第一篇：動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)總結(jié)! !!!

動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)總結(jié) 一．實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

1.實(shí)驗(yàn)器械、器皿的清洗和消毒（1）清洗和包裝

離心管(1.5ml，2ml,15ml)若干，凍存管若干放進(jìn)鋁飯盒，用牛皮紙包裹，系緊棉繩，用筆在飯盒上和牛皮紙上標(biāo)記盒內(nèi)所裝物品名稱、數(shù)量、日期和所屬人名稱。

藍(lán)槍頭兩盒，黃槍頭白槍頭各一盒用牛皮紙包裹，用棉繩扎緊。取適量蒸餾水于4L玻璃瓶，瓶蓋擰松半圈。

過濾器，250ml玻璃瓶，500ml玻璃瓶用自來水毛刷洗滌劑刷洗，蒸餾水潤(rùn)洗，烘干。

過濾器兩部分分別包裹，先將瓶口部位用錫紙包裹后，再罩以牛皮紙，再用棉布密包起來，用棉繩扎緊。

玻璃瓶擰下瓶蓋，瓶身浸酸。浸酸時(shí)應(yīng)注意安全，須穿戴耐酸手套和白大褂，注意保護(hù)好面部和身體裸露部分，提前備好一盆水在旁以便浸酸結(jié)束后清洗耐酸手套，防止走動(dòng)時(shí)酸液滴到地板上不好清洗。瓶口慢慢沉入液面下，注意緩慢降低瓶身，使液體慢慢浸入瓶?jī)?nèi)，以免產(chǎn)生氣泡濺出酸液，發(fā)生危險(xiǎn)。浸酸時(shí)器皿要充滿酸液，勿留氣泡，浸泡過夜。取出瓶身時(shí)，須穿戴耐酸手套和白大褂，注意保護(hù)好面部和身體裸露部分，提前備好一盆水在旁，取出后將瓶身放入盆內(nèi)水中在轉(zhuǎn)移至水池邊清洗，以免酸液滴落地板不好清洗。換水洗幾次，待水澄清后開始沖洗，每瓶都用自來水灌滿，倒掉，重復(fù)15次，再用蒸餾水漂洗5次，去離子水漂洗3次，烘干備用。（2）消毒滅菌

1>全自動(dòng)高壓滅菌鍋：插電源，打開開關(guān)，檢查水位，若水位不足加蒸餾水補(bǔ)足，放入物品，瓶類物體須擰松蓋子后放最上面一筐，蓋上滅菌鍋蓋，擰緊蓋子至溫度顯示欄的左上角有一紅點(diǎn)亮燈，按start開始升溫。若滅有無菌水或玻璃瓶待降溫至常溫再打開，打開后立即擰緊，無菌水瓶口封上封口膜。若沒滅瓶類物品，降溫至80度左右即可打開滅菌鍋，須戴上線手套取出。

2>手提式高壓滅菌鍋：插電源，打開開關(guān)，檢查水位，若水位不足加蒸餾水補(bǔ)足，檢查設(shè)定是否為121度20分鐘，放入物品，蓋上滅菌鍋蓋，注意導(dǎo)氣管一定插到鍋底并不能堵塞，用手對(duì)稱地?cái)Q緊鍋蓋螺栓，再用扳手繼續(xù)擰緊。加溫升壓之前，先打開排氣閥門，加溫約半小時(shí)后見排氣閥處開始排殘留在鍋內(nèi)的冷空氣，排氣五分鐘，關(guān)閉排氣閥，繼而開始升壓。滅菌后不要立即打開氣閥放氣以免水汽噴出。待自然降溫至常壓才能打開氣閥。

玻璃瓶須擰緊，飯盒，槍頭滅菌后放入烘箱烘干備用。2.無菌間消毒及設(shè)備檢查

用84消毒液拖地，用原液按照1：29的比例兌水，抹布、拖把擦洗。配400ml 75%酒精于盆中，用酒精棉仔細(xì)擦拭CO2培養(yǎng)箱，超凈臺(tái)，超凈臺(tái)內(nèi)物品，顯微鏡，桌面，若培養(yǎng)箱內(nèi)未培養(yǎng)細(xì)胞可以再打開高溫滅菌模式將培養(yǎng)箱滅菌一次。

用蒸餾水擦拭清洗水浴鍋內(nèi)壁，注意底座不要沾水。檢查CO2總壓力表，若讀數(shù)不足四分之一提前預(yù)定CO2瓶，換瓶時(shí)需要扳手。CO2培養(yǎng)箱最下層的增濕盤須定期觀察加水，將增濕盤內(nèi)注入1/2無菌蒸餾水，并將盤直接放置在培養(yǎng)箱中央。啟動(dòng)培養(yǎng)箱，培養(yǎng)箱接通電源，增濕盤加水，連接好氣體供給，檢查有無漏氣，輸入系統(tǒng)設(shè)置。設(shè)置溫度和二氧化碳。

紫外照射無菌間30分鐘，注意屋內(nèi)不要有人以及培養(yǎng)基等試劑。3.細(xì)胞培養(yǎng)用液的配置及分裝

RPM1640培養(yǎng)基配制：將干粉型RPM1640培養(yǎng)基溶于總量1/3的去離子水中，再用1/3水沖洗包裝內(nèi)2次，倒入培養(yǎng)基中，以保證所有干粉都溶解成培養(yǎng)液，根據(jù)產(chǎn)品說明的要求和實(shí)驗(yàn)補(bǔ)加谷氨酰胺和NaHCO3 ,傾斜三角瓶輕輕放入轉(zhuǎn)子，用磁力攪拌器攪拌2h。用泵使培養(yǎng)基在超凈臺(tái)內(nèi)通過滅菌的過濾器，過濾除菌，分裝后置4度冰箱保存?zhèn)溆?。使用前調(diào)pH至7.0，加雙抗于培養(yǎng)液中濃度為1%，使用時(shí)加胎牛血清10%FBS.胎牛血清FBS的處理：使用前應(yīng)做熱滅活處理，即通過加熱的方法破壞補(bǔ)體，將胎牛血清放入56度水浴中30分鐘，其間要不時(shí)輕輕晃動(dòng)，使受熱均勻，防止沉淀析出。分裝前提前2天放4度冰箱解凍，溶解完全后于超凈臺(tái)內(nèi)分裝為25ml每管，留2管放四度備用，余下放-20度凍存。配制含血清培養(yǎng)基或凍存液前務(wù)必提前一天取出分裝后的血清四度溶解備用，血清融化很慢。

5%NaHCO3溶液配制：5g NaHCO3，100ml蒸餾水，NaHCO3溶于水后，過濾除菌。0.25%胰蛋白酶液200ml在超凈臺(tái)內(nèi)分裝成每管1ml或2ml，封口膜封口，-20度備用。

雙抗溶液配制：80萬單位青霉素加4ml滅菌D-Hanks液，即成20萬單位/ml溶液。100萬單位鏈霉素加5ml滅菌的D-Hanks液，即成20萬單位/ml溶液。兩溶液各取0.5ml混合，加入9mlD-Hanks液，則成含青鏈霉素各1萬單位/ml，分裝后置于4度冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

二．操作步驟 注意事項(xiàng)：

1、所有實(shí)驗(yàn)用的器械，儀器滅菌，消毒，烘干。

2、打開溶劑，培養(yǎng)瓶瓶蓋時(shí)，瓶口及瓶蓋在酒精燈上烤一下。

3、用完溶劑，培養(yǎng)瓶時(shí)，瓶口及瓶蓋也要在酒精燈上烤一下。

4、所有物品放入超凈臺(tái)需用酒精棉擦拭，包括手伸出窗口拿取物品再回到窗內(nèi)時(shí)需要重新用酒精棉擦拭。開始工作：

1、實(shí)驗(yàn)前換紫外照過的白大褂和拖鞋。

2、戴橡膠手套，75%乙醇擦手，然后用75%乙醇擦一下臺(tái)面，點(diǎn)燃酒精燈。

3、取待用的細(xì)胞，旋緊瓶蓋。

4、胰酶消化緩慢時(shí)可以將細(xì)胞置于5%CO2、37度培養(yǎng)箱中1min-2min，目的是提高酶活性，促進(jìn)消化。1.細(xì)胞復(fù)蘇

提前預(yù)冷離心機(jī)，設(shè)參數(shù)為4度，1000r/min,5min。

將槍頭，裝有離心管的飯盒，垃圾盒放入超凈臺(tái)，酒精棉擦一遍超凈臺(tái)臺(tái)面和移液器尤其槍口，以防別人用槍時(shí)不慎沾染臟污堵塞槍口。超凈臺(tái)和房間照15分鐘紫外，照紫外的同時(shí)取出無血清培養(yǎng)基和含血清培養(yǎng)基37度水浴加熱。

關(guān)閉紫外，打開風(fēng)機(jī)，升高窗高，點(diǎn)燃酒精燈，用鑷子從飯盒中取2個(gè)15ml離心管放至試管架，每管加入3ml無血清培養(yǎng)基，提前剪好2條封離心管的封口膜備用。

戴上橡膠手套再套上線手套，用鑷子從液氮中取出塑料凍存管，用手拿凍存管迅速浸入37度水浴中，劇烈急速搖晃凍存管，因?yàn)橛蟹浪z布纏裹不用擔(dān)心進(jìn)水染菌，使其急速融化，注意管內(nèi)凍存細(xì)胞的融化情況。基本轉(zhuǎn)為液態(tài)時(shí)將凍存管取出，摘下線手套，凍存管轉(zhuǎn)移至超凈臺(tái)內(nèi)，用酒精擦手，擦拭凍存管尤其管口，撕下膠布和封口膜，再擦拭管口，整個(gè)溶解過程盡量在30s至1min內(nèi)完成。(注意：這一步對(duì)細(xì)胞存活率至關(guān)重要。既要盡快融化以減少融化過程對(duì)細(xì)胞的損害，又要盡可能減少細(xì)胞在較高溫度停留的時(shí)間以減少DMSO對(duì)細(xì)胞的毒害，切不可將凍存管放在燒杯內(nèi)不管。)打開凍存管管蓋，逐滴加入1ml無血清培養(yǎng)基，輕柔地將凍存管內(nèi)的細(xì)胞懸液吸取出來，轉(zhuǎn)移至已備好的離心管內(nèi)，輕輕搖混勻，蓋上管蓋，輕輕地上下顛倒混勻。封上封口膜。

低俗離心1000r/min,5min。小心地吸出上清液，要求上清液盡可能吸走，同時(shí)又不觸及管底沉淀的細(xì)胞。（較高要求時(shí)可以用手指輕彈離心管管底，將細(xì)胞團(tuán)分散，加入10ml無血清培養(yǎng)基混勻離心10min棄上清再洗一次，有助于減少DMSO殘留。）加3至5ml培養(yǎng)液至沉淀的細(xì)胞，輕輕搖晃使分散成細(xì)胞懸液，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，擰緊蓋子，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)箱中再反旋擰松半圈，以利于瓶口內(nèi)外進(jìn)行氣體交換，注意取出培養(yǎng)瓶時(shí)須先擰緊瓶口。37度恒溫箱中培養(yǎng)。第二天觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。培養(yǎng)基瓶蓋過火，擰緊后封上封口膜。收好物品，擦一遍臺(tái)子，滅酒精燈。2傳代培養(yǎng)

附著型胞(adherentcell)傳代培養(yǎng)

離心法提前預(yù)冷離心機(jī)，設(shè)置好參數(shù)4度，1000r/min,5min。倒液法不需要。

將滅菌槍頭，裝有離心管的飯盒，新培養(yǎng)皿/瓶,垃圾盒放入超凈臺(tái)，酒精棉擦一遍超凈臺(tái)臺(tái)面和移液器尤其槍口，以防別人用槍時(shí)不慎沾染臟污堵塞槍口。超凈臺(tái)和房間照15分鐘紫外，照紫外的同時(shí)從冰箱取出PBS,胰酶，含血清培養(yǎng)基于37度水浴加熱。關(guān)閉紫外，打開風(fēng)機(jī)和照明，升高窗高，點(diǎn)燃酒精燈，將所需試劑先擦瓶底，放在臺(tái)子上再擦側(cè)壁一圈，擦瓶口瓶蓋，撕下封口膜，再仔細(xì)擦一遍瓶口。用噴過酒精的塑料筐將細(xì)胞培養(yǎng)瓶擰緊蓋子拿到超凈臺(tái)旁的椅子上放平放穩(wěn)，每三瓶/皿一摞拿入超凈臺(tái)先擦最下面一個(gè)的底部，擦好后放在臺(tái)面上，擦一摞的側(cè)面一圈，在分別擦底面頂面瓶口，直到所有培養(yǎng)瓶各個(gè)面及瓶口擦好，注意不要擦到有marker標(biāo)記字跡的部位，酒精會(huì)擦掉字跡，若擦到字跡待酒精干后立即補(bǔ)寫上以防事后記不清。

輕輕倒掉舊培養(yǎng)液，注意不要使液體倒流回來沖擊細(xì)胞，掛在外壁的殘留液滴用酒精棉擦掉,培養(yǎng)瓶可以輕輕翻轉(zhuǎn)瓶子使細(xì)胞生長(zhǎng)的面在上，頂面在下，液體留至頂面后直接倒掉液體。加1ml PBS，注意槍沖著不長(zhǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)皿側(cè)壁或翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶朝瓶的頂壁或側(cè)壁打入PBS，盡量不碰到瓶口或培養(yǎng)皿，若懷疑碰壁，棄掉槍頭。輕輕搖晃培養(yǎng)皿或瓶，使PBS沾到所有細(xì)胞，洗滌細(xì)胞一遍，輕輕倒掉PBS。

加入0.25%胰蛋白酶液(1ml/25cm2,2ml/75cm2)，若是高倍胰酶先稀釋（0.25%為1X胰酶），37℃作用數(shù)分鐘。等待消化期間準(zhǔn)備好新的培養(yǎng)皿/瓶，每25cm2小皿/瓶加入2ml含血清培養(yǎng)基。消化中的皿蓋好蓋子或瓶擰緊蓋子，于倒立顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞將要分離而呈現(xiàn)圓粒狀，有10%細(xì)胞漂動(dòng)時(shí)，倒掉胰酶溶液，加入1ml(25cm2小皿/瓶)含血清之新鮮培養(yǎng)基終止胰酶作用。(若細(xì)胞將要分離而呈現(xiàn)圓粒狀且80%細(xì)胞漂動(dòng)，則不移去胰酶，在胰酶作用后，加入適量含血清之新鮮培養(yǎng)基終止胰酶作用，吹打成細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管，封上封口膜，離心后再吸掉上清液。）

輕輕搖晃培養(yǎng)瓶使細(xì)胞自瓶壁脫落，以吸管上下輕輕吸放數(shù)次以打散細(xì)胞團(tuán)塊，注意吹打時(shí)有系統(tǒng)性的將所有面積都打到不要集中只吹打一處而一些地方?jīng)]吹打到，吸和吹時(shí)槍頭都不要離開液面以減少氣泡，氣泡多破裂時(shí)對(duì)細(xì)胞有沖擊且會(huì)增加體積不利于操作，培養(yǎng)瓶吹打時(shí)操作角度小不方便，用倒液法（10%細(xì)胞漂動(dòng)即倒掉胰酶加含血清培養(yǎng)基終止消化）時(shí)吹打細(xì)胞要用二檔多吹打幾次，用皿或離心法（80%細(xì)胞飄動(dòng)不棄胰酶直接加含血清培養(yǎng)基再離心棄上清）時(shí)細(xì)胞很容易脫落，可以用一檔輕輕吹打，保證所有面積都吹打到即可?；旌途鶆蚝螅老♂尡壤D(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶中，擰緊瓶蓋，鏡下觀察細(xì)胞數(shù)量多，培養(yǎng)液澄清，若細(xì)胞密度過低將影響生長(zhǎng)可適當(dāng)補(bǔ)充細(xì)胞懸液，若細(xì)胞密度過大將影響迅速生長(zhǎng)一天后即需傳代，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)適當(dāng)添加培養(yǎng)基或細(xì)胞懸液使生長(zhǎng)速度符合預(yù)期，轉(zhuǎn)移至CO2培養(yǎng)箱，擰松半圈瓶蓋，37度培養(yǎng)。試劑瓶瓶蓋過火，擰緊后封上封口膜。密封收好物品。擦一遍臺(tái)子，滅酒精燈。

3細(xì)胞換液

取待用的細(xì)胞，旋緊瓶蓋。

棄去舊的培養(yǎng)液，把培養(yǎng)瓶放回原處。

用微量槍加入適量的PBS緩沖液，緩慢蕩洗一下細(xì)胞，然后將PBS緩沖液棄掉。

用微量槍加入適量的細(xì)胞培養(yǎng)液于培養(yǎng)瓶中。旋緊瓶蓋。將細(xì)胞置于5%CO2、37度培養(yǎng)箱，反旋擰松瓶蓋半圈，培養(yǎng)。

4細(xì)胞凍存 1>準(zhǔn)備工作：

提前一天將血清FBS從-20度取出放在4度冰箱解凍。選取對(duì)生增生期細(xì)胞（鏡下密密麻麻，胞體突觸明顯），在收集細(xì)胞24h前換液一次。

進(jìn)入細(xì)胞室前，首先用75%酒精擦試工作臺(tái)，接著紫外滅菌30，過后，關(guān)閉紫外燈，通風(fēng)10min。從冰箱中取出胰酶、PBS緩沖液、培養(yǎng)基，血清37度水浴。取出室溫放置的DMSO。找到防水的醫(yī)用膠布，濾菌膜，針管和所需槍頭飯盒等物品，噴一遍酒精，放入臺(tái)子照紫外。2>開始工作：

實(shí)驗(yàn)前在更衣間換上紫外照過的白大褂和拖鞋。戴上橡膠手套，75%乙醇擦手，然后用75%乙醇擦一下臺(tái)面，點(diǎn)燃酒精燈。酒精擦拭胰酶、PBS緩沖液、培養(yǎng)基放入超凈臺(tái)。過火鑷子取出離心管于試管架，剪好封口膜備用。用濾菌膜和針管過濾DMSO以除菌。

75%無血清培養(yǎng)基，20%的血清，5%過濾除菌的DMSO，混勻配制成所需的凍存液。

取待用的細(xì)胞，旋緊瓶蓋。

棄去舊的培養(yǎng)液，掛壁殘液注意用酒精棉擦去，用微量槍朝不長(zhǎng)細(xì)胞的側(cè)壁或頂部打槍，加入適量的PBS緩沖液，緩慢蕩洗一下細(xì)胞，然后將PBS緩沖液棄掉。用微量槍朝不長(zhǎng)細(xì)胞的側(cè)壁或頂部打槍，加入適量胰酶約2ml，棄掉槍頭。消化數(shù)分鐘，等待期間，用過火鑷子從飯盒中取出凍存管和管蓋標(biāo)記好細(xì)胞名稱和凍存日期，直立于臺(tái)面?zhèn)溆谩?/p>

用微量槍加入適量的完全培養(yǎng)液沖洗（吹散細(xì)胞）細(xì)胞，將瓶底粘著的細(xì)胞吹散下來，再將細(xì)胞懸液移入的離心管中，封口，標(biāo)簽。離心5min，1000轉(zhuǎn)/min。

細(xì)胞離心畢，拆封，瓶口及瓶蓋在酒精燈上烤一下，棄去上清液。用微量槍將凍存液平均加入離心管中，混勻離心管中細(xì)胞凍存液。用微量槍將含細(xì)胞的凍存液移入凍存管中，封口膜封口，防水醫(yī)用膠布再纏一圈，標(biāo)簽時(shí)間，細(xì)胞名稱。

凍存，需緩慢凍存，先放置4度冰箱20min，然后放置-20度冰箱30min，再置于-80度冰箱過夜，最后置于液氮灌-196度中保存。5 鋪板和細(xì)胞計(jì)數(shù)

用傳代方法制成細(xì)胞懸液。倒掉培養(yǎng)基，用PBS液洗滌后，0.25%的胰蛋白酶液消化，加入培養(yǎng)液吹打制成待測(cè)細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)至離心管，封上封口膜，離心1000r/min,5min。

等待離心其間，取細(xì)胞計(jì)數(shù)板，蓋玻片酒精擦拭，均在酒精燈上烤一下，將蓋玻片蓋在細(xì)胞計(jì)數(shù)槽上，使覆蓋細(xì)胞計(jì)數(shù)板上的上下兩個(gè)“十字”區(qū)域。取一只新的15ml離心管，做好標(biāo)記，擺放好。離心畢，拆封，瓶口及瓶蓋在酒精燈上烤一下，棄去上清液，加入全培養(yǎng)液吹散沉淀細(xì)胞成細(xì)胞懸液，擰緊管蓋，上下顛倒混勻。用槍吹打混勻離心管中含完全培養(yǎng)液的細(xì)胞，再?gòu)碾x心管中取1ml細(xì)胞懸液移入新的15ml離心管，加入4ml完全培養(yǎng)液，即稀釋五倍，吹打混勻細(xì)胞懸液，上下顛倒混勻細(xì)胞懸液。

上下顛倒混勻新15ml離心管內(nèi)細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)前將待測(cè)液吹打均勻，用微量槍從新15ml離心管中取出細(xì)胞懸液（約10μl），滴入計(jì)數(shù)板上蓋玻片的一側(cè)縫隙旁，虹吸作用液體會(huì)吸入蓋玻片下（不能有氣泡，不然會(huì)影響細(xì)胞計(jì)數(shù)，注意滴入懸液量不能太大致使細(xì)胞懸液流入旁邊的槽中），鏡下觀察細(xì)胞，數(shù)出計(jì)數(shù)板四角大方格中的細(xì)胞數(shù)（16個(gè)小格×4個(gè)大格），用計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)（約200個(gè)）

細(xì)胞數(shù) 萬個(gè)/mL原液=（4大方格細(xì)胞數(shù)之和/4）×稀釋倍數(shù)（常稀釋5倍，若細(xì)胞過多不能數(shù)清則加大稀釋倍數(shù)，不斷調(diào)整新離心管中細(xì)胞懸液的細(xì)胞濃度，直至鏡下觀察細(xì)胞數(shù)目符合要求。）每皿/瓶需鋪板50-100萬個(gè)細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)算出每皿所細(xì)胞懸液需毫升數(shù)，加入懸液時(shí)注意混勻，不得有氣泡，吸時(shí)注意每次槍尖是否都吸滿液體。每皿加入細(xì)胞懸液后，用含血清培養(yǎng)基補(bǔ)足至2ml/皿/瓶。24h后觀察細(xì)胞長(zhǎng)至八成滿時(shí)即可加藥處理。

6檢驗(yàn)判斷細(xì)胞狀態(tài)與加藥處理

細(xì)胞復(fù)蘇或傳代后24內(nèi)不可傳代，傳代4小時(shí)后開始貼壁。1>培養(yǎng)基顏色澄清度：

正常生長(zhǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)基澄清透明，傾斜使培養(yǎng)基聚集，對(duì)著燈看可透光，若出現(xiàn)絲狀沉淀或傾斜培養(yǎng)基對(duì)著燈看出現(xiàn)渾濁不透光且鏡下細(xì)胞之外的部分有密密麻麻的小黑點(diǎn)，很可能是染菌，應(yīng)棄掉。若鏡檢在細(xì)胞之外部分有一些渾濁，可能因?yàn)榧?xì)胞代謝旺盛分泌物堆積，或者因?yàn)橄瘯r(shí)間不夠以至于過度強(qiáng)硬吹打細(xì)胞，造成細(xì)胞損傷產(chǎn)生大量細(xì)胞碎片，應(yīng)換液。

新鮮培養(yǎng)基呈粉紅色，代謝代謝旺盛的細(xì)胞的培養(yǎng)基會(huì)變黃，此時(shí)若細(xì)胞貼壁應(yīng)換液，若此時(shí)細(xì)胞已長(zhǎng)滿，應(yīng)傳代。2>密度：

細(xì)胞密度過低，鏡下觀察稀稀疏疏，則生長(zhǎng)緩慢，甚至死亡。較大的細(xì)胞密度可促進(jìn)細(xì)胞之間相互作用，促進(jìn)細(xì)胞增殖生長(zhǎng)。密度過大，密密麻麻，部分細(xì)胞不能伸展成圓形，必須傳代，此時(shí)不傳代，一兩天后細(xì)胞狀態(tài)持續(xù)不好，開始死亡，鏡檢漂浮細(xì)胞增多。3>狀態(tài)：

鏡下觀察細(xì)胞，當(dāng)左右上下移動(dòng)鏡頭時(shí)漂動(dòng)的是未貼壁細(xì)胞或死細(xì)胞，固定不動(dòng)的是貼壁細(xì)胞，貼壁細(xì)胞是活細(xì)胞。

狀態(tài)良好的貼壁SY5Y細(xì)胞有圓形的胞體和細(xì)細(xì)分支的突觸，突觸分明。狀態(tài)不好的SY5Y細(xì)胞，突觸不明顯，看不到什么細(xì)細(xì)的分支，甚至成圓形。

消化時(shí)快離壁的細(xì)胞呈亮亮的圓形。

加藥前應(yīng)提前計(jì)算好藥品濃度體積，根據(jù)實(shí)驗(yàn)處理要求的濃度換算出每皿應(yīng)加藥品稀釋液體積和無血清培養(yǎng)基體積，列成表格以備加藥時(shí)明確操作。將藥品儲(chǔ)備液稀釋成稀釋液，再與相應(yīng)體積的無血清培養(yǎng)基在離心管中混合好。加COS時(shí)，倒掉含血清培養(yǎng)基，PBS蕩洗一遍，加以混合好的藥品。加COS 3小時(shí)后加Ab，Ab須提前37度水浴5小時(shí)，加藥時(shí)采用半數(shù)放液法，棄去1ml原培養(yǎng)基，加入1ml已混合好的藥品。

第二篇：《動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)》教學(xué)反思

動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)教學(xué)反思

楊建波

賽課已經(jīng)結(jié)束，但我的表現(xiàn)并不好。首先，引入新課不夠精彩，沒有激發(fā)學(xué)生的求知欲。我覺得應(yīng)該以演員SELINA演習(xí)時(shí)皮膚大面積燒傷,治療通常是取健康皮膚進(jìn)行自體移植，但對(duì)于大面積燒傷病人來講，健康皮膚很有限，如何來治療該病人作為問題引起同學(xué)們討論，引出這節(jié)課的主要內(nèi)容——?jiǎng)游锛?xì)胞培養(yǎng)。在此之前學(xué)生已經(jīng)學(xué)過了植物組織培養(yǎng)，因此我先回顧植物組織培養(yǎng)的原理并提出了一個(gè)問題：動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)能否像植物組織培養(yǎng)那樣最終培養(yǎng)成新個(gè)體？引導(dǎo)同學(xué)們思考兩者之間的異同。在講述培養(yǎng)過程時(shí)，學(xué)生閱讀課本自主總結(jié)和借助課件展示過程，幫助學(xué)生理解培養(yǎng)的過程及把握注意事項(xiàng)。本堂課上完后，我發(fā)現(xiàn)了自己有不少缺點(diǎn)和不足，需要在以后的教學(xué)中加以改正：1．沒有充分發(fā)揮學(xué)生的主體地位。新課程的理念是要轉(zhuǎn)變教師和學(xué)生的角色，讓學(xué)生成為課堂的主導(dǎo)者，而本節(jié)課仍然以傳統(tǒng)的教學(xué)模式為主，仍然是教師為主體。在實(shí)際教學(xué)過程中，主觀的想引導(dǎo)學(xué)生探究問題，思考問題，得出結(jié)論，而事實(shí)上學(xué)生回答問題答不到點(diǎn)子上，我就匆匆的把答案公布了，沒有真正做好引導(dǎo)工作。2．沒有充分調(diào)動(dòng)學(xué)生的積極性。課堂教學(xué)的氣氛對(duì)整堂課的教學(xué)質(zhì)量是至關(guān)重要的，縱觀整節(jié)課，學(xué)生對(duì)問題的思考、回答等積極性不高。3．時(shí)間安排不夠緊湊。導(dǎo)致最后講動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用時(shí)時(shí)間緊，講得比較匆忙。當(dāng)然本節(jié)課的成功之處是采用了多媒體教學(xué)，使課堂的知識(shí)容量比較大，對(duì)前面學(xué)過的內(nèi)容可以比較快的復(fù)習(xí)，真正做到溫故而知新。

第三篇：第八章 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)和生長(zhǎng)過程

第八章

動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)和培養(yǎng)過程

8.1背景

盡管先前有許多調(diào)查者研究了動(dòng)物細(xì)胞在試管中的習(xí)性。但是。1949年，這種能產(chǎn)生有用物質(zhì)的動(dòng)物細(xì)胞首次被利用。在當(dāng)時(shí)，J.F Enders 證明了脊髓灰質(zhì)炎病毒在培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞中可以生長(zhǎng)，而這種細(xì)胞源于靈長(zhǎng)類動(dòng)物的神經(jīng)和非神經(jīng)組織中。

簡(jiǎn)潔的總接一下這一偉大的探索工作，開始與19世紀(jì)80年代早期。根據(jù)論證白細(xì)胞能在軀體外分裂。這種細(xì)胞是通過觀察注入在血清、淋巴或腹水中以切成片狀的動(dòng)物組織所得。（1907年）Ｒ．Hａｒｒｉｓｏｎ的懸在下面的淋巴當(dāng)中的（蝌蚪骨髓）組織方法。而這種蓋玻片密封在一個(gè)中間挖空的載玻片上。這項(xiàng)偉績(jī)（１９１３年）由Ｃａｒｒｅｌ所繼承和發(fā)展。他研發(fā)了一種維持外來物質(zhì)特別是細(xì)菌培養(yǎng)的復(fù)雜方法，其他人很少有這種能力，然而，截至１９２８年，培養(yǎng)基的發(fā)展促進(jìn)動(dòng)物細(xì)胞的增長(zhǎng)以至于Ｍａｉｔｌａｎｄｓ能夠在裝有切碎的老鼠或小雞胚胎的試管中培養(yǎng)病毒。ｅｎｄｅｒｓ在脊髓灰質(zhì)炎的工作中運(yùn)用此方法。脊髓灰質(zhì)炎的作用是有他和他的同事通過使用抗生素獲得相當(dāng)多的幫助，這些抗生素在十年前是非常流行的，２０世紀(jì)５０年代早期Salk發(fā)明的脊髓灰質(zhì)炎疫苗是由猴子的腎和睪丸細(xì)胞在試管培養(yǎng)中生產(chǎn)的。一旦這種技術(shù)被確立，培養(yǎng)中生長(zhǎng)的小雞或其他原始的胚胎細(xì)胞生產(chǎn)其他疫苗。【麻疹病毒（１９５８年）。流行性腮腺炎病毒（１９５１年）、腺病毒（１９５８年）】

８．２從動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中獲得的不同產(chǎn)物

動(dòng)物細(xì)胞過去是現(xiàn)在仍然是從培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞中獲得最具有商業(yè)性的產(chǎn)物，目前，每年生產(chǎn)大約１．５＊１０９劑量的口啼疾疫苗，近似于紐卡斯?fàn)柌『婉R立克氏病的家禽疫苗。人類病毒疫苗以每年１０８劑或者較低一點(diǎn)的速度在運(yùn)用。干擾素生產(chǎn)的過程也是一大規(guī)模，接近或超過這些運(yùn)用于獸醫(yī)疫苗的情況下，然而有利于具體的合成雜交瘤細(xì)胞相對(duì)于免疫學(xué)方面是毫無疑問的，在未來的十年里是舉足輕重的。表８。１中列出已經(jīng)或者可能在培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞過程中獲得的主要產(chǎn)物，這并不是唯一的產(chǎn)物，而是表現(xiàn)著主要產(chǎn)物以及能在這些區(qū)域內(nèi)獲得的物質(zhì)的類型。

８．３產(chǎn)物生產(chǎn)方法的綜述

圖８。１到８。３概括的描述了對(duì)于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)體系中產(chǎn)物的發(fā)展。它包括三個(gè)階段，第一個(gè)階段是準(zhǔn)備階段，第二階段是動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)階段，第三階段是產(chǎn)物的產(chǎn)生階段。早某種體系上（荷爾蒙和免疫生物產(chǎn)物）最后一階段是區(qū)別于單元細(xì)胞的生產(chǎn)方式。然而在其它方面，最后一階段跟病毒細(xì)胞培養(yǎng)的傳染有關(guān)或與誘生劑有關(guān)。（如干擾素，見表８。３）

對(duì)生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)的很多努力涉及到質(zhì)量控制系統(tǒng)，與此同時(shí)，在線和離線檢測(cè)在生物技術(shù)領(lǐng)域中隨處可見。質(zhì)量控制測(cè)試的設(shè)計(jì)不僅能夠確保使用的物質(zhì)能夠促進(jìn)細(xì)胞或產(chǎn)物的發(fā)展，還能確保他們擺脫外來的生體，例如，污染物

圖表８。２清楚的表明生長(zhǎng)培養(yǎng)基的準(zhǔn)備工作是一項(xiàng)艱難而又需要專門的技術(shù)的過程，當(dāng)培養(yǎng)基所確定的組份容易控制時(shí)，最有困難的兩種組份是水和血清。

水可以從多種資源中獲得，甚至蒸餾和去離子作用后，水也可能包含著對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)不利的物質(zhì)。對(duì)此，格陵蘭冰島底部所融化的病是一種很有用的參考物質(zhì)，貯備水的缺乏帶來一些困難。細(xì)菌能在室溫蒸餾水中達(dá)到１０５單元的含量，同時(shí)遠(yuǎn)離組成的變量，這種細(xì)菌的產(chǎn)物少部分可能是有毒的，在８０C貯藏的水通常被攻克，在這個(gè)溫度下表面將無菌。

也可以制備沒有血清的培養(yǎng)基，但并非所有的細(xì)胞可以再生。然而這種細(xì)胞培養(yǎng)基的結(jié)合對(duì)密封材料的產(chǎn)生沒有多大用處。

以去除免疫球蛋白成分的血清在病毒生產(chǎn)體系方面最有用這種病毒生產(chǎn)體系是通過當(dāng)?shù)厣a(chǎn)的血清包含的對(duì)生產(chǎn)病毒的抗體的一種體系，雖然買的和做實(shí)驗(yàn)的血清的價(jià)格不菲，但是室內(nèi)生產(chǎn)是有可能的，血清質(zhì)量的控制的徹底性對(duì)可靠的重復(fù)運(yùn)轉(zhuǎn)是很有必要的。在零下２０C貯存預(yù)先測(cè)試的血清是經(jīng)常可取的，因?yàn)樗軌虼嫘迈r血清質(zhì)量減退的這些時(shí)光，（通常夏天較容易）。牛胎血清經(jīng)常被應(yīng)用于細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)面，但是牛胎血清既貴又罕見。帶有噬菌體支原體這樣的物質(zhì)也是最可靠的。也能成批成批的管擦牛胎血清的生長(zhǎng)特性，由于來自幼地鼠地腎的細(xì)胞，９０％利潤(rùn)從成年牛的血清也可以得到。動(dòng)物細(xì)胞能生長(zhǎng)在兩種不同類型的培養(yǎng)基上，如果多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞首次被運(yùn)用到表層或者固體基質(zhì)。那么他們可以被誘導(dǎo)分裂，正好相反，一些可能在懸浮液中被誘導(dǎo)自由生長(zhǎng)，前者被稱為單層細(xì)胞，應(yīng)為他們?cè)诨|(zhì)上形成一層厚壁細(xì)胞，即使在連續(xù)培養(yǎng)的添加組織也能形成，依賴基質(zhì)生長(zhǎng)的細(xì)胞被稱為是懸浮細(xì)胞或非貼壁依賴性細(xì)胞。

我們認(rèn)為只是生長(zhǎng)的單層細(xì)胞比懸浮細(xì)胞有特別少的致癌基因（能使細(xì)胞致癌的基因序列），因此對(duì)于人類的消耗，這種細(xì)胞被用于生產(chǎn)物質(zhì)，多種也證明此種 細(xì)胞比在懸浮液中的生長(zhǎng)的細(xì)胞有能力生成更多的病毒毒性。但是如病毒或是產(chǎn)物從懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞生產(chǎn)制造，那么多數(shù)過程會(huì)相對(duì)容易些，獸醫(yī)所使用的產(chǎn)物按這種方法所得（腳嘴病毒），同時(shí)也包括a-干擾素以及有關(guān)雜交瘤細(xì)胞的免疫學(xué)生物特性。盡管在選擇測(cè)試體系方面，后兩種產(chǎn)物所使用的細(xì)胞被證明是可以致癌的，但是在生產(chǎn)階段不會(huì)有什么危害，或者是優(yōu)先使用單位細(xì)胞的產(chǎn)物。在表8.2中，有一個(gè)對(duì)于單層細(xì)胞使用有利和不利條件的總結(jié)。我們可以得出結(jié)論，在細(xì)胞類型方面能夠生產(chǎn)商業(yè)性細(xì)胞是很有必要的。并且也需要兩種必要的但不同的技術(shù)，下面將陳述兩種不同的技術(shù)。

8.4單層細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)

獲取基質(zhì)的生產(chǎn)細(xì)胞系統(tǒng)可以被劃分為兩種類型，一種是增加設(shè)備單元的數(shù)量以擴(kuò)大進(jìn)程；另一種是多重和過程。通過增加設(shè)備的尺寸來實(shí)現(xiàn)擴(kuò)大

8.4.1單層細(xì)胞生長(zhǎng)的多重過程

傳統(tǒng)的來講，固定的玻璃瓶或者是培養(yǎng)皿內(nèi)已經(jīng)生成了單層細(xì)胞，這種瓶子有許多結(jié)構(gòu)，被命名為brockway，roux ,Carrel,Baxter或Medical Flats，鈉玻璃可能被使用，但是硼硅酸鹽會(huì)更受歡迎，因?yàn)樗M管越復(fù)雜，但越堅(jiān)硬越容易修理。那玻璃瓶也許會(huì)單獨(dú)使用，但是經(jīng)常固定在擱架上便于運(yùn)輸。能夠使細(xì)胞生長(zhǎng)在瓶的內(nèi)表面而不是瓶底的系統(tǒng)，它的發(fā)展同樣是滾瓶系統(tǒng)的發(fā)展。盡管所使用的矩形瓶和十字型瓶也能夠轉(zhuǎn)動(dòng)，但是對(duì)于這個(gè)系統(tǒng)，圓柱型瓶被廣泛使用，有許多瓶子能夠達(dá)到180cm長(zhǎng)，滾筒上邊放著瓶子，而這樣的滾筒放在機(jī)械支架上。一套標(biāo)準(zhǔn)的設(shè)備可以轉(zhuǎn)動(dòng)12個(gè)瓶子，6~10套支架可以組成一個(gè)生產(chǎn)單元，在意大利布雷西亞的Zooprofilattico Sperimentale大學(xué)學(xué)院有7000個(gè)瓶子在每四個(gè)培養(yǎng)箱里可同時(shí)轉(zhuǎn)動(dòng)。再次，滾動(dòng)瓶系統(tǒng)被發(fā)展到了極限，對(duì)于已大量瓶子為媒介的細(xì)胞和病毒的生長(zhǎng)同時(shí)還要保持無菌培養(yǎng)，所以這種增長(zhǎng)是很難克服的，布雷西亞單元高度的自動(dòng)化裝置提高了這種方法的經(jīng)濟(jì)可行性。

8.4.2單層細(xì)胞生長(zhǎng)的單元程序

20世紀(jì)60年代中期，關(guān)于單層細(xì)胞的培養(yǎng)單元程序得到發(fā)展，同時(shí)單元程序的發(fā)展現(xiàn)在已變成一項(xiàng)易于接受的首選的實(shí)用技術(shù)。最近，其他方面的創(chuàng)始人重新檢查了這一系統(tǒng)的許多細(xì)節(jié)，結(jié)果跟隨最近的發(fā)展，不同的系統(tǒng)將在下邊描述

根據(jù)可靠的成功的多重過程的運(yùn)轉(zhuǎn)，被設(shè)計(jì)取代他們的單元模式跟隨多重系統(tǒng)的基本模式，這樣，在器皿中的一套彈簧片單元程序得到發(fā)展，同時(shí)使人聯(lián)想到一架子的瓶子，這樣的系統(tǒng)有一次性的聚苯乙烯、聚碳酸酯和鈉玻璃組成。后期的發(fā)展是采用一疊盤子同時(shí)以直接構(gòu)造的形式轉(zhuǎn)動(dòng)他們，要么以水平的形式轉(zhuǎn)動(dòng)他們，后期系統(tǒng)正在擴(kuò)大密集利用的情況下，目前作為B或纖維素細(xì)胞干擾素的一種方式，在清理與細(xì)胞培養(yǎng)運(yùn)行期間，這種系統(tǒng)的擴(kuò)大反映著一系列工程技術(shù)困難與操作問題，按照這種方式裝入容器的表層數(shù)量很有限，卻有兩種結(jié)果：

（a）磁盤雙方都被使用，（b）以稀釋形式生產(chǎn)產(chǎn)物正如生長(zhǎng)培養(yǎng)基沖洗過后，而培養(yǎng)基要么達(dá)到飽和程度，要么至少半飽和程度，總共達(dá)到外面容器的容積。從已經(jīng)發(fā)展的大范圍多試管細(xì)胞的繁殖，我們看到了滾瓶系統(tǒng)的發(fā)展，系統(tǒng)達(dá)到2001量的大規(guī)模發(fā)展，近期的一套細(xì)胞大量生長(zhǎng)的設(shè)備，Gyrogen有一排平行的試管組成，這種試管是從1001的量結(jié)合外界圓柱形殼在外部力量的驅(qū)動(dòng)下轉(zhuǎn)動(dòng)。這套昂貴的設(shè)備可用來生產(chǎn)，但是是否合理的利用能得到經(jīng)濟(jì)上有力的價(jià)值好沒有被證實(shí)。半空纖維中的試管收縮是唯一導(dǎo)致生物量的發(fā)展。對(duì)小規(guī)模來講，在外界纖維以細(xì)胞生長(zhǎng)的方式刺激動(dòng)物組織結(jié)構(gòu)或者通過纖維腔來促使?fàn)I養(yǎng)培養(yǎng)基的滲漏。這是非常有可能實(shí)現(xiàn)的，在兩種意義上，這種系統(tǒng)有些優(yōu)勢(shì)，正如廢棄物質(zhì)（含有細(xì)胞毒素），和產(chǎn)物能夠從細(xì)胞當(dāng)中分開，這種細(xì)胞是通過纖維的半透膜產(chǎn)生的。最近，這種自然系統(tǒng)已經(jīng)發(fā)展到了0.21，同時(shí)在良好的發(fā)展計(jì)算機(jī)控制和檢測(cè)系統(tǒng)得到了商業(yè)化的應(yīng)用和發(fā)展。

目前，為了細(xì)胞和產(chǎn)物的生產(chǎn)，許多項(xiàng)目組利用填充層，例如B干擾素，口蹄疫病毒和豬水皰病病毒。經(jīng)過玻璃球瓶?jī)?nèi)的聚苯乙烯小白球隨著彈簧不銹鋼帶的變化而變化，然而，伴隨著大多數(shù)便利的集中在輔助培養(yǎng)基貯藏中控制活性（PH和二氧化碳），通過循環(huán)流動(dòng)的培養(yǎng)基，最基本的填充曾在多數(shù)系統(tǒng)中是很普通的，他們相對(duì)容易和擴(kuò)展，這是由于處理圓柱形填充的機(jī)械故障很容易得到排除處理，正如玻璃作為一種基質(zhì)。操作的可靠性得到提高，同時(shí)實(shí)驗(yàn)室研究的 在玻璃表層和細(xì)胞之間的關(guān)系也沒有改變，更愿意不來說，當(dāng)在一個(gè)熟悉的基質(zhì)中形成產(chǎn)品時(shí)，控制新的生物產(chǎn)品的生產(chǎn)者幾乎沒有多大問題。

很顯然，靜態(tài)填充床沒有他們自己的問題?？鐚拥男倍仁窍嗤模瑱z測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞有一些難度，但不能放在顯微鏡下觀察。通過檢測(cè)循環(huán)的培養(yǎng)基的成分，（細(xì)胞生長(zhǎng)的葡萄糖濃度，細(xì)胞分裂的乳酸脫氫酶活性好最終病毒解體），盡管后邊的問題容易處理，但是不均一的多項(xiàng)系統(tǒng)問題仍然存在。

A．J.van Wezel發(fā)展了對(duì)于單層動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)的同種系統(tǒng)。1967年它表明細(xì)胞以火膠棉鍍膜能生長(zhǎng)在0.2mm的葡聚糖纖維素A50顆粒上，憑借微小的攪動(dòng)，這種顆粒可以成懸浮狀態(tài)，相對(duì)密度為1.05，同時(shí)當(dāng)系統(tǒng)從它本身的方式攪拌時(shí)，細(xì)胞可以吸附在這種為載體上，由于這些最初的觀察，眾多的觀察者已經(jīng)表明可以達(dá)到5001的量。生長(zhǎng)在為載體上的細(xì)胞產(chǎn)生物質(zhì)是有可能的。最新報(bào)告表明，來自非洲的猿猴腎細(xì)胞脊髓灰質(zhì)炎病毒的產(chǎn)量是存在一個(gè)現(xiàn)代的為載體表面。其他為載體有聚苯乙烯、聚丙烯甚至是玻璃微球體。然而，在大多數(shù)情況下似乎葡聚糖為載體提供了最合適的基質(zhì)。

眾多研究者已經(jīng)能夠成功可靠的用為載體系統(tǒng)來操作，然而，有些研究人員的實(shí)驗(yàn)還有很大的困難，涉及到研究者所希望生成的特殊細(xì)胞任然有些困難。特殊細(xì)胞本身是集體組成的產(chǎn)物，以及他生成次生產(chǎn)物的方法問題。源于其他合適設(shè)備與不合適設(shè)備的不當(dāng)使用以及培養(yǎng)基選擇的不恰當(dāng)問題上。這些選擇階段或者是細(xì)胞與玻璃粉。首次關(guān)鍵性的聯(lián)合或者時(shí)候起貼壁細(xì)胞的可重復(fù)性。

總之，對(duì)于基質(zhì)有要求的細(xì)胞的生產(chǎn)，在此環(huán)境下，微載體成為首選方法。而且操作良好并且可靠，但是玻璃球的填充層能夠提供一個(gè)可靠的后補(bǔ)系統(tǒng)。其他系統(tǒng)也會(huì)有一定的位置，為準(zhǔn)備一種獨(dú)特的細(xì)胞類型能夠生長(zhǎng)和生產(chǎn)產(chǎn)物提供的特殊的環(huán)境。

8.4.3懸浮細(xì)胞的生產(chǎn)過程

懸浮動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)過程不同于細(xì)菌的培養(yǎng)，一條近期的評(píng)論描述了許多需要檢測(cè)和控制的參數(shù)，所使用的設(shè)備是一個(gè)有較低的攪拌和通風(fēng)度相當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)的發(fā)酵器。把傳統(tǒng)方法當(dāng)作一個(gè)系統(tǒng)，并且此系統(tǒng)已經(jīng)增大到8000L。來自于幼地鼠腎細(xì)胞貨真不同細(xì)胞的用于口啼疫病毒的商業(yè)產(chǎn)物，如此規(guī)模得益于倉(cāng)鼠，也就是所謂的2FFA-3.同樣，有Nsmalwa淋巴細(xì)胞所產(chǎn)生的a-干擾素，目前以同樣的規(guī)模的相似設(shè)備來生產(chǎn)。攪拌驅(qū)使系統(tǒng)的最基本的修改等同于氣升式發(fā)酵罐的運(yùn)用。通過在發(fā)酵罐底部引進(jìn)氣泡來提供三料的混合。因?yàn)檫@些在移動(dòng)也提上是非常有效的而且不會(huì)破壞細(xì)胞。傳統(tǒng)的噴射會(huì)對(duì)動(dòng)物細(xì)胞引起嚴(yán)重的破壞，這種噴射通過產(chǎn)生一些小的氣泡試圖增加氣泡的表層區(qū)域的面積。溶氧水平在標(biāo)準(zhǔn)狀況下本身下降15%一下或者上升到溶氧量以上才會(huì)有害。但在氣液接口處的相互作用的細(xì)胞可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞活性的損失。令人驚奇的是，起因于葉輪的飛快的速度造成的物理攪拌似乎沒有多大傷害，然而，對(duì)于相關(guān)參數(shù)的效應(yīng)和數(shù)量的研究中需要被保留著。

當(dāng)傳統(tǒng)的的不銹鋼槽作為科技的主導(dǎo)時(shí)?？萍疾话l(fā)達(dá)的國(guó)家可能會(huì)修改一些系統(tǒng)。對(duì)此通過外磁條力量來驅(qū)動(dòng)，101攪拌瓶可以制造出許多有用的疫苗，（每年均有5*106劑）。印度尼西亞的泗水市安裝了此系統(tǒng)。在此地，每個(gè)月將產(chǎn)生250000劑疫苗。同樣Polgolla和斯里蘭卡基本設(shè)備的安裝也很到位。

生產(chǎn)細(xì)胞還是為這些細(xì)胞收集信息，動(dòng)物細(xì)胞的連續(xù)培養(yǎng)是可行并且有用的方式。最近研究已經(jīng)表明了在系統(tǒng)的計(jì)算機(jī)在線監(jiān)測(cè)和控制的優(yōu)勢(shì)。購(gòu)買相應(yīng)的計(jì)算機(jī)硬件設(shè)備也比較容易。

然而動(dòng)物細(xì)胞的連續(xù)型生產(chǎn)利用以及具有商業(yè)吸引力的細(xì)胞產(chǎn)物還，沒有實(shí)現(xiàn)。

8.5后期過程

當(dāng)動(dòng)物細(xì)胞應(yīng)用于原材料生產(chǎn)時(shí)，許多后期過程等同于蛋白質(zhì)化學(xué)技術(shù)的其他領(lǐng)域。仍然考慮到存在些更多的獨(dú)特細(xì)節(jié)的操作系統(tǒng)。例如，過濾、篩選操作，離心分離操作（適速），沉降操作，包析發(fā)的層析操作以及濃縮干燥（反滲透法），這些普通的加工技術(shù)很難應(yīng)對(duì)，生物病毒物質(zhì)的鈍化，整個(gè)病毒顆?；钚宰訂卧漠a(chǎn)生以及用于有用物質(zhì)的形成具有劃時(shí)代意義。而這種劃時(shí)代是以動(dòng)物細(xì)胞為根據(jù)的獨(dú)特的處理工程。

8.5.1鈍化作用

盡管許多疫苗是由易感染的病毒粒子形成，但是一些被殺死或鈍化。鈍化在確保接受著沒有沒有危險(xiǎn)是非常重要的，鈍化藥物通常使用甲醛，然而用B—丙醇酸內(nèi)酯來鈍化狂犬病毒。進(jìn)來。用亞胺（乙炔和吖丙叮）來鈍化腳口疾病病毒。然而亞胺會(huì)使腳口疾病病毒的結(jié)構(gòu)發(fā)生輕微的變化。甲醛與衣殼體交聯(lián)形成更穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。其他鈍化法的紫外線輻射和縮水甘油醛，在所有鈍化方法中，確保鈍化的病毒具有單分散性是非常重要的，以至于失活劑不能阻止病毒在中型團(tuán)塊中有效的鈍化。

8.5.2亞基的形成

病毒疫苗必須考慮接受疫苗者的危險(xiǎn)，如果不適當(dāng)?shù)拟g化可能會(huì)形成亞基。依靠亞基的裂解最終將會(huì)形成一小部分致疾病的病毒。能夠形成亞基的病毒有狂犬病毒，肝炎病毒、單純性皰疹、巨細(xì)胞病毒和流感病毒。近來，嘗試從流感病毒中分離血凝素糖蛋白免疫原表明疫苗的有效性了、，盡管有效性和天然病毒不同，到目前為止，研究表明從病毒中分離出的糖蛋白的競(jìng)爭(zhēng)性比原始病毒低。但當(dāng)足夠的材料管理可以得到足夠的保護(hù)反應(yīng)。8.5.3產(chǎn)品配方

活的病毒疫苗通常包含1~4種不同類型的病毒。每劑有10活性病毒，有些材料需要冷凍干燥保存再生物保護(hù)劑中像流感病毒，人或牛的牛痘病毒或血清蛋白谷氨酸鹽和磷酸鹽離子。另一方面，殺死的病毒疫苗大約10為一劑.這些混合物被稱為佐劑，佐劑有強(qiáng)效的生物免疫原特性。佐劑的化學(xué)組成是不均等的，像強(qiáng)心苷、皂素、各種鋁鹽（氫氧化物，硫酸鹽。磷酸鹽）和一些確定的油脂，與水中懸浮的病毒均勻的發(fā)生生物交聯(lián)結(jié)合形成水油乳狀混合物。油水乳狀物在含有去垢劑的無機(jī)鹽水溶液中經(jīng)過第二次乳化作用。這些物質(zhì)的作用許多是一致的，他們促使身體和化學(xué)免疫系統(tǒng)最大速率合成大量的有用抗原。

8.6 基因工程動(dòng)物細(xì)胞和細(xì)菌

在原核細(xì)胞和真核細(xì)胞中插入確定的核酸序列的能力對(duì)于細(xì)菌和動(dòng)物細(xì)胞具有很廣泛的意義。作為一種產(chǎn)物，蛋白質(zhì)能夠插入特定的核酸。而基于動(dòng)物細(xì)胞的活的病毒疫苗形成過程不可能取代基于基因工程細(xì)菌的過程。這是清楚的，一些動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)的胰島素和一些α-干擾素商業(yè)上用原核生物生產(chǎn)。另外一些像用于口蹄疫病毒

3的死的病毒疫苗，骨髓灰質(zhì)炎和各種干擾素商業(yè)上可以在細(xì)胞類型生產(chǎn)。然而，基因工程動(dòng)物細(xì)胞能夠使蛋白質(zhì)糖基化成為更受歡迎的基質(zhì)用于人生長(zhǎng)激素，馬血溶性酶誘導(dǎo)物，組織血纖維蛋白溶原激活劑的生產(chǎn)。我們目前看到了備受爭(zhēng)議的生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)新時(shí)代的開端?，F(xiàn)在自信的預(yù)測(cè)未來的發(fā)展前景還很難，但是這些多潛力的方法必將給我們將來制造生物產(chǎn)品帶來很大的沖擊。

第四篇：細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)總結(jié)

血清使用問題的總結(jié)

一、血清滅活問題。

1、問：加到培養(yǎng)基中的血清必須滅活嗎？ 答：不是必須的，看做什么實(shí)驗(yàn)了。

2、問：四季青胎牛血清滅活是56℃30分鐘嗎？

答：如果用于培養(yǎng)大多數(shù)的腫瘤細(xì)胞，血清一般是不需要滅活的，這樣可以有效保存血清中的生長(zhǎng)因子。但是如果用于培養(yǎng)一些表面具有補(bǔ)體受體的細(xì)胞，如內(nèi)皮細(xì)胞，血清是需要滅活，一般是56℃，30min。

3、問：我要做滋養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)，胎牛血清要滅活嗎？

答：進(jìn)口的一般都已滅活，國(guó)產(chǎn)的不一定，最好還是滅活一下再用較安全。

4、問：我用病毒上清轉(zhuǎn)染細(xì)胞，培養(yǎng)用的血清需要滅活嗎？因?yàn)檠逯锌赡苡行┭a(bǔ)體和抗體，是不是會(huì)影響轉(zhuǎn)染？我想未滅活的血清中含些抗體補(bǔ)體可能會(huì)和病毒相結(jié)合，影響轉(zhuǎn)染，正確嗎？細(xì)胞是單核細(xì)胞白血病細(xì)胞，病毒是病毒包裝細(xì)胞PT67收集的病毒上清。為什么要用無血清培養(yǎng)基加病毒孵育幾小時(shí)，目的是什么？

答：血清一定要滅活，可以先用無血清培養(yǎng)基加病毒孵育幾小時(shí)以后再加血清。避免雜蛋白對(duì)病毒和宿主結(jié)合過程的干擾，一般是2-6小時(shí)，根據(jù)細(xì)胞的狀態(tài)決定。血清不一定需要滅活，滅活的目的是將血清中的補(bǔ)體滅活！這要根據(jù)實(shí)際情況而定，如果沒有把握那就滅活吧，也不麻煩56度半個(gè)小時(shí)。

5、問：(1)我買的是杭州四季青的新生牛血清，要滅活嗎？有些說法是需要，有些說直接解凍后就可以加入到培養(yǎng)基中；我配制胰蛋白酶液，用的是D-PBS，有關(guān)系嗎？

答：關(guān)于血清的熱滅活，是很多人感興趣也存在一定爭(zhēng)議的話題。大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室將血清的熱滅活還是作為常規(guī)來執(zhí)行，因?yàn)橛袃蓚€(gè)作用，第一是滅活補(bǔ)體，第二是滅活血清中可能存在的支原體。但是實(shí)驗(yàn)者并沒有考慮熱處理對(duì)血清中的生長(zhǎng)因子、氨基酸等成分帶來的負(fù)面影響。

我在實(shí)驗(yàn)室處理血清的時(shí)候，有一次水浴箱在滅活過程中出現(xiàn)故障，溫度升高到80℃，血清變成了凝膠狀，我重新處理了另外一份血清，將兩份血清對(duì)比，發(fā)現(xiàn)高溫直接影響到血清所含的抗體蛋白。在56℃下滅活半小時(shí)以上，肯定也會(huì)對(duì)里面的蛋白起到破壞作用。下次有機(jī)會(huì)我做個(gè)延長(zhǎng)滅活時(shí)間的實(shí)驗(yàn)試試，看看到底有多大的影響。熱滅活之后，血清放在四度冰箱久了，就會(huì)有沉淀產(chǎn)生，這常常會(huì)被認(rèn)為是微生物污染或者是黑膠蟲污染。為了驗(yàn)證到底有沒有污染，常常又會(huì)把血清放置37℃溫育，但是血清中的蛋白會(huì)進(jìn)一步析出，最后還是要做鏡檢，無菌培養(yǎng)試驗(yàn)，和革蘭氏染色試驗(yàn)，非常麻煩。

我看過一份資料，里面提到70%的實(shí)驗(yàn)者認(rèn)為滅活是理所當(dāng)然的。常規(guī)滅活建議的溫度在45℃到62℃之間，而時(shí)間則從15分鐘到60分鐘不等。其中最常用的手法是56℃熱處理30分鐘。隨著血清采集、處理、加工工藝的提高，許多早先認(rèn)為是熱滅活的原因已經(jīng)不再成立，只有少數(shù)對(duì)血清進(jìn)行熱滅活的研究者在實(shí)驗(yàn)中證實(shí)了這一步驟的有效性和必要性。有人比較過11個(gè)不同細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn)其中熱滅活對(duì)6 個(gè)細(xì)胞株(HBAE，MDBK，Vero，成纖維細(xì)胞，MRC-5)的生長(zhǎng)帶來負(fù)面影響，三個(gè)細(xì)胞株(FOX-NY，MDCK和CHO-K1)不受熱滅活的影響，而只有兩個(gè)細(xì)胞株(Balb/3T3，Sp2/0Ag14 hybrid)，在熱滅活之后，細(xì)胞生長(zhǎng)有輕微的改善。所以，在正常的操作下，熱滅活通常對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)沒有明顯的促進(jìn)作用。

你可以摸索一下，血清從-20℃冰箱拿出來之后在常溫解凍，然后混勻分裝成兩份，一份滅活，一份不滅活，比較這兩種血清對(duì)細(xì)胞是否有影響。然后再確定是滅活還是不滅活。這個(gè)過程最多也就一個(gè)星期。同時(shí)你還要考慮血清滅活與否對(duì)你后續(xù)的實(shí)驗(yàn)有沒有影響。

問：(2)分裝后的血清從-20℃取出放4℃讓其液化，卻見血清比較混濁，有沉淀產(chǎn)生，這屬正常嗎？ 答：正常。

二、血清滅活時(shí)溫度問題。

1、問：因?yàn)閷?shí)驗(yàn)室水浴鍋失控，血清滅活時(shí)，溫度到了61.7℃，這血清還能用嗎？

答：多長(zhǎng)時(shí)間??？短時(shí)間應(yīng)該可以吧，我有一次加熱了一個(gè)多小時(shí)，還照樣用。

2、問：我滅活胎牛血清時(shí)，用的電磁爐，定在了70℃，本來說調(diào)溫度到56℃再放血清的，后來忘了，就把血清放進(jìn)去了，所以滅活的溫度肯定超過56℃了，不知道這樣對(duì)血清有沒有影響？

答：常規(guī)滅活建議的溫度在45℃到62℃之間，而時(shí)間則從15分鐘到60分鐘不等，其中最常用的手法是56℃熱處理30分鐘?？纯茨沭B(yǎng)的細(xì)胞是什么，一般的話估計(jì)問題不大，要是很珍貴的細(xì)胞還是慎重一點(diǎn)啊。熱滅活目的是為了去除血清中補(bǔ)體等對(duì)熱敏感的物質(zhì)，在對(duì)補(bǔ)體滅活以外，熱處理同時(shí)也對(duì)血清中可能存在的支原體具有滅活作用。現(xiàn)在好像不主張熱滅活，熱滅活經(jīng)常給血清產(chǎn)品帶來負(fù)面影響，對(duì)血清的加熱經(jīng)常導(dǎo)致血清中沉淀的產(chǎn)生，此外，有研究結(jié)果證實(shí)熱滅活步驟減弱了胎牛血清和小牛血清對(duì)細(xì)胞的促粘附作用。

三、血清的制備方法問題。

1、問：我的實(shí)驗(yàn)需要自己制備一些血清用于培養(yǎng)細(xì)胞，有沒有人知道用于培養(yǎng)細(xì)胞的血清需要怎樣的制備過程？

答：自己制備血清當(dāng)心污染啊。如果無菌條件好的話，用靜置析出方法就行。

2、問：一般我們用得胎牛血清用前還要滅活，我想用大鼠的血，不知道要不要滅活？

答：你直接把采來的血液在離心管里4℃過夜，離心，取上清，在無菌過濾，也可滅活，然后分裝凍存，用時(shí)再配。

3、問：如果滅活會(huì)不會(huì)對(duì)血清中的一些因子有損傷？

答：加熱可以滅活補(bǔ)體系統(tǒng)。激活的補(bǔ)體參與溶解細(xì)胞事件，刺激平滑肌收縮，細(xì)胞和血小板釋放組胺，激活淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。在進(jìn)行免疫學(xué)研究、培養(yǎng)ES細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞時(shí)，推薦使用熱滅活血清。滅活一般不會(huì)對(duì)血清中的一些因子損傷的。

四、血清的保存問題。

1、問：2006年6月到期的GIBCO胎牛血清到2007年5月還能用嗎？ 答：只有試試了，如果一直在-20℃凍著來者，應(yīng)該還可以，先少用點(diǎn)看看。養(yǎng)細(xì)胞系應(yīng)該沒問題，原代不行。

2、問：請(qǐng)問我自然溶化好的胎牛血清和1640培養(yǎng)基今天用不上，明天用，我不想放到冰箱里，放在室溫下一晚行嗎？100毫升培養(yǎng)瓶加多少培養(yǎng)基呢？

答：可以放4℃。4-5ml。

3、問：4℃冰箱內(nèi)保存3個(gè)月的胎牛血清，能否繼續(xù)使用？相關(guān)細(xì)胞和其它試劑的代價(jià)比較高，不敢輕易嘗試。

答：需要長(zhǎng)期保存的胎牛血清必須要保存在-20至-70℃的低溫冰箱中，4℃冰箱中保存時(shí)間不要超過1個(gè)月。

五、FBS可否代替人AB型血清？

問：我現(xiàn)在在做人的外周血b淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)，文獻(xiàn)上要求用人的AB型血清，但是我覺得很多代理商都沒有。我想FBS代替，但不知道可否，我先是擔(dān)心免疫排斥之類，但是我查了些資料后，應(yīng)該不會(huì)(我覺得)。但是我又不能夠TRY。因?yàn)榧?xì)胞因子確實(shí)太貴了，所以咨詢一下。謝謝！答：你最好照文獻(xiàn)的做。除非你系列實(shí)驗(yàn)證明你用代用品的結(jié)果與文獻(xiàn)的相同(你還是要用到文獻(xiàn)的試劑)。細(xì)胞培養(yǎng)的影響因素很多，特別是培養(yǎng)基的成分。

六、血清和培養(yǎng)基的種類及品牌問題。

1、問：細(xì)胞培養(yǎng)的胎牛血清用哪個(gè)公司的產(chǎn)品比較好呢？周圍有人用PAA或Hyclone的，這兩種跟Gibco或sigma出品的差別大嗎？ 答：如果是長(zhǎng)得非?？斓眉?xì)胞如pa317，293，c6等惡性腫瘤細(xì)胞，一般得國(guó)產(chǎn)血清就可以，如果是原代培養(yǎng)的細(xì)胞，最好應(yīng)用胎牛血清或類標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清，Hyclone公司血清的質(zhì)量不如GIBCO(同類血清)。國(guó)產(chǎn)的杭州四季青和甘肅民海(中美和資)不錯(cuò)。有些細(xì)胞(如：sf9，293還有其他一些元代細(xì)胞)，用Gibco的比其他兩種好很多，會(huì)大大加速試驗(yàn)進(jìn)度。對(duì)于其他一些細(xì)胞(如：vero，MDCK，pk)四季青，Hyclone的小牛血清足矣！另外，Gibco的還要看產(chǎn)地。

2、問：最近要訂一瓶胎牛血清，實(shí)驗(yàn)室之前都在用小牛血清，沒有買過胎牛血清。請(qǐng)問哪個(gè)公司的好一些？問過試劑公司，有兩種：一種是PAA的(分普通級(jí)和優(yōu)級(jí))，一種是Hyclone的(只有普通級(jí)，而且是新西蘭產(chǎn)的)。試劑公司推薦使用PAA優(yōu)級(jí)的，但看好多文獻(xiàn)都用Hyclone的，公司說是因?yàn)楝F(xiàn)在Hyclone的都不是美國(guó)進(jìn)口的了。請(qǐng)問用的哪種胎牛血清比較好？

答：民海的效果還不錯(cuò)，要是不放心國(guó)產(chǎn)的，那就買進(jìn)口的。進(jìn)口的好多公司都有，新西蘭產(chǎn)的效果一般。Hyclone和Gibco的都還可以。民海的似乎比四季青的要好些。復(fù)蒙的感覺也不錯(cuò)。

3、問：四季青“無噬菌體、低內(nèi)毒素胎牛血清”與“無支原體胎牛血清”的區(qū)別？培養(yǎng)腫瘤傳代細(xì)胞用哪一個(gè)比較好些？ 答：用無支原體胎牛血清就可以啦。

4、問：SKBR-3細(xì)胞培養(yǎng)用哪種型號(hào)的1640培養(yǎng)基及胎牛血清？ 答：我一直用GIBCO的1640，你可以買含HEPES的1*10L的包裝，胎牛血清也是用的GIBCO，10%就行。請(qǐng)查閱： 004km.cn

七、培養(yǎng)基血清濃度問題。

問：在1640里加血清時(shí)加多了，90ml里加了20ml血清，約為18%，以前都是加10ml的，查了網(wǎng)上多建議用10%-15%，有關(guān)系嗎？

答：我認(rèn)為一般來說血清濃度的較大波動(dòng)對(duì)細(xì)胞的狀態(tài)影響較大，建議再加90ml1640調(diào)成10%。血清濃度大當(dāng)然細(xì)胞狀態(tài)感覺要好，但是高濃度的血清可能改變細(xì)胞的基因表達(dá)譜，影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。10%的濃度培養(yǎng)鼻煙癌細(xì)胞很好。

八、心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)時(shí)血清的使用問題。

1、問：在進(jìn)行心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)時(shí)，需要用含血清的培養(yǎng)基中止胰酶的消化作用，我現(xiàn)在使用的是含血清10%的培養(yǎng)液，但近日看北醫(yī)一個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)的課件發(fā)現(xiàn)，有用1%血清培養(yǎng)液進(jìn)行中止消化的，想問一下，1%的是否可以，效果是否有保證？這樣確實(shí)能節(jié)省不少血清的。答：關(guān)于心肌細(xì)胞元代培養(yǎng)的FBS問題：

(1)1%的血清完全培養(yǎng)基可不可以，得看你胰酶的用量。但是在心肌細(xì)胞元代培養(yǎng)就不行。10%的FBS完全培養(yǎng)基效果都不太好，開始心肌細(xì)胞元代培養(yǎng)需要高濃度的FBS，20%左右，但這就有出現(xiàn)另一個(gè)問題，在FBS完全培養(yǎng)基中，成纖維細(xì)胞呈優(yōu)勢(shì)細(xì)胞，須得在培養(yǎng)基加入適量的BrdU以抑制其生長(zhǎng)，純化心肌細(xì)胞。

(2)FBS的作用不僅僅是拿來中和胰酶，只是FBS中的一些蛋白質(zhì)如α-巨球蛋白等有抑制胰酶活性作用。

(3)元代心肌細(xì)胞培養(yǎng)的FBS使用，有講究：剛開始使用20%左右的高濃度的FBS，后逐漸遞減為無血清的DMEM/F-12培養(yǎng)基培養(yǎng)。

2、問：我胰酶的用量是0.08%，并混和了0.08%的膠原酶。FBS要高濃度遞減是否是說的在細(xì)胞培養(yǎng)中啊，難道在消化時(shí)終止也需要如此高的濃度嗎，還有，我的BRDU只用到48小時(shí)就不用了，因?yàn)閾?dān)心其損傷太大，可以持續(xù)用多久呢？

答：我用10%FBS終止的，然后差速1h，然后還是用10%FBS的HG-dmem養(yǎng)的，沒有用brdu，心肌細(xì)胞還是比較多和穩(wěn)定的，我第3天就可以用，第2天晚上看就會(huì)有搏動(dòng)。

九、牛血清污染噬菌體的問題。

1、問：有誰知道小牛血清制造過程中怎樣能夠避免噬菌體的污染，以及對(duì)已污染噬菌體的牛血清怎樣能夠除去噬菌體？

2、問：我也想知道，我用的血清中大部分都有噬菌體，它對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)到底有什么影響？ 暫無回答。

十、問：MTT加藥的時(shí)候加不加血清？加藥時(shí)要用無血清的培養(yǎng)基嗎？ 答：我的藥就是用含血清的培養(yǎng)基稀釋的，不含血清的培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞有毒性或抑制作用，無形中對(duì)細(xì)胞造了一個(gè)serum-free的模型，細(xì)胞在提內(nèi)本來就是有血清供應(yīng)，如果該藥物都不能對(duì)抗，那該藥物就沒有什么臨床價(jià)值了，這是我的理解。

十一、AB血清的制備問題。

問：本人想從人的外周血中分離AB血清的，用于B淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)。謝謝大家給點(diǎn)建議。人的血，來之不易啊。答：是AB血型人的血清嗎？這種血清即沒有抗A型抗原抗體，也沒有抗B型抗原抗體。分離血清時(shí)將采集的血液注入試管中，待血液凝固后離心分離血清?？蓪⒉杉难悍旁?7℃水浴箱中促進(jìn)血液凝固，減少凝固時(shí)間。離心可在2500～3000rpm，10min，足可以分離血清。分離后將血清吸出保存即可。分離血清的量可按采集血液的50%左右計(jì)算，因?yàn)榧t細(xì)胞占總血液的50%左右。當(dāng)然整個(gè)過程要注意無菌操作。

十二、PC12細(xì)胞培養(yǎng)所用血清問題。

問：我正準(zhǔn)備購(gòu)買上海細(xì)胞所的未分化的PC12細(xì)胞，需要滅活的馬血清，可現(xiàn)在買血清很困難，好像是海關(guān)有封鎖，代理商這么說的，我原定購(gòu)買的Gibco的horse surum，現(xiàn)在無法買到了，好容易找到一個(gè)目前可以進(jìn)血清的公司Hyclone，有一種Donor Equine serum是馬血清嗎？

答：Hyclone的Donor Equine serum可以用，我以前用的就是這個(gè)。我當(dāng)時(shí)是在鼎國(guó)(重慶辦事處)買的，100ml大概140元，具體不記得了。當(dāng)時(shí)是看它比別的進(jìn)口的馬血清便宜。另外：我買了以后滅活的。

十三、血清或培養(yǎng)基產(chǎn)生了顏色或沉淀的問題：

1、問：我用的是四季青的胎牛血清，56℃30分鐘滅活后出現(xiàn)了白色少量絮狀沉淀，是不是污染？還能不能再用？血清的生產(chǎn)日期是2006年7月(現(xiàn)在是2007年6月11日)。

答：應(yīng)該問題不大。你可以取少量血清放入培養(yǎng)皿中，37℃過夜培養(yǎng)看看就知道是否污染了。血清中沉淀物的出現(xiàn)有許多種原因，但最普遍的原因是由于血清中脂蛋白的變性所造成，而血纖維蛋白(形成凝血的蛋白之一)在血渭解凍后，也會(huì)存在于血清中，亦是造成沉淀物的主要原因之一。但這些絮狀沉淀物，并不影響血清本身的質(zhì)量。若您欲去除這些絮狀沉淀物，可以將血清分裝至無菌離心管內(nèi)，以400g稍微離心，上清液即可接著加入培養(yǎng)基內(nèi)一起過濾。

2、問：我用MTT法測(cè)細(xì)胞的增殖，用DMSO裂解細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)把DMSO加入到孔中就會(huì)形成乳白色(用的含胎牛血清的1640培養(yǎng)基，由于沒有離板子的離心機(jī)，所以沒有去除培養(yǎng)基直接加的DMSO)。以前用含小牛血清的培養(yǎng)基沒有看到有這種情況。該怎么解決？

答：為什么要用離心機(jī)離心呢？難倒你養(yǎng)的是懸浮細(xì)胞嗎？如果是貼壁細(xì)胞的話直接將MTT倒掉，再加DMSO即可，我們就是這么做的，效果很好！并且測(cè)細(xì)胞的增殖的話如果不去掉MTT就加DMSO的話誤差應(yīng)該很大！有時(shí)不一定就是血清的原因，可能跟你的MTT放置的時(shí)間或以及其他成分有關(guān)！

3、問：(1)GIBCO胎牛血清500ml，今天解凍后沒有混勻直接分裝，結(jié)果使得前面的幾管是清亮的，后面就帶有棕色的，不知有沒有影響？估計(jì)有什么影響？前面的成分好還是棕色的成分好啊？

答：肯定有。最好還是重新混合重新分裝，我覺得有效成分會(huì)集中在棕顏色部分。

問：(2)為什么會(huì)出現(xiàn)棕色呢？

答：血清中的棕色多一些可能是因?yàn)榧t蛋白的含量高些的緣故吧。問：(3)血清滅活之后可以存放嗎？我的是前天滅活的，但是沒有加到培養(yǎng)基里，而是放在冰箱里，那下次可以直接用嗎？還是再次滅活?。?答：當(dāng)然可以，如果多的話，分裝后最好放在－20℃，下次用時(shí)再解凍，也不用再滅活。最好用一管拿一管，少許血清可以放在4℃。分裝時(shí)還要注意不要裝得太滿，以免溢出污染。

十四、問：懸浮細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)能否加血清？如果加了會(huì)有什么結(jié)果？為什么懸浮細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)就不能加血清？

答：血清是細(xì)胞培養(yǎng)基中重要的培養(yǎng)成份之一，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有廣泛影響。在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，我們通常會(huì)加入10%的血清。血清的質(zhì)量對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)的成功至關(guān)重要。一般說來，牛血清包括以下成分：生長(zhǎng)因子(如激素，白細(xì)胞介素等)，他們可以促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)；貼附因子，他們可以促進(jìn)細(xì)胞的貼壁，往往只有細(xì)胞貼壁才能增值(懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞除外)；蛋白質(zhì)(如血清白蛋白，球蛋白等)，既可以作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，又可以中止胰酶的作用；還有很多成分不明的物質(zhì)。血清還可以起到解毒作用，如脂肪酸、重金屬和某些蛋白酶的毒性。血清還可以是細(xì)胞免受機(jī)械損傷。因此，無論是貼壁細(xì)胞還是懸浮細(xì)胞，血清是必不可少的。除非因?qū)嶒?yàn)要求無血清培養(yǎng)時(shí)，例如：為使細(xì)胞同步化時(shí)，我們會(huì)采用無血清培養(yǎng)的。單純的說懸浮細(xì)胞培養(yǎng)不能加血清就沒有太多的道理了。

十五、Gibico的胎牛血清內(nèi)是否含糖？

問：我想做糖誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的試驗(yàn)。細(xì)胞培養(yǎng)液里加入了20%的胎牛血清。因此胎牛血清里是否含有糖對(duì)我實(shí)驗(yàn)的培養(yǎng)液糖終濃度影響比較大。今天打電話問GIBCO公司的技術(shù)顧問，回答我糖濃度少于5μg/ml，因此基本可認(rèn)為是不含糖。但我今天把胎牛血清送到我們醫(yī)院檢液科，結(jié)果卻是：6.2mmmol/l(葡萄糖氧化酶法)。難道是檢測(cè)人血清的血糖濃度的方法不能用于檢查牛血清嗎？(另起茶水驗(yàn)?zāi)蚴录?檢驗(yàn)科沒有給我回答。答：應(yīng)該是不含糖的。請(qǐng)參照gibco的網(wǎng)站：http://004km.cn/content/sfs/brochures/B_08A00_0619_FBS_bro.pdf。第五頁我做了個(gè)記號(hào)。直接點(diǎn)擊鏈接就可以看到它的說明書頁面。我想我們肯定要以公司的說明書為準(zhǔn)。至于為什么檢驗(yàn)科測(cè)起來有誤差，我想可能是樣本不一樣，需要用標(biāo)志品矯正有關(guān)。具體需要檢驗(yàn)科的戰(zhàn)友解釋了。

十六、關(guān)于中和消化液需要的血清量。

問：用胰蛋白酶消化細(xì)胞后，需要用血清中和。具體這種中和作用所要求的胰蛋白酶和血清之間的比例是多少？

答：做了很久的試驗(yàn)，真的沒有想過胰酶和血清的對(duì)應(yīng)關(guān)系。不過細(xì)想下來，這個(gè)應(yīng)該也沒有固定的比值。血清的品種都是不同的，成分必然有差異，如何能確定其與胰酶的比值關(guān)系？我們消化細(xì)胞的時(shí)候，如果是傳代，細(xì)胞變形后，吸出胰酶直接加入適量的hanks液或者全培，這個(gè)量看自己的喜好和吹打細(xì)胞方便而定。一般都可以中止消化的。不會(huì)存在繼續(xù)消化的事情。如果是從組織上消化細(xì)胞做原代培養(yǎng)，我一般都使用全培進(jìn)行中止，而且加的很多，0.25%的胰酶，用10%血清，按1:2的比例應(yīng)該是足夠的。當(dāng)然全培是2，一般我養(yǎng)細(xì)胞的時(shí)候，會(huì)用國(guó)產(chǎn)的比較便宜的血清配制全培，專門用于中止消化，這樣有幾個(gè)好處：一是中止消化的效果應(yīng)該好于hanks液吧，再是也有利于維持細(xì)胞活性。而且這部分液體會(huì)被離心去掉，血清便宜，離心掉了不會(huì)心疼。而養(yǎng)細(xì)胞的時(shí)候用好血清。個(gè)人觀點(diǎn)，僅供參考。

十七、血清中的懸浮物問題。

1、問：發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)的細(xì)胞瓶中背景有許多的小黑點(diǎn)，培養(yǎng)液中也有一些漂浮的物。看了之前的帖以為是膠原蟲。本打算換液，換液前特意看了下前些天配的培養(yǎng)液，肉眼發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液中有懸浮的顆粒狀物質(zhì)(不多)，于是放在鏡下觀察，新鮮培養(yǎng)液中有一些懸浮的小顆粒，不多。(培養(yǎng)液是R1640+20%牛血清+1%雙抗)于是又將分裝在4℃保存的小牛血清拿出觀察，肉眼可見5、6個(gè)白色小小球狀的物質(zhì)，在血清瓶稍靠下的部位懸浮。鏡下觀察，也有少量的不知什么物質(zhì)的東西漂浮。小牛血清是Hyclone新西蘭的，標(biāo)簽上寫已經(jīng)經(jīng)過2μm濾膜過濾處理。根據(jù)上述培養(yǎng)液的情況，是否說明培養(yǎng)液已被污染？如果是正常的血清是不是在鏡下不應(yīng)該看到雜物，哪怕是極少量的？根據(jù)上述血清的描述，是不是說明血清也存在問題，還能用嗎？補(bǔ)充：細(xì)胞培養(yǎng)以來生長(zhǎng)狀態(tài)就不好。買血清的時(shí)候廠家說明不用滅活，所以未滅活。

答：(1)血清應(yīng)該-20℃保存，解凍血清時(shí)，請(qǐng)按照的逐步解凍法(-20℃至4℃至室溫)，若血清解凍時(shí)改變的溫度太大實(shí)驗(yàn)顯示非常容易產(chǎn)生沉淀物。(2)血清中沉淀物的出現(xiàn)有許多種原因，但最普遍的原因是由于血清中脂蛋白的變性所造成，而血纖維蛋白在血清解凍后，也會(huì)存在于血清中，亦可造成沉淀物。(3)若您一次無法用完一瓶，建議您無菌分裝血清，再放回冷凍，若存放于4℃時(shí)，請(qǐng)勿超過一個(gè)月，儲(chǔ)存在2－8℃時(shí)，血清中的各種蛋白和脂蛋白，可能聚集而形成沉淀或可見的混濁。

(4)解凍血清時(shí)，請(qǐng)隨時(shí)將之搖晃均勻，使溫度及成分均一，減少沉淀的發(fā)生。

(5)排出了血清的原因，在考慮實(shí)驗(yàn)用品和無菌操作的問題。

(6)細(xì)菌病毒、衣原體、黑膠蟲污染也很常見，如果細(xì)胞死的太多，影響較大建議更換培養(yǎng)液。

2、問：今天在配培養(yǎng)液時(shí)，發(fā)現(xiàn)血清里面有小碎片樣的漂浮物，血清仍然清亮，不渾濁。不知道是什么，問了實(shí)驗(yàn)室的學(xué)長(zhǎng)，說仍然可以用，但還是不放心，沒有用血清。求助園子的各位達(dá)人，這可能是血清出了什么問題？我的血清用了一個(gè)月不到，四季青的。

答：可能的原因：(1)培養(yǎng)液配置時(shí)Votex不夠，當(dāng)時(shí)是清亮的，但過一段時(shí)間會(huì)析出來；(2)真菌污染。

十八、污染和過濾的問題。

1、問：懷疑血清染菌，想用濾膜過濾一下，可否自己用0.22μm濾膜過濾？對(duì)血清性質(zhì)有多大影響？有做過的么？

答：可以過濾的，血清當(dāng)出廠時(shí)都是0.22μm或0.1μm過濾除菌。想證明有沒有染菌不用過濾這么麻煩，只要放置于37℃過夜就可以了，如果有微生物污染會(huì)變渾濁的，如果還是澄清的就說明沒有問題的。實(shí)驗(yàn)室中血清很難直接過濾，一般要加到培養(yǎng)基中再過濾。我們實(shí)驗(yàn)室制備培養(yǎng)基時(shí)，都使用濾膜過濾，一般而言如果制備1-2瓶培養(yǎng)基，一個(gè)濾膜及一支30ml注射器可以過濾50ml小牛血清。如果大量制備培養(yǎng)基也可以將血清加到培養(yǎng)基中，使用0.22微米的大濾膜一起過濾。

2、問：我懷疑我用的完全1640培養(yǎng)液被污染了，準(zhǔn)備重新過濾消毒，過濾后是否需要補(bǔ)充胎牛血清？如需又如何補(bǔ)充？

答：完全1640培養(yǎng)液被污染了，如果是支原體的話，過濾沒有作用，支原體可以通過濾膜。我們用1640液，都是配液后保留500ml，然后其他的分裝100-200ml，現(xiàn)用現(xiàn)配因?yàn)檠灞?640要貴，如果你想過濾的話，建議你加原比例血清，因?yàn)檠宀粫?huì)很容易通過濾膜。最主要的還是找到可能污染的原因。

3、問：加好了血清雙抗的培養(yǎng)基由于污染了再過濾后還能用嗎？ 答：建議不要用了。在加了雙抗的情況下已經(jīng)污染，那么細(xì)菌污染的可能性會(huì)較小了。一般的過濾除不能去除病毒或者部分真菌的污染的。

4、問：我準(zhǔn)備把使用的完全1640培養(yǎng)液重新過濾一遍，不知道培養(yǎng)液中的血清成分是否能通過濾膜，過濾后是否還需要補(bǔ)充胎牛血清？如需又如何補(bǔ)充？

答：可以透過，但是隨著液體量的增多會(huì)很慢，如果不加壓會(huì)比較麻煩，還有最好用低蛋白吸附的，不然損失是比較大的。

十九、更換無血清培養(yǎng)基后細(xì)胞大量死亡的問題。

問：我使用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染成骨細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染前要換上無血清的培養(yǎng)基。本來?xiàng)l件模的好好的，轉(zhuǎn)染效率也可以接受。但是寒假一回來就發(fā)生了怪事：細(xì)胞在有血清的培養(yǎng)基中長(zhǎng)的好好的，一換無血清的培養(yǎng)基就死亡。大概4個(gè)小時(shí)就能看到較多的細(xì)胞飄起來。但是原來我換無血清培養(yǎng)基，就算放那里10個(gè)小時(shí)都是沒問題的啊。已經(jīng)換了不同批次的培養(yǎng)基，甚至吸管什么的都換過了，但是就是不行，是怎么回事？

答：(1)兩周后的培養(yǎng)液應(yīng)補(bǔ)加谷氨酰胺，或者重新配液，轉(zhuǎn)染時(shí)應(yīng)不含抗生素。

(2)確認(rèn)操作方法和環(huán)境，建議檢查一下。

(3)Lipofectamine2000，脂質(zhì)體的毒性很大，如果有質(zhì)粒參與對(duì)細(xì)胞損傷更大，如果Lipofectamine2000在常溫放置過，對(duì)細(xì)胞更大，假期冰箱是否斷過電。

(4)培養(yǎng)箱的溫度、c02濃度，濕度。

二十、完全培養(yǎng)液的相關(guān)定義。

問：“完全培養(yǎng)液一詞”，是指加了血清的培養(yǎng)液?jiǎn)?？我在做含藥血清的?shí)驗(yàn)，涉及到血清添加量的問題。所以想弄明白文中所指的“完全培養(yǎng)液”是否是含藥血清。

答：原液是指配置后過濾除菌。不完全培養(yǎng)液是指不含有血清的原液，其他成分已補(bǔ)充。完全培養(yǎng)液是指不完全培養(yǎng)液加入血清后稱完全培養(yǎng)液。二

十一、血清相關(guān)知識(shí)總結(jié)。使用胎牛血清的注意事項(xiàng)：

血清是細(xì)胞培養(yǎng)中最重要的元素之一。下面是實(shí)驗(yàn)室里常會(huì)遇到的問題，僅供大家參考：

1、保存血清最好的方法： 建議血清應(yīng)保存在-5℃ 至-2O ℃。然而，若存放于 4 ℃ 時(shí)，請(qǐng)勿超過一個(gè)月。若您一次無法用完一瓶，建議您無菌分裝血清至恰當(dāng)?shù)臏缇萜鲀?nèi)，再放回冷凍。

2、如何解凍血清才不會(huì)使產(chǎn)品質(zhì)量受損：

建議您將血清從冷凍箱取出后，先置于2～8℃ 冰箱使之溶解，然后在室溫下使之全溶。但必須注意的是，溶解過程中必須規(guī)則地?fù)u晃均勻。

3、血清解凍后發(fā)現(xiàn)有絮狀沉淀物出現(xiàn)，該如何處理：

血清中沉淀物的出現(xiàn)有許多種原因，但最普的原因是由于血清中脂蛋白的變性所造成，而血纖維蛋白(形成凝血的蛋白之一)在血渭解凍后，也會(huì)存在于血清中，亦是造成沉淀物的主要原因之一。但這些絮狀沉淀物，并不影響血清本身的質(zhì)量。

若您欲去除這些絮狀沉淀物，可以將血清分裝至無菌離心管內(nèi)，以400g稍微離心，上清液即可接著加入培養(yǎng)基內(nèi)一起過濾。我們不建議您以過濾的方法去除這些絮狀沉淀物，因?yàn)樗赡軙?huì)阻塞您的過濾膜。

4、何謂熱滅活：

一般是以 56℃，30 分鐘來處理已解凍的血清，因?yàn)榇思訜岵襟E，可以使補(bǔ)體去活化，而補(bǔ)體所參與的反應(yīng)有 : 溶細(xì)胞活性，平滑肌的收縮，肥大細(xì)胞和血小板組胺的釋放，增強(qiáng)吞噬作用，淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的趨化和激活。

5、關(guān)于胎牛血清的滅活： 有必要做熱滅活嗎？ 實(shí)驗(yàn)顯示，經(jīng)過正確處理的熱滅活血清，對(duì)大多數(shù)的細(xì)胞而言是不需要的。經(jīng)此處理過的血清對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)只有微小的促進(jìn)，或完全沒有任何作用，甚至通常因?yàn)楦邷靥幚碛绊懥搜宓馁|(zhì)量，而造成細(xì)胞生長(zhǎng)速率的降低。而經(jīng)過熱處理的血清，沉淀物的形成會(huì)顯著的增多，這些沉淀物在倒立顯微鏡下觀察，像是“小黑點(diǎn)”，常常會(huì)讓研究者誤以為是血清遭受污染，而把血清放在 37℃ 環(huán)境中，又會(huì)使此沉淀物更增多，使研究者誤認(rèn)為是微生物的分裂擴(kuò)增。

因此我們建議您，若非必須，您可以不需要做熱處理這一步。如此一來，不但節(jié)省您寶貴的時(shí)間，更確保您血清的質(zhì)量！

6、血清相關(guān)知識(shí)： 如何避免沉淀物的產(chǎn)生？

我們建議您在使用血清的時(shí)候，注意下列的操作 :(1)解凍血清時(shí)，請(qǐng)按照所建議的逐步解凍法(-2O℃至4℃至室溫)，若血清解凍時(shí)改變的溫度太大(如-20℃至37℃)，實(shí)驗(yàn)顯示非常容易產(chǎn)生沉淀物。(2)解凍血清時(shí)，請(qǐng)隨時(shí)將之搖晃均勻，使溫度及成分均一，減少沉淀的發(fā)生。

(3)請(qǐng)勿將血清置于37℃太久。若在37℃放置太久，血清會(huì)變得混濁，同時(shí)血清中許多較不穩(wěn)定的成分也會(huì)因此受到損害，而影響血清的質(zhì)量。(4)血清的熱滅活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以無須做此步驟。

(5)若必須做血清的熱滅活，請(qǐng)遵守56℃，30 分鐘的原則，并且隨時(shí)搖晃均勻。溫度過高，時(shí)間過久或搖晃不均勻，都會(huì)造成沉淀物的增多。

第五篇：實(shí)驗(yàn)總結(jié)-細(xì)胞培養(yǎng)方法

一、培養(yǎng)細(xì)胞常用配置

培養(yǎng)基的配置：基礎(chǔ)培養(yǎng)基500ml+胎牛血清50ml+雙抗5ml 凍存液的配置：10 % DMSO + 90%胎牛血清 依次比例酌量配置。超凈工作臺(tái)常規(guī)配置

移液器1套（2.5μl、20μl、200μl、1ml），酒精燈1盞，液器1臺(tái)，斜架1臺(tái)，酒精噴壺1個(gè)，酒精棉球缸1個(gè)，污缸1個(gè)，常規(guī)耗材：培養(yǎng)瓶（50㎝2），定量移液管（5ml、10ml），槍頭（1ml、200μl、10μl），培養(yǎng)皿，6/24/48/96孔板，醫(yī)用脫脂棉球，凍存管 所需試劑：培養(yǎng)基，胎牛血清，雙抗，DMSO，胰酶，75%酒精……

實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：所需的各項(xiàng)高壓后的耗材及污物缸放于超凈工作臺(tái)內(nèi)，用酒精噴壺噴灑實(shí)驗(yàn)臺(tái)面，并關(guān)閉工作臺(tái)打開紫外燈照射30min后開始實(shí)驗(yàn)操作。培養(yǎng)基及胰酶恢復(fù)常溫后使用，可37℃水浴5-10min

二、細(xì)胞復(fù)蘇 步驟：

1.紫外消毒30min后關(guān)閉紫外燈，開啟超凈臺(tái)正常工作狀態(tài)，用酒精消毒操作者的雙手。

2.培養(yǎng)液（DMEM），恒溫水浴箱37℃預(yù)熱20min，備用。超凈臺(tái)內(nèi)準(zhǔn)備一支15ml離心管備用。

3.將所需的培養(yǎng)基確保瓶身干凈后酒精消毒放于工作臺(tái)面內(nèi)，點(diǎn)燃酒精燈，再將瓶口對(duì)準(zhǔn)在酒精燈上消毒2-3次，旋開瓶蓋后需再次分別消毒瓶口和瓶蓋。4.從液氮保存罐中取出凍存管，立即放入37℃水浴中，快速搖晃，直至凍存液融化至黃豆粒大小后迅速取出。

5.將細(xì)胞懸液移入15ml離心管，緩慢加入4ml培養(yǎng)液，離心（1000r/min，5min）。6.取出2個(gè)培養(yǎng)皿并做好標(biāo)記（復(fù)蘇日期等），提前加入5-10ml培養(yǎng)液；離心結(jié)束后用1ml培養(yǎng)液懸液混懸沉淀細(xì)胞后分別加入培養(yǎng)皿內(nèi)。

7.將培養(yǎng)基瓶口和瓶蓋消毒2-3次后擰緊，熄滅酒精燈，整理實(shí)驗(yàn)臺(tái)面，取出實(shí)驗(yàn)試劑及污缸等，關(guān)閉超凈工作臺(tái)。8.將培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)

注意事項(xiàng)：

1.取細(xì)胞的過程中注意帶好防凍手套。此項(xiàng)尤為重要，細(xì)胞凍存管可能漏入液氮，解凍時(shí)凍存管中的氣溫急劇上升，可導(dǎo)致爆炸。

2.凍存液的問題：凍存液的配置已是常識(shí)，在這里不作詳述，但二甲基亞砜（DMSO）對(duì)細(xì)胞不是完全無毒副作用，在常溫下，二甲基亞砜對(duì)細(xì)胞的毒副作用較大，因此，必須在1-2min內(nèi)使凍存液完全融化。如果復(fù)蘇溫度太慢，會(huì)造成細(xì)胞的損傷，二甲基亞砜（DMSO）最好選擇進(jìn)口產(chǎn)品。

3.離心前須加入少量培養(yǎng)液。細(xì)胞解凍后二甲基亞砜濃度較高，注意加入少量培養(yǎng)液可稀釋其濃度，以減少對(duì)細(xì)胞的損傷。

4.離心問題：目前主要有兩種見解。一種是解凍后的細(xì)胞懸液直接吹打均勻后分裝到培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，第二天換液。因?yàn)殡x心的目的是兩個(gè)，去除 DMSO，去除死細(xì)胞，這個(gè)是標(biāo)準(zhǔn)流程，但對(duì)一般人來說，把握不好離心轉(zhuǎn)速和時(shí)間，轉(zhuǎn)的不夠活細(xì)胞沉底的少，細(xì)胞就全被扔掉了，轉(zhuǎn)過了活細(xì)胞會(huì)受壓過大，死亡。此外在操作過程中容易污染，所以不推薦。另一種說法為細(xì)胞懸液中含有二甲基亞砜（DMSO），DMSO對(duì)細(xì)胞有一定的毒副作用，所以須將離心后的液體前倒凈，且一定倒干凈。

5.凍存細(xì)胞解凍時(shí)1ml細(xì)胞液要加10ml－15m培養(yǎng)液

6.復(fù)蘇細(xì)胞分裝的問題：復(fù)蘇1管細(xì)胞一般可分裝到2-3只培養(yǎng)皿中，分裝過多，細(xì)胞濃度過低，不利于細(xì)胞的貼壁。

7.加培養(yǎng)基的量放入問題：這個(gè)量的多少的把握主要涉及到的問題是DMSO的濃度，從如果你加培養(yǎng)基的太少，那么DMSO的濃度就會(huì)比較大，就會(huì)影響細(xì)胞生長(zhǎng)，從以前的資料來看，DMSO的濃度在小于0.5%的時(shí)候?qū)σ话慵?xì)胞沒有什么影響，還有一個(gè)說法是1％。所以如果你的凍存液的濃度是 10％DMSO的話那么加10ml以上的培養(yǎng)基就恰好稀釋到了無害濃度

8.原理：在不加任何條件下直接凍存細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞內(nèi)和外環(huán)境中的水都會(huì)形成冰晶，能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)發(fā)生機(jī)械損傷、電解質(zhì)升高、滲透壓改變、脫水、PH改變、蛋白變性等，能引起細(xì)胞死亡。如向培養(yǎng)液加入保護(hù)劑，可使冰點(diǎn)降低。在緩慢的凍結(jié)條件下，能使細(xì)胞內(nèi)水份在凍結(jié)前透出細(xì)胞。貯存在－130℃以下的低溫中能減少冰晶的形成。細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)速度要快，使之迅速通過細(xì)胞最易受損的－5～0℃，細(xì)胞仍能生長(zhǎng)，活力受損不大。目前常用的保護(hù)劑為二甲亞砜（DMSO）和甘油，它們對(duì)細(xì)胞無毒性，分子量小，溶解度大，易穿透細(xì)胞。

三、培養(yǎng)液的更換

1.紫外消毒30min后關(guān)閉紫外燈，開啟超凈臺(tái)正常工作狀態(tài)，用酒精消毒操作者的雙手。

2.培養(yǎng)液（DMEM），恒溫水浴箱37℃預(yù)熱20min，備用。

3.將所需的培養(yǎng)基確保瓶身干凈后酒精消毒放于工作臺(tái)面內(nèi)，點(diǎn)燃酒精燈，再將瓶口對(duì)準(zhǔn)在酒精燈上消毒2-3次，旋開瓶蓋后再次分別消毒瓶口和瓶蓋。4.將培養(yǎng)皿蓋內(nèi)口朝上放在架子上，將培養(yǎng)皿內(nèi)的培養(yǎng)液懸空倒進(jìn)污缸 5．拿出1支高壓后的5ml定量移液管，在酒精燈上灼燒尾部后裝于移液器上，再次放于酒精燈上灼燒整個(gè)定量移液管管身2-3次，懸空進(jìn)入培養(yǎng)基瓶?jī)?nèi)吸取5-10ml培養(yǎng)基再懸空移入培養(yǎng)皿內(nèi)，將培養(yǎng)皿蓋在酒精燈上消毒2-3次后蓋上。6.將培養(yǎng)基瓶口和瓶蓋消毒2-3次后擰緊，熄滅酒精燈，整理實(shí)驗(yàn)臺(tái)面，取出實(shí)驗(yàn)試劑及污缸等，關(guān)閉超凈工作臺(tái)。7.將培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)

每天定時(shí)觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，一般72-96h后，細(xì)胞生長(zhǎng)密度大于90%，即可進(jìn)行細(xì)胞的傳代。

四、細(xì)胞傳代

1.紫外消毒30min后關(guān)閉紫外燈，開啟超凈臺(tái)正常工作狀態(tài)，用酒精消毒操作者的雙手。

2.培養(yǎng)液，胰酶，恒溫水浴箱37℃預(yù)熱20min，備用。

3.將所需的培養(yǎng)基，胰酶確保瓶身干凈消毒后放于工作臺(tái)面內(nèi)，點(diǎn)燃酒精燈，再將瓶口對(duì)準(zhǔn)在酒精燈上消毒2-3次，旋開瓶蓋后再次分別消毒瓶口和瓶蓋，分別放于酒精燈的兩側(cè)。

4.將培養(yǎng)皿蓋內(nèi)口朝上放在架子上，將培養(yǎng)皿內(nèi)的培養(yǎng)液懸空倒進(jìn)污缸。取1ml移液器快速移動(dòng)在酒精燈上消毒1-2次，然后再裝上槍頭吸取1-2ml胰酶液，懸空沿皿壁加入培養(yǎng)皿內(nèi)。

5.將培養(yǎng)皿來回傾倒使胰酶浸沒整個(gè)皿底的細(xì)胞層，計(jì)時(shí)越1-3min（消化時(shí)間根據(jù)細(xì)胞不同時(shí)間不同），對(duì)著燈光可觀察到細(xì)胞與細(xì)胞之間有針孔樣縫隙，并有1-2個(gè)細(xì)胞脫落，鏡下觀察到細(xì)胞都變圓時(shí)為胰酶消化的最適時(shí)機(jī)。（若看到成片的細(xì)胞從瓶壁脫落為胰酶消化過度；若看不到針孔樣縫隙和細(xì)胞脫落，或鏡下細(xì)胞多有菱角則需繼續(xù)消化）。用移液器將胰酶吸凈。

6.吸取1ml培養(yǎng)基于培養(yǎng)皿內(nèi)，并用移液器吸取少量的培養(yǎng)基輕柔的反復(fù)沖洗培養(yǎng)瓶壁5-8次，使貼壁細(xì)胞完全脫落于培養(yǎng)基內(nèi)再輕輕吹打2-3次，使細(xì)胞盡可能處于單個(gè)懸浮狀態(tài)。

7.取1或2個(gè)新的培養(yǎng)皿，然后將細(xì)胞培養(yǎng)基均勻的分到2或3個(gè)培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)（注意原來傳代時(shí)使用的培養(yǎng)瓶可繼續(xù)傳代使用），進(jìn)行1傳2或1傳3的培養(yǎng)。8.拿出1支高壓后的5ml定量移液管，在酒精燈上灼燒尾部后裝于移液器上，再次放于酒精燈上灼燒整個(gè)定量移液管管身2-3次，懸空進(jìn)入培養(yǎng)基皿內(nèi)吸取5-10ml培養(yǎng)基懸空移入每個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)，將培養(yǎng)皿蓋在酒精燈上消毒2-3次蓋上，在皿蓋上做好實(shí)驗(yàn)標(biāo)記。

9.將培養(yǎng)基瓶口和瓶蓋消毒2-3次后擰緊，熄滅酒精燈，整理實(shí)驗(yàn)臺(tái)面，取出實(shí)驗(yàn)試劑及污缸等，關(guān)閉超凈工作臺(tái)。

10.將培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。注意整個(gè)培養(yǎng)箱底托盤內(nèi)一定要放高壓后的水，且定期更換確保無菌。

每天定時(shí)觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，一般72-96h后，細(xì)胞生長(zhǎng)密度大于90%，即可進(jìn)行細(xì)胞的傳代或保株。

五、細(xì)胞株的保存

原理：細(xì)胞凍存最常用的技術(shù)是液氮冷凍保存法，主要采用加適量保護(hù)劑的緩慢冷凍法凍存細(xì)胞。細(xì)胞在不加任何保護(hù)劑的情況下直接冷凍，細(xì)胞內(nèi)外的水分會(huì)很快形成冰晶，從而引起一系列不良反應(yīng)。如細(xì)胞脫水使局部電解質(zhì)濃度增高，pH值改變，部分蛋白質(zhì)由于上述原因而變性，引起細(xì)胞內(nèi)部空間結(jié)構(gòu)紊亂，溶酶體膜由此遭到損傷而釋放出溶酶體酶，使細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)成分造成破壞，線粒體腫脹，功能丟失，并造成能量代謝障礙。胞膜上的類脂蛋白復(fù)合體也易破壞引起細(xì)胞膜通透性的改變，使細(xì)胞內(nèi)容物丟失。如果細(xì)胞內(nèi)冰晶形成較多，隨冷凍溫度的降低，冰晶體積膨脹造成細(xì)胞核DNA空間構(gòu)型發(fā)生不可逆的損傷，而致細(xì)胞死亡。因此，細(xì)胞冷凍技術(shù)的關(guān)鍵是盡可能地減少細(xì)胞內(nèi)水分，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成。采用甘油或二甲基亞砜作保護(hù)劑，這兩種物質(zhì)分子量小，溶解度大，易穿透細(xì)胞，可以使冰點(diǎn)下降，提高細(xì)胞膜對(duì)水的通透性，且對(duì)細(xì)胞無明顯毒性。慢速冷凍方法又可使細(xì)胞內(nèi)的水分滲出細(xì)胞外，減少胞內(nèi)形成冰結(jié)晶的機(jī)會(huì)，從而減少冰晶對(duì)細(xì)胞的損傷。

實(shí)驗(yàn)步驟：

選擇處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，在凍存前一天最好換液。將多個(gè)培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞培養(yǎng)液去掉，用0.25% 胰蛋白酶消化。適時(shí)去掉胰蛋白酶，加入少量新培養(yǎng)液。用吸管吸取培養(yǎng)液反復(fù)吹打瓶壁上的細(xì)胞，使其成為均勻分散的細(xì)胞懸液。懸浮生產(chǎn)細(xì)胞則不要消化處理。然后將細(xì)胞收集于離心管中離心(1000r/min，10分鐘)。加入凍存管中，再加入1ml配置好的凍存液后放入梯度降溫盒，放入-80℃冰箱中。

1.紫外消毒30min后關(guān)閉紫外燈，開啟超凈臺(tái)正常工作狀態(tài)，用酒精消毒操作者的雙手。

2.培養(yǎng)液，胰酶，二甲基亞砜DMSO，胎牛血清（解凍），梯度降溫盒恢復(fù)常溫，恒溫水浴箱37℃預(yù)熱20min，備用。

3.將所需的培養(yǎng)基，胰酶確保瓶身干凈消毒后放于工作臺(tái)面內(nèi)，點(diǎn)燃酒精燈，再將瓶口對(duì)準(zhǔn)在酒精燈上消毒2-3次，旋開瓶蓋后再次分別消毒瓶口和瓶蓋，分別放于酒精燈的兩側(cè)。

4.將培養(yǎng)瓶瓶口在酒精燈上消毒2-3次，旋開后分別再次消毒瓶口和瓶蓋2-3次，蓋放于酒精燈右側(cè)后將培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)液懸空倒進(jìn)污缸，在酒精燈消毒2-3次瓶口，豎直放好。取1ml移液器快速移動(dòng)在酒精燈上消毒1-2次，然后再裝上槍頭吸取1.5ml胰酶液，懸空移入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。

5.將培養(yǎng)皿蓋內(nèi)口朝上放在架子上，將培養(yǎng)皿內(nèi)的培養(yǎng)液懸空倒進(jìn)污缸。取1ml移液器快速移動(dòng)在酒精燈上消毒1-2次，然后再裝上槍頭吸取1-2ml胰酶液，懸空沿皿壁加入培養(yǎng)皿內(nèi)。6.將培養(yǎng)皿來回傾倒使胰酶浸沒整個(gè)皿底的細(xì)胞層，計(jì)時(shí)越1-3min（消化時(shí)間根據(jù)細(xì)胞不同時(shí)間不同），對(duì)著燈光可觀察到細(xì)胞與細(xì)胞之間有針孔樣縫隙，并有1-2個(gè)細(xì)胞脫落，鏡下觀察到細(xì)胞都變圓時(shí)為胰酶消化的最適時(shí)機(jī)。（若看到成片的細(xì)胞從瓶壁脫落為胰酶消化過度；若看不到針孔樣縫隙和細(xì)胞脫落，或鏡下細(xì)胞多有菱角則需繼續(xù)消化）。用移液器將胰酶吸凈。

6.吸取1ml培養(yǎng)基于培養(yǎng)皿，并用移液器吸取少量的培養(yǎng)基輕柔的反復(fù)沖洗培養(yǎng)瓶壁5-8次，使貼壁細(xì)胞完全脫落于培養(yǎng)基內(nèi)再輕輕吹打2-3次，使細(xì)胞盡可能處于單個(gè)懸浮狀態(tài)。

7.將懸浮細(xì)胞吸入15ml離心管內(nèi)，加入4ml培養(yǎng)基離心1000r/min，5min 8.預(yù)先配制凍存液：10 % DMSO + 90%胎牛血清。按需要配置一定數(shù)量備用 9.棄去培養(yǎng)基，用凍存液進(jìn)行重懸混勻后，將1ml含有細(xì)胞的凍存液移入凍存管內(nèi)，擰緊瓶蓋，做好實(shí)驗(yàn)標(biāo)記。

10.將培養(yǎng)基，胰酶瓶口和瓶蓋消毒2-3次后擰緊，熄滅酒精燈，整理實(shí)驗(yàn)臺(tái)面，取出實(shí)驗(yàn)試劑及污缸等，關(guān)閉超凈工作臺(tái)。

8.將凍存管先放于4℃冰箱 30min后拿出放置-20℃冰箱過夜，次日再放于-80℃的冰箱內(nèi)3-4天，最后存放于-196℃的液氮灌內(nèi)長(zhǎng)期保存?；蛑苯臃湃胩荻冉禍睾袃?nèi)，放入-80℃冰箱內(nèi)過夜后最后存放于液氮罐內(nèi)。（梯度降溫盒內(nèi)為甲醇，使用5次需要更換，每次使用需做好標(biāo)記，使用前需恢復(fù)常溫）

六、細(xì)胞轉(zhuǎn)染

RNA干擾（RNA interference, RNAi）: ? 是指在進(jìn)化過程中高度保守的、由雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象?；虺聊?，主要有轉(zhuǎn)錄前水平的基因沉默(TGS)和轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默(PTGS)兩類:TGS是指由于DNA修飾或染色體異染色質(zhì)化等原因使基因不能正常錄;

? PTGS是啟動(dòng)了細(xì)胞質(zhì)內(nèi)靶mRNA序列特異性的降解機(jī)制。有時(shí)轉(zhuǎn)基因會(huì)同時(shí)導(dǎo)致TGS和PTGS。

? 由于使用RNAi技術(shù)可以特異性剔除或關(guān)閉特定基因的表達(dá)，（長(zhǎng)度超過三十的dsRNA會(huì)引起干擾素毒性）所以該技術(shù)已被廣泛用于探索基因功能和傳染性疾病及惡性腫瘤的治療領(lǐng)域。

? 病毒基因、人工轉(zhuǎn)入基因、轉(zhuǎn)座子等外源性基因隨機(jī)整合到宿主細(xì)胞基因組內(nèi)，并利用宿主細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄時(shí)，常產(chǎn)生一些dsRNA。宿主細(xì)胞對(duì)這些dsRNA迅即產(chǎn)生反應(yīng)。

作用機(jī)制

1)其胞質(zhì)中的核酸內(nèi)切酶Dicer將dsRNA切割成多個(gè)具有特定長(zhǎng)度和結(jié)構(gòu)的小片段RNA（大約21～23 bp），即siRNA。

2)siRNA在細(xì)胞內(nèi)RNA解旋酶的作用下解鏈成正義鏈和反義鏈，繼之由反義siRNA再與體內(nèi)一些酶（包括內(nèi)切酶、外切酶、解旋酶等）結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物（RNA-induced silencing complex，RISC)。

3)RISC與外源性基因表達(dá)的mRNA的同源區(qū)進(jìn)行特異性結(jié)合，RISC具有核酸酶的功能，在結(jié)合部位切割mRNA，切割位點(diǎn)即是與siRNA中反義鏈互補(bǔ)結(jié)合的兩端。被切割后的斷裂mRNA隨即降解，從而誘發(fā)宿主細(xì)胞針對(duì)這些mRNA的降解反應(yīng)。

4)siRNA不僅能引導(dǎo)RISC切割同源單鏈mRNA，而且可作為引物與靶RNA結(jié)合并在RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRP）作用下合成更多新的dsRNA，新合成的dsRNA再由Dicer切割產(chǎn)生大量的次級(jí)siRNA，從而使RNAi的作用進(jìn)一步放大，最終將靶mRNA完全降解。

5)RNAi發(fā)生于除原核生物以外的所有真核生物細(xì)胞內(nèi)。需要說明的是，由于dsRNA抑制基因表達(dá)具有潛在高效性，任何導(dǎo)致正常機(jī)體dsRNA形成的情況都會(huì)引起不需要的相應(yīng)基因沉寂。所以正常機(jī)體內(nèi)各種基因有效表達(dá)有一套嚴(yán)密防止dsRNA形成的機(jī)制。

脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染原理：

1.脂質(zhì)體是磷脂分散在水中時(shí)形成的脂質(zhì)雙分子層，又稱為人工生物膜。最初，人們只是運(yùn)用脂質(zhì)體模擬生物膜，研究膜的構(gòu)造及功能，從而發(fā)現(xiàn)了膜的融合及內(nèi)吞作用，因而可用作外源物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞的載體 2.陽離子脂質(zhì)體表面帶正電荷，能與核酸的磷酸根通過靜電作用將DNA分子包裹人內(nèi)，形成DNA一脂復(fù)合體，也能被表面帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜吸附，再通過膜的融合或細(xì)胞的內(nèi)吞作用，偶爾也通過直接滲透作用，將DNA傳遞進(jìn)入細(xì)胞，形成包涵體或進(jìn)入溶酶體其中一小部分DNA能從包涵體內(nèi)釋放，并進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中，再進(jìn)一步進(jìn)入核內(nèi)轉(zhuǎn)錄、表達(dá)

DNA轉(zhuǎn)染步驟

1.轉(zhuǎn)染前一天接種細(xì)胞于6孔板，0.5-2×105每孔，2ml無抗生素培養(yǎng)基每孔，第二天轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞達(dá)到90-95%每孔。

2.轉(zhuǎn)染前半小時(shí)換Opti-MEM無血清培養(yǎng)基1.5ml。

3.A液：DNA 5ug 加入245ul Opti-MEM無血清培養(yǎng)基，輕輕混勻。

4.B液：脂質(zhì)體使用前輕輕混勻，脂質(zhì)體10ul 加入245ul Opti-MEM無血清培養(yǎng)基，輕輕混勻，室溫靜止5min。

5.B液加入A液，用槍輕輕混勻，室溫靜止20min。

6.將混合液均勻分散慢慢滴加到6孔板細(xì)胞中，邊滴加變前后左右十字交叉搖晃。

7.孵箱37℃培養(yǎng)48h（轉(zhuǎn)染時(shí)間待定）。8.第二天看細(xì)胞狀態(tài)來決定是否換液。9.同時(shí)設(shè)立細(xì)胞對(duì)照組，空白轉(zhuǎn)染組。

siRNA轉(zhuǎn)染步驟

1)轉(zhuǎn)染前一天接種細(xì)胞于6孔板（40x104），2ml無抗生素培養(yǎng)基每孔，第二天轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞達(dá)到50-60%每孔。

2)轉(zhuǎn)染前半小時(shí)換Opti-MEM無血清培養(yǎng)基1.5ml。

3)A液：siRNA 5ul（共100pmol）加入245ul Opti-MEM無血清培養(yǎng)基，輕輕混勻。（siRNA按照說明書稀釋）4)B液：脂質(zhì)體（RNAimax）使用前輕輕混勻，脂質(zhì)體10ul 加入245ul Opti-MEM無血清培養(yǎng)基，輕輕混勻，室溫靜止5min。

5)B液加入A液，用槍輕輕混勻，室溫靜止20min。

6)將混合液均勻分散慢慢滴加到6孔板細(xì)胞中，邊滴加變前后左右十字交叉搖晃。

7)孵箱37℃培養(yǎng)48h（轉(zhuǎn)染時(shí)間待定）。8)第二天看細(xì)胞狀態(tài)來決定是否換液。9)同時(shí)設(shè)立細(xì)胞對(duì)照組，空白轉(zhuǎn)染組。

使用RNAiMAX和AGS cell用于siRNA在6孔板上進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)

1)提前配制GAPDH，NC，NV-FAM及各片段siRNA的20uM的稀釋液，取附贈(zèng)的DEPC水至管內(nèi)，打開離心管前先離心，將附在管壁上的凍干粉離心下來 2)溶解時(shí)滴加適量的DEPC水后蓋上管蓋，震蕩溶解：NC，NC-FAM溶解加入62.5ulDEPC水，其他siRNA片段加入125ul DEPC水

3)取6只EP管，分別標(biāo)記GAPDH，NC，NV-FAM，三個(gè)片段名稱，從管內(nèi)吸取20ul的稀釋液分裝后

4)將稀釋液至于-80度冰箱保存。

? 轉(zhuǎn)染前一天，在6孔板上接種40x104AGS cell，再取一個(gè)35mm培養(yǎng)皿接種40x104AGS cell，每孔放2ml不含抗生素的生長(zhǎng)培養(yǎng)基。使細(xì)胞在轉(zhuǎn)染的時(shí)候有50-60%的融合率

? 從細(xì)胞中除去生長(zhǎng)培養(yǎng)基

? 每個(gè)孔中加入1.5ml新鮮不含血清的培養(yǎng)基，并準(zhǔn)備如下混合物 1)A液：(取7個(gè)EP管，分別標(biāo)記空白，GAPDH，NC,NC-FAM,三個(gè)片段)。在250ul的opti-mem終加入100pmol siRNA（稀釋好的siRNA濃度為20uM，100pmol的siRNA需要取5ul），混合均勻

2)B液：（取一個(gè)EP管標(biāo)記RNAiMAX），RNAiMAX 使用前搖勻，在250ul X7.2=1800ul的opti-mem加入6ul X7.2=43.2ul的RNAiMAX，稀釋RNAiMAX混勻后并在室溫下溫育5min 3)混合A液和B液，混勻B液后吸取256ul至A液中室溫下溫育20min ? 將混合物混勻后加入到含AGS的6孔板與35mm培養(yǎng)皿中，每孔終體積為2ml，則加入混合液500ul，并輕搖混勻 ? 在37℃的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5-6小時(shí) ? 更換含血清的培養(yǎng)基并培養(yǎng)細(xì)胞24-48小時(shí) 24-48小時(shí)后收細(xì)胞跑WB，看沉默效果