第一篇：酵母表達(dá)系統(tǒng)概述及相關(guān)研究進(jìn)展

酵母表達(dá)系統(tǒng)的研究進(jìn)展和前景

(XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX學(xué)院)

摘要：酵母表達(dá)系統(tǒng)在表達(dá)真核生物蛋白方面已經(jīng)得到廣泛而成功的應(yīng)用，表達(dá)出的重組蛋白表現(xiàn)出較高甚至比原物種體內(nèi)的蛋白質(zhì)更高的生物活性。近年來，利用釀酒酵母和畢赤巴斯德氏酵母表達(dá)人源蛋白或肽類活性物以及其它中間體取得了新的進(jìn)展。本文主要從上游設(shè)計(jì)，重組表達(dá)，分離純化和活性驗(yàn)證等方面進(jìn)行了總結(jié)，并且對(duì)未來更好的利用酵母生產(chǎn)藥物等活性物質(zhì)作出展望。

關(guān)鍵詞：酵母表達(dá)系統(tǒng)；蛋白分泌：異源基因；糖基化修飾；人源活性藥物

引言

酵母作為一種表達(dá)外源基因的宿主菌, 既具有操作簡(jiǎn)單, 生長快等特點(diǎn), 又具有真核細(xì)胞的翻譯后修飾加工系統(tǒng)。在表達(dá)某些基因工程產(chǎn)品時(shí), 可以大規(guī)模生產(chǎn), 從而有效地降低成本。常用的酵母表達(dá)系統(tǒng)有釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng), 甲基營養(yǎng)型酵母表達(dá)系統(tǒng)和裂殖酵母表達(dá)系統(tǒng)。釀酒酵母（Saccharomyces.cerevisiae）在分子遺傳學(xué)方面被人們的認(rèn)識(shí)最早，也是最先作為外源基因表達(dá)的酵母宿主。但由于釀酒酵母的局限，1983 年美國Wegner 等人最先發(fā)展了以甲基營養(yǎng)型酵母（methylotrophic yeast）為代表的第二代酵母表達(dá)系統(tǒng)。其中畢赤酵母（P.pastoris）是繼S.cerevisiae 之后被迅速推廣的一種外源基因表達(dá)的宿主菌。

釀酒酵母難于高密度培養(yǎng)，分泌效率低，幾乎不分泌分子量大于30 kD的外源蛋白質(zhì)，也不能使所表達(dá)的外源蛋白質(zhì)正確糖基化，而且表達(dá)蛋白質(zhì)的C端往往被截短。因此，一般不用釀酒酵母做重組蛋白質(zhì)表達(dá)的宿主菌。但是，可以通過基因敲除或改造用釀酒酵母表達(dá)亞單位疫苗(如HBV疫苗、口蹄疫疫苗等)或非蛋白活性物質(zhì)及其中間體（如青蒿素，色素）。與原核和其它真核表達(dá)系統(tǒng)相比，巴斯德畢赤酵母作為重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)有以下優(yōu)點(diǎn)

[1]：（1）生長速率快，易于高密度培養(yǎng)（2）在幾乎不含蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基中具有高水平產(chǎn)率

（3）消除了內(nèi)源毒性和噬菌體感染（4）易于對(duì)具有明確特征的酵母表達(dá)載體進(jìn)行操作（5）對(duì)畢赤酵母的噬菌體對(duì)人沒有病原性（6）具有多種翻譯后修飾包括多肽折疊，糖基化，乙?；?，甲基化，蛋白質(zhì)降解調(diào)控以及定位至亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)（7）能夠構(gòu)建分泌的蛋白，這樣只需從生長培養(yǎng)基中提純而不必收集酵母本身細(xì)胞。

基因工程與酵母表達(dá)系統(tǒng)

即使酵母表達(dá)系統(tǒng)具有一些優(yōu)勢(shì)，但在用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)等藥物時(shí)，還需要選擇合適的載體并對(duì)宿主菌的某些代謝途徑進(jìn)行改造，使之利于目標(biāo)產(chǎn)物的表達(dá)，要用于工業(yè)生產(chǎn)，還需根據(jù)實(shí)際情況優(yōu)化培養(yǎng)條件，比如pH，溫度，溶氧量，培養(yǎng)基營養(yǎng)，特殊添加劑等。

釀酒酵母的表達(dá)載體有自主復(fù)制型和整合型，自主復(fù)制型質(zhì)粒通常有30個(gè)或更多的拷貝，含有自動(dòng)復(fù)制序列(automaticreplicating sequence，ARS)，能夠獨(dú)立于酵母染色體外進(jìn)行復(fù)制，如果沒有選擇壓力，這些質(zhì)粒往往不穩(wěn)定。整合型質(zhì)粒不含ARS，必需整合到染色體上，隨染色體復(fù)制而復(fù)制。整合過程是高特異性的，但是拷貝數(shù)很低。為此，人們?cè)O(shè)計(jì)了pMIRY2(for multiple integration into ribosomal DNin yeast)質(zhì)粒，旨在將目的基因靶向整合到rDNA簇上(rDNA簇為酵母基因組中串聯(lián)存在的150個(gè)重復(fù)序列)，因此利用pMIRY2質(zhì)?？梢缘玫?00個(gè)以上的拷貝。值得注意的是，釀酒酵母表達(dá)的外源蛋白質(zhì)往往被高度糖基化，糖鏈上可以帶有40個(gè)以上的甘露糖殘基，糖蛋白的核心寡聚糖鏈含有末端僅1,3甘露糖，致使產(chǎn)物的抗原性明顯增強(qiáng)。

畢赤酵母的表達(dá)載體多采用整合型載體，即將異源基因通過載體整合進(jìn)酵母基因組中，這是由于沒有適合畢赤酵母的游離型表達(dá)載體。所有巴斯德氏畢赤酵母的表達(dá)載體都是一個(gè)表達(dá)組件，它由一個(gè)啟動(dòng)子序列（大多是AOX1啟動(dòng)子），一個(gè)來自AOX1的轉(zhuǎn)錄終止序列用以指導(dǎo)3’終止過程和mRNA的多聚腺苷酸化，在它們之間有一個(gè)或多個(gè)克隆位點(diǎn)用以插入外源基因。這樣的設(shè)計(jì)保證了產(chǎn)物(cap-AOX1 5′UTR-ORF-3′UTR-polyA)是一個(gè)成熟的mRNA以適應(yīng)畢赤酵母的細(xì)胞體系，確保了信息的穩(wěn)定性和有效性。檢測(cè)表達(dá)所用的標(biāo)記基因一般是HIS4（組氨醇脫氫酶基因），有時(shí)也用kan（卡那霉素抗性基因）或Sh ble.此外，有時(shí)為了防止酵母自身蛋白酶對(duì)所要表達(dá)的異源蛋白的降解，會(huì)使用蛋白酶缺陷突變型或降低發(fā)酵溫度，保證目的蛋白的產(chǎn)量和得率。發(fā)酵過程一般分兩個(gè)階段，第一階段是細(xì)胞以甘油為碳源生長，甘油耗盡后進(jìn)入第二階段，加入甲醇誘導(dǎo)AOX1啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄翻譯，從而使異源基因表達(dá)，生產(chǎn)目標(biāo)蛋白。

酵母表達(dá)系統(tǒng)研究進(jìn)展

1． 利用釀酒酵母生產(chǎn)青蒿素前體——青蒿酸

青蒿素（Artemisinin）是目前治療瘧疾的高效藥物，這主要是由于瘧原蟲（Plasmodium falciparum）逐漸對(duì)其它藥物產(chǎn)生了抗藥性?，F(xiàn)在青蒿素的產(chǎn)量遠(yuǎn)達(dá)不到需求量，所以Jay D.Keasling 等人通過釀酒酵母生產(chǎn)它的前體——artemisinic acid，成本低，環(huán)保，可作為高質(zhì)[2]R

量和可靠的青蒿素來源。這個(gè)實(shí)驗(yàn)通過改造甲羥戊酸途徑，引入兩個(gè)來自青蒿（Artemisia annua）的外源酶amorphadiene synthase(ADS)和cytochrome P450 monooxygenase(CYP71AV1)使釀酒酵母獲得將amorpha-4,11-diene氧化為artemisinic acid的三步途徑。同時(shí)，還導(dǎo)入了CYP71AV1的天然氧化還原配體CPR(cytochrome P450 oxidoreductase)，在這之前，還需將法尼基焦磷酸即FPP（farnesyl pyrophosphate）的合成途徑修飾，減少它用于固醇的合成，使之更多的用于合成amorphadiene。然后，利用改造的釀酒酵母EPY224生產(chǎn)artemisinic acid，不僅純度較高，易于提取分離，而且不受氣候影響。

2．利用畢赤巴斯德氏酵母生產(chǎn)人源抗菌肽——LL-37

抗菌肽是生物體抵御外源性病原體的防御反應(yīng)中所產(chǎn)生的一類小分子多肽。許多傳統(tǒng)的抗生素具有毒副作用且能夠誘導(dǎo)耐藥菌株的產(chǎn)生，發(fā)展克服耐藥性問題的新型抗生素顯得越來越重要?？咕木哂蟹肿淤|(zhì)量小、水溶性好、耐熱性強(qiáng)、無免疫原性、抗菌譜廣和作用機(jī)制獨(dú)特等特點(diǎn)，還有研究表明，hCAP（Human cathelicidin antimicrobial peptide）是人皮膚在受傷或炎癥刺激下，嗜堿性粒細(xì)胞分泌的一種防御或抗微生物的肽，在人類中只有LL-37一種。固相化學(xué)合成技術(shù)可以生產(chǎn)像肽這樣較短的氨基酸序列，不過成本太高。Yong-Seok Kim等人[3]利用pGAPZ-E（pGAPZB載體的游離形式）將編碼成熟LL-37的111bp的基因片段采用電穿孔方法轉(zhuǎn)化到P.pastoris X-33中，進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，表達(dá)的重組LL-37通過LC-ESI-MS/MS檢測(cè)確定，發(fā)現(xiàn)有5kDa的LL-37條帶。酵母的表達(dá)出來的LL-37的粗提取物對(duì)Micrococcus luteus具有抑制活性。表達(dá)載體采用GAP強(qiáng)啟動(dòng)子，另外還進(jìn)行了有a-MF外分泌信號(hào)的載體pGAPZaA，結(jié)果采用這個(gè)載體的X-33培養(yǎng)物中沒有發(fā)現(xiàn)胞外分泌的LL-37.另外還利用蛋白酶缺陷型菌株SMD1168H進(jìn)行了轉(zhuǎn)化，LL-37在其中的表達(dá)水平與在X-33中的沒有顯著差異。這個(gè)實(shí)驗(yàn)說明了利用游離型表達(dá)載體在P.pastoris X-33中可以成功表達(dá)LL-37，并且具有生物活性，可以用于生產(chǎn)這類抗菌肽藥物。

3．人源化的畢赤酵母生產(chǎn)糖蛋白類藥物

人體內(nèi)，除了抗體外的大多數(shù)糖蛋白的半衰期和治療潛力依賴于末端的唾液酸化，這是由于一個(gè)糖蛋白的其它末端糖比如甘露糖，N-乙酰葡糖胺和半乳糖等會(huì)被體內(nèi)的糖特異性受體或凝集素識(shí)別并被清除，也就失去療效了。酵母和絲狀真菌在表達(dá)這類糖蛋白方面具有一定前景。用酵母表達(dá)在人體內(nèi)具有活性的糖蛋白需要進(jìn)行很多基因刪除或修飾，Tillman U.Gerngross等人[4]利用畢赤酵母構(gòu)建出能表達(dá)重組紅細(xì)胞生成素（EPO）的菌株P(guān).pastoris YSH597。這個(gè)菌株是在以前的菌株RDP762基礎(chǔ)上利用pSH926載體引入了5個(gè)新的外源基因構(gòu)建成的，為的是使這個(gè)酵母能完成人源的末端唾液酸化。對(duì)天然酵母的改造設(shè)計(jì)到四個(gè)酵

母特異性糖酰化基因的敲除和14個(gè)異源基因的導(dǎo)入。利用SDS-PAGE和HPLC提純分離的重組EPO具有與劑量相關(guān)的生物學(xué)活性。EPO是一種高度糖基化的蛋白質(zhì)，利用酵母表達(dá)需要在N-乙酰葡糖胺或甘露糖等修飾后再加上人源的唾液酸化過程，才能產(chǎn)生有活性的EPO（已經(jīng)進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)）。這項(xiàng)研究表明利用酵母生產(chǎn)EPO等同類糖蛋白具有可行性，不僅能節(jié)省時(shí)間，而且節(jié)約成本，大量生產(chǎn)以緩解對(duì)這類醫(yī)療藥物的需求。

酵母表達(dá)的糖蛋白不同于哺乳動(dòng)物表達(dá)的雜合型或復(fù)雜型糖蛋白，而是高甘露糖型或過度甘露糖化糖蛋白。楊曉鵬等人[5]在前期成功敲除畢赤酵母α-1,6-甘露糖轉(zhuǎn)移酶(Och1p)基因、阻斷畢赤酵母過度糖基化，獲得畢赤酵母過度糖基化缺陷菌株GJK01(ura3、och1)的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了PGE-URA3-PNOI-GAP-signal-MDSI載體，通過表達(dá)不同物種來源的α-1,2-甘露糖苷酶I(MDSI)的活性區(qū)與酵母自身定位信號(hào)的融合蛋白，并通過DSA-FACE(基于DNA 測(cè)序儀的熒光輔助糖電泳)分析篩選報(bào)告蛋白HSA/GM-CSF(人血清白蛋白與粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子融合蛋白)的糖基結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)編碼釀酒酵母α-1,2-甘露糖苷酶(MnsI)基因的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào)與帶有完整C-端催化區(qū)的擬南芥MDSI基因融合表達(dá)時(shí)，畢赤酵母工程菌株能夠合成Man5GlcNAc2 哺乳動(dòng)物甘露糖型糖蛋白。這為在酵母體內(nèi)合成類似于哺乳動(dòng)物雜合型或復(fù)雜型糖基化修飾的糖蛋白奠定了基礎(chǔ)。

4．在巴斯德氏畢赤酵母中高水平表達(dá)一種合成酶——植酸酶

植酸（Phytate）,即肌醇六磷酸（IP6），是植物種子中磷元素的主要儲(chǔ)存形式, 普遍存在于植物性食品和飼料。人和單胃動(dòng)物畜禽和魚類等缺乏內(nèi)源性植酸酶不能利用有機(jī)植酸磷。飼料中常添加無機(jī)磷酸鹽以滿足單胃動(dòng)物的磷營養(yǎng)需求，隨之產(chǎn)生了諸多問題，最主要的是植酸作為一種抗?fàn)I養(yǎng)因子，在體內(nèi)絡(luò)合多種礦質(zhì)元素和蛋白質(zhì)等，常引起人和單胃動(dòng)物各種營養(yǎng)不良癥，而且未被利用的植酸磷被微生物降解釋放無機(jī)磷易引發(fā)水體磷污染。植酸酶（Phytase）是一類特殊的正磷酸單酯磷酸水解酶，催化植酸水解生成低級(jí)肌醇磷酸衍生物和無機(jī)磷酸，在動(dòng)物營養(yǎng)、資源環(huán)境保護(hù)和人類健康等領(lǐng)域愈來愈顯示出巨大的應(yīng)用潛力和研究價(jià)值。植酸酶普遍存在于植物、真菌、酵母和細(xì)菌，其中微生物植酸酶因活性高、生產(chǎn)比較容易等諸多優(yōu)點(diǎn)，對(duì)其研究和開發(fā)最為廣泛和深入。Ai-Sheng Xiong等人利用一種擔(dān)子菌隔孢伏革菌(Peniophora lycii)的植酸酶[6]（一種6’-植酸酶）基因，優(yōu)化出適合P.pastoris的密碼子的基因序列——phy-pl-sh，連接上信號(hào)肽MF4I的基因，采用含有AOX1啟動(dòng)子的pPIC9K載體，轉(zhuǎn)化并使畢赤酵母GS115合成并分泌了植酸酶，產(chǎn)量為12.2g/L.控制的培養(yǎng)條件是：30°C，pH5.5，溶氧量30%，高密度培養(yǎng)。酶蛋白檢測(cè)和酶活測(cè)試發(fā)現(xiàn)，酶的糖基化較嚴(yán)重，用水解酶Endo Hf在37°C下處理提純的酶蛋白4h，得到的片段較均一，且在pH4.5下具有最大

酶活力。對(duì)基因穩(wěn)定性和酶的熱穩(wěn)定性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)效果良好，此外他們還利用DNA Shuffling獲得了幾種熱穩(wěn)定的酶的候選基因，這項(xiàng)研究表明利用畢赤巴斯德氏酵母生產(chǎn)6’-植酸酶具有很大潛力，可以用于工業(yè)生產(chǎn)。

5．畢赤酵母表達(dá)大分子類藥物

在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)具有生物活性的CTP-SOD 融合蛋白，顯著地提高了SOD 保護(hù)HeLa 細(xì)胞免受氧化損傷的能力。細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)肽(CTP，一種能夠攜帶外源大分子穿過細(xì)胞膜，定位于細(xì)胞質(zhì)的短肽)運(yùn)輸人銅鋅超氧化物歧化酶(Cu/Zn SOD)跨過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，可以提高其生物利用度。李沛志等[7]利用P.pastoris GS115(his4-)及其整合型分泌表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K轉(zhuǎn)化表達(dá)了融合蛋白CTD-SOD。首先，設(shè)計(jì)含有CTD轉(zhuǎn)導(dǎo)肽基因序列的融合基因，連接至pPIC9K 質(zhì)粒并用它轉(zhuǎn)化E.coli Top10并進(jìn)行菌落PCR篩選，抽提出重組質(zhì)粒并電擊轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母，將轉(zhuǎn)化成功的酵母接種到Y(jié)PD 培養(yǎng)基中，通過加入甲醇至終濃度0.5％誘導(dǎo)表達(dá)。培養(yǎng)結(jié)束后分析發(fā)酵液中誘導(dǎo)蛋白的表達(dá)量，純化后并進(jìn)行對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用測(cè)試。本研究成功地在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中高效表達(dá)了具有生物活性的CTP-SOD 融合蛋白，發(fā)酵上清中重組蛋白的含量為156.5 mg/L。純化得到的CTP-SOD 分子量約為22.5 kDa。CTP-SOD 預(yù)處理Hela 細(xì)胞可顯著地提高了鄰苯三酚(Progallol)誘導(dǎo)氧化脅迫下HeLa 細(xì)胞的存活率，較野生型SOD 相比具有較強(qiáng)的保護(hù)作用。但是，CTP 和其他種類的PTD（蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域，Protein transduction domain）相比是否更有利于SOD或其他在細(xì)胞質(zhì)中起作用的藥物發(fā)揮功能都有待進(jìn)一步深入的研究來證明，具有跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)能力的新一代藥物運(yùn)輸載體PTD 將會(huì)促進(jìn)多肽、核酸等大分子藥物的快速發(fā)展，為生物大分子藥物的應(yīng)用帶來更廣闊的前景。

在哺乳動(dòng)物中, 三葉型家族(trefoil factorfamily, TFFs)蛋白通過增強(qiáng)細(xì)胞遷移，促進(jìn)細(xì)胞增殖，對(duì)抗細(xì)胞凋亡等過程參與黏膜的修復(fù)并維持其完整性。Bm-TFF2, 一種從大蹼鈴蟾皮膚分泌物中分離得到的兩棲類三葉因子, 具有比人三葉因子更強(qiáng)的生物學(xué)活性。余果宇等人

[8]以Bm-TFF2 的cDNA 為模板, 利用PCR 方法擴(kuò)增Bm-TFF2 基因, 然后插到含有AOX1 啟動(dòng)子和α-因子信號(hào)肽序列的表達(dá)載體pPIC9K 中, 采用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行分泌表達(dá), 并用G418 篩選高拷貝整合轉(zhuǎn)化子。SDS-PAGE 和Western blotting 都檢測(cè)到Bm-TFF2 被分泌性表達(dá)于酵母上清。在1%的甲醇誘導(dǎo)表達(dá)不同時(shí)間后, 重組蛋白在72 h 的表達(dá)量最大, 可達(dá)50 mg/ L;而不同濃度的飽和硫酸銨沉淀菌液上清時(shí), 80%的飽和硫酸銨沉淀量最大。這些結(jié)果表明, 重組質(zhì)粒Bm-TFF2-pPIC9K 成功構(gòu)建并在真核細(xì)胞中高效表達(dá), 這為進(jìn)一步研究Bm-TFF2 的生物學(xué)活性及其結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。

6．畢赤酵母在表達(dá)病毒蛋白用于疫苗和診斷方面的應(yīng)用

人輪狀病毒的VP7 基因目前已有用大腸埃希氏菌、乳酸桿菌，植物和哺乳動(dòng)物細(xì)胞等表達(dá)系統(tǒng)的報(bào)道，而酵母表達(dá)尚未見報(bào)道。利用巴斯德畢赤酵母表達(dá)輪狀病毒的保護(hù)性抗原VP7，以制備輪狀病毒基因工程疫苗，可為預(yù)防輪狀病毒感染提供一條有效途徑。盧穎等人

[9]將已構(gòu)建的重組質(zhì)粒VP7-pPICZαA 經(jīng)SacⅠ線性化后，通過電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115中，然后Zeocin平板篩選并進(jìn)行PCR鑒定及Mut 表型篩選，成功構(gòu)建VP7 基因的重組酵母表達(dá)系統(tǒng)，為進(jìn)一步表達(dá)VP7 基因提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

為了分析真核體系中表達(dá)的乙型腦炎病毒E蛋白的生物學(xué)特性，張健等人[10]以乙腦病毒SA-14 株為代表，構(gòu)建了E 蛋白基因的畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)。首先，應(yīng)用RT-PCR 法擴(kuò)增乙型腦炎病毒E蛋白表達(dá)基因，定向克隆入載體pPICZαA，然后將重組質(zhì)粒以PmeⅠ線性化并電轉(zhuǎn)化入畢赤酵母GS115 感受態(tài)細(xì)胞，最后用Zeocin篩選轉(zhuǎn)化子進(jìn)行鑒定。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物約為1 350 bp，定向克隆獲得pPICZαA-E 表達(dá)載體，經(jīng)測(cè)序結(jié)果與Genbank 相應(yīng)序列比較，核苷酸序列同源性為100%，電轉(zhuǎn)化得到巴氏畢赤酵母重組菌株GS115-E，提取其基因組DNA 經(jīng)PCR鑒定與預(yù)期相符。本研究構(gòu)建的乙型腦炎病毒E 基因畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)為進(jìn)一步進(jìn)行E蛋白真核表達(dá)研究奠定了基礎(chǔ)。

酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)病毒蛋白抗原還在血清學(xué)診斷方面有所進(jìn)展。于天飛等人[11]在多酵母表達(dá)系統(tǒng)（GS115/pPIC9-TY，GS115/pPIC9K-ts（Mut+），KM71/pPIC9-ts）中表達(dá)了含有豬傳染性胃腸炎病毒S 基因B 和C 抗原位點(diǎn)片段。經(jīng)檢測(cè)表明，不同類型酵母表達(dá)系統(tǒng)蛋白表達(dá)量和抗原性差異不大，研究中獲得的重組蛋白為建立TGE血清學(xué)檢測(cè)方法提供了必要的物質(zhì)基礎(chǔ)．本試驗(yàn)所獲得蛋白為PRCV S蛋白缺失部分，以此重組蛋白作為診斷抗原建立的血清學(xué)診斷方法可望避免潛在的PRCV感染對(duì)檢測(cè)TGE的干擾，得出篩選生長速度較快的GS115/pPIC9-TY適合作為今后進(jìn)一步應(yīng)用的候選重組菌．

總結(jié)

由于酵母表達(dá)外源蛋白，特別是藥用蛋白質(zhì)的種種優(yōu)勢(shì)，促使研究人員不斷改進(jìn)酵母的遺傳特性和生理特性。這些突破更加提高了酵母在生產(chǎn)藥用蛋白中的應(yīng)用。在工作中對(duì)不同來源、不同作用特點(diǎn)外源蛋白的研究和開發(fā)應(yīng)用，畢赤酵母表達(dá)體系是一個(gè)很好的選擇，我們需要綜合考慮這一表達(dá)體系的上述特點(diǎn)，對(duì)目的外源蛋白基因進(jìn)行相應(yīng)的改造，設(shè)計(jì)合理的構(gòu)建策略，使重組外源蛋白按我們的要求進(jìn)行表達(dá)，有助于獲得大量有活性的表達(dá)產(chǎn)物。相信這一表達(dá)體系的采用和不斷深入研究勢(shì)必為基因工程藥物的發(fā)展提供加速度。

參考文獻(xiàn)

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第二篇：酵母表達(dá)系統(tǒng)使用心得

Pichia酵母表達(dá)系統(tǒng)使用心得

甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)有不少優(yōu)點(diǎn)，其中以Invitrogen公司的Pichia酵母表達(dá)系統(tǒng)最為人熟知，并廣泛應(yīng)用于外源蛋白的表達(dá)。雖然說酵母表達(dá)操作簡(jiǎn)單表達(dá)量高，但是在實(shí)際操作中，并不是每個(gè)外源基因都能順利得到高表達(dá)的。不少人在操作中會(huì)遇到這樣那樣的問題，收集了部分用戶在使用EasySelect Pichia Expression System這個(gè)被譽(yù)為最簡(jiǎn)單的畢赤酵母表達(dá)的經(jīng)典試劑盒過程中的心得體會(huì)。其中Xiang Yang是來自美國喬治城大學(xué)（Georgetown University）Lombardi癌癥中心（Lombardi Cancer Center），部分用戶來自國內(nèi)。甲醇酵母部分優(yōu)點(diǎn)：

1.屬于真核表達(dá)系統(tǒng)，具有一定的蛋白質(zhì)翻譯后加工，有利于真核蛋白的表達(dá)； 2.AOX強(qiáng)效啟動(dòng)子，外源基因產(chǎn)物表達(dá)量高，表達(dá)產(chǎn)物可以達(dá)到每升數(shù)克的水平； 3.酵母培養(yǎng)、轉(zhuǎn)化、高密度發(fā)酵等操作接近原核生物，遠(yuǎn)較真核系 統(tǒng)簡(jiǎn)單，非常適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)；

4.可以誘導(dǎo)表達(dá)，也可以分泌表達(dá)，便于產(chǎn)物純化；

5.可以甲醇代替IPTG作為誘導(dǎo)物，部分甲醇酵母更可以用工業(yè)甲醇替代葡萄糖作為碳源，生產(chǎn)成本低。

產(chǎn)品性能：優(yōu)點(diǎn)——使用簡(jiǎn)單，表達(dá)量高，His-tag便于純化；缺點(diǎn)——酵母表達(dá)蛋白有時(shí)會(huì)出現(xiàn)蛋白切割問題。

巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）是一種能高效表達(dá)重組蛋白的酵母品種，一方面由于其是屬于真核生物，因此表達(dá)出來的蛋白可以進(jìn)行糖基化修飾，另一方面畢赤酵母生長速度快，可以將表達(dá)的蛋白分泌到培養(yǎng)基中，方便蛋白純化。

畢赤酵母表達(dá)載體pPICZ在多克隆位點(diǎn)（MCR）3'端帶有his-tag和c-myc epitopes，這些tag有利于常規(guī)檢測(cè)和純化，而且在MCR5'端引入了alpha factor（α-factor）用以分泌表達(dá)，并且在表達(dá)后α-factor可以自動(dòng)被切除。在進(jìn)行克隆的時(shí)候，如果你選擇的是EcoRI，那么只需在目標(biāo)蛋白中增加兩個(gè)氨基酸序列即可完成。另外pPICZ系列選用的是Zeocin抗生素作為篩選標(biāo)記，而誘導(dǎo)表達(dá)的載體需要甲醇——甲醇比一般用于大腸桿菌表達(dá)誘導(dǎo)使用的IPTG便宜。第一步——構(gòu)建載體

Xiang Yang：pPICZ系列有許多克隆位點(diǎn)可供選擇，同時(shí)也有三種讀碼框以便不用的用戶需要。

紅葉山莊：有關(guān)是選擇pPIC9K還是pPICZ系列？pPIC9K屬于穿梭質(zhì)粒，也可以在原核表達(dá)，而pPICZ系列比較容易操作，大腸和畢赤酵母均用抗Zeocin篩選（PIC9K操作麻煩一點(diǎn)，大腸用amp抗性，而畢赤酵母先用His缺陷篩選陽性克隆，在利用G418篩選多拷貝），而且對(duì)于大小合適（30—50KD）的蛋白在產(chǎn)量上是pPIC9K無法比擬的。

leslie：要做畢赤酵母表達(dá)實(shí)驗(yàn)，首先當(dāng)然就要了解這個(gè)可愛的酵母了（橢圓形，肥嘟嘟的，十分可愛），她和大腸桿菌長得有較大區(qū)別（大腸桿菌是桿狀的），因此在培養(yǎng)的過程中要區(qū)別這兩種菌體，除了氣味，濃度，顏色以外，也可以取樣到顯微鏡中觀測(cè)。大家做畢赤表達(dá)的時(shí)候應(yīng)該都遇過這種情況吧，表達(dá)過程中染菌（我們實(shí)驗(yàn)室曾經(jīng)污染過各種顏色形狀的細(xì)菌，那真是一段可怕的經(jīng)歷），如果在不知情的情況下繼續(xù)做下去，那可以就是浪費(fèi)大把的

時(shí)間了。

基本熟悉了畢赤酵母，了解了她生長的喜好（多糖偏酸環(huán)境），生長的周期等等情況后，當(dāng)然更多的精力還是應(yīng)該花在表達(dá)的目的蛋白上，我的表達(dá)蛋白有些恐怖，有100KD，本來當(dāng)然應(yīng)該放在大腸桿菌中表達(dá)，但是為了分泌表達(dá)（其實(shí)后來發(fā)現(xiàn)大腸桿菌pET系列分泌表達(dá)系列也不錯(cuò)）和糖基化修飾（主要是這個(gè)方面，因?yàn)槲业牡鞍资侨嗽吹?，表達(dá)出來用于酵母雙雜，因此需要有完備的糖基化修飾）。這樣我的DNA片段由于較長，所以在做克隆的時(shí)候也要非常小心，需要注意的是：

①酶切位點(diǎn)不能出現(xiàn)在目的DNA片段中——如果片段長無法避免，可以采用平末端連接；

②雖然α-factor可以自動(dòng)切除，但是在設(shè)計(jì)表達(dá)的時(shí)候，如果在N端不能出現(xiàn)任何多余的aa（比如藥物蛋白表達(dá)），需要特別留意（說明書上有詳細(xì)說明：P13）；

③有三種不同的讀碼框（對(duì)于pPICZα系列來說就是對(duì)上α-factor序列），在設(shè)計(jì)克隆的時(shí)候要反復(fù)確定自己的讀碼框是否正確，這可是致命的問題；

④無論pPICZ還是pPICZα都有TGA（終止密碼子），但是pPICZ系列沒有ATG（起始密碼子），有人認(rèn)為酵母啟動(dòng)子與外源基因的ATG之間的距離越短對(duì)于表達(dá)的該基因越有利；

⑤如果不希望有c-myc和His-tag，可以在基因片段末尾加入終止密碼子；

⑥Pichia的密碼子與釀酒酵母的相似，有關(guān)基因表達(dá)偏好密碼子的問題有人認(rèn)為沒有必要更換，有人認(rèn)為一定要換，個(gè)人認(rèn)為以產(chǎn)量為主要目的的可以考慮更換基因密碼子，而如果片段過長就比較麻煩，不過有許多真核保守蛋白其實(shí)是和酵母密碼子相似的；

⑦克隆菌株需要有recA，endA，試劑盒帶有的TOP10挺好用的（其它像是DH5α都行），但是要注意帶有篩選抗生素Zeocin的培養(yǎng)基要用低鹽培養(yǎng)基（NaCl減半），這主要是因?yàn)榕掠绊懙娇股刈饔茫╖eocin平板要避光保存）；

⑧測(cè)序引物可以用α-factor信號(hào)引物，也可以用5'AOX1引物；

⑨如果需要高量表達(dá)，可以考慮做克隆的時(shí)候串聯(lián)基因片段進(jìn)行表達(dá)，另外也可以在轉(zhuǎn)化酵母的時(shí)候重復(fù)轉(zhuǎn)化。

⑩目的基因中最好不要含有pro-glu-ser-thr這樣的序列，因?yàn)檫@個(gè)序列是激活蛋白水解酶的作用底物，會(huì)影響表達(dá)，另外也不要含有x-phe-x-arg-gln和gln-arg-x-phe-x這樣的序列（x=任何氨基酸），因?yàn)檫@些序列容易受到容酶體的切割，而且目的蛋白末端最好是ala,asp,val,ser這樣的氨基酸。除此之外許多高A+T含量的基因通常會(huì)由于提前終止而不能有效轉(zhuǎn)錄，也需要多加注意。

第二步就是將線性化的DNA轉(zhuǎn)化入Pichia酵母中：

Xiang Yang：EasySelect試劑盒準(zhǔn)備了三種菌株：X33，GS115和KM71H。我傾向于選擇X33，因?yàn)檫@個(gè)菌株轉(zhuǎn)化率和表達(dá)量相對(duì)而言較高，如果你有電轉(zhuǎn)儀（electroporator），可以嘗試一下。如果沒有的話，EasySelect也準(zhǔn)備了化學(xué)轉(zhuǎn)化試劑——EasyComp Transformation，但是由于轉(zhuǎn)化率的緣故，我建議使用電轉(zhuǎn)儀。

leslie：在得到了正確的序列之后就可以準(zhǔn)備轉(zhuǎn)化畢赤酵母了，試劑盒攜帶有的是X-33，GS115和KM71H這三種畢赤酵母（另外常用的還有SMD1168），每種酵母的特點(diǎn)有些不盡相同

（Manual上寫的很清楚），其中X-33由于是野生型，因此耐受性比較好，如果擔(dān)心轉(zhuǎn)化率的話可以考慮這種酵母菌，而GS115與X33一樣都是屬于MUT＋表現(xiàn)型，也就是說可以在含甲醇的培養(yǎng)基中快速生長，但是據(jù)說會(huì)對(duì)外源基因表達(dá)有影響，KM71是MUT-型酵母，在甲醇培養(yǎng)基中生長緩慢，但是也有利于翻譯后加工，比如形成二硫鍵，糖基化等等，另外SMD1168則是基因組中的Pep4基因發(fā)生突變，造成蛋白水解酶活性的喪失，可以保護(hù)表達(dá)產(chǎn)物免受降解，促進(jìn)表達(dá)量的提高。

一般來說，如果是胞內(nèi)表達(dá)，應(yīng)盡量用Mut－細(xì)胞，這樣得到的蛋白產(chǎn)物中醇氧化酶蛋白量較少而目的蛋白量相對(duì)較多(約占Pp總分泌蛋白量的30-90%，如人乙酰膽堿酯酶B變異鏈的含量占到90%，使下游純化更易進(jìn)行。而對(duì)于分泌蛋白的表達(dá)，無論是甲醇利用慢(Mut-)還是甲醇利用快(Mut+)的細(xì)胞都可應(yīng)用，如在人血清白蛋白(HSA)(為分泌型蛋白)的表達(dá)中就看不出兩種類型的細(xì)胞之間有什么明顯差別。

所以一般手冊(cè)都會(huì)建議同時(shí)在這幾種菌株中進(jìn)行轉(zhuǎn)化，這主要是因?yàn)椴煌幕蛟诓煌慕湍妇锌赡鼙磉_(dá)量截然不同，因此在最開始的時(shí)候建議多用幾種酵母菌實(shí)驗(yàn)。

另外有個(gè)保存問題，原始酵母菌一定要保存好，因?yàn)榻湍冈趥鞔啻魏髸?huì)影響其轉(zhuǎn)化率和表達(dá)量，所以一方面分多管分裝保存于-80℃，另一方面如果出現(xiàn)了轉(zhuǎn)化或者表達(dá)的問題，在其它方面都沒有出錯(cuò)的前提下可以考慮重新取出新菌液（每次都要涂平板挑菌）。

在準(zhǔn)備酵母菌的同時(shí)也需要準(zhǔn)備質(zhì)粒，由于酵母菌轉(zhuǎn)化對(duì)轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的要求較高，量也較大（5-10ug），因此許多時(shí)候都會(huì)用PEG大提質(zhì)粒，或者用大提試劑盒，總而言之要準(zhǔn)備好足夠量的質(zhì)粒，并且不要忘記也要同時(shí)準(zhǔn)備空載體以做對(duì)照。在轉(zhuǎn)化前質(zhì)粒需要進(jìn)行線性化，這主要是為了增加重組率（EasySelect試劑盒表達(dá)量高的一個(gè)重要原因也就在于其原理是將目的片段整合到載體上，大大的增加了目的片段的表達(dá)）。線性化位點(diǎn)個(gè)人認(rèn)為也會(huì)影響到表達(dá)量，對(duì)于基因片段不大的蛋白可以考慮用幾個(gè)線性化位點(diǎn)同時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)化篩選，但是如果片段大，就有可能供選擇的機(jī)會(huì)少，而且也有可能遇上沒有合適的線性化位點(diǎn)的情況，這個(gè)時(shí)候也不是說不能進(jìn)行表達(dá)，但是準(zhǔn)備的質(zhì)粒就要增加10倍，另外也可以進(jìn)行部分酶切（即先進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，掐定時(shí)間和酶量保證被切開的質(zhì)粒有部分是在線性化位點(diǎn)切開而基因片段保存完好）。

在線性化之后的質(zhì)粒就可以酒精沉淀回收了——中間步驟需要使酶失活，說明書建議是熱失活或者EDTA，個(gè)人認(rèn)為前者比較好，主要是擔(dān)心EDTA對(duì)于轉(zhuǎn)化的影響，另外這三種酶失活的溫度都是65℃/20min。沉淀回收之后是離心10分鐘，用80%的酒精洗滌后風(fēng)干，這一步需要多加注意保證風(fēng)干完全，因?yàn)橛袑?shí)驗(yàn)證明殘留的酒精對(duì)于轉(zhuǎn)化的影響頗大。

接下來就是酵母轉(zhuǎn)化了，這是令許多人頭疼的一步，也是影響實(shí)驗(yàn)決定表達(dá)的關(guān)鍵步驟。轉(zhuǎn)化方法有不少，例如電轉(zhuǎn)，化學(xué)轉(zhuǎn)化，原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，其方法的難易程度和轉(zhuǎn)化率高低呈反向遞減的，也就是說電轉(zhuǎn)最容易，轉(zhuǎn)化率較高（但要求有電轉(zhuǎn)儀），而原生質(zhì)體最麻煩，而且效果不好（比較傳統(tǒng)），因此不建議使用，EasySelect說明書上這么建議，并且也詳細(xì)說明了電轉(zhuǎn)，化學(xué)轉(zhuǎn)化（EasyComp和LiCl）方法的過程，可以按部就班。需要注意的是（電轉(zhuǎn)過程）：

①最好每次都從平板上挑酵母菌，用培養(yǎng)過的酵母放置時(shí)間不要超過一個(gè)星期；

②擴(kuò)大培養(yǎng)的濃度一定要控制好，個(gè)人認(rèn)為不需要OD600達(dá)到1.3-1.5，1.0-1.3的就好，這個(gè)時(shí)候的酵母比較新鮮，轉(zhuǎn)化率比較高； ③整個(gè)感受態(tài)制作過程中一定要在冰上操作，離心最好也用冷凍離心機(jī)，這是影響轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵——為了進(jìn)一步保證這一點(diǎn)，無菌水可以是冰水混合物，另外山梨醇和電轉(zhuǎn)杯都要預(yù)冷；

④電轉(zhuǎn)儀需要預(yù)熱，所以準(zhǔn)備感受態(tài)的時(shí)候就可以把電轉(zhuǎn)儀打開了，電轉(zhuǎn)后山梨醇的加入要快，曾有人做實(shí)驗(yàn)證明晚一秒就會(huì)降低轉(zhuǎn)化的數(shù)量級(jí)，雖然不一定可信，但是我個(gè)人也認(rèn)為這個(gè)過程要快，電轉(zhuǎn)后可以看看時(shí)間，如果時(shí)間過短（比如(4)就可能說明雜質(zhì)較多，會(huì)影響轉(zhuǎn)化率；

⑤轉(zhuǎn)化后溫育是個(gè)增加同源重組，增加存活率的過程，需要注意不要感染了大腸桿菌，再加入培養(yǎng)基30℃搖一段時(shí)間，可以取部分涂板（不同濃度抗生素），或者也有人將菌短暫離心，棄去上清，剩余全部涂板以保證轉(zhuǎn)化率。

(化學(xué)轉(zhuǎn)化)

如果沒有電轉(zhuǎn)儀，LiCl轉(zhuǎn)化是一種可供選擇的方法，轉(zhuǎn)化率是102到103cfu/ug。

主要過程為： 取過夜活化培養(yǎng)的菌液按1：1000接種于15ml新鮮的YPD液體培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.8-1.0；4℃，4500rpm離心5分鐘，用8ml冰預(yù)冷的無菌水洗滌菌體，傾除洗滌液，用1mL，4℃，4500rpm離心5分鐘，沉淀用50μl冰預(yù)冷的100mmol/L LiCl懸浮，最后定容至80-90ml。

LiCl轉(zhuǎn)化 取適量單鏈鮭精DNA（2mg/mL）煮沸5min，立即置于冰上備用，取上述制備好的感受態(tài)細(xì)胞12 000rpm，離心15s，吸棄LiCl溶液，按順序依次加入 50%PEG240ml 1mmol/L LiCl

ml 單鏈鮭精DNA

25ml 線性化質(zhì)粒DNA 10 ml(約10mg)用吸頭反復(fù)吹打，使細(xì)胞沉淀與加入的溶液混勻，30℃靜置溫育30min，42℃熱擊20-25min，4500rpm離心10min，吸棄轉(zhuǎn)化液，細(xì)胞沉淀加1ml YPD培養(yǎng)基于30℃ 200 rpm培養(yǎng)2-4hr，取轉(zhuǎn)化混合液100ml涂布含100μg/mL ZeocinTM 的YPDS平板，30℃培養(yǎng)2-3天。

第三步——挑克隆篩選

Xiang Yang：在protocol中用了許多篇幅來指導(dǎo)這一步，包括如何去通過平板篩選，觀測(cè)生長速率來確定Mut表現(xiàn)型等。這個(gè)過程需要3到5天，而我一般只用用了4個(gè)小時(shí)進(jìn)行PCR（AOX引物）篩選。

leslie：完成轉(zhuǎn)化后就是克隆鑒定的過程了，包括高拷貝篩選，PCR鑒定和表型鑒定的過程，其中我做的比較多的是PCR鑒定（因?yàn)楸容^快），具體過程protocol上說的很清楚，其實(shí)也很簡(jiǎn)單，就是凍融破菌進(jìn)行菌落PCR，但是其中許多具體細(xì)節(jié)問題也挺讓人頭痛的，第一就是破壁的問題，許多人用PCR方法進(jìn)行鑒定都無法得到結(jié)果，甚至在表達(dá)出了以后還是無法得到這張鑒定圖片，主要原因之一就是無法正常釋放酵母基因組，一般通過培養(yǎng)菌然后進(jìn)行沸水和-20℃冷凍循環(huán)過程裂解細(xì)胞在目的蛋白片段比較合適的范圍以內(nèi)是可以得到好的結(jié)果的，但是有時(shí)候片段過長，模壁就會(huì)阻礙擴(kuò)增，所以我們實(shí)驗(yàn)室會(huì)用蝸牛酶（很便宜的酶來的）來幫助溶菌，我看許多實(shí)驗(yàn)室也會(huì)這么做，不過加入的時(shí)間不同而已，其次也有奢侈的用試劑盒的。

第二就是是模板量，個(gè)人建議模板真的不要加太多了，按照說明書的上的5ul我覺得還是多了，而且建議總體積不用這么大，當(dāng)然加入模板的量也與自己培養(yǎng)菌的濃度以及用來凍融的菌數(shù)量有關(guān)。其次是假陽性和假陰性結(jié)果，在Mut-和Mut+情況是不一樣的，如果用的是5'AOX引物，KM71H會(huì)出現(xiàn)3.6kb的片段，而Mut+則會(huì)出現(xiàn)AOX1基因原本長度的片段——大約長2.2kb，因此如果的基因片段長度相似，要注意區(qū)分。建議PCR過程中使用多對(duì)引物進(jìn)行反應(yīng)，包括自己基因的，α-factor的，5'AOX的，都可以，反正各種對(duì)照多了有利于比較——當(dāng)然前提是你不能暈了頭。

掉了毛的鴕鳥：巴斯德畢赤酵母包含醇氧化酶-1(AOX1)基因的啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄終止子(5’AOX1和3’AOX1),他們被多克隆位點(diǎn)分開,外源基因可在此插入,此外，載體中還包含組氨酸脫氫酶基因(HIS4)選擇標(biāo)記（HIS4區(qū)的整合方式為位點(diǎn)特異性單交換引起的基因插入，整合后使組氨酸缺陷型宿主（his4）恢復(fù)野生型.HIS4區(qū)或AOX1區(qū)位點(diǎn)的整合都使轉(zhuǎn)化子具有HIS4基因，因而可利用表型差異進(jìn)行篩選，酵母GS115具有組氨醇脫氫酶缺陷型基因his4，可接受含HIS4的載體而具有HIS＋表型以篩選轉(zhuǎn)化子.）及3’AOX1區(qū),當(dāng)整合型載體轉(zhuǎn)化受體菌感受態(tài)細(xì)胞時(shí),他的5’AOX1和3’AOX1能與染色體上的同源基因重組,從而使整個(gè)載體和外源基因插入到受體菌染色體上，在加入甲醇作為唯一碳源的培養(yǎng)基中,外源基因在5’AOX1啟動(dòng)子的控制下表達(dá).在載體中引入Tn903Kanr基因(抗G418)有助于篩選高拷貝轉(zhuǎn)化子,轉(zhuǎn)化子的拷貝數(shù)與抗G418的能力有關(guān),通過篩選抗G418能力強(qiáng)的酵母即可獲得高拷貝轉(zhuǎn)化子.外源基因是以同源重組的方式插入到酵母菌的染色體中,因此不易丟失，多次傳代后酵母仍能穩(wěn)定表達(dá)外源蛋白，具有良好的遺傳穩(wěn)定性.第四步——表達(dá)

Xiang Yang：將你的克隆在YPD培養(yǎng)基中培育到OD600值達(dá)到6.0，就可以離心收菌。用表達(dá)培養(yǎng)基（比如BMMY）重懸沉淀，在30oC培育過夜。

leslie：篩選鑒定出自己的重組子可以說什么都不能證明，還是要看這一步的酵母表達(dá)，有許多人在酵母表達(dá)上花費(fèi)了大量的時(shí)間——不同于大腸桿菌的兩天出結(jié)果，一次畢赤酵母的表達(dá)就需要起碼一周的時(shí)間，篩選了上百上千的克隆，但是仍然是竹籃打水一場(chǎng)空，我個(gè)人建議如果在篩選完3批以上就可以放棄這一批轉(zhuǎn)化的酵母菌，另外調(diào)整進(jìn)行重新轉(zhuǎn)化。

另外剛開始的時(shí)候可以用小量表達(dá)，可以用5ml：生長慢型，生長快型，陰性對(duì)照（空質(zhì)粒），陽性對(duì)照（可以是曾經(jīng)表達(dá)成功的重組子）和沒有進(jìn)行轉(zhuǎn)化的酵母菌的單克隆，BMGY中培養(yǎng)到OD值2-6，離心收菌（如果怕污染或者麻煩，可以放置酵母菌一段時(shí)間，一半為20-30分鐘，讓菌沉淀下來，小心傾倒去上清培養(yǎng)基獲得菌），轉(zhuǎn)入BMMY中誘導(dǎo)表達(dá)，這些步驟都需要在超凈工作臺(tái)里進(jìn)行，如果要區(qū)分是否染菌，可以取一些到顯微鏡下觀察，或者聞氣味（酸甜的是酵母），觀顏色（乳白色的是酵母）。除此之外，如果是小量表達(dá)，有可能會(huì)在沒有達(dá)到4天的時(shí)間培養(yǎng)基就干了，所以可以適當(dāng)補(bǔ)充一些，以及在搖床里放置盛有無菌水的深口瓶，來保持搖床里濕度。

誘導(dǎo)物甲醇注意要在超凈臺(tái)中打開，可以分裝到滅過菌的瓶子中——當(dāng)然甲醇是不能滅菌的，而且也要注意在用酒精燈過甲醇瓶口的時(shí)候要小心，如果真的引起爆炸那可就損失大了。另外如果覺得每天添加甲醇麻煩，也有人用一次性注射器透過紗布添加甲醇，這個(gè)方法可能會(huì)造成染菌，慎選。說到紗布就想到了通氣性問題，酵母在無氧和有氧的情況下都可以存活，但是在甲醇誘導(dǎo)的情況下畢赤酵母用的是醇氧化酶，自然氧氣量對(duì)于這一基因的表達(dá)影響重大，但是由于害怕感染大腸桿菌，紗布裹的也不能太少，最好專辟出一個(gè)搖床進(jìn)行三十度酵母表達(dá)，這樣可以考慮將紗布減少到3—5層，同時(shí)需要注意的是搖瓶內(nèi)菌液體積不要超過10-30%。

每天取樣出來進(jìn)行SDS-PAGE電泳鑒定，能這樣最好，不過每天做膠跑膠染色真的很麻煩，可以匯集一批同時(shí)跑，不過樣品一定要煮過凍存，而且每次取樣不要反復(fù)凍融，最好分裝保存——因?yàn)榈鞍捉?jīng)煮沸變性會(huì)不穩(wěn)定，容易降解。另外為了防止蛋白在分泌出來的過程就降解了（特別是小分子蛋白），也可以通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值抑制蛋白水解酶的活性（這一方面說明書講解得詳細(xì)），還可以加入酪蛋白氨基酸等保護(hù)物質(zhì)，競(jìng)爭(zhēng)性抑制蛋白水解酶 的活性來防止表達(dá)產(chǎn)物降解。

如果使用的是分泌型培養(yǎng)基，按道理收集培養(yǎng)基上清就可以進(jìn)行下一步分析了，但是由于培養(yǎng)基中的蛋白濃度PAGE膠一般是檢測(cè)不出來的——除非你的表達(dá)蛋白量非常大。所以需要進(jìn)行濃縮，方法有TCA法，硫酸氨鹽析，PEG沉淀，透析，超濾等等，當(dāng)然最簡(jiǎn)單的就是煮沸蒸發(fā)水分濃縮了。另外跑膠的時(shí)候同時(shí)對(duì)照酵母胞內(nèi)蛋白，以防沒有分泌出來。SDS-PAGE的配置參見分子克隆，注意你的蛋白大小與膠的濃度的對(duì)應(yīng)性，如果小到20kD以下，可以考慮用tricine膠，不過是個(gè)需要全盤重新準(zhǔn)備的過程，要考慮清楚。如果選用的載體是帶有信號(hào)肽的，雖說是分泌表達(dá)好純化，但實(shí)際上畢赤酵母本身還是有本底表達(dá)的，而且有時(shí)候會(huì)造成假陽性，所以最后表達(dá)過程需要用Western blot或者Elasa，通常都是用WB，具體的細(xì)節(jié)可見Western Blotting前傳：想成為高手嗎？系列文章，另外要提一句的是，如果本身蛋白沒有合適抗體（如果是利用從大腸表達(dá)出來的蛋白做出的抗體也有可能與用真核系統(tǒng)表達(dá)出來的蛋白無法發(fā)生免疫作用），可以選用anti-myc或者anti-his的，前提當(dāng)然是你的蛋白沒有提前終止。

其它在表達(dá)中可能出現(xiàn)的情況包括表達(dá)量低，沒有分泌表達(dá)（針對(duì)pPICZa系列），頭兩天蛋白量較大，無法重復(fù)，表達(dá)出來的蛋白偏大等等，需要分各個(gè)方面分析原因，比如蛋白明明加上了信號(hào)肽，但是就是無法分泌出來，這可能是蛋白結(jié)構(gòu)在通過細(xì)胞膜的時(shí)候受到了阻礙，可能需要重新轉(zhuǎn)化，更換線性化位點(diǎn)或者更換菌株；如果蛋白表達(dá)第一天較高，但是之后越來越少，這很有可能是蛋白降解了或者產(chǎn)生了競(jìng)爭(zhēng)表達(dá)；畢赤酵母無法重復(fù)的問題比較嚴(yán)重，許多情況下在第一次獲得了高量表達(dá)之后就再怎么也重復(fù)不了這個(gè)結(jié)果，遇到這種情況真是令人非常痛苦，可是除了重新摸索條件還能怎么樣呢？而表達(dá)出來的蛋白分子量偏大則是個(gè)正?，F(xiàn)象，除了糖基化以外還有其它原因，比如二聚體，這些需要進(jìn)行WB或進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

第五步——發(fā)酵和產(chǎn)物純化

Xiang Yang：我用的是HisTraP Columns（GE Healthcare），經(jīng)過簡(jiǎn)單的純化之后我可以得到90%的目的蛋白。我的目的蛋白是一個(gè)大小為45kDa，可以通過二硫鍵形成反向平行二聚體(antiparallel homodimer)的糖蛋白，經(jīng)過純化，我通過一個(gè)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)(cell proliferation assay)檢測(cè)了其活性，結(jié)果表明表達(dá)出來的蛋白在體外有完全的活性。并且我也在體外利用受體分析了蛋白結(jié)合活性，與對(duì)照(通過大腸桿菌和Bacular細(xì)胞未帶tag的蛋白)相比，his-tag有一點(diǎn)副作用。

伊可麗：由于在搖瓶培養(yǎng)中巴斯德畢赤酵母表達(dá)外源蛋白的水平往往不能準(zhǔn)確地反映罐發(fā)酵中的表達(dá)情況，使之成為令人頭痛的問題。主要原因是在搖瓶培養(yǎng)中，培養(yǎng)液的pH值無法控制，培養(yǎng)物通氣不充分及無法控制添加碳源的最適速率。但是為了避免對(duì)每一個(gè)表達(dá)菌株進(jìn)行繁瑣的發(fā)酵罐培養(yǎng)條件的實(shí)驗(yàn)，仍需摸索表達(dá)菌株的搖瓶培養(yǎng)條件，使其產(chǎn)物的表達(dá)量與預(yù)期的發(fā)酵罐培養(yǎng)結(jié)果相近。

總而言之，EasySelect系統(tǒng)是一個(gè)便于操作的酵母表達(dá)系統(tǒng)，我已經(jīng)使用這一系統(tǒng)表達(dá)過15個(gè)類似物了，每一個(gè)我都獲得了超過1mg/1升培養(yǎng)液的純化蛋白。

第三篇：酵母雙雜交技術(shù)研究進(jìn)展

酵母雙雜交技術(shù)研究進(jìn)展

提 要 酵母雙雜交技術(shù)是一種有效的真核活細(xì)胞內(nèi)研究方法，在蛋白質(zhì)相互作用的研究方面得到了廣泛的應(yīng)用并取得了許多有價(jià)值的重要發(fā)現(xiàn)。作為一個(gè)完整的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，它自建立以來經(jīng)過了不斷的改進(jìn)與完善，不僅進(jìn)一步提高了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性與精確性，而且在此基礎(chǔ)上又發(fā)展了反向雙雜交，三雜交及核外雙雜交等多項(xiàng)技術(shù)。這些都將對(duì)功能基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的研究起到促進(jìn)作用。

0 引言

隨著分子生物學(xué)研究尤其是人類基因組計(jì)劃的迅速發(fā)展，大量關(guān)于基因結(jié)構(gòu)的信息不斷涌現(xiàn)，對(duì)這些信息進(jìn)行系統(tǒng)研究以了解新基因功能的要求也日益迫切。這不僅需要利用計(jì)算機(jī)進(jìn)行生物信息學(xué)的分析和預(yù)測(cè)，而且必須結(jié)合生物學(xué)實(shí)驗(yàn)獲取證據(jù)。為適應(yīng)同時(shí)對(duì)多個(gè)基因或蛋白進(jìn)行研究的發(fā)展趨勢(shì)，已出現(xiàn)了很多新技術(shù)，如DNA微陣列技術(shù)（DNA micoarry）,基因表達(dá)的系列分析（SAGE）,肽質(zhì)譜分析法，蛋白雙向膠電泳技術(shù)及酵母雙雜交技術(shù)（Yeast Two-Hybrid System）等。其中酵母雙雜交技術(shù)以其簡(jiǎn)便，靈敏，高效以及能反映不同蛋白質(zhì)之間在活細(xì)胞內(nèi)的相互作用等特點(diǎn)在基因功能的研究中得到了廣泛的應(yīng)用。酵母雙雜交技術(shù)的基本原理

1989年，Song和Field建立了第一個(gè)基于酵母的細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)蛋白間相互作用的遺傳系統(tǒng)〔1〕。很多真核生物的位點(diǎn)特異轉(zhuǎn)錄激活因子通常具有兩個(gè)可分割開的結(jié)構(gòu)域，即DNA特異結(jié)合域（DNA-binding domain，BD）與轉(zhuǎn)錄激活域（Transcriptional activation domain，AD）。這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域各具功能，互不影響。但一個(gè)完整的激活特定基因表達(dá)的激活因子必須同時(shí)含有這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域,否則無法完成激活功能。不同來源激活因子的BD區(qū)與AD結(jié)合后則特異地激活被BD結(jié)合的基因表達(dá)。基于這個(gè)原理，可將兩個(gè)待測(cè)蛋白分別與這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域建成融合蛋白，并共表達(dá)于同一個(gè)酵母細(xì)胞內(nèi)。如果兩個(gè)待測(cè)蛋白間能發(fā)生相互作用，就會(huì)通過待測(cè)蛋白的橋梁作用使AD與BD形成一個(gè)完整的轉(zhuǎn)錄激活因子并激活相應(yīng)的報(bào)告基因表達(dá)。通過對(duì)報(bào)告基因表型的測(cè)定可以很容易地知道待測(cè)蛋白分子間是否發(fā)生了相互作用。

酵母雙雜交系統(tǒng)由三個(gè)部分組成：(1)與BD融合的蛋白表達(dá)載體，被表達(dá)的蛋白稱誘餌蛋白(bait)。(2)與AD融合的蛋白表達(dá)載體，被其表達(dá)的蛋白稱靶蛋白(prey)。(3)帶有一個(gè)或多個(gè)報(bào)告基因的宿主菌株。常用的報(bào)告基因有HIS3，URA3，LacZ和ADE2等。而菌株則具有相應(yīng)的缺陷型。雙雜交質(zhì)粒上分別帶有不同的抗性基因和營養(yǎng)標(biāo)記基因。這些有利于實(shí)驗(yàn)后期雜交質(zhì)粒的鑒定與分離。根據(jù)目前通用的系統(tǒng)中BD來源的不同主要分為GAL4系統(tǒng)和LexA系統(tǒng)。后者因其BD來源于原核生物，在真核生物內(nèi)缺少同源性，因此可以減少假陽性的出現(xiàn)。酵母雙雜交技術(shù)的應(yīng)用現(xiàn)狀

酵母雙雜交技術(shù)產(chǎn)生以來，它主要應(yīng)用在以下幾方面：(1）檢驗(yàn)一對(duì)功能已知蛋白間的相

互作用。(2）研究一對(duì)蛋白間發(fā)生相互作用所必需的結(jié)構(gòu)域。通常需對(duì)待測(cè)蛋白做點(diǎn)突變或缺失突變的處理。其結(jié)果若與結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究結(jié)合則可以極大地促進(jìn)后者的發(fā)展。(3)用已知功能的蛋白基因篩選雙雜交cDNA文庫，以研究蛋白質(zhì)之間相互作用的傳遞途徑。(4)分析新基因的生物學(xué)功能。即以功能未知的新基因去篩選文庫。然后根據(jù)釣到的已知基因的功能推測(cè)該新基因的功能。常見問題的解決與改進(jìn)

酵母雙雜交系統(tǒng)應(yīng)用中常遇到的問題一是假陽性較多，二是轉(zhuǎn)化效率偏低。所謂假陽性就是:在待研究的兩個(gè)蛋白間沒有發(fā)生相互作用的情況下,報(bào)告基因被激活。主要原因是由于BD融合誘餌蛋白有單獨(dú)激活作用,或者這種融合蛋白的激活作用被外來蛋白激活。另外AD融合靶蛋白如果有DNA的特異性結(jié)合,則也可單獨(dú)激活報(bào)告基因的表達(dá)。因此,為排除假陽性就需要作嚴(yán)格的對(duì)照試驗(yàn)。應(yīng)對(duì)誘餌和靶蛋白分別作單獨(dú)激活報(bào)告基因的鑒定。目前幾個(gè)公司推出的酵母雙雜系統(tǒng)都采用了多個(gè)報(bào)告基因,且每個(gè)報(bào)告基因的上游調(diào)控區(qū)各不相同,這可減少大量的假陽性。另外,報(bào)告基因通常整合到染色體上,可以使基因表達(dá)水平穩(wěn)定,消除了由于質(zhì)?？截悢?shù)變化引起基因表達(dá)水平波動(dòng)而造成的假陽性。即使根據(jù)嚴(yán)格的對(duì)照實(shí)驗(yàn)證明確實(shí)發(fā)生了蛋白間的相互作用，還應(yīng)對(duì)以下方面進(jìn)行分析：

(1)這種相互作用是否會(huì)在細(xì)胞內(nèi)自然發(fā)生,即這一對(duì)蛋白在細(xì)胞的正常生命活動(dòng)中是否會(huì)在同一時(shí)間表達(dá)且定位在同一區(qū)域。

（2)某些蛋白如是依賴于遍在蛋白的蛋白酶解途徑的成員,它們具有普遍的蛋白間的相互作用的能力。

（3)一些實(shí)際上沒有任何相互作用的但有相同的模體(motif)如兩個(gè)親a-螺旋的蛋白質(zhì)間可以發(fā)生相互作用。十年來,酵母雙雜交技術(shù)一直在消除假陽性方面不斷改進(jìn),并且已取得較好的效果。

在酵母雙雜交的應(yīng)用中有時(shí)也會(huì)遇到假陰性現(xiàn)象。所謂假陰性，即兩個(gè)蛋白本應(yīng)發(fā)生相互作用,但報(bào)告基因不表達(dá)或表達(dá)程度甚低以至于檢測(cè)不出來。造成假陰性的原因主要有兩 方面：一是融合蛋白的表達(dá)對(duì)細(xì)胞有毒性。這時(shí)應(yīng)該選擇敏感性低的菌株或拷貝數(shù)低的載體。二是蛋白間的相互作用較弱，應(yīng)選擇高敏感的菌株及多拷貝載體。目前假陰性現(xiàn)象雖不是實(shí)驗(yàn)中的主要問題,但也應(yīng)予以重視。

轉(zhuǎn)化效率是酵母雙雜交文庫篩選時(shí)成敗的關(guān)鍵之一，特別是對(duì)低豐度cDNA庫進(jìn)行篩選時(shí)，必須提高轉(zhuǎn)化效率。轉(zhuǎn)化時(shí)可采用共轉(zhuǎn)化或依次轉(zhuǎn)化，相比之下共轉(zhuǎn)化省時(shí)省力。更重要的是如果單獨(dú)轉(zhuǎn)化會(huì)發(fā)生融合表達(dá)蛋白對(duì)酵母細(xì)胞的毒性時(shí),共轉(zhuǎn)化則可以減弱或消除這種毒性。一種更有效的方法是將誘餌蛋白載體與靶蛋白載體分別轉(zhuǎn)入不同接合型的單倍體酵母中,通過兩種接合型單倍體細(xì)胞的雜交將誘餌蛋白與靶蛋白帶入同一個(gè)二倍體細(xì)胞。目前很多機(jī)構(gòu)建立了大量的cDNA文庫和基因組文庫，但這些文庫大多無法直接用于雙雜交系統(tǒng)的篩選。而文庫的質(zhì)量對(duì)于轉(zhuǎn)化和篩選又非常關(guān)鍵。因此，大量構(gòu)建適用于酵母雙雜交的文庫非常必要。現(xiàn)已出現(xiàn)一種采用體內(nèi)重組技術(shù)來達(dá)到這個(gè)目的的方法。酵母雙雜交技術(shù)的新發(fā)展

酵母雙雜交技術(shù)在應(yīng)用中發(fā)揮了巨大的作用，但人們也注意到了它有一定的局限性。為此發(fā)展了多種適應(yīng)不同目的需要的改型的雙雜交技術(shù)。

反向雙雜交技術(shù) 在研究中檢測(cè)并鑒定出那些能阻斷兩個(gè)蛋白間相互作用的因素有重要意義。在研究那些能使相互作用被阻斷的因素(如尋找哪些結(jié)構(gòu)域上發(fā)生突變可使相互作用中

斷或那些分子可以阻斷相互作用)時(shí)，傳統(tǒng)的雙雜交技術(shù)有較大的局限性。因此，反向雙雜交系統(tǒng)(Reverse Two-Hybrid System)應(yīng)運(yùn)而生。這項(xiàng)技術(shù)的特點(diǎn)是采取了反選擇篩選策略。根據(jù)反選擇設(shè)計(jì)的不同，大致可以分為兩類。一類是用便于反選擇的URA3或CYH2基因作為報(bào)告基因。URA3基因編碼尿嘧啶合成途徑中的重要酶：乳清酸核苷5’-磷酸脫羧酶，它能把5’-氟乳清酸（5’-FOA）轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞毒性物質(zhì)，使細(xì)胞無法生長。反之，在能生長的細(xì)胞中，外界因素已使蛋白間的相互作用不能發(fā)生，而我們想知道的正是這些因素。因此，只要對(duì)存活的克隆進(jìn)行檢測(cè)就可以得到結(jié)果。Vidal等人用這種技術(shù)發(fā)現(xiàn)了影響轉(zhuǎn)錄因子E2F1中與DP1相互作用必需區(qū)內(nèi)的點(diǎn)突變。另一類是將常規(guī)報(bào)告基因(如HIS3)置于大腸桿菌轉(zhuǎn)座子Tn10編碼的tet-抑制因子(TetR)/操縱基因控制之下。待測(cè)蛋白之間發(fā)生相互作用后首先激活tet-R基因表達(dá)抑制因子TetR,TetR結(jié)合到tet操縱基因后就抑制了報(bào)告基因的表達(dá)，結(jié)果轉(zhuǎn)化子不能生長。只有當(dāng)待測(cè)蛋白之間的相互作用被某種因素所阻斷而無法激活tet-R基因時(shí)，報(bào)告基因才能擺脫tet操縱基因的控制而表達(dá)，使轉(zhuǎn)化子獲得在選擇培養(yǎng)基上生長的能力。Shih 等人利用這種方法鑒定出cAMP-應(yīng)答元件結(jié)合蛋白(cAMP-response element binding protein,CREB)中磷酸化位點(diǎn)的Ser133突變會(huì)阻斷其與輔助激活因子(CREB結(jié)合蛋白)的相互作用。

三雜交技術(shù) 在許多細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞過程中，兩個(gè)蛋白間的相互作用常涉及到其它的大分子。如蛋白，激酶，RNA,多肽及其它大分子。在研究這些大分子對(duì)蛋白間相互作用的影響過程中發(fā)展了一種新的技術(shù)系統(tǒng)——三雜交系統(tǒng)(Three-Hybrid System)，其本質(zhì)與雙雜交是相同的，只是需通過第三個(gè)分子的介導(dǎo)把兩個(gè)雜交蛋白帶到一起。例如小配體三雜交系統(tǒng)(Small Ligand Three-Hybrid System)是利用可以滲透的二聚體化學(xué)誘導(dǎo)物(Chemical Inducers of Dimerization,CIDs)作橋梁，將AD和BD融合蛋白連接到一起，激活報(bào)道基因的表達(dá)。研究較多的是免疫抑制劑FK506。Belshaw等將FK506與環(huán)孢菌素A(Cyclosporin

A)構(gòu)建成異源二聚體，它能把分別與FK506和環(huán)孢菌素A有相互作用的AD和BD融合蛋白拉倒一起，激活報(bào)告基因。Licitra將FK506與地米塞松(dexamethasone)通過共價(jià)鍵連接成二聚體。通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了FK506與蛋白FKBP-12間的特異性相互作用，表明用這種方法鑒定蛋白與小分子間的相互作用是切實(shí)可行的。RNA與蛋白之間的相互作用是許多細(xì)胞生命活動(dòng)的基礎(chǔ)，例如mRNA的翻譯，早期發(fā)育以及RNA病毒的感染等。然而可用于這方面研究的簡(jiǎn)便方法卻很少。RNA三雜交系統(tǒng)(RNA Three-Hybrid System)的建立為分析RNA與蛋白之間的相互作用提供了有效的手段。這個(gè)系統(tǒng)主要是由一個(gè)RNA分子和兩個(gè)都能結(jié)合該RNA的蛋白質(zhì)組成。此RNA的一部分與一個(gè)已知蛋白結(jié)合后就可利用它的另一部分去篩選新的RNA結(jié)合蛋白。因此這種技術(shù)既可檢測(cè)由RNA介導(dǎo)的兩個(gè)蛋白質(zhì)之間的相互作用，也可篩選鑒定新的蛋白結(jié)合RNA。Putz等把HIV-1病毒Rev蛋白的突變體RevM10與Gal4 DB域融合作為誘餌蛋白，利用該RevM10蛋白能識(shí)別并結(jié)合其靶RNA中Rev蛋白反應(yīng)元件(Rev responsive element,RRE)的作用去篩選同樣也能與此RNA結(jié)合并已與Gal4 AD域融合的未知蛋白。根據(jù)同樣的原理，如將一個(gè)已知RNA與RRE融合形成雜合RNA分子并配以RevM10-Gal4 DB融合蛋白作為誘餌，便可用于篩選該RNA結(jié)合蛋白的cDNA克隆。SenGupta 等利用RNA噬菌體衣殼蛋白能識(shí)別結(jié)合其基因組內(nèi)一種21核苷酸的RNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)的特性，將RNA噬菌體衣殼蛋白與Lex DB域融合，構(gòu)建成可用于尋找體內(nèi)的RNA結(jié)合蛋白的酵母三雜交系統(tǒng)。

核外雙雜交技術(shù) 在傳統(tǒng)的酵母雙雜交系統(tǒng)中，蛋白之間的相互作用是在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)生的。因此,它不能檢測(cè)某些在核外蛋白之間的相互作用。為了克服這種局限性，近年來有人建立了核外雙雜交技術(shù)。其中SRS 和USPS就是這種技術(shù)的兩個(gè)代表。SRS也稱Sos蛋白召集系統(tǒng)(Sos Recruitment System)。它的基本原理是分別將待測(cè)蛋白X與哺乳動(dòng)物細(xì)胞的一種鳥苷交換因子(EGF)Sos蛋白融合；將Y蛋白與錨定在酵母細(xì)胞膜上的Src肉豆寇烯化信

號(hào)蛋白融合，并使它們共表達(dá)于一個(gè)cdc25-2基因溫度敏感型突變的酵母菌株內(nèi)。由于該菌株中cdc25-2基因編碼的EGF蛋白在36℃條件下不能激活細(xì)胞膜上的Ras蛋白，Ras途徑不通。所以細(xì)胞無法在36℃條件下生存。但如果待測(cè)蛋白X與Y之間發(fā)生相互作用就能把Sos蛋白帶到細(xì)胞膜上并激活附近的Ras蛋白，從而打通Ras途徑，使該菌株獲得在36℃條件下生存的能力。Aronheim等用此技術(shù)鑒別出了一些新的c-Jun相互作用蛋白，并分離到了一個(gè)AP-1抑制因子JDP2。USPS也稱為基于遍在蛋白的裂解蛋白感受器(Ubiquitin-based Split Protein Sensor)。它的設(shè)計(jì)是根據(jù)這樣一個(gè)事實(shí)，即真核細(xì)胞中遍在蛋白與某一蛋白之間新生成的融合會(huì)被遍在蛋白特異的蛋白酶(UBPs)迅速切開，但這種切割只有當(dāng)遍在蛋白正確折疊時(shí)才會(huì)發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，遍在蛋白基因的N端和C端這兩部分即使分離，只要共表達(dá)與同一個(gè)細(xì)胞內(nèi)，它們?nèi)阅苷_折疊。將待測(cè)蛋白X與帶有點(diǎn)突變的遍在蛋白N端片段融合，將待測(cè)蛋白Y與下游接有報(bào)告蛋白的正常遍在蛋白C端片段融合，并使它們共表達(dá)與同一個(gè)細(xì)胞內(nèi)。因遍在蛋白N端片段內(nèi)含有點(diǎn)突變，它與C端片段之間不能自然形成正確的折疊。只有當(dāng)?shù)鞍譞和Y之間發(fā)生相互作用時(shí)才能克服點(diǎn)突變的影響，使遍在蛋白的兩端形成正確折疊，從而引來UBPs切除與C端片段連接的報(bào)告蛋白。此技術(shù)建立之初是通過Western blot檢測(cè)有無被切下的報(bào)告蛋白來判斷待測(cè)蛋白之間是否發(fā)生了相互作用的，所以操作比較繁瑣，不便于推廣。最近有人對(duì)它作了改進(jìn)，以一種融合的轉(zhuǎn)錄激活因子PLV作為報(bào)告蛋白。PLV一旦被從遍在蛋白C端片段上切下，它就會(huì)進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)激活特定的報(bào)告基因，如：LacZ 和HIS3等。這樣就可以根據(jù)轉(zhuǎn)化細(xì)胞是否生長及顯色來判斷待測(cè)蛋白之間有無相互作用。因此極大地簡(jiǎn)化了操作步驟，提高了篩選效率。酵母雙雜交技術(shù)發(fā)展與應(yīng)用的趨勢(shì)

在后基因組時(shí)代更具意義且更能發(fā)揮酵母雙雜交技術(shù)的領(lǐng)域是研究生命活動(dòng)中的網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)。第一個(gè)具有開拓性的工作是Bartel利用酵母雙雜交技術(shù)建立了一個(gè)T7-噬菌體的網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)圖(linkage-map)。Fromont-Racine等對(duì)篩選到的陽性克隆進(jìn)行鑒定測(cè)序，并將它們分為5類，然后對(duì)其中的四類(非編碼序列除外)通過15輪的篩選與分析，繪制出一張綜合了酵母蛋白相互作用的全局性信息圖。這是以往的實(shí)驗(yàn)所難以獲得的。

為適應(yīng)功能基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控研究的需要，CLONTECH公司在Merck-Washington大學(xué)的EST項(xiàng)目研究成果基礎(chǔ)上，采用了與傳統(tǒng)建庫方式完全不同的細(xì)胞內(nèi)同源重組方法，以高通量規(guī)模構(gòu)建了一種陣列模式的酵母雙雜交cDNA文庫。它主要有以下特點(diǎn)：

(1)來源于多種組織器官和細(xì)胞系，因此含有幾乎所有基因的cDNA；

（2）所含各種cDNA的豐度趨于平衡；

（3)含有較長的插入序列，但不是全長cDNA序列。

這樣既避免了5’非編碼區(qū)可能存在的終止密碼阻礙融合蛋白的翻譯，又保證了表達(dá)出的蛋白構(gòu)象接近于天然。這種建庫方法不僅減少了工作量，而且在雙雜交中新發(fā)現(xiàn)的相互作用蛋白種類也明顯增多。

最后，有必要指出的是，酵母雙雜交技術(shù)必須與其它技術(shù)結(jié)合才能有利于對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果作出更為完整和準(zhǔn)確的判斷。

胡文峰

2007040380106

第四篇：畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)簡(jiǎn)介

巴斯德畢赤酵母及啟動(dòng)子

1.1 畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)簡(jiǎn)介

隨著蛋白異源表達(dá)的飛速發(fā)展，越來越多的表達(dá)系統(tǒng)被建立并得到應(yīng)用。酵母作為單細(xì)胞真核生物，因具有比較完備的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制和對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的加工修飾能力，仍表現(xiàn)出不可比擬的優(yōu)勢(shì)。以甲醇營養(yǎng)型酵母（Methylotrophic yeast）-畢赤酵母為代表的第二代酵母表達(dá)系統(tǒng)，是近年來被公認(rèn)的最有效的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)之一，已有多種外源蛋白在該宿主系統(tǒng)中獲得了成功表達(dá)[1]。作為生產(chǎn)外源蛋白的重要宿主菌，依靠其各種不同功能的表達(dá)載體，已經(jīng)得到廣泛的應(yīng)用。表達(dá)的蛋白質(zhì)包括酶、膜蛋白、抗原、抗體和調(diào)節(jié)蛋白等[2,3]。

畢赤酵母（Pichia pastoris）表達(dá)系統(tǒng)是近年來發(fā)展迅速、應(yīng)用廣泛的一種真表達(dá)系統(tǒng)。它是甲醇營養(yǎng)型酵母菌，有兩個(gè)乙醇氧化酶（alcohol oxidase，Aox）碼基因AOX1和AOX2，兩者序列相似，AOX1基因嚴(yán)格受甲醇誘導(dǎo)和調(diào)控。當(dāng)甲醇為唯一碳源時(shí)，AOX1啟動(dòng)子可被甲醇誘導(dǎo)，啟動(dòng)乙醇氧化酶的表達(dá)，從而用甲醇進(jìn)行代謝[4]。含AOX1啟動(dòng)子的質(zhì)?？捎脕泶龠M(jìn)編碼外源蛋白的目的因的表達(dá)。

隨著Invitrogen公司開發(fā)的一系列畢赤酵母表達(dá)試劑盒的應(yīng)用，目前用該統(tǒng)已成功表達(dá)出了數(shù)以千計(jì)的來自細(xì)菌、真菌、原生動(dòng)物、植物、無脊椎動(dòng)物、包括人在內(nèi)的脊椎動(dòng)物以及病毒等的具有生物學(xué)功能的外源蛋白或蛋白結(jié)構(gòu)[5,6]。1.1.1 P.Pastoris表達(dá)載體及其元件

由于畢赤酵母沒有穩(wěn)定的附加質(zhì)粒，表達(dá)載體需與宿主染色體發(fā)生同源重組，外源基因表達(dá)框架整合于染色體中以實(shí)現(xiàn)外源基因的表達(dá)整合表達(dá)的優(yōu)點(diǎn)在于保持外源基因穩(wěn)定性并可產(chǎn)生多拷貝基因。典型的畢赤氏酵母表達(dá)載體含有醇氧化酶基因的調(diào)控序列，主要的結(jié)構(gòu)包括：5′AOX1啟動(dòng)子片段、多克隆位點(diǎn)(MCS)、轉(zhuǎn)錄終止和 polyA形成基因序列(TT)、篩選標(biāo)記(His4或 Zeocin)、3′AOX1基因片段，作為一個(gè)能在大腸桿菌中繁殖擴(kuò)增的穿梭質(zhì)粒，它還有部分pBR322質(zhì)粒或COLE1序列。如果是分泌型表達(dá)載體，在多克隆位點(diǎn)的前面，外源基因的5′端和啟動(dòng)子的3′端之間插人了分泌作用的信號(hào)肽序列。在這個(gè)分泌信號(hào)的引導(dǎo)下，外源蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體中經(jīng)修飾和加工后能夠由胞內(nèi)轉(zhuǎn)移至胞外，將成熟的蛋白質(zhì)分泌到細(xì)胞外。目前所采用的表達(dá)體均為穿梭質(zhì)粒，先在大腸桿菌保存、復(fù)制、擴(kuò)增，然后線性化后被導(dǎo)入宿主母細(xì)胞。

常用的表達(dá)載體包括胞內(nèi)表達(dá)載體及分泌表達(dá)載體如下表：

表1 常用表達(dá)載體及其選擇標(biāo)記

表達(dá)方式 載體名稱 pPICZA,B,C

胞內(nèi)表達(dá) pPIC6A,B,C PGAPZA,B,C

啟動(dòng)子 AOX1 AOX1 GAP

選擇標(biāo)記 Zeocin blasticidin Zeocin pPIC3.5K PAO815 PFLD pPICZαA,B,C pPIC6αA,B,C 分泌表達(dá) PGAPZαA,B,C pPIC9k pFLDα

AOX1 AOX1 FLD AOX1 AOX1 GAP AOX1 FLD

His4 kanmycin ampicillin His4 ampicillin Zeocin ampicillin Zeocin blasticidin Zeocin

His4 kanmycin ampicillin Zeocin ampicillin

1.1.2 畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)

自從1987年Cregg等首次用巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）作為宿主表達(dá)外源蛋白以來,作為一種新的高效的表達(dá)系統(tǒng)，畢赤酵母越來越引起人們的重視，到1995年，已有四十多種外源蛋白在該宿主菌中獲得表達(dá)。而最近幾年每年報(bào)道的在畢赤酵母中表達(dá)的外源基因就有幾十種，且一年比一年多，它除了具有原核生物易于培養(yǎng)、繁殖快、便于基因工程操作和高密度發(fā)酵等特性之外，同釀酒酵母等傳統(tǒng)真核表達(dá)系統(tǒng)相比，它還具有以下的優(yōu)勢(shì):（1）含有特有的強(qiáng)有力的AOX（醇氧化酶基因）啟動(dòng)子，用甲醇可嚴(yán)格地調(diào)控外源基因的表達(dá)；

（2）培養(yǎng)成本低，產(chǎn)物易分離。畢赤酵母所用發(fā)酵培養(yǎng)基十分廉價(jià)，一般碳源為甘油或葡萄糖及甲醇，其余為無機(jī)鹽，培養(yǎng)基中不含蛋白，有利于下游產(chǎn)品分離純化；而釀酒酵母所用誘導(dǎo)物一般為價(jià)格較高的半乳糖；

（3）外源蛋白基因遺傳穩(wěn)定。外源基因能以高拷貝數(shù)整合到畢赤酵母基因組中，不易丟失并能夠到高表達(dá)菌株；

（4）作為真核表達(dá)系統(tǒng)，畢赤酵母具有真核生物的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，具有糖基化、脂肪?；?、蛋白磷酸化等翻譯后修飾加工功能。

1.2

AOX啟動(dòng)子序列分析現(xiàn)狀

啟動(dòng)子是基因表達(dá)調(diào)控的順式元件，也是基因工程表達(dá)載體的一個(gè)重要元件。啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)錄水平上的重要作用，不僅決定了基因的表達(dá)水平，也決定了基因表達(dá)的時(shí)空順序[7,8]，可以說啟動(dòng)子活性的高低在很大程度上影響著基因表達(dá)最終產(chǎn)物的表達(dá)水平。所以找到一個(gè)轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)功能較好的啟動(dòng)子，對(duì)于外源蛋白高效表達(dá)的研究具有重要的意義。目前，已有不少的啟動(dòng)子被克隆和功能鑒定[9]。

新型疫苗主要包括亞單位疫苗、基因缺失疫苗、核算疫苗、重組活載體疫苗等，盡管大多數(shù)被認(rèn)為較為安全，但往往都需要免疫刺激性強(qiáng)的佐劑來提高免疫效果。菌蛻疫苗可通過發(fā)酵大量生產(chǎn)且無需加入佐劑即可獲得堅(jiān)強(qiáng)的免疫效果。

目前，畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中較常用的表達(dá)載體有兩類[10]：種是分泌型表達(dá)載體(如pPIC9K)，另一種是組成型表達(dá)載體(如pGAPZB)。前者(以pPIC9K為例)含有的醇氧化酶啟動(dòng)子pAOX1，可以在甲醇的誘導(dǎo)下高效表達(dá)。該載體自身攜帶有α 分泌信號(hào)肽，可以將外源蛋白直接分泌到胞外。后者(以pGAPZB 為例)含有三磷酸甘油醛脫氫酶基因啟動(dòng)子pGAP，可以在多種碳源如葡萄糖、甘油、甲醇或油酸條件下表達(dá)外源蛋白，且不需添加誘導(dǎo)物[11]。

在啟動(dòng)子功能的研究中，多數(shù)是利用報(bào)告基因的表達(dá)量來達(dá)到功能研究的目的，常用的報(bào)告基因有綠色熒光蛋白GFP(green fluorescent protein)、紅色熒光蛋白R(shí)FP(red fluorescent protein)β-葡糖醛酸糖苷酶GUS(β-glucuronidase)和氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶CAT(chloramphenicolacetyltransferase)等[12,13]。在前期的工作中，克隆了啟動(dòng)子pScgpd，并在巴斯德畢赤酵母中研究了AOX1 啟動(dòng)子的功能[14]。實(shí)驗(yàn)以人血清白蛋白(HSA）作為報(bào)告基因，在Pichia pastoris GS115中表達(dá)。

到目前為止，利用AOX啟動(dòng)子表達(dá)的蛋白有很多，例如：在AOX1(醇氧化酶)啟動(dòng)子調(diào)控下，類似天然抗菌肽大小的magainin 及cecA-mil 蛋白獲得分泌表達(dá)[15]；人前列腺特異性抗原的表達(dá)[16]；重組木糖異構(gòu)酶的分泌和表達(dá)[17]；人骨唾液酸蛋白的表達(dá)等[18]。

第五篇：數(shù)據(jù)機(jī)房供電概述及系統(tǒng)設(shè)計(jì)

機(jī)房供電概述及系統(tǒng)設(shè)計(jì)

（一）機(jī)房供電概述

1.供配電系統(tǒng)

供配電是數(shù)據(jù)中心機(jī)房的生命線，這句話一點(diǎn)也不夸張，因?yàn)殡x開了電我們的機(jī)房是連一分鐘也運(yùn)行不了的，因此要建一個(gè)好的機(jī)房，首先要將供配電解決好。一般要求主要開關(guān)設(shè)備應(yīng)該被設(shè)計(jì)成適合增容、維護(hù)和冗余，并提供雙倍的或隔離的冗余配置。設(shè)計(jì)時(shí)應(yīng)該考慮到開關(guān)裝置、總線或斷路器維護(hù)的方便性。瞬時(shí)電壓浪涌抑制(TVSS)應(yīng)該被安裝在電力分配系統(tǒng)的每一級(jí)上，并且采用適當(dāng)?shù)囊?guī)格，以便能夠抑制可能發(fā)生的瞬時(shí)的能量。

不同類別機(jī)房對(duì)電源的要求：

A類機(jī)房：停電后會(huì)產(chǎn)生重大損失和社會(huì)影響，要求建立不停電電源系統(tǒng)。

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B類機(jī)房：停電后會(huì)產(chǎn)生一定損失和社會(huì)影響，要求建立備用電源系統(tǒng)。

C類機(jī)房：停電后不會(huì)產(chǎn)生大的隕失和社會(huì)影響，可按一般用戶配置。

2.市電輸變電系統(tǒng)

對(duì)于一級(jí)負(fù)荷機(jī)房應(yīng)該有從不同變電站供給的雙路供電，加上柴油發(fā)電機(jī)，通過應(yīng)急電源柜切換后供給機(jī)房內(nèi)的UPS和精密空調(diào)機(jī)組，ATS切換最好做在機(jī)房配電系統(tǒng)就近，切換后以最短距離輸送給機(jī)房設(shè)備。備用發(fā)電機(jī)系統(tǒng)是至關(guān)重要的一個(gè)因素。即便其中有一個(gè)故障時(shí)，也能夠直接地向計(jì)算機(jī)和其它設(shè)備提供一個(gè)理想質(zhì)量和容量的電力供應(yīng)。發(fā)電機(jī)的設(shè)計(jì)應(yīng)能夠處理UPS系統(tǒng)或電腦設(shè)備負(fù)荷的諧波電流。備用發(fā)電機(jī)應(yīng)該提供備用電源給所有的冷卻設(shè)備，避免負(fù)載設(shè)備溫度上升以及停止運(yùn)行。如果發(fā)電機(jī)不支持這些系統(tǒng)，它們所帶來的益處就顯得很有限。在自動(dòng)控制發(fā)生故障時(shí)，發(fā)電機(jī)應(yīng)該能夠采用手動(dòng)控制。應(yīng)該給每一個(gè)發(fā)電機(jī)輸出提供瞬時(shí)電壓浪涌抑制(TVSS)裝置。

發(fā)電機(jī)燃料應(yīng)該是柴油，這樣啟動(dòng)比較快。考慮現(xiàn)場(chǎng)儲(chǔ)藏量的要求，通常需要保證4小時(shí)到60天。并且需要給所有燃料儲(chǔ)藏系統(tǒng)提供一個(gè)遠(yuǎn)程的燃料監(jiān)控和警報(bào)系統(tǒng)。由于微生物增長是柴油燃料最常見的故障，應(yīng)設(shè)計(jì)有便攜的或安裝固定的清潔系統(tǒng)。在寒冷的季節(jié)，2 / 15

需要考慮給燃料系統(tǒng)加熱或循環(huán)，避免柴油燃料膠凝。當(dāng)確定好現(xiàn)場(chǎng)燃料儲(chǔ)藏系統(tǒng)的容量時(shí)，同時(shí)需要考慮燃料供貨商在緊急情況時(shí)的反應(yīng)時(shí)間。

在發(fā)電機(jī)周圍提供UPS照明電源或單獨(dú)的電池，在發(fā)電機(jī)和裝置同時(shí)發(fā)生故障時(shí)提供照明。同樣，在發(fā)電機(jī)周圍也應(yīng)該提供UPS供電插座。

在組件的分別測(cè)試之外，備用發(fā)電機(jī)系統(tǒng)、UPS系統(tǒng)和自動(dòng)轉(zhuǎn)換開關(guān)應(yīng)該作為一個(gè)系統(tǒng)一起測(cè)試。在冗余系統(tǒng)測(cè)試單個(gè)組件的故障時(shí)，冗余系統(tǒng)是為在一個(gè)組件發(fā)生故障時(shí)能夠繼續(xù)起作用而設(shè)計(jì)的。此外，一旦數(shù)據(jù)中心開始運(yùn)行，應(yīng)該定期測(cè)試系統(tǒng)，確保各個(gè)組件能夠繼續(xù)正常地發(fā)揮作用。

3.機(jī)房用電的配置

配電必須充分考慮到今后的發(fā)展余量。如lBMP550A服務(wù)器，每臺(tái)高配功率為lKW，一個(gè)機(jī)柜若裝6臺(tái)就是6KW，假如預(yù)期機(jī)房在今后會(huì)裝到最多四十個(gè)機(jī)柜那就是240KW；UPS一般可按照設(shè)備容量的1.3倍計(jì)算，就是312KVA，再加上適當(dāng)?shù)挠嗔浚x用3臺(tái)200KVAUPS冗余供電是一種較為理想的方案。

UPS的供電總?cè)萘?臺(tái)200KVA冗余UPS可少算一臺(tái)400KVA，精密空調(diào)單臺(tái)的實(shí)際耗電功率為20KW，假如配置10臺(tái)精密空調(diào)的話，總功率為10*20引200KW，機(jī)房UPS、空調(diào)總功率為：400+200=600KW，3 / 15

機(jī)房供配電要考慮到日后的發(fā)展余量等因素，一般可按照UPS與空調(diào)容量總和的150%配置，就是600*1.5=900KW，另外再加上新風(fēng)機(jī)4KW、照明等的用電算8KW，則機(jī)房總的配電容量應(yīng)為912KW其中由應(yīng)急柜供電的為UPS和精密空調(diào)。

4.作為國家A類標(biāo)準(zhǔn)的計(jì)算機(jī)機(jī)房都要求具備雙路市電電源接入供電，但雙路電源的切換開關(guān)（ATS0最好要安裝在UPS輸入的附近，這樣接法相比在遠(yuǎn)端的配電柜切換來，可以消除從配電問到UPS之間動(dòng)力線路，開關(guān)等引起的故障）。機(jī)房供配電的安全可靠性牽涉的問題很多，從市電輸入到UPS，從UPS輸出到各級(jí)ATS、各級(jí)開關(guān)然后到輸出端的各個(gè)接線盒及插座，每一個(gè)環(huán)節(jié)都十分重要，特別是處于供配電上游的UPS輸入總開關(guān)和輸出總開關(guān)以及ATS。其中任何一個(gè)一旦出現(xiàn)問題，都會(huì)引發(fā)嚴(yán)重的停電事故，后果將不堪設(shè)想，因此其配置問題必須慎之又慎，另外對(duì)于動(dòng)力電纜的配置問題也很值得研究，由于機(jī)房內(nèi)大量非線性負(fù)載的存在，使得諧波電流很大，所以一般機(jī)房剛建好時(shí)零地電壓都很低，而設(shè)備裝滿時(shí)零地電壓都會(huì)大大增加?我們的有效辦法之一就是降低零線的電阻，以前我們的零線、地線的線徑一般都比相線要，小很多，但實(shí)踐中三相配電線路內(nèi)，相線上的3的整數(shù)倍諧波在中性線上會(huì)疊加，使中性線的電流值可能超過相線上的電流。但是從隆低諧波電流和零地電壓的目標(biāo)出發(fā)，我們應(yīng)該將零線和地線的線徑選得與相線相同甚至更粗一點(diǎn)。

（二）負(fù)荷等級(jí)和額定容量

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依據(jù)計(jì)算機(jī)的用途和性質(zhì)以及負(fù)荷分級(jí)的規(guī)定，采取相應(yīng)的供電技術(shù):對(duì)于一級(jí)負(fù)荷采用一類供電，重要機(jī)房供電屬于一級(jí)負(fù)荷，按一級(jí)負(fù)荷的供電要求，必須保證兩個(gè)以上獨(dú)立的電源點(diǎn)供電，采用兩條專用干線引進(jìn)，兩路獨(dú)立電源在末端互投，建立不停電系統(tǒng)，而且要保證供電的質(zhì)量;對(duì)于二級(jí)負(fù)荷采用二類供電，建立帶備用的供電系統(tǒng);對(duì)于三級(jí)負(fù)荷采用三類供電，按一般用戶供電考慮。

機(jī)房用電系統(tǒng)要求提供的電源額定容量一般以兩種方式給出:

(1)確定機(jī)房用電系統(tǒng)的總功率大小或機(jī)房用電系統(tǒng)的總電流。這是選取電力設(shè)備、總斷路器、供電電纜、機(jī)房的總發(fā)熱量以及精密空調(diào)時(shí)都必需考慮的問題。通常供電總功率應(yīng)留有不少于25%的余量。

(2)確定各機(jī)柜、分機(jī)、設(shè)備等所要求的工作電流。這對(duì)設(shè)計(jì)計(jì)算機(jī)房的配電柜、選取合適的傳輸導(dǎo)線和分路開關(guān)也是必需的。針對(duì)電氣設(shè)備額定電流，在整定總斷路器和分路開關(guān)時(shí)要注意電氣設(shè)備的啟動(dòng)電流值。在進(jìn)行方案設(shè)計(jì)時(shí)，有些經(jīng)驗(yàn)數(shù)據(jù)可供估算時(shí)參考，如:l)UPS功率:主機(jī)房可按350W~400W/㎡計(jì)算;照明用電可按l5W~20W/㎡計(jì)算。

2)空調(diào)機(jī)電功率要根據(jù)機(jī)房制冷量考慮。主機(jī)房制冷量按400W/㎡計(jì)算，輔助機(jī)房制冷量按300W/m2計(jì)算，然后再根據(jù)電氣設(shè)備不同的效率和換算系數(shù)，確定空調(diào)系統(tǒng)用電負(fù)荷量。

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（三）防雷和接地

接地極的接地電阻，當(dāng)系統(tǒng)采用聯(lián)合接地時(shí)，R≤10?(北京地區(qū)可按0.5?考慮);當(dāng)采用單獨(dú)接地時(shí)，R≤4?。在總配電室要做總等電位連接，各樓層的智能化系統(tǒng)設(shè)備機(jī)房、樓層弱電間、樓層配電間的接地，采用局部等電位聯(lián)接。貫穿弱電豎井的接地干線，應(yīng)當(dāng)是鍍鋅扁鋼，截面尺寸不小于一40mm×4mm。

機(jī)房的重要設(shè)備和配電柜(箱)，必須按GB50057一1994(2000年版)，并安裝電涌保護(hù)器、做好等電位連接。

機(jī)房供電系統(tǒng)設(shè)計(jì)

機(jī)房電氣工程中，安全、可靠是機(jī)房供配電系統(tǒng)設(shè)計(jì)的關(guān)鍵出發(fā)點(diǎn)，由于機(jī)房的供配電系統(tǒng)、照明、設(shè)備防雷、機(jī)房接地、UPS不間斷電源等與一般的強(qiáng)電設(shè)計(jì)有所不同，又與弱電專業(yè)的十幾個(gè)子系統(tǒng)密切相關(guān)。因此，它們處于強(qiáng)、弱電專業(yè)設(shè)計(jì)分工的接合部。

機(jī)房在智能建筑中的重要性確定了安全、可靠是供配電系統(tǒng)設(shè)計(jì)的關(guān)鍵出發(fā)點(diǎn)。由于機(jī)房的供配電系統(tǒng)、照明、設(shè)備防雷、機(jī)房接地、UPS不間斷電源等與一般的強(qiáng)電設(shè)計(jì)有所不同，又與弱電專業(yè)的十幾個(gè)子系統(tǒng)密切相關(guān)。因此，它們處于強(qiáng)、弱電專業(yè)設(shè)計(jì)分工的接合部。有兩種專業(yè)技術(shù)規(guī)范在這些界面上，有些規(guī)定也不十分明確，帶來的問題是:機(jī)房各子系統(tǒng)的設(shè)計(jì)深度差距較大；主要弱電機(jī)房預(yù)留的位置不合適，面積過大或偏??；弱電豎井中遺漏接地干線和電源插座；

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UPS電源容量、支持時(shí)間長短不一；UPS電源供電方式是采用集中式還是分散式不能確定；各子系統(tǒng)的供電和接地方式不規(guī)范等。一部分設(shè)計(jì)文件中，還經(jīng)常發(fā)現(xiàn)有文字說明描述不清楚、系統(tǒng)圖和平面圖五花八門、圖形符號(hào)不按現(xiàn)行制圖，標(biāo)準(zhǔn)繪制等問題。

機(jī)房常用的供電方式不間斷電源(UPS)供電。由于采用了脈寬調(diào)頻技術(shù)、高效功率器件的成熟、微處理器的發(fā)展等因素，不間斷電源已經(jīng)成為計(jì)算機(jī)房供電的主要手段。不間斷電源最大的特點(diǎn)，在于不間斷性，而且能最大限度地提供穩(wěn)定電壓，隔離外電網(wǎng)的干擾。外電網(wǎng)一旦停電，UPS能在設(shè)備所允許的極短時(shí)間內(nèi)(微秒至毫秒級(jí))自動(dòng)從備用能源經(jīng)逆變器變換成電壓、頻率和相位都與原供電電源相同的電能繼續(xù)向計(jì)算機(jī)供電。或者平時(shí)由逆變器供電，只在逆變器發(fā)生故障時(shí)，由靜態(tài)電子開關(guān)自動(dòng)將計(jì)算機(jī)瞬時(shí)切換到外電網(wǎng)供電或切換到另一臺(tái)與之并聯(lián)的UPS上，實(shí)現(xiàn)不間斷供電。UPS提供的電源具有較高的電壓和頻率穩(wěn)定性，波形失真也較小，干擾更優(yōu)于外電網(wǎng)，是計(jì)算機(jī)系統(tǒng)最理想的供電方式。幾乎所有的重要計(jì)算機(jī)設(shè)備都采用UPS供電。

(一)電源布置和系統(tǒng)設(shè)計(jì)

設(shè)計(jì)和施工必須充分了解并掌握供電對(duì)象。充分搜集機(jī)房設(shè)備和系統(tǒng)的資料才能做好電源布置和系統(tǒng)設(shè)計(jì)，從而合理地滿足機(jī)房用電需要。

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機(jī)房應(yīng)設(shè)單獨(dú)電源管理間，用符合防火要求的隔墻與弱電設(shè)備隔離，避免電源管理間操聲、蓄電池酸堿液滲漏和電氣火災(zāi)等事故傳播到計(jì)算機(jī)設(shè)備機(jī)房內(nèi)。計(jì)算機(jī)設(shè)備機(jī)房與電源管理間中間設(shè)單扇朝電源管理間方向開啟的連通門，還可考慮設(shè)置玻璃觀察視窗。電源管理間應(yīng)做水泥地面，為防潮、防濕可砌高0.3~0.5m的水泥平臺(tái)擱置配電柜和UPS電源等。

UPS主供:主機(jī)設(shè)備、網(wǎng)絡(luò)設(shè)備、保安監(jiān)控設(shè)備、多媒體、消防、應(yīng)急照明等。

市電主供:空調(diào)設(shè)備、普通照明和給排風(fēng)、維修插座、一般動(dòng)力等。

(二)動(dòng)力供配電系統(tǒng)

由總配電柜饋出的動(dòng)力供配電系統(tǒng)采用50Hz交流電，380/220V三相五線電源，TN-S接地方式，零線和地線分開設(shè)置且零地線之間電壓小于lV。動(dòng)力配電柜、照明配電箱采用放射式配電直接配至各用電設(shè)備。

機(jī)房內(nèi)所有線纜須設(shè)計(jì)鋼制橋架、線槽或鋼管敷設(shè)。由于精密空調(diào)的供電電流大、負(fù)載動(dòng)態(tài)范圍寬，為防止干擾，應(yīng)考慮另選路徑單獨(dú)敷設(shè)電纜。

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動(dòng)力配電柜(箱)具有火警聯(lián)動(dòng)保護(hù)功能，出現(xiàn)火警時(shí)可與消防系統(tǒng)聯(lián)動(dòng)及時(shí)切斷電源，關(guān)閉防煙防火閥，并且在值班室安裝手動(dòng)電源切斷裝置。動(dòng)力柜、照明箱內(nèi)的開關(guān)和主要元器件采用進(jìn)口產(chǎn)品，并設(shè)置有效的防雷措施。有條件時(shí)，大型機(jī)房最好采用專用電力變壓器供電。

(三)UPS供配電系統(tǒng)

UPS供配電系統(tǒng)的供電范圍是計(jì)算機(jī)設(shè)備(主機(jī)和附屬設(shè)備)、通信設(shè)備、網(wǎng)絡(luò)設(shè)備、保安監(jiān)控設(shè)備、消防系統(tǒng)、應(yīng)急照明等。UPS輸出配電回路(每個(gè)配電控制開關(guān)為一個(gè)回路)需按機(jī)房內(nèi)設(shè)備要求設(shè)置，小型機(jī)/服務(wù)器、網(wǎng)絡(luò)核心交換機(jī)及重要路由器要由獨(dú)立雙回路供電，其他計(jì)算機(jī)設(shè)備可用一個(gè)回路帶3~4個(gè)插座，固定于地板下。UPS電源分別送到主機(jī)房配電柜(末端)既可靠，又方便使用。還應(yīng)該考慮為數(shù)據(jù)中心中關(guān)鍵的負(fù)載設(shè)備安裝電源分配單元(PDU)，這些設(shè)施是合并了幾個(gè)組件功能到一起的一個(gè)裝置，通常很小，比分開安裝幾個(gè)獨(dú)立的面板和變壓器更有效。如果機(jī)房細(xì)分為不同的房間或空間，每一個(gè)房間或空間是由它們各自獨(dú)立的緊急電源開關(guān)(EPO)所支持，那么這些空間應(yīng)該擁有自己獨(dú)立的水平分布區(qū)域。

電源分配單元(PDU)集成了獨(dú)立的變壓器、瞬時(shí)電壓浪涌抑制(TVSS)、輸出面板和電源控制的功能，并提供了更多的優(yōu)點(diǎn)。

一個(gè)典型的PDU包括以下組件。

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● 離線變壓器雙輸入斷路器應(yīng)被視為允許連接一個(gè)臨時(shí)接駁，允許維護(hù)或資源冉分布時(shí)不用關(guān)閉關(guān)鍵的負(fù)載。

● 變壓器:盡可能靠近負(fù)載以減少從地線到零線之間的共模噪聲，減少電壓源接地和信號(hào)源接地之間的差別。當(dāng)變壓器位于PDU裝置內(nèi)時(shí)，就達(dá)到了最近的位置。

● 瞬時(shí)電壓浪涌抑制(TVSS):當(dāng)導(dǎo)線長度盡可能的短時(shí)，最好低于2OOm皿，瞬時(shí)電壓浪涌抑制(TVSS)裝置的效率將大大地提高了。通過提供在同一個(gè)裝置中瞬時(shí)電壓浪涌抑制(TVSS)作為分配面板，可以提高效率。

● 分配面板:可以將面板與變壓器安裝在同一個(gè)機(jī)柜中或在需要更多面板的情況下，可以使用一個(gè)遠(yuǎn)程的電源面板。

● 計(jì)量、監(jiān)測(cè)、警報(bào)、和遠(yuǎn)程控制當(dāng)提供一個(gè)傳統(tǒng)的面板系統(tǒng)時(shí)，通常意味著大量的空間要求。

● 緊急電源關(guān)閉(EPO)控制。

單點(diǎn)接地總線應(yīng)該用電力分配單元(PDU)將電源分配到關(guān)鍵的負(fù)載上。在需要額外分支電路的地方，面板或PDU“sidecars”可以是次級(jí)反饋的。應(yīng)該提供兩個(gè)冗余PDU給每個(gè)機(jī)架供電，每一個(gè)PDU最好采用不同的UPS系統(tǒng)供電;提供給單相或三相計(jì)算機(jī)設(shè)備一個(gè)可以安裝在機(jī)架上的快速轉(zhuǎn)換開關(guān)或從每一個(gè)PDU饋給的靜態(tài)開關(guān)。選

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擇性地，可以提供給單線和三線設(shè)備，從分開的UPS系統(tǒng)饋給的雙饋給靜態(tài)開關(guān)式PDU，盡管這種安排提供稍微少一些的冗余和靈活性。應(yīng)該考慮用彩色的表示牌和饋給電纜來區(qū)別A和B分布，例如，所有的A側(cè)用白色，所有的B側(cè)用藍(lán)色。

一條電路不應(yīng)該服務(wù)多于一個(gè)機(jī)架，防止一條電路對(duì)多個(gè)機(jī)架產(chǎn)生電路故障。為了提供冗余，每一個(gè)機(jī)架和機(jī)柜應(yīng)該各自獨(dú)有的、兩個(gè)專用的、從兩個(gè)不同的電力分配單元(PDU)或供電面板來的16A、220V的電路。對(duì)于高密度的機(jī)架可能要求更高的安培容量，一些新服務(wù)器可能要求一個(gè)或多個(gè)、單相或三相插座，額定電流要求5OA或更高。每一個(gè)插座應(yīng)該用服務(wù)于它的PDU或電路號(hào)來標(biāo)識(shí)。

(四)配電設(shè)備的安裝和線路敷設(shè)問題

在機(jī)房設(shè)備布局確定的前提下，按照電氣設(shè)備用途和設(shè)計(jì)圖紙進(jìn)行設(shè)備安裝和線路敷設(shè)。

(1)設(shè)備安裝。機(jī)房配電柜、UPS電源柜落地安裝;動(dòng)力配電箱、照明配電箱底邊距地1.4m墻上暗裝;根據(jù)機(jī)房內(nèi)設(shè)備負(fù)荷容量和分布情況，機(jī)柜(箱)內(nèi)元器件配置作到排列有序、安裝牢固、理線整齊、接線正確、標(biāo)志明顯、外觀良好，內(nèi)外清潔。分設(shè)單相、三相回路，配用小型真空斷路器，如C65N等線路保護(hù)開關(guān)。箱內(nèi)設(shè)置輔助等電位接地母排。電源柜及其他電氣裝置的底座應(yīng)與建筑樓地面牢靠固定。電氣接線盒內(nèi)無殘留物，蓋板整齊、嚴(yán)密、緊貼墻面。同類電

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氣設(shè)備安裝高度應(yīng)一致。吊頂內(nèi)電氣裝置應(yīng)安裝在便于維修處。特種電源配電裝置應(yīng)有明顯標(biāo)志，并注明頻率、電壓。暗裝照明箱或開關(guān)面板安裝在機(jī)房出入口附近墻面的方便位置。分體空調(diào)插座設(shè)置在機(jī)房內(nèi)墻面上距地1.8m處。

主機(jī)房內(nèi)應(yīng)分別設(shè)置維修和測(cè)試用電源插座，兩者應(yīng)有明顯的區(qū)別標(biāo)志。測(cè)試用電源插座應(yīng)由計(jì)算機(jī)主機(jī)電源系統(tǒng)供電。其他房間內(nèi)應(yīng)適當(dāng)設(shè)置維修用電源插座。單相檢修電源回路要在電源管理間各墻面距地0.3m設(shè)置檢修電源插座，禁止使用2kW以上大功率電感性電動(dòng)工具。確需使用這類工具以及三相檢修設(shè)備，應(yīng)使用施工移動(dòng)式配電盤從機(jī)房所在樓層附近的動(dòng)力或照明配電箱接取電源。

(2)線路敷設(shè)。供電距離盡量短，主要是從供電安全考慮，電子計(jì)算機(jī)電源間應(yīng)靠近主機(jī)房設(shè)備。主機(jī)房內(nèi)活動(dòng)地板下部的低壓配電線路應(yīng)采用銅芯屏蔽導(dǎo)線或銅芯屏蔽電纜。機(jī)房內(nèi)的電源線、信號(hào)線和通信線應(yīng)分別鋪設(shè)，排列整齊，捆扎固定，長度留有余量。UPS電源配電箱(柜)引出的配電線路，穿薄皮鋼管或阻燃PVC管，沿機(jī)房活動(dòng)地板下敷設(shè)至各排機(jī)柜和配線架的背面，經(jīng)帶穿線孔的活動(dòng)地板引上，穿管保護(hù)迸大金屬導(dǎo)軌式插座線槽、機(jī)柜或配線架?？刂婆_(tái)或設(shè)備桌后的敷線，用金屬導(dǎo)軌式插座線槽并用螺栓固定，安裝在設(shè)備桌背面距活動(dòng)地板0.1~0.3m處。

信號(hào)線纜在活動(dòng)地板下從機(jī)柜、配線架至各設(shè)備，應(yīng)采用金屬線槽沿設(shè)備周圍或主機(jī)房從設(shè)備背面的活動(dòng)地板穿線孔引人的設(shè)

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備(注意不得與電源線路共用活動(dòng)地板穿線孔，且間距大于0.1m)，信號(hào)線纜避免沿機(jī)房墻邊敷設(shè)以防與強(qiáng)電線管交叉。活動(dòng)地板下部的電源線應(yīng)盡可能遠(yuǎn)離計(jì)算機(jī)信號(hào)線，并避免并排敷設(shè)。當(dāng)不能避免時(shí)，應(yīng)采取相應(yīng)的屏蔽措施。桌上設(shè)備之間的信號(hào)連線是短線的(長度于3m)應(yīng)沿設(shè)備背部桌面明敷，但不得懸吊在設(shè)備桌背側(cè)空中;是長線的(長度大于3m)應(yīng)從活動(dòng)地板穿線孔翻下(上)穿薄皮鋼管在活動(dòng)地板下敷設(shè)。機(jī)房照明負(fù)荷和普通空調(diào)負(fù)荷，由電源管理間分別引出動(dòng)力和照明回路供電。照明和空調(diào)負(fù)荷線路均沿吊頂內(nèi)或墻面敷設(shè)，避免在弱電機(jī)房

(3)可靠接地?？偱潆姽?、UPS電源柜、動(dòng)力配電箱、照明配電箱的金屬框架及基礎(chǔ)型

鋼必需接地(PE)或接零(PEN)可靠。門和框架的接地端子間用裸編銅線連接。柜、箱內(nèi)配線整齊。照明配電箱內(nèi)的漏電保護(hù)器的動(dòng)作電流不大于30mmA，動(dòng)作時(shí)間不大于0.ls。接地(PE)或接零(PEN)支線必須單獨(dú)與接地(PE)或接零(PEN)干線相連接，不得串聯(lián)連接。UPS電源柜輸出端的中性線(N極)，必須與由接地裝置直接引來的接地干線連接，作重復(fù)接地，接地電阻小于4?。當(dāng)燈具距地面高度小于2.4m時(shí)，燈具的可接近裸露導(dǎo)體必須接地(PE)或接零(PEN)可靠，并應(yīng)有專用接地螺栓和標(biāo)識(shí)。外電源進(jìn)線至機(jī)房電源管理間時(shí)，應(yīng)將電纜的金屬外皮與接地裝置連接;從樓外引入的皚裝信號(hào)電纜和屏蔽信號(hào)線，進(jìn)入弱電機(jī)房前也應(yīng)注意采取防雷擊措施，避免沿建筑外墻

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或防雷引線引雷人室，遭受雷擊和高頻電磁干擾。同軸電纜的屏蔽層必須與機(jī)殼一起接地。

上述線纜進(jìn)人機(jī)房后，應(yīng)設(shè)金屬接線箱(盒)，并將線纜金屬(屏蔽)外皮連接避雷器或浪涌電壓抑止器(SPD)，然后與機(jī)房等電位接地母排，用截面積不小于16mm2的銅芯絕.緣線連通。這樣可以有效的抑制線纜接收到的電磁干擾信號(hào)，從而保證信號(hào)傳輸?shù)馁|(zhì)量。從機(jī)房送出的信號(hào)線路應(yīng)采用金屬線槽沿墻并在吊頂內(nèi)敷設(shè)，避免與其他電氣管路平行緊貼。盡量避開空調(diào)、消防、暖氣和給排水等管道，與它們的間距按相關(guān)規(guī)范執(zhí)行。金屬電纜橋架及其支架和引入或引出的金屬電纜導(dǎo)管必須接地(PE)或接零(PEN)可靠，且必須符合下列規(guī)定:

1)金屬電纜橋架及其支架全長應(yīng)不少于2處與接地(PE)或接零(PEN)干線相連接。

2)電纜橋架間連接板的兩端跨接銅芯接地線，接地線最小允許截面積不小于6mm2。

3)接地(PE)或接零(PEN)線在插座間不串聯(lián)連接。

工程實(shí)施中按上述做法可以較好地處理機(jī)房供電的可靠和安全，各種不同電壓和頻率的信號(hào)線纜敷設(shè)安全、相互隔離度好、整齊、美觀并方便維護(hù)管理。

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(4)消防系統(tǒng)的要求。消防系統(tǒng)的設(shè)備動(dòng)力電纜，控制電纜、電線，按規(guī)范要求選用耐

火型電纜、電線。其他弱電系統(tǒng)所用電纜、電線均采用阻燃型。在設(shè)備選擇及線路敷時(shí)，應(yīng)充分考慮電磁兼容問題。

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