果膠能促進(jìn)機體內(nèi)有機物的排泄，減少體內(nèi)毒素，還能降低體內(nèi)的膽固醇含量;果膠和多糖等組成的粘性物質(zhì)，對人體具有促進(jìn)胃腸蠕動、防止便秘等保健作用，適當(dāng)多食可增強性功能，還可以增強人體的耐力;另外黃秋葵低脂、低糖，可以作為減肥食品[3-4]。由于其含鋅和硒等微量元素，可增強人體防癌抗癌能力;且含有較多維生素A能有效保護視網(wǎng)膜，確保良好的視力，能防止白內(nèi)障的產(chǎn)生。黃秋葵中富含維生素C，可預(yù)防心血管疾病，能提高機體免疫力，而且維生素C和可溶性纖維(果膠)結(jié)合，有利于皮膚的保健，可以代替一些化學(xué)護膚用品[5-7]。植物多酚具有抗氧化、抑制酶活性、抗致突變、抑菌、消炎和降血壓等多種生物活性[8]。生物類黃酮是一種具有較強清除自由基和抗氧化能力的物質(zhì)，其抗氧化作用甚至比維生素C、維生素E還要高，還具有降脂、抗心血管疾病、抗骨質(zhì)疏松和防癌抗癌等作用，可在醫(yī)藥、化妝品、食品方面廣泛應(yīng)用[9]。黃秋葵功能成分提取方法與技術(shù)

2.1 多糖的提取

2.1.1 超聲波輔助法

超聲的機械化學(xué)作用可破壞細(xì)胞壁，加強細(xì)胞內(nèi)的傳質(zhì)作用，從而提高植物中有機化合物的提取速率，同時超聲波產(chǎn)生的“空化”作用可極大提高有效成分提取率。黃誠等采用超聲波輔助提取黃秋葵多糖[3]，得出最佳料液比、時間、提取液pH值、和溫度分別為1∶50、20 min、9和70℃，并在該條件下黃秋葵多糖的得率達(dá)6.8%。劉怡彤等利用同一方法提取黃秋葵多糖[10]，得到最佳超聲時間為90 min，超聲溫度為45℃，料液比為1∶45，超聲功率為84 W，并在此條件下多糖的含量可達(dá)2.671 mg/g。

2.1.2 微波輔助法

微波輻射加熱導(dǎo)致植物細(xì)胞內(nèi)的極性物質(zhì)產(chǎn)生大量的熱，液態(tài)水汽化，產(chǎn)生的壓力將細(xì)胞膜和細(xì)胞壁沖破，進(jìn)而導(dǎo)致胞外溶劑進(jìn)入胞內(nèi)溶解并釋放胞內(nèi)多糖等物質(zhì)，較大程度提高了多糖等物質(zhì)的萃取效率。高愿軍等以蒸餾水作為提取劑[11]，采用微波輔助法提取黃秋葵多糖，在微波功率為650 W，料液比為1∶25(g/mL)，浸提溫度90℃條件下提取5 min，多糖含量可達(dá)2.64%。該方法顯著縮短了提取時間。

2.1.3 纖維素酶法

酶法是利用酶反應(yīng)將原料組織分解加速有效成分的釋放和提取。高愿軍等采用纖維素酶法浸提黃秋葵多糖[11]，不僅高效、易操作而且對環(huán)境友好，最佳工藝條件為：酶解溫度45℃，酶解pH4.8，加酶量2%，料液比1∶35(g/mL)，在此條件下得到多糖提取率為6.32%。

2.1.4 水提醇沉法

任丹丹等采用水提醇沉法提取黃秋葵粗多糖[12]，經(jīng)此提取方法得到黃秋葵粗多糖的產(chǎn)率約為0.40%。水提取的缺點是耗時長且效率低。

2.2 果膠的提取方法

2.2.1 酸解鹽析法

黃誠等采用酸解鹽析法[13]，以黃秋葵去籽干果為原料提取果膠，通過正交實驗得出最佳工藝條件是pH=4，料液比為1∶10，溫度70℃，酸解時間110 min，無機酸類型為硫酸，在此條件下黃秋葵果膠的得率能達(dá)到29.10%。

2.2.2 微波輔助酸提醇沉法

李加興等運用微波輔助酸提醇沉工藝[14]，以黃秋葵干果為原料提取果膠，通過響應(yīng)面分析法優(yōu)化工藝參數(shù)得到最適宜的微波功率為590 W，pH為2.9，浸提溫度為74℃，在該工藝條件下浸提30 min可得果膠提取率為24.81%，與傳統(tǒng)直接加熱法相比大大縮短了浸提時間并提高了提取效率。

2.2.3 酸解醇沉法

劉曉霞等以黃秋葵花粉末為原料[15]，采用酸解乙醇沉淀的方法提取黃秋葵花果膠，并通過響應(yīng)面分析法對提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳料液比為1∶30，提取溫度為90℃，鹽酸溶液的pH=1.60和提取時間為2.76h，在此條件下提取果膠的平均得率達(dá)32.46%。酸解醇沉法雖然提取率高，但提取溫度也高，且耗時長，安全性低，酸提取易破壞果膠多糖的空間結(jié)構(gòu)及活性

第二篇：植物性香料提取技術(shù)的研究進(jìn)展

植物性香料提取技術(shù)的研究進(jìn)展香料是一種能被嗅感嗅出氣味和被味感品出香味的物質(zhì)，是用以調(diào)制香精的原料。植物性天然香料也稱植物性精油(essential oil)，是由植物的花、葉、莖、根和果實，或者樹木的葉、木質(zhì)、樹皮和樹根中提取的易揮發(fā)芳香組分的混合物。

近年來，美國、El本、韓國等發(fā)達(dá)國家對天然香料提取技術(shù)研究已經(jīng)相當(dāng)成熟，對應(yīng)用研究也很活躍；而目前我國還大多集中在對天然香料提取方面的研究，并且缺乏對深加工技術(shù)與高附加值產(chǎn)品方案的研究。因此，全面了解植物性天然香料的提取技術(shù)，對我國香料香精行業(yè)的發(fā)展具有深遠(yuǎn)的現(xiàn)實意義。發(fā)展歷史

香料的發(fā)展歷史悠久，從黃帝神農(nóng)氏時代人們采集樹皮、草根作為醫(yī)藥用品來驅(qū)疫避穢開始，現(xiàn)已有5000多年的歷史。起初人們把這些有香味的物質(zhì)作為敬神拜福，清凈身心之用，也用于祭祀和喪葬方面，后逐漸用于飲食、裝飾和美容。大約在8～l0世紀(jì)，人們已經(jīng)知道用蒸餾法分離香料。1370年第一種用乙醇提取的香水一匈牙利水(Eaudela Reimed Hongafie)出現(xiàn)了，開始只是從迷迭香中蒸餾制得，其后才逐漸從薰衣草等植物中制得。自1420年，在蒸餾中采用蛇形

冷凝器后，精油發(fā)展迅速，法國格拉斯(Grasse)因生產(chǎn)花油和香水，而成為世界著名的天然香料(特別是香花)的生產(chǎn)基地。此后各地逐步采用蒸餾提取精油，同時從柑桔樹的花、果實及葉中提取精油，這樣就從香料植物固體轉(zhuǎn)變成液體，提取了植物中的精油，這是劃時代的進(jìn)展。l8世紀(jì)后，由于有機化學(xué)的發(fā)展，人們在對天然香料的提取、成份分析等方面都取得了很大進(jìn)步。隨著天然香料應(yīng)用范圍不斷擴大，香料工業(yè)急劇發(fā)展，天然香料提取技術(shù)也得到不斷改進(jìn)ll J。提取技術(shù)

2．1 榨磨法

該方法主要用于提取柑桔類果實精油，如檸檬油、甜橙油、香檸檬油、紅橘油等?；驹硎遣捎美淠セ驒C械冷榨的方法將含芳香油較多的果皮中的芳香油分壓榨出來，并噴水使油和水混合流出，再經(jīng)高速離心機將精油分離出來。此法生產(chǎn)過程在常溫下進(jìn)行，確保了芳香油中萜烯類化合物不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，從而使精油質(zhì)量提高、香氣逼真。該法傳統(tǒng)上主要采用整果壓榨法和果皮海綿吸收法，近代生產(chǎn)方法采用整果冷磨法和果皮壓榨法 J。榨磨過程主要包括循環(huán)噴淋水、過濾與沉降、離心分離、榨磨后果皮處理幾個工藝過程。

2．2 蒸餾技術(shù)

2．2．1 水蒸氣蒸餾

水蒸氣蒸餾是使水蒸氣連續(xù)地流過容器中樣品混合物來進(jìn)行蒸餾的方法。該法避免了精油長時間在高溫下發(fā)生破壞分解、水解或聚合，使精油的質(zhì)量和提取率都得到了一定程度的提高。水蒸氣蒸餾法生產(chǎn)精油主要有水上蒸餾、水中蒸餾、直接蒸汽蒸餾(水氣蒸餾)三種方式。李玉媛 等分別采用水上蒸餾和水中蒸餾法多次提取云南擬單性木蘭鮮葉精油，取精油

平均得率進(jìn)行比較，研究表明，水上蒸餾較好，不僅精油得率高，香成分也較水中蒸餾法保留的好。羅曼 等采用隔層蒸餾代替水蒸氣蒸餾法提取山蒼籽油，不僅能夠提高精油的提取率，并且所獲香料油為無色透明，而靠蒸汽直接蒸餾的香料油茶褐色，即使經(jīng)精餾，其精油仍呈深黃色。周榮琪 對果皮、枝葉、花等各類芳香植物的提取進(jìn)行了實驗，研究表明，蒸餾方式、加熱方式、蒸汽速度、操作壓力、操作溫度等因素對出油率均有影響。Boutekedjiret等 采用蒸餾的方法對迷迭香精油進(jìn)行提取，研究表明在各種蒸餾方式中以水蒸氣蒸餾操作最為簡單，不但可降低香料成分餾出溫度，而且可防止分解或變質(zhì)，薄荷油、桉葉油、迷迭香油等均可采用此法提取。該法設(shè)備簡單，操作方便，但采用此法處理得到的香精只含有揮發(fā)成分，而味覺成分未被提取出，因此在植物類香精油的提取中使用較多。但蒸餾技術(shù)存在著操作溫度較高、時間較長、低沸點和水溶性組分缺失較大的缺點。

2．2．2 水?dāng)U散法

水?dāng)U散法提取芳香精油這一新型的提取技術(shù)產(chǎn)生于2O世紀(jì)9O年代中期，與常規(guī)蒸餾相比，其進(jìn)汽方式截然不同，水蒸氣是在低壓下自上而下的通過植物層，水?dāng)U散表示其中的一個過程(即滲透過程，指提取油從植物油腺中向外擴散的過程)，在重力作用下，水蒸氣將油帶入冷凝器，蒸汽由上往下作快速補充。水?dāng)U散裝置具有易搬運、操作簡單、節(jié)約蒸氣、勞動強度低、精油產(chǎn)量高、質(zhì)量好等優(yōu)點。

目前國內(nèi)外對此技術(shù)的研究及其應(yīng)用報道甚少，周榮琪[ 曾用公丁香對這項技術(shù)與水蒸餾做了對比實驗，得到一些有參考價值的數(shù)據(jù)，對比結(jié)果表明，水?dāng)U散技術(shù)不僅具有得油率高、蒸餾時間短、能耗低、設(shè)備簡單等優(yōu)點，而且油質(zhì)也較好。這是因為水?dāng)U散強化了蒸餾中的擴散作用，抑制了蒸餾中的不利因素水解和熱解作用。

2．3 溶劑浸提法

溶劑浸提法是用水、酒精、石油醚以及其他有機溶劑對芳香原料(包括含精油的植物各部分、樹脂樹膠以及動物的泌香物質(zhì)等)作選擇性的萃取，排除那些不重要的成分，有選擇地提取香味物質(zhì)。

溶劑萃取法的優(yōu)點是操作簡單，且可通過選擇不同的萃取溶劑而有選擇地提取致香成分。如在蘋果香精的萃取中，異戊烷對低級醇類的回收率就高于其它萃取溶劑 ]。但從萃取液中有效地除去溶劑且盡量降低致香成分的損失是溶劑萃取法面臨的重要問題。蒸餾一萃取裝置(SDE法)使萃取溶劑的用量大幅度減少，較好地解決了在去除溶劑的過程中失去致香成分的問題。朱旗等¨叫用SDE法提取的茶葉香精油中的香氣總量、數(shù)量及回收率均優(yōu)于普通溶劑萃取法，特別是醇類和酯類，香氣成分尤為突出。與其他提取方法相比，浸提法不僅生產(chǎn)周期長，而且溶劑用量大，設(shè)備較復(fù)雜，密封程度要求較高，溶劑損耗也增加了產(chǎn)品的成本，因此浸提生產(chǎn)多用于較貴的品種(如茉莉、藏紅花等)。

2．4 超臨界CO：萃取

超臨界CO：萃取技術(shù)與一般傳統(tǒng)分離方法相比較，具有其獨特的優(yōu)點。CO：臨界溫度3

1．4℃，臨界壓力7．28MPa。這樣的性質(zhì)使得超臨界CO：萃取特別適用于天然植物中脂溶性揮發(fā)油、浸膏、樹脂和熱敏性產(chǎn)品的萃取。由于其近常溫的操作溫度，可幾乎保留全部天然香氣本香成分物質(zhì)，故產(chǎn)品香氣天然感好、香氣純正、色澤淺、無溶劑殘留，產(chǎn)品質(zhì)量高。

另外提取過程簡單，故分離過程中損失少，收率高，該法在天然植物有效成分的提取中具有越來越廣泛的應(yīng)用前景。

符史良等⋯用超臨界cO：萃取香草蘭香料，研究了壓力、溫度、時間等因素對香料萃取率的影響，確定了從香草蘭豆莢萃取香料的最佳工藝條件，并用高效液相色譜(HPLC)測定香料中香蘭素的含量。

Luiz等¨ 以SCF—CO，為溶劑，在23～50℃、8．5～12MPa的條件下對檸檬香草精油的超臨界萃取進(jìn)行了研究，綜合考慮萃取率、萃取速率和產(chǎn)品的質(zhì)量，找到了最佳的操作條件：P= 12MPa，t=40oC。所提取的產(chǎn)品充分保留了檸檬香草中的活性成分和其特有的香味。周江等 以超臨界c0：為溶劑，采用SFE對香草蘭中香蘭素的提取進(jìn)行了研究，得到的最佳萃取條件為55oC，39MPa，產(chǎn)品的提取率可達(dá)97．2％，所提取的香蘭素充分保留了香草蘭的營養(yǎng)成分和活性成分，并具有香草蘭獨特的香氣。Reis—Vasco等¨ 采用一萃兩分的工藝流程，對薄荷精油的超臨界CO：萃取進(jìn)行了研究，其選用的最佳工藝條件為：萃取P=10MPa、t=50~C；一級分離P =8MPa，溫度t =一16℃，除去其中的臘質(zhì)成分；二級分離P：=1．8MPa，溫度t：=0~C，所得到的精油品質(zhì)純正，香氣濃郁。研究者還嘗試將超臨界技術(shù)與其他分離技術(shù)相耦合。如Chang等‘1 在提取分離綠茶精油時，將SFE技術(shù)與吸附分離技術(shù)相耦合，收到了提高分離效率之功效。

2．5 超聲波萃取

超聲提取的機制包括機械機制、熱學(xué)機制及空化機制_1。超聲萃取的空化作用是：存在于萃取液中的微氣泡(空化核)在聲場作用下振動，當(dāng)聲壓達(dá)到一定值時，氣泡迅速增長，然后突然閉合，在氣泡閉合時產(chǎn)生激波，在波面處造成很大壓強梯度，因而產(chǎn)生局部高溫高壓，溫度可達(dá)5000K以上，壓力可達(dá)上千個大氣壓，將植物細(xì)胞壁打破，香料得以浸出，從而提高萃取率。所以選擇合理的聲學(xué)參數(shù)，使萃取液達(dá)到最大空化狀態(tài)，才能獲得良好的萃取效果。楊海燕等 在自制的超聲萃取試驗裝置上進(jìn)行了超聲萃取寬葉纈草中香料的試驗研究。正交

試驗顯示，影響萃取吸光度值的主次因素為：萃取溫度、萃取濃度、萃取時間。較優(yōu)水平為萃取濃度10g／50mL、溫度為45℃、時間2h。進(jìn)行超聲和不加超聲對比試驗表明，加超聲比不加超聲提高吸光度值12％～40％。文獻(xiàn)_1 報道了一種

新型超聲反應(yīng)器，并將其應(yīng)用于天然香料的提取T業(yè)中。此技術(shù)主要是利用超聲波破碎細(xì)胞(空化作用)和強化傳質(zhì)(機械作用)，在天然植物的浸取過程中，粉碎植物細(xì)胞，釋放出其內(nèi)容物，以達(dá)到從中提取有效成分的目的，并起到提高傳質(zhì)速率、縮短浸取時間、提高有效成分得率的作用。

2．6 微波輻射誘導(dǎo)萃取技術(shù)

微波輻照誘導(dǎo)萃取法基本原理是促使香料植物組織的維管束和腺胞系統(tǒng)的細(xì)胞破裂，活性物質(zhì)沿破裂的細(xì)胞自由流出，被萃取劑捕獲并溶解其中的一個過程¨。微波萃取的方法一般分為常壓法、高壓法、連續(xù)流動法。與傳統(tǒng)提取方法相比，新方法的特點是快速、節(jié)能、節(jié)省溶劑、污染小而且有利于萃取熱不穩(wěn)定的物質(zhì)，可以避免長時間高溫引起的物質(zhì)的分解，特別適合于熱敏性組分或從天然物質(zhì)中提取有效成分 J。：另外，微波萃取的傳熱與傳質(zhì)方

向一致，因而加熱均勻，萃取效率高。國外已有很多學(xué)者利用微波萃取香料，加拿大環(huán)境署Pare于1994年申請了美國專利，他們對薄荷、洋蔥中的揮發(fā)油進(jìn)行了提取。將剪碎的薄荷葉放入盛有正己烷的玻璃燒杯中，經(jīng)微波短時間處理后，薄荷油釋放到正己烷中，與傳統(tǒng)的乙醇浸提相比，微波處理得到的薄荷油幾乎不含葉綠素和薄荷酮。20s的微波誘導(dǎo)提取與2h的水蒸汽蒸餾、6h的索氏提取相當(dāng)，且提取產(chǎn)物的質(zhì)量優(yōu)于傳統(tǒng)方法。

1991年Jean等 在對熏衣草油進(jìn)行微波提取時就獲得了比水?dāng)U散技術(shù)多2．5％的乙酸芳樟酯和9．1％的芳樟醇。該方法與常規(guī)蒸餾法和萃取法相比，所得產(chǎn)品品質(zhì)好、色澤淺、質(zhì)地醇，而且微波輻射誘導(dǎo)萃取具有高效率、高選擇性、不會破壞天然熱敏性物質(zhì)等優(yōu)點。

另有Chen等 以正己烷：乙醇提取迷迭香及薄荷葉中的揮發(fā)油為研究體系，系統(tǒng)研究了微波場中的溫度分布，考察了物料量、微波功率、照射時間等對微波提取的影響，并研究了微波提取揮發(fā)油的動力學(xué)過程。微波萃取法具有雖然具有良好的再現(xiàn)性，但此技術(shù)應(yīng)用于天然香料的提取，鑒于基體物質(zhì)和萃取體系的復(fù)雜性，其萃取機理還需進(jìn)一步研究。

2．7 吸附法

吸附生產(chǎn)天然香料基本上有兩種形式，即非揮發(fā)性溶劑吸收法和固體吸附劑吸收法。與其他方法相比，吸收法加工過程溫度低、芳香成分不易破壞，產(chǎn)品香氣最佳。鮮花或食品所揮發(fā)的香氣或香氣成分宜采用吸收法進(jìn)行捕集。但其存在手工操作多，生產(chǎn)周期長，生產(chǎn)效率低等問題。非揮發(fā)性溶劑吸收法根據(jù)吸收時的溫度不同可分為溫浸法和冷吸收法兩種。溫浸法所用非揮發(fā)性溶劑為精制的動物油脂、橄欖油、麻油等。冷吸收法所用非揮發(fā)性溶劑為精制的豬油和牛油。在冷吸收法摘除的殘花中，仍含有一些芳香成分，可用揮發(fā)性溶劑浸提法提取制取浸膏。固體吸附劑吸收法是利用吸附香氣成分的吸附劑提取低沸點的香氣成分，其特點在于能富集、提取沸點低的香氣成分，且不會破壞香氣的組分和性質(zhì)。但高沸點的組分較少，因此精油收率一般較低。多孑L吸附樹脂對極性較小的有機分子的有強吸附作用，因而主要用于頭香制備。

2．8 微膠囊雙水相萃取技術(shù)

雙水相萃取分離技術(shù)是近年來溶劑萃取技術(shù)與其他技術(shù)相結(jié)合產(chǎn)生的一種新的分離技術(shù)。雙水相能有效分離細(xì)胞勻漿中的極微小碎片，提取醛、酮、醇等弱極性至無極性香味成分，提取過程不需加熱和相變，分相時間短，能耗低。但目前只限于生物物質(zhì)、中草藥有效成分的分離方面。

劉品華_2 提出的微膠囊雙水相法，把微膠囊技術(shù)和雙水相萃取技術(shù)相結(jié)合，用于提取植物精油、能避免提取過程中的高溫、氧化、聚合等情況發(fā)生，有效地保護了精油的天然組分，通過調(diào)整精油和鹽的用量改變分配比，可控制囊化萃取物中精油的各種成分比，以達(dá)到有目的、最有效的、最佳分配比的囊化萃取。此技術(shù)應(yīng)用前景較好。

2．9 酶提取技術(shù)

梅長松等 用纖維素酶(CE)法提取松針中的天然香料，確定了酶法提取松針葉中有效成分的最佳工藝條件。與普通的水提取法相比，酶法具有提取條件溫和，提取率高等優(yōu)點，提取率可以提高40％以上。存在的問題與展望

近年來，隨著氣相色譜、高效液相色譜、質(zhì)譜、核磁共振譜、紅外分光光度法和紫外分光光度法在有機分子結(jié)構(gòu)分析中的廣泛應(yīng)用，人們加快了對天然香料的提取和食品成分的研究進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)了一批很有價值的新型香料化合物，香料工業(yè)也取得了很大進(jìn)步。在對天然香料提取的研究過程中，超臨界萃取技術(shù)、超聲波技術(shù)、微波技術(shù)等在香料工業(yè)中的應(yīng)用也越來越廣泛，這些新技術(shù)的應(yīng)用，給古老的香料工業(yè)注入了新的生機和活力。但是由于發(fā)展不成熟，雖然這些新技術(shù)都具有可行性，各具特點，但也還存在著許多問題，例如超聲波萃取技術(shù)中對合理的聲學(xué)參數(shù)選擇的研究、微波提取天然香料的萃取機理的研究等都有待有待進(jìn)一步開展。同時，在選擇提取方法時，注意對我們現(xiàn)階段掌握的各項提取技術(shù)進(jìn)

行綜合的利用，將會是香料工業(yè)未來發(fā)展的一個突破，也是未來香料提取技術(shù)的一個發(fā)展研究方向，如超臨界CO 萃取與分離技術(shù)中的分子蒸餾聯(lián)用技術(shù)，超臨界CO 萃取與吸附分離技術(shù)相耦合等都能有效提高提取效率，將新的提取方法結(jié)合新的分析技術(shù)，也將有助于香料提取工業(yè)的發(fā)展。另外，對新的提取技術(shù)要加強推廣應(yīng)用，例如應(yīng)用超(亞)臨界CO：萃取法提取精油的研究已取得初步成果，但仍局限于食品工業(yè)方面，今后應(yīng)加強在提取領(lǐng)域的應(yīng)用開發(fā)；微膠囊雙水相萃取技術(shù)目前也只限于生物物質(zhì)、中草藥有效成分的分離方面，但其在提取植物精油方面具有良好的應(yīng)用前景，應(yīng)加強開發(fā)應(yīng)用。

第三篇：植物提取物抗氧化成分及研究進(jìn)展

植物提取物抗氧化原理及成分研究

抗氧化是抗氧化自由基的簡稱。因為人體常與外界接觸，平時的呼吸、外界污染、放射線照射等因素會導(dǎo)致人體內(nèi)產(chǎn)生自由基，過量的自由基會導(dǎo)致人體癌癥、衰老和其它疾病，而抗氧化自由基（以下簡稱“抗氧化”）可以有效克服這些危害。因此，抗氧化已成為保健品和化妝品市場的主要研究課題之一。

本文從多種類植物提取物抗氧化成分及其原理出發(fā)，闡述了各界近年來利用植物對抗自由基的研究進(jìn)展。

一、植物提取物抗氧化原理

不同的植物提取的有效成分不盡相同，同樣，抗氧化作用的植物提取物也有很多不同成分，其作用機理也有所區(qū)別，西安源森生物從以下幾方面進(jìn)行了總結(jié)闡述：

（一）作用于與自由基有關(guān)的酶

與自由基有關(guān)的酶類分為氧化酶與抗氧化酶兩類，植物提取物的抗氧化作用體現(xiàn)在抑制相關(guān)氧化酶的活性和增強抗氧化酶活性兩方面。1.抑制氧化酶的活性

生物體內(nèi)許多氧化酶，如P-450 酶、黃嘌呤氧化酶(XOD)、脂氧化酶、髓過氧化酶(MPO)和環(huán)氧酶等，與自由基的生成有關(guān)，能誘發(fā)大量的自由基。

另外，誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(iNOS)在缺血再灌注時活性增加，產(chǎn)生大量NO而導(dǎo)致氧化損傷。

研究表明，許多植物提取物對上述各種氧化酶有抑制作用，從源頭抑制自由基生成。黃酮類化合物中的槲皮素、姜黃素在缺血再灌注損傷時可抑制 iNOS 的活性，從而起到抗氧化作用；絞股藍(lán)皂苷可以降低異常增高的XOD 和MPO 的活性，改善糖尿病大鼠腎臟的氧化應(yīng)激，延緩腎臟損害的進(jìn)展。2.增強抗氧化酶活性

機體存在具有防護、清除和修復(fù)過量自由基傷害的抗氧化酶類，如過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化物酶等。SOD 是體內(nèi)超氧陰離子的主要清除者，將其催化分解為H2O2，但H2O2也具有氧化損傷作用，CAT 將其轉(zhuǎn)化為O2和 H2O。同時 H2O2也可通過 GSH-Px 的催化和還原型谷胱甘肽(GSH)反應(yīng)生成H2O，同時生成氧化型谷胱甘肽。

許多研究表明，植物提取抗氧化成分不僅能防護體內(nèi)抗氧化酶，還能增強機體內(nèi)抗氧化酶活性，如黃酮類中的槲皮素能減少胰島β細(xì)胞的氧化損傷，同時還能恢復(fù)Fe2+致腎細(xì)胞損傷動物的SOD、GSH-Px 和CAT 的活力；皂苷類物質(zhì)對氧自由基本身影響較少，但大多能提高體內(nèi) SOD、CAT 等抗氧化酶的活性，從而增強機體抗氧化系統(tǒng)功能。

此外，一些天然物質(zhì)可在基因與轉(zhuǎn)錄水平上誘導(dǎo)體內(nèi)抗氧化酶如 SOD 的表達(dá)，發(fā)揮其抗氧化作用。

（二）抗氧化成分之間互補和協(xié)同作用

植物提取物抗氧化成分之間存在相互補充、相互協(xié)調(diào)的關(guān)系，在體內(nèi)通過電子和 / 或質(zhì)子轉(zhuǎn)移、作用于氧化酶和抗氧化酶、螯合鈍化過渡金屬離子、影響基因表達(dá)等途徑聯(lián)合發(fā)揮抗氧化作用。

研究發(fā)現(xiàn)不同濃度的茶多酚和西洋參之間均存在明顯的協(xié)同增效作用，并且隨著濃度上升，協(xié)同增效作用也相應(yīng)增強。VE 和VC對鷹嘴豆抗氧化多肽的還原能力有顯著的增效作用，且VC與鷹嘴豆抗氧化多肽的協(xié)同作用較VE更強，所有的協(xié)同作用隨添加量和作用時間的增加而增強。

（三）直接清除或抑制自由基

植物提取物能夠作為氫質(zhì)子或電子的供給體，直接猝滅或抑制自由基，終止自由基的連鎖反應(yīng)，發(fā)揮抗氧化功能。1.提供質(zhì)子

大部分抗氧化成分都是氧自由基清除劑，如多酚類物質(zhì)、甾醇、VE等，原因之一是其本身可以釋放出體積小、親合性很強的氫質(zhì)子，捕捉高勢能的極活潑的自由基使之轉(zhuǎn)變?yōu)榉腔钚曰蜉^為穩(wěn)定的化合物，同時自身轉(zhuǎn)變成較氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)生成的自由基更穩(wěn)定的物質(zhì)，從而中斷或延滯鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。2.提供電子

植物提取物發(fā)揮抗氧化作用的另一個原因是通過電子轉(zhuǎn)移直接給出電子而清除自由基，如多酚類、植物多糖、維生素等。β-胡蘿卜素有很好的抗氧化性能，能通過提供電子抑制活性氧的生成達(dá)到清除自由基的目的；而VC是通過逐級供給電子而轉(zhuǎn)變成半脫氫抗壞血酸和脫氫抗壞血酸以實現(xiàn)清除活性氧自由基的目的。

（四）螯合鈍化過渡金屬離子

過渡金屬離子(如 Fe2+、Cu2+等)在氧自由基產(chǎn)生過程中是必需的，如 F e2 +既能介導(dǎo)脂質(zhì)過氧化，也是?OH 等自由基產(chǎn)生的催化劑。

植物提取物中的黃酮類化合物具有4-酮基，5-羥基的分子結(jié)構(gòu)，且B 環(huán)3′和4 ′位的連位羥基含有孤對電子，因而能螯合金屬離子。能通過配位電子螯合鈍化促氧化金屬離子的抗氧化成分還有單寧、多糖、活性肽、植酸、檸檬酸等。

二、植物提取物抗氧化成分研究

植物提取物的抗氧化活性成分主要有生物堿類、皂苷類、維生素類、多酚類、多肽類和多糖類等，這些成分大多從谷物、中草藥、蔬菜、水果、植物飲品和香辛料提取而來。西安源森生物就以上幾類物質(zhì)的抗氧化性進(jìn)行說明：

（一）生物堿類

生物堿(alkaloids)是一類大多具有復(fù)雜含氮環(huán)狀結(jié)構(gòu)、顯著生理活性的有機化合物，絕大多數(shù)分布在高等植物中，尤其是雙子葉植物，如毛茛科、罌粟科、茄科、蕓香科、豆科等。影響生物堿抗氧化活性的結(jié)構(gòu)因素主要是立體結(jié)構(gòu)和電性，雜環(huán)中氮原子越“裸露”在外，越有利于充分地接近活性氧并與之反應(yīng)，抗氧化效果就越好；供電子基團或者能使氮原子富有電子的結(jié)構(gòu)因素也可增加其抗氧化活性。

具有抗氧化作用的生物堿類有馬錢子堿、苦豆堿、四氫小檗堿、去甲烏藥堿、木蘭堿、川芎嗪、小檗堿、海罌粟堿、藥根堿、番荔枝堿等。

（二）皂苷類

皂苷(saponins)是中草藥中一類重要的活性物質(zhì)，根據(jù)苷元的化學(xué)結(jié)構(gòu)不同分為甾體皂苷和三萜皂苷兩類，前者多存在于百合科和薯蕷科植物中；后者多存在于五加科和傘形科等植物中。

近年研究表明，大多數(shù)皂苷具有明顯的抗氧化作用，包括：五加科皂苷(包括人參、西洋參、刺五加)、豆科(包括黃芪、大豆、甘草)等。絞股藍(lán)、紅景天、燈盞花、七葉、柴胡、苦瓜、虎杖、羅漢果、油茶等所含的總皂苷成分也具較強的抗氧化活性。西安源森生物公司給i以五加科皂苷、豆科皂苷和紅景天、虎杖、苦瓜提取的總皂苷成為作為抗氧化類主打產(chǎn)品。

（三）維生素類

維生素(vitamins)既是不可少的食品營養(yǎng)素，也是人體最重要的抗氧化物質(zhì)。植物中的抗氧化維生素主要有VE、VC 和胡蘿卜素，但它們在特定情況下也可成為促氧化劑。1.V E VE 是各種生育酚的統(tǒng)稱，其中α-生育酚生物活性最大，若以它為基準(zhǔn)，β-生育酚、γ-生育酚和δ-生育酚的生理活性分別為 40%、8% 和 20%，其余活性極其微弱。在大多數(shù)情況下，VE 的抗氧化作用是與脂氧自由基或脂過氧自由基反應(yīng)，向它們提供氫離子，使脂質(zhì)過氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中斷，是最重要的脂溶性斷鏈型抗氧化劑。2.VC VC 又稱抗壞血酸，是含有 6 個碳原子的α-酮基內(nèi)酯的酸性多羥化合物。具有可解離出氫離子的烯醇式羥基，是最重要的水溶性捕捉型抗氧化物，能通過逐級供給電子而實現(xiàn)清除活性氧自由基；還能保護 VE 和促進(jìn) VE 的再生。3.類胡蘿卜素

類胡蘿卜素共有600余種，均為具有11 個雙鍵的類異戊二烯結(jié)構(gòu)，β-胡蘿卜素是典型代表。研究發(fā)現(xiàn)有顯著抗氧化性的還有葉黃素、玉米黃質(zhì)、番茄紅素和蝦青素等。

β-胡蘿卜素是VA 的前體，由4 個異戊二烯雙鍵首尾相連而成，分子兩端各有一個β-紫蘿酮環(huán)，主要有全反式、9-順式、l3-順式及 l5-順式 4 種形式。有很好的抗氧化性能，能通過提供電子抑制活性氧的生成達(dá)到清除自由基的目的。

葉黃素共有 8 種異構(gòu)體，主要存在于甘藍(lán)、菠菜等深綠色蔬菜及金盞花、萬壽菊等花卉中。玉米黃質(zhì)主要存在于枸杞子、玉米、菠菜和亞洲柿子等食物中。葉黃素和玉米黃質(zhì)總是伴生存在，作用也十分近似，主要表現(xiàn)在抗氧化方面，能減少氧化脅迫對眼睛的傷害，即對視網(wǎng)膜黃斑部由光線所誘發(fā)的氧化作用有抵抗能力，能夠預(yù)防因視覺斑降解引起的衰老。另外還能預(yù)防晶狀體中蛋白和脂質(zhì)的氧化，從而降低老年性白內(nèi)障的發(fā)生。

番茄紅素是一種無環(huán)類胡蘿卜素，化學(xué)結(jié)構(gòu)是一個非環(huán)的、含有11 個共軛雙鍵和 2 個非共軛雙鍵組成的線性全反式結(jié)構(gòu)。能接受不同電子的激發(fā)，生成基態(tài)氧或三重態(tài)氧番茄紅素，一個三重態(tài)氧番茄紅素可猝滅成千上萬個單線態(tài)氧自由基，抗氧化能力是 VE 的100 倍、VC 的 1000 倍，是自然界最強的延緩衰老的抗氧化劑。

蝦青素是一種特殊的氧化型類胡蘿卜素，不僅同其他類胡蘿卜素一樣在分子中有很長的共軛雙鍵，而且在其兩個紫羅蘭環(huán)的 3、4 位上各有一個羥基和不飽和酮基，這種相鄰的羥基和酮基可構(gòu)成α-羥基酮。這些結(jié)構(gòu)都具有比較活潑的電子效應(yīng)，能向自由基提供電子或吸引自由基的未配對電子，極易捕獲自由基，因此蝦青素具有較一般類胡蘿卜素更強的抗氧化性。

（四）多酚類

植物多酚類抗氧化物質(zhì)就其化學(xué)結(jié)構(gòu)的不同，可分為鞣質(zhì)、類黃酮、酚酸3 大類。1.鞣質(zhì)類物質(zhì)

鞣質(zhì)類又稱單寧(tannins)，在植物中廣泛分布，通常是指相對分子質(zhì)量在 500～3000 的植物多酚。根據(jù)分子結(jié)構(gòu)不同和水解難易可分為 3 類：水解鞣質(zhì)(如沒食子單寧、鞣花單寧)、縮合鞣質(zhì)(如原花色素、低聚原花色素)、縮合鞣質(zhì)與水解鞣質(zhì)中的葡萄糖以碳鍵連接而成的復(fù)合鞣質(zhì)(如山茶素 B、番石榴素 A)。

影響鞣質(zhì)類抗氧化活性的因素有3個：單元的結(jié)合方式；羥基是否游離；六羥基二苯甲?；?HHDP)、沒食子?；?gall)、脫氫六羥基二苯甲?；?DHHDP)基團的種類及數(shù)量。當(dāng)單寧結(jié)合單元(如兒茶素)以可水解的酯鍵、苷鍵結(jié)合時，分子的抗氧化能力增強，而以碳碳鍵結(jié)合成縮合型時，分子抗氧化能力大大下降；酚羥基游離時有利于活性上升；HHDP、gall、DHHDP 基團的活性順序為HHDP ＞ gall ＞ DHHDP，在結(jié)合單元中，這 3 個基團數(shù)目越多，活性越大。

2.類黃酮物質(zhì)

類黃酮(flavonoids)也稱為黃酮類化合物，在多酚類物質(zhì)中種類最多，幾乎所有植物的所有組織均含有這類天然產(chǎn)物。泛指兩個苯環(huán)(A －與 B －環(huán))通過中央三碳鍵相互連接而成的一系列化合物，可進(jìn)一步分為黃酮類、黃酮醇類、黃烷酮類、二氫黃酮醇類、黃烷-3-醇類(也即兒茶素類)、異黃酮類、查爾酮類及花色素類等亞族。黃酮類化合物具有不同的抗氧活性，其抗氧活性的大小與化合物的結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。酚羥基及其取代基位羰基、羥基成苷、羥基甲基化和Δ2(3)雙鍵)的位置和數(shù)量是確定其抗氧化活性的重要因素。

一般認(rèn)為，B環(huán)上的鄰二酚羥基對黃酮類抗氧化活性起主要作用；一個環(huán)上的鄰二羥基與另一個環(huán)上的對二羥基產(chǎn)生很有潛力的抗氧化性，A 環(huán)上的 5、7、8 位增加羥基可以不同程度地增加抗氧化能力。許多黃酮類化合物顯示出明顯的抗氧化特性，代表性的有刺槐素、槲皮素(櫟精)、柚皮素、黃杉素、茶多酚、大豆異黃酮、三羥基查爾酮、矢車菊色素等。3.酚酸類物質(zhì)

酚酸是指同一苯環(huán)上有若干個酚性羥基的一類化合物。自然界植物中發(fā)現(xiàn)的具有抗氧化性的酚酸類物質(zhì)可分為 3 類：第1 類是羥基苯甲酸及其衍生物，如原兒茶酸、沒食子酸、丁香酸等；第 2 類是鞣花酸及其衍生物，如3-羥基苯乙酸；第3 類是羥基肉桂酸(羥基苯丙烯酸)及其衍生物，如綠原酸、阿魏酸、咖啡酸、迷迭香酸、香豆酸、芥子酸等。

酚酸類物質(zhì)的抗氧化能力，在化學(xué)結(jié)構(gòu)上的規(guī)律與黃酮類一樣，即凡在苯環(huán)上具有相鄰酚性羥基者，比沒有的要強得多，如具有聯(lián)苯三酚結(jié)構(gòu)的的沒食子酸及其各種衍生物，比只有兩個羥基的強。而具有鄰苯二酚結(jié)構(gòu)的如綠原酸、咖啡酸、迷迭香酸，其抗氧化能力遠(yuǎn)比只有一個羥基的阿魏酸、芥子酸強。

（五）活性肽

具有抗氧化性質(zhì)的多肽類物質(zhì)被稱為抗氧化活性肽(bioactive peptides)。國內(nèi)外研究人員已從不同植物來源的蛋白質(zhì)中提取到各種具有抗氧化活性的肽類物質(zhì)，然而能了解細(xì)致分子結(jié)構(gòu)，并進(jìn)行相關(guān)機理研究的天然抗氧化肽僅限于谷胱甘肽，更多的是各種天然蛋白酶解物中具有一定抗氧化活性低分子混合肽，如大豆肽、玉米肽、小麥肽、米糠肽、花生肽。此外，在黑米、菜籽、靈芝、桂花、枸杞等植物蛋白質(zhì)原料中均獲得了具有抗氧化作用的活性肽。西安源森生物實驗室研究表明：構(gòu)成肽的氨基酸種類、數(shù)量及氨基酸排列順序決定著肽的抗氧化能力。具有抗氧化能力的氨基酸及其衍生物有半胱氨酸、組氨酸、色氨酸、賴氨酸、精氨酸、亮氨酸和纈氨酸、5-羥色氨酸等。

（六）多糖類

多糖(polysaccharides)是由10個以上多種單糖聚合而成的天然高分子物質(zhì)。近年來，人們對多糖及復(fù)合物的抗氧化活性作用有了越來越深入的認(rèn)識。

已有大量研究指出，從植物中提取分離得到的多糖類化合物具有抑制脂質(zhì)過氧化作用、清除自由基、抑制亞油酸氧化等抗氧化作用。枸杞多糖、金櫻子多糖、黃芪多糖、油柑多糖、牛膝多糖、大蒜多糖、三七多糖等 100 多種植物多糖具有抗氧化作用，具有抗氧化活性的植物多糖不斷被發(fā)現(xiàn)。

（七）其他類

還有許多成分如萜類(蒼術(shù)酮、生姜單萜)、醌類(丹參醌、大黃蒽醌)、褪黑素等均為有效的植物源抗氧化成分。

三、結(jié)語

研究資料顯示目前大多數(shù)抗氧化研究均采用體外實驗，整體或在體實驗資料較少，難以系統(tǒng)、準(zhǔn)確地反應(yīng)天然成分抗氧化作用的全貌。以整體實驗為主，體外實驗為輔，綜合酶學(xué)、免疫學(xué)、藥理學(xué)等多學(xué)科知識建立一套全面客觀、高效快速的動物實驗?zāi)Ｐ蛠砭C合評價物質(zhì)的抗氧化性是以后研究需要重點解決的問題。

在為保健品市場提供有效應(yīng)對高血壓、糖尿病、腫瘤、帕金森癥、老年癡呆等病癥的優(yōu)質(zhì)抗氧化類植物提取物之外，西安源森生物公司已將“安全抗氧化植物提取物的營養(yǎng)保健食品應(yīng)用”列為主要研究課題之一，以緊抓《食品安全法》頒布實施所帶來的市場機遇。

第四篇：成分輸血護理技術(shù)

成分輸血護理技術(shù)

成分輸血就是用物理或化學(xué)方法, 將血液中各種有效成分分離出來, 分別制成高濃度, 高純度的制品 , 然后再根據(jù)患者的病情需要, 采用缺什么, 補什么的原則, 很容易達(dá)到一個有效的治療劑量, 使輸血更加有針對性。成分輸血是安全輸血的重要措施。護理人員在輸血過程中, 若能正確, 安全, 有效的順利實施, 可達(dá)到預(yù)期的目的, 否則就會給患者增添新的痛苦, 乃至危及生命, 這就要求護士必須加強輸血的護理。

1、血源特征 1、1 新鮮冰凍血漿(FFP)。臨床上新鮮血漿立即放入-50℃的具有風(fēng)冷裝置的速凍箱, 在最短的時間內(nèi)冷凍血漿, 將完成速凍的血漿再放入-20℃以下冰箱內(nèi)貯存, 使用前在37℃ 的恒溫水浴箱內(nèi)融化后, 等于新鮮血漿, 新鮮冰凍血漿保持期為1年, 1年后為普通冰凍血漿, 保質(zhì)期為5年。

1、2 懸浮紅細(xì)胞。新鮮全血或保存不久的庫血經(jīng)離心或靜置, 使紅細(xì)胞下沉后, 將上層血漿分離出來, 剩下的紅細(xì)胞和少量血漿即為懸浮紅細(xì)胞。在4± 2℃冰箱內(nèi)保存, 以ACD抗凝劑的紅細(xì)胞有效期為21 d, 5 d 之內(nèi)稱為新鮮紅細(xì)胞, 用CPD-A 抗凝劑的紅細(xì)胞有效期為35 d, 10 d 之內(nèi)為新鮮紅細(xì)胞。

1、3濃縮血小板。在22 ± 2℃震蕩條件下可保存24 h, 在4℃ 儲存時?；钚院芸煜陆? 6 h 后大約僅有40% 存活, 12 h后僅有20%左右存活, 故儲存血即使是新鮮血, 其中的血小板也難達(dá)到止血作用。特制的血小板保存袋在22 ±2℃ 震蕩條件下可保存5 d, 應(yīng)用二甲基亞砜作保護劑, 低溫(-80℃)保存血小板近幾年也也取得了突破性進(jìn)展, 使血小板的保存期達(dá)到半年。1、4 濃縮白細(xì)胞。在4℃ 條件下可保存24 h, 室溫下保存不應(yīng)超過8 h。

2、輸血安全的護理 2、1輸血前的護理：

輸血前患者的心理護理。護士在輸血前應(yīng)耐心地向患者及家屬解釋輸血的目的, 重要性, 方法和輸血中及輸血后可能出現(xiàn)的不良反應(yīng), 取得患者的合作, 為輸血治療打下良好的心理基礎(chǔ)。2、1、1 輸血前要采血檢測患者的甲肝、乙肝、丙肝、艾滋病、梅毒等, 同時按輸血申請單要求逐項填寫, 連同血樣送輸血科, 并與輸血科人員一起校對并登記。2、1、2 輸血前了解患者有無輸血史及不良反應(yīng), 必要時, 遵醫(yī)囑給予抗組胺或者類固醇藥物。2、1、3 熟練掌握輸血原則, 是安全輸血的關(guān)鍵。因此臨床護士采配血樣, 領(lǐng)血時, 應(yīng)做到:（1）若患者正在進(jìn)行輸液, 輸血,不宜在同側(cè)手臂采血;（2）護士到輸血科取血時, 應(yīng)與輸血科人員認(rèn)真核對輸血資料, 包括患者姓名, 病案號, 科室, 病房, 床號, 血型;獻(xiàn)血者條形碼, 血液編碼, 血型, 血液容量, 血液種類, 采血日期, 有效期, 血袋及血袋標(biāo)簽完整性, 血液顏色有無異常, 有無溶血, 滲漏;交叉配血試驗結(jié)果。2、1、4 了解患者體溫, 脈搏, 血壓, 呼吸及有無過敏史, 流產(chǎn)史, 死胎史, 是否查過Rh 血型和其它特殊血型, 并詳細(xì)記錄在輸血護理單上, 并備好防治輸血不良反應(yīng)的藥物等。2、1、5 輸血靜脈的選擇。一般選用四肢淺表靜脈, 可根據(jù)輸血患者當(dāng)前的具體情況而定, 輸血器應(yīng)選用帶濾網(wǎng)的12~ 18號針頭輸注, 保證輸血通暢。2、2 輸血中的護理 2、2、1注意觀察輸血反應(yīng)癥狀和體征。輸血時應(yīng)遵循先慢后快的原則, 輸血反應(yīng)多發(fā)生于輸血后5 ~ 15 m in。常見癥狀: 倦怠感、背痛、發(fā)熱、皮膚瘙癢、胸悶、胸部壓迫感、呼吸困難、嘔吐及沿輸血靜脈走行出現(xiàn)發(fā)熱、疼痛、腫脹等。輸血反應(yīng)的體征: 顏面潮紅, 紫紺, 出冷汗, 皮疹, 脈快而細(xì)弱, 脈律不齊, 血壓下降以及休克等[ 4]。當(dāng)患者出現(xiàn)上述癥狀, 體征時,應(yīng)立即停止輸血, 迅速報告醫(yī)生, 并將輸血裝置, 血袋等保錙下來, 連同相關(guān)表格、標(biāo)簽等一起送檢, 以便查明原因。2、2、2 輸血過程中禁止加入其它藥液, 以免發(fā)生凝血或溶血。2、3 輸血后的護理 2、3、1 由于輸血穿刺針頭粗, 故拔針后應(yīng)壓迫局部3 ~ 5min, 以防止出血, 如有出血傾向應(yīng)適當(dāng)延長時間, 直至不出血為止。2、3、2輸血后數(shù)日至2周內(nèi)有出現(xiàn)遲發(fā)性溶血反應(yīng)的可能,護士應(yīng)注意觀察患者的全身情況, 生命體征的變化、血常規(guī)、尿的顏色、性質(zhì)及量等, 以便早期發(fā)現(xiàn)異常及時治療。2、3、3 有些輸血反應(yīng)如: 疾病、感染等發(fā)病較晚, 護士應(yīng)做好出院指導(dǎo), 囑患者定期來院檢查。2、3、4 一次性輸血器和注射器經(jīng)毀形, 浸泡, 消毒后由專門機構(gòu)回收集中處理。輸血后的血袋及不良反應(yīng)回報單, 一并送至輸血科, 低溫保留24 h, 再由指定人員回收焚燒處理。

第五篇：酵母雙雜交技術(shù)研究進(jìn)展

酵母雙雜交技術(shù)研究進(jìn)展

提 要 酵母雙雜交技術(shù)是一種有效的真核活細(xì)胞內(nèi)研究方法，在蛋白質(zhì)相互作用的研究方面得到了廣泛的應(yīng)用并取得了許多有價值的重要發(fā)現(xiàn)。作為一個完整的實驗系統(tǒng)，它自建立以來經(jīng)過了不斷的改進(jìn)與完善，不僅進(jìn)一步提高了實驗結(jié)果的可靠性與精確性，而且在此基礎(chǔ)上又發(fā)展了反向雙雜交，三雜交及核外雙雜交等多項技術(shù)。這些都將對功能基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的研究起到促進(jìn)作用。

0 引言

隨著分子生物學(xué)研究尤其是人類基因組計劃的迅速發(fā)展，大量關(guān)于基因結(jié)構(gòu)的信息不斷涌現(xiàn)，對這些信息進(jìn)行系統(tǒng)研究以了解新基因功能的要求也日益迫切。這不僅需要利用計算機進(jìn)行生物信息學(xué)的分析和預(yù)測，而且必須結(jié)合生物學(xué)實驗獲取證據(jù)。為適應(yīng)同時對多個基因或蛋白進(jìn)行研究的發(fā)展趨勢，已出現(xiàn)了很多新技術(shù)，如DNA微陣列技術(shù)（DNA micoarry）,基因表達(dá)的系列分析（SAGE）,肽質(zhì)譜分析法，蛋白雙向膠電泳技術(shù)及酵母雙雜交技術(shù)（Yeast Two-Hybrid System）等。其中酵母雙雜交技術(shù)以其簡便，靈敏，高效以及能反映不同蛋白質(zhì)之間在活細(xì)胞內(nèi)的相互作用等特點在基因功能的研究中得到了廣泛的應(yīng)用。酵母雙雜交技術(shù)的基本原理

1989年，Song和Field建立了第一個基于酵母的細(xì)胞內(nèi)檢測蛋白間相互作用的遺傳系統(tǒng)〔1〕。很多真核生物的位點特異轉(zhuǎn)錄激活因子通常具有兩個可分割開的結(jié)構(gòu)域，即DNA特異結(jié)合域（DNA-binding domain，BD）與轉(zhuǎn)錄激活域（Transcriptional activation domain，AD）。這兩個結(jié)構(gòu)域各具功能，互不影響。但一個完整的激活特定基因表達(dá)的激活因子必須同時含有這兩個結(jié)構(gòu)域,否則無法完成激活功能。不同來源激活因子的BD區(qū)與AD結(jié)合后則特異地激活被BD結(jié)合的基因表達(dá)?；谶@個原理，可將兩個待測蛋白分別與這兩個結(jié)構(gòu)域建成融合蛋白，并共表達(dá)于同一個酵母細(xì)胞內(nèi)。如果兩個待測蛋白間能發(fā)生相互作用，就會通過待測蛋白的橋梁作用使AD與BD形成一個完整的轉(zhuǎn)錄激活因子并激活相應(yīng)的報告基因表達(dá)。通過對報告基因表型的測定可以很容易地知道待測蛋白分子間是否發(fā)生了相互作用。

酵母雙雜交系統(tǒng)由三個部分組成：(1)與BD融合的蛋白表達(dá)載體，被表達(dá)的蛋白稱誘餌蛋白(bait)。(2)與AD融合的蛋白表達(dá)載體，被其表達(dá)的蛋白稱靶蛋白(prey)。(3)帶有一個或多個報告基因的宿主菌株。常用的報告基因有HIS3，URA3，LacZ和ADE2等。而菌株則具有相應(yīng)的缺陷型。雙雜交質(zhì)粒上分別帶有不同的抗性基因和營養(yǎng)標(biāo)記基因。這些有利于實驗后期雜交質(zhì)粒的鑒定與分離。根據(jù)目前通用的系統(tǒng)中BD來源的不同主要分為GAL4系統(tǒng)和LexA系統(tǒng)。后者因其BD來源于原核生物，在真核生物內(nèi)缺少同源性，因此可以減少假陽性的出現(xiàn)。酵母雙雜交技術(shù)的應(yīng)用現(xiàn)狀

酵母雙雜交技術(shù)產(chǎn)生以來，它主要應(yīng)用在以下幾方面：(1）檢驗一對功能已知蛋白間的相

互作用。(2）研究一對蛋白間發(fā)生相互作用所必需的結(jié)構(gòu)域。通常需對待測蛋白做點突變或缺失突變的處理。其結(jié)果若與結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究結(jié)合則可以極大地促進(jìn)后者的發(fā)展。(3)用已知功能的蛋白基因篩選雙雜交cDNA文庫，以研究蛋白質(zhì)之間相互作用的傳遞途徑。(4)分析新基因的生物學(xué)功能。即以功能未知的新基因去篩選文庫。然后根據(jù)釣到的已知基因的功能推測該新基因的功能。常見問題的解決與改進(jìn)

酵母雙雜交系統(tǒng)應(yīng)用中常遇到的問題一是假陽性較多，二是轉(zhuǎn)化效率偏低。所謂假陽性就是:在待研究的兩個蛋白間沒有發(fā)生相互作用的情況下,報告基因被激活。主要原因是由于BD融合誘餌蛋白有單獨激活作用,或者這種融合蛋白的激活作用被外來蛋白激活。另外AD融合靶蛋白如果有DNA的特異性結(jié)合,則也可單獨激活報告基因的表達(dá)。因此,為排除假陽性就需要作嚴(yán)格的對照試驗。應(yīng)對誘餌和靶蛋白分別作單獨激活報告基因的鑒定。目前幾個公司推出的酵母雙雜系統(tǒng)都采用了多個報告基因,且每個報告基因的上游調(diào)控區(qū)各不相同,這可減少大量的假陽性。另外,報告基因通常整合到染色體上,可以使基因表達(dá)水平穩(wěn)定,消除了由于質(zhì)?？截悢?shù)變化引起基因表達(dá)水平波動而造成的假陽性。即使根據(jù)嚴(yán)格的對照實驗證明確實發(fā)生了蛋白間的相互作用，還應(yīng)對以下方面進(jìn)行分析：

(1)這種相互作用是否會在細(xì)胞內(nèi)自然發(fā)生,即這一對蛋白在細(xì)胞的正常生命活動中是否會在同一時間表達(dá)且定位在同一區(qū)域。

（2)某些蛋白如是依賴于遍在蛋白的蛋白酶解途徑的成員,它們具有普遍的蛋白間的相互作用的能力。

（3)一些實際上沒有任何相互作用的但有相同的模體(motif)如兩個親a-螺旋的蛋白質(zhì)間可以發(fā)生相互作用。十年來,酵母雙雜交技術(shù)一直在消除假陽性方面不斷改進(jìn),并且已取得較好的效果。

在酵母雙雜交的應(yīng)用中有時也會遇到假陰性現(xiàn)象。所謂假陰性，即兩個蛋白本應(yīng)發(fā)生相互作用,但報告基因不表達(dá)或表達(dá)程度甚低以至于檢測不出來。造成假陰性的原因主要有兩 方面：一是融合蛋白的表達(dá)對細(xì)胞有毒性。這時應(yīng)該選擇敏感性低的菌株或拷貝數(shù)低的載體。二是蛋白間的相互作用較弱，應(yīng)選擇高敏感的菌株及多拷貝載體。目前假陰性現(xiàn)象雖不是實驗中的主要問題,但也應(yīng)予以重視。

轉(zhuǎn)化效率是酵母雙雜交文庫篩選時成敗的關(guān)鍵之一，特別是對低豐度cDNA庫進(jìn)行篩選時，必須提高轉(zhuǎn)化效率。轉(zhuǎn)化時可采用共轉(zhuǎn)化或依次轉(zhuǎn)化，相比之下共轉(zhuǎn)化省時省力。更重要的是如果單獨轉(zhuǎn)化會發(fā)生融合表達(dá)蛋白對酵母細(xì)胞的毒性時,共轉(zhuǎn)化則可以減弱或消除這種毒性。一種更有效的方法是將誘餌蛋白載體與靶蛋白載體分別轉(zhuǎn)入不同接合型的單倍體酵母中,通過兩種接合型單倍體細(xì)胞的雜交將誘餌蛋白與靶蛋白帶入同一個二倍體細(xì)胞。目前很多機構(gòu)建立了大量的cDNA文庫和基因組文庫，但這些文庫大多無法直接用于雙雜交系統(tǒng)的篩選。而文庫的質(zhì)量對于轉(zhuǎn)化和篩選又非常關(guān)鍵。因此，大量構(gòu)建適用于酵母雙雜交的文庫非常必要?，F(xiàn)已出現(xiàn)一種采用體內(nèi)重組技術(shù)來達(dá)到這個目的的方法。酵母雙雜交技術(shù)的新發(fā)展

酵母雙雜交技術(shù)在應(yīng)用中發(fā)揮了巨大的作用，但人們也注意到了它有一定的局限性。為此發(fā)展了多種適應(yīng)不同目的需要的改型的雙雜交技術(shù)。

反向雙雜交技術(shù) 在研究中檢測并鑒定出那些能阻斷兩個蛋白間相互作用的因素有重要意義。在研究那些能使相互作用被阻斷的因素(如尋找哪些結(jié)構(gòu)域上發(fā)生突變可使相互作用中

斷或那些分子可以阻斷相互作用)時，傳統(tǒng)的雙雜交技術(shù)有較大的局限性。因此，反向雙雜交系統(tǒng)(Reverse Two-Hybrid System)應(yīng)運而生。這項技術(shù)的特點是采取了反選擇篩選策略。根據(jù)反選擇設(shè)計的不同，大致可以分為兩類。一類是用便于反選擇的URA3或CYH2基因作為報告基因。URA3基因編碼尿嘧啶合成途徑中的重要酶：乳清酸核苷5’-磷酸脫羧酶，它能把5’-氟乳清酸（5’-FOA）轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞毒性物質(zhì)，使細(xì)胞無法生長。反之，在能生長的細(xì)胞中，外界因素已使蛋白間的相互作用不能發(fā)生，而我們想知道的正是這些因素。因此，只要對存活的克隆進(jìn)行檢測就可以得到結(jié)果。Vidal等人用這種技術(shù)發(fā)現(xiàn)了影響轉(zhuǎn)錄因子E2F1中與DP1相互作用必需區(qū)內(nèi)的點突變。另一類是將常規(guī)報告基因(如HIS3)置于大腸桿菌轉(zhuǎn)座子Tn10編碼的tet-抑制因子(TetR)/操縱基因控制之下。待測蛋白之間發(fā)生相互作用后首先激活tet-R基因表達(dá)抑制因子TetR,TetR結(jié)合到tet操縱基因后就抑制了報告基因的表達(dá)，結(jié)果轉(zhuǎn)化子不能生長。只有當(dāng)待測蛋白之間的相互作用被某種因素所阻斷而無法激活tet-R基因時，報告基因才能擺脫tet操縱基因的控制而表達(dá)，使轉(zhuǎn)化子獲得在選擇培養(yǎng)基上生長的能力。Shih 等人利用這種方法鑒定出cAMP-應(yīng)答元件結(jié)合蛋白(cAMP-response element binding protein,CREB)中磷酸化位點的Ser133突變會阻斷其與輔助激活因子(CREB結(jié)合蛋白)的相互作用。

三雜交技術(shù) 在許多細(xì)胞內(nèi)信號傳遞過程中，兩個蛋白間的相互作用常涉及到其它的大分子。如蛋白，激酶，RNA,多肽及其它大分子。在研究這些大分子對蛋白間相互作用的影響過程中發(fā)展了一種新的技術(shù)系統(tǒng)——三雜交系統(tǒng)(Three-Hybrid System)，其本質(zhì)與雙雜交是相同的，只是需通過第三個分子的介導(dǎo)把兩個雜交蛋白帶到一起。例如小配體三雜交系統(tǒng)(Small Ligand Three-Hybrid System)是利用可以滲透的二聚體化學(xué)誘導(dǎo)物(Chemical Inducers of Dimerization,CIDs)作橋梁，將AD和BD融合蛋白連接到一起，激活報道基因的表達(dá)。研究較多的是免疫抑制劑FK506。Belshaw等將FK506與環(huán)孢菌素A(Cyclosporin

A)構(gòu)建成異源二聚體，它能把分別與FK506和環(huán)孢菌素A有相互作用的AD和BD融合蛋白拉倒一起，激活報告基因。Licitra將FK506與地米塞松(dexamethasone)通過共價鍵連接成二聚體。通過實驗進(jìn)一步證實了FK506與蛋白FKBP-12間的特異性相互作用，表明用這種方法鑒定蛋白與小分子間的相互作用是切實可行的。RNA與蛋白之間的相互作用是許多細(xì)胞生命活動的基礎(chǔ)，例如mRNA的翻譯，早期發(fā)育以及RNA病毒的感染等。然而可用于這方面研究的簡便方法卻很少。RNA三雜交系統(tǒng)(RNA Three-Hybrid System)的建立為分析RNA與蛋白之間的相互作用提供了有效的手段。這個系統(tǒng)主要是由一個RNA分子和兩個都能結(jié)合該RNA的蛋白質(zhì)組成。此RNA的一部分與一個已知蛋白結(jié)合后就可利用它的另一部分去篩選新的RNA結(jié)合蛋白。因此這種技術(shù)既可檢測由RNA介導(dǎo)的兩個蛋白質(zhì)之間的相互作用，也可篩選鑒定新的蛋白結(jié)合RNA。Putz等把HIV-1病毒Rev蛋白的突變體RevM10與Gal4 DB域融合作為誘餌蛋白，利用該RevM10蛋白能識別并結(jié)合其靶RNA中Rev蛋白反應(yīng)元件(Rev responsive element,RRE)的作用去篩選同樣也能與此RNA結(jié)合并已與Gal4 AD域融合的未知蛋白。根據(jù)同樣的原理，如將一個已知RNA與RRE融合形成雜合RNA分子并配以RevM10-Gal4 DB融合蛋白作為誘餌，便可用于篩選該RNA結(jié)合蛋白的cDNA克隆。SenGupta 等利用RNA噬菌體衣殼蛋白能識別結(jié)合其基因組內(nèi)一種21核苷酸的RNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)的特性，將RNA噬菌體衣殼蛋白與Lex DB域融合，構(gòu)建成可用于尋找體內(nèi)的RNA結(jié)合蛋白的酵母三雜交系統(tǒng)。

核外雙雜交技術(shù) 在傳統(tǒng)的酵母雙雜交系統(tǒng)中，蛋白之間的相互作用是在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)生的。因此,它不能檢測某些在核外蛋白之間的相互作用。為了克服這種局限性，近年來有人建立了核外雙雜交技術(shù)。其中SRS 和USPS就是這種技術(shù)的兩個代表。SRS也稱Sos蛋白召集系統(tǒng)(Sos Recruitment System)。它的基本原理是分別將待測蛋白X與哺乳動物細(xì)胞的一種鳥苷交換因子(EGF)Sos蛋白融合；將Y蛋白與錨定在酵母細(xì)胞膜上的Src肉豆寇烯化信

號蛋白融合，并使它們共表達(dá)于一個cdc25-2基因溫度敏感型突變的酵母菌株內(nèi)。由于該菌株中cdc25-2基因編碼的EGF蛋白在36℃條件下不能激活細(xì)胞膜上的Ras蛋白，Ras途徑不通。所以細(xì)胞無法在36℃條件下生存。但如果待測蛋白X與Y之間發(fā)生相互作用就能把Sos蛋白帶到細(xì)胞膜上并激活附近的Ras蛋白，從而打通Ras途徑，使該菌株獲得在36℃條件下生存的能力。Aronheim等用此技術(shù)鑒別出了一些新的c-Jun相互作用蛋白，并分離到了一個AP-1抑制因子JDP2。USPS也稱為基于遍在蛋白的裂解蛋白感受器(Ubiquitin-based Split Protein Sensor)。它的設(shè)計是根據(jù)這樣一個事實，即真核細(xì)胞中遍在蛋白與某一蛋白之間新生成的融合會被遍在蛋白特異的蛋白酶(UBPs)迅速切開，但這種切割只有當(dāng)遍在蛋白正確折疊時才會發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，遍在蛋白基因的N端和C端這兩部分即使分離，只要共表達(dá)與同一個細(xì)胞內(nèi)，它們?nèi)阅苷_折疊。將待測蛋白X與帶有點突變的遍在蛋白N端片段融合，將待測蛋白Y與下游接有報告蛋白的正常遍在蛋白C端片段融合，并使它們共表達(dá)與同一個細(xì)胞內(nèi)。因遍在蛋白N端片段內(nèi)含有點突變，它與C端片段之間不能自然形成正確的折疊。只有當(dāng)?shù)鞍譞和Y之間發(fā)生相互作用時才能克服點突變的影響，使遍在蛋白的兩端形成正確折疊，從而引來UBPs切除與C端片段連接的報告蛋白。此技術(shù)建立之初是通過Western blot檢測有無被切下的報告蛋白來判斷待測蛋白之間是否發(fā)生了相互作用的，所以操作比較繁瑣，不便于推廣。最近有人對它作了改進(jìn)，以一種融合的轉(zhuǎn)錄激活因子PLV作為報告蛋白。PLV一旦被從遍在蛋白C端片段上切下，它就會進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)激活特定的報告基因，如：LacZ 和HIS3等。這樣就可以根據(jù)轉(zhuǎn)化細(xì)胞是否生長及顯色來判斷待測蛋白之間有無相互作用。因此極大地簡化了操作步驟，提高了篩選效率。酵母雙雜交技術(shù)發(fā)展與應(yīng)用的趨勢

在后基因組時代更具意義且更能發(fā)揮酵母雙雜交技術(shù)的領(lǐng)域是研究生命活動中的網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)。第一個具有開拓性的工作是Bartel利用酵母雙雜交技術(shù)建立了一個T7-噬菌體的網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)圖(linkage-map)。Fromont-Racine等對篩選到的陽性克隆進(jìn)行鑒定測序，并將它們分為5類，然后對其中的四類(非編碼序列除外)通過15輪的篩選與分析，繪制出一張綜合了酵母蛋白相互作用的全局性信息圖。這是以往的實驗所難以獲得的。

為適應(yīng)功能基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控研究的需要，CLONTECH公司在Merck-Washington大學(xué)的EST項目研究成果基礎(chǔ)上，采用了與傳統(tǒng)建庫方式完全不同的細(xì)胞內(nèi)同源重組方法，以高通量規(guī)模構(gòu)建了一種陣列模式的酵母雙雜交cDNA文庫。它主要有以下特點：

(1)來源于多種組織器官和細(xì)胞系，因此含有幾乎所有基因的cDNA；

（2）所含各種cDNA的豐度趨于平衡；

（3)含有較長的插入序列，但不是全長cDNA序列。

這樣既避免了5’非編碼區(qū)可能存在的終止密碼阻礙融合蛋白的翻譯，又保證了表達(dá)出的蛋白構(gòu)象接近于天然。這種建庫方法不僅減少了工作量，而且在雙雜交中新發(fā)現(xiàn)的相互作用蛋白種類也明顯增多。

最后，有必要指出的是，酵母雙雜交技術(shù)必須與其它技術(shù)結(jié)合才能有利于對實驗結(jié)果作出更為完整和準(zhǔn)確的判斷。

胡文峰

2007040380106