第一篇：小鼠MCAO總結(jié)

小鼠MCAO模型

一、實驗器材：

1.手術(shù)器械：眼科剪

1、顯微剪

1、鉤鑷

1、直鑷

1、顯微鑷

2、止血鉗

1、持針器

1、縫合線（2-0/5-0）、縫合針、麻醉劑：10%水合氯醛（350mg/kg）2.栓線：0.18mm（20~25g）、0.20mm(25~30g)；在栓線10mm的位置用黑色記號筆標(biāo)記；75%酒精清潔后置1: 2500單位肝素化生理鹽水中備用。

3.其他用品：酒精棉球、75%酒精、生理鹽水、注射器（1ml、2ml）、黑色記號筆、固定鼠用粗線繩、鼠板

二、步驟：Zea Longa 線栓法

1.麻醉：10％水合氯醛腹腔注射（350mg/kg）2.術(shù)前準(zhǔn)備：仰臥位固定大鼠，備皮消毒 3.分離血管及掛線：

1)自胸骨柄到下頜骨間取長約1cm 正中切口。見下頜下腺，將其分離至兩側(cè)；

2)見右側(cè)肩胛舌骨肌、胸骨舌骨肌、二腹肌形成的三角區(qū)，鏡下分離此三角區(qū)內(nèi)，暴露右側(cè)頸總動脈（CCA）、頸外動脈（ECA）、頸內(nèi)動脈（ICA）； 3)首先分離CCA于其上掛線1；

4)隨后向頭側(cè)分離ECA血管及其分支，于ECA上頭尾側(cè)分別掛線2、3；

5)然后清除CCA分叉部脂肪，觀察ECA分支與ICA關(guān)系，分離ICA及ECA分支，于其上掛線4；

6)注意操作輕柔避免迷走神經(jīng)、舌咽神經(jīng)、氣管損傷，避免過度牽拉血管使其嚴(yán)重移位或斷裂。

5.結(jié)扎：死結(jié)：線1、2；活結(jié)：線4；不系結(jié)：線3 6.剪口插入：

1)將鼠臺逆時針旋轉(zhuǎn)90°，在ECA上距分叉1~1.5mm用顯微剪剪一切口； 2)將標(biāo)記好的線栓由此切口插入CCA 中；

3)將鼠臺轉(zhuǎn)回，將線栓從CCA拔出至分叉稍尾側(cè)，右手將線栓轉(zhuǎn)向滑入ICA，右手拉開線4活結(jié)，后繼續(xù)插入ICA，待有阻力時再進(jìn)入少許，深度1cm+，到達(dá)大腦中動脈與前交通之間；

4)順利插入后將絲線4扎緊，抽出線3減去多余線頭。6.縫皮

7.術(shù)后：小鼠俯臥位，頭略抬高，至于溫濕度適宜環(huán)境。

三、注意事項：

1.雌性鼠對于牽拉等操作的反應(yīng)更強烈，故建議選擇雄性大鼠作為實驗對象。

2.大鼠解剖學(xué)變異：一般而言，F(xiàn)isher-344大鼠MCA解剖變異較小，閉塞后形成的梗死體積一致性好；Wistar-Kyoto 大鼠變異相對最大； 而Sprague-Dawley大鼠介于兩者之間。3.麻醉：10%水合氯醛腹腔注射（30ml/kg），一般可持續(xù)1~1.5h。如按標(biāo)準(zhǔn)體重計算的麻醉劑量效果欠佳，可使用總量的10%進(jìn)行追加。需注意反復(fù)多次或過量追加易造成動物死亡，或?qū)е虑逍淹七t而影響再灌注前評分，從而使再灌注時間不能統(tǒng)一界定在2h。水合氯醛可使動物呼吸頻率下降50%左右,但一般不會導(dǎo)致動物窒息而死亡。術(shù)中嚴(yán)密觀察動物呼吸頻率、深度及有無痰鳴音等。

4.分離氣管前肌肉時注意保護(hù)好甲狀腺和甲狀旁腺。甲狀腺呈鮮紅色，緊密貼在氣管前壁上，甲狀旁腺位于甲狀腺外上方，顏色略淡。血管分離要到位，使用電凝器可明顯減少小血管的出血，從而保證手術(shù)野清晰，尤其是肌肉內(nèi)部的血管和 ECA 的一些細(xì)小分

支，未明確時不可隨意離斷。結(jié)扎血管時要注意力度和方向，由于血管被膜被分離后血管表面相當(dāng)光滑，結(jié)扎不牢可能導(dǎo)致難以控制的出血；術(shù)中還要注意保護(hù)與血管緊密相依的神經(jīng)，注意觀察神經(jīng)的顏色、反光性和輕觸時的感覺，切勿損傷或離斷。牽拉迷走神經(jīng)時可見動物呼吸明顯減慢甚至血液呈深紫色，出現(xiàn)肢體末端紫紺。在無法給予輔助通氣時，應(yīng)暫停操作。一般來說，動物呼吸可恢復(fù)到麻醉后的平穩(wěn)狀態(tài)，血液顏色也可恢復(fù)到正常，這時再繼續(xù)手術(shù)較為安全。

5.關(guān)于是否結(jié)扎 PPA 文獻(xiàn)報道尚不一致。可沿ICA一直分離至看到其入顱分支與PPA分叉處，觀察線栓走行狀況，若順利將長度約1cm的線栓插入，則可固定線栓而無需對 PPA進(jìn)行操作； 如只進(jìn)入5mm左右即遇到明顯阻力，則線栓進(jìn)入PPA的可能性很大，此時可將線栓撤離至ECA/ICA處，提起PPA，以幫助線栓沿ICA進(jìn)入顱內(nèi)而最終阻塞MCA。

6.Koizumi等1986年首次報道不開顱經(jīng)CCA插入尼龍線栓致MCA閉塞；之后，Longa等進(jìn)行了改良，將栓線從ECA插入，再灌注時將栓線抽回ECA內(nèi)，通過CCA實現(xiàn)再灌注。Koizumi使用的絲線末段均勻包被硅膠，直徑增加近30~40%，插入后不僅可伸入大腦前動脈ACA）近端，肯定阻塞ACA及前交通動脈，而且阻塞MCA及后交通動脈開口處，徹底阻塞MCA及其所有側(cè)枝供應(yīng)血管，形成供應(yīng)區(qū)域完全缺血，因此局部梗死面積大，均勻一致，各動物間差異較小。Longa使用的4-0尼龍線末端球形擴(kuò)大，但并非直接閉塞MCA，而是依靠結(jié)扎同側(cè)ICA和其球形擴(kuò)大的末端伸入ACA腔內(nèi)、阻斷經(jīng)前交通動脈來自對側(cè)ACA的血流形成局灶性腦缺血，但不能阻斷來自后交動脈的側(cè)枝供應(yīng)，且絲線末端伸入ACA腔內(nèi)位置不同，所起作用差異很大，因此形成的梗死面積很小，各動物之間差異較大。宋紅松等建議采用Koizumi方法。丁香園：

1.注意盡量不要損傷在頸內(nèi)頸外分叉下的交感神經(jīng)節(jié)。2.栓線進(jìn)入后頸內(nèi)動脈后即可逐漸插入了，有時候很順利一插到底，但有時候在中間就怎么也進(jìn)不去了，這是因為在血管入顱穿過顱骨時有一個狹窄或者角度。因此，碰上這種明顯阻力時，一定不能盲目向前使力插，越插栓線前端變形越進(jìn)不去且容易損傷血管。這時候正確的作法是往外抽出較多栓線，也許會有一定的動脈血流出，不必慌，只要順著血管走行調(diào)整一下進(jìn)線角度輕柔的使勁，一般都能進(jìn)去，反復(fù)試幾次還不行最好換根栓線，很可能前端也經(jīng)變形角度變了！頸內(nèi)動脈的走向為內(nèi)上方,可以用眼科鑷夾住魚線插,但進(jìn)去后要注意,別太用力,要不血管就要破了

3.栓線不能在血管里反復(fù)進(jìn)退，否則及容易造成蛛網(wǎng)膜下腔出血，而且很容易誤解為模型成功，因為這時的神經(jīng)功能改變也很明顯，但并不是由于栓塞引起的

4.大鼠仰臥時，ICA從CCA分出后下行（向背側(cè)）約5mm又分為兩支A，即走向乳突泡（Mastoid bulla）的 翼腭A和進(jìn)入顱內(nèi)的ICA的延伸部分。因為翼腭A的走向幾乎和分

支前的ICA走向相同，而ICA的延伸部分則是改向頭側(cè)走行，所以插線時會很自然的進(jìn)入翼腭A。進(jìn)線時，用鑷子將ICA輕輕往頭側(cè)推一下，使ICA和其延長的分支成一直線，同時順勢插線，可很容易的進(jìn)入顱內(nèi)?；蚴顾ň€有一定程度的彎曲，且只要保證栓線向屋頂方向彎曲，一般都能將線插如顱內(nèi)，決不會進(jìn)入翼腭A。

5.注意手的感覺，輕緩?fù)七M(jìn)，直至感覺到阻力為

止（當(dāng)遇到阻力后，再插線會見到線彎曲）?？赡苡腥藭f，把血管插破了也未感覺到阻力或線遇阻后的彎曲。一個原因是線太硬，另一主要原因是當(dāng)栓線從血管切口插入后為防止血液從此處流出，需要結(jié)扎一條細(xì)線，這條線結(jié)扎的松緊程度很關(guān)鍵，應(yīng)在不流血的情況下盡可能的松，這樣你會發(fā)現(xiàn)進(jìn)線時很輕松，一旦遇到阻力，就會感覺到。后者至關(guān)重要，請體會。

6.栓線一旦進(jìn)入ACA，就要把上面提到的那根細(xì)線適度扎緊（“適度”很重要，會影響到再灌流時大鼠的生死存亡），此時的關(guān)鍵是動作輕柔，不要使ICA有任何的牽拉，否則栓線會脫出ACA，可能會造成缺血失敗。血管外的栓線不要留得過長，更不要縫在皮外，大鼠醒來后會自己拔出。

7.如果你用的是中長效麻醉劑，插線成功后，固定絲線，然后讓其俯臥位，而且稍稍抬高其頸部，才能確保模型成功。8.術(shù)后一定要注意保暖。

9.插入線拴要輕柔熟練，速度盡可能快，以避免時間長了血管內(nèi)血栓形成。

10.手術(shù)后評分的主觀因素很大，有用5分制和11分制的，我個人認(rèn)為用5分制比較準(zhǔn)些。11.大鼠大腦中動脈永久性閉塞性腦缺血模型，梗死體積出現(xiàn)的最小時間點可能為2h，體積隨時間進(jìn)行性增大，至12h基本趨于穩(wěn)定

12.整個試驗是很費動物的，存在15-30％的淘汰率（如果你做的好），但注意嚴(yán)格控制自己淘汰的動物（紀(jì)錄具體情況）。

13.除了剛才說的蛛網(wǎng)膜下腔出血外，還有一些老鼠肺出血明顯，整個肺暗紅，我也想不出原因，不知道是不是醫(yī)學(xué)臨床所說的腦肺綜合癥.14.術(shù)后處理：由于術(shù)后動物尚未清醒,因此護(hù)理也很重要。但為保證栓線成功,達(dá)到預(yù)期的阻塞時間,防止栓線脫落暫時把動物留在手術(shù)臺上,保證動物不會因掙扎而把栓線過早脫落,但仍需監(jiān)測體溫,并注意保暖。再灌注后動物可放入籠中。另外籠中應(yīng)保持干燥,沒有積水及粉塵,防止動物誤吸而窒息。我們在實驗中發(fā)現(xiàn)一些模型癥狀不典型甚至沒有癥狀,都是由于動物蘇醒后極力掙扎使栓線過早脫落所致。手術(shù)后大鼠存活期可以滿足通常的實驗需求,一般來講,隨著栓塞和再灌注損傷時間的延長,死亡率會上升。大鼠在術(shù)后24～48小時最容易死亡,這種死亡是嚴(yán)重腦缺血損傷造成的,較直接的因素是腦水腫。用線栓制作持續(xù)性局灶性腦缺血模型時,術(shù)后要肌注慶大霉素預(yù)防感染;如果動物模型要生存1周以上,必要肌注速尿,防止因腦水腫動物在短期內(nèi)死亡。術(shù)后飲水中加入葡萄糖,保證動物術(shù)后有充足的能量生存到實驗要求的時間。

舍去標(biāo)準(zhǔn)：

⑴栓線插入深度不足18 mm,且無明顯神經(jīng)功能缺損表現(xiàn)或癥狀很輕的大鼠 ⑵ 蛛網(wǎng)膜下腔出血、MCA起始部或其附近的willis環(huán)動脈有凝血塊的大鼠，因為這是出血性腦損傷或永久性腦缺血損傷，而非MCAO/Reperfusion損傷。3）手術(shù)時出血較多，癥狀很重的動物。死亡原因分析：

首先要找出死亡原因，解剖死亡大鼠的腦，先看是否有蛛網(wǎng)膜下腔出血，如有出血，表明死因是插線太深，以后注意插線深度；如無出血，則還要再看是否有嚴(yán)重的半球水腫，如水腫嚴(yán)重，則表明死因是腦缺血時間太重，需要縮短缺血時間；如既無出血，又無明顯的腦水腫，那就要注意動物狀態(tài)或生活環(huán)境是否太差。

第二篇：小鼠游泳實驗及解剖總結(jié)

小鼠游泳實驗及解剖總結(jié)

1測試小鼠的抗疲勞能力~有時候還需要測定其恢復(fù)能力~但實驗周期長，故不作要求~

2首先抓取小鼠，在天平上放一個燒杯，去零，稱重，記錄小鼠體重，為m g 稱保險絲，保險絲體重為小鼠體重百分之十~ Ps 方法：要用到刻度尺，首先稱一定長度的保險絲的重量，如記為a cm，重量為n g，則我們要量取的保險絲長度為x=0.1m*a/n

3用細(xì)繩系上保險絲（要注意細(xì)繩的長度要適當(dāng)），怎么系呢，系在尾巴根部，用一燒杯扣住小鼠，燒杯開口處有一小嘴，所以讓小鼠的尾巴露出來即可~2個人操作，一個人用手按住燒杯，一手捏住小鼠尾巴中部，一人則將系有重物的細(xì)繩系在小鼠尾巴中部~

4一人將小鼠放入裝有溫水的超大量筒，一人開始將小鼠放入燒杯的同時，一人開始計時，等到小鼠下沉10秒，則停止計時。

5記錄時間即可啦~ 補充：扔進(jìn)大量筒之前可以先將小鼠打濕，為什么呢？因為小鼠的毛比較蓬松，里面充了空氣，所以當(dāng)把小鼠放進(jìn)大量筒后，可能對實驗有影響~有時甚至把小鼠毛給刮掉~ 比較嚴(yán)格的實驗還要求小鼠要空腹，不然小鼠肚子里有糞便，對小鼠體重也影響~

小鼠解剖

解剖方法類似于蟾蜍解剖~用大頭針固定~辨別雌雄，雌性有三孔：尿道，陰道，肛門。雄性少了陰道。對于雄性，有時候可以看到睪丸在外面，有時候在肚子里面~不同小鼠情況可能不同

觀察的有心臟，肺部，食道，味，盲腸，頜下腺，舌下腺，腮腺，淋巴，胰臟，脾臟，輸卵管，子宮，卵巢等等 頜下腺（2片）深紅色，前段一塊覆蓋著半透明的舌下腺，因為半透明且覆蓋在頜下腺上，所以也呈現(xiàn)深紅色，所以可以將舌下腺那一片掀開，再放回去，可能比較容易觀察，有的小鼠可能淋巴發(fā)育比較成熟，會覆蓋在舌下腺上，注意區(qū)別。

盲腸：沒有路的長，很容易辨別的吧。

對于雌性，要分清子宮（類似Y形）輸卵管，卵巢的相對位置。

第三篇：小鼠品系介紹

Swiss、KM、ICR、CD-1小鼠品系來源與優(yōu)缺點

1.品系名稱由來

（1）Swiss：1926年美國Rockfeller研究所的Clara Lynch博士從瑞士（Switzerland）Centre Anticancereux Romand的de Coulon實驗室引入非近交白化小鼠，培育成Swiss小鼠。

（2）KM：1944年3月17日衛(wèi)生部北京生物制品研究所湯飛凡教授從印度Hoffkine研究所引進(jìn)Swiss小鼠，飼養(yǎng)在中國昆明中央防疫處。由于該小鼠起初引入地是昆明，故稱之為昆明小鼠，這就是昆明小鼠品系名稱的由來。

（3）ICR：1948年，美國費城癌癥研究所（Institute of Cancer Research, ICR）Hauschka以多產(chǎn)為目標(biāo)，用Rockfeller研究所培育出的Swiss小鼠群進(jìn)行選育，培育出Ha/ICR，以后由美國腫瘤研究協(xié)會分送各國飼養(yǎng)實驗，各國稱為ICR小鼠。中國科學(xué)院遺傳研究所在1973年從日本國立腫瘤研究所引進(jìn)，1979中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院分院動物中心引進(jìn)，1978年北京檢定所引進(jìn)，1983年上海計劃生育研究所從瑞士蘇黎世毒理學(xué)研究所引進(jìn)。

（4）CD-1：1948年Edward Mirand博士將費城癌癥研究所培育的Ha/ICR引入Roswell Park Memorial Institute，命名為HaM/ICR。1959年美國Charles River Lab引入該品系并于同年進(jìn)行了剖腹產(chǎn)，并命名CD-1（ICR），并注冊CD-1?商標(biāo)。

2.優(yōu)缺點

（1）KM：優(yōu)點是抗病力和適應(yīng)力很強，繁殖率和成活率高。KM小鼠基因庫大，基因雜合率高，在中國昆明小鼠作為實驗動物用于生物醫(yī)學(xué)研究已有半個多世紀(jì)之久，一直是我國生產(chǎn)量、使用量最大的遠(yuǎn)交群（封閉群）小鼠，被廣泛應(yīng)用藥理學(xué)、毒理學(xué)等領(lǐng)域的研究，以及藥品、生物制品的生產(chǎn)與檢定，藥典中甚至將KM小鼠作為某些檢測項目的指定用動物。目前國內(nèi)已從KM小鼠遠(yuǎn)交群中先后培育出不少近交系小鼠：C-1，615，TA2，AMMS/1等。缺點：國內(nèi)各地昆明小鼠遺傳背景不很一致，不同地飼養(yǎng)的昆明小鼠封閉群的生長發(fā)育與繁殖性能存在較大差異。

（2）ICR：優(yōu)點是除了抗病力和適應(yīng)力強，繁殖率和成活率高之外，從全球范圍來看，ICR小鼠的使用更為普遍，其背景資料也更為豐富，而且發(fā)表文章時動

物品系這一考核指標(biāo)更容易被接受。缺點：與KM小鼠相同，不同地域飼養(yǎng)的封閉群差別也較大。

（3）CD-1：是ICR小鼠的升級替代品系。因為Charles River Lab已經(jīng)注意到了ICR小鼠的缺點，為了減少CD-1小鼠因不同地域飼養(yǎng)而引起的不同封閉群之間在生長發(fā)育與繁殖性能上的差異，Charles River將世界各地繁殖的CD-1種群按計劃定期輪換，形成了具有國際遺傳學(xué)標(biāo)準(zhǔn)的CD-1 IGS（International genetic standard）小鼠。這也是CD-1小鼠特有的優(yōu)勢，1999年北京維通利華公司從Charles River引入CD-1核心群，成為中國大陸唯一授權(quán)使用其注冊商標(biāo)權(quán)的單位。

第四篇：MEF小鼠胚胎成纖維細(xì)胞知識總結(jié)（精選）

MEF小鼠胚胎成纖維細(xì)胞知識總結(jié)

2008-06-19 00:00 來源：丁香園

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知識總結(jié)

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1517 關(guān)鍵詞： MEF小鼠 胚胎成纖維細(xì)胞

小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的富集

1、給13-14天的孕鼠注射大約0.5ml阿佛丁。當(dāng)鼠麻醉后，實施斷頸法處死小鼠。

2、用70％乙醇擦拭腹部，把皮膚向后拉，暴露出腹膜。用消毒過的工具，剪開腹壁以暴露出子宮角。將子宮角移到10cm的皿里。用10ml不含鈣鎂離子的PBS洗三遍。

3、用剪刀剪開每一測的胚囊,并將胚胎移到培養(yǎng)皿中。

4、用兩副鐘表鑷子將胎盤和膜與胚胎分離開，分離后切除內(nèi)臟（所有深色的東西）。將胚胎轉(zhuǎn)移到(有蓋)培養(yǎng)皿中，用10ml不含鈣鎂離子的PBS洗三遍。

5、用帶有彎鉤的眼科剪將組織剪碎，當(dāng)你剪的很累以致于不能再剪的時候，加入2ml胰蛋白酶/EDTA繼續(xù)剪。再加入另外5ml胰蛋白酶/EDTA，并在37℃孵育大約20分鐘。此時，返回至第一步，對下一只鼠進(jìn)行操作。

6、執(zhí)行1－4步，到將胚胎置于胰蛋白酶/EDTA中這一步。

7、吹打胰蛋白酶/EDTA中的胚胎，直到有很少的組織物殘留。將皿放回培養(yǎng)箱再孵育10分鐘。

8、用20ml培養(yǎng)基以終止胰蛋白酶/EDTA的消化，將皿中的物質(zhì)轉(zhuǎn)移至50ml錐形管中。

9、混勻管內(nèi)的物質(zhì)，加入到含有20ml培養(yǎng)基的T75培養(yǎng)瓶中。每個培養(yǎng)瓶中裝大約3個胚胎。

10、將這些培養(yǎng)瓶放在培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)過夜。

11、將胚胎置于PBS中，并重復(fù)第5步。

12、第二天更換培養(yǎng)基，以去除碎片和中毒的細(xì)胞及其分泌的物質(zhì)。

13、當(dāng)培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞長到80-90%匯合時并仍處于指數(shù)生長期時，是凍存細(xì)胞的最佳時期。一般說來，這發(fā)生在準(zhǔn)備胚胎的第二天。這可能或早或晚發(fā)生，所以請注意觀察你的培養(yǎng)瓶。

注釋：

我們已用CF－1品系的鼠制備了成纖維細(xì)胞。

培養(yǎng)基成分：

88％ DMEM 10％ FBS 1％ NEAA 1% 雙抗

對于新建立的細(xì)胞系，要對樣本進(jìn)行支原體檢測。

小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的消化/傳代

1、移去MEF培養(yǎng)基

2、用5ml不含鈣鎂離子的PBS洗滌細(xì)胞（以去除胰蛋白酶的抑制物）。

3、每個培養(yǎng)瓶里加入1.5ml的胰蛋白酶/EDTA（0.05%的胰蛋白酶），消化5min。

4、為了使細(xì)胞分散開，輕輕吹打細(xì)胞。

5、每加入1ml的胰蛋白酶/EDTA，加入至少1ml的MEF培養(yǎng)基以終止胰蛋白酶的消化。

6、將細(xì)胞懸液加入到15ml的錐形管中，吹打幾次，使細(xì)胞分散為單個的。

7、在新的T75培養(yǎng)瓶中加入10mlMEF培養(yǎng)基。

8、將細(xì)胞懸液分裝到新的T75培養(yǎng)瓶中，放在37℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

注釋：

MEF培養(yǎng)基成分：

89% DMEM(Gibco # 12100-046)10% FBS(Gibco # 16000-044)1% NEAA(Gibco # 11140-050)MEF每傳一代就會生長得更慢些。你第一次傳代的比例可以是1:5，但是最后一次的傳代（第4代或第5代）比例應(yīng)該是1:2。

小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的凍存

重懸培養(yǎng)基：

80% DMEM 20% FBS 1% NEAA 凍存培養(yǎng)基：

60％ DMEM 30％ FBS 20％ DMSO

1、用不含鈣鎂離子的PBS洗一次細(xì)胞。

2、加入胰蛋白酶/EDTA37℃消化大約5min。

3、將細(xì)胞吹打下來。

4、加入與胰蛋白酶/EDTA等體積的培養(yǎng)基以終止胰蛋白酶的消化。

5、吹散大塊組織。如果還有大塊組織存在，可將懸液加入到50ml的管中使其沉淀。

6、取上清液，將其分裝到錐形管中，1000rpm離心5min。

7、每個凍存瓶中加入0.5ml（凍存液的一半體積）的重懸培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。

8、逐滴加入等體積的（0.5ml/瓶）凍存培養(yǎng)基，混勻?，F(xiàn)在DMSO的濃度是10％。

9、每個凍存瓶中加入1ml的細(xì)胞。

10、迅速將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到凍存的容器中，-70℃凍存過夜。（細(xì)胞不能長時間放置在室溫而含有DMSO的情況下）

11、第二天將細(xì)胞放于液氮中長期保存。注釋：

提前標(biāo)注好凍存細(xì)胞的以下信息：

細(xì)胞系名稱

傳代的代數(shù)

凍存細(xì)胞的數(shù)目

日期

Initials 注明凍存/解凍形式

小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的解凍/復(fù)蘇

1、將凍存瓶從液氮中取出。

2、放在37℃水浴中快速解凍，being careful not to immerse the vial above the level of the cap.3、當(dāng)僅還有一點冰晶殘留時，用95％的乙醇消毒凍存瓶的外面，并將其置于hood中。（為什么用95％的乙醇消毒？hood是什么？）

4、輕輕地上下翻轉(zhuǎn)細(xì)胞一次，將它們放入15ml錐形管中。

5、想管中逐滴加入10ml培養(yǎng)基。這一步操作不能少于兩分鐘。做快了對細(xì)胞將是一種打擊，你將得到比其他方法具有更低生活能力的細(xì)胞。6、1000rpm離心5min。

7、將細(xì)胞重懸于10ml培養(yǎng)基中，然后放入T75培養(yǎng)瓶中。

8、放入37℃培養(yǎng)箱。

9、注明凍存/解凍的形式，以更新數(shù)據(jù)。

1、關(guān)于如何確底胚胎期12.5d~13d的小鼠？希望大家能夠介紹一下自己所采用的方法，集思廣益。我所采用的方法是選擇同一天出生的三對小鼠，到成熟（8~10 w）后，分三周合籠，（每周合籠一對），然后待最早合籠的小鼠產(chǎn)崽后，再取另兩個雌鼠的胚胎。不知道這樣行不行，也沒注意別人是怎樣做的。另外問了幾個外科的同學(xué)也沒找到可以查出小鼠孕期的儀器。

2、關(guān)于提取MEF的比較好的protocol

3、關(guān)于MEF轉(zhuǎn)染時起耐受性如何？這個我以后主要做這些，可能會積累一定的經(jīng)驗，但現(xiàn)在肯定有各位朋友已經(jīng)從事或正在從事著方面的工作，希望能夠分享經(jīng)驗。

4、關(guān)于其分泌細(xì)胞因子能力？我從一些文獻(xiàn)上發(fā)現(xiàn)，MEF除了作為胚胎干細(xì)胞的飼養(yǎng)層以外，也是研究天然免疫的重要材料，如日本東京大學(xué)的AKIRA的實驗室，大板大學(xué)的takashi fujita實驗室就發(fā)了相當(dāng)多的文章。從這些文獻(xiàn)可以看出，MEF分泌細(xì)胞因子能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)強于HEK293等工程細(xì)胞，相當(dāng)于肝實質(zhì)細(xì)胞，略低于幾種免疫細(xì)胞。但較免疫細(xì)胞，我認(rèn)為有其不可替代的優(yōu)勢：

（1）其并不是主要發(fā)揮免疫功能的細(xì)胞，只有在受到外界刺激時才會應(yīng)答，分泌細(xì)胞因子，免疫細(xì)胞在不受刺激時也會為了維持穩(wěn)態(tài)而不斷產(chǎn)生細(xì)胞因子，即使有嚴(yán)格的control 組，但專門的免疫細(xì)胞即使是同一種細(xì)胞（DC，NK，T）但不同的細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的能力也是參差不齊的。會造成control 相對不一致。

（2）另一方面，由于這些免疫細(xì)胞大部分都是懸浮的，不太容易轉(zhuǎn)染，結(jié)果陽性率也會較低。（3）現(xiàn)在的分離MEF的方法很便宜，不復(fù)雜，而分離純的免疫細(xì)胞（如NK，DC），需要MACS，F(xiàn)ACS等，這對目前國內(nèi)的實驗室經(jīng)費相對緊張的情況來說，不是很劃算。因此除非是需要研究某一種免疫細(xì)胞，如果是為了研究天然免疫或者adaptive immune過程中某中基因，或者蛋白，或者某一信號通路等的作用，MEF 細(xì)胞不失為一種選擇。

網(wǎng)友crepi 的觀點：

1、我每次取的是16~18天的胚鼠 個人覺得無礙 我倒更喜歡大一點的胚胎 更好操作一點

2、我取的是皮膚 然后胰酶4度消化過夜 第二天終止消化 撕掉表皮 留下真皮 減碎 用的100目濾網(wǎng)過濾 這個胰酶消化的時間是個關(guān)鍵 時間長了 細(xì)胞容易死 時間少了，表皮不容易揭下來 我有此就是這樣 消化了15個小時 結(jié)果接種下來的細(xì)胞不能貼壁 全死了

3、我用的培養(yǎng)液是DMEM+10%小牛血清 培養(yǎng)液也是關(guān)鍵 因為雖然都是成纖維細(xì)胞比較潑辣 但總歸是原代 可能還是比較嬌嫩 我前幾天就是這樣 后來發(fā)現(xiàn)是培養(yǎng)液出的問題 測的PH值都8.3了 細(xì)胞不死才怪 畢竟細(xì)胞耐酸不耐堿

4、原代培養(yǎng)的最大天敵還是污染

網(wǎng)友baichangming的觀點：

MEF對培養(yǎng)基和血清的要求不高，一般的都行我用過高糖DMEM和D/F-12，生長情況都行，而且看不出什么差別。血清也是以前用幾百塊錢的國產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清也長得也不錯，因為要養(yǎng)干細(xì)胞，所以現(xiàn)在換成進(jìn)口Gibco胎牛的血清（兩千多/500ml），感覺細(xì)胞的狀態(tài)確實好了一些。我的血清濃度一般是16.66666%。

網(wǎng)友北羽迦樓的觀點： 細(xì)胞沒別的，就是很容易老化，一般我都是1:5~1:3傳代，3代之后細(xì)胞就出現(xiàn)衰老了，我感覺年輕增殖能力強的MEF應(yīng)該有著清晰的細(xì)胞輪廓，細(xì)胞立體效果不錯，在相差顯微鏡下，細(xì)胞核清晰，細(xì)胞纖長，正在分裂或是剛剛分裂的細(xì)胞沒有伸出偽足，但是同樣有著更加明亮的輪廓，與細(xì)胞邊緣相比，細(xì)胞呈深色（我覺得是透光效果不好）。一般在4×下觀察最能看出細(xì)胞的狀態(tài)，此時能看到細(xì)胞呈梭形或是三角形。細(xì)胞鋪展很厲害，細(xì)胞的透光效果增加，說明開始衰老。衰老的MEF最好不要做feeder,但是也不是完全不好。但是要是做轉(zhuǎn)染或是感染的話，出現(xiàn)衰老的MEF就不行了。所以一般就是3代以內(nèi)做。

我們用的就是WiCell的protocal養(yǎng)，和前面那位戰(zhàn)友發(fā)的差不多。只是我們用1mg/ml Collengase IV消化40min，用什么酶不重要，我覺得最重要的就是種盤后的換液。原代2小時不管還有多少米貼都不要，傳代復(fù)蘇后一小時就換。消化的時候也是要舍得，0.05%Trypsin-EDTA(GIBCO)，5min消化不下來的也統(tǒng)統(tǒng)不要。因為健康的MEF就是易消化易貼壁。老化以及混雜的其他細(xì)胞（神經(jīng)、上皮）就沒那么快了。

附帶一句，易消化易貼壁是fibroblast的共性。

第五篇：小鼠尾靜脈注射心得

小鼠尾靜脈注射心得

對血管的選擇

1.小鼠尾部有三條靜脈，左右兩邊各一條而且比較淺，容易穿刺；中間一條較深不容易找到，建議盡量不要選擇。另外穿刺選擇尾部中下1/3-1/2處比較好，因為此處皮膚較薄，可以用75%的酒精反復(fù)擦拭穿刺部位血管，使其充盈，并使皮膚的角質(zhì)層軟化，便于穿刺?；蛘咴谧⑸渲?，小鼠尾巴用溫水泡大約2min,（水溫大約50℃），這樣才能使血管充分舒張。注射前用干棉球擦干，從下往上扎。這樣的好處是萬一一次扎不進(jìn)，還可以繼續(xù)使用此血管。

2.針的選擇：書上說使用的是1ml的注射器，有人在實驗中用的是頭皮針，后接1ml注射器，因為頭皮針針頭更小，對血管的損傷更小，適合連續(xù)多次給藥，其次使用頭皮針穿刺后，我們可以通過回血來判斷穿刺是否成功。（4號半1ml 注射器已經(jīng)足夠且容易進(jìn)針。

3.注射手法：左手食指和中指上下夾住你所選擇血管的靠近身體的一邊，無名指和小指墊起一塊紗布或者紙巾（建立一個穿刺的平面的作用），拇指壓住所選血管的尾尖端，上下夾住血管的距離應(yīng)以不影響右手持針上下移動為宜。（否則容易人為建立穿刺的角度，而使右手持穿刺針穿刺過深，導(dǎo)致穿刺失敗。）右手持穿刺針，針斜面向上，針與皮膚稍成一角度（10℃左右），進(jìn)針后要將針頭稍向上挑，然后將針向里送一點。如果在血管里，則無阻力，并且能看見針。若針看得很清晰，則扎到了皮下，若針看不清，則針扎深了?？吹交匮砻鞒晒?，還可以回抽，見到回血后表明穿刺已進(jìn)入血管，可以給藥。

4.穿刺結(jié)束后，用紗布壓住穿刺部位反折尾部進(jìn)行止血。良好并徹底的止血對于血管可以起到很好的保護(hù)作用，這對于需要天天穿刺給藥是非常有用的。（一般小鼠需要按壓時間很長，否則易引起出血。）

5.用細(xì)針頭皮下進(jìn)針（我用的是4號）從遠(yuǎn)端打起，后面的皮薄一點，較容易打成功（個人看法），打成功時進(jìn)針會很順暢，注藥沒有阻力，一般不會自己回血，若不成功再往近端打，但一般一條血管打過三次還不成功的話最好先暫停，因為刺激后血管會收縮，很難打，歇一會兒換另一邊打。還有一點，信心很重要！有了信心才能找到感覺。

1.將小鼠固定好,將尾巴拉直，繃緊，這是成功的第一步。

小鼠性情較溫順，一般不會咬人，比較容易抓取固定。通常用右手提起小鼠尾巴將其放在鼠籠蓋或其它粗糙表面上，在小鼠向前掙扎爬行時，用左手拇指和食指捏住其雙耳及頸部皮膚，將小鼠置于左手掌心、無名指和小指夾其背部皮膚和尾部，即可將小鼠完全固定。在一些特殊的實驗中，如進(jìn)行尾靜脈注射時，可使用特殊的固定裝置進(jìn)行固定,如尾靜脈注射架或粗的玻璃試管。如要進(jìn)行手術(shù)或心臟采血應(yīng)先行麻醉再操作,如進(jìn)行解剖實驗則必須先行無痛處死后再進(jìn)行。

或者用這個方法：1 小鼠要固定好，自制一個籠子，前面通氣，中間最好有一個擋板，讓小鼠不能后退，筒子后面開一個口，尾巴從這里出來，這樣固定牢靠；

2、注射前尾巴用稍熱的水浸泡幾分鐘，有利于注射；

3、先遠(yuǎn)后盡，不要一開始就從尾根部，那樣失敗了不好辦；

4、進(jìn)血管后注意保持穩(wěn)定，針尖很容易刺穿血管的。至于能否穿進(jìn)，個人手感如何，全靠自己啦。多練習(xí)，一定很快掌握的，不難，絕對不難！我練習(xí)10余只小鼠就比較熟練了

2.用酒精棉球擦拭尾巴,使血管擴(kuò)張;或者用熱水或者熱毛巾焐熱，使靜脈擴(kuò)張；選用適當(dāng)?shù)尼橆^，越細(xì)越好；在尾部較靠近上段的地方注射，這里血管比較大。用酒精或熱水擦拭，擦拭的時候，可把尾巴用力扯在桌面上。注射狀態(tài)為尾巴發(fā)白，緊靠白色的尾骨兩側(cè)清晰可見兩根紅色靜脈。

3.用左手的食指,中指,無名指及大拇指將小鼠尾巴固定,;手法：握住1ml注射器前面0.1ml處。右手小指搭在拽著鼠尾的左手拇指處 按此手形進(jìn)針；看針尖前面那個斜面有3/4（關(guān)鍵），如果血管充盈則進(jìn)1/2，進(jìn)入，停，上挑針頭，進(jìn)針；左右輕擺動，如可動，可注射。原則是：把你第一次打進(jìn)的手形，完全固定下來，每次都重復(fù)。

4.注射:注射時左手扯尾，使尾巴緊貼桌面，尾巴與桌邊緊貼轉(zhuǎn)彎處為進(jìn)針部位，一般選擇距尾尖1/4或1/3處進(jìn)針，此處皮膚較薄，血管清晰，進(jìn)針容易。進(jìn)針時針頭與桌面平行，針尖稍稍朝下，從中指及無名指與拇指接觸處稍上方進(jìn)針，一旦進(jìn)入，須將針頭稍稍上挑進(jìn)入，針頭沿血管進(jìn)入，肉眼可關(guān)察到針頭前進(jìn)。如果針頭在血管中前進(jìn)，可明顯地感覺到針行通暢，毫無阻力。若針頭不在血管中，手感針行有阻力，有一種堵的感覺。進(jìn)針時不要太深，針頭入皮膚后馬上把針頭略往上，平行進(jìn)針，針扎入時有落空感，推液時無阻力則說明成功了！如針頭處出現(xiàn)皮丘則說明在皮下，推出重來。進(jìn)針處最好在尾巴的1/3-1/2處，甚至可以更下一點。這樣一次失敗了還可以往上再來，不要馬上在最高處打，因為你們要打這么多天。要為以后作準(zhǔn)備。用熱水、酒精、紅外都可以擴(kuò)張血管?？梢砸暻闆r而用。總而言之，最重要的是“熟能生巧”。你最好先練習(xí)一下或請高手相助。不然到了最后幾天，真的很難打的。

2。注射：針進(jìn)入后，切記手不可發(fā)抖，因為血管壁非常薄，容易扎穿。推藥時，要緩?fù)?。若進(jìn)針成功，推藥順暢，無阻力；若推藥時感覺有阻力，說明針頭不在血管中，須及時拔出，重新進(jìn)針。一般選用4號或4號半針頭。最好用打疫苗的2毫升一次性注射器。尾靜脈注射并不難，主要是一種感覺。若用上十只鼠練手，你必會找到感覺。心要靜，手要穩(wěn)，要有耐心。我研一的時候尾靜脈注射讓我頭疼萬分，越急越打不進(jìn)去。后來靜下心來，邊注射邊找感覺，很快就熟練了。

祝你找到感覺

5.通過看有無回血來測試針是否在靜脈內(nèi);

6.注射.