第一篇：細(xì)胞增殖與毒性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)方法及經(jīng)驗(yàn)總結(jié)

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細(xì)胞增殖與毒性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)方法及經(jīng)驗(yàn)總結(jié)-CCK-8 法

實(shí)驗(yàn)原理：Cell Counting Kit-8（簡(jiǎn)稱CCK-8）試劑可用于簡(jiǎn)便而準(zhǔn)確的細(xì)胞增殖和毒性分析。其基本原理為：該試劑中含有WST-8【化學(xué)名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽】，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被細(xì)胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物（Formazan dye）。生成的甲瓚物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比。因此可利用這一特性直接進(jìn)行細(xì)胞增殖和毒性分析。

一、用途：

藥物篩選、細(xì)胞增殖測(cè)定、細(xì)胞毒性測(cè)定、腫瘤藥敏試驗(yàn)等。

二、優(yōu)點(diǎn)：

1.使用方便，省去了洗滌細(xì)胞，不需要放射性同位素和有機(jī)溶劑； 2.CCK-8法能快速檢測(cè)；

3.CCK-8法的檢測(cè)靈敏度很高，甚至可以測(cè)定較低細(xì)胞密度； 4.CCK-8法的重復(fù)性優(yōu)于MTT 法，MTT 實(shí)驗(yàn)生成的formazan不是水溶性的，需要使用DMSO 等有機(jī)溶劑溶解；

5.而本方法產(chǎn)生的formazan是水溶性的，不僅省去了溶解步驟，更因此而減少了該操作步驟帶來(lái)的誤差；

6.CCK-8法對(duì)細(xì)胞毒性小，可以多次測(cè)定選取最佳測(cè)定時(shí)間，與MTT 方法相比線性范圍更寬，靈敏度更高；

7.CCK-8細(xì)胞活性檢測(cè)試劑中為1瓶溶液，毋需預(yù)制，即開(kāi)即用。

三、所需設(shè)備及儀器：

1.10ul，100-200ul及多通道移液器 2.酶標(biāo)儀（帶有450nm濾光片）3.96孔培養(yǎng)板

4.二氧化碳培養(yǎng)箱

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四、方法及步驟：

實(shí)驗(yàn)一：細(xì)胞增殖分析

1、制備細(xì)胞懸液：細(xì)胞計(jì)數(shù)。

2、接種到96孔板中：根據(jù)合適的鋪板細(xì)胞數(shù)（約1-2×104），每孔約100ul細(xì)胞懸液，同樣的樣本可做4-6個(gè)重復(fù)。3、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)：細(xì)胞接種后貼壁大約需要培養(yǎng)4小時(shí)，如果不需要貼壁，這步可以省去。

4、加入10ul CCK8：由于每孔加入CCK8量比較少，有可能因試劑沾在孔壁上而帶來(lái)誤差，建議將槍頭浸入培養(yǎng)液中加入且在加完試劑后輕輕敲擊培養(yǎng)板以幫助混勻。或者直接配置含10%CCK8的培養(yǎng)基（現(xiàn)用現(xiàn)配），以換液的形式加入。

5、培養(yǎng)0.5-4小時(shí):細(xì)胞種類不同，形成的Formazan的量也不一樣。如果顯色不夠的話，可以繼續(xù)培養(yǎng)，以確認(rèn)最佳條件（建議預(yù)實(shí)驗(yàn)先摸清楚時(shí)間點(diǎn)）。特別是血液細(xì)胞形成的Formazan很少，需要較長(zhǎng)的顯色時(shí)間（5-6小時(shí)）。

6、測(cè)定450nm吸光度：建議采用雙波長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)定，檢測(cè)波長(zhǎng)450-490nm，參比波長(zhǎng)600-650nm。

實(shí)驗(yàn)二：細(xì)胞毒性分析

1、制備細(xì)胞懸液：細(xì)胞計(jì)數(shù)

2、接種到96孔板中：根據(jù)合適的鋪板細(xì)胞數(shù)（約≥5×104），每孔約100ul細(xì)胞懸液，同樣的樣本可做4-6個(gè)重復(fù)。3、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)：細(xì)胞接種后貼壁大約需要培養(yǎng)4小時(shí)，如果不需要貼壁，這步可以省去。

4、加入不同濃度的毒性物質(zhì)。5、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)：加入毒性物質(zhì)的培養(yǎng)時(shí)間，要看毒性物質(zhì)的性質(zhì)和細(xì)胞的敏感性，一般要根據(jù)細(xì)胞周期來(lái)決定，起碼要一代以上的時(shí)間（例如：6、12、24、48、60、72小時(shí)）。

6、加入10ul CCK8：由于每孔加入CCK8量比較少，有可能因試劑沾在孔壁上而帶來(lái)誤差，建議將槍頭浸入培養(yǎng)液中加入且在加完試劑后輕輕敲擊培養(yǎng)板以幫助混勻。

7、培養(yǎng)0.5-4小時(shí):細(xì)胞種類不同，形成的Formazan的量也不一樣。如果顯色不夠的話，可以繼續(xù)培養(yǎng)，以確認(rèn)最佳條件。特別是血液細(xì)胞形成的Formazan很少，需要較長(zhǎng)的顯色時(shí)間（5-6小時(shí)）。

8、測(cè)定450nm吸光度：建議采用雙波長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)定，檢測(cè)波長(zhǎng)450-490nm，參比波長(zhǎng)600-650nm。

五、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：

·若暫時(shí)不測(cè)定OD值，可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。24小時(shí)內(nèi)測(cè)定，吸光度不會(huì)發(fā)生變化。

·如果待測(cè)物質(zhì)有氧化性或還原性的話，可在加CCK8之前更換新鮮培養(yǎng)基（除去培養(yǎng)基，并用培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞兩次，然后加入新的培養(yǎng)基），去掉藥物影響。當(dāng)然藥物影響比較小的情況下，可以不更換培養(yǎng)基，直接扣除培養(yǎng)基中加入藥物后的空白吸收即可。

·當(dāng)使用標(biāo)準(zhǔn)96孔板時(shí)，貼壁細(xì)胞的最小接種量至少為1,000 個(gè)/孔(100 μl 培養(yǎng)基)。檢 一站式科研技術(shù)服務(wù)商—武漢金開(kāi)瑞生物004km.cn

測(cè)白細(xì)胞時(shí)的靈敏度相對(duì)較低，因此推薦接種量不低于2,500 個(gè)/孔(100 μl 培養(yǎng)基)。

·酚紅和血清對(duì)CCK8法的檢測(cè)不會(huì)造成干擾，可以通過(guò)扣除空白孔中本底的吸光度而消去。

· CCK8可以檢測(cè)大腸桿菌，但不能檢測(cè)酵母細(xì)胞。在細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)每次測(cè)定的過(guò)程中需要避免細(xì)菌污染，以免影響結(jié)果。

· CCK-8在0-5℃下能夠保存至少6個(gè)月，在-20℃下避光可以保存1年。

·當(dāng)在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)板最外一圈的孔最容易干燥揮發(fā)，由于體積不準(zhǔn)確而增加誤差。一般情況下，最外一圈的孔加培養(yǎng)基或者PBS，不作為測(cè)定孔用。

·在培養(yǎng)基中加入CCK8，培養(yǎng)一定的時(shí)間，測(cè)定450 nm的吸光度即為空白對(duì)照。在做加藥實(shí)驗(yàn)時(shí)，還應(yīng)考慮藥物的吸收，可在加入藥物的培養(yǎng)基中加入CCK8，培養(yǎng)一定的時(shí)間，測(cè)定450 nm的吸光度作為空白對(duì)照。

·金屬對(duì)CCK-8顯色有影響：當(dāng)終濃度為1 mM的氯化亞鉛、氯化鐵、硫酸銅會(huì)抑制5%、15%、90%的顯色反應(yīng)，使靈敏度降級(jí)。如果終濃度是10 mM的話，將會(huì)100%抑制。

·懸浮細(xì)胞由于染色比較困難，一般需要增加細(xì)胞數(shù)量和延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間。

·加入CCK-8 時(shí)，如果細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，培養(yǎng)基顏色或pH 值已變化，建議換用新鮮的培養(yǎng)基。

·用酶標(biāo)儀檢測(cè)前需確保每個(gè)孔內(nèi)沒(méi)有氣泡，否則會(huì)干擾測(cè)定，且要擦拭干凈樣品板了。

六、經(jīng)驗(yàn)總結(jié)及分享：

CCK8的說(shuō)明書大家一定要認(rèn)真閱讀，里面很多細(xì)節(jié)的問(wèn)題都有提到。而且說(shuō)明書里提供的一些關(guān)于各種細(xì)胞的種板數(shù)都很有參考價(jià)值，因?yàn)槟鞘欠磸?fù)驗(yàn)證過(guò)的最佳數(shù)值。但無(wú)論如何，做這個(gè)試驗(yàn)一定要摸條件。你就算再懶，這個(gè)懶不得，否則你都只是在做無(wú)用功。以下言論全部以細(xì)胞毒性試驗(yàn)為前提，如果你做的是促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的藥物的藥效實(shí)驗(yàn)?zāi)蔷土懋?dāng)別論了。

摸條件包括

1、種板數(shù)；

2、種板后細(xì)胞的貼壁生長(zhǎng)時(shí)間；

3、加藥后的孵育時(shí)間；

4、cck8試劑加入量；

5、cck8試劑加入后細(xì)胞孵育時(shí)間?？雌饋?lái)很多，其實(shí)這就是一個(gè)實(shí)驗(yàn)。而且都是種的空白板，也就是不加藥物，只加細(xì)胞和CCK8。

1、種板數(shù)：這個(gè)要查文獻(xiàn)，看你所用細(xì)胞別人有無(wú)做過(guò)，把范圍大致找出。記住還要參考說(shuō)明書，這個(gè)很重要。然后稀釋一系列濃度種板。首先你要觀察多長(zhǎng)時(shí)間細(xì)胞可貼壁完全，一般貼壁生長(zhǎng)24小時(shí)。然后還有在你的實(shí)驗(yàn)時(shí)間內(nèi)，不同細(xì)胞數(shù)下孔內(nèi)生長(zhǎng)情況。比如我擬定考察4天的時(shí)間，那么在4天內(nèi)，細(xì)胞是剛好鋪滿還是堆積生長(zhǎng)？因?yàn)槊繅K板都會(huì)設(shè)置對(duì)照孔，也就是含有細(xì)胞的培養(yǎng)基+CCK8，這個(gè)數(shù)值是板上的最大數(shù)值，CCK8試驗(yàn)最佳OD 一站式科研技術(shù)服務(wù)商—武漢金開(kāi)瑞生物004km.cn

值在1.0附近，所以這個(gè)最大數(shù)值最好能控制在1.0左右。我的實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)是不要讓細(xì)胞長(zhǎng)滿，一旦長(zhǎng)滿了很難去判斷是否堆積生長(zhǎng)了，對(duì)藥物能否順利進(jìn)入細(xì)胞有影響此為其一，其二生長(zhǎng)不均勻易導(dǎo)致孔間OD值數(shù)據(jù)偏差大，而且OD值也很大。

2、貼壁生長(zhǎng)的時(shí)間我一般就直接讓它貼壁長(zhǎng)24h了，這個(gè)時(shí)間細(xì)胞已經(jīng)貼壁完全，而且這樣設(shè)置時(shí)間對(duì)自己安排實(shí)驗(yàn)時(shí)間也方便。沒(méi)人愿意大半夜爬起來(lái)做實(shí)驗(yàn)吧。

3、加藥后的孵育時(shí)間，我的實(shí)驗(yàn)摸了3個(gè)時(shí)間，24h，48h，72h。然后根據(jù)數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性（RSD）、OD值的范圍（1.0左右）這些來(lái)選擇最好的時(shí)間。太長(zhǎng)了就沒(méi)有必要了，細(xì)胞呆在孔里幾天不換液結(jié)果可想而知了。

4、CCK8試劑加入量，說(shuō)明書中明確寫出建議加入量為培養(yǎng)基體積的10%。這里有一個(gè)問(wèn)題：假設(shè)我要孔內(nèi)是200微升的體系，即細(xì)胞懸液+藥液+CCK8=200微升呢，還是細(xì)胞懸液+藥液=200微升，cck8不算在體系內(nèi)呢。關(guān)于這一點(diǎn)文獻(xiàn)報(bào)道不一致。本人最終采用的是后者。

5、cck8試劑加入后孵育時(shí)間，隨著時(shí)間的增加，OD值就會(huì)增大?？傊瓌t就是把OD值控制在1.0左右。這里我考察了0.5h、1.0h、2.0h。

再說(shuō)一下關(guān)于種板設(shè)置問(wèn)題。眾所周知周圍一圈孔因?yàn)檫吘壭?yīng)都是不用來(lái)做實(shí)驗(yàn)的。一般每組樣品我會(huì)設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，得到的OD值去掉最大值與最小值，其余取平均值。我用的是排槍，會(huì)省很多力氣，但是也會(huì)增大組內(nèi)誤差。這個(gè)只有通過(guò)校正移液槍和選用最適槍頭了。

做這個(gè)實(shí)驗(yàn)我想大家遇到的最大問(wèn)題應(yīng)該是數(shù)據(jù)不穩(wěn)定，組內(nèi)數(shù)據(jù)偏差大。講了很多怎樣摸條件，其實(shí)就一個(gè)原則，把OD值控制在1.0左右。數(shù)據(jù)不穩(wěn)定也只能通過(guò)增大樣品數(shù)，借助數(shù)據(jù)處理來(lái)彌補(bǔ)。還有實(shí)驗(yàn)操作一定要仔細(xì)小心，盡量平行操作。

補(bǔ)充

突然想起用酶標(biāo)儀檢測(cè)的時(shí)候還有一些細(xì)節(jié)問(wèn)題。比如孔里不能有氣泡，如果有氣泡，就用吸耳球吹掉，氣泡會(huì)很影響檢測(cè)結(jié)果。樣品板要擦拭干凈，當(dāng)然了，蓋子一定要記得拿掉啊Big Smile補(bǔ)充說(shuō)明：這幾天有同學(xué)提出了一個(gè)問(wèn)題，這個(gè)問(wèn)題非常好也非常關(guān)鍵：將OD值控制在1.0這個(gè)說(shuō)法是否有依據(jù)？

這里我還是想提醒大家一定要認(rèn)真閱讀試劑盒的說(shuō)明書，試想一個(gè)試劑盒的上市并且作為技術(shù)手段得到認(rèn)可需要經(jīng)過(guò)多少試驗(yàn)反復(fù)驗(yàn)證。我購(gòu)買的是同仁化學(xué)研究所的CCK8試劑盒，說(shuō)明書的P7Q23：OD值在什么范圍比較合適？答：一般情況下OD值在0.1-2.0都可以，在1.0附近比較好。

再說(shuō)到自己的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，酶標(biāo)儀的原理其實(shí)和紫外分光光度計(jì)是一樣的，所以UV上很多減小誤差的注意事項(xiàng)在酶標(biāo)儀上同樣受用。這就能夠理解為什么不能有氣泡，為什么要擦拭干凈樣品板了。再者熟悉UV原理的同學(xué)會(huì)了解利用紫外檢測(cè)有一個(gè)最佳檢測(cè)范圍，超過(guò)了這個(gè)范圍，數(shù)值就會(huì)呈現(xiàn)出不穩(wěn)定，無(wú)規(guī)律。（大家可以把自己的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析看看是不是數(shù)值控制在1.0附近更穩(wěn)定。）而更有甚者就是超出了儀器的檢測(cè)范圍，儀器讀數(shù)為—。一站式科研技術(shù)服務(wù)商—武漢金開(kāi)瑞生物004km.cn

我在摸條件的時(shí)候，cck8加入2.0h后檢測(cè)就出現(xiàn)過(guò)酶標(biāo)儀讀不出數(shù)據(jù)的情況。

第二篇：LDH乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)方法

LDH乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性檢測(cè)

LDH釋放檢測(cè)

方法：

a.根據(jù)細(xì)胞的大小和生長(zhǎng)速度將適量細(xì)胞接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，使待檢測(cè)時(shí)細(xì)胞密度不超過(guò)80-90%滿。

b.吸去培養(yǎng)液，用PBS液洗滌一次。換新鮮培養(yǎng)液(推薦使用含1%血清的低血清培養(yǎng)液或適當(dāng)?shù)臒o(wú)血清培養(yǎng)液)，將各培養(yǎng)孔分成如下幾組：包括無(wú)細(xì)胞的培養(yǎng)液孔(背景空白對(duì)照孔)，未經(jīng)藥物處理的對(duì)照細(xì)胞孔(樣品對(duì)照孔)，未經(jīng)藥物處理的用于后續(xù)裂解的細(xì)胞孔(樣品最大酶活性對(duì)照孔)，以及藥物處理的細(xì)胞孔(藥物處理樣品孔)，并做好標(biāo)記。按照實(shí)驗(yàn)需要給予適當(dāng)藥物處理(如加入0-10μl左右特定的藥物刺激，可設(shè)置不同濃度，不同處理時(shí)間，對(duì)照孔中需加入適當(dāng)?shù)乃幬锶軇?duì)照)，繼續(xù)按常規(guī)培養(yǎng)。到預(yù)定的檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)前1小時(shí)，從細(xì)胞培養(yǎng)箱里取出細(xì)胞培養(yǎng)板，在“樣品最大酶活性對(duì)照孔”中加入試劑盒提供的LDH釋放試劑，加入量為原有培養(yǎng)液體積的10%。加入LDH釋放試劑后，反復(fù)吹打數(shù)次混勻，然后繼續(xù)在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育。

c.到達(dá)預(yù)定時(shí)間后，將細(xì)胞培養(yǎng)板用多孔板離心機(jī)400g離心5min。分別取各孔的上清液120μl，加入到一新的96孔板相應(yīng)孔中，隨即進(jìn)行樣品測(cè)定。

準(zhǔn)備工作：

a.INT溶液(1X)的配置：根據(jù)所需的INT溶液(1X)的量，取適量INT溶液(10X)用INT稀釋液稀釋至1X。例如，取20μl INT溶液(10X)，加入180μl INT稀釋液，混勻后即配置為200μl INT溶液(1X)。INT溶液(1X)宜現(xiàn)配現(xiàn)用，配置后4℃保存可于當(dāng)天使用，不宜配置后凍存。

b.LDH檢測(cè)工作液的配制: 根據(jù)待測(cè)定的樣品數(shù)(含對(duì)照)，參考下表在臨檢測(cè)前新鮮配制適量的檢測(cè)工作液。注意：LDH檢測(cè)工作液必須現(xiàn)配現(xiàn)用，配制和使用過(guò)程中均要注意適當(dāng)避光。樣品測(cè)定:

a.各孔分別加入60μl LDH檢測(cè)工作液。

b.混勻，室溫(約25℃)避光孵育30min(可用鋁箔包裹后置于水平搖床或側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng))。然后在490nm處測(cè)定吸光度。使用600nm或大于600nm的任一波長(zhǎng)作為參考波長(zhǎng)進(jìn)行雙波長(zhǎng)測(cè)定。c.計(jì)算(測(cè)得的各組吸光度均應(yīng)減去背景空白對(duì)照孔吸光度)

細(xì)胞毒性或死亡率(%)=(處理樣品吸光度－樣品對(duì)照孔吸光度)/(細(xì)胞最大酶活性的吸光度－樣品對(duì)照孔吸光度)×100

d.可繪制細(xì)胞毒性曲線：縱座標(biāo)為實(shí)際吸光度，橫坐標(biāo)為藥物濃度；據(jù)此可計(jì)算該藥物作用特定時(shí)間的半致死劑量LD50。

第三篇：細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法總結(jié)

1、磷脂酰絲氨酸外翻分析（Annexin V法）

磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，但在細(xì)胞凋亡的早期，PS可從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中(圖3)。Annexin-V是一種分子量為35~36KD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力特異性結(jié)合。將Annexin-V進(jìn)行熒光素（FITC、PE）或biotin標(biāo)記，以標(biāo)記了的Annexin-V作為熒光探針，利用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡可檢測(cè)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

PS轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜外不是凋亡所獨(dú)特的，也可發(fā)生在細(xì)胞壞死中。兩種細(xì)胞死亡方式間的差別是在凋亡的初始階段細(xì)胞膜是完好的，而細(xì)胞壞死在其早期階段細(xì)胞膜的完整性就破壞了。

碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一種核酸染料，它不能透過(guò)完整的細(xì)胞膜，但在凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞，PI能夠透過(guò)細(xì)胞膜而使細(xì)胞核紅染。因此將Annexin-V與PI匹配使用，就可以將凋亡早晚期的細(xì)胞以及死細(xì)胞區(qū)分開(kāi)來(lái)。

在雙變量流式細(xì)胞儀的散點(diǎn)圖上，左下象限顯示活細(xì)胞，為（FITC-/PI-）；右上象限是非活細(xì)胞，即壞死細(xì)胞，為（FITC+/PI+）；而右下象限為早期凋亡細(xì)胞，顯現(xiàn)（FITC+/PI-）。右上象限為獨(dú)立的核（FITC-/PI+）。

Annexin-V可以再鈣離子存在的情況下，和細(xì)胞表面外翻的磷脂酰絲氨酸結(jié)合，而磷脂酰絲氨酸的外翻是細(xì)胞凋亡的早期事件。

PI是一種DNA染料，當(dāng)細(xì)胞凋亡的晚期，細(xì)胞的細(xì)胞膜通透性增加，PI從而進(jìn)入細(xì)胞核與DNA結(jié)合。

所以

Annexin-V陰性-PI陰性 代表正常細(xì)胞

Annexin-V陽(yáng)性-PI陰性 代表凋亡早期的細(xì)胞

Annexin-V陽(yáng)性-PI陽(yáng)性 代表凋亡晚期的細(xì)胞或壞死的細(xì)胞

Annexin-V陰性-PI陽(yáng)性 一般不存在這一群細(xì)胞，如果出現(xiàn)這一團(tuán)細(xì)胞可能是PI標(biāo)記時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，或者操作過(guò)于劇烈而傷害到原本正常的細(xì)胞。（還有一種說(shuō)法是凋亡最后階段的細(xì)胞，細(xì)胞已經(jīng)沒(méi)有細(xì)胞膜了說(shuō)以不結(jié)合Annexin-V而只結(jié)合PI）

2.線粒體膜電位變化的檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)原理

JC-1是一種廣泛用于檢測(cè)線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential)△Ψm的理想熒光探針?？梢詸z測(cè)細(xì)胞、組織或純化的線粒體膜電位。在線粒體膜電位較高時(shí)，JC-1 聚集在線粒體的基質(zhì)(matrix)中，形成聚合物(J-aggregates)，可以產(chǎn)生紅色熒光（FL-2 通道）；在線粒體膜電位較低時(shí)，JC-1 不能聚集在線粒體的基質(zhì)中，此時(shí)JC-1 為單體(monomer)，可以產(chǎn)生綠色熒光（FL-1 通道）。這樣就可以非常方便地通過(guò)熒光顏色的轉(zhuǎn)變來(lái)檢測(cè)線粒體膜電位的變化。常用紅綠熒光的相對(duì)比例來(lái)衡量線粒體去極化的比例。線粒體膜電位的下降是細(xì)胞凋亡早期的一個(gè)標(biāo)志性事件。通過(guò) JC-1 從紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變可以很容易地檢測(cè)到細(xì)胞膜電位的下降，同時(shí)也可以用JC-1 從紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變作為細(xì)胞凋亡早期的一個(gè)檢測(cè)指標(biāo)。

JC-1 單體的最大激發(fā)波長(zhǎng)為 514nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)為 527nm；JC-1 聚合物(J-aggregates)的最大激發(fā)波長(zhǎng)為 585nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)為 590nm。

A-C 為對(duì)照，細(xì)胞亞群(R1)在 FL-2和FL-1 通道同時(shí)顯示 JC-1 的熒光信號(hào)。D-F 顯示 JC-1在FL-2通道熒光信號(hào)降低的細(xì)胞亞群(R2)顯著增加，證明線粒體膜電位△Ψm 下降，細(xì)胞發(fā)生凋亡。凋亡與線粒體膜電位的去極化相關(guān)。細(xì)胞凋亡時(shí)線粒體膜電位發(fā)生去極化，JC-1進(jìn)入線粒體以單體形式存在，僅在Fl-1通道有熒光。

檢測(cè)原理

正常細(xì)胞：JC-1聚集在線粒體內(nèi)，形成多聚體，呈鮮紅色熒光，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有綠色；即紅光++，綠光++。

凋亡細(xì)胞：由于線粒體跨膜電位的破壞，不能聚集到線粒體內(nèi)，紅色熒光減弱，單體的形式存在于胞質(zhì)內(nèi)發(fā)綠色熒光。即紅光+，綠光++

3、Caspase-3活性的檢測(cè)

Caspase家族在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過(guò)程中起著非常重要的作用，其中caspase-3為關(guān)鍵的執(zhí)行分子，它在凋亡信號(hào)傳導(dǎo)的許多途徑中發(fā)揮功能。Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞漿中，在凋亡的早期階段，它被激活，活化的Caspase-3由兩個(gè)大亞基（17KD）和兩個(gè)小亞基（12KD）組成，裂解相應(yīng)的胞漿胞核底物，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。但在細(xì)胞凋亡的晚期和死亡細(xì)胞，caspase-3的活性明顯下降。

(1)Western blot 分析Procaspase-3的活化，以及活化的Caspase-3及對(duì)底物多聚ADP-核糖聚合酶[poly（ADP-ribose）polymerase，PARP]等的裂解。

(2)熒光分光光度計(jì)分析

檢測(cè)原理：活化的Caspsae與其特異性底物DEVD-pNA結(jié)合切割，釋放出游離pNA，通過(guò)測(cè)定其吸光度，根據(jù)其發(fā)光強(qiáng)度的高低代表其活化程度。

(3)流式細(xì)胞術(shù)分析

PharMingen 多克隆或單克隆 Caspase-3 抗體可以識(shí)別 Caspase-3 活化形式，它特異性識(shí)別由無(wú)活性的 Pro-Caspase-3 活化水解后的暴露的斷裂端, 熒光標(biāo)記多克隆兔抗 Active-Caspase-3 抗體為流式細(xì)胞術(shù)分析凋亡細(xì)胞的 Caspase-3 而設(shè)計(jì)。1、2、3是早期凋亡現(xiàn)象；

4、5是晚期凋亡現(xiàn)象。

4、TUNEL法(末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記)

細(xì)胞凋亡中, 染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產(chǎn)生大量粘性3'-OH末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）的作用下將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物標(biāo)記到DNA的3'-末端，從而可進(jìn)行凋亡細(xì)胞的檢測(cè)，這類方法稱為脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）。由于正常的或正在增殖的細(xì)胞幾乎沒(méi)有DNA的斷裂，因而沒(méi)有3'-OH形成，很少能夠被染色。TUNEL實(shí)際上是分子生物學(xué)與形態(tài)學(xué)相結(jié)合的研究方法，對(duì)完整的單個(gè)凋亡細(xì)胞核或凋亡小體進(jìn)行原位染色，能準(zhǔn)確地反應(yīng)細(xì)胞凋亡典型的生物化學(xué)和形態(tài)特征，可用于石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片、培養(yǎng)的細(xì)胞和從組織中分離的細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)測(cè)定，并可檢測(cè)出極少量的凋亡細(xì)胞，因而在細(xì)胞凋亡的研究中被廣泛采用。

5、DNA ladder 細(xì)胞凋亡晚期，核酸內(nèi)切酶在核小體之間剪切核DNA，產(chǎn)生大量長(zhǎng)度在180-200 bp 的DNA片段。細(xì)胞經(jīng)處理后，采用常規(guī)方法分離提純DNA，進(jìn)行瓊脂糖凝膠和溴化乙啶染色，在凋亡細(xì)胞群中可觀察到典型的DNA ladder。在瓊脂糖凝膠電泳上表現(xiàn)為梯形電泳圖譜(DNA ladder)。壞死細(xì)胞---連續(xù)性條帶。

一、形態(tài)學(xué)觀察方法

1、HE染色、光鏡觀察：凋亡細(xì)胞呈圓形，胞核深染，胞質(zhì)濃縮，染色質(zhì)成團(tuán)塊狀，細(xì)胞表面有“出芽”現(xiàn)象?！咎K木精 — 伊紅染色法，(hematoxylin-eosin staining)，簡(jiǎn)稱HE染色法。蘇木精染液為堿性，主要使細(xì)胞核內(nèi)的染色質(zhì)與胞質(zhì)內(nèi)的核糖體著紫藍(lán)色 ；伊紅為酸性染料，主要使細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外基質(zhì)中的成分著紅色?！?/p>

2、丫啶橙（AO）染色，熒光顯微鏡觀察：活細(xì)胞核呈黃綠色熒光，胞質(zhì)呈紅色熒光。凋亡細(xì)胞核染色質(zhì)呈黃綠色濃聚在核膜內(nèi)側(cè)，可見(jiàn)細(xì)胞膜呈泡狀膨出及凋亡小體。

3、臺(tái)盼藍(lán)染色：如果細(xì)胞膜不完整、破裂，臺(tái)盼藍(lán)染料進(jìn)入細(xì)胞，細(xì)胞變藍(lán)，即為壞死。如果細(xì)胞膜完整，細(xì)胞不為臺(tái)盼藍(lán)染色，則為正常細(xì)胞或凋亡細(xì)胞。此方法對(duì)反映細(xì)胞膜的完整性，區(qū)別壞死細(xì)胞有一定的幫助。

4、透射電鏡觀察：可見(jiàn)凋亡細(xì)胞表面微絨毛消失，核染色質(zhì)固縮、邊集，常呈新月形，核膜皺褶，胞質(zhì)緊實(shí)，細(xì)胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小體和凋亡小體被臨近巨噬細(xì)胞吞噬現(xiàn)象。

一、細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)檢測(cè)

1、光學(xué)顯微鏡和倒置顯微鏡

（1）未染色細(xì)胞：凋亡細(xì)胞的體積變小、變形，細(xì)胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，細(xì)胞凋亡晚期可見(jiàn)凋亡小體。貼壁細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、變圓、脫落。

（2）染色細(xì)胞：常用姬姆薩染色、瑞氏染色等。凋亡細(xì)胞的染色質(zhì)濃縮、邊緣化，核膜裂解、染色質(zhì)分割成塊狀和凋亡小體等典型的凋亡形態(tài)。

2、熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡

一般以細(xì)胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變?yōu)橹笜?biāo)來(lái)評(píng)判細(xì)胞凋亡的進(jìn)展情況。常用的DNA特異性染料有：HO 33342(Hoechst 33342)，HO 33258(Hoechst 33258), DAPI。三種染料與 DNA的結(jié)合是非嵌入式的，主要結(jié)合在DNA的A-T堿基區(qū)。紫外光激發(fā)時(shí)發(fā)射明亮的藍(lán)色熒光。

Hoechst是與DNA特異結(jié)合的活性染料，儲(chǔ)存液用蒸餾水配成1mg/ml的濃度，使用時(shí)用PBS稀釋成終濃度為2~5mg/ml。

DAPI為半通透性，用于常規(guī)固定細(xì)胞的染色。儲(chǔ)存液用蒸餾水配成1mg/ml的濃度，使用終濃度一般為0.5 ~1mg/ml。

結(jié)果評(píng)判：細(xì)胞凋亡過(guò)程中細(xì)胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變分為三期：Ⅰ期的細(xì)胞核呈波紋狀（rippled）或呈折縫樣（creased），部分染色質(zhì)出現(xiàn)濃縮狀態(tài)；Ⅱa期細(xì)胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化；Ⅱb期的細(xì)胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體(圖1)。

3、透射電子顯微鏡觀察

結(jié)果評(píng)判：凋亡細(xì)胞體積變小，細(xì)胞質(zhì)濃縮。凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)高度盤繞，出現(xiàn)許多稱為氣穴現(xiàn)象（cavitations）的空泡結(jié)構(gòu)(圖2)；Ⅱa期細(xì)胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化；細(xì)胞凋亡的晚期，細(xì)胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體。圖2

七、凋亡相關(guān)蛋白TFAR19蛋白的表達(dá)和細(xì)胞定位分析

TFAR19（PDCD5）是由本研究室在國(guó)際上首先報(bào)導(dǎo)的一個(gè)擁有自己知識(shí)產(chǎn)權(quán)的人類新基因，前期的功能研究表明，它是促進(jìn)細(xì)胞凋亡的增強(qiáng)劑。利用熒光素（FITC）標(biāo)記的TFAR19單克隆抗體為探針，對(duì)細(xì)胞凋亡過(guò)程中TFAR19蛋白的表達(dá)水平及定位研究發(fā)現(xiàn)，凋亡早期TFAR19表達(dá)水平增高并出現(xiàn)快速核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象，伴隨著細(xì)胞核形態(tài)學(xué)的變化，持續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間，在凋亡小體中仍然可見(jiàn)。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)，凋亡早期TFAR19蛋白的核轉(zhuǎn)位早于磷脂酰絲氨酸（PS）外翻和細(xì)胞核DNA的片段化，提示TFAR19蛋白的核轉(zhuǎn)位是細(xì)胞凋亡更早期發(fā)生的事件之一。進(jìn)一步的研究證明，凋亡早期TFAR19的核轉(zhuǎn)位具有普遍意義，不同細(xì)胞凋亡早期均出現(xiàn)TFAR19高表達(dá)和核轉(zhuǎn)位。這為研究細(xì)胞凋亡早期所發(fā)生的事件，提供了一種新的技術(shù)和指標(biāo)。

第四篇：細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法小結(jié)

細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法小結(jié)

一、定性和定量研究

只定性的研究方法：常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳、脈沖場(chǎng)倒轉(zhuǎn)瓊脂糖凝膠電泳、形態(tài)學(xué)觀察（普通光學(xué)顯微鏡、透射電鏡、熒光顯微鏡）

進(jìn)行定量或半定量的研究方法：各種流式細(xì)胞儀方法、原位末端標(biāo)記法、ELISA定量瓊脂糖凝膠電泳。

二、區(qū)分凋亡和壞死

可將二者區(qū)分開(kāi)的方法：瓊脂糖凝膠電泳，形態(tài)學(xué)觀察（透射電鏡是是區(qū)分凋亡和壞死最可靠的方法），Hoechst33342/PI雙染色法流式細(xì)胞儀檢測(cè)，AnnexinV/PI雙染色法流式細(xì)胞儀檢測(cè)等。

不能將二者區(qū)分開(kāi)的方法：原位末端標(biāo)記法、PI單染色法流式細(xì)胞儀檢測(cè)等。

三、樣品來(lái)源不同選擇 組織：主要用形態(tài)學(xué)方法(HE染色，透射電鏡、石蠟包埋組織切片進(jìn)行原位末端標(biāo)記，ELISA或?qū)⒔M織碾碎消化做瓊脂糖凝膠電泳)。

四、細(xì)胞凋亡檢測(cè)

1、早期檢測(cè): 1)PS(磷脂酰絲氨酸)在細(xì)胞外膜上的檢測(cè) 2)細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)改變的檢測(cè) 3)細(xì)胞色素C的定位檢測(cè) 4)線粒體膜電位變化的檢測(cè)

2、晚期檢測(cè)：

細(xì)胞凋亡晚期中，核酸內(nèi)切酶在核小體之間剪切核DNA，產(chǎn)生大量長(zhǎng)度在180-200 bp 的DNA片段。

對(duì)于晚期檢測(cè)通常有以下方法：

1)TUNEL(末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記)2)LM-PCR Ladder(連接介導(dǎo)的PCR檢測(cè))3)Telemerase Detection(端粒酶檢測(cè))

3、生化檢測(cè)：

1）典型的生化特征：DNA 片段化

2）檢測(cè)方法主要有：瓊脂糖凝膠電泳、原位末端標(biāo)記（TUNEL）等 3）TUNEL（末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記）4）通過(guò)DNA末端轉(zhuǎn)移酶將帶標(biāo)記的 dNTP（多為dUTP）間接或直接接到DNA片段的3’-OH端，再通過(guò)酶聯(lián)顯色或熒光檢測(cè)定量分析結(jié)果?？勺黾?xì)胞懸液、福爾馬林固定或石蠟處理的組織、細(xì)胞培養(yǎng)物等多種樣本的檢測(cè)。

4、LM-PCR Ladder(連接介導(dǎo)的PCR檢測(cè))當(dāng)?shù)蛲黾?xì)胞比例較小以及檢測(cè)樣品量很少（如活體組織切片）時(shí)，直接瓊脂糖電泳可能觀察不到核DNA的變化。通過(guò)LM-PCR,連上特異性接頭，專一性地?cái)U(kuò)增梯度片段，從而靈敏地檢測(cè)凋亡時(shí)產(chǎn)生梯度片段。此外，LM-PCR 檢測(cè)是半定量的，因此相同凋亡程度的不同樣品可進(jìn)行比較。如果細(xì)胞量很少，還可在分離提純DNA后，用32P-ATP和脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）使DNA標(biāo)記，然后進(jìn)行電泳和放射自顯影，觀察凋亡細(xì)胞中DNA ladder的形成。

上述兩種方法都針對(duì)細(xì)胞凋亡晚期核DNA斷裂這一特征，但細(xì)胞受到其它損傷（如機(jī)械損傷，紫外線等）也會(huì)產(chǎn)生這一現(xiàn)象，因此它對(duì)細(xì)胞凋亡的檢測(cè)會(huì)受到其它原因的干擾。需結(jié)合其它的方法來(lái)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。其它方法：

1）Telemerase Detection(端粒酶檢測(cè))端粒酶是由RNA和蛋白組成，它可以自身RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成端粒區(qū)重復(fù)序列，使細(xì)胞獲得“永生化”。正常體細(xì)胞是沒(méi)有端粒酶活性的，每分裂一次，染色體的端粒會(huì)縮短，這可能作為有絲分裂的一種時(shí)鐘，表明細(xì)胞年齡、復(fù)制衰老或細(xì)胞凋亡的信號(hào)。研究發(fā)現(xiàn)，90%以上的癌細(xì)胞或凋亡細(xì)胞都具有端粒酶的活性。2）mRNA水平的檢測(cè)

研究者們發(fā)現(xiàn)了很多在細(xì)胞凋亡時(shí)表達(dá)異常的基因，檢測(cè)這些特異基因的表達(dá)水平也成為檢測(cè)細(xì)胞凋亡的一種常用方法。據(jù)報(bào)道，F(xiàn)as 蛋白結(jié)合受體后能誘導(dǎo)癌細(xì)胞中的細(xì)胞毒性T細(xì)胞（cytotoxic T cells）等靶細(xì)胞。Bcl-2 和bcl-X(長(zhǎng)的)作為抗凋亡（bcl-2 和bcl-X）的調(diào)節(jié)物，它們的表達(dá)水平比例決定了細(xì)胞是凋亡還是存活。用熒光定量PCR技術(shù)來(lái)檢測(cè)基因表達(dá)水平無(wú)疑比之前者更快更準(zhǔn)確。通過(guò)檢測(cè)fas, bax-alpha 和 bcl-X(長(zhǎng)的)基因的 mRNA表達(dá)水平來(lái)進(jìn)行細(xì)胞凋亡的檢測(cè)。

5、細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)改變的檢測(cè)：

正常狀態(tài)下,谷光苷肽(GSH)作為細(xì)胞的一種重要的氧化還原緩沖劑。細(xì)胞內(nèi)有毒的氧化物通過(guò)被GSH還原而定期去除，氧化型的GSH又可被GSH還原酶迅速還原。這一反應(yīng)在線粒體中尤為重要，許多呼吸作用中副產(chǎn)物的氧化損傷將由此被去除。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)GSH的排除非常活躍時(shí)，細(xì)胞液就由還原環(huán)境轉(zhuǎn)為氧化環(huán)境，這可能導(dǎo)致了凋亡早期細(xì)胞線粒體膜電位的降低，從而使細(xì)胞色素C（三羧酸循環(huán)中的重要組分）從線粒體內(nèi)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞液中，啟動(dòng)凋亡效應(yīng)器caspase的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。

6、細(xì)胞色素C的定位檢測(cè)

細(xì)胞色素C作為一種信號(hào)物質(zhì)，在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要的作用。正常情況下，它存在于線粒體內(nèi)膜和外膜之間的腔中，凋亡信號(hào)刺激使其從線粒體釋放至細(xì)胞漿，結(jié)合Apaf-1（apoptotic protease activating factor-1）后啟動(dòng)caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)：細(xì)胞色素C/Apaf-1復(fù)合物激活caspase-9，后者再激活caspase-3和其它下游caspase。

7、線粒體膜電位變化的檢測(cè)：

1）線粒體跨膜電位的耗散與細(xì)胞凋亡有密切關(guān)系

2）近年來(lái)陸續(xù)有報(bào)道說(shuō)明線粒體跨膜電位的耗散早于核酸酶的激活，也早于磷酯酰絲氨酸暴露于細(xì)胞表面。而一旦線粒體跨膜電位耗散，細(xì)胞就會(huì)進(jìn)入不可逆的凋亡過(guò)程。

3）在細(xì)胞凋亡過(guò)程中線粒體跨膜電位的耗散主要是由于線粒體內(nèi)膜的通透性轉(zhuǎn)變，這是由于生成了動(dòng)態(tài)的由多個(gè)蛋白質(zhì)組成的位于線粒體內(nèi)膜與外膜接觸位點(diǎn)的通透性轉(zhuǎn)變孔道(PT孔道)能穩(wěn)定線粒體跨膜電位就能防止細(xì)胞凋亡。線粒體在細(xì)胞凋亡作用中的進(jìn)一步證據(jù)：

1）若將純化的正常的線粒體與純化的細(xì)胞核在一起保溫，并不導(dǎo)致細(xì)胞核的變化。但若將誘導(dǎo)生成PT孔道的線粒體與純化的細(xì)胞核一同保溫，細(xì)胞核即開(kāi)始凋亡變化。2）形態(tài)學(xué)觀察，看到細(xì)胞數(shù)目有限，統(tǒng)計(jì)學(xué)上的準(zhǔn)確性受影響；

3）凝膠電泳檢測(cè)DNA破壞了細(xì)胞的完整性也不能測(cè)出凋亡細(xì)胞占總細(xì)胞的比例； 4）流式細(xì)胞術(shù)可檢測(cè)細(xì)胞、亞細(xì)胞及分子水平的特征性變化。用于流式細(xì)胞儀檢測(cè)的染料：

PI、Hoechst、EB、DAPI、丫啶橙等，其中PI、Hoechst最常用。PI和Hoechst33342雙標(biāo)：

PI、Hoechst33342均可與細(xì)胞核DNA（或RNA）結(jié)合。但是PI不能通過(guò)正常的細(xì)胞膜，Hoechst則為膜通透性的熒光染料，故細(xì)胞在處于壞死或晚期調(diào)亡時(shí)細(xì)胞膜被破壞，這時(shí)可為PI著紅色。正常細(xì)胞和中早期調(diào)亡細(xì)胞均可被Hoechst著色，但是正常細(xì)胞核的Hoechst著色的形態(tài)呈圓形，淡蘭色，內(nèi)有較深的蘭色顆粒；而調(diào)亡細(xì)胞的核由于濃集而呈亮蘭色，或核呈分葉，碎片狀，邊集。

故PI著色為壞死細(xì)胞；亮蘭色，或核呈分葉狀，邊集的Hoechst著色的為調(diào)亡細(xì)胞。PI和Annexin-V雙標(biāo)：

磷脂酰絲氨酸（PS）正常位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，但在細(xì)胞凋亡的早期（或細(xì)胞損傷時(shí)）PS可從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中。

Annexin-V（green）可以和磷脂酰絲氨酸（PS）特異性結(jié)合。因此細(xì)胞處于調(diào)亡或壞死時(shí)，Annexin-V可為陽(yáng)性（早期的壞死細(xì)胞可能為陰性）。但是只有壞死的細(xì)胞PI是陽(yáng)性

五、形態(tài)學(xué)觀察

1、普通光學(xué)顯微鏡觀察

2、透射電子顯微鏡觀察

3、熒光顯微鏡觀察

1、普通光鏡下觀察：

1)用蘇木素-伊紅（HE）染色：細(xì)胞核固縮碎裂、呈藍(lán)黑色、胞漿呈淡紅色（凋亡細(xì)胞），正常細(xì)胞核呈均勻淡藍(lán)色或藍(lán)色，壞死細(xì)胞核呈很淡的藍(lán)色或藍(lán)色消失

2)Giemsa染色法、瑞氏染色法等，正常細(xì)胞核的色澤均一，凋亡細(xì)胞染色變深，壞死細(xì)胞染色淺或沒(méi)染上顏色 直接用倒置顯微鏡觀察： 1）細(xì)胞體積變小，全面皺縮；

2）凋亡小體為數(shù)個(gè)圓形小體圍繞在細(xì)胞周圍。

2、透射電子顯微鏡觀察

凋亡細(xì)胞體積變小，細(xì)胞質(zhì)濃縮。

細(xì)胞凋亡過(guò)程中細(xì)胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變分為三期：Ⅰ期的細(xì)胞核呈波紋狀或呈折縫樣，部分染色質(zhì)出現(xiàn)濃縮狀態(tài)；Ⅱa期細(xì)胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化；Ⅱb期的細(xì)胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體。

3、熒光顯微鏡

常用的熒光染料：丫啶橙、PI、DAPI、Hoechst33258 和Hoechst33342、EB等

Hoechst 33342、Hoechst 33258、DAPI三種染料與DNA的結(jié)合是非嵌入式的，主要結(jié)合在DNA的A-T堿基區(qū)。紫外光激發(fā)時(shí)發(fā)射明亮的藍(lán)色熒光。1）PI雙染色法基本原理

Hoechst是與DNA特異結(jié)合的活性染料，能進(jìn)入正常細(xì)胞膜而對(duì)細(xì)胞沒(méi)有太大得細(xì)胞毒作用。Hoechst 33342在凋亡細(xì)胞中的熒光強(qiáng)度要比正常細(xì)胞中要高。DAPI為半通透性，用于常規(guī)固定細(xì)胞的染色。碘化丙啶(PI)是一種核酸染料，它不能透過(guò)完整的細(xì)胞膜，但在凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞，PI能夠透過(guò)細(xì)胞膜而將細(xì)胞核染紅。因此將Annexin-V與PI匹配使用，就可以將凋亡早晚期的細(xì)胞以及死細(xì)胞區(qū)分開(kāi)來(lái)。

注意事項(xiàng)：細(xì)胞凋亡時(shí)，其DNA可染性降低被認(rèn)為是凋亡細(xì)胞的標(biāo)志之一，但這種DNA可染性降低也可能是因?yàn)镈NA含量的降低，或者是因?yàn)镈NA結(jié)構(gòu)的改變使其與染料結(jié)合的能力發(fā)生改變所致。在分析結(jié)果時(shí)應(yīng)該注意。

六、細(xì)胞凋亡的分子生物學(xué)檢測(cè)方法: 細(xì)胞凋亡中染色體DNA的斷裂是個(gè)漸進(jìn)的分階段的過(guò)程，染色體DNA首先在內(nèi)源性的核酸水解酶的作用下降解為50-300kb的大片段。然后大約30 ﹪的染色體DNA在Ca 2+和Mg2+依賴的核酸內(nèi)切酶作用下，在核小體單位之間被隨機(jī)切斷，形成180～200bp核小體DNA多聚體。DNA雙鏈斷裂或只要一條鏈上出現(xiàn)缺口而產(chǎn)生的一系列DNA的3’-OH末端可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過(guò)氧化物酶、堿性磷酸化酶或生物素形成的衍生物標(biāo)記到DNA的3’-末端，從而可進(jìn)行凋亡細(xì)胞的檢測(cè)，這類方法一般稱為脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（TUNEL）。由于正常的或正在增殖的細(xì)胞幾乎沒(méi)有DNA的斷裂，因而沒(méi)有3’-OH形成，很少能夠被染色。低分子量的DNA分離后，也可使用DNA聚合酶進(jìn)行缺口翻譯（nick translation），使低分子量的DNA標(biāo)記或染色，然后分析凋亡細(xì)胞。TUNEL或缺口翻譯法實(shí)際上是分子生物學(xué)與形態(tài)學(xué)相結(jié)合的研究方法，對(duì)完整的單個(gè)凋亡細(xì)胞核或凋亡小體進(jìn)行原位染色，能準(zhǔn)確的反應(yīng)細(xì)胞凋亡最典型的生物化學(xué)和形態(tài)特征，可用于石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片、培養(yǎng)的細(xì)胞和從組織中分離的細(xì)胞的細(xì)胞凋亡測(cè)定，并可檢測(cè)出極少量的凋亡細(xì)胞，靈敏度遠(yuǎn)比一般的組織化學(xué)和生物化學(xué)測(cè)定法要高，因而在細(xì)胞凋亡的研究中已被廣泛采用。過(guò)氧化物酶標(biāo)記測(cè)定法

原理：脫氧核糖核苷酸衍生物地高辛[（digoxigenin）-11-dUTP]在TdT酶的作用下，可以摻入到凋亡細(xì)胞雙鏈或單鏈DNA的3-OH末端，與dATP形成異多聚體，并可與連接了報(bào)告酶（過(guò)氧化物酶或堿性磷酸酶）的抗地高辛抗體結(jié)合。在適合底物存在下，過(guò)氧化物酶可產(chǎn)生很強(qiáng)的顏色反應(yīng)，特異準(zhǔn)確的定位出正在凋亡的細(xì)胞，因而可在普通光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察。

毛地黃植物是地高辛的唯一來(lái)源。在所有動(dòng)物組織中幾乎不存在能與抗地高辛杭體結(jié)合的配體，因而非特異性反應(yīng)很低?？沟馗咝恋奶禺愋钥贵w與脊椎動(dòng)物甾體激素的交叉反應(yīng)不到1％，若此抗體的Fc部分通過(guò)蛋白酶水解的方法除去后，則可完全排除細(xì)胞Fc受體非特異性的吸附作用。

本方法可以用于福爾馬林固定的石蠟包埋的組織切片、冰凍切片和培養(yǎng)的或從組織中分離的細(xì)胞凋亡測(cè)定。(一)試劑配制

1、磷酸緩沖液PBS（pH7.4）：磷酸鈉鹽 50mM，NaCl 200mM。

2、蛋白酶K（200μg/ml，pH7.4）：蛋白酶K 0.02g；PBS 100ml。

3、含2%H2O2的PBS緩沖液（pH7.4）：H2O2 2.0ml；PBS緩沖液 98.0ml。

4、TdT酶緩沖液（新鮮配）：Trlzma堿 3.63g用 0.1N HCl調(diào)節(jié)pH至 7.2，加ddH2O定容到1000ml；再加入二甲砷酸鈉 29．96g和氯化鈷0.238g。

5、TdT酶反應(yīng)液：TdT酶32μl；TdT酶緩沖液 76μl，混勻，置于冰上備用。

6、洗滌與終止反應(yīng)緩沖液：氯化鈉 17.4g；檸檬酸鈉 8.82g；ddH2O 1000ml 7、0.05％二氨基聯(lián)苯（DAB）溶液：DAB 5mg；PBS 10ml，pH7.4, 臨用前過(guò)濾后，加過(guò)氧化氫至0.02%。8、0.5％甲基綠（pH4.0）：甲基綠0.5g；0.1M乙酸鈉100ml。9、100％丁醇，100％、95％、90％、80％和70％乙醇，二甲苯，10％中性甲醛溶液，乙酸，松香水等。

10、過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗地高辛抗體（ONCOR）

（二）實(shí)驗(yàn)步驟

1、標(biāo)本預(yù)處理：（1）石蠟包埋的組織切片預(yù)處理：將組織切片置于染色缸中，用二甲苯洗兩次，每次5min。用無(wú)水乙醇洗兩次，每次3min。用95％和75％乙醇各洗一次，每次3min。用PBS洗5min 加入蛋白酶K溶液（20ug／ml），于室溫水解15min，去除組織蛋白。用蒸餾水洗4次，每次2min，然后按下述步驟2進(jìn)行操作。

（2）冰凍組織切片預(yù)處理：將冰凍組織切片置10％中性甲醛中，于室溫固定10min后，去除多余液體。用PBS洗兩次，每次5min。置乙醇：乙酸（2：1）的溶液中，于-20℃處理5min，去除多余液體。用PBS洗兩次，每次5min，然后按下述步驟2進(jìn)行操作。

（3）培養(yǎng)的或從組織分離的細(xì)胞的預(yù)處理：將約 5 × 107個(gè)/ml細(xì)胞于 4％中性甲醛室溫中固定 10min。在載玻片上滴加 50～100μl細(xì)胞懸液并使之干燥。用PBS洗兩次，每次5min，然后按下述步驟2進(jìn)行操作。

2、色缸中加入含2％過(guò)氧化氫的PBS，于室溫反應(yīng)5min。用PBS洗兩次，每次5min。

3、用濾紙小心吸去載玻片上組織周圍的多余液體，立即在切片上加2滴 TdT酶緩沖液，置室溫1～5min。

4、用濾紙小心吸去切片周圍的多余液體，立即在切片上滴加 54μl TdT酶反應(yīng)液，置濕盒中于37C反應(yīng) 1hr（注意：陰性染色對(duì)照，加不含TdT酶的反應(yīng)液）。

5、將切片置于染色缸中，加入已預(yù)熱到37℃的洗滌與終止反應(yīng)緩沖液，于37℃保溫30min，每10min將載玻片輕輕提起和放下一次，使液體輕微攪動(dòng)。

6、組織切片用PBS洗 3次，每次 5min后，直接在切片上滴加兩滴過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗地高辛抗體，于濕盒中室溫反應(yīng)30min。

7、用PBS洗4次，每次5min。

8、在組織切片上直接滴加新鮮配制的0.05％DAB溶液，室溫顯色3～6min。

9、用蒸餾水洗4次，前3次每次1min，最后1次5min。

10、于室溫用甲基綠進(jìn)行復(fù)染10min。用蒸餾水洗3次，前兩次將載玻片提起放下10次，最后1次靜置30s。依同樣方法再用100％正丁醇洗三次。

11、用二甲苯脫水3次，每次2min，封片、干燥后，在光學(xué)顯微鏡下觀察并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

（三）注意事項(xiàng)

一定要設(shè)立陽(yáng)性和陰性細(xì)胞對(duì)照。陽(yáng)性對(duì)照的切片可使用DNaseI部分降解的標(biāo)本，陽(yáng)性細(xì)胞對(duì)照可使用地塞米松（1μM）處理3-4hr的大、小鼠胸腺細(xì)胞或人外周血淋巴細(xì)胞。陰性對(duì)照不加TdT酶，其余步驟與實(shí)驗(yàn)組相同。

第五篇：細(xì)胞裂解實(shí)驗(yàn)方法總結(jié)

細(xì)胞裂解是改變細(xì)胞通透性和活性的重要實(shí)驗(yàn)方法。主要分為化學(xué)法和機(jī)械法，前者比較溫和，后者雖然產(chǎn)量高，但反應(yīng)更劇烈，很有可能造成細(xì)胞中的DNA斷裂。本文主要是介紹細(xì)胞的裂解方法以及實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的方法探討。

裂解方法包括化學(xué)裂解、酶裂解和機(jī)械裂解?；瘜W(xué)裂解和酶裂解通常是比較溫和的方法，通常會(huì)很少使DNA 斷裂。這兩種方法(包括SDS 和溶菌酶處理等)提取純化DNA中常用的方法。機(jī)械裂解可以更均一的裂解細(xì)胞，同化學(xué)裂解相比，機(jī)械處理具有更高的裂解效率和更低的選擇性。機(jī)械處理可以更劇烈和全面的裂解細(xì)胞，但也會(huì)造成DNA 的斷裂。

一、機(jī)械裂解法主要有以下兩種：

1.熱休克(Thermal shock)，既反復(fù)凍溶法，是一種常用的機(jī)械裂解方式比，通常由冷凍和解凍兩部分組成(freezing and thawing)。原理：由于細(xì)胞內(nèi)冰粒形成和剩余細(xì)胞液的鹽濃度增高引起溶脹，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)破碎。冷凍通常在液氮或-20 ℃ 冰上進(jìn)行，解凍可以在37、50、65 或100 ℃水浴中進(jìn)熱休克比化學(xué)裂解溫和，但是很有效，有資料表明用熱休克和溶菌酶與SDS的方法獲得了90%的細(xì)胞裂解率。

2.超聲波處理(Ultrasonication)既利用超聲加熱的方法，把細(xì)胞破碎。但這種處理會(huì)導(dǎo)致DNA 的斷裂，所以加熱不宜過(guò)劇烈，要設(shè)定好超聲時(shí)間和間隙時(shí)間，一般超聲時(shí)間不超過(guò)5秒，間隙時(shí)間最好大于超聲時(shí)間，這些都有利于保護(hù)酶的活性。bead-beating 也是常用的機(jī)械處理方式，有報(bào)道指出bead-beating 比熱休克和化學(xué)裂解的細(xì)胞裂解效果更好雖然DNA產(chǎn)量較高，但通常得到的DNA片段較小。

二、化學(xué)裂解和酶裂解法(在提核酸時(shí)聯(lián)合使用)主要是裂解液處理法，細(xì)胞裂解液的主要目的有以下幾種：

（1）利用去污劑破壞脂質(zhì)雙分子層，破裂細(xì)胞；

（2）溶解蛋白；

（3）蛋白變性使其穩(wěn)定；

（4）抑制蛋白酶活性。

主要根據(jù)不同的目的，裂解液的組成有所不同，主要有提取核酸和蛋白兩中。在提取RNA或DNA時(shí)，我們主要是要充分裂解細(xì)胞，得到更多的核酸；如果我們的目的是蛋白，那要根據(jù)蛋白的位置、特性等因素考慮裂解液，在提取蛋白后，再根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要復(fù)性蛋白等。以下是細(xì)胞裂解中常用試劑和其作用： 50 mMTris-HCl pH 7.4(緩沖體系)，150 mMNaCl(等滲體系)，1 mM PMSF(強(qiáng)大的蛋白酶抑制劑)，1 mM EDTA(變性劑和穩(wěn)定劑)，5 μg/ml Aprotinin(蛋白酶抑制劑)，5 μg/ml Leupeptin(蛋白酶抑制劑)，1% Triton x-100(破壞細(xì)胞)，1% Sodium deoxycholate(中度變性劑和蛋白溶解劑)，0.1% SDS(強(qiáng)變性劑和蛋白溶解劑)。7M 尿素，2M硫脲(可以提高膜蛋白的融解)，蛋白酶K等。細(xì)胞裂解時(shí)間把握問(wèn)題：孔板里細(xì)胞用PBS洗2次后，加入細(xì)胞裂解液，然后去測(cè)總蛋白含量和酶的活力，不知道細(xì)胞要裂解到什么程度? 答：因?yàn)樗玫募?xì)胞類型不一樣，所以實(shí)驗(yàn)的條件也需要摸索，建議這樣來(lái)做：加入細(xì)胞裂解液后，不同時(shí)間取樣，以時(shí)間和總蛋白含量和酶的活力作曲線，這樣就可以找到裂解的最佳時(shí)間，僅供參考。

原核表達(dá)的細(xì)胞裂解問(wèn)題：做原核表達(dá)，用BL21表達(dá)，之后如何裂解細(xì)胞才行呢?我的菌液只有300微升，說(shuō)明書上用超聲裂解細(xì)胞，但沒(méi)給出具體做法，我們這只有大的探頭，不好做，有什么好的辦法么? 要是用超聲裂解，要怎么做才行?我是超聲15 s間隔10 s座4次。裂解不好，應(yīng)該怎樣改呀?!答：請(qǐng)?jiān)囈辉嘔FCC推薦法： 1.收集細(xì)胞懸液

2.4 ℃ 低溫離心(3000 rpm，5min)3.棄上清，加入一定量PBS(200 ul)，輕輕吹打混勻，-20 ℃ 冷凍30 min，37 ℃ 解凍，如此反復(fù)3次，可形成細(xì)胞裂解液

三、western blot細(xì)胞裂解方法個(gè)人小結(jié)：

過(guò)些天準(zhǔn)備做western blot，昨天就提前把細(xì)胞裂解了，提出蛋白來(lái)保存。一下是我做的方法，大家參考，可能有不正確的地方，希望大家指出來(lái)，謝謝!1.取一瓶細(xì)胞(100 ml的瓶子)，PBS洗2次，胰酶消化，加入10 ml 培養(yǎng)液，制備成細(xì)胞懸液；

2.將細(xì)胞懸液移入10 ml離心管中，4 ℃，2500 rpm，離心5 min；

3.棄上清，加入預(yù)冷的PBS(即4 ℃ 存放的PBS)于離心管中，吹打，4 ℃，2500 rpm，離心5min；棄上清，重復(fù)上述步驟一次；共洗細(xì)胞2次，充分洗掉培養(yǎng)液；

4.棄上清，加入200 ul細(xì)胞裂解液(每1 ml裂解液中加入10 ulPMSF)，置于冰上，裂解40 min～1 h；裂解過(guò)程中可用槍頭吹打或間斷搖動(dòng)離心管，以使蛋白充分裂解； 5.取出離心管，于4 ℃，12000 rpm，離心5 min； 6.將上清移入EP管中，-20 ℃ 保存，即可。

注：本來(lái)應(yīng)該在培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中裂解，但出于某種原因，我為節(jié)約細(xì)胞裂解液，故試著在離心管中裂解，不知道這樣裂解是否充分。但我想這種方法也是可以考慮的。

四、核蛋白裂解液配方與步驟： 1.核蛋白裂解液配方 Buffer A 10 mM HEPES 1.5 mM MgCl2 10 mMKCl 0.5 mM DTT，0.05% NP40(or 0.05% Igepal or Tergitol)pH 7.9 Buffer B 5 mM HEPES 1.5 mM MgCl2 0.2 mM EDTA 0.5 mM DTT 26% glycerol(v/v)，pH 7.9 2.核蛋白裂解操作步驟 Method 1.Prepare 1 ml of buffer A with added cocktail of usual inhibitors from frozen stock and store on ice.2.Add 500 μl of buffer a per large petri dish on ice and scrape thoroughly，leave on ice for 10 min.3.Centrifuge at 4 °C at 3000 rpm for 10 min.4.Remove supernatant and keep it(this will contain everything except large plasma membrane pieces，DNA，nucleoli)，extract out 10 μl for Bradford assay.5.On ice resuspend pellet in 374 μl of buffer B and add 26 μl of 4.6 M NaCl to give 300mM NaCl(high salt helps lyse membranes and forces DNA into solution).6.Homogenize with 20 full strokes in Dounce or glass homogenizer on ice.7.Leave on ice for 30 min.8.Centrifuge at 24，000 g for 20 min at 4 °C.9.Aliquot supernatant，remove 10 μl for Bradford assay and store at-70 °C.細(xì)胞裂解機(jī)制被廣泛應(yīng)用于各類的生物實(shí)驗(yàn)中，最突出的當(dāng)屬WB。為達(dá)到最佳的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，需要注意的是所有的實(shí)驗(yàn)步驟都需在四度以下進(jìn)行，并且避免過(guò)多的反復(fù)凍融。而且整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中記得戴手套。編輯： 嗚咽