第一篇：實(shí)驗四動物血液中DNA的提取-教案

授課教師常祖明學(xué)生人數(shù) 55

課題血液基因組DNA的提取

授課類型新授課授課方法講授、演示 教學(xué)用具多媒體、實(shí)驗室設(shè)備

教學(xué)目的掌握雞血DNA提取的原理及方法

教學(xué)重點(diǎn)理解實(shí)驗過程中每一步操作的目的及原理 教學(xué)難點(diǎn) 教學(xué)過程

一、實(shí)驗?zāi)康?/p>

1.掌握雞血DNA提取的原理；

2.掌握雞血DNA提取的方法及操作過程。

二、實(shí)驗原理

哺乳動物的成熟紅細(xì)胞已經(jīng)高度分化，因而當(dāng)中沒有細(xì)胞核，無法提取DNA。禽類的血細(xì)胞則可以。禽類代謝旺盛，血液中紅細(xì)胞更多，而且紅細(xì)胞中有完整的細(xì)胞核、大量的染色體。且材料易得、經(jīng)濟(jì)。用雞血細(xì)胞做實(shí)驗材料有兩個原因。一是因為雞血細(xì)胞核的DNA含量豐富，材料易得；二是雞血細(xì)胞極易吸水脹破，而用動物肝臟細(xì)胞作實(shí)驗材料常常需要勻漿和離心，對設(shè)備要求較高，操作繁瑣，歷時較長。

三、實(shí)驗儀器 1.水浴鍋：55℃

2.離心機(jī)：8000轉(zhuǎn)、12000轉(zhuǎn) 3.離心管：5ml（120個）

4.移液槍：10μl、680μl、700μl、800μl、900μl、1ml 5.容量瓶：100ml 6.取血針及管

四、實(shí)驗材料及藥品

實(shí)驗材料：普通家雞：需血液4.08ml（每管136(l）1.無水乙醇

作用：DNA沉淀劑、洗滌劑。

商品信息：瓶/500ml，分析純AR。

理化性質(zhì)：無色澄清液體。有灼燒味。易流動。極易從空氣中吸收水分，能與水和氯仿、乙醚等多種有機(jī)溶劑以任意比例互溶。

儲存：儲存于陰涼、通風(fēng)的庫房。遠(yuǎn)離火種、熱源。庫溫不宜超過30℃。保持容器密封。應(yīng)與氧化劑、酸類、堿金屬、胺類等分開存放，切忌混儲。采用防爆型照明、通風(fēng)設(shè)施。禁止使用易產(chǎn)生火花的機(jī)械設(shè)備和工具。

危害：易燃，具刺激性。蒸氣與空氣能形成爆炸性混合物，爆炸極限3.5%～18.0%（體積）。2.檸檬酸

作用：ACD抗凝血劑成分之一。在抗凝劑中，中和檸檬酸鈉的堿性。商品信息：分析純AR，白色塑料瓶/500g，理化性質(zhì)：無臭，有很強(qiáng)的酸味，白色粉末或顆粒，易溶于水和醇。在潮濕的空氣中微有潮解性。

儲存：在濕空氣中有輕微潮解，需陰涼密封干燥保存。

危害：檸檬酸濃溶液對黏膜有刺激作用。檸檬酸可燃。粉體與空氣可形成爆炸性混合物，遇明火、高熱或與氧化劑接觸，有引起燃燒爆炸的危險。3.檸檬酸鈉

作用：ACD抗凝血劑成分之一。能與血液中的鈣離子結(jié)合成螯合物，而使鈣離子失去凝血作用，從而阻止血液凝固。

商品信息：檸檬酸三鈉分析純500克/瓶。

理化性質(zhì)：有機(jī)化合物，外觀為白色到無色晶體。無臭, 有清涼咸辣味。常溫及空氣中穩(wěn)定, 在濕空氣中微有溶解性, 在熱空氣中產(chǎn)生風(fēng)化現(xiàn)象。加熱至150℃失去結(jié)晶水。易溶于水、可溶于甘油、難溶于醇類及其他有機(jī)溶劑，過熱分解，在潮濕的環(huán)境中微有潮解，在熱空氣中微有風(fēng)化，其溶液 pH 值約為8。儲存： 常溫密閉保存 危害：無毒 4.尿素

作用：禽血裂解液成分之一。尿素能非常有效地使蛋白質(zhì)變性，尤其能非常有效地破壞非共價鍵結(jié)合的蛋白質(zhì)。

商品信息：化學(xué)試劑分析純 500克/瓶（塑料瓶裝）理化性質(zhì)：無色柱狀結(jié)晶或白色結(jié)晶性粉末，溶于水，乙醇和苯，難溶于乙醚，不溶于氯仿。儲存：密封避光保存。

危害：避免與皮膚和眼睛接觸。5.十二烷基硫酸鈉(SDS)作用：禽血裂解液成分之一。裂解核酸-蛋白質(zhì)復(fù)合體，用于從蛋白質(zhì)中分離核酸。商品信息：500g/分析純AR。

理化性質(zhì)：白色或淡黃色粉末。溶解性：溶于水，呈透明溶液，溶液呈中性。易溶于熱水，溶于水，溶于熱乙醇，微溶于醇，不溶于氯仿、醚。儲存：密封陰涼干燥保存 防止受潮受熱 危害：對粘膜和上呼吸道有刺激作用，對眼和皮膚有刺激作用。可引起呼吸系統(tǒng)過敏性反應(yīng)。該品可燃，具刺激性，具致敏性。遇明火、高熱可燃。受高熱分解放出有毒的氣體。6.1M Tris-HCl(PH8.0)緩沖液

作用：禽血裂解液成分之一。提供一個緩沖環(huán)境，防止DNA被破壞 商品信息：瓶/100ml，無色、澄清溶液

理化性質(zhì)：Tris中文品名為三羥甲基氨基甲烷，瓶/500g。是一種白色結(jié)晶或粉末。溶于乙醇和水，微溶于乙酸乙酯、苯，不溶于乙醚、四氯化碳，對銅、鋁有腐蝕作用，有刺激性的化學(xué)物質(zhì)。

儲存：室溫保存。

危害：毒性低，可致癌，不要直接接觸皮膚。7.乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-2Na）

作用：配制0.5M EDTA（PH8.0）溶液。螯合Mg2+或Mn2+離子,抑制脫氧核糖核酸酶（DNase）活性，活性依賴于鈣離子，并能被鎂離子或二價錳離子激活。商品信息：瓶/250g。理化性質(zhì)：無味無臭或微咸的白色或乳白色結(jié)晶或顆粒狀粉末。溶于水，不溶于乙醇、乙醚，其水溶液pH值約為5.3。可由EDTA與氫氧化鈉和碳酸鈣作用制得。

儲存：于陰涼、通風(fēng)的庫房。遠(yuǎn)離火種、熱源。應(yīng)與氧化劑分開存放，切忌混儲。配備相應(yīng)品種和數(shù)量的消防器材。儲區(qū)應(yīng)備有合適的材料收容泄漏物。

危害：對粘膜和上呼吸道有刺激作用。對眼睛、皮膚有刺激作用。本品可燃，具刺激性。8.蛋白酶K（共需300μl，每管10μl）作用：消化組蛋白，釋放出DNA；消化DNase，提高DNA產(chǎn)量 商品信息：（20mg/mL）1ml/支。

理化性質(zhì)：一種枯草蛋白酶類的高活性蛋白酶，從林伯氏白色念球菌中純化得到。儲存：保存在－20℃冰箱里，避免反復(fù)凍融，有效保證12月。危害：使用時注意不要接觸皮膚，以免損傷皮膚表面的蛋白質(zhì)。9.Tris飽和酚（共需60ml，每管2ml）作用：強(qiáng)蛋白質(zhì)變性劑。商品信息：瓶/250ml。理化性質(zhì)：為淺黃色透明液體，上層為Tris-HCl溶液，加有抗氧化的0.25% 8-羥基喹啉和0.1%的β-巰基乙醇。

儲存：4℃避光保存。

危害：Tris飽和酚有較強(qiáng)的腐蝕性，應(yīng)盡量避免皮膚直接接觸或吸入體內(nèi)。如發(fā)現(xiàn)變?yōu)辄S色或棕色，表明發(fā)生氧化，不能使用。10.氯仿（三氯甲烷）

作用：蛋白質(zhì)變性劑，加速有機(jī)相與液相分層，去除核酸溶液中的跡量酚。商品信息：瓶/500ml。

理化性質(zhì)：無色透明重質(zhì)液體，極易揮發(fā)，有特殊氣味。不溶于水，溶于醇、醚、苯。儲存：保存在密封的棕色瓶中。

危害：麻醉性。有致癌可能性。在光照下遇空氣逐漸被氧化生成劇毒的光氣。11.異戊醇

作用：減少蛋白質(zhì)變性操作過程中產(chǎn)生的氣泡。異戊醇可以降低表面張力，從而減少氣泡產(chǎn)生。另外，異戊醇有助于分相，使離心后的上層含DNA的水相、中間的變性蛋白相及下層有機(jī)溶劑相維持穩(wěn)定。商品信息：瓶/500ml。

理化性質(zhì)：無色液體，有不愉快的氣味。微溶于水，可混溶于醇、醚等有機(jī)溶劑。

儲存：儲存于陰涼、通風(fēng)的庫房。遠(yuǎn)離火種、熱源。庫溫不宜超過30℃。保持容器密封。應(yīng)與氧化劑、酸類等分開存放，切忌混儲。采用防爆型照明、通風(fēng)設(shè)施。禁止使用易產(chǎn)生火花的機(jī)械設(shè)備和工具。儲區(qū)應(yīng)備有泄漏應(yīng)急處理設(shè)備和合適的收容材料。

危害：吸入、口服或經(jīng)皮膚吸收有麻醉作用。其蒸氣或霧對眼睛、皮膚、粘膜和呼吸道有刺激作用，可引起神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂，長時間接觸有麻醉作用。易燃，其蒸氣與空氣可形成爆炸性混合物，遇明火、高熱能引起燃燒爆炸。12.無水葡萄糖

作用：ACD抗凝血劑成分之一。商品信息：500g/瓶。

理化性質(zhì)：無色結(jié)晶或白色結(jié)晶性粉末；無臭、味甜。水中易溶，在乙醇中微溶。儲存：無水葡萄糖易吸水結(jié)塊，因此應(yīng)密封保存。危害：無。

五、實(shí)驗試劑 1.75%的乙醇

{75ml + 25ml水} → 100ml75%的乙醇

2.ACD抗凝劑 100ml（共需48ml，每管0.8ml）

{檸檬酸0.48g + 檸檬酸鈉1.32g + 葡萄糖1.47g} →加水至100ml，滅菌后備用。3.禽血裂解液 100ml（共需51ml，每管1.7ml）

{尿素12g + SDS 1g + 1M Tris-HCl(PH8.0)10ml + 0.5M EDTA(PH8.0)20ml} →加水定容至100ml，備用。

【0.5M EDTA（PH8.0）】的配制：100ml {水80ml + EDTA-2Na 18.61g} →用NaOH（約2g）調(diào)至PH8.0 →定容至100ml →分裝后高壓滅菌備用。注：需加入NaOH調(diào)至PH8.0才能完全溶解。4.氯仿-異戊醇（24:1）共需54ml，每管1.8ml {氯仿 96ml + 異戊醇 4ml} = 100ml，4℃保存

5.酚-氯仿-異戊醇（25:24:1）共需60ml，每管2ml {氯仿-異戊醇（24:1）40ml + Tris飽和酚40ml} = 80ml，4℃保存 6..TE緩沖液 PH8.0 50ml {10mM Tris-HCl（PH8.0）緩沖液 0.5ml + 0.5M EDTA（PH8.0）0.1ml} → →定容到50ml →高壓滅菌后冷卻4℃保存 【0.5M EDTA（PH8.0）】的配制：100ml {水 80ml + EDTA-2Na 18.61g} →用NaOH（約2g）調(diào)至PH8.0 →定容至100ml →分裝后高壓滅菌備用。注：需加入NaOH調(diào)至PH8.0才能完全溶解?！?0mM Tris-HCl（PH8.0）緩沖液】的配制：10ml {1M Tris-HCl PH8.0緩沖液100μl + 水9.9ml} →定容至10ml → 10mM Tris-HCl（PH8.0）緩沖液

六、實(shí)驗步驟

1.采用翅靜脈采血，抽取血液5mL，溶于20mL 75%的乙醇中，振蕩混勻，配成家雞血樣25ml（酒精：血＝4：1）目的：乙醇可以抑制DNA水解酶的活性，防治DNA降解，并且75%有防止血液凝固的作用。75%乙醇效果比無水乙醇效果好，血樣不至于太干澀。酒精:血(4:1)混合的血樣保存時間長，可達(dá)4個月。

2.取血樣(酒精:血＝4:1)680(L至5mL離心管中，8000轉(zhuǎn)離心1分鐘，棄上清； 目的：去除血樣中大部分的乙醇，保證后面蛋白酶K的活性。

3.加800(LACD搖勻，8000轉(zhuǎn)離心1分鐘，棄上清；再加800(LACD搖勻，8000轉(zhuǎn)離心1分鐘，棄上清；

目的：ACD抗凝劑可以螯合血液中的鈣離子，防治血細(xì)胞凝集成團(tuán)凝固，影響血細(xì)胞的破碎和對血細(xì)胞里DNA的提取。多次離心可以去除血樣中的乙醇，保證后面蛋白酶K的活性。4.加1700(L裂解液，10(L蛋白酶K（100(g），搖勻，55℃水浴保溫過夜； 目的：DNA裂解液的作用是破壞細(xì)胞膜、核膜,并使組織蛋白與DNA分離，抑制細(xì)胞中DNase的活性；而蛋白酶k的作用是將蛋白質(zhì)降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分離出來，蛋白酶k還可以消化DNAse，提高DNA產(chǎn)量。55℃水浴保溫過夜可以讓蛋白酶K充分發(fā)揮作用。

5.加2mL飽和酚，搖勻至無塊狀物，12000轉(zhuǎn)離心10分鐘；

目的：飽和酚是強(qiáng)蛋白質(zhì)變性劑，可以將蛋白質(zhì)及降解后的產(chǎn)物充分變性，變性后的蛋白質(zhì)溶解度減低，易沉淀。

6.吸取上層透明的DNA溶液至另一5mL離心管中，注意不要攪拌下層的酚－蛋白層；

目的：加入飽和酚后溶液分層，上層是透明的DNA溶液，再往下是變性的蛋白質(zhì)，飽和酚的比重最大在最下層。

7.加2mL酚-氯仿-異戊醇（25：24：1），搖勻至懸浮液，12000轉(zhuǎn)離心10分鐘； 目的：加入酚-氯仿-異戊醇進(jìn)一步去除DNA溶液中的殘留蛋白質(zhì)。

8.吸取上層DNA液于另一5mL離心管中，加1.8mL氯仿-異戊醇溶液，搖勻，12000轉(zhuǎn)離心10分鐘； 目的：由于酚與水有部分混溶，DNA水溶液中會混有部分酚，由于氯仿和酚互溶而不溶于水，用氯仿-異戊醇在抽提一次可以把酚帶走。

9.吸取上層DNA液900(L于另一5mL離心管中，加無水乙醇至滿，顛倒混合，試管中出現(xiàn)白色團(tuán)塊，即是DNA；

目的：DNA水溶液是DNA以水合狀態(tài)穩(wěn)定存在，當(dāng)加入乙醇時，乙醇與DNA不相溶但與水相溶，乙醇會奪去DNA周圍的水分子，使DNA失水而易于聚合收集。用無水乙醇的目的是乙醇中如果含有水，DNA會部分溶于水中，降低DNA沉淀的產(chǎn)量。

10.吸出試管中的無水乙醇，加75%的乙醇，混合，吸出75%的乙醇，重復(fù)2次；

目的：像前面步驟中加入的抗凝血劑中的檸檬酸鈉、葡萄糖，裂解液中的SDS、EDTA-2Na，在氯仿及醇中的溶解度低，經(jīng)乙醇沉淀后的DNA中會有以上雜質(zhì)存在。以上雜質(zhì)有個共同的特征就是都易溶于水，故用75%的乙醇洗滌，可以利用其中的15%的水溶解這些雜質(zhì)除去。11.將DNA自然晾干后溶入1000(L TE緩沖液，-20℃保存；

目的：乙醇已揮發(fā)除去，TE緩沖液一可以抑制Dnase活性，二維持一定堿性PH值，有助于DNA的溶解和穩(wěn)定。

七、實(shí)驗注意事項

1.在整個實(shí)驗過程中應(yīng)嚴(yán)格執(zhí)行無菌操作； 2.部分藥品有毒，操作中應(yīng)注意安全防護(hù)；

3.剛投入水浴時可以稍快速的晃動，之后的晃動一定要輕柔； 4.抽提時不要有太力振動，操作也要仔細(xì)，盡量避免DNA斷裂；

5.吸出試管中的無水乙醇時用的槍頭一定要剪過的，這點(diǎn)很重要，過尖的槍頭會把DNA鏈弄斷。

八、思考題

1.本實(shí)驗中幾次用到的不同濃度乙醇的作用是什么？

九、實(shí)驗安排

全班55人，按照學(xué)號分組，每6人一組，共9組，最后一組7人。每組作3個離心管，共用一個研缽。

每3組（共18人9個離心管）共同進(jìn)行離心操作。

第二篇：實(shí)驗四 植物DNA的提取[定稿]

實(shí)驗四

植物DNA的提取

一、實(shí)驗?zāi)康?/p>

掌握CTAB法從植物葉片提取DNA的原理和方法。采用CTAB法從植物葉片中提取基因組DNA，并進(jìn)行純度分析。

二、實(shí)驗原理

1、核酸提取的基本原理

核酸是生物有機(jī)體中的重要成分，在生物體中核酸常與蛋白質(zhì)結(jié)合在一起，以核蛋白的形式存在。核酸分為脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)兩大類，在真核細(xì)胞中，前者主要存在于細(xì)胞核中，后者主要存在于細(xì)胞質(zhì)及核仁里。在制備核酸時，通過研磨破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，使核蛋白被釋放出來。

在濃氯化鈉溶液(1～2 mol／L)中，DNA核蛋白的溶解度很大，RNA核蛋白的溶解度很?。欢谙÷然c溶液(0.14 mol／L)中，DNA核蛋白的溶解度很小，RNA核蛋白的溶解度很大。因此，可利用不同濃度的氯化鈉溶液將DNA核蛋白和RNA核蛋白從樣品中分別抽提出來。分離得到核蛋白后，需進(jìn)一步將蛋白等雜質(zhì)除去，常采用的去除蛋白的方法有3種：①用含異戊醇的氯仿振蕩核蛋白溶液，使其乳化，然后離心除去變性蛋白質(zhì)，此時蛋白質(zhì)凝膠停留在水相和氯仿相中間，而DNA溶于上層水相。用兩倍體積的無水乙醇溶液將DNA鈉鹽沉淀出來。如果用酸性乙醇或冰乙酸來沉淀，得到的是游離的DNA。②用十二烷基硫酸鈉(SDS)等去污劑使蛋白質(zhì)變性，與核酸分離，從而從材料中直接提取出DNA。③用苯酚處理，然后離心分層，DNA溶于上層水相，蛋白變性后則停留在酚層內(nèi)。吸出上面水層，加兩倍體積的無水乙醇溶液，得到白色纖維狀DNA沉淀。反復(fù)使用上述方法多次處理DNA核蛋白溶液，就能將蛋白等雜質(zhì)較徹底地除去，得到較純的DNA制品。為了徹底除去DNA制品中混雜的RNA，可用RNA酶處理。生物材料中含有的脂肪物質(zhì)和大部分的多糖，在用鹽溶液分離核蛋白和用乙醇或異丙醇分級沉淀時即被除去。

在DNA提取、制備的過程中，核酸極不穩(wěn)定，許多因素可破壞其完整結(jié)構(gòu)：①化學(xué)因素，核酸的結(jié)構(gòu)在pH值4.0～11.0間較穩(wěn)定，pH值在此范圍外就會使核酸變性降解，故制備過程應(yīng)避免過酸過堿。②物理因素，DNA分子鏈很長，是雙螺旋結(jié)構(gòu)，既有一定的柔性，又有一定的剛性，故強(qiáng)機(jī)械作用如劇烈攪拌會令DNA分子斷裂，不利于收集，應(yīng)加以避免。③酶的作用，細(xì)胞中普遍存在的核酸酶在細(xì)胞壁或膜遭到破壞時被釋放出來，它會降解DNA分子。故須用酶的變性劑、抑制劑使之失活。操作過程最好在低溫(0℃左右)下進(jìn)行。常用的酶抑制劑有檸檬酸鹽、氟化物、砷酸鹽、乙二胺四乙酸鹽、(ETDA-Na)等。SDS和苯酚作為蛋白變性劑，同時可使核酸酶被破壞而失活。

2、CTAB法和SDS法的提取原理

（1）CTAB法是一種快速簡便的提取植物總DNA的方法.。CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）是一種陽離子型去污劑，它不僅能使蛋白質(zhì)變性，而且還能與核酸形成特異的核酸-CTAB復(fù)合物，這種復(fù)合物溶于高鹽緩沖液（≥0.7M NaCl），降低鹽濃度，通過超速離心能選擇性地沉淀核酸，并與多糖等可溶性雜質(zhì)分開，CTAB-核酸復(fù)合物再用70-75%乙醇浸泡可脫掉CTAB。提取時先將新鮮的葉片在液氮中研磨，破碎其細(xì)胞，然后加入CTAB分離緩沖液，將DNA溶解出來，再經(jīng)氯仿－異戊醇抽提除去蛋白質(zhì)，最后通過異丙醇沉淀或低鹽離心得到DNA。

（2）SDS法也是提取植物DNA的常用方法。先將新鮮的葉片在液氮中研磨以機(jī)械力破本碎細(xì)胞壁，然后加入SDS使細(xì)胞膜破裂，并同時將蛋白質(zhì)和多糖等雜質(zhì)與核酸分開。加入KAc可使SDS—蛋白質(zhì)復(fù)合物轉(zhuǎn)變?yōu)槿芙舛雀〉拟淃}形式，使沉淀更加完全。

3、DNA的濃度測定和純度分析

（1）定磷法：是對樣品中核酸（DNA和RNA）含量的準(zhǔn)確定量。將樣品中的核酸用強(qiáng)酸（硫酸或高氯酸）消化成無機(jī)磷，然后用定磷試劑對生成的無機(jī)磷酸進(jìn)行滴定。定磷試劑是酸性鉬酸銨溶液，鉬酸銨能與無機(jī)磷酸定量結(jié)合成磷鉬酸絡(luò)合物，該絡(luò)合物能被抗壞血酸等還原劑還原成蘭色的鉬藍(lán)，在660nm處有最大光吸收。

（2）紫外光吸收法：核酸及其衍生物的紫外吸收高峰在260nm。1ug/mL的DNA溶液A260=0.020，1ug/mL的RNA溶液或單鏈DNA的A260=0.022~0.024。1個A260相當(dāng)于50ug/mL的DNA、40ug/mL的RNA。蛋白質(zhì)的最大吸收在280nm，多糖的最大吸收在230nm。純的DNA的A260/A280在1.8左右，純的RNA的A260/A280在2.0左右。

三、試劑和器材：

(1)1M Tris-cl（pH8.0）：Tris l21.1g溶于蒸餾水，用濃HCl調(diào)至pH8.0以蒸餾水定容至1000ml(2)CTAB分離緩沖液： 2g CTAB，8.18g NaCL，0.74g EDTA.Na2.2H2O，10mL 1mol/L的Tris-HCL(pH8.0)，0.2mL巰基乙醇，加水定容到100mL。

(3)洗滌緩沖液（70%乙醇，10mmol/L乙酸銨）：70mL無水乙醇，0.077g乙酸銨，加水到100mL。(4)TE緩沖液：10mmol/L Tris-HCL（pH7.4），1mmol/L EDTA(5)氯仿:異戊醇=24:1(6)液氮

(7)研缽，恒溫水浴（37～100℃），離心機(jī)，離心管。

四、操作方法：

(1)將10mlCTAB分離緩沖液加入50ml離心管中，置于65℃水浴中預(yù)熱。(2)稱取1.5g葉片，置于預(yù)冷的研缽中，倒入液氮，盡快將葉片研碎。(3)取1g粉末直接加入預(yù)熱的CTAB分離緩沖液中，輕輕轉(zhuǎn)動使之混勻。

(4)樣品于65℃保溫30分鐘，每5～10分鐘混勻一次。(5)加等體積（10ml）的氯仿－異戊醇，輕輕顛倒混勻。(6)室溫下4000r/min離心10分鐘。

(7)用膠頭滴管將上層水相吸入另一干凈的離心管中（注意不要吸動懸浮的細(xì)胞碎片和中間白色的蛋白質(zhì)層），向離心管中加入2/3體積的異丙醇，輕輕混勻，使DNA析出。（有些情況下，這一步可以產(chǎn)生云霧狀的DNA析出，如果看不到云霧狀的DNA，樣品則可以在冰浴中放置數(shù)小時甚至過夜）。(8)用下述方法收集DNA：

如果呈云霧狀的DNA析出，則用玻璃棒在云霧狀的DNA中輕輕轉(zhuǎn)動，纏起DNA，然后將玻璃棒轉(zhuǎn)移至20mL洗滌緩沖液中浸泡洗滌10分鐘（不要將DNA沉淀從玻璃棒上弄掉）。

如果看不到云霧狀的DNA，可將離心管在4000r/min離心5分鐘，小心地倒掉上清液，在松散的沉淀上加20mL洗滌緩沖液，輕輕轉(zhuǎn)動離心管，洗滌核酸沉淀10分鐘，然后離心，小心地倒掉上清液，讓DNA沉淀自然干燥20分鐘。(9)用玻璃棒纏出DNA，在室溫下使DNA自然干燥20分鐘。(10)

將自然干燥的DNA溶于1mLTE緩沖液中，—20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(11)

取100uL稀釋20倍，測定A260，A280，A230，或作出吸收波譜200~400nm并計算濃度和得率。

(12)

取5~10uLDNA溶液做0.7%的瓊脂糖電泳，檢查DNA的大小和質(zhì)量，以λ-DNA/HindⅢ做分子量標(biāo)準(zhǔn)，另取5uL做限制性酶切。

注意；所有操作均須溫和，避免劇烈震蕩。

五、思考題

1、CTAB、EDTA、巰基乙醇的作用是什么？

2、吸取樣品、抽提、及電泳時應(yīng)注意什么？為什么？

第三篇：DNA粗提取及鑒定教案

《DNA粗提取及鑒定》

一、學(xué)習(xí)目標(biāo)：

學(xué)生通過對本節(jié)內(nèi)容的探究學(xué)習(xí)：能

⑴了解DNA的物理化學(xué)性質(zhì)。⑵理解DNA粗提取與鑒定的原理。⑶掌握DNA粗提取及鑒定方法，⑷利用DNA的性質(zhì)進(jìn)行實(shí)驗分析和實(shí)驗設(shè)計。

二、本節(jié)內(nèi)容學(xué)習(xí)的重點(diǎn)：DNA的粗提取和鑒定原理、方法。

難點(diǎn)：DNA的粗提取和鑒定原理、方法。

三、自主探究

（一）（閱讀教材、學(xué)案；探究下列問題）

1、提取生物大分子的基本思路？

2、提取DNA的基本思路？

3、用文字和坐標(biāo)曲線描述DNA的溶解性；并思考該問題在DNA粗提取中將有何應(yīng)用？

4、DNA在酒精溶液中的溶解性

5、DNA對酶、高溫和洗滌劑的耐受性

6、如何來進(jìn)行DNA鑒定

自主探究

（二）（閱讀教材、學(xué)案；探究下列問題）

1、進(jìn)行DNA粗提取應(yīng)選擇什么樣的材料；你的選擇的理由？

2、為什么加入蒸餾水能使雞血細(xì)胞破裂？

3、如何破碎植物細(xì)胞，并獲取含DNA的濾液；請舉例說明，并告訴自己應(yīng)注意什么？

自主探究

（三）（閱讀教材、學(xué)案；探究下列問題）

去除濾液中的雜質(zhì)

1、此步驟獲得的濾液中可能含有哪些細(xì)胞成分？

2、方案一中為什么反復(fù)地溶解與析出DNA，能夠去除雜質(zhì)？

3、方案二與方案三的原理有什么不同？

自主探究

（四）（閱讀教材、學(xué)案；探究下列問題）

1、DNA析出的原理，DNA析出物是什么顏色？

2、DNA鑒定需要設(shè)置對照嗎？要注意什么問題？ 四：

討論

（一）你幫助、我改正；我質(zhì)疑，共提升

小組內(nèi)討論自主探究內(nèi)容并自行改正

討論

（二）你我同思考，細(xì)總結(jié)，共同突破難點(diǎn)

小組內(nèi)討論：總結(jié)

1、本實(shí)驗的實(shí)驗原理

2、DNA粗提取與鑒定過程

3、此實(shí)驗過程中有幾次使用蒸餾水？幾次過濾，幾次析出？分別在哪一步？

五：

小組間質(zhì)疑，完善 六：課堂小結(jié)

七：達(dá)標(biāo)檢測；當(dāng)堂掌握 知識拓展：課下思考總結(jié)：

1、在我們的高中生物學(xué)習(xí)中有顏色反應(yīng)的實(shí)驗有那些？

2、DNA在不同濃度氯化鈉溶液中溶解度的變化曲線還能表示那些量的關(guān)系？

3、還有那些實(shí)驗中用到了酒精，他們的作用是？

第四篇：實(shí)驗一大腸桿菌DNA的提?。▽憣憥屯扑]）

大腸桿菌總DNA的提取

實(shí)驗原理：本實(shí)驗利用溶菌酶和堿裂解液SDS使細(xì)胞壁破壞，利用氯仿抽提的方法去除蛋白質(zhì)，得到的DNA溶液利用乙醇將DNA沉淀下來。

實(shí)驗?zāi)康模?.掌握DNA提取的原理和方法；

2.掌握瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的方法 實(shí)驗材料：

1.實(shí)驗菌株：大腸桿菌

2.試劑：TE溶液：Tris?HCl 10 mM，EDTA 1 mM，pH 8.0，20% SDS：

溶菌酶（50mg/ml）

5M NaCl

氯仿：異戊醇（24：1 v/v）

無水乙醇

0.8%瓊脂糖

TAE電泳緩沖液 儀器：離心機(jī)，電泳儀 實(shí)驗步驟：

1)取1.5ml培養(yǎng)好的大腸桿菌培養(yǎng)液與離心管中，7,000 rpm離心5 min，棄上清； 2)加入500ul TE溶液洗滌菌體7,000 rpm離心5 min，棄上清；

3)用360ul TE溶液懸浮菌體，加入20ul 溶菌酶（50mg/ml），37°C保溫30min； 4)加入40ul 20 %SDS使其終濃度為2 %，60°C水浴30min。5)加入110ul 5 M 高氯酸鈉 使其終濃度為1 M，充分混勻；

6)加入等體積氯仿：異戊醇（24：1 v/v），充分混勻，4°C 12,000 rpm 離心15min，吸取上清于一新離心管中；

7)加入2倍體積的無水乙醇，混勻后12000rpm 離心10min； 8)棄上清，離心管在空氣中自然晾干； 9)加入30-40ul TE溶解DNA；

10)取3-5ul DNA溶液，瓊脂糖電泳檢測。

第五篇：高中生物必修二實(shí)驗十一DNA的粗提取與鑒定

實(shí)驗十一

DNA的粗提取與鑒定 教學(xué)目的

初步掌握DNA粗提取和鑒定的方法。觀察提取出來的DNA物質(zhì)。實(shí)驗原理

DNA在NaCl溶液中的溶解度是隨NaCl的濃度變化而改變的。DNA在0．14mol/L的NaCl溶液中的溶解度最低，據(jù)此可使溶解于NaCl溶液中的DNA析出。DNA不溶于酒精溶液，但細(xì)胞中某些物質(zhì)可以溶于酒精溶液，據(jù)此可提取雜質(zhì)較少的DNA。DNA＋二苯胺藍(lán)色（用于DNA的鑒定）實(shí)驗步驟 1．材料制備

0.1G/ml檸檬酸鈉100ml

500ml燒杯→玻璃棒攪拌→1000r/min離心2min→吸去上清液→ 活雞血180ml

即得雞血細(xì)胞液（也可將上述燒杯置于冰箱中，靜置一天使雞血細(xì)胞自行沉淀）2．方法步驟

取血細(xì)胞液5-10ml＋20ml蒸餾水，玻璃棒沿一個方向快速攪拌

（1）提取血細(xì)胞核物質(zhì)紗布過濾，濾液中含DNA和其他核物質(zhì)，如蛋白質(zhì) 原理：血細(xì)胞的細(xì)胞膜、核膜吸水脹破，玻璃棒快速攪拌機(jī)械加速血細(xì)胞破裂（2）溶解核內(nèi)DNA：濾液＋2mol/LNaCl溶液40ml，玻璃棒沿一個方向攪拌

（3）析出含DNA的粘稠物：向上述溶液中緩緩加入蒸餾水，并輕輕地沿一個方向攪拌，出現(xiàn)絲狀物，當(dāng)絲狀物不再增加時，停止加水（此時NaCl溶液相當(dāng)于稀釋到0．14mol/L）（4）濾取含DNA的粘稠物：用多層紗布過濾，含DNA的粘稠物留在紗布上（5）DNA粘稠物再溶解：

20ml2mol/LNaCl溶液

50ml燒杯，上述粘稠物緩慢攪拌3 min（6）過濾含DNA的2mol/LNaCl溶液：用2層紗布過濾，濾液中含DNA（7）提取含雜質(zhì)較少的DNA：上述溶液＋95%酒精，緩慢攪拌，出現(xiàn)乳白色絲狀物，用玻璃棒將絲裝物卷起。（8）DNA鑒定：

實(shí)驗關(guān)鍵：

本實(shí)驗成功的關(guān)鍵是獲取較純凈的DNA，因此應(yīng)注意：

1．充分?jǐn)嚢桦u血細(xì)胞液。DNA存在于雞血細(xì)胞核中。將雞血細(xì)胞與蒸餾水混合以后，應(yīng)用 玻璃棒沿一個方向快速攪拌，使血細(xì)胞加速破裂，并釋放出DNA 2．沉淀DNA必須用冷酒精。實(shí)驗前必須準(zhǔn)備好大量95%的酒精，并在冰箱中（5℃以下）至少存放24小時。

3．正確攪拌含有懸浮物的溶液。在第（3）、（5）步驟，玻璃棒不要直插燒杯底部，且攪拌要輕緩，以便獲得較完整的DNA分子。在步驟（7），要將玻璃棒插入燒杯溶液中間，用手緩慢轉(zhuǎn)動5-10min?！就愵}庫】

．在“DNA的粗提取與鑒定”的實(shí)驗中分別使用2mol／L、0．14mol／L、2mol／L、0015mol／L的氯化鈉溶液，其作用分別是（A）A．溶解、析出、溶解、溶解

C．溶解、溶解、析出、溶解 B．析出、溶解、析出、溶解

D．溶解、析出、溶解、析出 ．下列圖示中能反映DNA溶解度與NaCI溶液濃度之間關(guān)系的是（C）

．DNA在下列哪種濃度的NaCl溶液中溶解度最低（B）

A．2．00mol/L

B．0．14 mol/L

C．0．015 mol/L

D．0．10 mol/L ．在DNA的粗提取過程中，初步析出DNA和提取較純凈的DNA所用的藥品的濃度和名稱分別是（B）

①0．1 g/ml的檸檬酸鈉溶液②2．00mol/L的NaCl溶液③0．14 mol/L的NaCl溶液④體積分?jǐn)?shù)為95%的酒精溶液⑤0．015 mol/L的NaCl溶液⑥0．04 mol/L的NaCl溶液 A．①③⑤

B．③④

C．②④

D．②③④ ．與析出DNA粘稠物有關(guān)的敘述，不正確的是（C）A．操作時緩緩滴加蒸餾水，降低DNA的溶解度

B．在操作A時，用玻璃棒輕緩攪拌，以保證DNA分子完整 C．加蒸餾水可同時降低DNA和蛋白質(zhì)的溶解度，兩者均可析出 D．當(dāng)絲狀粘稠物不再增加時，此時NaCl的濃度約為0.14mol/L.．（多選）下列有關(guān)“DNA粗提取”的操作中，正確的是（ABCD）A．在雞血細(xì)胞液中加入蒸餾水

B．在“析出DNA粘稠物”時，要緩緩加入蒸餾水，直至溶液中粘稠物不再增多 C．在用酒精凝集DNA時，要使用冷酒精 D．用玻璃棒攪拌時要沿一個方向 ．“DNA的粗提取與鑒定實(shí)驗”中有三次過濾：（1）過濾用蒸餾水稀釋過的雞血細(xì)胞液。（2）過濾含粘稠物的0.14mol/L NaCl.（3）過濾溶解有DNA的2mol/L NaCl.以上三次過濾分別為了獲得（A）

A．含核物質(zhì)的濾液、紗布上的粘稠物、含DNA的濾液 B．含核物質(zhì)的濾液、濾液中DNA粘稠物、含DNA的濾液 C．含核物質(zhì)的濾液、濾液中DNA粘稠物、紗布中DNA D．含較純的DNA濾液、紗布上粘稠物、含DNA的濾液

．為獲取較純凈的DNA，采集來的血樣可用蛋白酶處理，然后用有機(jī)溶劑除去蛋白質(zhì)。下列有關(guān)敘述，正確的是（D）

A．除去血漿中的蛋白質(zhì)

B．除去染色體上的蛋白質(zhì)

C．除去血細(xì)胞表面的蛋白質(zhì)

D．除去血細(xì)胞中所有的蛋白質(zhì)

．在“DNA的粗提取與鑒定實(shí)驗”中，和“使用蛋白酶從染色體中提取DNA”中的蛋白酶具有相似作用的物質(zhì)是（D）

A．NaCl溶液

B．蒸餾水

C．檸檬酸鈉

D．冷卻的酒精 ．DNA不溶于下列何種溶液（D）

A．NaCl溶液

B．KCl溶液

C．MgCl溶液

D．酒精溶液 ．下列不同濃度的NaCl溶液中，使DNA析出最徹底和溶解度最高的是（A）①0.14mol/L ②2mol/L ③0.25mol/L ④0.015 mol/L A．①和②

B．②和①

C．②和③

D．②和④ ．下列操作中，對DNA的提取量影響較小的是（B）

A．使雞血細(xì)胞在蒸餾水中充分破裂，放出DNA等核物質(zhì) B．?dāng)嚢钑r，要用玻璃棒沿一個方向輕緩攪動

C．在析出DNA粘稠物時，要緩緩加入蒸餾水，直至溶液中粘稠物不再增多 D．在用酒精沉淀DNA時，要使用冷酒精，甚至再將混合液放入冰箱中冷卻 E．在DNA的溶解和再溶解時，要充分?jǐn)嚢?．在“DNA的粗提取與鑒定實(shí)驗”中：

（1）實(shí)驗中兩次使用蒸餾水，第一次目的是，第二次目的是。

（2）說明不同濃度的NaCl溶液的作用： 2mol/L NaCl的作用； 0.14mol/L NaCl的作用； 0.015 mol/L NaCl的作用；

（3）提純DNA的原理是，所用試劑為。攪拌要，目的。

（4）能否用哺乳動物血液代替？簡述理由。

[（1）使血細(xì)胞吸水破裂，溶解細(xì)胞核內(nèi)的DNA；降低NaCl溶液的濃度，降低DNA分子在NaCl溶液中的溶解度析出DNA分子（2）溶解含DNA的核物質(zhì)；使含DNA的絲狀粘稠物析出DNA分子；進(jìn)行DNA鑒定（3）DNA不溶于酒精溶液，但細(xì)胞中某些鹽類蛋白質(zhì)可溶于酒精溶液；95%的冷卻酒精；輕緩、同方向；保持DNA分子的完整性（4）不能，成熟的哺乳動物紅細(xì)胞沒有細(xì)胞核] ．此實(shí)驗中有幾次用玻璃棒攪拌，每次攪拌的方向是一致的；但每次攪拌的強(qiáng)度不同，請就此予以說明。

（1）提取雞血細(xì)胞核內(nèi)物質(zhì)時，應(yīng)攪拌，目的是。

（2）向含核物質(zhì)的2mol/L NaCl 溶液滴加蒸餾水析出DNA粘稠物時，應(yīng)攪拌，目的是。（3）DNA粘稠物再溶解于2mol/L NaCl 溶液時，應(yīng)攪拌，目的是。（4）用95%的冷卻酒精提取含雜質(zhì)較少的DNA時，應(yīng)攪拌，目的是。

[（1）快速；加速血細(xì)胞破裂（2）輕緩；盡量保持DNA分子的完整性（3）輕緩；盡量保持DNA分子的完整性（4）輕緩；保持DNA分子的完整性] ．以下是有關(guān)DNA的粗提取實(shí)驗的閱讀材料：

a．核酸極不穩(wěn)定，在較為劇烈的化學(xué)、物理因素和酶的作用下很容易降解。在制備DNA時要加入DNA酶（水解DNA的酶）的抑制劑檸檬酸鈉，以除去Mg，防止DNA酶的激活。b．核酸中的DNA和RNA在生物體內(nèi)均以核蛋白（由核酸和蛋白質(zhì)組成）的形式存在，DNA核蛋白在1 mol/L NaCl 溶液中溶解度很大，但在0.14mol/L NaCl 溶液中溶解度很低；而RNA核蛋白溶于0.14mol/L NaCl 溶液。

c．用苯酚處理，可使蛋白質(zhì)變性，且留在苯酚層內(nèi)；在DNA溶液中加入2．5倍體積，濃度為95%的酒精，可將DNA分離出來。此時DNA十分粘稠，可用玻璃棒攪成團(tuán)取出。d．DNA在強(qiáng)酸性環(huán)境下，水解產(chǎn)生脫氧核糖等小分子物質(zhì)，它與二苯胺酸性溶液反應(yīng)，能生成藍(lán)色化合物。

e．實(shí)驗材料與器械：檸檬酸鈉溶液、石英砂、0.14mol/L NaCl 溶液、1 mol/L NaCl 溶液、苯酚、95%的酒精、二苯胺試劑、濃硫酸、花椰菜、研缽、燒杯、漏斗、玻璃棒、量筒、石棉網(wǎng)、酒精燈、吸管、試管等。

以下是DNA粗提取實(shí)驗的步驟，請根據(jù)以上閱讀材料回答有關(guān)問題：（1）研磨：取10克花椰菜加適量的、和石英砂，研磨成勻漿。（2）過濾。（3）將濾液稀釋6倍，其目的是：。（4）離心處理，產(chǎn)生沉淀。

（5）取沉淀物，置于2毫升1 mol/L NaCl 溶液中，使DNA核蛋白再次溶解，再加2毫升苯酚充分震蕩后靜止，待其分層后棄其上層苯酚。這一步的目的是除去。（6）如何將剩余溶液中的DNA提取出來？。（7）如何證明提取物質(zhì)確實(shí)是DNA分子？。

其實(shí)驗過程的要點(diǎn)是向放有DNA的試管中加入適量該試劑，混合均勻后，將試管置于中5min，待試管后，觀察試管中的顏色變化。這個實(shí)驗也說明DNA耐溫，前次溫度有利于，后次溫度則有利于DNA。

[（1）檸檬酸鈉溶液、1 mol/L NaCl 溶液（3）使DNA核蛋白溶解度降低而析出（5）（DNA核蛋白中的）蛋白質(zhì)（6）向下層溶液中加2．5倍體積，濃度為95%的酒精，此時用玻璃棒攪動，玻璃棒上成團(tuán)的物質(zhì)即是DNA（7）用適量濃硫酸處理提取物，再滴加二苯胺酸性溶液數(shù)滴，如有藍(lán)色物質(zhì)出現(xiàn)即可證明提取物為DNA。沸水??；冷卻；高；加快染色反應(yīng)的速度；析出。] ．“DNA的粗提取與鑒定”實(shí)驗中，A、B、C、D、E五個小組除下表中所列處理方法不同外，其他操作步驟均相同，而且正確，但實(shí)驗結(jié)果卻不同。組別

實(shí)驗材料

提取核物質(zhì)時 加入的溶液

去除雜質(zhì)時 加入的溶液

DNA鑒定時 加入的試劑

A

雞血

蒸餾水

95％的酒精(25C)

二苯胺

B 菜花

蒸餾水

95％的酒精(冷卻)雙縮脲，C 人血漿

蒸餾水

95％的酒精(冷卻)

二苯胺

D

人血細(xì)胞

2mol／L的氯化鈉

0．14mol／L的氯化鈉

雙縮脲

E

雞血

蒸餾水

95％的酒精(冷卻)

二苯胺

(1)實(shí)驗材料選擇錯誤的組別是。其原因是。

(2)實(shí)驗步驟(不包括實(shí)驗材料)均正確，但得不到DNA的組別是。

(3)沸水浴中試管顏色變藍(lán)的組別是；藍(lán)色較淡的是，其原因是。(4)B組實(shí)驗不成功的最主要原因是。[(1)C、D 人的血漿中沒有細(xì)胞結(jié)構(gòu)，成熟的紅細(xì)胞中沒有細(xì)胞核，選用這些材料得不到DNA或得到的DNA很少

(2)C(3)A、E A 冷卻的酒精對DNA的凝集效果較佳，該組使用的是25℃的酒精

(4)菜花細(xì)胞在蒸餾水中不能被破壞，得不到DNA(應(yīng)采用研磨的方法)] ．在“DNA的粗提取與鑒定”的實(shí)驗中，有同學(xué)按書本知識和自己的思路，試做了如下實(shí)驗，請你判斷實(shí)驗結(jié)果。

(1)他把與檸檬酸鈉混合的新鮮血液放在幾層紗布上過濾，紗布上最主要的結(jié)構(gòu)是。

(2)他在含有DNA、RNA及蛋白質(zhì)等的混合物中加入大量的物質(zhì)的量濃度為2．0mol/L的氯化鈉溶液后，通過攪拌后，放在幾層紗布上過濾，他得到的濾液中一定含有實(shí)驗?zāi)康闹行枰崛〉某煞质恰?/p>

(3)他在上述濾液中加入冷酒精(體積分?jǐn)?shù)為95％)，并用玻璃棒向—個方向攪拌，溶液中的絲狀物的主要成分是。

(4)他把含有DNA、RNA、蛋白質(zhì)與氯化鈉的混合溶液稀釋成物質(zhì)的量濃度為0．14mol/L的氯化鈉溶液后，放在幾層紗布上過濾，他得到的濾液中含量最多的成分是。[血細(xì)胞

DNA DNA 水] ．請利用如下實(shí)驗材料做相關(guān)實(shí)驗，再選擇其中的一種實(shí)驗材料，設(shè)計一個實(shí)驗，以展示你的科學(xué)素養(yǎng)和創(chuàng)新才能。

(1)如用上述材料做觀察植物細(xì)胞的有絲分裂、葉綠體中色素的提取和分離、觀察植物的向性運(yùn)動等實(shí)驗。你選擇的最佳材料依次是(填圖中序號即可)。

(2)如用紫色洋蔥表皮做完細(xì)胞的質(zhì)壁分離及復(fù)原實(shí)驗后，又用此裝片觀察細(xì)胞分裂，結(jié)果未觀察到處于分裂期的細(xì)胞。請解釋原因。(3)創(chuàng)新實(shí)驗設(shè)計方案

實(shí)驗課題：探究鎳為植物生活所必需的礦質(zhì)元素

材料用具：完全營養(yǎng)液甲、缺鎳的完全營養(yǎng)液乙、適當(dāng)?shù)娜萜骱凸潭ú牧?、長勢相似的玉米幼苗，含鎳的無機(jī)鹽。方法步驟： ①； ②； ②。

實(shí)驗預(yù)期：。

為進(jìn)一步驗證鎳元素一定是必需元素．還應(yīng)增加的實(shí)驗步驟及結(jié)果是：。

[（1）①⑤③（2）高度分化的細(xì)胞一般不能繼續(xù)分裂（3）①取長勢相似的等量玉米幼苗，編為甲、乙兩組；②甲組用營養(yǎng)液甲培養(yǎng)，乙組用營養(yǎng)液乙培養(yǎng)，其余條件均相同且適宜；③定期觀察并記錄兩組幼苗的生長情況。實(shí)驗預(yù)期：①若兩組長勢相似，則鎳不是玉米生活所必需的營養(yǎng)元素；②若甲組生長正常，乙組生長不良，則鎳是玉米生活所必需的營養(yǎng)元素。在乙組缺鎳的培養(yǎng)液中加入適量含鎳的無機(jī)鹽，若癥狀在不久后消失，則鎳一定是玉米生活所必需的營養(yǎng)元素。]