第一篇：多種細(xì)胞的培養(yǎng)方法,步驟,心得,經(jīng)驗(yàn)(大總結(jié))!

多種細(xì)胞的培養(yǎng)方法

HePG2細(xì)胞和L-02細(xì)胞的傳代：

HePG2細(xì)胞屬人肝腫瘤的恒生細(xì)胞株，L-02細(xì)胞則是人胎肝細(xì)胞株，二者所使用的培養(yǎng)基可以是一樣的，即最常見的DMEM。一干使用低糖的。

細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶時(shí)既要傳代。使用胰酶消化即可。用D-Hank's液配制成0.25%的胰酶。使用前37度預(yù)熱，細(xì)胞經(jīng)PBS清洗兩遍后，每個(gè)中號(hào)培養(yǎng)瓶加0.7ml的胰酶，胰酶的量可根據(jù)自己培養(yǎng)瓶的大小而定，原則就是能夠蓋滿瓶底。加入胰酶以后，為使酶的活性最大，將培養(yǎng)瓶蓋擰緊后放回培養(yǎng)箱中，3分鐘左右即用含血清的培養(yǎng)基終止消化。如果在室溫情況下消化，時(shí)間相應(yīng)加長(zhǎng)，可以在顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞界限已十分清楚，即已分離為單個(gè)細(xì)胞，且有少量細(xì)胞漂起，則要終止消化了。

16HBE細(xì)胞株的傳代方法：

鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)融合達(dá)70-80%，準(zhǔn)備傳代。常規(guī)開紫外照射超凈臺(tái)20分鐘，同時(shí)把含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基、0。25%胰酶、PBS放置37度培養(yǎng)箱中孵育。20分鐘后開始傳代。先棄掉舊培養(yǎng)液，加PBS洗一次，然后加0。25%胰酶2ml消化（指25乘25cm大小的培養(yǎng)瓶）細(xì)胞，鏡下觀察細(xì)胞，細(xì)胞突起回縮，細(xì)胞變圓，然后將培養(yǎng)瓶放置37度二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育3分鐘左右（當(dāng)然時(shí)間是隨機(jī)的，比如：新配的胰酶作用時(shí)間短一些，配制時(shí)間長(zhǎng)的胰酶作用時(shí)間會(huì)長(zhǎng)一些，當(dāng)然要不斷地鏡下觀察），待細(xì)胞大部分消化下來(lái)（大部分細(xì)胞呈流沙狀脫離瓶壁），加4ml含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基終止消化。反復(fù)吹打瓶壁上殘留的細(xì)胞，并將已消化下來(lái)的細(xì)胞吹打均勻，然后吸入離心管中1000轉(zhuǎn)離心1分鐘，然后棄掉上清，用手指將離心管中的細(xì)胞彈打均勻，加新培養(yǎng)基，吹打均勻，分至3個(gè)新的培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)足培養(yǎng)液。將培養(yǎng)瓶平放，小心移入37度二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。次日觀察。

胃癌細(xì)胞AGS和SGC-7901的培養(yǎng)：

細(xì)胞傳代時(shí)不能長(zhǎng)的太滿,70%-80%就可以傳了.實(shí)驗(yàn)前先把紫外燈打開照30分鐘,然后再把鼓風(fēng)機(jī)開10分鐘,同時(shí)把培養(yǎng)液和胰酶放入37度水浴箱中,千萬(wàn)記住不要蓋上水浴箱的蓋子.傳代時(shí),我一般把培養(yǎng)瓶口過(guò)一下火,就直接把培養(yǎng)液到去,再用0.25%的胰酶(不含EDTA)消化.等細(xì)胞變圓,細(xì)胞間空隙加大就直接把培養(yǎng)液到去,不用離心,然后再吹打,雖說(shuō)要輕柔,但很難吹打成單細(xì)胞懸液,所以稍用力也沒(méi)有關(guān)系.雖然操作不規(guī)范,但節(jié)省時(shí)間,細(xì)胞也沒(méi)有被污染.AAV-293細(xì)胞的傳代:

AAV-293細(xì)胞較喜歡成團(tuán)生長(zhǎng),比較嬌嫩,怕冷,傳代時(shí)不要一次從二氧化碳培養(yǎng)箱拿出很多瓶,一次只要拿2-3瓶出來(lái)傳就可以了,否則細(xì)胞很容易死掉.細(xì)胞在50-60%傳代,細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)最好.用D-Hank's液配制成0.25%的胰酶消化半分鐘左右,棄去胰酶.觀察培養(yǎng)瓶是否有針孔樣縫隙,如有就可以加入培養(yǎng)液吹打細(xì)胞.消化過(guò)久,對(duì)細(xì)胞損害很大,而且成團(tuán)很難吹打成單個(gè)細(xì)胞.然后加入含有10%小牛血清的DMEM.輕輕放入二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng).肺癌細(xì)胞（人類），其中絕大部分都是貼壁細(xì)胞，具體如：

（１）Ａ５４９（肺腺癌）

（２）ＮＣＩＨ４４６（小肺細(xì)胞癌）（３）８０１（非小肺細(xì)胞癌）

（４）ＮＣＩＨ４６０（大細(xì)胞肺癌）

在消化傳代過(guò)程中，步驟基本一致：

吸去舊的培養(yǎng)液－＞用Ｈａｎｋｓ＇（１Ｘ）清洗一兩次－＞加入一定量的消化液（Ｔｒｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ）－＞置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞大部分變圓時(shí)，回到超靜臺(tái)－＞吸去消化液－＞加入一定量的新培養(yǎng)液－＞反復(fù)吹打細(xì)胞－＞再置顯微鏡下觀察，直到細(xì)胞全部懸浮起來(lái)－＞吸出一部分加入新的培養(yǎng)瓶中－＞最后再補(bǔ)充加入一定量新的培養(yǎng)液（ＲＰＭＩ１６４０ｗｉｔｈ １０％ ＦＢＳ）．

注意： 吹細(xì)胞時(shí)盡量多吹邊角兒，此處細(xì)胞生長(zhǎng)的多．另外吸出細(xì)胞前要混勻． 另注：消化液的配制方法：

Trpsin-EDTA(1X)--0.25% Trpsin with EDTA-4Na prepared with 2.5g Trpsin(1:250)and 0.38g EDTA-4Na/L in HBSS 小鼠前脂肪細(xì)胞（3T3-L1）：

吸棄原培養(yǎng)液-->PBS洗一兩次-->加入400ul0.125％胰酶（原代最好加0.05% EDTA）消化-->轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)盤，保證整個(gè)盤面都被trypsin液潤(rùn)過(guò)->吸棄trypsin后37度消化3min-->以完全培液（DMEM+10% FCS＋1/1000Biotin+1/1000泛酸鈣-->吸打（槍的吸力調(diào)至最?。?：10接種，前后左右搖晃培養(yǎng)盤，細(xì)胞均勻后放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)（10%CO2 ,37度）

MDBK（牛腎細(xì)胞）類型：貼壁細(xì)胞

來(lái)源：購(gòu)自武漢病毒所細(xì)胞保存中心 由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物生物技術(shù)中心繁殖保存 傳代步驟：

棄去舊的生長(zhǎng)液-->用無(wú)鈣鎂水(CMF)沖洗貼壁細(xì)胞數(shù)次(視細(xì)胞瓶的大小,3--5次)-->剩少許CMF,滴入 ATV 2--3滴-->搖勻細(xì)胞瓶中的液體,使ATV均勻的分布到瓶里的沒(méi)個(gè)地方-->放入37度二氧化碳溫箱中3--5min消化-->棄去ATV,加入生長(zhǎng)液,拍打吸吹下細(xì)胞-->鏡下觀察-->分瓶-->作好記號(hào),放入37度二氧化碳溫箱生長(zhǎng)

細(xì)胞特點(diǎn):該細(xì)胞生長(zhǎng)力強(qiáng),而且快速一般24h就可以張到80%,48h不傳就會(huì)變的很老,所以該細(xì)胞傳時(shí)要勤點(diǎn);我感覺(jué)MDBK還是很好傳的,比以前我傳的ST、Vero細(xì)胞等要好傳一些，且不那么容易死亡，所以是我的一個(gè)比較好的選擇！該細(xì)胞適合接種皰疹病毒（如：偽狂犬病毒）！

BHK-21：

棄除舊的培養(yǎng)液后---用緩沖液沖洗一遍----用0.22%的胰酶消化液消化約兩分鐘左右可以看到細(xì)胞像沙子一樣脫落-------趕緊倒掉胰酶加入含10%的牛血清培養(yǎng)液終止消化。但目前國(guó)內(nèi)能找到的BHK-21細(xì)胞大部分都有支原體感染，如果是好的BHK-21細(xì)胞能做到1比20的分種率。

補(bǔ)充一點(diǎn)關(guān)于BHK-21的培養(yǎng),先用少量胰酶沖洗一下,棄去,再用胰酶消化1min左右,效果會(huì)好一些

皮膚成纖維細(xì)胞和THP-1細(xì)胞：

皮膚成纖維細(xì)胞是貼壁生長(zhǎng)的。THP-1細(xì)胞是懸浮的。

由于我們實(shí)驗(yàn)室養(yǎng)細(xì)胞的時(shí)間也不是很長(zhǎng)，所以也只能說(shuō)說(shuō)自己平時(shí)的操作了。先說(shuō)皮膚成纖維細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞鋪滿瓶底，也就是細(xì)胞與細(xì)胞之間沒(méi)有間隙時(shí)，就可以傳代了。一般十天左右傳一代。先吸棄舊培養(yǎng)液，用D-Hanks液洗兩遍，再加入0.25%的胰酶，加入的量以能覆蓋瓶底為準(zhǔn)。加入后輕輕搖晃培養(yǎng)瓶使液體覆蓋瓶底，然后靜置兩分鐘左右，最好是能在顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞之間出現(xiàn)間隙且有一部分細(xì)胞呈現(xiàn)圓形后即可。吸去胰酶，加入含血清培養(yǎng)液，搖晃瓶子使培養(yǎng)液覆蓋瓶底就行了。因?yàn)檠蹇梢越K止胰酶的消化。然后吹打瓶底各處使細(xì)胞脫落。再分瓶補(bǔ)加培養(yǎng)液。

THP-1細(xì)胞的傳代就比較簡(jiǎn)單了。

可以有兩種傳代方法。如果鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)很好，沒(méi)有其它雜質(zhì)即細(xì)胞裂解物之類的，就可以采用直接傳代法。傳代前將細(xì)胞培養(yǎng)瓶直立一個(gè)半小時(shí)使細(xì)胞自然下沉。吸棄上層少量培養(yǎng)液約三分之一，將余下的培養(yǎng)液分成兩瓶，再分別補(bǔ)加培養(yǎng)液即可。如果鏡下觀察覺(jué)得培養(yǎng)液中有雜質(zhì)即可采用離心傳代法。如果細(xì)胞數(shù)目較多可以低速離心約600轉(zhuǎn)離心六分鐘，細(xì)胞可以沉淀下來(lái)而且可以去除細(xì)胞碎片之類的雜質(zhì)。如果覺(jué)得細(xì)胞數(shù)目不多比較寶貴，那就提高轉(zhuǎn)速可以1000轉(zhuǎn)離心六分鐘，這樣細(xì)胞損失很少但可能也有些雜質(zhì)會(huì)一起沉淀下來(lái)。離心后去除上清液，加入新的培養(yǎng)液吹打渾勻即可分瓶傳代了。目前的方法就這些，希望對(duì)新手有所幫助

BHK－21的經(jīng)驗(yàn)：

吸出培養(yǎng)基，吸得越干凈越好，直接加入1ml胰酶（T－25瓶），放到37度培養(yǎng)箱消化。是否需要用hanks 或 pbs之類得緩沖洗細(xì)胞并不絕對(duì)必要，我都沒(méi)有洗，感覺(jué)應(yīng)該洗一下更好，但也更麻煩并增加了污染得可能性。如果細(xì)胞長(zhǎng)得太老，可以先加入1ml胰酶在細(xì)胞表面浸潤(rùn)一下就吸出來(lái)，然后再加入1ml胰酶消化。胰酶在使用前最好預(yù)熱到37度。由于胰酶平時(shí)保存在4度，反復(fù)預(yù)熱對(duì)胰酶的活性不好，我的經(jīng)驗(yàn)是將胰酶進(jìn)行分裝，盡可能避免胰酶反復(fù)冷卻加熱。消化時(shí)間的選擇要根據(jù)實(shí)際情況決定，BHK－21還是比較好消化的，5－15min應(yīng)該足夠了，消化時(shí)間太長(zhǎng)對(duì)細(xì)胞不利。可以在顯微鏡下觀察消化情況，必要時(shí)可以拍打培養(yǎng)瓶幫助細(xì)胞分散，消化結(jié)束后直接加入培養(yǎng)基即可，胰酶會(huì)被血親滅活。一般在T－25瓶中留7－8ml培養(yǎng)基培養(yǎng)。在90％單層細(xì)胞時(shí)，1：4傳代2天后可長(zhǎng)滿。如果使用的培養(yǎng)基偏堿最好先放在CO2培養(yǎng)箱中平衡。細(xì)胞生長(zhǎng)中注意觀察培養(yǎng)基顏色（加入酚紅作指示劑），如出現(xiàn)偏黃表明細(xì)胞代謝產(chǎn)酸較多，此時(shí)如細(xì)胞未長(zhǎng)滿應(yīng)更換部分或全部培養(yǎng)基以確保細(xì)胞狀態(tài)不受影響。

幾種乳腺癌細(xì)胞的培養(yǎng)：

我養(yǎng)的細(xì)胞都是乳腺癌細(xì)胞，就是以下幾種，1、MCF-7：是一種很好養(yǎng)的人乳腺癌細(xì)胞，培養(yǎng)基用DMEM或RPMI1640均可，10－15％的小牛血清就能長(zhǎng)得很好。一般兩到三天傳一代。傳代也很常規(guī)。吸出培養(yǎng)基，加入0.25％的胰酶1ml，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶，使胰酶流遍瓶壁，以去除殘余的培養(yǎng)基。再加入2ml胰酶（25ml培養(yǎng)瓶）靜置消化2－5min，待細(xì)胞縮起變圓，將胰酶吸出加入培養(yǎng)基3ml吹打成單細(xì)胞懸液分瓶即可。我一般都不用緩沖液沖洗，而直接用胰酶沖洗一下以去除剩余血清的作用，感覺(jué)效果還不錯(cuò)。因?yàn)镸CF-7消化較快，一般不放到培養(yǎng)箱中消化，以免消化太過(guò)。需要注意的是MCF-7生長(zhǎng)較快如不及時(shí)傳代可出現(xiàn)整瓶細(xì)胞浮起，一般都來(lái)不及搶救。

2、T47D：也是一種人乳腺癌細(xì)胞，培養(yǎng)基用DMEM＋10－15％的小牛血清，培養(yǎng)方法與MCF-7差不多，但這種細(xì)胞傳代時(shí)間長(zhǎng)了會(huì)極難養(yǎng)。我曾養(yǎng)過(guò)一株新從美國(guó)購(gòu)置的，兩三天傳一代，長(zhǎng)得很旺。后又從國(guó)內(nèi)購(gòu)買一株時(shí)間較長(zhǎng)的，要七天傳一代，而且很嬌氣。

3、MA891 鼠乳腺癌細(xì)胞：這種細(xì)胞比較特殊的是很難消化，容易消化成一團(tuán)一團(tuán)的，如果胰酶的量比常用的多三分之一充分預(yù)熱并放入培養(yǎng)箱中消化就會(huì)好的多。傳到15－20代細(xì)胞就易長(zhǎng)成團(tuán)，從此生長(zhǎng)緩慢，形態(tài)改變，需要復(fù)蘇重養(yǎng)。

95-D細(xì)胞的傳代:

首先要把0.25%的胰酶和培養(yǎng)液在37度水浴20~30分鐘(預(yù)熱).從培養(yǎng)箱中拿出培養(yǎng)的細(xì)胞瓶(一般我是讓它長(zhǎng)到90%幾再傳代的),吸去培養(yǎng)液,可用PBS洗兩遍.也可不洗.加入適量0.25%胰酶消化(試瓶子的大小而定,如250毫升的瓶子加1毫升就行了),讓它都浸濕細(xì)胞就可以吸去了.等個(gè)三十秒就在手上拍打,不要太用勁.就可以看到細(xì)胞脫落了,再加入3毫升左右的培養(yǎng)液吹打(這時(shí)加的培養(yǎng)液不要太多,否則難吹打成單個(gè)細(xì)胞!),制成細(xì)胞懸液,再傳至消毒的培養(yǎng)瓶中(我一般是1傳三,三天后又可以傳代了)再加入適量培養(yǎng)液(如250毫升瓶中加入12~14毫升).再放置在37度5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng).在操作過(guò)程中要有酒精燈的,瓶口,鑷子等可在火上過(guò)一下.其他的地方可用75%的酒精消毒.無(wú)菌觀念要強(qiáng)!

胃癌細(xì)胞MKN28和AGS：

80%-90%confluency,吸棄原培養(yǎng)液-->PBS洗一次-->加入400ul0.125％胰酶（10cm）-->轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)盤，保證整個(gè)盤面都被trypsin液潤(rùn)過(guò)->37度消化5-10min-->以完全培液（RPMI1640+10% FBS-->吸打,1：5接種，前后左右搖晃培養(yǎng)盤，細(xì)胞均勻后放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)（5%CO2 ,37度，24h一個(gè)周期

L929細(xì)胞：

是一種貼壁細(xì)胞，貼壁后繁殖迅速，約3－4天傳代。切記：不要等到細(xì)胞貼的太滿，約70－80％即可傳代（細(xì)胞傳代時(shí)不能長(zhǎng)的太滿,70%-80%就可以傳了BSZLY2003）。否則細(xì)胞容易聚團(tuán)，再想將其打散很不容易，并且打散后細(xì)胞的狀態(tài)也不好了。我用的消化液是EDTA，新配的感覺(jué)特好用，胰酶也用過(guò)，但不如EDTA好用。以下傳代方法同樓上各位朋友。

另外還有一點(diǎn)建議：細(xì)胞傳代之前用75％酒精棉球擦一擦手。細(xì)胞培養(yǎng)瓶打開前也要擦一下，可以降低污染的幾率。

SP 2/0：

是小鼠骨髓瘤細(xì)胞株，貼壁生長(zhǎng)，科室給學(xué)生開實(shí)驗(yàn)就用此細(xì)胞，所用培養(yǎng)基為1640，用小牛血清，濃度15%生長(zhǎng)較好。培養(yǎng)孵箱為37度，5%的CO2。

開始將復(fù)蘇的細(xì)胞傳到小培養(yǎng)瓶（如25ml)，由于細(xì)胞分泌各種因子及細(xì)胞間的相互作用，因此生長(zhǎng)較快，1-2天就可進(jìn)行傳代（當(dāng)然要達(dá)到80-90%的融合）。

消化采用0.25%的胰酶，在顯微鏡下觀察，看細(xì)胞形態(tài)變圓，而且細(xì)胞間界限明顯后，或有極少數(shù)細(xì)胞漂浮起來(lái)就可終止消化。

吹打時(shí)，動(dòng)作要輕、快，而且吹管中要吸滿液體，這樣就不會(huì)產(chǎn)生氣泡，吹打按一定的順序進(jìn)行，將瓶子徹底吹打，尤其是邊緣和角落。

傳代，先將此瓶細(xì)胞只傳到一個(gè)大瓶中，以保證細(xì)胞的數(shù)量，小瓶也可保留，繼續(xù)培養(yǎng)。這樣3-4天又可進(jìn)行傳代。

mcf-7細(xì)胞株：

本人的細(xì)胞株購(gòu)自武漢中國(guó)典藏物培養(yǎng)中心（美國(guó)ATCC株亞型），培養(yǎng)基是MEM，10％的小牛血清（購(gòu)自杭州四季青公司）。傳代要看細(xì)胞數(shù)的多少，一般來(lái)說(shuō)10％的細(xì)胞，要5天左右，如果90％融合的細(xì)胞一傳2，3天子代細(xì)胞即可傳代。傳代：偶用的是25ml培養(yǎng)瓶，吸出培養(yǎng)基，6mlpbs沖洗3次，加入0.25％的胰酶2－3ml，胰酶均勻蓋滿瓶壁，消化2－5min左右（可以同時(shí)振搖），細(xì)胞縮起變圓，浮起，加入培養(yǎng)基2－3ml，不用太精確，吹打成單細(xì)胞懸液分瓶即可。室溫下消化即可，因?yàn)槭浅衫w維細(xì)胞，較為耐受胰酶，消化時(shí)間稍長(zhǎng)亦可，要注意mcf-7細(xì)胞是一種腫瘤細(xì)胞，生長(zhǎng)規(guī)律性差，很容易不均勻，要注意吹打的充分性

HSC-T6（大鼠肝星狀細(xì)胞系）：

棄培液-->以D-Hanks'液洗兩次-->0.05％胰酶消化-->鏡下觀察細(xì)胞變圓（約5分鐘）-->以完全培液（DMEM+10% FCS）終止反應(yīng)-->吹打，1:31:4接種，而且換液間隔不要超過(guò)48h，否則細(xì)胞容易脫落下來(lái)。

血液病細(xì)胞。

如Molt－4,Hl－60等：這些細(xì)胞的特點(diǎn)是懸浮生長(zhǎng)，傳代方便，而且適應(yīng)能力強(qiáng)——————好養(yǎng)！

當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)到約2—8×10（6）后，即可認(rèn)為進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，此時(shí)傳代好，一般控制在2－5×10（6）之間最好，此時(shí)狀態(tài)最好。傳代方法：（傳代前的消毒處理略）

直接在細(xì)胞懸液中加入一定比例的培養(yǎng)基。比例是根據(jù)您的實(shí)驗(yàn)時(shí)間安排而定，此細(xì)胞一般24小時(shí)左右可以增長(zhǎng)一倍數(shù)量，因此，如果現(xiàn)在的濃度為4，您明天要實(shí)驗(yàn)，則可1：1傳，————2×10（6）。明天同一時(shí)間大概就是4左右。

hl－60細(xì)胞：生長(zhǎng)迅速，必須每天觀察，因此如果明天您要4×10（6），今天為4，就必須以1：2～3的傳。否則明天就已經(jīng)因濃度太大而不易實(shí)驗(yàn)。

因是懸浮細(xì)胞，所以觀察時(shí)以大小，圓不圓，顆粒多少，成團(tuán)情況，培養(yǎng)基顏色來(lái)觀察 vero（非洲綠猴腎cell):貼壁細(xì)胞，以25ml小方瓶為例，培養(yǎng)液用的是MEM。MEM的配制：10%小牛血清，1%雙抗，3%谷氨酰胺，1~1.5%NaHCO3.傳代方法：

1.倒掉培養(yǎng)液，如果細(xì)胞臟的話可用PBS洗兩次，否則不用。2.胰酶0.25%2ml消化1~3分鐘，容易消化.Molt－4：

3.倒掉胰酶，加MEM9~12ml,將貼壁細(xì)胞搖至懸浮，并用吸管吹勻，一傳三或一傳四。4.放置37度，5%CO2孵箱

Jurkat細(xì)胞（人外周血白血病T細(xì)胞）：是一種懸浮細(xì)胞：

1、培養(yǎng)液：RPMI1640，15％小牛血清，2％Na2CO3，1％HEPES，青霉素100IU／1ml，慶大霉素100IU／ml；

2、培養(yǎng)條件：5％CO2，37度，30％濕度；

3、細(xì)胞復(fù)蘇：要快速將凍存管放入37度水中，不斷輕輕搖晃，直到細(xì)胞完全溶解，加入10ml左右的培養(yǎng)液，800～1000rpm，10分鐘離心，之后倒掉液體，加入新的培養(yǎng)基就可以進(jìn)行培養(yǎng)了；

4、細(xì)胞培養(yǎng)：起初進(jìn)行傳代時(shí)由于細(xì)胞剛剛復(fù)蘇，長(zhǎng)得比較慢，所以可以3～4天傳一代，傳過(guò)兩代后，一般2～3天傳一代，每次傳代后在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，在傳過(guò)幾代合適的時(shí)候可以進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

5、細(xì)胞凍存：1000rpm離心后，棄去液體，加入含有15％DMSO的凍存液，按下列順序降溫：室溫→4℃（20分鐘〕→冰箱冷凍室（30分鐘）→低溫冰箱（－80℃ 1小時(shí)）→液氮。

6、我在做細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)的一些小經(jīng)驗(yàn)：

（1）細(xì)胞培養(yǎng)箱在每使用1個(gè)月最好用酒精擦洗一次，這樣可以減少污染；

（2）雖然說(shuō)加樣器放在紫外下照射會(huì)不準(zhǔn)，但我們還是丟了一把1ml的加樣器在超凈臺(tái)，沒(méi)有拿出來(lái)過(guò)，我想這樣也許會(huì)減少污染；

（3）小牛血清我們用的是國(guó)產(chǎn)的，所以在一開始的時(shí)候加了15％的小牛血清，但細(xì)胞總是長(zhǎng)不好，后來(lái)摸索條件，把小牛血清的量調(diào)到了20％，細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛；（4）HEPES雖然貴點(diǎn)，但加上去后細(xì)胞會(huì)長(zhǎng)的不錯(cuò)；（5）在超凈臺(tái)操作前要用0.1％的新潔爾滅或75%酒精擦手

MCF-7細(xì)胞：

細(xì)胞放在顯微鏡下觀察，細(xì)胞無(wú)污染、退縮，等其長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶約70%-80%時(shí)即可進(jìn)行傳代操作，具體步驟如下：

1.打開瓶蓋，棄上清,2.D-HANK‘S夜（以50ml培養(yǎng)瓶為例，下同）2吸管清洗后棄之；3.加0.25%胰酶2吸管；4.輕搖晃后置入37度溫箱；5.3-5分鐘后置顯微鏡下觀察，見細(xì)胞胞質(zhì)退縮，變圓；6.吸去胰酶，加含10%FCS的RPMI1640 3吸管；7.用洗管吹打，見細(xì)胞脫落，培養(yǎng)液變混，即可吸出加到新的培養(yǎng)瓶中。

注意事項(xiàng)：若胰酶消化超過(guò)時(shí)間，見細(xì)胞已漂浮，切不可直接倒去上清，可直接加等量的含10%FCS的RPMI1640，吹打后加到離心管中離心5分鐘，再棄上清，加入培養(yǎng)基進(jìn)行傳代

BALB/c-3T3：小鼠成纖維細(xì)胞。

消化過(guò)程：倒掉培養(yǎng)基——向培養(yǎng)瓶中加入少量37度預(yù)熱的0.25%胰酶，轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)瓶使胰酶浸過(guò)瓶底，倒掉胰酶——再向瓶中加入胰酶，加入量以能覆蓋細(xì)胞為宜，1分鐘后倒掉胰酶——將培養(yǎng)瓶置于37度孵箱中——顯微鏡下觀察，細(xì)胞開始變形時(shí)以含10%小牛血清的DMEM中止消化——吹打成單細(xì)胞懸液，1:2~1:3接種，繼續(xù)培養(yǎng)。

SKOV3細(xì)胞傳代方法：

自CO2培養(yǎng)箱取出培養(yǎng)瓶－>超凈工作臺(tái)中,以吸管輕輕吹打有細(xì)胞的瓶壁，去除生長(zhǎng)不好的細(xì)胞-->棄去培養(yǎng)液-->加0.04%&<46;EDTA數(shù)滴(用0.02%的EDTA不易消化掉)，浸過(guò)細(xì)胞-->置37℃培養(yǎng)箱10min&<46;左右-->取出，倒置顯微鏡下觀察，細(xì)胞變圓回縮，但又未自瓶壁脫落--&<46;>超凈工作臺(tái)中棄去EDTA－>加入含10%新生牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基--&<46;>吸管吹打后，1:2或1:3接種。&<46;

293細(xì)胞的傳代：

通常我是不用EDTA的只用0.25%的胰酶消化一般在細(xì)胞約80%匯合時(shí)傳代加入一毫升的胰酶后可以不用吸出胰酶（前提是用10%以上濃度的血清DMEM培養(yǎng)液）加上胰酶直接拍打至細(xì)胞脫落加入少許培養(yǎng)液中和后分瓶然后補(bǔ)加培養(yǎng)液 5%CO2孵箱 37度培養(yǎng)效果不錯(cuò)

HK2的傳代（人腎近曲小管上皮細(xì)胞)： 以50ml培養(yǎng)瓶為例

1、細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，長(zhǎng)滿瓶底80％時(shí)，膠頭滴管移去培養(yǎng)液，可輕輕吹打，移液時(shí)不留培養(yǎng)液殘余

2、加0.25％胰酶1ml消化37℃約2min，鏡下可見細(xì)胞基本圓形脫落，加含血清培養(yǎng)液2ml中止消化，反復(fù)混懸

3、移入離心管，1200g，5min

4、棄去上清，加入新培養(yǎng)液5ml，再次吹打混懸細(xì)胞，按需要分入新的培養(yǎng)瓶，鏡下可見散在分布圓形細(xì)胞

5、入37℃5％CO2孵箱，半天即可再貼壁

caco-2（人結(jié)腸癌上皮細(xì)胞）：

將Caco-2 細(xì)胞培養(yǎng)于高葡萄糖(的DMEM培養(yǎng)基中(1%非必需氨基酸, L-谷氨酰胺（L-glutamine), 培養(yǎng)液含青霉素（penicillin）10,000U/ml-鏈霉素（streptomycin）10,000ug/ml, 10%胎牛血清（Fetal bovine serum，F(xiàn)BS)）,長(zhǎng)于T-75組織培養(yǎng)曲頸瓶中,通入5%CO2(相對(duì)濕度90%),置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)介質(zhì)2～3天更換一次,當(dāng)細(xì)胞達(dá)到90%融合后，以不含鈣,鎂離子的磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗后與胰酶(0.25%)—EDTA(1mM)于37℃一起孵育至分離(約5～10分鐘)。吹打細(xì)胞使之脫落，置離心管中1000rmp離心5分鐘。細(xì)胞重新懸浮于完全DMEM液中以1:3的比例分配至新培養(yǎng)瓶中。即完成傳代。

Bel7402和ECV-304：

37度，5％CO2培養(yǎng)箱。

消化前所用物品75％酒精擦拭后放到超凈臺(tái)上，紫外照射30min，同時(shí)胰酶和1640培養(yǎng)液（10％小牛血清，杭州四季青）75％酒精擦拭后放入37度培養(yǎng)箱平衡，進(jìn)無(wú)菌室開始傳代時(shí)取出。來(lái)蘇水托地，整個(gè)房間紫外消毒30min。開風(fēng)淋30min（時(shí)間寧長(zhǎng)勿短啊，有一次弄得我的臉暴皮！半個(gè)月才緩過(guò)來(lái)）。Bel7402通常都是棄培養(yǎng)液（我通常是倒，覺(jué)得用吸管次數(shù)多會(huì)增加污染的機(jī)會(huì)，而我老師意見正好相反，郁悶?。?，加入少量胰酶清洗，棄去后，加入胰酶2－3ml，培養(yǎng)箱內(nèi)放置3min左右，取出，加入培養(yǎng)液中和胰酶，輕輕吹打即可。

ECV－304培養(yǎng)條件同時(shí)。操作的時(shí)候步驟基本相同，只是加入胰酶消化的時(shí)間比Bel-7402稍微長(zhǎng)1－2min

卵巢癌的細(xì)胞：

包括SKOV3、A2780、3AO、OVCAR3、HRA，幾種細(xì)胞的特性不完全一樣，但是我的傳代的步驟是基本一致的：細(xì)胞生長(zhǎng)至80%匯合時(shí)傳代，先倒掉培養(yǎng)液，加預(yù)先加好雙抗的生理鹽水或PBS 5-10ml（100ml培養(yǎng)瓶）后輕輕搖晃數(shù)次后倒掉，加0.25-0.35%的胰酶2ml，并使其分布均勻（這一點(diǎn)很重要，一定要注意工作臺(tái)是否平整，否則容易造成胰酶分布不均勻而細(xì)胞消化不同步），待細(xì)胞間隙變大時(shí)終止消化，加含10%血清的培養(yǎng)液（我用的是1640）4ml輕柔吹打，再按照需傳代的比例（1：2或1：3）補(bǔ)足培養(yǎng)液后分裝至2-3個(gè)培養(yǎng)瓶中。若細(xì)胞碎片較多，可在消化后不倒掉胰酶直接加含血清的培養(yǎng)液吹打后500rpm離心5min，再用培養(yǎng)液重懸分瓶。消化所需的具體時(shí)間依細(xì)胞的種類和狀態(tài)而定，也和細(xì)胞的匯合程度有關(guān)，一般是80%匯合時(shí)最容易消化，若細(xì)胞長(zhǎng)得太滿，消化時(shí)間要適當(dāng)延長(zhǎng)，必要時(shí)可以將培養(yǎng)瓶移至培養(yǎng)箱內(nèi)消化。另外，一次性培養(yǎng)瓶要比玻璃培養(yǎng)瓶所需的消化時(shí)間稍長(zhǎng)。

胰腺癌細(xì)胞我所養(yǎng)的是CAP，感覺(jué)不太好伺候，尤其是傳代時(shí)很困難。我一般是在倒掉培養(yǎng)液后，加生理鹽水或PBS沖洗，而后加一次胰酶作用3-5分鐘，倒掉胰酶，再加2-3ml新的胰酶繼續(xù)消化，這樣加兩次的效果好一些，但是吹打的時(shí)候還是很困難，總感覺(jué)細(xì)胞的貼壁能力太強(qiáng)了，明明看見細(xì)胞已經(jīng)變圓了，可就是吹不下來(lái)?，F(xiàn)在想想可能在胰酶中加EDTA會(huì)好一些。

CHO細(xì)胞：中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞。

1、培養(yǎng)液用的GIBCO的RPMI-1640。里面加10%小牛血清，青霉素+鏈霉素。消化時(shí)用0.25%胰酶。

2、我都是1640配營(yíng)養(yǎng)液時(shí)現(xiàn)加血清和雙抗，血清分裝后直接由-20度到37度水浴箱中溶掉，沒(méi)發(fā)現(xiàn)血清有沉淀現(xiàn)象?？傮w積100ml的培養(yǎng)液：90ml1640+10ml牛血清+1ml雙抗，無(wú)其他物質(zhì)了。培養(yǎng)過(guò)程中沒(méi)發(fā)現(xiàn)有什么問(wèn)題。

3、傳代時(shí)，先吸掉培養(yǎng)液，我都不用倒掉的方法，怕由于瓶口而污染，都是慢慢吸管吸出的。然后培養(yǎng)液略微沖洗一下，加胰酶，倒置顯微鏡下見80%細(xì)胞變圓后，吸出胰酶，培養(yǎng)液終止消化。吹打下細(xì)胞，按所需稀釋比例傳代。我現(xiàn)在的CHO細(xì)胞狀態(tài)不是很好，但是瘋長(zhǎng)，不知道為什么。所以每次傳代時(shí)，我都是留一滴足夠，差不多能稀釋20倍了。不知哪個(gè)戰(zhàn)友也養(yǎng)CHO細(xì)胞，多交流。

小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7的消化及傳代：

RAW264.7因是單核巨噬細(xì)胞其生物學(xué)特性就是貼壁特別牢，普通的方法根本就不可能將它消化下來(lái)，這也是養(yǎng)這種細(xì)胞最頭痛的問(wèn)題?，F(xiàn)將我的一點(diǎn)心得，簡(jiǎn)介如下： 消化液：0.5％胰酶、0.2％EDTA，實(shí)驗(yàn)前加溫到37度

以50ml培養(yǎng)瓶為例：

1、細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，長(zhǎng)滿瓶底80％時(shí)，棄去培養(yǎng)液，加D-HANKS 漂洗兩次；2.加入含胰酶和EDTA的消化液1－2ml,消化37℃約2-5min，鏡下可見細(xì)胞基本圓形回縮即中止消化，棄消化液加D-HANKS 漂洗兩次；3.加入新培養(yǎng)液10ml復(fù)吹打混懸細(xì)胞，按需要分入新的培養(yǎng)瓶；4.入37℃5％CO2孵箱，幾小時(shí)后即可再貼壁。

SK-BR-3（乳腺腺癌細(xì)胞系）的傳代方法：

剛開始養(yǎng)SK-BR-3時(shí)，細(xì)胞狀態(tài)不是很好，貼壁也不均勻，于是開始想辦法，考慮是不是吹打的不夠，或是傳得過(guò)多，或是其它的什么，后來(lái)發(fā)現(xiàn)的確如此，細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)與傳代的方法有很密切的聯(lián)系。

我的傳代方法是：

以50平方厘米培養(yǎng)瓶為例，待細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底70％－80％ 1 吸除或倒掉瓶?jī)?nèi)舊培養(yǎng)基。PBS 5ml加入培養(yǎng)瓶，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶，讓PBS流遍細(xì)胞表面，倒掉。3 PBS 5ml加入培養(yǎng)瓶重復(fù)洗一次，倒掉。加入1ml胰蛋白酶消化液，輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)瓶，使消化液流遍所有細(xì)胞表面，然后置37度5％的二氧化碳培養(yǎng)箱放置5分鐘，在顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞脫壁、變圓即可。5 加入含血清的培養(yǎng)基5ml中止消化，吸取瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)液，反復(fù)輕輕吹打瓶壁細(xì)胞，確保所有的瓶底都要吹打到。6 吸1/3至1/4的細(xì)胞懸液接種至新的培養(yǎng)瓶，然后加8ml的新的細(xì)胞培養(yǎng)基，置37度5％的二氧化碳培養(yǎng)箱完成傳代。

飼養(yǎng)層細(xì)胞STO的傳代：

1.當(dāng)細(xì)胞鋪滿整個(gè)平皿(100mm)后,吸棄舊培養(yǎng)液，10mLPBS洗一遍

2.0.25%胰酶（預(yù)熱20分鐘左右）2ml消化，輕輕搖晃，直至肉眼見單層細(xì)胞呈塊狀脫落（或在顯微鏡下觀察細(xì)胞之間分離），立刻加5ml(DMEM+10%FBS)終止消化，輕柔吹打8-10次成單細(xì)胞。

3.離心1000rpm*5min,棄上清，加DMEM+10%FBS輕柔吹打。

4.將細(xì)胞懸液1:4傳到100mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，每個(gè)皿加10ml(DMEM+10%FBS)培養(yǎng)液，正常情況下2-3天就可以長(zhǎng)滿，期間不用換液。

小鼠ES-R1細(xì)胞系傳代：

因?yàn)槲覀冇蔑曫B(yǎng)層細(xì)胞鋪皿而不是明膠包被，所以傳代之前必須處理飼養(yǎng)層細(xì)胞。1.飼養(yǎng)層細(xì)胞STO處理：當(dāng)STO鋪滿平皿后，向培養(yǎng)液中加入100ul 1mg/mlmitomycinC(toxic, 操作時(shí)不要接觸，作用是抑制STO增殖)，輕輕搖晃平皿，保證絲裂霉素分布均勻，放置于培養(yǎng)箱中處理2h后，吸棄培養(yǎng)液，10mlPBS洗兩遍（目的是把mitomycinC洗凈），0.25%胰酶消化，5ml(DMEM+10%FBS)終止，離心1000rpm*5min棄上清，加DMEM+10%FBS后吹打均勻，種到新的100mm細(xì)胞培養(yǎng)皿，補(bǔ)齊培養(yǎng)液至10ml。置于培養(yǎng)箱中過(guò)夜。2.第二天早上傳干細(xì)胞：

（1）吸棄舊培養(yǎng)液，10mlPBS洗一遍，2ml 0.25%胰酶消化，邊消化邊輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)皿，4-5min后鏡下觀察發(fā)現(xiàn)發(fā)部分細(xì)胞脫落，成小的細(xì)胞團(tuán)塊，加8ml DMEM+10%FBS終止消化，輕柔吹打。

（2）然后將液體轉(zhuǎn)移到15ml塑料離心管中，靜置10-15min，吸棄上清，加2mlES培養(yǎng)液。

（3）將滴管在酒精燈下拉成非常細(xì)的玻璃管，吹打1－2次，盡量將ES吹散

（4）將前一天鋪好的STO的培養(yǎng)液吸棄，換成10ml的ES培養(yǎng)液（操作要小心，不然STO很容易脫落），再把塑料離心管中的ES1:3或1:4(視情況而定)傳到鋪好的STO皿中，前后左右垂直晃動(dòng)幾下，使干細(xì)胞分布均勻，置于培養(yǎng)箱中，每天換液，兩到三天傳代。應(yīng)該注意的問(wèn)題：

1.STO不管是在ES傳代還是換液過(guò)程中都可能因?yàn)榧右后w速度過(guò)快而脫落，所以最好靠近培養(yǎng)皿壁先一滴一滴加，避免液體直接打在STO上。2.玻璃管拉得盡量細(xì)一些。3.一定要把mitomycin洗干凈

HepG2細(xì)胞株的傳代經(jīng)驗(yàn)：

首先在倒置顯微鏡下觀察生長(zhǎng)融合達(dá)80%，不需要長(zhǎng)滿，就準(zhǔn)備傳代。倒掉舊的培養(yǎng)基，再用已經(jīng)高壓滅菌過(guò)的PBS洗1－2次，我用的是25平方厘米的培養(yǎng)瓶，加入1毫升已經(jīng)配制好的0.25%胰蛋白酶－0.02%EDTA(0.25%胰蛋白酶是用D-Hanks配制后先用濾紙過(guò)濾，再用一次性過(guò)濾器過(guò)濾除菌，再分裝成1ml的小包裝，剛好每次用完一個(gè)，避免每次反復(fù)凍存，會(huì)使胰酶的活性下降），加入的量以剛好蓋滿瓶底為宜。放到倒置顯微鏡下觀察變化，一旦發(fā)現(xiàn)細(xì)胞開始變園收縮，大約1－3分鐘時(shí)間，必要時(shí)可以吹打幫助細(xì)胞分散，就立即加入培養(yǎng)基中和胰酶，如有EDTA最好要離心（800rpm,5min)，棄上清夜，再加入完全培養(yǎng)基吹勻，再分瓶，一般一瓶可以分2－3瓶。放入5%的CO2培養(yǎng)箱，37度培養(yǎng)24小時(shí)后觀察。

hela細(xì)胞的培養(yǎng)條件為: 高糖DMEM培養(yǎng)基,100ml/l胎牛血清;培養(yǎng)液中一般血清含量為10% 傳代步驟: 1．倒去細(xì)胞培養(yǎng)液(對(duì)于小口的培養(yǎng)瓶可采用頃倒方法,對(duì)于培養(yǎng)皿,必須用吸管吸出)

2．吸取適量的PBS加入培養(yǎng)瓶中,輕輕振蕩后棄去重復(fù)一次,以清于血清成分, 利于胰酶消化

3．加入適量0.25%胰蛋白酶（一般100mm培養(yǎng)皿可加入1ml，15cm培養(yǎng)瓶加入5-8滴）轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)瓶，使其濕潤(rùn)整個(gè)細(xì)胞房，高溫下消化2-3分鐘。

翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，肉眼觀察細(xì)胞單層，見細(xì)胞單層薄膜出現(xiàn)針孔大小空隙時(shí)即可頃去消化液，如消化程度不夠可延長(zhǎng)消化時(shí)間，或置于37°C孵箱中加速胰酶作用如見大量細(xì)胞片裝脫落，已消化過(guò)頭，則不能頃倒消化液而直接進(jìn)行下一步操作 4．加入適量培養(yǎng)液終止消化 吸取瓶中培養(yǎng)液反復(fù)沖瓶壁上的細(xì)胞層，至全部沖下輕輕吹打，混勻，成細(xì)胞懸液取樣計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為5′10 /ml

15cm培養(yǎng)瓶培養(yǎng)時(shí)，吸取1ml細(xì)胞懸液加到新培養(yǎng)瓶中，加入4ml培養(yǎng)液，蓋好,置37°C孵箱中培養(yǎng)。

傳代的天數(shù)要以HELA細(xì)胞的生長(zhǎng)密度為基礎(chǔ),細(xì)胞密度大了就要傳,應(yīng)該每天觀察HELA細(xì)胞,注意其生長(zhǎng)狀態(tài).HELA細(xì)胞的生長(zhǎng)分5期: 游離期

細(xì)胞經(jīng)消化分散后，由于愿生質(zhì)收縮及細(xì)胞彈性，細(xì)胞成圓形，折光性強(qiáng)，呈懸浮狀態(tài)。吸附期

接種24小時(shí)后，由于細(xì)胞的附壁特性，開始貼壁，圓形細(xì)胞變成延展?fàn)顟B(tài)。繁殖期

細(xì)胞快速生長(zhǎng)、分裂，形成細(xì)胞島直至細(xì)胞單層。維持期

細(xì)胞形成單層后生長(zhǎng)與分裂減緩、折光性減弱，細(xì)胞內(nèi)顆粒增多，由于代謝物的積累，CO2增多，培養(yǎng)液變黃。衰退期

如不及時(shí)換液和傳代，由于營(yíng)養(yǎng)缺乏、代謝物積累，細(xì)胞內(nèi)顆粒進(jìn)一步增多,立體感差，細(xì)胞皺縮、脫落、逐漸衰老死亡。

應(yīng)該在其維持期和衰退期及時(shí)換液.一般而言是4天換一次液.祝你實(shí)驗(yàn)順利!

S180腫瘤細(xì)胞的, S180腹水型腫瘤細(xì)胞平時(shí)可以在小鼠腹腔中轉(zhuǎn)種傳代.我們科室保種時(shí)就這樣的.在有的試驗(yàn)時(shí)需在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)一段時(shí)間,由于其增殖較快,培養(yǎng)時(shí)密度不宜大,一般10*5/ml就夠了;通常2天就需換一次液,由于其是懸浮細(xì)胞，無(wú)須消化,直接離心去上清,PBS洗滌,用含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液就可以了.其要求條件相對(duì)較底,一般培養(yǎng)室都能達(dá)到.我平時(shí)還養(yǎng)小鼠的淋巴細(xì)胞,我們養(yǎng)的是混合淋巴細(xì)胞,不是單一的細(xì)胞株(或系),主要特點(diǎn)是如果需要傳代培養(yǎng)要加IL-2(出于經(jīng)費(fèi)考慮,我們就用人源IL-2,因?yàn)镮L-2具有沿種系普向上約束性,而鄉(xiāng)下無(wú)約束性)50~100u/ ml,換液時(shí)可以離心去上清,可以用PBS洗滌兩一次,加入含10%小牛血清就可以了,其他注意事項(xiàng)同一般的培養(yǎng).小鼠成肌細(xì)胞C2C12和人橫紋肌肉瘤A204細(xì)胞的消化傳代方法

供大家參考: 1)細(xì)胞消化液的配制及存儲(chǔ):我采用的是0.25%Trypsin+0.05%EDTA的消化液,BUFFER采用的是D-Hank's液.配完后分裝成4-5ml/tube,于-20度冰箱中儲(chǔ)存.2)消化前的處理:當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至亞融和狀態(tài)需要傳代時(shí),提前半小時(shí)將配好的消化液放在細(xì)胞培養(yǎng)孵箱中預(yù)熱,同時(shí)將配好的高壓無(wú)菌的D-Hank's液也進(jìn)行預(yù)熱.3)消化細(xì)胞:將預(yù)熱的D-Hank's液洗細(xì)胞2次,2ml/25cm2,然后再加入預(yù)熱的消化液,作用3-5min,并反復(fù)振蕩,鏡下觀察.當(dāng)細(xì)胞被消化成單個(gè)圓球狀時(shí),加入等體積的培養(yǎng)基中止消化,然后反復(fù)吹打,將消化后的細(xì)胞懸液,全部吸出后置于離心管中離心,1000rpm,10min.4)傳代接種細(xì)胞:離心完畢后,棄去上面的上清,加入新鮮預(yù)熱的培養(yǎng)基,并計(jì)數(shù),按要求接種的密度接種到新的培養(yǎng)瓶中即可.這種方法的優(yōu)點(diǎn)是:細(xì)胞消化徹底,損傷小,接種均勻,易于控制密度等.hepa1-6和p19細(xì)胞。

hepa1-6是小鼠肝癌細(xì)胞，p19細(xì)胞是小鼠畸形胎瘤細(xì)胞，前者須用10%胎牛血清的DMEN養(yǎng)，后者須用10%胎牛血清的FD養(yǎng)，且經(jīng)常在傳代初期出現(xiàn)生長(zhǎng)狀態(tài)不好，要反復(fù)洗滌后換液，多觀察。

Ecv304細(xì)胞的培養(yǎng)

Ecv304細(xì)胞也很好培養(yǎng)．用含有10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)，一般２－３天長(zhǎng)到８０％即可傳代，傳代是吸去培基，用ＰＢＳ沖洗，加入0.０5%的胰酶＋0.02%的EDTA，３７度消化１分鐘，加含有10%小牛血清的DMEM終止消化，吸管輕輕打散細(xì)胞，然后加培基放入37度二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)即可． 小鼠肝癌H22體內(nèi)傳代的詳細(xì)步驟：

1.腹腔種植小鼠肝癌H22細(xì)胞后第5-7天時(shí)，將小鼠頸椎脫臼處死，于75%酒精浸泡1-2分鐘或腹部消毒。

2.于無(wú)菌條件下用5 號(hào)針頭注射器抽取腹水，并置于10～50 ml離心管內(nèi)，用生理鹽水(NS)10倍稀釋，吸管充分吹打均勻，1 000 r/min-1離心5#ml 7 min，傾出上清，按一定比例加入生理鹽水，配制成瘤細(xì)胞懸液5-10*10^7/ml，0.2 ml/只，接種到小鼠腹腔。3.為簡(jiǎn)單起見，也可將抽取的腹水用生理鹽水做簡(jiǎn)單稀釋（1：2～1：4），0.2 ml/只，腹腔傳代。

4.下次傳代時(shí)，重復(fù)以上步驟即可。小鼠肉瘤S180腹腔體內(nèi)傳代同上。

H22小鼠肝癌細(xì)胞株

是腹水型細(xì)胞株，懸浮生長(zhǎng)。液氮冷凍保存。使用時(shí)取出復(fù)蘇，用1640加10%新生牛血清培養(yǎng)，三天后取液計(jì)數(shù)成1＊108濃度，取0.08ml注入小鼠腹腔，7天左右腹水可用，一般要低速離心去掉巨噬細(xì)胞等混雜細(xì)胞，腹水得到的細(xì)胞比培養(yǎng)瓶中生長(zhǎng)的細(xì)胞活力高，皮下接種成瘤率為100％。本法傳代可靠性高，細(xì)胞活力強(qiáng)，致瘤率高。

神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞傳代經(jīng)驗(yàn)：

1、倒掉培養(yǎng)液,用D-HANKS洗兩次

2、加入0.125％胰酶/0.02％EDTA（1：1），蓋滿瓶底為宜。

3、將培養(yǎng)瓶放置顯微鏡下進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞間隙增大，突起回縮后豎起培養(yǎng)瓶，倒掉消化液。

4、用D-HANKS洗一次，此時(shí)動(dòng)作要輕

5、加入完全培養(yǎng)液，輕輕吹打混勻，接種至培養(yǎng)瓶中。注意： 1、0.125％胰酶/0.02％EDTA的PH值和溫度重要，即PH值（7.5），溫度（37℃）

2、如果消化速度過(guò)快，細(xì)胞掉下來(lái)，也不要緊，加D-HANKS或完全培養(yǎng)液終止消化，離心1000r/min，10分鐘即可

3、輕輕吹打

大鼠肝癌細(xì)胞系CBRH7919 是我國(guó)自己培養(yǎng)的細(xì)胞系，最初是用二乙基亞硝胺誘發(fā)的Wistar大鼠肝癌組織傳代而成。此細(xì)胞系增殖力很強(qiáng)。

傳代方法：細(xì)胞長(zhǎng)到90%以上，棄培養(yǎng)液->0.25%胰酶消化->消化時(shí)間1.5-2min->吸棄胰酶->加入1640培養(yǎng)液，10%胎（?。┡Ｑ?>傳代（一般一傳三）

如胰酶消化時(shí)間增加，可通過(guò)離心沉淀細(xì)胞后加入培養(yǎng)液傳代，但這樣增加傳代時(shí)間，而且該細(xì)胞系粘附性較強(qiáng)，離心后易形成細(xì)胞團(tuán)，且不易分散。

293細(xì)胞

293貼壁很不牢，可以不加消化液直接吹打下來(lái)，但這樣下來(lái)的細(xì)胞容易聚成團(tuán)，傳代后形態(tài)不大好看?？梢韵鹊沟襞囵B(yǎng)液，以D-HANK‘S液輕輕沖洗，再加0.6ml 0.25%胰酶/0.01%EDTA，輕輕潤(rùn)濕細(xì)胞后即可棄去，置于鏡下觀察，很快即可見細(xì)胞變圓，加入適量完全培養(yǎng)基終止，輕輕吹打即可。這樣細(xì)胞既不會(huì)消化過(guò)頭，又極盡吹散。

膀胱癌 T24細(xì)胞（貼壁的）。

心得如下：

1、T24長(zhǎng)的非常快，傳代一般1：5傳，每4天需要再傳。

2、雖然是永生化細(xì)胞，也一定不要等細(xì)胞100%匯合再傳代，多次這樣細(xì)胞狀態(tài)不好，球形增加，還不容易洗掉。

3、要用胰酶（0.25%）--EDTA（0.01%）混合消化液消化好些，一般1分鐘內(nèi)呈球形，即可混懸細(xì)胞了。

4、培養(yǎng)液用10%小牛血清的DMEM或1640都可以。

步驟：吸凈培養(yǎng)液，PBS洗2次，加消化液室溫一分鐘左右，要在顯微鏡下注意觀察，不要過(guò)頭，球形后，吸掉消化液，加1毫升培養(yǎng)液，吹打混勻，1：5傳代。

SMMC－7721，肝癌細(xì)胞株：

1、SMMC－7721開始長(zhǎng)的比較慢，呈花瓣?duì)睿善笱杆僭鲋?，?xì)胞由于過(guò)密開始變小，如果不及時(shí)傳代，會(huì)清楚的看到細(xì)胞張成兩層，下層細(xì)胞大一些，上次呈圓形，小。2、3-4天可以傳代，傳代時(shí)稀釋度視情況而定，一般1：3-5

3、用胰酶（0.25%）--EDTA（0.01%）混合消化液消化，消化時(shí)間較長(zhǎng)，大約5分鐘，當(dāng)細(xì)胞過(guò)多時(shí)時(shí)間更長(zhǎng)，建議分兩次消化，既先消化下來(lái)的一部分倒出加培養(yǎng)液（培養(yǎng)液用10%小牛血清的1640)終止，剩下的細(xì)胞繼續(xù)加消化液消化。

步驟：倒凈培養(yǎng)液，胰酶洗1次，倒盡，加胰酶消化液置于37度，在顯微鏡下注意觀察，細(xì)胞變圓后，倒掉消化液，培養(yǎng)液，吹打混勻，1：3-5傳代。

293T,貼壁細(xì)胞：在消化傳代過(guò)程中，步驟如下：

用滴管吸盡舊的培養(yǎng)液－＞用培養(yǎng)基洗一次－＞加入一定量的胰酶（已預(yù)熱）-＞顯微鏡下觀察，待細(xì)胞大部分變圓時(shí)，回到超靜臺(tái)－＞用滴管吸盡酶液－＞加入一定量的含血清的新培養(yǎng)液－＞反復(fù)吹打細(xì)胞－＞再置顯微鏡下觀察，直到細(xì)胞全部懸浮起來(lái)－＞吸出一部分加入新的培養(yǎng)瓶中－＞最后再補(bǔ)充加入一定量新的培養(yǎng)液，放入培養(yǎng)箱。可用含有血清的DMEM，也可以用含有血清的1640。

HELF(人胚肺成纖維細(xì)胞), 這也是一種貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞,所以傳代培養(yǎng)時(shí)的大概方法沒(méi)有什么不同.但這種細(xì)胞貼壁貼得不是很緊,所以消化過(guò)程中有幾點(diǎn)注意事項(xiàng)(本人總結(jié)): 1.當(dāng)?shù)钩鲈信囵B(yǎng)液時(shí),最好將培養(yǎng)瓶反過(guò)來(lái),即有細(xì)胞的面朝上.2.如用EDTA消化,最好先讓其消化3分鐘,后每一兩分鐘看一次.3.每次看時(shí)不要太過(guò)晃動(dòng)瓶子,以防細(xì)胞成片脫落.如果細(xì)胞成片脫落了就比較麻煩了,因?yàn)榧?xì)胞已經(jīng)脫落,就不得不終止消化,但實(shí)際上細(xì)胞與細(xì)胞間的連接并沒(méi)有完全斷開,吹打也分不開,那樣分出來(lái)的細(xì)胞也就成團(tuán),則不利于細(xì)胞貼壁及生長(zhǎng).4.如果在終止消化前有細(xì)胞脫落,不要浪費(fèi),先加Hank's液終止消化,然后離心,收集細(xì)胞,再讓其生長(zhǎng).5.細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)好時(shí),一般5-7天可以長(zhǎng)滿,其間換一次液就可以了.6.但我也遇到過(guò)生長(zhǎng)不太好的情況,細(xì)胞長(zhǎng)了12天才長(zhǎng)滿,且其中有幾天幾乎沒(méi)長(zhǎng)或出現(xiàn)大量黑色死細(xì)胞團(tuán),這時(shí)不要放棄,只要活細(xì)胞不是太少,沒(méi)有關(guān)系.之所以長(zhǎng)的慢或有死細(xì)胞,大概是消化時(shí)EDTA的損傷造成的,細(xì)胞恢復(fù)活性需要一定時(shí)間,且一旦活性恢復(fù),細(xì)胞將長(zhǎng)得很快.人肝癌BEL-7402細(xì)胞傳代步驟：

1.棄去舊培養(yǎng)液（可用巴氏吸管吸去，也可直接翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使培養(yǎng)面朝上，直接倒掉培養(yǎng)液）。

2.PBS沖輕緩漂洗細(xì)胞兩遍，盡量洗去殘余血清，棄PBS液。加0.25%胰酶（以蓋滿瓶底為標(biāo)準(zhǔn)）于37度條件下消化，倒置相差顯微鏡下觀察，細(xì)胞解離程度以細(xì)胞突起回縮，細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞近乎縮成圓形為準(zhǔn)。4.直接加含血清的1640培養(yǎng)基（或血清)終止消化。

5.用彎頭吸管均勻有序的吹打細(xì)胞，動(dòng)作不宜過(guò)猛，防止起泡產(chǎn)生。

5.離心5分鐘（1000轉(zhuǎn)/分鐘），去上清。加入PBS液吹打混勻，再離心一遍。6.用含10％小牛血清的1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，按1：3傳代！7.補(bǔ)加培養(yǎng)液至所用培養(yǎng)瓶容積的1/10為準(zhǔn)。8.送孵箱培養(yǎng)。

小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7的消化及傳代，RAW264.7因是單核巨噬細(xì)胞其生物學(xué)特性就是貼壁特別牢。我得操作如下：

實(shí)驗(yàn)前將DPBS及DMEM加溫到37度 使用Flask75培養(yǎng)瓶：

1、細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，長(zhǎng)滿瓶底70％時(shí)，棄去培養(yǎng)液，加DPBS10ml漂洗一至兩次；棄去 2.加入10mlDPBS,然后用scratcher輕輕刮即可，離心后去除DPBS.用DMEM培養(yǎng)液10ml復(fù)吹打混懸細(xì)胞 3.分入新的培養(yǎng)瓶；

4.入37℃5％CO2孵箱，幾小時(shí)后即可再貼壁。

卵巢癌細(xì)胞SKOV3

貼壁生長(zhǎng)，傳代步驟： 1.倒掉舊培養(yǎng)液，盡量倒凈。

2.如果是50ml的培養(yǎng)瓶，加入約1ml0.25％胰酶中和殘留培養(yǎng)液，倒出。也可用D-HANKS液洗一次，可以節(jié)約胰酶。

3.再加1ml0.25％胰酶消化，本人體會(huì)，新開瓶（指分裝的小瓶）使用的胰酶消化能力強(qiáng)，可以減少用量至0.5－0.8ml,已用較久的胰酶如用少了就不管用。

4.鏡下觀察，如果80％以上細(xì)胞都回縮變圓，立刻將培養(yǎng)瓶豎起，防止過(guò)度消化。5.倒掉胰酶，用含10％小牛血清1640培養(yǎng)液5ml加入瓶?jī)?nèi)，按順序輕吹打，如瓶底由模糊變透亮，說(shuō)明細(xì)胞已從瓶壁吹離。

6.此種細(xì)胞生長(zhǎng)較快，所以一般按1傳5－6傳代，按瓶數(shù)補(bǔ)足培養(yǎng)液，吹勻后分別接種到新瓶中。

7.根據(jù)培養(yǎng)液顏色變化所提示的酸堿度變化，一般2天左右換液一次。

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株ECV304：在含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清（FPS）的RPMI1640培養(yǎng)液，37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，3-4d換液傳代一次。實(shí)驗(yàn)時(shí)采用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。傳代時(shí)先倒掉舊培養(yǎng)液，用pbs５ml洗兩遍，再加入0.25%的胰酶+0.01%edta，加入的量以能覆蓋瓶底為準(zhǔn)。加入后輕輕搖晃培養(yǎng)瓶使液體覆蓋瓶底，然后大約半分鐘左右看一次，對(duì)著光源觀察瓶底細(xì)胞黏附面是否有裂縫（如有則在顯微鏡下可見細(xì)胞之間出現(xiàn)間隙且有大部分細(xì)胞呈現(xiàn)圓形），倒掉，加入含低濃度血清培養(yǎng)液，然后吹打瓶底各處使細(xì)胞脫落。離心后去除上清液，加全培，再分４瓶，補(bǔ)加培養(yǎng)液。這樣操作步驟可大大簡(jiǎn)化，不需要將培養(yǎng)瓶拿出拿進(jìn)操作臺(tái)了．

附:消化緩沖液(0.25%)胰蛋白酶：胰蛋白酶干粉1.25g，0.1gEDTA，溶于50ml 10×D-Hanks溶液中，調(diào)節(jié)至PH 7.6，定容至500ml，22um濾膜過(guò)濾除菌，分裝后-20℃保存?zhèn)溆?/p>

第二篇：細(xì)胞培養(yǎng)步驟

細(xì)胞培養(yǎng)前需要準(zhǔn)備的物品

提前開啟37℃水浴鍋和超凈臺(tái)的紫外燈；

滅菌吸頭、1.5mL的離心管、空玻璃瓶；

無(wú)菌的15mL、50mL離心管；

無(wú)菌的10cm培養(yǎng)皿、16孔板、32孔板、96孔板、培養(yǎng)瓶等。

5mL、10mL的移液管；

橡膠手套、普通移液器、電子移液器、裝有99.9%-100%CO2鋼瓶

70%酒精、DMEM培養(yǎng)基（37℃提前溫?。?、FBS血清、二抗生素（10,000Unit/mL penicillin和10,000ug/mL Streptomycin混合液）、0.05% typsin-EDTA（上述培養(yǎng)細(xì)胞所用試劑都用GIBCO的產(chǎn)品，國(guó)產(chǎn)的產(chǎn)品沒(méi)有辦法保證質(zhì)量）細(xì)胞培養(yǎng)步驟

1.取一瓶液體DMEM培養(yǎng)液（GIBCODMEM液體低糖培養(yǎng)基）、FBS血清、二抗，在放入超凈臺(tái)前用70%的酒精消毒；

2.向500mL的DMEM培養(yǎng)基中加入55mL的FBS血清，至終濃度為10%，再向其中加入雙抗生素，一般保證抗生素的單位達(dá)到100Units（即500mL培養(yǎng)基中加入5mL 10,000單位的雙抗生素，如果用于保藏的細(xì)胞培養(yǎng)最好不加），放置于4℃冰箱中保藏待用；

3.細(xì)胞培養(yǎng)使用前培養(yǎng)基應(yīng)先放入37℃水浴中溫浴，提前打開超凈臺(tái)的紫外燈殺菌，然后從水浴鍋中取出培養(yǎng)基，噴上70%酒精后放入超凈臺(tái)中待用；

4.從液氮中取出凍存管，立刻放入37℃的水浴鍋中晃動(dòng)，直至細(xì)胞凍存液完全溶解；

5.將細(xì)胞凍存懸液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，加入約5mL培養(yǎng)液，輕輕吹打混勻；

6.將細(xì)胞懸液經(jīng)500rpm/min離心5min，棄上清液。

7.向細(xì)胞沉淀內(nèi)再加入適量培養(yǎng)液，輕輕吹打混勻，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中進(jìn)行培養(yǎng)。

8.取出在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)的細(xì)胞（一般BMSCs傳代3次左右就不太好了，所以較難培養(yǎng)）顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，在超凈臺(tái)中吸去表面的培養(yǎng)基，此時(shí)加入少量的培養(yǎng)基清洗一下，然后向培養(yǎng)基內(nèi)加入1-2 ml 0.05%胰蛋白

酶后放入37℃培養(yǎng)箱中處理1-2分鐘使細(xì)胞與培養(yǎng)皿脫離。

9.取出培養(yǎng)皿，觀察胰酶處理的效果，一般以視野中出現(xiàn)均勻的單細(xì)胞為宜，如果有多個(gè)細(xì)胞聚集的現(xiàn)象可以繼續(xù)處理1-2分鐘，然后吸去胰酶，加入適量的培養(yǎng)基進(jìn)行終止胰蛋白酶活性，用電子移液器套移液管進(jìn)行吹打，使細(xì)胞懸浮。

10.顯微鏡下觀察細(xì)胞懸浮程度，最好是可以看到均勻的單細(xì)胞，如果有多個(gè)細(xì)胞聚集的現(xiàn)象可以用手動(dòng)移液器進(jìn)行吹打。

11.向事先準(zhǔn)備好的培養(yǎng)皿中加入8-9ml的培養(yǎng)基（此過(guò)程加入的培養(yǎng)基的量與加入細(xì)胞時(shí)所帶入的培養(yǎng)基的量有關(guān)），一般10cm的平板中總量有10ml的培養(yǎng)基。向含有培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中加入1-2ml的細(xì)胞懸液，然后放入細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)

注意事項(xiàng)：

1.加入FBS血清時(shí)要考慮血清本身的體積，使FBS血清的終濃度達(dá)到10%；

2.FBS血清和二抗生素提前1天放入4℃的冰箱中融化，可以用50mL無(wú)菌的離心管分裝，以免多次融化造成血清變性。每50mL的離心管中最多裝入40-45mL的FBS血清，因?yàn)檠鍍龃婧髸?huì)膨脹；

3.凍存管中的細(xì)胞溶化過(guò)程要迅速，減少DMSO對(duì)細(xì)胞的破壞作用；

第三篇：實(shí)驗(yàn)總結(jié)-細(xì)胞培養(yǎng)方法

一、培養(yǎng)細(xì)胞常用配置

培養(yǎng)基的配置：基礎(chǔ)培養(yǎng)基500ml+胎牛血清50ml+雙抗5ml 凍存液的配置：10 % DMSO + 90%胎牛血清 依次比例酌量配置。超凈工作臺(tái)常規(guī)配置

移液器1套（2.5μl、20μl、200μl、1ml），酒精燈1盞，液器1臺(tái)，斜架1臺(tái)，酒精噴壺1個(gè)，酒精棉球缸1個(gè)，污缸1個(gè)，常規(guī)耗材：培養(yǎng)瓶（50㎝2），定量移液管（5ml、10ml），槍頭（1ml、200μl、10μl），培養(yǎng)皿，6/24/48/96孔板，醫(yī)用脫脂棉球，凍存管 所需試劑：培養(yǎng)基，胎牛血清，雙抗，DMSO，胰酶，75%酒精……

實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：所需的各項(xiàng)高壓后的耗材及污物缸放于超凈工作臺(tái)內(nèi)，用酒精噴壺噴灑實(shí)驗(yàn)臺(tái)面，并關(guān)閉工作臺(tái)打開紫外燈照射30min后開始實(shí)驗(yàn)操作。培養(yǎng)基及胰酶恢復(fù)常溫后使用，可37℃水浴5-10min

二、細(xì)胞復(fù)蘇 步驟：

1.紫外消毒30min后關(guān)閉紫外燈，開啟超凈臺(tái)正常工作狀態(tài)，用酒精消毒操作者的雙手。

2.培養(yǎng)液（DMEM），恒溫水浴箱37℃預(yù)熱20min，備用。超凈臺(tái)內(nèi)準(zhǔn)備一支15ml離心管備用。

3.將所需的培養(yǎng)基確保瓶身干凈后酒精消毒放于工作臺(tái)面內(nèi)，點(diǎn)燃酒精燈，再將瓶口對(duì)準(zhǔn)在酒精燈上消毒2-3次，旋開瓶蓋后需再次分別消毒瓶口和瓶蓋。4.從液氮保存罐中取出凍存管，立即放入37℃水浴中，快速搖晃，直至凍存液融化至黃豆粒大小后迅速取出。

5.將細(xì)胞懸液移入15ml離心管，緩慢加入4ml培養(yǎng)液，離心（1000r/min，5min）。6.取出2個(gè)培養(yǎng)皿并做好標(biāo)記（復(fù)蘇日期等），提前加入5-10ml培養(yǎng)液；離心結(jié)束后用1ml培養(yǎng)液懸液混懸沉淀細(xì)胞后分別加入培養(yǎng)皿內(nèi)。

7.將培養(yǎng)基瓶口和瓶蓋消毒2-3次后擰緊，熄滅酒精燈，整理實(shí)驗(yàn)臺(tái)面，取出實(shí)驗(yàn)試劑及污缸等，關(guān)閉超凈工作臺(tái)。8.將培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)

注意事項(xiàng)：

1.取細(xì)胞的過(guò)程中注意帶好防凍手套。此項(xiàng)尤為重要，細(xì)胞凍存管可能漏入液氮，解凍時(shí)凍存管中的氣溫急劇上升，可導(dǎo)致爆炸。

2.凍存液的問(wèn)題：凍存液的配置已是常識(shí)，在這里不作詳述，但二甲基亞砜（DMSO）對(duì)細(xì)胞不是完全無(wú)毒副作用，在常溫下，二甲基亞砜對(duì)細(xì)胞的毒副作用較大，因此，必須在1-2min內(nèi)使凍存液完全融化。如果復(fù)蘇溫度太慢，會(huì)造成細(xì)胞的損傷，二甲基亞砜（DMSO）最好選擇進(jìn)口產(chǎn)品。

3.離心前須加入少量培養(yǎng)液。細(xì)胞解凍后二甲基亞砜濃度較高，注意加入少量培養(yǎng)液可稀釋其濃度，以減少對(duì)細(xì)胞的損傷。

4.離心問(wèn)題：目前主要有兩種見解。一種是解凍后的細(xì)胞懸液直接吹打均勻后分裝到培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，第二天換液。因?yàn)殡x心的目的是兩個(gè)，去除 DMSO，去除死細(xì)胞，這個(gè)是標(biāo)準(zhǔn)流程，但對(duì)一般人來(lái)說(shuō)，把握不好離心轉(zhuǎn)速和時(shí)間，轉(zhuǎn)的不夠活細(xì)胞沉底的少，細(xì)胞就全被扔掉了，轉(zhuǎn)過(guò)了活細(xì)胞會(huì)受壓過(guò)大，死亡。此外在操作過(guò)程中容易污染，所以不推薦。另一種說(shuō)法為細(xì)胞懸液中含有二甲基亞砜（DMSO），DMSO對(duì)細(xì)胞有一定的毒副作用，所以須將離心后的液體前倒凈，且一定倒干凈。

5.凍存細(xì)胞解凍時(shí)1ml細(xì)胞液要加10ml－15m培養(yǎng)液

6.復(fù)蘇細(xì)胞分裝的問(wèn)題：復(fù)蘇1管細(xì)胞一般可分裝到2-3只培養(yǎng)皿中，分裝過(guò)多，細(xì)胞濃度過(guò)低，不利于細(xì)胞的貼壁。

7.加培養(yǎng)基的量放入問(wèn)題：這個(gè)量的多少的把握主要涉及到的問(wèn)題是DMSO的濃度，從如果你加培養(yǎng)基的太少，那么DMSO的濃度就會(huì)比較大，就會(huì)影響細(xì)胞生長(zhǎng)，從以前的資料來(lái)看，DMSO的濃度在小于0.5%的時(shí)候?qū)σ话慵?xì)胞沒(méi)有什么影響，還有一個(gè)說(shuō)法是1％。所以如果你的凍存液的濃度是 10％DMSO的話那么加10ml以上的培養(yǎng)基就恰好稀釋到了無(wú)害濃度

8.原理：在不加任何條件下直接凍存細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞內(nèi)和外環(huán)境中的水都會(huì)形成冰晶，能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)發(fā)生機(jī)械損傷、電解質(zhì)升高、滲透壓改變、脫水、PH改變、蛋白變性等，能引起細(xì)胞死亡。如向培養(yǎng)液加入保護(hù)劑，可使冰點(diǎn)降低。在緩慢的凍結(jié)條件下，能使細(xì)胞內(nèi)水份在凍結(jié)前透出細(xì)胞。貯存在－130℃以下的低溫中能減少冰晶的形成。細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)速度要快，使之迅速通過(guò)細(xì)胞最易受損的－5～0℃，細(xì)胞仍能生長(zhǎng)，活力受損不大。目前常用的保護(hù)劑為二甲亞砜（DMSO）和甘油，它們對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性，分子量小，溶解度大，易穿透細(xì)胞。

三、培養(yǎng)液的更換

1.紫外消毒30min后關(guān)閉紫外燈，開啟超凈臺(tái)正常工作狀態(tài)，用酒精消毒操作者的雙手。

2.培養(yǎng)液（DMEM），恒溫水浴箱37℃預(yù)熱20min，備用。

3.將所需的培養(yǎng)基確保瓶身干凈后酒精消毒放于工作臺(tái)面內(nèi)，點(diǎn)燃酒精燈，再將瓶口對(duì)準(zhǔn)在酒精燈上消毒2-3次，旋開瓶蓋后再次分別消毒瓶口和瓶蓋。4.將培養(yǎng)皿蓋內(nèi)口朝上放在架子上，將培養(yǎng)皿內(nèi)的培養(yǎng)液懸空倒進(jìn)污缸 5．拿出1支高壓后的5ml定量移液管，在酒精燈上灼燒尾部后裝于移液器上，再次放于酒精燈上灼燒整個(gè)定量移液管管身2-3次，懸空進(jìn)入培養(yǎng)基瓶?jī)?nèi)吸取5-10ml培養(yǎng)基再懸空移入培養(yǎng)皿內(nèi)，將培養(yǎng)皿蓋在酒精燈上消毒2-3次后蓋上。6.將培養(yǎng)基瓶口和瓶蓋消毒2-3次后擰緊，熄滅酒精燈，整理實(shí)驗(yàn)臺(tái)面，取出實(shí)驗(yàn)試劑及污缸等，關(guān)閉超凈工作臺(tái)。7.將培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)

每天定時(shí)觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，一般72-96h后，細(xì)胞生長(zhǎng)密度大于90%，即可進(jìn)行細(xì)胞的傳代。

四、細(xì)胞傳代

1.紫外消毒30min后關(guān)閉紫外燈，開啟超凈臺(tái)正常工作狀態(tài)，用酒精消毒操作者的雙手。

2.培養(yǎng)液，胰酶，恒溫水浴箱37℃預(yù)熱20min，備用。

3.將所需的培養(yǎng)基，胰酶確保瓶身干凈消毒后放于工作臺(tái)面內(nèi)，點(diǎn)燃酒精燈，再將瓶口對(duì)準(zhǔn)在酒精燈上消毒2-3次，旋開瓶蓋后再次分別消毒瓶口和瓶蓋，分別放于酒精燈的兩側(cè)。

4.將培養(yǎng)皿蓋內(nèi)口朝上放在架子上，將培養(yǎng)皿內(nèi)的培養(yǎng)液懸空倒進(jìn)污缸。取1ml移液器快速移動(dòng)在酒精燈上消毒1-2次，然后再裝上槍頭吸取1-2ml胰酶液，懸空沿皿壁加入培養(yǎng)皿內(nèi)。

5.將培養(yǎng)皿來(lái)回傾倒使胰酶浸沒(méi)整個(gè)皿底的細(xì)胞層，計(jì)時(shí)越1-3min（消化時(shí)間根據(jù)細(xì)胞不同時(shí)間不同），對(duì)著燈光可觀察到細(xì)胞與細(xì)胞之間有針孔樣縫隙，并有1-2個(gè)細(xì)胞脫落，鏡下觀察到細(xì)胞都變圓時(shí)為胰酶消化的最適時(shí)機(jī)。（若看到成片的細(xì)胞從瓶壁脫落為胰酶消化過(guò)度；若看不到針孔樣縫隙和細(xì)胞脫落，或鏡下細(xì)胞多有菱角則需繼續(xù)消化）。用移液器將胰酶吸凈。

6.吸取1ml培養(yǎng)基于培養(yǎng)皿內(nèi)，并用移液器吸取少量的培養(yǎng)基輕柔的反復(fù)沖洗培養(yǎng)瓶壁5-8次，使貼壁細(xì)胞完全脫落于培養(yǎng)基內(nèi)再輕輕吹打2-3次，使細(xì)胞盡可能處于單個(gè)懸浮狀態(tài)。

7.取1或2個(gè)新的培養(yǎng)皿，然后將細(xì)胞培養(yǎng)基均勻的分到2或3個(gè)培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)（注意原來(lái)傳代時(shí)使用的培養(yǎng)瓶可繼續(xù)傳代使用），進(jìn)行1傳2或1傳3的培養(yǎng)。8.拿出1支高壓后的5ml定量移液管，在酒精燈上灼燒尾部后裝于移液器上，再次放于酒精燈上灼燒整個(gè)定量移液管管身2-3次，懸空進(jìn)入培養(yǎng)基皿內(nèi)吸取5-10ml培養(yǎng)基懸空移入每個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)，將培養(yǎng)皿蓋在酒精燈上消毒2-3次蓋上，在皿蓋上做好實(shí)驗(yàn)標(biāo)記。

9.將培養(yǎng)基瓶口和瓶蓋消毒2-3次后擰緊，熄滅酒精燈，整理實(shí)驗(yàn)臺(tái)面，取出實(shí)驗(yàn)試劑及污缸等，關(guān)閉超凈工作臺(tái)。

10.將培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。注意整個(gè)培養(yǎng)箱底托盤內(nèi)一定要放高壓后的水，且定期更換確保無(wú)菌。

每天定時(shí)觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，一般72-96h后，細(xì)胞生長(zhǎng)密度大于90%，即可進(jìn)行細(xì)胞的傳代或保株。

五、細(xì)胞株的保存

原理：細(xì)胞凍存最常用的技術(shù)是液氮冷凍保存法，主要采用加適量保護(hù)劑的緩慢冷凍法凍存細(xì)胞。細(xì)胞在不加任何保護(hù)劑的情況下直接冷凍，細(xì)胞內(nèi)外的水分會(huì)很快形成冰晶，從而引起一系列不良反應(yīng)。如細(xì)胞脫水使局部電解質(zhì)濃度增高，pH值改變，部分蛋白質(zhì)由于上述原因而變性，引起細(xì)胞內(nèi)部空間結(jié)構(gòu)紊亂，溶酶體膜由此遭到損傷而釋放出溶酶體酶，使細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)成分造成破壞，線粒體腫脹，功能丟失，并造成能量代謝障礙。胞膜上的類脂蛋白復(fù)合體也易破壞引起細(xì)胞膜通透性的改變，使細(xì)胞內(nèi)容物丟失。如果細(xì)胞內(nèi)冰晶形成較多，隨冷凍溫度的降低，冰晶體積膨脹造成細(xì)胞核DNA空間構(gòu)型發(fā)生不可逆的損傷，而致細(xì)胞死亡。因此，細(xì)胞冷凍技術(shù)的關(guān)鍵是盡可能地減少細(xì)胞內(nèi)水分，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成。采用甘油或二甲基亞砜作保護(hù)劑，這兩種物質(zhì)分子量小，溶解度大，易穿透細(xì)胞，可以使冰點(diǎn)下降，提高細(xì)胞膜對(duì)水的通透性，且對(duì)細(xì)胞無(wú)明顯毒性。慢速冷凍方法又可使細(xì)胞內(nèi)的水分滲出細(xì)胞外，減少胞內(nèi)形成冰結(jié)晶的機(jī)會(huì)，從而減少冰晶對(duì)細(xì)胞的損傷。

實(shí)驗(yàn)步驟：

選擇處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，在凍存前一天最好換液。將多個(gè)培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞培養(yǎng)液去掉，用0.25% 胰蛋白酶消化。適時(shí)去掉胰蛋白酶，加入少量新培養(yǎng)液。用吸管吸取培養(yǎng)液反復(fù)吹打瓶壁上的細(xì)胞，使其成為均勻分散的細(xì)胞懸液。懸浮生產(chǎn)細(xì)胞則不要消化處理。然后將細(xì)胞收集于離心管中離心(1000r/min，10分鐘)。加入凍存管中，再加入1ml配置好的凍存液后放入梯度降溫盒，放入-80℃冰箱中。

1.紫外消毒30min后關(guān)閉紫外燈，開啟超凈臺(tái)正常工作狀態(tài)，用酒精消毒操作者的雙手。

2.培養(yǎng)液，胰酶，二甲基亞砜DMSO，胎牛血清（解凍），梯度降溫盒恢復(fù)常溫，恒溫水浴箱37℃預(yù)熱20min，備用。

3.將所需的培養(yǎng)基，胰酶確保瓶身干凈消毒后放于工作臺(tái)面內(nèi)，點(diǎn)燃酒精燈，再將瓶口對(duì)準(zhǔn)在酒精燈上消毒2-3次，旋開瓶蓋后再次分別消毒瓶口和瓶蓋，分別放于酒精燈的兩側(cè)。

4.將培養(yǎng)瓶瓶口在酒精燈上消毒2-3次，旋開后分別再次消毒瓶口和瓶蓋2-3次，蓋放于酒精燈右側(cè)后將培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)液懸空倒進(jìn)污缸，在酒精燈消毒2-3次瓶口，豎直放好。取1ml移液器快速移動(dòng)在酒精燈上消毒1-2次，然后再裝上槍頭吸取1.5ml胰酶液，懸空移入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。

5.將培養(yǎng)皿蓋內(nèi)口朝上放在架子上，將培養(yǎng)皿內(nèi)的培養(yǎng)液懸空倒進(jìn)污缸。取1ml移液器快速移動(dòng)在酒精燈上消毒1-2次，然后再裝上槍頭吸取1-2ml胰酶液，懸空沿皿壁加入培養(yǎng)皿內(nèi)。6.將培養(yǎng)皿來(lái)回傾倒使胰酶浸沒(méi)整個(gè)皿底的細(xì)胞層，計(jì)時(shí)越1-3min（消化時(shí)間根據(jù)細(xì)胞不同時(shí)間不同），對(duì)著燈光可觀察到細(xì)胞與細(xì)胞之間有針孔樣縫隙，并有1-2個(gè)細(xì)胞脫落，鏡下觀察到細(xì)胞都變圓時(shí)為胰酶消化的最適時(shí)機(jī)。（若看到成片的細(xì)胞從瓶壁脫落為胰酶消化過(guò)度；若看不到針孔樣縫隙和細(xì)胞脫落，或鏡下細(xì)胞多有菱角則需繼續(xù)消化）。用移液器將胰酶吸凈。

6.吸取1ml培養(yǎng)基于培養(yǎng)皿，并用移液器吸取少量的培養(yǎng)基輕柔的反復(fù)沖洗培養(yǎng)瓶壁5-8次，使貼壁細(xì)胞完全脫落于培養(yǎng)基內(nèi)再輕輕吹打2-3次，使細(xì)胞盡可能處于單個(gè)懸浮狀態(tài)。

7.將懸浮細(xì)胞吸入15ml離心管內(nèi)，加入4ml培養(yǎng)基離心1000r/min，5min 8.預(yù)先配制凍存液：10 % DMSO + 90%胎牛血清。按需要配置一定數(shù)量備用 9.棄去培養(yǎng)基，用凍存液進(jìn)行重懸混勻后，將1ml含有細(xì)胞的凍存液移入凍存管內(nèi)，擰緊瓶蓋，做好實(shí)驗(yàn)標(biāo)記。

10.將培養(yǎng)基，胰酶瓶口和瓶蓋消毒2-3次后擰緊，熄滅酒精燈，整理實(shí)驗(yàn)臺(tái)面，取出實(shí)驗(yàn)試劑及污缸等，關(guān)閉超凈工作臺(tái)。

8.將凍存管先放于4℃冰箱 30min后拿出放置-20℃冰箱過(guò)夜，次日再放于-80℃的冰箱內(nèi)3-4天，最后存放于-196℃的液氮灌內(nèi)長(zhǎng)期保存?；蛑苯臃湃胩荻冉禍睾袃?nèi)，放入-80℃冰箱內(nèi)過(guò)夜后最后存放于液氮罐內(nèi)。（梯度降溫盒內(nèi)為甲醇，使用5次需要更換，每次使用需做好標(biāo)記，使用前需恢復(fù)常溫）

六、細(xì)胞轉(zhuǎn)染

RNA干擾（RNA interference, RNAi）: ? 是指在進(jìn)化過(guò)程中高度保守的、由雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象?；虺聊?，主要有轉(zhuǎn)錄前水平的基因沉默(TGS)和轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默(PTGS)兩類:TGS是指由于DNA修飾或染色體異染色質(zhì)化等原因使基因不能正常錄;

? PTGS是啟動(dòng)了細(xì)胞質(zhì)內(nèi)靶mRNA序列特異性的降解機(jī)制。有時(shí)轉(zhuǎn)基因會(huì)同時(shí)導(dǎo)致TGS和PTGS。

? 由于使用RNAi技術(shù)可以特異性剔除或關(guān)閉特定基因的表達(dá)，（長(zhǎng)度超過(guò)三十的dsRNA會(huì)引起干擾素毒性）所以該技術(shù)已被廣泛用于探索基因功能和傳染性疾病及惡性腫瘤的治療領(lǐng)域。

? 病毒基因、人工轉(zhuǎn)入基因、轉(zhuǎn)座子等外源性基因隨機(jī)整合到宿主細(xì)胞基因組內(nèi)，并利用宿主細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄時(shí)，常產(chǎn)生一些dsRNA。宿主細(xì)胞對(duì)這些dsRNA迅即產(chǎn)生反應(yīng)。

作用機(jī)制

1)其胞質(zhì)中的核酸內(nèi)切酶Dicer將dsRNA切割成多個(gè)具有特定長(zhǎng)度和結(jié)構(gòu)的小片段RNA（大約21～23 bp），即siRNA。

2)siRNA在細(xì)胞內(nèi)RNA解旋酶的作用下解鏈成正義鏈和反義鏈，繼之由反義siRNA再與體內(nèi)一些酶（包括內(nèi)切酶、外切酶、解旋酶等）結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物（RNA-induced silencing complex，RISC)。

3)RISC與外源性基因表達(dá)的mRNA的同源區(qū)進(jìn)行特異性結(jié)合，RISC具有核酸酶的功能，在結(jié)合部位切割mRNA，切割位點(diǎn)即是與siRNA中反義鏈互補(bǔ)結(jié)合的兩端。被切割后的斷裂mRNA隨即降解，從而誘發(fā)宿主細(xì)胞針對(duì)這些mRNA的降解反應(yīng)。

4)siRNA不僅能引導(dǎo)RISC切割同源單鏈mRNA，而且可作為引物與靶RNA結(jié)合并在RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRP）作用下合成更多新的dsRNA，新合成的dsRNA再由Dicer切割產(chǎn)生大量的次級(jí)siRNA，從而使RNAi的作用進(jìn)一步放大，最終將靶mRNA完全降解。

5)RNAi發(fā)生于除原核生物以外的所有真核生物細(xì)胞內(nèi)。需要說(shuō)明的是，由于dsRNA抑制基因表達(dá)具有潛在高效性，任何導(dǎo)致正常機(jī)體dsRNA形成的情況都會(huì)引起不需要的相應(yīng)基因沉寂。所以正常機(jī)體內(nèi)各種基因有效表達(dá)有一套嚴(yán)密防止dsRNA形成的機(jī)制。

脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染原理：

1.脂質(zhì)體是磷脂分散在水中時(shí)形成的脂質(zhì)雙分子層，又稱為人工生物膜。最初，人們只是運(yùn)用脂質(zhì)體模擬生物膜，研究膜的構(gòu)造及功能，從而發(fā)現(xiàn)了膜的融合及內(nèi)吞作用，因而可用作外源物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞的載體 2.陽(yáng)離子脂質(zhì)體表面帶正電荷，能與核酸的磷酸根通過(guò)靜電作用將DNA分子包裹人內(nèi)，形成DNA一脂復(fù)合體，也能被表面帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜吸附，再通過(guò)膜的融合或細(xì)胞的內(nèi)吞作用，偶爾也通過(guò)直接滲透作用，將DNA傳遞進(jìn)入細(xì)胞，形成包涵體或進(jìn)入溶酶體其中一小部分DNA能從包涵體內(nèi)釋放，并進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中，再進(jìn)一步進(jìn)入核內(nèi)轉(zhuǎn)錄、表達(dá)

DNA轉(zhuǎn)染步驟

1.轉(zhuǎn)染前一天接種細(xì)胞于6孔板，0.5-2×105每孔，2ml無(wú)抗生素培養(yǎng)基每孔，第二天轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞達(dá)到90-95%每孔。

2.轉(zhuǎn)染前半小時(shí)換Opti-MEM無(wú)血清培養(yǎng)基1.5ml。

3.A液：DNA 5ug 加入245ul Opti-MEM無(wú)血清培養(yǎng)基，輕輕混勻。

4.B液：脂質(zhì)體使用前輕輕混勻，脂質(zhì)體10ul 加入245ul Opti-MEM無(wú)血清培養(yǎng)基，輕輕混勻，室溫靜止5min。

5.B液加入A液，用槍輕輕混勻，室溫靜止20min。

6.將混合液均勻分散慢慢滴加到6孔板細(xì)胞中，邊滴加變前后左右十字交叉搖晃。

7.孵箱37℃培養(yǎng)48h（轉(zhuǎn)染時(shí)間待定）。8.第二天看細(xì)胞狀態(tài)來(lái)決定是否換液。9.同時(shí)設(shè)立細(xì)胞對(duì)照組，空白轉(zhuǎn)染組。

siRNA轉(zhuǎn)染步驟

1)轉(zhuǎn)染前一天接種細(xì)胞于6孔板（40x104），2ml無(wú)抗生素培養(yǎng)基每孔，第二天轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞達(dá)到50-60%每孔。

2)轉(zhuǎn)染前半小時(shí)換Opti-MEM無(wú)血清培養(yǎng)基1.5ml。

3)A液：siRNA 5ul（共100pmol）加入245ul Opti-MEM無(wú)血清培養(yǎng)基，輕輕混勻。（siRNA按照說(shuō)明書稀釋）4)B液：脂質(zhì)體（RNAimax）使用前輕輕混勻，脂質(zhì)體10ul 加入245ul Opti-MEM無(wú)血清培養(yǎng)基，輕輕混勻，室溫靜止5min。

5)B液加入A液，用槍輕輕混勻，室溫靜止20min。

6)將混合液均勻分散慢慢滴加到6孔板細(xì)胞中，邊滴加變前后左右十字交叉搖晃。

7)孵箱37℃培養(yǎng)48h（轉(zhuǎn)染時(shí)間待定）。8)第二天看細(xì)胞狀態(tài)來(lái)決定是否換液。9)同時(shí)設(shè)立細(xì)胞對(duì)照組，空白轉(zhuǎn)染組。

使用RNAiMAX和AGS cell用于siRNA在6孔板上進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)

1)提前配制GAPDH，NC，NV-FAM及各片段siRNA的20uM的稀釋液，取附贈(zèng)的DEPC水至管內(nèi)，打開離心管前先離心，將附在管壁上的凍干粉離心下來(lái) 2)溶解時(shí)滴加適量的DEPC水后蓋上管蓋，震蕩溶解：NC，NC-FAM溶解加入62.5ulDEPC水，其他siRNA片段加入125ul DEPC水

3)取6只EP管，分別標(biāo)記GAPDH，NC，NV-FAM，三個(gè)片段名稱，從管內(nèi)吸取20ul的稀釋液分裝后

4)將稀釋液至于-80度冰箱保存。

? 轉(zhuǎn)染前一天，在6孔板上接種40x104AGS cell，再取一個(gè)35mm培養(yǎng)皿接種40x104AGS cell，每孔放2ml不含抗生素的生長(zhǎng)培養(yǎng)基。使細(xì)胞在轉(zhuǎn)染的時(shí)候有50-60%的融合率

? 從細(xì)胞中除去生長(zhǎng)培養(yǎng)基

? 每個(gè)孔中加入1.5ml新鮮不含血清的培養(yǎng)基，并準(zhǔn)備如下混合物 1)A液：(取7個(gè)EP管，分別標(biāo)記空白，GAPDH，NC,NC-FAM,三個(gè)片段)。在250ul的opti-mem終加入100pmol siRNA（稀釋好的siRNA濃度為20uM，100pmol的siRNA需要取5ul），混合均勻

2)B液：（取一個(gè)EP管標(biāo)記RNAiMAX），RNAiMAX 使用前搖勻，在250ul X7.2=1800ul的opti-mem加入6ul X7.2=43.2ul的RNAiMAX，稀釋RNAiMAX混勻后并在室溫下溫育5min 3)混合A液和B液，混勻B液后吸取256ul至A液中室溫下溫育20min ? 將混合物混勻后加入到含AGS的6孔板與35mm培養(yǎng)皿中，每孔終體積為2ml，則加入混合液500ul，并輕搖混勻 ? 在37℃的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5-6小時(shí) ? 更換含血清的培養(yǎng)基并培養(yǎng)細(xì)胞24-48小時(shí) 24-48小時(shí)后收細(xì)胞跑WB，看沉默效果

第四篇：Excel導(dǎo)出多種方法總結(jié)

Excel導(dǎo)出

方法一：XML拼接導(dǎo)出

通過(guò)stringbuild，將要導(dǎo)出的數(shù)據(jù)拼接為XML，然后導(dǎo)出。

步驟：

1． 獲取數(shù)據(jù)源

2． 拼xml文件頭，給定輸出文件格式和編碼格式

3． 通過(guò)table拼接數(shù)據(jù)源到xml中

4． 獲取導(dǎo)出路徑

5． 通過(guò)IO流將xml寫入，并輸出到指定位置

該方法最為簡(jiǎn)單，但是導(dǎo)出后無(wú)法把握內(nèi)容輸出格式（一般為常規(guī)格式—HTML）。方法二：Excel對(duì)象方法

通過(guò)Vs自帶的microsoft.Office類創(chuàng)建Excel

步驟：

1． 初始化Excel對(duì)象，實(shí)例化Excel

2． 定義Application對(duì)象，Workbook對(duì)象，Worksheet 對(duì)象，Range對(duì)象

3． 初始化Application對(duì)象

4． 創(chuàng)建sheet表，給定表內(nèi)容格式，5． 綁定數(shù)據(jù)源，將數(shù)據(jù)遍歷到Excel單元格

6． 給定導(dǎo)出路徑導(dǎo)出

7． 異常判斷，清空對(duì)象，殺掉進(jìn)程

該方法最為復(fù)雜，但是可以直接操作Excel對(duì)象，功能豐富，最大卻點(diǎn)是創(chuàng)建完成后要處理進(jìn)程，最大難點(diǎn)是存在Com權(quán)限，這對(duì)于沒(méi)有管理員權(quán)限的用戶難以使用，設(shè)置麻煩

方法三：Dataset直接導(dǎo)出

通過(guò)Dataset獲取數(shù)據(jù)源，然后拼接到stringbuild可以直接輸出

步驟：

1．2．

3．4． 獲取數(shù)據(jù)源 給定輸出類型，編碼類型 遍歷數(shù)據(jù) 向HTTP輸出流中寫入取得的數(shù)據(jù)信息并輸出

該方法思路編碼都簡(jiǎn)單，但是在遍歷數(shù)據(jù)時(shí)不易處理單元格之間格式而導(dǎo)致，所有數(shù)據(jù)成一個(gè)string輸出，并且效率低

方法四：GridView/DataGrid綁定導(dǎo)出

通過(guò)GridView或者DataGrid的數(shù)據(jù)源直接導(dǎo)入到IO中輸出

步驟：

1． 初始化GridView、DataGrid

2． 給定GridView、DataGrid樣式

3． 綁定GridView、DataGrid數(shù)據(jù)源

4． 給定輸出文件類型和編碼類型，文本格式

5． 向HTTP輸出流中寫入取得的數(shù)據(jù)信息并輸出

該方法效率高，樣式豐富，可以設(shè)置為文本，較為完美！

第五篇：動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)總結(jié)! !!!

動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)總結(jié) 一．實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

1.實(shí)驗(yàn)器械、器皿的清洗和消毒（1）清洗和包裝

離心管(1.5ml，2ml,15ml)若干，凍存管若干放進(jìn)鋁飯盒，用牛皮紙包裹，系緊棉繩，用筆在飯盒上和牛皮紙上標(biāo)記盒內(nèi)所裝物品名稱、數(shù)量、日期和所屬人名稱。

藍(lán)槍頭兩盒，黃槍頭白槍頭各一盒用牛皮紙包裹，用棉繩扎緊。取適量蒸餾水于4L玻璃瓶，瓶蓋擰松半圈。

過(guò)濾器，250ml玻璃瓶，500ml玻璃瓶用自來(lái)水毛刷洗滌劑刷洗，蒸餾水潤(rùn)洗，烘干。

過(guò)濾器兩部分分別包裹，先將瓶口部位用錫紙包裹后，再罩以牛皮紙，再用棉布密包起來(lái)，用棉繩扎緊。

玻璃瓶擰下瓶蓋，瓶身浸酸。浸酸時(shí)應(yīng)注意安全，須穿戴耐酸手套和白大褂，注意保護(hù)好面部和身體裸露部分，提前備好一盆水在旁以便浸酸結(jié)束后清洗耐酸手套，防止走動(dòng)時(shí)酸液滴到地板上不好清洗。瓶口慢慢沉入液面下，注意緩慢降低瓶身，使液體慢慢浸入瓶?jī)?nèi)，以免產(chǎn)生氣泡濺出酸液，發(fā)生危險(xiǎn)。浸酸時(shí)器皿要充滿酸液，勿留氣泡，浸泡過(guò)夜。取出瓶身時(shí)，須穿戴耐酸手套和白大褂，注意保護(hù)好面部和身體裸露部分，提前備好一盆水在旁，取出后將瓶身放入盆內(nèi)水中在轉(zhuǎn)移至水池邊清洗，以免酸液滴落地板不好清洗。換水洗幾次，待水澄清后開始沖洗，每瓶都用自來(lái)水灌滿，倒掉，重復(fù)15次，再用蒸餾水漂洗5次，去離子水漂洗3次，烘干備用。（2）消毒滅菌

1>全自動(dòng)高壓滅菌鍋：插電源，打開開關(guān)，檢查水位，若水位不足加蒸餾水補(bǔ)足，放入物品，瓶類物體須擰松蓋子后放最上面一筐，蓋上滅菌鍋蓋，擰緊蓋子至溫度顯示欄的左上角有一紅點(diǎn)亮燈，按start開始升溫。若滅有無(wú)菌水或玻璃瓶待降溫至常溫再打開，打開后立即擰緊，無(wú)菌水瓶口封上封口膜。若沒(méi)滅瓶類物品，降溫至80度左右即可打開滅菌鍋，須戴上線手套取出。

2>手提式高壓滅菌鍋：插電源，打開開關(guān)，檢查水位，若水位不足加蒸餾水補(bǔ)足，檢查設(shè)定是否為121度20分鐘，放入物品，蓋上滅菌鍋蓋，注意導(dǎo)氣管一定插到鍋底并不能堵塞，用手對(duì)稱地?cái)Q緊鍋蓋螺栓，再用扳手繼續(xù)擰緊。加溫升壓之前，先打開排氣閥門，加溫約半小時(shí)后見排氣閥處開始排殘留在鍋內(nèi)的冷空氣，排氣五分鐘，關(guān)閉排氣閥，繼而開始升壓。滅菌后不要立即打開氣閥放氣以免水汽噴出。待自然降溫至常壓才能打開氣閥。

玻璃瓶須擰緊，飯盒，槍頭滅菌后放入烘箱烘干備用。2.無(wú)菌間消毒及設(shè)備檢查

用84消毒液拖地，用原液按照1：29的比例兌水，抹布、拖把擦洗。配400ml 75%酒精于盆中，用酒精棉仔細(xì)擦拭CO2培養(yǎng)箱，超凈臺(tái)，超凈臺(tái)內(nèi)物品，顯微鏡，桌面，若培養(yǎng)箱內(nèi)未培養(yǎng)細(xì)胞可以再打開高溫滅菌模式將培養(yǎng)箱滅菌一次。

用蒸餾水擦拭清洗水浴鍋內(nèi)壁，注意底座不要沾水。檢查CO2總壓力表，若讀數(shù)不足四分之一提前預(yù)定CO2瓶，換瓶時(shí)需要扳手。CO2培養(yǎng)箱最下層的增濕盤須定期觀察加水，將增濕盤內(nèi)注入1/2無(wú)菌蒸餾水，并將盤直接放置在培養(yǎng)箱中央。啟動(dòng)培養(yǎng)箱，培養(yǎng)箱接通電源，增濕盤加水，連接好氣體供給，檢查有無(wú)漏氣，輸入系統(tǒng)設(shè)置。設(shè)置溫度和二氧化碳。

紫外照射無(wú)菌間30分鐘，注意屋內(nèi)不要有人以及培養(yǎng)基等試劑。3.細(xì)胞培養(yǎng)用液的配置及分裝

RPM1640培養(yǎng)基配制：將干粉型RPM1640培養(yǎng)基溶于總量1/3的去離子水中，再用1/3水沖洗包裝內(nèi)2次，倒入培養(yǎng)基中，以保證所有干粉都溶解成培養(yǎng)液，根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明的要求和實(shí)驗(yàn)補(bǔ)加谷氨酰胺和NaHCO3 ,傾斜三角瓶輕輕放入轉(zhuǎn)子，用磁力攪拌器攪拌2h。用泵使培養(yǎng)基在超凈臺(tái)內(nèi)通過(guò)滅菌的過(guò)濾器，過(guò)濾除菌，分裝后置4度冰箱保存?zhèn)溆谩Ｊ褂们罢{(diào)pH至7.0，加雙抗于培養(yǎng)液中濃度為1%，使用時(shí)加胎牛血清10%FBS.胎牛血清FBS的處理：使用前應(yīng)做熱滅活處理，即通過(guò)加熱的方法破壞補(bǔ)體，將胎牛血清放入56度水浴中30分鐘，其間要不時(shí)輕輕晃動(dòng)，使受熱均勻，防止沉淀析出。分裝前提前2天放4度冰箱解凍，溶解完全后于超凈臺(tái)內(nèi)分裝為25ml每管，留2管放四度備用，余下放-20度凍存。配制含血清培養(yǎng)基或凍存液前務(wù)必提前一天取出分裝后的血清四度溶解備用，血清融化很慢。

5%NaHCO3溶液配制：5g NaHCO3，100ml蒸餾水，NaHCO3溶于水后，過(guò)濾除菌。0.25%胰蛋白酶液200ml在超凈臺(tái)內(nèi)分裝成每管1ml或2ml，封口膜封口，-20度備用。

雙抗溶液配制：80萬(wàn)單位青霉素加4ml滅菌D-Hanks液，即成20萬(wàn)單位/ml溶液。100萬(wàn)單位鏈霉素加5ml滅菌的D-Hanks液，即成20萬(wàn)單位/ml溶液。兩溶液各取0.5ml混合，加入9mlD-Hanks液，則成含青鏈霉素各1萬(wàn)單位/ml，分裝后置于4度冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

二．操作步驟 注意事項(xiàng)：

1、所有實(shí)驗(yàn)用的器械，儀器滅菌，消毒，烘干。

2、打開溶劑，培養(yǎng)瓶瓶蓋時(shí)，瓶口及瓶蓋在酒精燈上烤一下。

3、用完溶劑，培養(yǎng)瓶時(shí)，瓶口及瓶蓋也要在酒精燈上烤一下。

4、所有物品放入超凈臺(tái)需用酒精棉擦拭，包括手伸出窗口拿取物品再回到窗內(nèi)時(shí)需要重新用酒精棉擦拭。開始工作：

1、實(shí)驗(yàn)前換紫外照過(guò)的白大褂和拖鞋。

2、戴橡膠手套，75%乙醇擦手，然后用75%乙醇擦一下臺(tái)面，點(diǎn)燃酒精燈。

3、取待用的細(xì)胞，旋緊瓶蓋。

4、胰酶消化緩慢時(shí)可以將細(xì)胞置于5%CO2、37度培養(yǎng)箱中1min-2min，目的是提高酶活性，促進(jìn)消化。1.細(xì)胞復(fù)蘇

提前預(yù)冷離心機(jī)，設(shè)參數(shù)為4度，1000r/min,5min。

將槍頭，裝有離心管的飯盒，垃圾盒放入超凈臺(tái)，酒精棉擦一遍超凈臺(tái)臺(tái)面和移液器尤其槍口，以防別人用槍時(shí)不慎沾染臟污堵塞槍口。超凈臺(tái)和房間照15分鐘紫外，照紫外的同時(shí)取出無(wú)血清培養(yǎng)基和含血清培養(yǎng)基37度水浴加熱。

關(guān)閉紫外，打開風(fēng)機(jī)，升高窗高，點(diǎn)燃酒精燈，用鑷子從飯盒中取2個(gè)15ml離心管放至試管架，每管加入3ml無(wú)血清培養(yǎng)基，提前剪好2條封離心管的封口膜備用。

戴上橡膠手套再套上線手套，用鑷子從液氮中取出塑料凍存管，用手拿凍存管迅速浸入37度水浴中，劇烈急速搖晃凍存管，因?yàn)橛蟹浪z布纏裹不用擔(dān)心進(jìn)水染菌，使其急速融化，注意管內(nèi)凍存細(xì)胞的融化情況。基本轉(zhuǎn)為液態(tài)時(shí)將凍存管取出，摘下線手套，凍存管轉(zhuǎn)移至超凈臺(tái)內(nèi)，用酒精擦手，擦拭凍存管尤其管口，撕下膠布和封口膜，再擦拭管口，整個(gè)溶解過(guò)程盡量在30s至1min內(nèi)完成。(注意：這一步對(duì)細(xì)胞存活率至關(guān)重要。既要盡快融化以減少融化過(guò)程對(duì)細(xì)胞的損害，又要盡可能減少細(xì)胞在較高溫度停留的時(shí)間以減少DMSO對(duì)細(xì)胞的毒害，切不可將凍存管放在燒杯內(nèi)不管。)打開凍存管管蓋，逐滴加入1ml無(wú)血清培養(yǎng)基，輕柔地將凍存管內(nèi)的細(xì)胞懸液吸取出來(lái)，轉(zhuǎn)移至已備好的離心管內(nèi)，輕輕搖混勻，蓋上管蓋，輕輕地上下顛倒混勻。封上封口膜。

低俗離心1000r/min,5min。小心地吸出上清液，要求上清液盡可能吸走，同時(shí)又不觸及管底沉淀的細(xì)胞。（較高要求時(shí)可以用手指輕彈離心管管底，將細(xì)胞團(tuán)分散，加入10ml無(wú)血清培養(yǎng)基混勻離心10min棄上清再洗一次，有助于減少DMSO殘留。）加3至5ml培養(yǎng)液至沉淀的細(xì)胞，輕輕搖晃使分散成細(xì)胞懸液，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，擰緊蓋子，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)箱中再反旋擰松半圈，以利于瓶口內(nèi)外進(jìn)行氣體交換，注意取出培養(yǎng)瓶時(shí)須先擰緊瓶口。37度恒溫箱中培養(yǎng)。第二天觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。培養(yǎng)基瓶蓋過(guò)火，擰緊后封上封口膜。收好物品，擦一遍臺(tái)子，滅酒精燈。2傳代培養(yǎng)

附著型胞(adherentcell)傳代培養(yǎng)

離心法提前預(yù)冷離心機(jī)，設(shè)置好參數(shù)4度，1000r/min,5min。倒液法不需要。

將滅菌槍頭，裝有離心管的飯盒，新培養(yǎng)皿/瓶,垃圾盒放入超凈臺(tái)，酒精棉擦一遍超凈臺(tái)臺(tái)面和移液器尤其槍口，以防別人用槍時(shí)不慎沾染臟污堵塞槍口。超凈臺(tái)和房間照15分鐘紫外，照紫外的同時(shí)從冰箱取出PBS,胰酶，含血清培養(yǎng)基于37度水浴加熱。關(guān)閉紫外，打開風(fēng)機(jī)和照明，升高窗高，點(diǎn)燃酒精燈，將所需試劑先擦瓶底，放在臺(tái)子上再擦側(cè)壁一圈，擦瓶口瓶蓋，撕下封口膜，再仔細(xì)擦一遍瓶口。用噴過(guò)酒精的塑料筐將細(xì)胞培養(yǎng)瓶擰緊蓋子拿到超凈臺(tái)旁的椅子上放平放穩(wěn)，每三瓶/皿一摞拿入超凈臺(tái)先擦最下面一個(gè)的底部，擦好后放在臺(tái)面上，擦一摞的側(cè)面一圈，在分別擦底面頂面瓶口，直到所有培養(yǎng)瓶各個(gè)面及瓶口擦好，注意不要擦到有marker標(biāo)記字跡的部位，酒精會(huì)擦掉字跡，若擦到字跡待酒精干后立即補(bǔ)寫上以防事后記不清。

輕輕倒掉舊培養(yǎng)液，注意不要使液體倒流回來(lái)沖擊細(xì)胞，掛在外壁的殘留液滴用酒精棉擦掉,培養(yǎng)瓶可以輕輕翻轉(zhuǎn)瓶子使細(xì)胞生長(zhǎng)的面在上，頂面在下，液體留至頂面后直接倒掉液體。加1ml PBS，注意槍沖著不長(zhǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)皿側(cè)壁或翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶朝瓶的頂壁或側(cè)壁打入PBS，盡量不碰到瓶口或培養(yǎng)皿，若懷疑碰壁，棄掉槍頭。輕輕搖晃培養(yǎng)皿或瓶，使PBS沾到所有細(xì)胞，洗滌細(xì)胞一遍，輕輕倒掉PBS。

加入0.25%胰蛋白酶液(1ml/25cm2,2ml/75cm2)，若是高倍胰酶先稀釋（0.25%為1X胰酶），37℃作用數(shù)分鐘。等待消化期間準(zhǔn)備好新的培養(yǎng)皿/瓶，每25cm2小皿/瓶加入2ml含血清培養(yǎng)基。消化中的皿蓋好蓋子或瓶擰緊蓋子，于倒立顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞將要分離而呈現(xiàn)圓粒狀，有10%細(xì)胞漂動(dòng)時(shí)，倒掉胰酶溶液，加入1ml(25cm2小皿/瓶)含血清之新鮮培養(yǎng)基終止胰酶作用。(若細(xì)胞將要分離而呈現(xiàn)圓粒狀且80%細(xì)胞漂動(dòng)，則不移去胰酶，在胰酶作用后，加入適量含血清之新鮮培養(yǎng)基終止胰酶作用，吹打成細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管，封上封口膜，離心后再吸掉上清液。）

輕輕搖晃培養(yǎng)瓶使細(xì)胞自瓶壁脫落，以吸管上下輕輕吸放數(shù)次以打散細(xì)胞團(tuán)塊，注意吹打時(shí)有系統(tǒng)性的將所有面積都打到不要集中只吹打一處而一些地方?jīng)]吹打到，吸和吹時(shí)槍頭都不要離開液面以減少氣泡，氣泡多破裂時(shí)對(duì)細(xì)胞有沖擊且會(huì)增加體積不利于操作，培養(yǎng)瓶吹打時(shí)操作角度小不方便，用倒液法（10%細(xì)胞漂動(dòng)即倒掉胰酶加含血清培養(yǎng)基終止消化）時(shí)吹打細(xì)胞要用二檔多吹打幾次，用皿或離心法（80%細(xì)胞飄動(dòng)不棄胰酶直接加含血清培養(yǎng)基再離心棄上清）時(shí)細(xì)胞很容易脫落，可以用一檔輕輕吹打，保證所有面積都吹打到即可?；旌途鶆蚝螅老♂尡壤D(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶中，擰緊瓶蓋，鏡下觀察細(xì)胞數(shù)量多，培養(yǎng)液澄清，若細(xì)胞密度過(guò)低將影響生長(zhǎng)可適當(dāng)補(bǔ)充細(xì)胞懸液，若細(xì)胞密度過(guò)大將影響迅速生長(zhǎng)一天后即需傳代，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)適當(dāng)添加培養(yǎng)基或細(xì)胞懸液使生長(zhǎng)速度符合預(yù)期，轉(zhuǎn)移至CO2培養(yǎng)箱，擰松半圈瓶蓋，37度培養(yǎng)。試劑瓶瓶蓋過(guò)火，擰緊后封上封口膜。密封收好物品。擦一遍臺(tái)子，滅酒精燈。

3細(xì)胞換液

取待用的細(xì)胞，旋緊瓶蓋。

棄去舊的培養(yǎng)液，把培養(yǎng)瓶放回原處。

用微量槍加入適量的PBS緩沖液，緩慢蕩洗一下細(xì)胞，然后將PBS緩沖液棄掉。

用微量槍加入適量的細(xì)胞培養(yǎng)液于培養(yǎng)瓶中。旋緊瓶蓋。將細(xì)胞置于5%CO2、37度培養(yǎng)箱，反旋擰松瓶蓋半圈，培養(yǎng)。

4細(xì)胞凍存 1>準(zhǔn)備工作：

提前一天將血清FBS從-20度取出放在4度冰箱解凍。選取對(duì)生增生期細(xì)胞（鏡下密密麻麻，胞體突觸明顯），在收集細(xì)胞24h前換液一次。

進(jìn)入細(xì)胞室前，首先用75%酒精擦試工作臺(tái)，接著紫外滅菌30，過(guò)后，關(guān)閉紫外燈，通風(fēng)10min。從冰箱中取出胰酶、PBS緩沖液、培養(yǎng)基，血清37度水浴。取出室溫放置的DMSO。找到防水的醫(yī)用膠布，濾菌膜，針管和所需槍頭飯盒等物品，噴一遍酒精，放入臺(tái)子照紫外。2>開始工作：

實(shí)驗(yàn)前在更衣間換上紫外照過(guò)的白大褂和拖鞋。戴上橡膠手套，75%乙醇擦手，然后用75%乙醇擦一下臺(tái)面，點(diǎn)燃酒精燈。酒精擦拭胰酶、PBS緩沖液、培養(yǎng)基放入超凈臺(tái)。過(guò)火鑷子取出離心管于試管架，剪好封口膜備用。用濾菌膜和針管過(guò)濾DMSO以除菌。

75%無(wú)血清培養(yǎng)基，20%的血清，5%過(guò)濾除菌的DMSO，混勻配制成所需的凍存液。

取待用的細(xì)胞，旋緊瓶蓋。

棄去舊的培養(yǎng)液，掛壁殘液注意用酒精棉擦去，用微量槍朝不長(zhǎng)細(xì)胞的側(cè)壁或頂部打槍，加入適量的PBS緩沖液，緩慢蕩洗一下細(xì)胞，然后將PBS緩沖液棄掉。用微量槍朝不長(zhǎng)細(xì)胞的側(cè)壁或頂部打槍，加入適量胰酶約2ml，棄掉槍頭。消化數(shù)分鐘，等待期間，用過(guò)火鑷子從飯盒中取出凍存管和管蓋標(biāo)記好細(xì)胞名稱和凍存日期，直立于臺(tái)面?zhèn)溆谩?/p>

用微量槍加入適量的完全培養(yǎng)液沖洗（吹散細(xì)胞）細(xì)胞，將瓶底粘著的細(xì)胞吹散下來(lái)，再將細(xì)胞懸液移入的離心管中，封口，標(biāo)簽。離心5min，1000轉(zhuǎn)/min。

細(xì)胞離心畢，拆封，瓶口及瓶蓋在酒精燈上烤一下，棄去上清液。用微量槍將凍存液平均加入離心管中，混勻離心管中細(xì)胞凍存液。用微量槍將含細(xì)胞的凍存液移入凍存管中，封口膜封口，防水醫(yī)用膠布再纏一圈，標(biāo)簽時(shí)間，細(xì)胞名稱。

凍存，需緩慢凍存，先放置4度冰箱20min，然后放置-20度冰箱30min，再置于-80度冰箱過(guò)夜，最后置于液氮灌-196度中保存。5 鋪板和細(xì)胞計(jì)數(shù)

用傳代方法制成細(xì)胞懸液。倒掉培養(yǎng)基，用PBS液洗滌后，0.25%的胰蛋白酶液消化，加入培養(yǎng)液吹打制成待測(cè)細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)至離心管，封上封口膜，離心1000r/min,5min。

等待離心其間，取細(xì)胞計(jì)數(shù)板，蓋玻片酒精擦拭，均在酒精燈上烤一下，將蓋玻片蓋在細(xì)胞計(jì)數(shù)槽上，使覆蓋細(xì)胞計(jì)數(shù)板上的上下兩個(gè)“十字”區(qū)域。取一只新的15ml離心管，做好標(biāo)記，擺放好。離心畢，拆封，瓶口及瓶蓋在酒精燈上烤一下，棄去上清液，加入全培養(yǎng)液吹散沉淀細(xì)胞成細(xì)胞懸液，擰緊管蓋，上下顛倒混勻。用槍吹打混勻離心管中含完全培養(yǎng)液的細(xì)胞，再?gòu)碾x心管中取1ml細(xì)胞懸液移入新的15ml離心管，加入4ml完全培養(yǎng)液，即稀釋五倍，吹打混勻細(xì)胞懸液，上下顛倒混勻細(xì)胞懸液。

上下顛倒混勻新15ml離心管內(nèi)細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)前將待測(cè)液吹打均勻，用微量槍從新15ml離心管中取出細(xì)胞懸液（約10μl），滴入計(jì)數(shù)板上蓋玻片的一側(cè)縫隙旁，虹吸作用液體會(huì)吸入蓋玻片下（不能有氣泡，不然會(huì)影響細(xì)胞計(jì)數(shù)，注意滴入懸液量不能太大致使細(xì)胞懸液流入旁邊的槽中），鏡下觀察細(xì)胞，數(shù)出計(jì)數(shù)板四角大方格中的細(xì)胞數(shù)（16個(gè)小格×4個(gè)大格），用計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)（約200個(gè)）

細(xì)胞數(shù) 萬(wàn)個(gè)/mL原液=（4大方格細(xì)胞數(shù)之和/4）×稀釋倍數(shù)（常稀釋5倍，若細(xì)胞過(guò)多不能數(shù)清則加大稀釋倍數(shù)，不斷調(diào)整新離心管中細(xì)胞懸液的細(xì)胞濃度，直至鏡下觀察細(xì)胞數(shù)目符合要求。）每皿/瓶需鋪板50-100萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)算出每皿所細(xì)胞懸液需毫升數(shù)，加入懸液時(shí)注意混勻，不得有氣泡，吸時(shí)注意每次槍尖是否都吸滿液體。每皿加入細(xì)胞懸液后，用含血清培養(yǎng)基補(bǔ)足至2ml/皿/瓶。24h后觀察細(xì)胞長(zhǎng)至八成滿時(shí)即可加藥處理。

6檢驗(yàn)判斷細(xì)胞狀態(tài)與加藥處理

細(xì)胞復(fù)蘇或傳代后24內(nèi)不可傳代，傳代4小時(shí)后開始貼壁。1>培養(yǎng)基顏色澄清度：

正常生長(zhǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)基澄清透明，傾斜使培養(yǎng)基聚集，對(duì)著燈看可透光，若出現(xiàn)絲狀沉淀或傾斜培養(yǎng)基對(duì)著燈看出現(xiàn)渾濁不透光且鏡下細(xì)胞之外的部分有密密麻麻的小黑點(diǎn)，很可能是染菌，應(yīng)棄掉。若鏡檢在細(xì)胞之外部分有一些渾濁，可能因?yàn)榧?xì)胞代謝旺盛分泌物堆積，或者因?yàn)橄瘯r(shí)間不夠以至于過(guò)度強(qiáng)硬吹打細(xì)胞，造成細(xì)胞損傷產(chǎn)生大量細(xì)胞碎片，應(yīng)換液。

新鮮培養(yǎng)基呈粉紅色，代謝代謝旺盛的細(xì)胞的培養(yǎng)基會(huì)變黃，此時(shí)若細(xì)胞貼壁應(yīng)換液，若此時(shí)細(xì)胞已長(zhǎng)滿，應(yīng)傳代。2>密度：

細(xì)胞密度過(guò)低，鏡下觀察稀稀疏疏，則生長(zhǎng)緩慢，甚至死亡。較大的細(xì)胞密度可促進(jìn)細(xì)胞之間相互作用，促進(jìn)細(xì)胞增殖生長(zhǎng)。密度過(guò)大，密密麻麻，部分細(xì)胞不能伸展成圓形，必須傳代，此時(shí)不傳代，一兩天后細(xì)胞狀態(tài)持續(xù)不好，開始死亡，鏡檢漂浮細(xì)胞增多。3>狀態(tài)：

鏡下觀察細(xì)胞，當(dāng)左右上下移動(dòng)鏡頭時(shí)漂動(dòng)的是未貼壁細(xì)胞或死細(xì)胞，固定不動(dòng)的是貼壁細(xì)胞，貼壁細(xì)胞是活細(xì)胞。

狀態(tài)良好的貼壁SY5Y細(xì)胞有圓形的胞體和細(xì)細(xì)分支的突觸，突觸分明。狀態(tài)不好的SY5Y細(xì)胞，突觸不明顯，看不到什么細(xì)細(xì)的分支，甚至成圓形。

消化時(shí)快離壁的細(xì)胞呈亮亮的圓形。

加藥前應(yīng)提前計(jì)算好藥品濃度體積，根據(jù)實(shí)驗(yàn)處理要求的濃度換算出每皿應(yīng)加藥品稀釋液體積和無(wú)血清培養(yǎng)基體積，列成表格以備加藥時(shí)明確操作。將藥品儲(chǔ)備液稀釋成稀釋液，再與相應(yīng)體積的無(wú)血清培養(yǎng)基在離心管中混合好。加COS時(shí)，倒掉含血清培養(yǎng)基，PBS蕩洗一遍，加以混合好的藥品。加COS 3小時(shí)后加Ab，Ab須提前37度水浴5小時(shí)，加藥時(shí)采用半數(shù)放液法，棄去1ml原培養(yǎng)基，加入1ml已混合好的藥品。