第一篇：實(shí)驗(yàn)步驟

2.2.3.1最佳蒸煮時間測定

參照Aproved Method 66-50（AACC2000）。將面片切成長10cm的面條，取大約30根，用500mL蒸餾水在電磁爐上，以小火烹煮（尚朋堂的電磁爐在90℃檔上，水處于微沸狀態(tài)）。煮3min后每30s取一根面條，用小刀切開橫截面，觀察橫截面有無白心，記錄白心剛好消失的時間為最佳蒸煮時間。

2.2.3.2面條吸水率測定

準(zhǔn)確稱取25g左右(精確到0.01g)面條放入500mL沸騰的蒸餾水中煮到最佳蒸煮時間，立即用漏勺撈出，再用50mL蒸餾水沖淋，收集煮面及沖淋的水，室溫下將面條瀝干5分鐘，準(zhǔn)確稱量，計算公司如下：

公式：面條吸水率（％）=（W2－W1）/ W1×100

W2 —蒸煮后面條重量，g

W1 —蒸煮前面條重量，g

2.2.3.3蒸煮損失率測定

預(yù)先稱收集有煮面及沖淋的水500mL燒杯的重量（精確至0.01g），在溫度為105℃的烘箱內(nèi)將其蒸發(fā)干，干燥后的燒杯冷卻后稱重，直至恒重，精確至0.01g。

M2公式：L??100%M1*(100?M)

M2—烘至恒重干物質(zhì)重量，g

M1—煮前面條質(zhì)量，g

M—面條含水量，%

2.2.3.4熟面拉伸（Kieffer）測定

將速凍面塊復(fù)熱后，在冷水（0~5℃）中浸泡1min后在質(zhì)構(gòu)儀TA-XT2i上用A/KIE探頭測

定，每組數(shù)據(jù)測6個平行樣，取平均值。參數(shù)設(shè)定如下：

參數(shù)設(shè)定：

Test Made and Option: Measure force in tension

Pre Test Speed: 2.0mm/secTest Speed: 3.0mm/sec

Post-Test Speed: 10.0mm/secDistance: 40mm

Trigger Force: 5.0g

2.2.3.5剪切力（Firmness）測定

將速凍面塊復(fù)熱后，在冷水（0~5℃）中浸泡1min后在質(zhì)構(gòu)儀上選用A/LKB-F輕型切刀測

定，每組數(shù)據(jù)測6個平行樣，取平均值。

參數(shù)設(shè)定：

Test Made and Option: Measure force in compression

Pre Test Speed: 1.0mm/secTest Speed: 0.5mm/sec

Post-Test Speed: 10.0mm/secForce: 2000.0g

Trigger Force: 5.0g

2.2.3.6TPA（質(zhì)構(gòu)剖面分析Texture Profile Analysis）測定

將速凍面塊復(fù)熱后，在冷水（0~5℃）中浸泡1min后，用TPA探頭測定，鋁合金材料，探頭寬度與長度分別為：5mm和50mm。TPA測試是通過兩次下壓完成對樣品的測試，每次下壓過程均包含下壓和收回兩個階段。TPA各參數(shù)設(shè)置及意義如下：

參數(shù)設(shè)定：

Pre-Test Speed: 1.0mm/secTest Speed:0.80mm/sec Post-Test Speed: 0.8mm/secTarget Mode: Strain Strain: 70.00%Time: 3.00sec Trigger Force: 5.0gTare Mode:

隨著蒸煮時間的增加，吸水率隨之增大，蒸煮損失也逐漸變大。這是因?yàn)殡S著面條蒸煮時間增加，淀粉的糊化更加完全，吸水量逐漸增加，同時面條淀粉和蛋白的溶出量也增加。

表2-4 蒸煮時間對速凍熟面質(zhì)構(gòu)品質(zhì)的影響

剪切 拉伸 拉伸距

蒸煮時間

TPA

力(g)力(g)離(mm)硬度(g)粘著性 彈性 粘聚性 咀嚼性(g)回復(fù)性 483.08 27.12 85.29 1068.44 504.91 26.98 87.01 1117.30 460.09 24.68 78.58 1028.97 460.8022.37 77.18 1019.39

28.47 0.93 28.14 0.95 25.36 0.95 23.57 0.93

0.54 0.54 0.53 0.53

540.19 567.69 518.68 507.31

0.40 0.41 0.41 0.438 10 12

由表3-2可以看出，在不同蒸煮時間下，煮8min時質(zhì)構(gòu)測得的剪切力、拉伸指標(biāo)和TPA指標(biāo)都較強(qiáng)，而煮10min，12min，使得面條蒸煮時間過長，所以速凍熟面品質(zhì)變差，面條整體口感偏軟。

蒸煮過程對面條品質(zhì)變化影響很大，因此要嚴(yán)格控制蒸煮時間及其蒸煮方式。本實(shí)驗(yàn)過程中，蒸煮8min時面條內(nèi)部白心全部消失，且質(zhì)構(gòu)指標(biāo)和蒸煮指標(biāo)表現(xiàn)最好。因此，確定蒸煮時間為8min。

隨著復(fù)熱時間的增加，吸水率隨之增大，蒸煮損失也逐漸變大。

表2-7 復(fù)熱時間對速凍熟面質(zhì)構(gòu)品質(zhì)的影響

復(fù)熱時間 40 60 80 100

剪切 拉伸 拉伸距

TPA

力(g)力(g)離(mm)硬度(g)粘著性 彈性 粘聚性 咀嚼性(g)回復(fù)性 471.69 83.0026.29 1015.9626.97 0.95 472.30 82.4525.50 1001.7923.60 0.92 455.80 78.4123.63

972.8133.22 0.94

0.55 0.54 0.54 0.54

527.85 517.65 513.55 506.63

0.43 0.43 0.42 0.43

455.95 77.6322.718 980.4530.12 0.95

由表2-7可以看出，在不同復(fù)熱時間下，復(fù)熱40s和60s時質(zhì)構(gòu)測得的剪切力、拉伸指標(biāo)和TPA指標(biāo)都較強(qiáng)，而復(fù)熱80s，100s，使得速凍熟面復(fù)熱時間過長，所以速凍熟面品質(zhì)變差，面條整體口感偏軟。

本實(shí)驗(yàn)過程中，復(fù)熱60s時速凍面塊剛好全部化開，且質(zhì)構(gòu)指標(biāo)和蒸煮指標(biāo)表現(xiàn)最好。因此，確定復(fù)熱時間為60s。

第二篇：會計電算化實(shí)驗(yàn)步驟

用友U8V11實(shí)驗(yàn)步驟：

1.程序——用友U8V11——系統(tǒng)服務(wù)——應(yīng)用服務(wù)器配置——數(shù)據(jù)庫服務(wù)器——增加— —數(shù)據(jù)源：default、數(shù)據(jù)庫服務(wù)器：本機(jī)名（如不知道本機(jī)名，可以通過單擊右下角類似主機(jī)的圖標(biāo)查看，服務(wù)器名即本機(jī)名）——測試連接——確定。

2.程序——用友U8V11——系統(tǒng)服務(wù)——系統(tǒng)管理——系統(tǒng)——注冊。接下來會彈出一個 對話框，要確保第一行是本機(jī)名，如果不是，請更改成本機(jī)名。倒數(shù)第二行會自己出來，如果自己沒有出來，請等一等，出來后，點(diǎn)擊登錄。賬套——建立——新建空白賬套——下一步——賬套號（學(xué)號后三位）賬套名稱（姓名班級，如張三文會123-6）；啟用會計期間（和手工帳的會計期間保持一致）——下一步——單位名稱（手工賬單位名稱）——下一步（注意行業(yè)性質(zhì)是2007 年新會計準(zhǔn)則科目，其他不用變）——下一步（對勾全打上）——下一步——完成——是。

編碼方案：第一行 4 2 2 2 2 2 2 2 2。其他行不用填寫——確定。數(shù)據(jù)精度：不用變——確定。

權(quán)限——用戶——增加（編號：001，姓名：自己的名字，所屬角色：賬套主管。編號：002-005是小組其他成員的名字，角色是普通員工）。

權(quán)限——權(quán)限——修改（001號所有的都打?qū)矗?02-005號只在基本信息和財務(wù)會計前面打鉤）——保存。

3、程序——用友U8V11——企業(yè)應(yīng)用平臺。此時會彈出一個對話框：第一行是本機(jī)名。第二行是001（即賬套主管的編號），第四行會自動過入。日期是之前設(shè)置的日期——登錄。

進(jìn)入后：

1、增加會計科目。基礎(chǔ)檔案——財務(wù)——會計科目——增加（增加二級會計科目點(diǎn)擊增加，增加三級會計科目點(diǎn)擊增加下級）。

2、錄入期初余額。財務(wù)會計——總賬——期初——期初余額。錄入完畢后，進(jìn)行試算，試算平衡后，開始填制憑證。3.填制憑證。財務(wù)會計——總賬——憑證——填制憑證。此時會讓設(shè)置憑證，選擇最長的 那個，即：現(xiàn)金收款憑證、現(xiàn)金付款憑證、銀行收款憑證、銀行付款憑證、轉(zhuǎn)賬憑證 之后定義憑證類別：

現(xiàn)金收款憑證 借方必有 1001 現(xiàn)金付款憑證 貸方必有 1001 銀行收款憑證 借方必有 1002 銀行付款憑證 貸方必有 1002 轉(zhuǎn)賬憑證 憑證必?zé)o 1001、1002 4.然后開始逐筆輸入憑證。

輸入完后：退出當(dāng)前系統(tǒng)，換一個人開始下一步的工作。

比如換成002，進(jìn)入后：

1.財務(wù)會計——總賬——憑證——主管簽字。2.財務(wù)會計——總賬——憑證——審核憑證。3.財務(wù)會計——總賬——憑證——記賬 4.財務(wù)會計——總賬——期末——對賬。]] 完畢后開始截實(shí)驗(yàn)報告要求的憑證的圖片和明細(xì)賬的圖片。

截圖完畢后，退出當(dāng)前系統(tǒng)，換成001登陸，填制UFO報表。1． 財務(wù)會計——總賬——UFO報表。2． 文件——新建

3． 格式——報表模板——所在行業(yè)選2007年新會計制度科目。財務(wù)報表選資產(chǎn)負(fù)債表— —確認(rèn)——確定。此時會出現(xiàn)帶有公式單元的資產(chǎn)負(fù)債表。4． 雙擊左下角格式，使之變成數(shù)據(jù)二字。5． 數(shù)據(jù)——關(guān)鍵字——錄入——確認(rèn)——是。

6． 利潤表也是這樣編制的。編制完成后，可以對資產(chǎn)負(fù)債表和利潤表截圖。

第三篇：點(diǎn)對點(diǎn)通信實(shí)驗(yàn)步驟2017

基于CAsyncSocket類的點(diǎn)對點(diǎn)通信客戶機(jī)創(chuàng)建流程 ? 通信流程：

1.服務(wù)器點(diǎn)擊“監(jiān)聽”按鈕開始監(jiān)聽，實(shí)現(xiàn)Create和Listen函數(shù) 2.客戶機(jī)點(diǎn)擊“連接”按鈕進(jìn)行連接，實(shí)現(xiàn)Connect函數(shù) 3.服務(wù)器端接受連接，并觸發(fā)onAccept事件，實(shí)現(xiàn)函數(shù)Aeecpt 4.客戶端或者服務(wù)器端點(diǎn)擊“發(fā)送”按鈕，發(fā)送文本框的數(shù)據(jù)

5.服務(wù)器端或者客戶端接收數(shù)據(jù)，OnReveive事件被觸發(fā)，實(shí)現(xiàn)函數(shù)Receive 6.客戶端或者服務(wù)器端點(diǎn)擊“斷開”，執(zhí)行函數(shù)close，觸發(fā)另一端的onClose事件

自定義類獲取對話框指針的方法

1.先在CMyDialog.cpp中聲明一個全局變量CMyDialog* pDlg;2在OnInitDialog()初始化的時候，pDlg = this;3.在自定義類使用的時候，在自定義的類的Cpp中添加extern CMyDialog* pDlg;4.在自定類中使用pDlg->yourfunction();? 編程過程： 客戶端：

1、創(chuàng)建MFC應(yīng)用程序，勾選windows socket選項(xiàng)，如創(chuàng)建工程名為client，自動創(chuàng)建類CClientAPP和CClientDlg，并生成相應(yīng)的源文件（.cpp）和頭文件(.h)。APP代表應(yīng)用程序。Dlg代表對話框

2、布置界面如下圖所示

3、建立類向?qū)?，給文本編輯框，列表框定義變量名及類型

4、插入基于CAsyncSocket的類，如取名clientsock，確定后類視圖下右鍵單擊類并載入虛函數(shù)onReceive(),onClose()，如果是服務(wù)器端還要加載onAccept

5、程序的各個類之間建立聯(lián)系，具體步驟：

5.1對話框界面與套接字建立連接。在ClientDlg.h文件中將“clientsock.h”文件包含進(jìn)來，使其能夠訪問套接字，代碼為#include” clientsocket.h”;并添加成員變量m_clientsock，代碼clientsock m_clientsock;

5.2套接字與對話框界面建立聯(lián)系。在套接字的源文件clientsock.cpp中，為使其能夠訪問對話框界面，添加對話框類頭文件 #include”ClinetDlg.h”

5.3套接字類能夠方便訪問對話框的成員.在對話框中定義指向本身的指針，并在套接字類中引用該指針

在clientDlg.Cpp中定義個全局變量，類型為對話框指針

5.4在初始化函數(shù)中給指針賦值。將當(dāng)前對話框賦值給指針變量：

5.5在套接字類中使用對話框指針。在clientsock.cpp文件中引入該全局變量extern CClientDlg * pdlg；

經(jīng)過以上步驟，類之間的關(guān)系，以及對話框指針的設(shè)置完成。服務(wù)器過程與客戶端是一樣的，區(qū)別在于5.1創(chuàng)建套接字變量時應(yīng)創(chuàng)建兩個，一個用于監(jiān)聽，一個用于服務(wù)。

接下來是具體的編程過程

服務(wù)器端，如果工程名為server，插入的類名為sersock，且界面如下圖，并按上述客戶端方式已做基本設(shè)置,包括文件互相包含、創(chuàng)建指針機(jī)制、建立類向?qū)?，載入虛函數(shù)。如這些都完成，則開始編程

1、在類視圖下，點(diǎn)擊CServerDlg右鍵單擊添加函數(shù)void myaccept（），void myrecv()和void myclose（）

2、雙擊監(jiān)聽按鈕，實(shí)現(xiàn)監(jiān)聽：使用updatedata(),Create()和Lisen（）

3、雙擊發(fā)送按鈕，實(shí)現(xiàn)發(fā)送：使用Send（）

4、當(dāng)有客戶端連接進(jìn)來時，觸發(fā)sersock下的onAccept()此函數(shù)下執(zhí)行 pdlg->myaccept();在myaccept()中執(zhí)行Accept（）

5、當(dāng)有消息進(jìn)來時，觸發(fā)sersock下的onreceive()此函數(shù)下執(zhí)行 pdlg->myrecv();在myrecv()中執(zhí)行Receive（）

客戶端

6、在類視圖下，點(diǎn)擊CClientDlg右鍵單擊添加函數(shù) void myrecv()和void myclose（）

7、雙擊連接，實(shí)現(xiàn)updatedata(),Create()和Connect（）

8、雙擊發(fā)送按鈕，實(shí)現(xiàn)發(fā)送：使用Send（）

9、當(dāng)有消息進(jìn)來時，觸發(fā)clientsock下的onreceive()此函數(shù)下執(zhí)行 pdlg->myrecv();在myrecv()中執(zhí)行Receive（）

第四篇：IP實(shí)驗(yàn)步驟基本實(shí)驗(yàn)步驟

IP實(shí)驗(yàn)步驟 基本實(shí)驗(yàn)步驟

(1)收獲細(xì)胞，加入適量細(xì)胞IP裂解緩沖液(含蛋白酶抑制劑)，冰上或者4?裂解30min，12,000g離心30 min后取上清;(2)取少量裂解液以備Western blot分析，剩余裂解液將1μg相應(yīng)的抗體和10-50 μl protein A/G-beads加入到細(xì)胞裂解液，4?C緩慢搖晃孵育過夜;(3)免疫沉淀反應(yīng)后，在4?C 以3,000 g速度離心5 min，將protein A/G-beads離心至管底;將上清小心吸去，protein A/G-beads用1ml裂解緩沖液洗3,4次;最后加入15μl的2×SDS 加樣緩沖液，沸水煮10分鐘;(4)SDS-PAGE, Western blotting或進(jìn)行質(zhì)譜分析。

一、樣品處理: 免疫沉淀實(shí)驗(yàn)成功與否，第一步處理樣品非常關(guān)鍵。免疫沉淀實(shí)驗(yàn)本質(zhì)上是處于天然構(gòu)象狀態(tài)的抗原和抗體之間的反應(yīng)，而樣品處理的質(zhì)量決定了抗原抗體反應(yīng)中的抗原的質(zhì)量，濃度以及抗原是否處于天然構(gòu)象狀態(tài)。所以制備高質(zhì)量的樣品以用于后續(xù)的抗體-agarose beads孵育對免疫沉淀實(shí)驗(yàn)是否成功非常關(guān)鍵。在這個環(huán)節(jié)中，除了要控制所有操作盡量在冰上或者4?完成外，最為關(guān)鍵的是裂解液的成份。

用于免疫沉淀實(shí)驗(yàn)的樣品一般是原代培養(yǎng)細(xì)胞裂解液或者細(xì)胞系裂解液。我們以常用的RIPA裂解液為例(主要含有pH7.4左右的離子緩沖液，接近生理濃度下的NaCl，一定比例的去垢劑和甘油以及各類蛋白酶抑制劑等)來說明其各主要成份的用途，進(jìn)而幫助我們?nèi)绾吾槍Σ煌膶?shí)驗(yàn)?zāi)康暮筒煌牡鞍踪|(zhì)特性來選擇最佳的裂解液。

a(緩沖液:離子緩沖液常采用pH7.4的Hepes或者Tris-Cl。b(NaCl濃度一般習(xí)慣用150 mM，這主要是因?yàn)?50 mM接近生理濃度，不會破壞蛋白質(zhì)之間的相互作用。然而細(xì)胞內(nèi)部的NaCl濃度并不是均一的，局部NaCl的濃度可以低到50 mM，150 mM的NaCl有可能會破壞這個區(qū)域的蛋白質(zhì)相互作用。因此裂解液配方最佳的NaCl濃度要視所分析的蛋白的亞細(xì)胞定位而定。

c(甘油由于其粘性，可以對蛋白質(zhì)之間的相互作用起到一個很好的保護(hù)作用。一般添加10%的甘油有助于穩(wěn)定蛋白質(zhì)之間的相互作用。

d(裂解液中的去垢劑可以裂解細(xì)胞質(zhì)膜，也同時破壞了許多細(xì)胞器的膜，從而釋放了其中儲存的許多蛋白酶。而由于用于免疫沉淀實(shí)驗(yàn)的去垢劑作用比較溫和，因此蛋白酶的活性大部分得以保存。還有一部分蛋白酶來自胞質(zhì)中，主要由于其抑制蛋白或者其活性抑制環(huán)境受到改變后從而恢復(fù)了蛋白酶活性。因此，添加蛋白酶抑制劑對于防止目的蛋白的降解從而完成免疫沉淀實(shí)驗(yàn)非常關(guān)鍵。一般主要通過添加EDTA抑制金屬蛋白酶，通過Protease Cocktail(多種蛋白酶抑制劑混合物)可以抑制蛋白酶。

e(去垢劑對于免疫沉淀實(shí)驗(yàn)尤其是免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)是一個非常關(guān)鍵的因素。不同的去垢劑種類和不同的去垢劑濃度主要通過影響以下三個因素來影響免疫沉淀效果:-細(xì)胞質(zhì)/器膜的通透性:因?yàn)樵S多目的蛋白都定位在細(xì)胞器中，所以必須先將這些蛋白釋放出來，抗體才能與之反應(yīng)。

-膜蛋白的釋放:許多膜蛋白的構(gòu)象對去垢劑種類和濃度非常敏感，因此針對這類蛋白的免疫沉淀實(shí)驗(yàn)，需要謹(jǐn)慎地嘗試多種去垢劑以及不同濃度。

-蛋白相互作用:不同去垢劑對不同性質(zhì)的蛋白質(zhì)的相互作用影響程度不一樣，需要根據(jù)具體蛋白的特性進(jìn)行分析選擇去垢劑種類和濃度。而由于何種去垢劑適應(yīng)作用于何種蛋白質(zhì)現(xiàn)在很難精準(zhǔn)預(yù)測，所以一個更為切實(shí)可行的辦法就是通過具體實(shí)驗(yàn)篩選合適的去垢劑種類和濃度。

二、抗體-agarose beads孵育

裂解細(xì)胞，離心并去除不可溶的膜組份后，上清可以儲存在-80?保存3個月，但最好能夠使用新鮮制備的細(xì)胞裂解液上清去進(jìn)行抗體-agarose beads孵育實(shí)驗(yàn)?？贵w可以先加入上清中與樣品孵育數(shù)小時后再加入Protein A或者G beads孵育過夜，也可以同時加入抗體和Protein A或者G beads孵育過夜。一般選擇1mg總蛋白(1mg/ml)對應(yīng)添加1 ug抗體，最高可以添加至5 ug抗體，過多的抗體會產(chǎn)生假陽性。這個步驟中關(guān)鍵因素在于選擇合適的陰性對照。一般選用加同樣量的IgG，但更為妥當(dāng)?shù)姆椒ㄊ沁x擇針對胞內(nèi)其它無關(guān)目的蛋白的一抗做對照。例如，做膜蛋白A的免疫沉淀，選擇膜蛋白B來做陰性對照，只要確認(rèn)二者之間沒有相互作用;而做胞質(zhì)可溶性蛋白C的免疫沉淀，則選擇另外一個可溶性蛋白D來做陰性對照。同時，為避免Protein A或者G beads有(非)特異性吸附從而造成免疫沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果的假陽性，一般在加入目的蛋白抗體之前，預(yù)先將Protein A或者G beads與細(xì)胞裂解液孵育數(shù)小時，然后取上清用于后續(xù)的抗體-agarose beads孵育。

同時，Protein A或者G beads對不同類型的抗體親和力不同，結(jié)合一抗的種屬和Ig亞型，選擇合適的Protein A或者G beads也是決定免疫沉淀實(shí)驗(yàn)成功與否的一個重要因素。一般推薦使用Protein A和Protein G beads的混合物，這樣可以達(dá)到最佳實(shí)驗(yàn)效果，而且省去了許多選擇的煩惱。

三、抗體-agarose beads復(fù)合物洗滌: 除了選擇特異性好的抗體以及選擇合適的陰性對照外，去除免疫沉淀實(shí)驗(yàn)非特異性的一個辦法是對抗體-agarose beads復(fù)合物進(jìn)行多次洗滌。一般洗滌緩沖液使用和裂解液一樣的配方，但去除甘油，以減少由于甘油的粘性帶來的非特異性吸附。針對不同的實(shí)驗(yàn)要求，還可以通過更改NaCl的濃度以及去垢劑的比例，種類來達(dá)到去除非特異性吸附的效果。例如，針對單純的免疫沉淀而非免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)或者雖然是進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，但蛋白質(zhì)之間的結(jié)合比較牢靠，可以考慮使用低濃度(0.2-0.5%)的SDS洗滌抗體-agarose beads復(fù)合物，這樣可以去除絕大部分非特異性相互作用。

四、鑒定

免疫沉淀實(shí)驗(yàn)用途非常廣泛(見IP: Q&A)，而且基于最基本的免疫沉淀實(shí)驗(yàn)衍生出了許多免疫沉淀相關(guān)實(shí)驗(yàn)手段(比如免疫共沉淀，染色質(zhì)免疫沉淀和RNA-蛋白免疫沉淀)，因此，免疫沉淀實(shí)驗(yàn)的鑒定方法主要視實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩ā?/p>

我們在本手冊中主要簡單概述常見的免疫沉淀之后的WB檢測需要注意的實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)。由于

免疫沉淀實(shí)驗(yàn)使用目的蛋白抗體加Protein A/G beads與樣品孵育，因此在最后離心獲得抗體-agarose beads復(fù)合物后，eppendorf管中主要含有抗體，目的蛋白，Protein A/G beads以及一些其它非特異性作用蛋白。其中，抗體和目的蛋白以及Protein A/G beads三者之間是以非共價健結(jié)合在一起，只有Protein A/G與agarose beads是共價結(jié)合在一起的。因此，最后經(jīng)過添加含巰基乙醇的加樣緩沖液以及煮沸變性并離心出去Protein A/G beads后，eppendorf管只有抗體和目的蛋白以及少量非特異性吸附蛋白。這樣SDS-PAGE中就含有目的蛋白和抗體二種蛋白，由于加樣緩沖液中含有巰基乙醇從而導(dǎo)致抗體的重鏈與輕鏈之間的二硫鍵被破壞從而使得抗體分子變成重鏈分子(55KD)和輕鏈分子(25KD)。因此，WB顯色反應(yīng)中除了能檢測到目的蛋白外，如果所使用的二抗與用于免疫沉淀實(shí)驗(yàn)的抗體分子屬于同一種屬的話，還能檢測到重鏈和輕鏈分子。通常用于免疫沉淀的抗體量非常大(1ug)，所以當(dāng)目的蛋白的大小接近重鏈或者輕鏈分子時，重鏈或者輕鏈分子的WB信號常常由于信號過強(qiáng)而導(dǎo)致影響對目的蛋白的WB結(jié)果判斷。

針對上述情況，通常有二種解決辦法: a(選擇不同種屬的抗體分別進(jìn)行免疫沉淀實(shí)驗(yàn)和WB實(shí)驗(yàn)，這樣再選擇一個種屬交叉反應(yīng)比較弱或者無種屬交叉反應(yīng)的二抗進(jìn)行WB實(shí)驗(yàn)，就可以大大減弱重鏈和輕鏈分子的WB信號。

b(使用交聯(lián)劑將抗體和Protein A/G beads交聯(lián)，然后通過添加不含巰基乙醇的加樣緩沖液處理目的蛋白-抗體-agarose beads復(fù)合物，最后離心去除抗體-agarose beads復(fù)合物，上清中只留下目的蛋白。

免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)原理

IP是利用抗原蛋白質(zhì)和抗體的特異性結(jié)合以及細(xì)菌蛋白質(zhì)的“protein A/G"特異性地結(jié)合到抗體(免疫球

蛋白)的FC片段的現(xiàn)象開發(fā)出來的方法。目前多用protein A/G預(yù)先結(jié)合在argarose beads上，使之

與含有抗原的溶液及抗體反應(yīng)后，beads上的prorein A/G就能達(dá)到吸附抗原的目的。通過低速離心，可以從含有目的抗原的溶液中將目的抗原與其它抗原分離。

免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法，是確定兩種蛋白質(zhì)是否在生理?xiàng)l件下有相互作用的有效方法。其原理是:當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下被裂解時，完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì),蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來。如果用蛋白質(zhì)X的抗體免疫沉淀X，那么與X在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)Y也能沉淀下來。這種方法常用于測定兩種目標(biāo)蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結(jié)合;也可用于確定一種特定蛋白質(zhì)的新的作用蛋白。

白與蛋白 尋找新的 經(jīng)由免疫共沉淀然后通過質(zhì)譜或者的相互 相互作用 WB鑒定新的相互作用蛋白 作用 蛋白

驗(yàn)證目的 經(jīng)由免疫共沉淀然后通過使用待測 蛋白和 蛋白 待測蛋白 的抗體進(jìn)行WB實(shí)驗(yàn)可以確定目的蛋 是否有 白

相互作用 和待測蛋白是否有相互作用 通過對經(jīng)由免疫共沉淀而得到的DNA 片段進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)可以獲得DNA片研究蛋白與DNA的動態(tài)作用 段的序列信息以及目的蛋白與DNA 之間的動態(tài)作用信息

通過使用針對組蛋白不同修飾位點(diǎn)的研究蛋白 抗體進(jìn)行染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)去檢測

染色質(zhì) 與DNA 研究組蛋白的各種共價修飾 組蛋白的不同修飾狀態(tài)和目的基因啟

免疫沉淀 的相互 與基因表達(dá)之間的關(guān)系 動子之間的動態(tài)相互作用，從而研究作用 組蛋白修飾與目的基因表達(dá)之間的關(guān)

系

基于CHIP的原理發(fā)展出來的RIP 研究蛋白與RNA的相互作用(RNA-IP)技術(shù)可以用來研究目的蛋 白與RNA之間的相互作用信息

我該選擇什么樣的抗體做免疫沉淀，免疫共沉淀和RNA免疫沉淀以及染色質(zhì)免疫沉淀, 在所有免疫沉淀相關(guān)實(shí)驗(yàn)中，抗原的起始濃度相對其它免疫相關(guān)實(shí)驗(yàn)(WB和IF等)要低得多，所以對抗體的親和力相對其它實(shí)驗(yàn)(WB和IF等)提出了很高的要求，這就需要使用高親和力的抗體去進(jìn)行免疫沉淀相關(guān)實(shí)驗(yàn)。同時，由于免疫沉淀相關(guān)實(shí)驗(yàn)主要是在生理?xiàng)l件性進(jìn)行，所以需要抗體識別蛋白的天然表面構(gòu)象，因此選擇的抗體其針對的抗原決定蔟需要暴露在蛋白表面。這些因素對制備能成功應(yīng)用于IP實(shí)驗(yàn)的抗體提出了很高的要求: a(用于免疫的蛋白抗原其構(gòu)象需要盡量接近目的蛋白的天然構(gòu)象或者用于免疫的多肽盡量暴露在目的蛋白的表面。獲得接近天然構(gòu)象的蛋白抗原的途徑有很多，主要有天然提取，原核表達(dá)重組蛋白以及真核表達(dá)重組蛋白三種方式。這其中，就蛋白構(gòu)象角度而言，天然提取是最佳途徑，但這種方法受材料來源限制和純化方法復(fù)雜等多因素影響，一般很少采用。原核表達(dá)因?yàn)槌杀镜土?，操作方便最為受歡迎，但其受表達(dá)環(huán)境與大部分蛋白天然存在環(huán)境差別巨大，構(gòu)象失真情況嚴(yán)重，抗原的構(gòu)象質(zhì)量有嚴(yán)重問題。大規(guī)模瞬時真核表達(dá)是近期新興的表

達(dá)系統(tǒng)，具有表達(dá)環(huán)境接近天然，操作方便等諸多優(yōu)點(diǎn)，是獲取具有天然構(gòu)象蛋白抗原的首選工具。

b(親和力要比普通的抗體應(yīng)用要求高得多。多克隆抗體由于可以結(jié)合目的抗原的多個抗原決定簇，所以在親和力方面是首選。但考慮到特異性，獲得單克隆抗體群是更好的選擇。具體優(yōu)缺點(diǎn)總結(jié)如下表。

單克隆抗體群(由一個免疫原產(chǎn)生的多 多克隆抗體 單克隆抗體 個單克隆抗體混合物)抗體抗原作由抗體的親和力決定(極佳極佳 極佳 用信號強(qiáng)度 或者極弱)通常很好，但有時會極佳(由于選擇可以進(jìn)行IP且沒有交特異性 極佳，但有時會有交叉反應(yīng) 有非特異性相互作用 叉反應(yīng)的抗體組成單克隆抗體群)親和力高(由于抗體特異性好，親和力高(由于選擇可以進(jìn)可以與目的蛋白的多特異性好，且可以無限量供優(yōu)點(diǎn) 行IP且沒有交叉反應(yīng)的抗體組成單克個抗原決定蔟相互作應(yīng) 隆抗體群)用)需要篩選親和力高的抗體;能夠篩選得到的符合條件的單克隆并非特異性相互作用很缺點(diǎn) 抗原表位可能會被相互作不多，所以單克隆抗體群也就不容易獲難去除 用蛋白遮蔽 得

免疫沉淀效由抗體的親和力決定(極佳極佳(由于選擇可以進(jìn)行IP且沒有交極佳(由于親和力高)果 或者極弱)叉反應(yīng)的抗體組成單克隆抗體群)由抗體的親和力決定和抗通常很好，但有時非免疫共沉淀原表位是否被相互作用蛋極佳(由于選擇可以成功進(jìn)行IP且沒特異性相互作用會帶效果 白遮蔽決定(極佳或者極有交叉反應(yīng)的抗體組成單克隆抗體群)來假陽性 弱)由抗體的親和力決定和抗

通常很好，但有時非原表位是否被遮蔽或者以染色質(zhì)免疫極佳(由于選擇可以成功進(jìn)行IP且沒特異性相互作用會帶及抗原表位是否被交聯(lián)實(shí)沉淀效果 有交叉反應(yīng)的抗體組成單克隆抗體群)來假陽性 驗(yàn)所破壞決定(極佳或者極

弱)

第五篇：嵌入式實(shí)驗(yàn)環(huán)境搭建一般步驟

嵌入式實(shí)驗(yàn)環(huán)境搭建的一般步驟

1．啟動虛擬機(jī)

雙擊Windows桌面WMware Workstation圖標(biāo)； 2.用交叉網(wǎng)線把主機(jī)和實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)連接：

選擇Resume this virtual machine，進(jìn)入Linux界面。在虛擬機(jī)中打開一個Linux終端，需要點(diǎn)擊：紅帽子->終端, 打開一個Linux終端。

⒈）minicom仿真終端設(shè)置

在終端下輸入minicom –s，選擇serial port setup，回車。

按下A鍵，將對應(yīng)參數(shù)設(shè)置為/dev/ttyS0并回車；按下E鍵，按下I鍵，將對應(yīng)參數(shù)設(shè)置為115200 8N1，回車；按下F鍵，將對應(yīng)參數(shù)設(shè)置為No；然后回車保存參數(shù)，選擇save setup as df1。最后選擇exit。2.）添加串口設(shè)備

如果正在運(yùn)行虛擬機(jī)、Linux，這時要添加串口設(shè)備，則必須先用power off方式退出虛擬機(jī)，然后再次啟動虛擬機(jī)，點(diǎn)擊“VM”，選擇“settings”，點(diǎn)擊Add按鈕選擇“Serial Port”點(diǎn)擊“Next”按鈕，然后在出現(xiàn)的各個對話框中，依次點(diǎn)擊“Next”、“Finish”，則在虛擬機(jī)中添加了串行端口

選擇power on this virtual machine，進(jìn)入Linux界面。用戶名“root”，口令“123456”。在終端窗口[root@localhost~]#輸入minicom并打開實(shí)驗(yàn)箱之后回車，則minicom仿真終端程序會將目標(biāo)板輸出到終端的信息，顯示出來。

在該界面上會出現(xiàn)“Techv_omap35xx login:”輸入“root”，點(diǎn)擊回車，此窗口會出現(xiàn)“root@Techv_omap35xx：~#”表示目標(biāo)板終端。3.安裝交叉編譯器：

a)將交叉編譯器拷貝到/usr/local子目錄

打開“我的電腦”，找到E：/軟件/ arm-2007q3-51-arm-none-linux-gnueabi-i686.tar.bz 將其進(jìn)行復(fù)制，粘貼到主文件夾下的/usr/local下 b)建文件“arm”并查看 [root@localhost~]# cd /usr/local [root@localhost local]# mkdir arm [root@localhost local]# ls –l 在此窗口中會顯示/usr/local中的信息。會看到arm和拷貝的文件。

c)解壓

[root@localhost local]#tar xvjf arm-2007q3-51-arm-none-linux-gnueabi-i686.tar.bz空格-C/usr/local/arm（回車）d)添加環(huán)境變量

[root@localhost local]# echo $PATH 添加環(huán)境變量方法：

[root@localhost local]#kwrite /root/.bashrc（回車），在fi下一行添加“export PATH=/usr/local/arm/arm-2007q3/bin:$PATH”，點(diǎn)擊保存、退出，回到終端窗口“[root@localhost local]#”。關(guān)掉終端窗口“[root@localhost local]#”.重啟終端窗口： 點(diǎn)擊紅帽子->終端, 打開一個Linux終端：[root@localhost local]# echo $PATH（回車），看到改后的路徑。

4.主機(jī)Linux環(huán)境和目標(biāo)板IP地址設(shè)置 主機(jī)終端修改IP地址

[root@localhost local]#ifconfig eth0 192.168.1.5（回車）查看

[root@localhost local]# ifconfig（回車）實(shí)驗(yàn)箱終端修改IP地址

root@Techv_omap35xx：~#ifconfig eth0 192.168.1.9（回車）查看

root@Techv_omap35xx：~#ifconfig（回車）5網(wǎng)絡(luò)防火墻的設(shè)置 主機(jī)linux終端窗口

[root@localhost local]#setup（回車），光標(biāo)移動找到“防火墻設(shè)置”，點(diǎn)擊回車，用光標(biāo)移動鍵選擇“禁用”防火墻，用“TAB”選擇“確定”后回車，退出設(shè)置.6.連接

在主機(jī)linux minicom終端窗口

[root@localhost local]# ping 192.168.1.9（回車），可以用Ctrl+c鍵去終止ping命令 在實(shí)驗(yàn)箱中

root@Techv_omap35xx：~# ping 192.168.1.5（回車），看看實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)能否和主機(jī)連上?？梢杂肅trl+c鍵去終止ping命令 7.配置NFS網(wǎng)絡(luò)文件系統(tǒng)

a)設(shè)置主機(jī)Linux允許NFS服務(wù) 首先在linux 主機(jī)的終端上 [root@localhost local]#setup（回車）

在“系統(tǒng)服務(wù)“選項(xiàng)菜單選中 [*]nfs，[ ]iptables，（用空格鍵切換*和），然后按F12鍵退出，再選擇方向鍵，退出setup界面 b)主機(jī)終端窗口

[root@localhost local]#kwrite /etc/exports（回車），進(jìn)入令一個界面，刪除第一行，輸入：（注意中間有空格）

/ *(rw)/home/nfs1 *(rw)然后，保存、退出。

c)新的設(shè)置重啟NFS方法：

[root@localhost local]#/etc/init.d/nfs restart 終端內(nèi)輸出（有8個確定）：

這樣就一切OK了！主機(jī)linux下的NFS啟動起來。d）將主機(jī)/home/nfs1目錄掛接為目標(biāo)板/tmp目錄 ⑴ 掛接前主機(jī)建立/home/nfs1子目錄

[root@localhost /]# mkdir /home/nfs1 [root@localhost /]# cd /home/nfs1 用vi建立一個文件，文件名為abc:

[root@localhost nfs1]# vi abc 保存文件并退出，語句ESC ESC :wq!（注意;這里的abc是個空文件）

[root@localhost nfs1]# ls –l ⑵ 在目標(biāo)板對應(yīng)終端窗口，執(zhí)行掛接命令

root@Techv_OMAP35xx:/# mount-o soft,nolock,rsize=1024-v 192.168.1.5

:/home/nfs1 /tmp ⑶ 掛接后目標(biāo)板/tmp目錄列表

root@Techv_OMAP35xx:/# cd /tmp

root@Techv_OMAP35xx:/var/volatile/tmp# ls –l