第一篇：PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范

PCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室操作規(guī)范

一、PCR 實(shí)驗(yàn)室的設(shè)置及管理

1．目的：建立實(shí)驗(yàn)室的合理設(shè)置和科學(xué)管理，防止實(shí)驗(yàn)污染，保證檢測(cè)結(jié)果的可靠性。2．適用范圍：本程序適用于分子診斷室的設(shè)置、工作流程和日常管理等。3．負(fù)責(zé)人： 4．細(xì)則：

4．1流感實(shí)驗(yàn)室為急傳所的專業(yè)實(shí)驗(yàn)室，從事臨床標(biāo)本的基因擴(kuò)增檢測(cè)及相關(guān)科研工作等。4．2 本實(shí)驗(yàn)室采用實(shí)時(shí)熒光定量（定性）PCR 技術(shù)作為病毒基因診斷的主要手段，實(shí)驗(yàn)室分為三個(gè)區(qū)：試劑準(zhǔn)備區(qū)（第一區(qū)）、標(biāo)本處理區(qū)（第二區(qū)）、擴(kuò)增分析區(qū)（第三區(qū)）。每一工作區(qū)配備專用的設(shè)備、儀器、輔助設(shè)施、耗材、清潔用品、辦公用品、專用工作服，并有明顯的區(qū)分標(biāo)識(shí)。標(biāo)本的接收則在檢驗(yàn)科標(biāo)本接收處進(jìn)行。

4．3 各工作區(qū)專用的儀器設(shè)備、辦公用品、工作服、實(shí)驗(yàn)耗材和清潔用具等，不可混用。4．4 各工作區(qū)配置、功能和內(nèi)務(wù)管理見各相關(guān)SOP 文件。

4．5 嚴(yán)格遵守從“試劑準(zhǔn)備區(qū)→標(biāo)本處理區(qū)→擴(kuò)增分析區(qū)”的單一流向制度，不得逆向進(jìn)入前一工作區(qū)。

4．6 非本實(shí)驗(yàn)室工作人員，未經(jīng)許可不得入內(nèi)；進(jìn)修、實(shí)習(xí)或其他科室人員因科研活動(dòng)需要，進(jìn)入實(shí)驗(yàn)區(qū)域（試劑準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本處理區(qū)、擴(kuò)增分析區(qū)）需首先熟悉本程序的各項(xiàng)規(guī)定并嚴(yán)格遵守執(zhí)行，在本實(shí)驗(yàn)室人員監(jiān)督指導(dǎo)下進(jìn)行。4．7 實(shí)驗(yàn)完畢后做好清潔消毒工作。

二、PCR 實(shí)驗(yàn)室工作制度

1．目的 ：保持良好的工作環(huán)境，以確保檢測(cè)結(jié)果的可靠性，防止交叉污染，防止差錯(cuò)、事故及糾紛的發(fā)生。

2．適用范圍：所有本實(shí)驗(yàn)室人員。3．負(fù)責(zé)人： 4．細(xì)則： 4．1 本實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行臨床基因擴(kuò)增檢測(cè)及相關(guān)實(shí)驗(yàn)工作，不得進(jìn)行其它實(shí)驗(yàn)操作。4．2 各區(qū)的用品不得混用。

4．3 在各區(qū)的實(shí)驗(yàn)操作過程中，操作者必須戴手套和帽子，嚴(yán)格按照操作規(guī)程。4．4 試劑準(zhǔn)備區(qū)只能進(jìn)行試劑的貯存及配制等相關(guān)操作（見相關(guān)SOP 文件）。

4．5 標(biāo)本處理區(qū)只能進(jìn)行臨床標(biāo)本的保存，核酸提取、保存及其加入至擴(kuò)增反應(yīng)管和測(cè)定RNA 時(shí)cDNA 的合成（見相關(guān)SOP 文件）。

4．6 擴(kuò)增分析區(qū)只能進(jìn)行DNA 或cDNA 的擴(kuò)增、實(shí)時(shí)熒光PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的分析（見相關(guān)SOP 文件）。

4．7 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)嚴(yán)格執(zhí)行本實(shí)驗(yàn)室的各項(xiàng)操作規(guī)程，及時(shí)做好各種操作記錄，力求準(zhǔn)確、可靠。實(shí)驗(yàn)完畢，做好清潔、整理及分析統(tǒng)計(jì)等工作。

4．8 室內(nèi)儀器由專人負(fù)責(zé)，未經(jīng)許可，不得隨意使用或挪用；愛護(hù)使用儀器，定期進(jìn)行保養(yǎng)與維修。

4．9 愛護(hù)科室財(cái)產(chǎn)，注意安全；離開實(shí)驗(yàn)室前應(yīng)關(guān)好門窗，檢查水、電等。

三、PCR 實(shí)驗(yàn)室內(nèi)務(wù)管理制度

1．目的：保證實(shí)驗(yàn)室日常內(nèi)務(wù)管理及清潔工作順利進(jìn)行。2．適用范圍：實(shí)驗(yàn)室相關(guān)人員及相關(guān)清潔工人。3．負(fù)責(zé)人： 4．細(xì)則：

4．1 非本室工作人員未經(jīng)允許不得進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室。4．2 各區(qū)的用品不得混用。

4．3 實(shí)驗(yàn)人員要有強(qiáng)烈的時(shí)間觀念，按時(shí)上下班，不遲到、早退。

4．4 進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室的工作人員必須遵守實(shí)驗(yàn)室的單一流向的規(guī)定，禁止逆向走動(dòng)。

4．5 所有儀器（如PCR 擴(kuò)增儀）須有專人負(fù)責(zé)，并有使用維護(hù)記錄；實(shí)驗(yàn)人員必須熟悉儀器性能后方允許操作，并嚴(yán)格遵守操作規(guī)程。

4．6 所有試劑進(jìn)購、配制、質(zhì)檢、使用均要有記錄，未經(jīng)允許不得隨意帶出本實(shí)驗(yàn)室。4．7 每天了解儀器運(yùn)轉(zhuǎn)情況及試劑使用情況，確保儀器整潔安全，試劑合格使用。4．8 各區(qū)的各種清潔消毒均應(yīng)有記錄，工作衣消毒時(shí)注意各區(qū)應(yīng)分開進(jìn)行處理。4．9 注意保持實(shí)驗(yàn)室衛(wèi)生整潔，嚴(yán)禁在室內(nèi)抽煙、吃零食，非實(shí)驗(yàn)操作人員應(yīng)盡量少入。4.10下班前檢查門、窗、水、電，節(jié)假日應(yīng)指定人員負(fù)責(zé)檢查實(shí)驗(yàn)室的儀器、設(shè)備。

四、PCR 實(shí)驗(yàn)室人員的配置及管理

1．目的：保證實(shí)驗(yàn)室有足夠數(shù)量的合格的具備開展該類實(shí)驗(yàn)?zāi)芰Φ膶?shí)驗(yàn)人員。2．適用范圍：適用于實(shí)驗(yàn)室人員配置、管理、培訓(xùn)及考核。3．負(fù)責(zé)人： 4．細(xì)則： 4．1 人員要求

4．1．1 本實(shí)驗(yàn)室工作人員應(yīng)為醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)專業(yè)或相關(guān)專業(yè)畢業(yè)，具有中級(jí)以上技術(shù)職稱或?qū)？埔陨蠈W(xué)歷。

4．1．2 實(shí)驗(yàn)室工作人員應(yīng)參加衛(wèi)生部或省臨檢中心舉辦的PCR 技術(shù)培訓(xùn)，并取得合格證。4．1．3 對(duì)于新進(jìn)入本室的人員，如尚未取得PCR 技術(shù)培訓(xùn)合格證，應(yīng)在實(shí)驗(yàn)室有培訓(xùn)合格證的上級(jí)技術(shù)人員的指導(dǎo)下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)工作，實(shí)驗(yàn)報(bào)告由有資格人員出具，并應(yīng)在最短的時(shí)間內(nèi)取得上崗培訓(xùn)合格證。4．2 人員配置

4．2．1 實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)工作需要配備足夠的工作人員。4．2．2 各級(jí)技術(shù)人員履行相應(yīng)的工作職責(zé)。4．3 人員培訓(xùn)及考核

4．3．1 實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)人或負(fù)責(zé)人指定人員參加每年衛(wèi)生部PCR 室間質(zhì)評(píng)總結(jié)會(huì)。

4．3．2 實(shí)驗(yàn)室工作人員每1～2 年至少參加1 次PCR 技術(shù)的省級(jí)或國(guó)家級(jí)繼續(xù)教育項(xiàng)目，參加相關(guān)學(xué)術(shù)交流會(huì)議。

4．3．3 安排未取得上崗培訓(xùn)合格證的工作人員在合適的時(shí)間內(nèi)參加技術(shù)培訓(xùn)。

4．3．4 科室不定期組織實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部實(shí)驗(yàn)人員學(xué)習(xí)、更新核酸擴(kuò)增方面的相關(guān)知識(shí)，提升自身的理論學(xué)習(xí)水平。特別是在標(biāo)本接收區(qū)采血、接收標(biāo)本的人員，需定期對(duì)其進(jìn)行有關(guān)核酸擴(kuò)增技術(shù)，標(biāo)本采集、保存、運(yùn)輸?shù)戎R(shí)的培訓(xùn)。一些科室的送檢標(biāo)本由該科室的人員送到標(biāo)本接收區(qū)，對(duì)這些臨床醫(yī)護(hù)人員也要定期進(jìn)行有關(guān)核酸擴(kuò)增技術(shù)，標(biāo)本采集、保存、運(yùn)輸?shù)戎R(shí)的培訓(xùn)。

4．3．5 本實(shí)驗(yàn)室工作人員每年進(jìn)行考核一次,考核內(nèi)容: a)日常工作質(zhì)量 b)室內(nèi)質(zhì)控測(cè)評(píng) c)室間質(zhì)控測(cè)評(píng) d)在抱怨處理中的表現(xiàn)

4．3．6 本實(shí)驗(yàn)室工作人員實(shí)行嚴(yán)格獎(jiǎng)懲制度,有下列表現(xiàn)者可受獎(jiǎng): a)工作質(zhì)量高, 質(zhì)控測(cè)評(píng)成績(jī)優(yōu)秀者

b)有科研能力,并有一定數(shù)量和質(zhì)量的論文發(fā)表 c)有獨(dú)創(chuàng)性工作成果,經(jīng)鑒定認(rèn)可者 d)受到有關(guān)部門或群眾嘉獎(jiǎng)?wù)?有下列情況者將受到懲處: a)工作質(zhì)量問題較多，質(zhì)控測(cè)評(píng)成績(jī)不合格； b)不遵守規(guī)章制度并造成一定影響； c)不求上進(jìn)。

4．3．7 本實(shí)驗(yàn)室工作人員獎(jiǎng)懲方法分精神及物質(zhì)兩類,經(jīng)實(shí)驗(yàn)室上報(bào)及有關(guān)部門批準(zhǔn)后執(zhí)行。

4．3．8 本實(shí)驗(yàn)室工作人員均建立業(yè)績(jī)檔案,實(shí)行能進(jìn)能出制度,不斷吸收高質(zhì)量人員,加強(qiáng)培訓(xùn)和提高,對(duì)于不適合本室工作的人員要及時(shí)調(diào)離。4．4 人員管理

4．4．1 實(shí)驗(yàn)室建立所有工作人員的技術(shù)檔案，包括：學(xué)歷、任職資格、發(fā)表論文、研究成果、培訓(xùn)等相關(guān)材料復(fù)印件。

4．4．2 技術(shù)檔案分文本檔案和電子檔案，文本檔案每年更新1 次，電子檔案隨時(shí)更新。

五、PCR 實(shí)驗(yàn)室清潔程序

1．目的：保證實(shí)驗(yàn)室環(huán)境的整潔，防止污染。

2．適用范圍：適于實(shí)驗(yàn)室工作環(huán)境、實(shí)驗(yàn)臺(tái)面、工作服、移液器等的清潔消毒工作。3．負(fù)責(zé)人： 操作人： 4．細(xì)則：

4．1 實(shí)驗(yàn)室地面必須平整、干凈，通道要利于通行，沒有無用的物品阻礙。

4．2 合理規(guī)劃實(shí)驗(yàn)室內(nèi)物品，做到擺放整齊、有序，無用的或使用效率低的物品放置到儲(chǔ)存處，常用的物品要容易尋找到。

4．3 抽屜、柜子、文件類物品要作好標(biāo)記，以方便識(shí)別。4．4 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后用2%戊二醛對(duì)臺(tái)面進(jìn)行清潔，并用移動(dòng)紫外燈進(jìn)行消毒。

4．5 每天對(duì)使用過的移液器用75%酒精進(jìn)行擦拭。每周1 次對(duì)移液器咀進(jìn)行75%酒精浸泡15 分鐘左右，若使用過程中發(fā)生污染應(yīng)隨時(shí)浸泡處理。

4．6 實(shí)驗(yàn)過程中如發(fā)生標(biāo)本或試劑外濺，應(yīng)立即用2%戊二醛滴上，濾紙蓋上半小時(shí)，然后用酒精擦洗，并用移動(dòng)紫外燈消毒。

4．7 每天實(shí)驗(yàn)前開啟各區(qū)的通風(fēng)系統(tǒng)，各區(qū)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，分別打開傳遞窗紫外燈、移動(dòng)紫外燈（對(duì)實(shí)驗(yàn)臺(tái)面消毒）、天花板紫外燈消毒實(shí)驗(yàn)室，每次開啟 30～60 分鐘。4．8 待紫外燈消毒時(shí)間足夠后，依次關(guān)閉各區(qū)紫外燈并記錄。

4．9 依次清潔三個(gè)區(qū)的實(shí)驗(yàn)臺(tái)面和地面，各區(qū)清潔消毒工具均專用，不可混用，注意按照單一方向流程的原則來進(jìn)行清潔。4．10 處理好各區(qū)廢棄物。

4．11 每周將工作服洗滌消毒，不同實(shí)驗(yàn)區(qū)的工作服隔開洗滌。

六、PCR 標(biāo)本唯一標(biāo)識(shí)編號(hào)規(guī)則

1．目的：保證標(biāo)本編號(hào)的唯一性，也是準(zhǔn)確發(fā)放報(bào)告的基礎(chǔ)。

2．適用范圍：使用核酸擴(kuò)增熒光檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室所開展的病毒以及基因檢測(cè)項(xiàng)目： 3．負(fù)責(zé)人： 操作人： 4．程序：

4．1 按檢測(cè)日期分類標(biāo)記

根據(jù)標(biāo)本送檢的日期，每天的標(biāo)本對(duì)應(yīng)標(biāo)記一種唯一的代號(hào)。4．2 按檢測(cè)類型分類標(biāo)記

根據(jù)檢測(cè)項(xiàng)目的不同，每種檢測(cè)項(xiàng)目對(duì)應(yīng)標(biāo)記一種唯一的代號(hào)。4．3 按驗(yàn)單接收順序編號(hào)

在同種檢測(cè)類型的驗(yàn)單中，按驗(yàn)單順序編號(hào)。4．4 特殊標(biāo)本的編號(hào)

如有特殊情況，應(yīng)在標(biāo)記前面增加特異字母區(qū)別開。4．5 編號(hào)步驟 a）對(duì)當(dāng)天送來的標(biāo)本，根據(jù)編號(hào)的基本原則編號(hào)，每個(gè)樣本的每個(gè)檢測(cè)項(xiàng)目對(duì)應(yīng)一個(gè)唯一的編號(hào)。

b）用筆在每張檢驗(yàn)申請(qǐng)單和對(duì)應(yīng)的樣品管上作好相同的標(biāo)記。

c）做好標(biāo)本的接收記錄，每個(gè)樣本的記錄都應(yīng)包括以下信息：接收時(shí)間、醫(yī)院、科室、送檢醫(yī)生、患者姓名、性別、年齡、標(biāo)本類別、標(biāo)本狀態(tài)、送標(biāo)本者、接收人、檢驗(yàn)單號(hào)、標(biāo)本唯一統(tǒng)編號(hào)等。

d）處理好樣品、點(diǎn)樣后，將反應(yīng)管放入擴(kuò)增儀上開始擴(kuò)增。

f）擴(kuò)增得到結(jié)果后，先在統(tǒng)計(jì)簿上填入結(jié)果，作好記錄，再一一把實(shí)驗(yàn)結(jié)果填入相應(yīng)申請(qǐng)單。

g）發(fā)放檢驗(yàn)報(bào)告單。

七、PCR 基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室的要求

1．目的：規(guī)定在各區(qū)內(nèi)所進(jìn)行的工作及其操作。2．適用范圍：所有在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行的工作。3．負(fù)責(zé)人： 操作人： 4．程序：

一、臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的設(shè)計(jì)

（一）臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室區(qū)域設(shè)計(jì)原則。原則上臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)當(dāng)設(shè)置以下區(qū)域：試劑儲(chǔ)存和準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增區(qū)、擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。這4個(gè)區(qū)域在物理空間上必須是完全相互獨(dú)立的，各區(qū)域無論是在空間上還是在使用中，應(yīng)當(dāng)始終處于完全的分隔狀態(tài)，不能有空氣的直接相通。根據(jù)使用儀器的功能，區(qū)域可適當(dāng)合并。例如使用實(shí)時(shí)熒光PCR儀，擴(kuò)增區(qū)、擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)可合并；采用樣本處理、核酸提取及擴(kuò)增檢測(cè)為一體的自動(dòng)化分析儀，則標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增區(qū)、擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)可合并。各區(qū)的功能是：

1.試劑儲(chǔ)存和準(zhǔn)備區(qū)：貯存試劑的制備、試劑的分裝和擴(kuò)增反應(yīng)混合液的準(zhǔn)備，以及離心管、吸頭等消耗品的貯存和準(zhǔn)備。

2.標(biāo)本制備區(qū)：核酸（RNA、DNA）提取、貯存及其加入至擴(kuò)增反應(yīng)管。對(duì)于涉及臨床樣本的操作，應(yīng)符合生物安全二級(jí)實(shí)驗(yàn)室防護(hù)設(shè)備、個(gè)人防護(hù)和操作規(guī)范的要求。

3.擴(kuò)增區(qū)：cDNA合成、DNA擴(kuò)增及檢測(cè)。

4.擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)：擴(kuò)增片段的進(jìn)一步分析測(cè)定，如雜交、酶切電泳、變性高效液相分析、測(cè)序等。

（二）臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的空氣流向。臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的空氣流向可按照試劑儲(chǔ)存和準(zhǔn)備區(qū)→標(biāo)本制備區(qū)→擴(kuò)增區(qū)→擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)進(jìn)行，防止擴(kuò)增產(chǎn)物順空氣氣流進(jìn)入擴(kuò)增前的區(qū)域?？砂凑諒脑噭﹥?chǔ)存和準(zhǔn)備區(qū)→標(biāo)本制備區(qū)→擴(kuò)增區(qū)→擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)方向空氣壓力遞減的方式進(jìn)行?？赏ㄟ^安裝排風(fēng)扇、負(fù)壓排風(fēng)裝置或其他可行的方式實(shí)現(xiàn)。

（三）工作區(qū)域儀器設(shè)備配置標(biāo)準(zhǔn)。

1.試劑儲(chǔ)存和準(zhǔn)備區(qū)。

（1）2～8℃和-20℃以下冰箱。

（2）混勻器。

（3）微量加樣器（覆蓋0.2-1000μl）。

（4）可移動(dòng)紫外燈（近工作臺(tái)面）。

（5）消耗品：一次性手套、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭。

（6）專用工作服和工作鞋(套)。

（7）專用辦公用品。

2.標(biāo)本制備區(qū)。

（1）2-8℃冰箱、-20℃或-80℃冰箱。

（2）高速離心機(jī)。

（3）混勻器。

（4）水浴箱或加熱模塊。

（5）微量加樣器（覆蓋0.2-1000μl）。

（6）可移動(dòng)紫外燈（近工作臺(tái)面）。

（7）生物安全柜。

（8）消耗品：一次性手套、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾芯）。

（9）專用工作服和工作鞋(套)。

（10）專用辦公用品。

（11）如需處理大分子DNA，應(yīng)當(dāng)具有超聲波水浴儀。

3.擴(kuò)增區(qū)。

（1）核酸擴(kuò)增儀。

（2）微量加樣器（覆蓋0.2-1000μl），（視情況定）。

（3）可移動(dòng)紫外燈（近工作臺(tái)面）。

（4）消耗品：一次性手套、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾芯）。

（5）專用工作服和工作鞋。

（6）專用辦公用品。

4.擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。

視檢驗(yàn)方法不同而定，基本配置如下：

（1）微量加樣器（覆蓋0.2-1000μl）。

（2）可移動(dòng)紫外燈（近工作臺(tái)面）。

（3）消耗品：一次性手套、加樣器吸頭（帶濾芯）。

（4）專用工作服和工作鞋。

（5）專用辦公用品。

上述各區(qū)域儀器設(shè)備配備為基本配備，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)當(dāng)根據(jù)自己使用的擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)或試劑的特點(diǎn)，對(duì)儀器設(shè)備進(jìn)行必要的增減。

二、臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室工作基本原則

(一)進(jìn)入各工作區(qū)域應(yīng)當(dāng)嚴(yán)格按照單一方向進(jìn)行，即試劑儲(chǔ)存和準(zhǔn)備區(qū)→標(biāo)本制備區(qū)→擴(kuò)增區(qū)→ 擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。

(二)各工作區(qū)域必須有明確的標(biāo)記，不同工作區(qū)域內(nèi)的設(shè)備、物品不得混用。

(三)不同的工作區(qū)域使用不同的工作服（例如不同的顏色）。工作人員離開各工作區(qū)域時(shí)，不得將工作服帶出。

(四)實(shí)驗(yàn)室的清潔應(yīng)當(dāng)按試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)→標(biāo)本制備區(qū)→擴(kuò)增區(qū)→擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)的方向進(jìn)行。不同的實(shí)驗(yàn)區(qū)域應(yīng)當(dāng)有其各自的清潔用具以防止交叉污染。

(五)工作結(jié)束后，必須立即對(duì)工作區(qū)進(jìn)行清潔。工作區(qū)的實(shí)驗(yàn)臺(tái)表面應(yīng)當(dāng)可耐受諸如次氯酸鈉的化學(xué)物質(zhì)的消毒清潔作用。實(shí)驗(yàn)臺(tái)表面的紫外照射應(yīng)當(dāng)方便有效。由于紫外照射的距離和能量對(duì)去污染的效果非常關(guān)鍵，因此可使用可移動(dòng)紫外燈（254nm波長(zhǎng)），在工作完成后調(diào)至實(shí)驗(yàn)臺(tái)上60～90cm內(nèi)照射。由于擴(kuò)增產(chǎn)物僅幾百或幾十堿基對(duì)（bp），對(duì)紫外線損傷不敏感，因此紫外照射擴(kuò)增片段必須延長(zhǎng)照射時(shí)間，最好是照射過夜。

(六)實(shí)驗(yàn)室的安全工作制度或安全標(biāo)準(zhǔn)操作程序，所有操作符合《實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求》（GB19489-2008）。

三、臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室各區(qū)域工作注意事項(xiàng)

(一)試劑儲(chǔ)存和準(zhǔn)備區(qū)。貯存試劑和用于標(biāo)本制備的消耗品等材料應(yīng)當(dāng)直接運(yùn)送至試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)，不能經(jīng)過擴(kuò)增檢測(cè)區(qū)，試劑盒中的陽性對(duì)照品及質(zhì)控品不應(yīng)當(dāng)保存在該區(qū)，應(yīng)當(dāng)保存在標(biāo)本處理區(qū)。

(二)標(biāo)本制備區(qū)。由于在樣本混合、核酸純化過程中可能會(huì)發(fā)生氣溶膠所致的污染，可通過在本區(qū)內(nèi)設(shè)立正壓條件，避免從鄰近區(qū)進(jìn)入本區(qū)的氣溶膠污染。為避免樣本間的交叉污染，加入待測(cè)核酸后，必須蓋好含反應(yīng)混合液的反應(yīng)管。對(duì)具有潛在傳染危險(xiǎn)性的材料，必須在生物安全柜內(nèi)開蓋，并有明確的樣本處理和滅活程序。

(三)擴(kuò)增區(qū)。為避免氣溶膠所致的污染，應(yīng)當(dāng)盡量減少在本區(qū)內(nèi)的走動(dòng)。必須注意的是，所有經(jīng)過檢測(cè)的反應(yīng)管不得在此區(qū)域打開。

(四)擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。核酸擴(kuò)增后產(chǎn)物的分析方法多種多樣，如膜上或微孔板或芯片上探針雜交方法（放射性核素標(biāo)記或非放射性核素標(biāo)記）、直接或酶切后瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳、Southern轉(zhuǎn)移、核酸測(cè)序方法、質(zhì)譜分析等。本區(qū)是最主要的擴(kuò)增產(chǎn)物污染來源，因此必須注意避免通過本區(qū)的物品及工作服將擴(kuò)增產(chǎn)物帶出。在使用PCR-ELISA方法檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，必須使用洗板機(jī)洗板，廢液必須收集至1 mol/L HCl中，并且不能在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)傾倒，而應(yīng)當(dāng)至遠(yuǎn)離PCR實(shí)驗(yàn)室的地方棄掉。用過的吸頭也必須放至1 mol/L HCl中浸泡后再放到垃圾袋中按程序處理，如焚燒。

由于本區(qū)有可能會(huì)用到某些可致基因突變和有毒物質(zhì)如溴化乙錠、丙烯酰胺、甲醛或放射性核素等，故應(yīng)當(dāng)注意實(shí)驗(yàn)人員的安全防護(hù)。

八、PCR 廢棄物的處理程序

1．目的：保證實(shí)驗(yàn)室、實(shí)驗(yàn)人員和外部環(huán)境的安全。

2．適用范圍：核酸擴(kuò)增熒光檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室常用化學(xué)試劑（NaOH、EDTA、乙醇、生理鹽水等）、實(shí)驗(yàn)室廢棄物的處理； 3．負(fù)責(zé)人： 操作人： 4．細(xì)則：

4.1 科室職責(zé)應(yīng)對(duì)本室工作人員講明本程序在預(yù)防交叉、實(shí)驗(yàn)室污染及切斷傳播途徑中的重 要性，并要求嚴(yán)格執(zhí)行。

4.2 實(shí)驗(yàn)室所有垃圾，裝入專用污物袋內(nèi)，各區(qū)備有：生活垃圾袋（黑色）及生物污染垃圾 袋（黃色）。使用過的一次性消耗品(如試管、吸頭、離心管、等)，先放入10%次氯酸鈉溶 液中浸泡2～4 小時(shí)后，再放入黃色垃圾袋內(nèi)，使用過的手套、鞋套等直接放入黃色垃圾袋 內(nèi)集中處理。

4.3 夾取標(biāo)本的工具，如鉗、鑷、接種環(huán)、吸管等，用后均應(yīng)消毒清潔，進(jìn)行微生物檢驗(yàn)時(shí)，應(yīng)重新滅菌，金屬工具可燒灼滅菌或消毒液浸泡；玻璃制品干熱或壓力蒸汽滅菌。4.4 一次性塑料痰盂，用2%戊二醛液浸泡2～4小時(shí)后，放入黃色垃圾袋內(nèi)集中處理。4.5 廢棄標(biāo)本如血、尿、胸水、腹水、腦脊液、唾液、胃液、腸液、關(guān)節(jié)腔液等用10%的84 液浸泡2～4小時(shí)后，集中處理。

4.6 盛標(biāo)本的容器，若為一次性使用的紙質(zhì)容器及其外面包被的廢紙，放入污物袋里 處理；對(duì)可再次使用的玻璃、塑料或搪瓷容器，煮沸15 分鐘或加入10%次氯酸鈉溶液浸泡2～4 小時(shí)，消毒液每日更換，消毒后用洗滌劑及流水刷洗，瀝干，用于微生物培養(yǎng)采樣者，用壓力蒸汽滅菌后備用。

4.7 廢棄標(biāo)本及其容器裝入黃色垃圾袋內(nèi)、封閉，污物處理中心處理。

九、基因擴(kuò)增檢測(cè)實(shí)驗(yàn)及結(jié)果分析

1、目的：保證擴(kuò)增及結(jié)果分析的標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化。2．適用范圍：適用于本室使用的普通離心機(jī)。3．負(fù)責(zé)人： 操作人：

4、標(biāo)準(zhǔn)程序：

4.2.8 發(fā)放報(bào)告：及時(shí)登記檢測(cè)結(jié)果記錄，發(fā)放臨床報(bào)告。

4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果無效的判斷標(biāo)準(zhǔn)：出現(xiàn)下述四種情況中的任何一種或多種，當(dāng)次實(shí)驗(yàn)結(jié)果不可 發(fā)，查找原因，重做實(shí)驗(yàn)。4.3.1 陰性對(duì)照出現(xiàn)擴(kuò)增。4.3.2 陽性對(duì)照無擴(kuò)增。

4.3.3 大批甚至所有的標(biāo)本都擴(kuò)增了。4.3.4 室內(nèi)質(zhì)控血清檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)失控情況，實(shí)驗(yàn)失控的具體標(biāo)準(zhǔn)詳見室內(nèi)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)操作程 序。

4.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效的判斷標(biāo)準(zhǔn)：達(dá)到下列要求后，當(dāng)次實(shí)驗(yàn)有效，可以發(fā)放結(jié)果。4.4.1 陰性對(duì)照沒有擴(kuò)增，陽性對(duì)照擴(kuò)增。

4.4.2 陽性標(biāo)準(zhǔn)品梯度曲線平滑均勻，斜率、截距和相關(guān)系數(shù)三個(gè)參數(shù)的數(shù)值均在范圍內(nèi)。4.4.3 室內(nèi)質(zhì)控血清檢測(cè)結(jié)果處于在控狀態(tài)，具體標(biāo)準(zhǔn)詳見

十、臨床標(biāo)本的保存操作程序

1．目的：臨床標(biāo)本正確保存，以便必要時(shí)復(fù)查。2．適用范圍：分子診斷室的所有臨床檢測(cè)標(biāo)本。3．負(fù)責(zé)人： 操作人： 4．程序：

4．1 處理前的標(biāo)本保存

a）全血標(biāo)本可4℃下短期（24h 內(nèi)）保存，長(zhǎng)期保存則需分離出血清（血漿），保存于-20℃下。

b）咽拭子、痰或胸腹水、腦脊液、膿液標(biāo)本短保存于-70℃下。4．2 報(bào)告發(fā)出后的標(biāo)本保存：

a）提取的核酸標(biāo)本當(dāng)天檢測(cè)可置4℃保存，如當(dāng)天不檢測(cè)應(yīng)置-20℃保存。報(bào)告發(fā)出后第二天丟棄。

b）原始血清/血漿樣本在報(bào)告發(fā)出后放入低溫冰箱-20℃保存1 個(gè)星期，以備復(fù)查。超過1 個(gè)星期保存期的標(biāo)本由室負(fù)責(zé)人酌情處理，一般按生物傳染性物品統(tǒng)一處理。

c）血清/血漿標(biāo)本放置低溫冰箱保存時(shí)須有記錄，按編號(hào)順序存放，并由專人負(fù)責(zé)管理。4．3 特殊標(biāo)本的處理：

對(duì)暫不檢測(cè)的項(xiàng)目和規(guī)定時(shí)間外收到的零散樣本，要隨時(shí)登記和交班，以免漏檢，遺失和延誤檢驗(yàn)。對(duì)特殊樣本或特殊病人的樣本，實(shí)行“首接”負(fù)責(zé)制，所謂特殊樣本是指難于采集的樣本，以及特殊病人的樣本一律實(shí)行“首接”負(fù)責(zé)制，無論那位工作人員，一旦收到樣本后，均須負(fù)其責(zé)任，不得以任何借口推托，及時(shí)和正確保管和轉(zhuǎn)送樣本到有關(guān)實(shí)驗(yàn)室或有關(guān)人員，同時(shí)作交班記錄和雙簽名。

十一、臨床標(biāo)本的采集、運(yùn)送、接收程序

1．目的：規(guī)范臨床待檢標(biāo)本的正確采集、送檢和處理。2．適用范圍：分子診斷室的所有臨床檢測(cè)標(biāo)本。3．負(fù)責(zé)人： 操作人： 4．程序： 4．1 標(biāo)本的采集

4．1．1 標(biāo)本由臨床各科室接受過臨床基因擴(kuò)增檢測(cè)有關(guān)標(biāo)本采集、保存、運(yùn)輸知識(shí)培訓(xùn)的醫(yī)護(hù)人員采集并送至實(shí)驗(yàn)室。4．1．2 標(biāo)本采集要求

a）血液標(biāo)本：用2ml 真空采集管或1.5ml 高壓滅菌離心管采集血液標(biāo)本，血標(biāo)本采集后在2 小時(shí)內(nèi)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室。離心（檢驗(yàn)單與標(biāo)本一道）后用一次性吸管吸取血清或血漿加入經(jīng)消毒的1.5ml 的離心管中，編號(hào)。

b）痰標(biāo)本：用帶蓋的無菌一次性塑料瓶收集清晨第一口痰標(biāo)本送檢。（對(duì)于無痰或少痰的患者，可用45℃加溫的100g/L NaCl 水溶液霧化吸入或改變體位以使痰液易于咳出；對(duì)于小兒可以輕壓胸骨柄上方以誘導(dǎo)咳痰，用消毒棉拭子刺激喉部引起咳嗽反射，用棉拭子采集標(biāo)本。）標(biāo)本在室溫下保存不能超過24 小時(shí)。4．2 標(biāo)本的運(yùn)送

標(biāo)本采集后，密閉、標(biāo)（貼）姓名，應(yīng)盡可能快的送至檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室，如運(yùn)送時(shí)間需2 小時(shí)以上，必須用冰盒送至實(shí)驗(yàn)室。4．5 接收

4．5．1 嚴(yán)格對(duì)各類樣本的查對(duì)和雙簽制度，對(duì)病房各樣本及時(shí)進(jìn)行驗(yàn)收，查對(duì)，不符合要求的樣本一律退回，并有書面記錄。

十二、PCR 生物安全防護(hù)措施

1．目的：預(yù)防工作人員在實(shí)驗(yàn)過程中被感染或污染。2．適用范圍：適用于本室所有工作人員。3．負(fù)責(zé)人： 操作人： 4．細(xì)則： 4．1 實(shí)驗(yàn)人員在實(shí)施生物防護(hù)措施時(shí)，應(yīng)嚴(yán)格遵守各項(xiàng)相應(yīng)的規(guī)章制度，建立起強(qiáng)烈的生物防護(hù)意識(shí)。

4．2 每天更換廢液缸的2%戊二醛溶液，并保證2%戊二醛溶液用量為廢液缸內(nèi)總液量的五分之一左右。

配置消毒液時(shí)，正確量取足量的消毒劑（用量杯，保證濃度），水的用量也要正確，缸體密封性良好。

4．3 實(shí)驗(yàn)臺(tái)面日常清潔時(shí)使用75%的酒精擦拭。

4．4 每區(qū)每次實(shí)驗(yàn)后紫外燈照射30～60 分鐘，如有需要可延長(zhǎng)照射時(shí)間。

4．5 所有來自病人的血液或體液標(biāo)本均應(yīng)視作傳染源，因此在標(biāo)本的采集、運(yùn)輸過程中，標(biāo)本容器應(yīng)完好無泄漏。

4．6 處理標(biāo)本時(shí)應(yīng)穿工作服、戴手套，以免沾上皮膚。如手或其它部位的皮膚沾上血液或體液標(biāo)本以及試劑，應(yīng)立即沖洗干凈。有下列情況之一者，需另外消毒：手接觸有傳染性的微生物，水龍頭、水池肥皂可能被污染，工作服可能被大量細(xì)菌污染。消毒劑可用“84”消毒液。4．7 在實(shí)驗(yàn)過程中，病人標(biāo)本（血液、體液）或試劑不慎濺入眼內(nèi)應(yīng)立即用清水洗。4．8 實(shí)驗(yàn)過程中在使用針具等銳器時(shí)，盡量小心防止受傷。若被銳器刺破時(shí)，應(yīng)立即脫下手套，盡量擠壓傷處，使血流出，然后用碘酒、酒精消毒，必要時(shí)進(jìn)行預(yù)防補(bǔ)救措施。4．9 在實(shí)驗(yàn)過程中病人標(biāo)本（血液、體液）外漏時(shí)，應(yīng)立即用2%戊二醛滴上，濾紙或紗布蓋上半小時(shí)，然后用酒精擦洗，并用紫外燈消毒。

4．10 實(shí)驗(yàn)完畢離開時(shí)，應(yīng)脫下所有該實(shí)驗(yàn)區(qū)個(gè)人防護(hù)裝備。4．11 實(shí)驗(yàn)完畢后應(yīng)對(duì)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行紫外消毒。

4．12 遇有意外事故應(yīng)立即報(bào)告科室負(fù)責(zé)人，當(dāng)事人應(yīng)立即注射相關(guān)疫苗或進(jìn)行預(yù)防性治療，并進(jìn)行醫(yī)學(xué)觀察，嚴(yán)重者應(yīng)報(bào)告技術(shù)負(fù)責(zé)人。

十三、PCR 實(shí)驗(yàn)室化學(xué)試劑配制程序

1．目的：保證實(shí)驗(yàn)中用到的各種溶液符合實(shí)驗(yàn)要求。

2．適用范圍：核酸擴(kuò)增熒光檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室常用溶液：4%NaOH 溶液、75%酒精、消毒劑（三氯異氰尿酸或 二氯異氰尿酸鈉）、2%戊二醛溶液等。3．負(fù)責(zé)人： 操作人： 4．程序： 4．4 化學(xué)試劑的配制：

4．4．1 用具：干燥潔凈的250ml 量桶一只，1000ml 量桶一只，1000ml 燒杯一只，三角燒瓶?jī)芍?，天平一架?00ml 塑料試劑瓶、2000ml 廣口瓶各一只。4．4．2 配制步驟：

4．4．2．1 配制4%NaOH 溶液: a）用天平稱取4 克分析純的NaOH 固體，置于一只三角燒瓶中。

b）用250ml 量桶準(zhǔn)確取100ml 水，緩緩注入盛放NaOH 固體的三角燒瓶中。c）搖蕩三角燒瓶使NaOH 固體充分溶解。

d）然后緩緩傾倒入100ml 塑料試劑瓶中密封保存?zhèn)溆谩?．4．2．2 配制消毒劑: a）一般桌面、器具和地面的消毒只要使有效氯達(dá)到500mg/L，即可達(dá)到消毒作用。

b）消毒劑為粉狀（20 克/袋），如配制一升的消毒劑溶液，則取500g，倒入燒杯中，緩緩加入1000ml水充分溶解，備用。

c）如需加大消毒力度，則有效氯濃度加大。4．4．2．3 配制2%戊二醛溶液: a）準(zhǔn)確量取戊二醛原液20ml 倒入1000ml 燒杯中。

b）量取980ml 水，緩緩倒入1000ml 燒杯中，混勻，加至2000ml 廣口瓶中備用。注意事項(xiàng)：每份配制好的溶液保質(zhì)期為14 天

十四、PCR 應(yīng)急處理程序

1．目的：在實(shí)際工作中，儀器設(shè)備發(fā)生故障、試劑盒發(fā)生質(zhì)量問題時(shí)，為保證檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性、及時(shí)，應(yīng)正確采取應(yīng)急措施，最大程度上避免或減輕不利影響。

2．適用范圍：適用于滿足核酸擴(kuò)增熒光檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)需要并可能對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果造成誤差的儀器設(shè)備和試劑盒。3．負(fù)責(zé)人： 4．細(xì)則： 4．1 核酸擴(kuò)增熒光檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室工作人員在職責(zé)范圍內(nèi)均有責(zé)任熟悉各種儀器和相關(guān)設(shè)備的性能、要求、維護(hù)和保養(yǎng)、常見故障的排除、尤其要嚴(yán)格按照操作規(guī)程操作。

4．2 工作人員在職責(zé)范圍內(nèi)均有責(zé)任有意識(shí)地注意以求及時(shí)發(fā)現(xiàn)并報(bào)告儀器設(shè)備和試劑盒的異常情況。

4．3 作為應(yīng)急處理，潛在著一定的可能影響檢測(cè)質(zhì)量的不確定因素。室負(fù)責(zé)人負(fù)責(zé)在第一時(shí)間檢查核實(shí)應(yīng)急措施的有效性。4．4 儀器設(shè)備故障

4．4．1 室負(fù)責(zé)人接到異常情況報(bào)警后，立即現(xiàn)場(chǎng)確認(rèn)異常情況的性質(zhì)：觀察有誤、誤操作、偶發(fā)現(xiàn)象或確屬不能立即排除的故障。

4．4．2 用紅牌故障標(biāo)志標(biāo)示故障儀器，以防被錯(cuò)誤使用。

4．4．3 有滿足要求的替用設(shè)備的，啟用替用設(shè)備（準(zhǔn)用儀器）。借用其他部門儀器設(shè)備時(shí)，及時(shí)聯(lián)系借用并核實(shí)該設(shè)備的使用狀態(tài)。替用、借用或備用設(shè)備的使用在滿足質(zhì)量要求的同時(shí)，必須同時(shí)滿足實(shí)驗(yàn)室管理措施（特別是防污染）的要求。

4．4．4 不能解決的問題，應(yīng)及時(shí)與供應(yīng)方會(huì)同解決。根據(jù)雙方合同約定，及時(shí)通知供應(yīng)方。供應(yīng)方技術(shù)支持人員將在規(guī)定的時(shí)間內(nèi)隨身攜帶備用設(shè)備到達(dá)現(xiàn)場(chǎng)。

4．4．5 儀器維修后，必須經(jīng)驗(yàn)收合格并供需雙方簽字，調(diào)試實(shí)驗(yàn)通過后才能重新啟用。取下紅色故障標(biāo)示（暫停使用），換上藍(lán)色正常標(biāo)示（正常使用）。4．4．6 科室主任須檢查并隨時(shí)跟蹤所采取措施的有效性。

4．4．7 對(duì)未能及時(shí)排除故障時(shí)，必須及時(shí)上報(bào)科室，在科主任批準(zhǔn)下，應(yīng)積極聯(lián)系附近的其他已得到衛(wèi)生部臨檢中心認(rèn)證的臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)，以滿足病人和臨床或科研需求。

4．5 試劑盒質(zhì)量發(fā)生問題，經(jīng)核實(shí)后，及時(shí)通知供貨商迅速更換另一批次試劑，使用前需先作質(zhì)量檢測(cè)，合格后方可使用。

4．6 儀器設(shè)備故障或試劑質(zhì)量問題不能得到解決，預(yù)期將會(huì)影響到檢測(cè)報(bào)告的及時(shí)發(fā)出，可將標(biāo)本送至其它已得到衛(wèi)生部臨檢中心認(rèn)證的臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室檢。4．7 影響到檢測(cè)報(bào)告發(fā)出的情況，應(yīng)在應(yīng)急處理記錄表作記錄。

十五、試劑的質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)操作程序 1．目的：保證每批用于臨床實(shí)驗(yàn)的試劑的質(zhì)量良好，符合要求。2．適用范圍：各種用于臨床實(shí)驗(yàn)的核酸擴(kuò)增熒光檢測(cè)試劑。3．負(fù)責(zé)人： 操作人： 4．程序：

4．1 收到試劑后，目測(cè)試劑是否處在凍存狀態(tài)。

4．2 核對(duì)試劑品種和數(shù)量并檢查包裝：外包裝（廠名廠址、、批準(zhǔn)文號(hào)、批號(hào)和有效期等）；內(nèi)包裝（試劑瓶完整性、試劑配備品種完整性、使用說明書有否等）。4．3 及時(shí)將試劑轉(zhuǎn)入－20℃冰箱保存。將上述檢測(cè)核對(duì)情況在記錄本上登記。

4．4 最遲在前批次試劑存量尚可維持常規(guī)實(shí)驗(yàn)一周時(shí)，按如下要求對(duì)新批號(hào)試劑進(jìn)行效驗(yàn)實(shí)驗(yàn)。

4．5 效驗(yàn)實(shí)驗(yàn)：

4．5．1 要求設(shè)置：空白對(duì)照、陰性對(duì)照、陽性對(duì)照、室內(nèi)質(zhì)控各一，陽性標(biāo)準(zhǔn)品梯度（104、105、106、108）。

4．5．2 出現(xiàn)如下情況中任何一種的，判斷為試劑不合格，不能用于臨床檢測(cè)： a）空白對(duì)照出現(xiàn)擴(kuò)增。如擴(kuò)增曲線CT 值大于25，需重復(fù)實(shí)驗(yàn)確證試劑污染。

b）陽性對(duì)照和陽性標(biāo)準(zhǔn)品均未檢出，或陽性對(duì)照未檢出而陽性標(biāo)準(zhǔn)品檢出率大幅下降，表示試劑失效或檢測(cè)靈敏度大幅下降。

4．5．3 陽性對(duì)照未檢出，陽性標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)正常，提示樣品提取液可能存在問題。重復(fù)新舊提取液陽性對(duì)照實(shí)驗(yàn)，確定提取液失效問題。更換提取液后該批試劑方可使用。

4．5．4 空白對(duì)照無擴(kuò)增，陰性對(duì)照有擴(kuò)增，排除其他污染可能性后，提取液存在污染可能。單獨(dú)用提取液點(diǎn)樣上機(jī)，出現(xiàn)擴(kuò)增，需更換提取液后方可使用該批試劑。

4．5．5 陽性對(duì)照檢出，陽性標(biāo)準(zhǔn)品未檢出或擴(kuò)增曲線明顯系統(tǒng)性CT 值偏大5 個(gè)循環(huán)以上。提示陽性標(biāo)準(zhǔn)品存在問題。更換陽性標(biāo)準(zhǔn)品后該批試劑方可投入使用。

4．5．6 空白對(duì)照、陰性對(duì)照無擴(kuò)增，陽性對(duì)照正常檢出，陽性標(biāo)準(zhǔn)品導(dǎo)出的標(biāo)準(zhǔn)曲線之斜率（－2.9～－3.9）、截距（26～34）、相關(guān)性（﹤－0.99）均在使用范圍內(nèi)，表明該批試劑良好，可以投入臨床使用。4．6 將實(shí)驗(yàn)結(jié)果歸入記錄。

十六、離心機(jī)操作維護(hù)程序

1．目的：保證離心機(jī)的正常使用。

2．適用范圍：適用于本室使用的普通離心機(jī)。3．負(fù)責(zé)人： 操作人： 4.性能參數(shù):見說明書。5．程序：

5．1 離心機(jī)應(yīng)放置在水平堅(jiān)固的地板或平臺(tái)上，并力求使儀器處于水平位置以免離心時(shí)造成儀器振蕩。

5．2 打開電源開關(guān)，將預(yù)先平衡好的樣品對(duì)稱放置于轉(zhuǎn)頭的樣品架上，關(guān)閉機(jī)蓋。5．3 旋動(dòng)定時(shí)旋鈕設(shè)定離心時(shí)間，緩慢旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)速調(diào)節(jié)旋鈕使儀器轉(zhuǎn)速達(dá)到預(yù)定要求。5．4 離心完畢后，將轉(zhuǎn)速調(diào)節(jié)旋鈕調(diào)回零位，關(guān)閉電源開關(guān)。

5．5 待離心機(jī)完全停止轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)打開機(jī)蓋，取出離心樣品，再次關(guān)閉機(jī)蓋結(jié)束離心。5．6 離心室的清潔：為了避免樣本等殘留物的污染，應(yīng)經(jīng)常對(duì)離心機(jī)外殼和離心室進(jìn)行清潔處理。對(duì)離心室清潔，應(yīng)先打開離心機(jī)蓋，撥掉電源線，用專用設(shè)備將離心機(jī)轉(zhuǎn)子旋下，再用中性去污劑（70%的異丙醇/水混合物或乙醇去污染）清潔離心室；離心室內(nèi)的橡膠密封圈經(jīng)去污劑處理后，用水沖洗，再用甘油潤(rùn)滑。

5．7 轉(zhuǎn)子的清潔：轉(zhuǎn)子會(huì)被樣本殘留物污染，也可能會(huì)被某些化學(xué)試劑腐蝕，因此應(yīng)對(duì)轉(zhuǎn)子每月進(jìn)行清潔維護(hù)。每月用中性的清潔劑清潔轉(zhuǎn)子一次，并在儀器維護(hù)記錄本上作好記錄，以延長(zhǎng)轉(zhuǎn)子的壽命。6.儀器維護(hù)

(1)為確保安全和離心效果,儀器必須放置在堅(jiān)固水平的臺(tái)面上,塑料蓋門上不得放置任何物品,樣品必須對(duì)稱放置,并在開機(jī)前確保已擰緊螺母。

(2)應(yīng)經(jīng)常檢查轉(zhuǎn)頭及試驗(yàn)用的離心管是否有裂紋,老化等現(xiàn)象,如有須及時(shí)更換.(3)試驗(yàn)完畢后,需將儀器擦拭干凈,以防腐蝕.(4)如樣品比重超過1.2g/cm3,最高轉(zhuǎn)速n 按下式計(jì)算:n=nmax*√--1.2/樣呂比重.(5)當(dāng)電機(jī)碳刷長(zhǎng)度小于6mm 時(shí),必須及時(shí)更換.(6)在離心機(jī)未停穩(wěn)時(shí)不得開蓋.(7)儀器必須有可靠接地.(8)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,請(qǐng)關(guān)閉后面的電源開關(guān),撥掉電源插頭時(shí),請(qǐng)不要忘了打開后面的電源開關(guān).(9)該儀器在日常使用中請(qǐng)注意符合“5.6,5.7”要求。(10)嚴(yán)格按照儀器的開關(guān)機(jī)程序關(guān)機(jī)。7.期間核查

(1)本儀器不需要特別的周期間隔。

(2)校準(zhǔn)物均為與ICSH 之標(biāo)準(zhǔn)相符合的校準(zhǔn)物，測(cè)定值偏差均不超過其規(guī)定值。

十七、冰箱操作維護(hù)規(guī)程

1．目的：對(duì)冰箱進(jìn)行適當(dāng)?shù)木S護(hù)，以確保冰箱的正常使用。2．適用范圍：本實(shí)驗(yàn)室使用的各種品牌、型號(hào)的冰箱。3．負(fù)責(zé)人： 操作人： 4.性能參數(shù):見說明書。5．程序：

4．1 開、關(guān)機(jī)：冰箱按說明書要求放好后，插上電源線，冷藏室溫度開關(guān)置于4℃，冷凍室溫度開關(guān)置于-20℃，2 小時(shí)后用溫度計(jì)確認(rèn)。系統(tǒng)進(jìn)入正常運(yùn)行狀態(tài)后即可使用。4．2 外冰箱應(yīng)放置于水平地面并留有一定的散熱空間。外接電源電壓必須匹配，并要求有良好的接地線。

4．3 冰箱內(nèi)禁止存放與本實(shí)驗(yàn)室無關(guān)的物品。

4．4 放入冰箱內(nèi)的所有試劑、樣品、質(zhì)控品等必須密封保存。

4．5 保持冰箱出水口通暢；非自動(dòng)除霜冰箱應(yīng)在每月底除霜；月底清潔冰箱，清潔時(shí)切斷電源，用軟布蘸水擦拭冰箱內(nèi)外，必要時(shí)可用中性洗滌劑。4．6 每日觀察冰箱內(nèi)溫度并記錄于冰箱的質(zhì)控圖上。

4．7 若溫度超出規(guī)定范圍，調(diào)節(jié)溫控使其回到正常范圍，并進(jìn)行記錄。

4．8 若溫控調(diào)節(jié)無效，報(bào)請(qǐng)?jiān)O(shè)備科維修，修理后須驗(yàn)收合格并簽字后方能正常使用。6.儀器維護(hù)

(1)使用注意。該儀器在日常使用中請(qǐng)注意符合“4.注意事項(xiàng)”要求

(2)廢液瓶滿要及時(shí)倒掉廢液，切勿強(qiáng)行扯動(dòng)紅黃兩根管來打開瓶蓋，檢查廢液瓶是否漏氣，防止低真空出現(xiàn)。

(3)當(dāng)出現(xiàn)堵孔時(shí)，按自動(dòng)沖洗鍵沖洗管道。(4)嚴(yán)格按照儀器的關(guān)機(jī)程序關(guān)機(jī)。7.期間核查

(1 冰箱不需要特別的周期間隔。

(2)校準(zhǔn)物均為與ICSH 之標(biāo)準(zhǔn)相符合的校準(zhǔn)物，測(cè)定值偏差均不超過其規(guī)定值。

十八、生物安全柜操作維護(hù)規(guī)程

1．目的：正確使用生物安全柜。

2．適用范圍：本SOP 適用于本實(shí)驗(yàn)室使用的生物安全柜。3．負(fù)責(zé)人： 操作人： 4.性能參數(shù):見說明書。5．程序：

5．1 新安裝或長(zhǎng)期未使用的生物安全柜，使用前必須用超凈真空吸塵器或不產(chǎn)生纖維的物品認(rèn)真進(jìn)行清潔工作。

5．2 接通電源，使用前應(yīng)提前15～30 分鐘同時(shí)開啟紫外燈和風(fēng)機(jī)組工作。

5．3 當(dāng)需要調(diào)節(jié)風(fēng)機(jī)風(fēng)速時(shí)，用生物安全柜操作面板上的風(fēng)速調(diào)節(jié)鈕進(jìn)行調(diào)節(jié)。風(fēng)機(jī)、照明均由指示燈指示其工作狀態(tài)。

5．4 工作臺(tái)面上禁止存放不必要的物品，以保持工作區(qū)的潔凈氣流不受干擾。

5．5 禁止在工作臺(tái)面上記錄書寫，工作時(shí)應(yīng)盡量避免作明顯擾動(dòng)氣流的動(dòng)作；禁止在預(yù)過濾進(jìn)風(fēng)口部位放置物品，以免擋住進(jìn)風(fēng)口造成進(jìn)風(fēng)量減少，降低凈化能力。

5．6 使用結(jié)束后，用消毒液清理工作臺(tái)面后打開紫外燈，15～30 分鐘后關(guān)閉紫外燈，關(guān)閉生物安全柜電源。每次使用生物安全柜后，均需對(duì)其進(jìn)行清潔。

5．7 根據(jù)環(huán)境潔凈程度，定期將預(yù)過濾器中的濾料拆下清洗，一般間隔時(shí)間為3～6 個(gè)月。5．8 定期（一般每半年1 次）計(jì)測(cè)工作區(qū)風(fēng)速，如發(fā)現(xiàn)不符合技術(shù)參數(shù)要求，則可調(diào)大風(fēng)機(jī)供電電壓。當(dāng)風(fēng)機(jī)組電壓調(diào)到最大時(shí)，工作區(qū)風(fēng)速仍達(dá)不到0.3m/s，則必須更換高效空氣過濾器（由廠家或院儀器維修人員進(jìn)行）。

4．9 有相應(yīng)的維護(hù)記錄，長(zhǎng)期不使用的生物安全柜撥下電源插頭。6.儀器維護(hù)

(1)使用注意。該儀器在日常使用中請(qǐng)注意符合“4.注意事項(xiàng)”要求(2)廢液瓶滿要及時(shí)倒掉廢液，切勿強(qiáng)行扯動(dòng)紅黃兩根管來打開瓶蓋，檢查廢液瓶是否漏氣，防止低真空出現(xiàn)。

(3)當(dāng)出現(xiàn)堵孔時(shí)，按自動(dòng)沖洗鍵沖洗管道。(4)嚴(yán)格按照儀器的關(guān)機(jī)程序關(guān)機(jī)。7.期間核查

(1)PE-5700 基因擴(kuò)增儀的定標(biāo)不需要特別的周期間隔，本實(shí)驗(yàn)室PE-5700 基因擴(kuò)增儀執(zhí)行衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心的指定校準(zhǔn)。

(2)校準(zhǔn)物均為與ICSH 之標(biāo)準(zhǔn)相符合的校準(zhǔn)物，測(cè)定值偏差均不超過其規(guī)定值。

十九、移液器操作維護(hù)規(guī)程

1．目的：確保移液的精確性，正確使用移液器。2．適用范圍：本實(shí)驗(yàn)室使用的可調(diào)式移液器。3．負(fù)責(zé)人： 操作人： 4．程序： 4．1 移液器的使用

4．1．1 轉(zhuǎn)動(dòng)旋鈕設(shè)定移液量，設(shè)定的移液量不可超出該移液器規(guī)定的范圍。4．1．2 裝上配套的Tip。4．1．3 前進(jìn)移液法

a）將按鈕壓至第一停點(diǎn)位置；

b）將移液管管嘴浸入液面下2~3mm 深處，然后慢慢松開按鈕吸入液體。待移入管嘴吸滿液體后，將管嘴撤出液面，擦掉管嘴外側(cè)的所有液滴。

c）輕輕壓下操作按鈕至第一停點(diǎn)位置，放出液體。約1 秒鐘后，繼續(xù)將操作按鈕向下壓至第二停點(diǎn)位置。待管嘴液體放干凈后，將管嘴貼在容器瓶壁上防止形成液滴滴入瓶中，撤出管嘴。

d）松開按鈕使之回到起點(diǎn)位置。需要時(shí)，可更換管嘴繼續(xù)移液操作。4．1．4 倒退移液法：適用于高粘度液體及/或易起泡沫液體的移液。a）將操作按鈕向下壓至第二停點(diǎn)位置。

b）將移液管管嘴浸入試劑瓶液面下2~3mm 深處，然后慢慢松開鈕吸入液體。待移入管嘴吸滿液體后，將管嘴撤出液面，擦掉管嘴外側(cè)的所有液滴。c）輕輕壓下操作按鈕至第一停點(diǎn)位置，放出液體。

d）遺留在管嘴時(shí)的液體或者隨管嘴一起扔掉，或者放回原來的容器中。4．1．5 重復(fù)操作法：重復(fù)操作移液法可以快速、簡(jiǎn)便地重復(fù)轉(zhuǎn)移同體積的同種液體。a）將操作按鈕向下壓至第二停點(diǎn)位置。

b）將移液管管嘴浸入液面下2~3mm 深處，然后慢慢松開按鈕吸入液體。待移入管嘴吸滿液體后，將管嘴貼在容器瓶壁上防止形成液滴滴入瓶中。

c）輕輕壓下操作按鈕至第一停點(diǎn)位置，放出液體。待放完所需體積液體后，把按鈕停在第一停點(diǎn)位置，不包括在移液量之內(nèi)的少量液體仍留在管嘴內(nèi)，管嘴外的液滴則需包括在移液量之內(nèi)。

d）將管嘴浸入試劑液面下不遠(yuǎn)處，然后慢慢松開按鈕使管嘴重新吸入液體。(3)e）重復(fù)步序c）和d）繼續(xù)移液操作，就可重復(fù)轉(zhuǎn)移相同體積液體。4．2 移液器的維護(hù)

每天對(duì)使用過的移液器用75%酒精進(jìn)行擦拭。每周1 次對(duì)移液器咀進(jìn)行75%酒精浸泡15 分鐘左右，若使用過程中發(fā)生污染應(yīng)隨時(shí)浸泡處理。4．3 移液器的校準(zhǔn)

為確保移液器加樣的精確性和準(zhǔn)確性，正確使用移液器，需定期（一年）對(duì)移液器進(jìn)行校準(zhǔn) 4．3．1 校準(zhǔn)環(huán)境和用具要求室溫：20～25℃，測(cè)定中波動(dòng)范圍不大于±0.5℃。

電子天平：放置于無塵和震動(dòng)影響的臺(tái)面上，房間盡可能有空調(diào)。稱量時(shí)，為保證天平內(nèi)的濕度（相對(duì)濕度60～90%），天平內(nèi)應(yīng)放置一裝有10mL 蒸餾水的小燒杯。

小燒杯：5～10mL 體積。測(cè)定液體：溫度為20～25℃的去氣雙蒸水。選定校準(zhǔn)體積： a）擬校準(zhǔn)體積；

b）移液器標(biāo)定體積的中間體積。

c）最小可調(diào)體積（不小于擬定體積的10%）。如為固定體積移液器，則只有一種校準(zhǔn)體積。4．3．2 校準(zhǔn)步驟

a）將移液器調(diào)至擬校準(zhǔn)體積，選擇合適的吸頭； b）調(diào)節(jié)好天平；

c）來回吸吹蒸餾水3 次，以使吸頭濕潤(rùn)，用紗布拭干吸頭；

d）垂直握住移液器，將吸頭浸入液面2～3mm，緩慢（1～3 秒）一致地吸取蒸餾水 e）將吸頭離開液面，靠在管壁，去掉吸頭外部的液體；

f）將移液器以30℃角放入稱量燒杯中，緩慢一致地將移液器壓至第一檔，等待1～3 秒，再壓至第二檔，使吸頭里的液體完全排出； g）記錄稱量值； h）擦干吸頭外面； i）按上步驟稱量10 次； j）取10 次測(cè)量值的均值作為最后移液器吸取的蒸餾水重量，按表1 所列蒸餾水Z 因子計(jì)算體積；

k）按校準(zhǔn)結(jié)果調(diào)節(jié)移液器。4．3．3 比較校準(zhǔn)法

利用經(jīng)計(jì)量局校準(zhǔn)并頒發(fā)校準(zhǔn)報(bào)告之同型號(hào)移液器，在移液器量程范圍的高低兩個(gè)檔各選擇一個(gè)校準(zhǔn)點(diǎn)

(4)用電子天平稱量結(jié)果與已校準(zhǔn)移液器稱量結(jié)果進(jìn)行比較，完成校準(zhǔn)。

參考文件：

1.衛(wèi)生部辦公廳關(guān)于印發(fā)《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增管理辦法》的通知 2.衛(wèi)生部檢驗(yàn)中心《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室工作導(dǎo)則》 3.《實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求》（GB19489-2008）。

4.ISO15189 質(zhì)量管理體系范本文件（第六冊(cè)）

第二篇：pcr檢測(cè)技術(shù)

《食品安全學(xué)》綜述

PCR快速檢測(cè)技術(shù)綜述

1．前言

聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）是80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)。它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、易自動(dòng)化等突出優(yōu)點(diǎn)；能在一個(gè)試管內(nèi)將所要研究的目的基因或某一DNA片段于數(shù)小時(shí)內(nèi)擴(kuò)增至十萬乃至百萬倍，是肉眼能直接觀察和判斷；可從一根頭發(fā)、一滴血、甚至一個(gè)細(xì)胞中擴(kuò)增出足量的DNA供分析研究和檢測(cè)鑒定。過去幾天幾個(gè)星期才能做到的事情，用PCR幾個(gè)小時(shí)便可完成。PCR技術(shù)是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的一項(xiàng)革命性創(chuàng)舉和里程碑。

該酶促反應(yīng)最基本的3個(gè)環(huán)節(jié)是：[1]模板DNA的變性，即在94℃下模板雙鏈DNA變?yōu)閱捂淒NA；[2]引物與模板鏈的特異性復(fù)性；[3]引物鏈的延伸。

2.研究的目的與意義

聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)建立以來，定性技術(shù)不斷改進(jìn)和完善，可以達(dá)到檢測(cè)單個(gè)靶序列的水平、但實(shí)際工作中常需要定量檢測(cè)標(biāo)本中核酸，而不是某一特定序列存在與否，借助PCR對(duì)基因快速、敏感、特異而準(zhǔn)確定量成為目前分子生物學(xué)技術(shù)研究的熱點(diǎn)之一。定量PCR旨在評(píng)估樣品中靶分子數(shù)，此測(cè)定可以是絕對(duì)的，如每微克樣本中靶DNA的分子數(shù)；也可以是相對(duì)定量，即與設(shè)定的內(nèi)參照或外參照比較而言。鑒于PCR方法主要有5個(gè)，即對(duì)PCR產(chǎn)物的直接定量、極限稀釋法、靶基因與參照基因的同步擴(kuò)增、競(jìng)爭(zhēng)性PCR和熒光定量PCR[1]。這幾種放啊各有利弊，對(duì)其選擇取決于靶基因的特性、對(duì)PCR產(chǎn)量的期望值、對(duì)準(zhǔn)確度的要求、需要相對(duì)還是絕對(duì)定量。

人類對(duì)于核酸的研究已經(jīng)有100多年的歷史。20世紀(jì)60年代末70年代初，人們致力于研究基因的體外分離技術(shù)。但是，由于核酸的含量較少，一定程度上限制了DNA的體外操作。Khorana于1971年最早提出核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想。但是，當(dāng)時(shí)的基因序列分析方法尚未成熟，對(duì)熱具有較強(qiáng)穩(wěn)定性的DNA聚合酶還未發(fā)現(xiàn)，寡核苷酸引物的合成仍處在手工、半自動(dòng)合成階段，這種想法似乎沒有任何實(shí)際意義。

1985年，美國(guó)科學(xué)家Kary Mullis在高速公路的啟發(fā)下，經(jīng)過兩年的努力，發(fā)明了PCR技術(shù)，并在Science雜志上發(fā)表了關(guān)于PCR技術(shù)的第一篇學(xué)術(shù)論文。從此，PCR技術(shù)得到了生命科學(xué)界的普遍認(rèn)同，Kary Mullis也因此而獲得1993年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。

但是，最初的PCR技術(shù)相當(dāng)不成熟，在當(dāng)時(shí)是一種操作復(fù)雜、成本高昂、“中看不中用”的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)。1988年初，Keohanog通過對(duì)所使用的酶的改進(jìn)，提高了擴(kuò)增的真實(shí)性。爾后，Saiki等人又從生活在溫泉中的水生嗜熱桿菌內(nèi)提取到一種耐熱的DNA聚合酶，使得PCR技術(shù)的擴(kuò)增效率大大提高。也正是由于此酶的發(fā)現(xiàn)使得PCR技術(shù)得到了廣泛地應(yīng)用，使該技術(shù)成為遺傳與分子生物學(xué) 分析的根本性基石。在以后的幾十年里，PCR方法被不斷改進(jìn)：它從一種定性的分析方法發(fā)展到定量測(cè)定；從原先只能擴(kuò)增幾個(gè)kb的基因到目前已能擴(kuò)增長(zhǎng)達(dá)幾十個(gè)kb的DNA片段。到目前為止，PCR技術(shù)已有十幾種之多，例如，將PCR與反轉(zhuǎn)錄酶結(jié)合，成為反轉(zhuǎn)錄PCR，將PCR與抗體等相結(jié)合就成為免疫PCR等。3.國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀

3.1.基礎(chǔ)研究方面的應(yīng)用

目前從事分子生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)室和研究人員，幾乎每天都在使用PCR，可以說幾乎沒有一個(gè)分子生物學(xué)家沒有使用過PCR。因此，PCR與分子克隆一樣是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)方法，可用于達(dá)到以下目的：

[1] 擴(kuò)增目的基因和鑒定重組子； [2]克隆基因；

[3]基因功能和表達(dá)調(diào)控的研究； [4]基因組測(cè)序； [5]制備單鏈模板； [6]致突變；

3.2.PCR在臨床上的應(yīng)用[2]

[1]在遺傳學(xué)上的應(yīng)用：人類的遺傳性疾病是因?yàn)槟骋粔A基序列發(fā)生了突變，使之缺失或形成某一限制性內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)，通過PCR結(jié)合限制片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析（PCR-RFLP），就可以從基因的水平對(duì)遺傳性疾病進(jìn)行分析。例如，血友病甲是一種常見的遺傳性出血性疾病，患者體內(nèi)缺乏凝血因子FVIII這是由于基因第14個(gè)外顯子的第336位氨基酸的編碼基因發(fā)生了突變，產(chǎn)生了一個(gè)新的PstI酶切點(diǎn)，因此可以使用PCR-RFLP對(duì)血友病進(jìn)行診斷。PCR還可以用來檢測(cè)遺傳性耳聾和Leber遺傳性視神經(jīng)病。

[2]在腫瘤研究中的應(yīng)用：PCR已日益廣泛應(yīng)用于腫瘤的病因與發(fā)病機(jī)理研究以及腫瘤診斷與治療的研究中。例如，差異顯示PCR技術(shù)能針對(duì)不同腫瘤尋找其特異而敏感的標(biāo)志物，并用于腫瘤早期診斷、判斷預(yù)后及療效評(píng)估。另一方面，在使用普通放療、化療的同時(shí)可結(jié)合定量PCR技術(shù)檢測(cè)微小殘留病灶，以進(jìn)一步改進(jìn)治療方案。此外，由于癌癥的發(fā)生在一定意義上是單個(gè)細(xì)胞分子發(fā)生變化，因而可以使用單細(xì)胞PCR技術(shù)對(duì)癌癥的發(fā)病機(jī)理進(jìn)行研究。[3]在基因分型中的應(yīng)用：當(dāng)進(jìn)行器官移植時(shí)并須先組織配型工作，此時(shí)常應(yīng)用序列特異性寡核苷酸多態(tài)性PCR（PCR-sequence specific oilgonucleotide polymorphism,PCR-SSOP）對(duì)人類白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen,HLA）進(jìn)行分型，使移植成功率大大提高。此外PCR-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性也可以用于對(duì)HLA的分型。3．3.在法醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用[3]

例如：最早應(yīng)用DNA限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性結(jié)合PCR-RFLP來進(jìn)行法醫(yī)學(xué)個(gè)體識(shí)別和親子鑒定。目前發(fā)現(xiàn)在真核生物基因組編碼和非編碼序列中的短串聯(lián)重復(fù)序列的重復(fù)次數(shù)在個(gè)體間存在著差異，因此可以使用短串聯(lián)重復(fù)PCR技術(shù)對(duì)其進(jìn)行分析。使用PCR技術(shù)進(jìn)行法醫(yī)鑒定的優(yōu)點(diǎn)是樣品用量小并且適于對(duì)高度降解材料的檢測(cè)。除剛才提到的之外，可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列（variable number tandem repeat,VN-TR）PCR也可以用于法醫(yī)學(xué)個(gè)體識(shí)別和親子鑒定。所以，綜上所述，PCR的確是一種分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)技術(shù)。在它30多年的發(fā)展中衍生出了諸如PCR-RFLP、PCR-SSOP、VN-TR，以及免疫PCR、致突變PCR和定量PCR等十幾種不同的技術(shù)方法。PCR技術(shù)可以為基因工程提供目的基因，并廣泛地應(yīng)用于個(gè)體識(shí)別、親子鑒定、免疫配型、疾病診斷等方面?？梢哉f，PCR已經(jīng)滲透到了生命科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。21世紀(jì)是生物工程的世紀(jì)。我相信，在今后的發(fā)展中PCR技術(shù)會(huì)不斷地得到擴(kuò)充和完善，PCR技術(shù)也將4.相關(guān)檢測(cè)技術(shù) 4.1.技術(shù)原理

DNA的半保留復(fù)制是生物進(jìn)化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈，在DNA聚合酶與啟動(dòng)子的參與下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則復(fù)制成同樣的兩分子挎貝。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，DNA在高溫下也能發(fā)生變性解鏈，當(dāng)溫度降低后又可以復(fù)性成為雙鏈。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復(fù)性，并設(shè)計(jì)引物做啟動(dòng)子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復(fù)制。

但是，DNA聚合酶在高溫時(shí)會(huì)失活，因此，每次循環(huán)都得加入新的DNA聚合酶，不僅操作煩瑣，而且價(jià)格昂貴，制約了PCR技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展。發(fā)現(xiàn)耐熱DNA聚合同酶--Taq酶對(duì)于PCR的應(yīng)用有里程碑的意義，該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活，不需要每個(gè)循環(huán)加酶，使PCR技術(shù)變得非常簡(jiǎn)捷、同時(shí)也大大降低了成本，PCR技術(shù)得以大量應(yīng)用，并逐步應(yīng)用于臨床。4.2.工作原理

類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火--延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR 擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；③引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍 4.3.工作步驟

標(biāo)準(zhǔn)的PCR過程分為三步：

1.DNA變性（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA 2.退火（25℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部雙鏈。

3.延伸（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右最佳的活性）的作用下，以dNTP為原料，從引物的5′端→3′ 端延伸，合成與模板互補(bǔ)的DNA鏈。每一循環(huán)經(jīng)過變性、退火和延伸，DNA含量既增加一倍。現(xiàn)在有些PCR因?yàn)閿U(kuò)增區(qū)很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的時(shí)間內(nèi)復(fù)制完成，因此可以改為兩步法，即退火和延伸同時(shí)在60℃-65℃間進(jìn)行，以減少一次升降溫過程，提高了反應(yīng)速度 5.研究方案

醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)大致可分為形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)、血清免疫學(xué)和分子生物學(xué)幾大類，其分別代表幾代實(shí)驗(yàn)診斷技術(shù)。60年代DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)及半保留復(fù)制模式的出現(xiàn)，70年代基因重組及體外基因克隆技術(shù)、分子雜交技術(shù)的應(yīng)用使分子生物學(xué)在疾病診斷中得到了長(zhǎng)足的發(fā)展。特別是1985年Mullis發(fā)明了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)，使醫(yī)學(xué)界真正興起了基因診斷技術(shù)熱，成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)展的又一里程碑。用于臨床檢驗(yàn)的PCR技術(shù)與經(jīng)典的PCR反應(yīng)在操作上稍有區(qū)別，有其自己的特色。一般在樣品處理上，多采用非離子去污劑一次加熱處理，這種方法對(duì)DNA純化有限，但適應(yīng)臨床微量、快速的特點(diǎn)。另外PCR反應(yīng)體系中各組成成份往往都預(yù)分裝到反應(yīng)管中，既減少操作者的工作強(qiáng)度而且也減少了污染的機(jī)會(huì)，具有極高的使用價(jià)值。本公司率先研制并推出單管單人份的PCR診斷試劑，具有開創(chuàng)性意義。這些改進(jìn)都不影響PCR效果，同樣表現(xiàn)出高特異性、高敏感性、簡(jiǎn)便快捷等PCR最優(yōu)秀的特征，在常見傳染病、性病、腫瘤、遺傳病、寄生蟲病、優(yōu)生優(yōu)育、法醫(yī)學(xué)等廣泛領(lǐng)域中有相當(dāng)高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。5.1研究方法

① 早期診斷，因?yàn)镻CR擴(kuò)增極其敏感，理論上可檢出100CID/ml乙肝病毒的患者血清，在感染潛伏期即可被PCR法檢出。

② 對(duì)低持續(xù)感染乙肝病人的診斷，有些乙肝病人體內(nèi)的病毒長(zhǎng)期低復(fù)制感染，血清病毒濃度極低，一般酶標(biāo)試劑無法檢出，可以用PCR法檢出。

③ 療效跟蹤及病程判斷，因?yàn)镻CR能半定量檢測(cè)乙肝病毒基因，是病毒是否存在及其數(shù)量多少的最直接指標(biāo)。在治療過程中通過監(jiān)測(cè)血清或白細(xì)胞中病毒基因存在與否及其動(dòng)態(tài)變化即能準(zhǔn)確地了解病情。丙型肝炎病毒在血清中的濃度很低，丙肝病毒的分離尚未成功。目前用于丙肝病毒檢驗(yàn)的方法主要是ELISA法測(cè)定血清中的HCV抗體。由于HCV尚無法分離純化，所以用于包被的抗原是人工合成肽或基因工程蛋白，這些人工抗原與天然病毒抗原有一定的區(qū)別，理論上是存在假陽性或假陰性。同時(shí)血清中抗體的出現(xiàn)及動(dòng)態(tài)變化與病人病情無線性相關(guān)關(guān)系。RT－PCR技術(shù)使這些困難得到解決。HCV是RNA病毒，需先將病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA（RT）后再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，這種技術(shù)稱之為逆轉(zhuǎn)錄－PCR（RT－PCR）。PCR敏感性高可以檢測(cè)出血清中低濃度的病毒，了解病毒在體內(nèi)復(fù)制的動(dòng)態(tài)狀況。RNA純化要求嚴(yán)格，是RT－PCR的技術(shù)關(guān)鍵，本公司目前使用的高效基因釋放劑，聯(lián)合特異性固相基因吸附乳膠顆粒，對(duì)樣本中的RNA進(jìn)行分離純化，使這一問題得到解決。通常用于RNA→cDNA逆轉(zhuǎn)錄的酶大致可以分為二大類，即低溫逆轉(zhuǎn)錄酶，如AMV/MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，高溫逆轉(zhuǎn)錄酶，如Tth酶。Tth酶在錳離子作用下，具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性，Tth酶活性溫度高，可以使核酸充分線性化，提高逆轉(zhuǎn)錄效率及特異性。Tth酶在鎂離子的作用下，又具有DNA聚合酶活性，從而真正實(shí)現(xiàn)單管單酶單人份的擴(kuò)增要求，這樣就在不降低擴(kuò)增敏感性的條件下，一步完成擴(kuò)增，不僅簡(jiǎn)化操作，而且又減少污染，提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性。國(guó)內(nèi)本公司已采用這種技術(shù)推出單管單酶單人份的RT－PCR診斷試劑。丁型肝炎病毒是缺陷病毒，與乙型肝炎病毒協(xié)同感染。甲型肝炎病毒、戊型肝炎病毒主要存在于急性病人糞便樣本中，戊型肝炎病毒也長(zhǎng)期存在于血清中。在PCR檢測(cè)時(shí)，需注意取材的合理性。在消化道傳染性疾病中，另一類最重要的感染性疾病是幽門螺旋桿菌（HP）所引起的胃炎、胃潰瘍等。HP可以經(jīng)口－口途經(jīng)傳播并定位于胃粘膜上皮細(xì)胞，早期表現(xiàn)為淺表性胃炎，可發(fā)展成為胃潰瘍。我國(guó)胃炎發(fā)病率之高估計(jì)比乙型肝炎更嚴(yán)重，對(duì)HP的檢測(cè)應(yīng)受到廣大醫(yī)務(wù)工作者的重視。對(duì)HP的檢測(cè)可以用生化法測(cè)試尿素酶或用免疫法測(cè)試血清中對(duì)HP特異性抗體，也可對(duì)胃液、胃粘膜樣本進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)及菌種鑒定。PCR法檢測(cè)HP非常敏感且特異性高，有研究發(fā)現(xiàn)可以從病人的唾液或口腔含漱液中檢出HP.PCR法避免了取胃液及胃粘膜，減少病人痛苦，5.2.技術(shù)路線

PCR技術(shù)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)（PCR）是一種選擇性體外擴(kuò)增DNA或RNA片段的方法。具有特異性強(qiáng)、敏感性高、快速、簡(jiǎn)便、可擴(kuò)增RNA或cDNA、對(duì)起始材料質(zhì)量要求低等優(yōu)點(diǎn)。5.3.所用儀器與材料

引物: PCR產(chǎn)物的特異性主要取決于引物鏈的特異性。由于存在同源序列，隨意設(shè)計(jì)的引物鏈，其PCR產(chǎn)物在電泳分析時(shí)可能出現(xiàn)多條鏈，因此在設(shè)計(jì)引物鏈時(shí)應(yīng)充分考慮引物特異性。引物長(zhǎng)度一般為15-30個(gè)堿基,G+C含量為40-60%,濃度0.1-1umol/L。TaqDNA聚合酶：濃度為1-4ul/100ul。TaqDNA聚合酶單位用量增長(zhǎng)可能導(dǎo)致非特異DNA擴(kuò)增。模板DNA：應(yīng)避免混有任何蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑及能結(jié)合DNA的蛋白酶。DNA摸板的制備方法有加熱法、凍溶法、超聲波粉碎法、堿變性法、SDS裂解法等多種。

4×dNTPs ： dNTP儲(chǔ)存液pH應(yīng)為7.0，在反應(yīng)體系中，4種dNTP的濃度應(yīng)相同，每種dNTP的濃度以50-200 umol/L為宜。緩沖液及其他成份：PCR反應(yīng)體系中，一般采用Tris-HCl緩沖液。適宜的Mg2+濃度為高于dNTP總濃度0.2-2.5 mmol/L。

6．研究?jī)?nèi)容

PCR技術(shù)的出現(xiàn)對(duì)法醫(yī)學(xué)的發(fā)展也有不可低估的作用。在法醫(yī)物證如血斑、毛發(fā)、組織碎片等的確證，DAN多態(tài)性分析遠(yuǎn)比血清學(xué)或等方法確實(shí)可靠。早期DNA多態(tài)性分析主要使用Southern印跡雜交的方法。1985年Jeffreys首先采用肌紅基因第一個(gè)內(nèi)含子中的串聯(lián)重復(fù)序列作探針，從人的基因庫中篩選出小衛(wèi)量DNA，使用阿交法產(chǎn)生雜交圖譜即DNA指紋。這一技術(shù)成功地應(yīng)用于個(gè)人識(shí)別及親子鑒定。這種方法仍受到樣本量的限制，當(dāng)樣本DNA數(shù)量不足時(shí)或DAN嚴(yán)重降解則不能正常檢出。且雜交技術(shù)常使用同位素杯記探針要求較鎬的防護(hù)措施。PCR技術(shù)的出現(xiàn)，可以對(duì)極少量物證如一根毛發(fā)、一滴血液、極小精斑都可以進(jìn)行分析。在人類基因組中有許多由10-15bp核心順序構(gòu)成的串聯(lián)重復(fù)DNA序列，具有單位點(diǎn)特征的稱為VNTR結(jié)構(gòu)，多位點(diǎn)串聯(lián)成為衛(wèi)星DNA。6．1.檢測(cè)對(duì)象

常見的傳染性疾病有細(xì)菌、病毒、衣原體、支原體等，可引起消化、呼吸、循環(huán)、泌尿生殖等不同系統(tǒng)相應(yīng)的病變。消化系統(tǒng)感染性疾病在我國(guó)具有代表性意義的有肝炎、胃炎及腸道感染性疾病。引起肝炎的病原體主要包括乙型肝炎病毒（乙肝）、丙型肝炎病毒（丙肝），其它還有甲型肝炎病毒（甲肝）、丁型肝炎病毒（丁肝）、戊型肝炎病毒（戊肝）、庚型肝炎病毒（庚肝）等。這幾種肝炎病毒中只有乙型肝炎病毒是DNA病毒，其余均為RNA病毒。我國(guó)是乙肝高發(fā)區(qū)，乙肝病人為世界乙肝病人總數(shù)的50％。[4]乙肝病毒經(jīng)血液傳播，病毒主要在肝細(xì)胞中增殖，也可以長(zhǎng)期存留在骨髓細(xì)胞或外周血白細(xì)胞中。通常用PCR法檢測(cè)血清中的乙肝病毒。有報(bào)道用PCR法可以在淚液、乳汁、精液及血白細(xì)胞中檢出乙肝病毒，這些發(fā)現(xiàn)提示其它傳染途經(jīng)存在的可能 6．2檢測(cè)內(nèi)容

PCR反應(yīng)混合物經(jīng)過循環(huán)擴(kuò)增后，所需做的工作就是檢測(cè)反應(yīng)液中是否存在預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物及產(chǎn)物的特異性。目前已經(jīng)發(fā)展了許多檢測(cè)分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的方法。包括凝膠電泳、高壓液相色譜、核酸探針雜交、探針捕獲酶免疫分析、酶切圖譜分析、單鏈構(gòu)型多態(tài)性分析、核酸序列分析。

PCR技術(shù)類型[5]

免疫PCR技術(shù) 原位PCR技術(shù) 不對(duì)稱PCR技術(shù) 巢式PCR技術(shù) 反向PCR技術(shù) 逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)

復(fù)合PCR技術(shù)

彩色PCR技術(shù)

抗原捕獲PCR技術(shù) 增敏PCR技術(shù)

酶標(biāo)PCR技術(shù)

二溫式PCR技術(shù)

錨定PCR技術(shù)

定量PCR技術(shù)

毛細(xì)管PCR技術(shù)

多重PCR技術(shù)

巢式或套式PCR技術(shù) 7.預(yù)期目標(biāo)PCR 技術(shù)在大腸桿菌O157: H7檢測(cè)中

（1)簡(jiǎn)單PCR： Meng等以eae基因5′末端附近一段688bp DNA片段為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)了一對(duì)引物,擴(kuò)增產(chǎn)物為633bp的DNA片段。其退火溫度為60℃－63℃, 應(yīng)用煮沸法與基因釋放法,大腸桿菌O157: H7檢出限分別為25與38CFU/ml,檢測(cè)時(shí)間為3h。Thomas等用PCR擴(kuò)增了slt基因片段。引物： 正鏈5′-(TTTACGATAGACTTCTCGAC)-3', 反鏈5′-（CACATATAAATTATTTCGCTC）-3’

其PCR產(chǎn)物由凝膠電泳測(cè)定,檢測(cè)時(shí)間為ld。

徐建國(guó)等根據(jù)O157: H7 特有的hlyA、B基因序列設(shè)計(jì)了PCR引物,產(chǎn)物為338bp。

PCR技術(shù)在大腸桿菌O157: H7檢測(cè)中（2）多重PCR:由于鑒定O157: H7血清型不能僅僅依靠簡(jiǎn)單PCR,近年來國(guó)外學(xué)者對(duì)多重PCR方法在大腸桿菌O157: H7的診斷價(jià)值方面進(jìn)行了研究。Meng等同時(shí)擴(kuò)增了eae 上游基因片段、sitⅠ基因片段、sit Ⅱ基因片段,其長(zhǎng)度分別為633、210、484bp。此引物設(shè)計(jì)可有效區(qū)別O157: H7血清型與O55: H7、O55: NM。Fratamico等在一個(gè)單一反應(yīng)中同時(shí)擴(kuò)增了eae基因、slt Ⅰ、Ⅱ的保守序列及60MDa質(zhì)粒保守序列,其產(chǎn)物分別為1087、227、224、166bp。嚴(yán)笠選用針對(duì)大腸桿菌O157: H7志賀樣毒素Ⅰ、Ⅱ（SLT－Ⅰ、SLT－Ⅱ）和溶血素（Hly）基因的三對(duì)引物,在同一擴(kuò)增體系中進(jìn)行PCR,檢測(cè)12株不同來源的O157: H7大腸桿菌及其它致病性大腸桿菌及沙門菌、志賀菌15株。結(jié)果復(fù)合PCR方法較單一PCR方法具有較高的特異性，12株O157: H7取得了穩(wěn)定、可靠的陽性結(jié)果。能迅速、有效地與其它致病性大腸桿菌及沙門氏菌、志賀菌相鑒別。

PCR技術(shù)在大腸桿菌O157: H7檢測(cè)中的應(yīng)用（3）原位PCR: kurokawa等不用培養(yǎng)過程,直接用原位PCR技術(shù)結(jié)合落射顯微鏡,在單細(xì)胞水平快速檢測(cè)O157: H7。

4.23SrRNA在大腸桿菌O157: H7分型、檢測(cè)中

傳統(tǒng)的細(xì)菌分類方法主要依賴于細(xì)菌的形態(tài)學(xué)、代謝產(chǎn)物、酶活性和表面抗原等特征。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)理論和技術(shù)的迅速發(fā)展，微生物檢測(cè)進(jìn)入了基因時(shí)代，以核糖體核糖核酸序列為基礎(chǔ)的分類方法為微生物的鑒別提供了新的分子生物學(xué)方法。[6]如16srRNA、23srRNA、16-23srRNA區(qū)間序列分析等等，它完全不同于傳統(tǒng)方法，具有快速、簡(jiǎn)便、敏感和特異等優(yōu)點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)

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第三篇：PCR實(shí)驗(yàn)常見問題

【實(shí)驗(yàn)】PCR常見問題總結(jié)

作者: gene121(站內(nèi)聯(lián)系TA)發(fā)布: 2005-07-04 PCR產(chǎn)物的電泳檢測(cè)時(shí)間一般為48h以內(nèi)，有些最好于當(dāng)日電泳檢測(cè)，大于48h后帶型不規(guī)則甚致消失。一.假陰性，不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶

PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有①模板核酸的制備，②引物的質(zhì)量與特異性，③酶的質(zhì)量及活性 ④PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應(yīng)針對(duì)上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析研究。

模板：①模板中含有雜蛋白質(zhì)，②模板中含有Taq酶抑制劑，③模板中蛋白質(zhì)沒有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白，④在提取制備模板時(shí)丟失過多，或吸入酚。⑤模板核酸變性不徹底。在酶和引物質(zhì)量好時(shí)，不出現(xiàn)擴(kuò)增帶，極有可能是標(biāo)本的消化處理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應(yīng)固定不宜隨意更改。

酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時(shí)使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導(dǎo)致假陰性。需注意的是有時(shí)忘加Taq酶或溴乙錠。

引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對(duì)稱，是PCR失敗或擴(kuò)增條帶不理想、容易彌散的常見原因。有些批號(hào)的引物合成質(zhì)量有問題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對(duì)稱擴(kuò)增，對(duì)策為：①選定一個(gè)好的引物合成單位。②引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時(shí)做PCR有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時(shí)要平衡其濃度。③引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長(zhǎng)期放冰箱冷藏部分，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。④引物設(shè)計(jì)不合理，如引物長(zhǎng)度不 夠，引物之間形成二聚體等。

Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對(duì)PCR擴(kuò)增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴(kuò)增的特異性，濃度過低則影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶。

反應(yīng)體積的改變：通常進(jìn)行PCR擴(kuò)增采用的體積為20ul、30ul、50ul。或100ul，應(yīng)用多大體積進(jìn)行PCR擴(kuò)增，是根據(jù)科研和臨床檢測(cè)不同目的而設(shè)定，在做小體積如20ul后，再做大體積時(shí)，一定要模索條件，否則容易失敗。

物理原因：變性對(duì)PCR擴(kuò)增來說相當(dāng)重要，如變性溫度低，變性時(shí)間短，極有可能出現(xiàn)假陰性;退火溫度過低，可致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率退火溫度過高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴(kuò)增效率。有時(shí)還有必要用標(biāo)準(zhǔn)的溫度計(jì)，檢測(cè)一下擴(kuò)增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。

靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列，其PCR擴(kuò)增是不會(huì)成功的。1假陽性

出現(xiàn)的PCR擴(kuò)增條帶與目的靶序列條帶一致，有時(shí)其條帶更整齊，亮度更高。

引物設(shè)計(jì)不合適：選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性，因而在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽性。需重新設(shè)計(jì)引物。

靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個(gè)基因組或大片段的交叉污染，導(dǎo)致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決：①操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外。②除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或 器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及樣進(jìn)槍頭等均應(yīng)一次性使用。③必要時(shí)，在加標(biāo)本前，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，與引物互補(bǔ)后，可擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽性的產(chǎn)生，可用巢式PCR方法來減輕或消除。2出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶

PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致，或大或小，或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶與非特異性擴(kuò)增帶。非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不完全互補(bǔ)、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環(huán)次數(shù)過多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn)，酶量過多有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。其對(duì)策有：①必要時(shí)重新設(shè)計(jì)引物。②減低酶量或調(diào)換另一來源的酶。③降低引物量，適當(dāng)增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。④適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點(diǎn)法(93℃變性，65℃左右退火與延伸)。3出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶

PCR擴(kuò)增有時(shí)出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引起。其對(duì)策有：①減少酶量，或調(diào)換另一來源的酶。②減少dNTP的濃度。③適當(dāng)降低Mg2+濃度。④增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。二.PCR污染與對(duì)策

PCR反應(yīng)的最大特點(diǎn)是具有較大擴(kuò)增能力與極高的靈敏性，但令人頭痛的問題是易污染，極其微量的污染即可造成假陽性的產(chǎn)生。污染原因

(一)標(biāo)本間交叉污染:標(biāo)本污染主要有收集標(biāo)本的容器被污染，或標(biāo)本放置時(shí)，由于密封不嚴(yán)溢于容器外，或容器外粘有標(biāo)本而造成相互間交叉污染;標(biāo)本核酸模板在提取過程中，由于吸樣槍污染導(dǎo)致標(biāo)本間污染;有些微生物標(biāo)本尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴(kuò)散，導(dǎo)致彼此間的污染。

(二)PCR試劑的污染:主要是由于在PCR試劑配制過程中，由于加樣槍、容器、雙蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染.(三)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染:這是PCR反應(yīng)中最主要最常見的污染問題，因?yàn)镻CR產(chǎn)物拷貝量 大(一般為1013拷貝/ml)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于PCR檢測(cè)數(shù)個(gè)拷貝的極限，所以極微量的PCR產(chǎn)物 污染，就可造成假陽就可形成假陽性。

還有一種容易忽視，最可能造成PCR產(chǎn)物污染的形式是氣溶膠污染;在空氣與液體面摩擦?xí)r就可形成氣溶膠，在操作時(shí)比較劇烈地?fù)u動(dòng)反應(yīng)管，開蓋時(shí)、吸樣時(shí)及污染進(jìn)樣槍的反復(fù)吸樣都可形成氣溶膠而污染.據(jù)計(jì)算一個(gè)氣溶膠顆?？珊?8000拷貝，因而由 其造成的污染是一個(gè)值得特別重視的問題.(四)實(shí)驗(yàn)室中克隆質(zhì)粒的污染:在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室及某些用克隆質(zhì)粒做陽性對(duì)照的檢驗(yàn)室，這個(gè)問題也比較常見。因?yàn)榭寺≠|(zhì)粒在單位容積內(nèi)含量相當(dāng)高，另外在純化過程中需用較多的用具及試劑，而且在活細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)粒，由于活細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖的簡(jiǎn)便性及具有很強(qiáng)的生命力，其污染可能性也很大。污染的監(jiān)測(cè)

一個(gè)好的實(shí)驗(yàn)室，要時(shí)刻注意污染的監(jiān)測(cè)，考慮有無污染是什么原因造成的污染，以便采取措施，防止和消除污染。對(duì)照試驗(yàn)

1.陽性對(duì)照:在建立PCR反應(yīng)實(shí)驗(yàn)室及一般的檢驗(yàn)單位都應(yīng)設(shè)有PCR陽性對(duì)照，它是PCR反應(yīng)是否成功、產(chǎn)物條帶位置及大小是否合乎理論要求的一個(gè)重要的參考標(biāo)志。陽性對(duì)照要選擇擴(kuò)增度中等、重復(fù)性好，經(jīng)各種鑒定是該產(chǎn)物的標(biāo)本，如以重組質(zhì)粒為陽性對(duì)照，其含量宜低不宜高(100個(gè)拷貝以下)，但陽性對(duì)照尤其是重組質(zhì)粒及高濃度陽性標(biāo)本，其對(duì)檢測(cè)或擴(kuò)增樣品污染的可能性很大。因而當(dāng)某一PCR試劑經(jīng)自己使用穩(wěn)定，檢驗(yàn)人員心中有數(shù)時(shí)，在以后的實(shí)驗(yàn)中可免設(shè)陽性對(duì)照。

2.陰性對(duì)照:每次PCR實(shí)驗(yàn)務(wù)必做陰性對(duì)照。它包括①標(biāo)本對(duì)照:被檢的標(biāo)本是血清就用鑒定后的正常血清作對(duì)照;被檢的標(biāo)本是組織細(xì)胞就用相應(yīng)的組織細(xì)胞作對(duì)照。②試劑對(duì)照:在PCR試劑中不加模板DNA或RNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以監(jiān)測(cè)試劑是否污染。

3.重復(fù)性試驗(yàn)

4.選擇不同區(qū)域的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增 防止污染的方法

(一)合理分隔實(shí)驗(yàn)室:將樣品的處理、配制PCR反應(yīng)液、PCR循環(huán)擴(kuò)增及PCR產(chǎn)物的鑒定等步驟分區(qū)或分室進(jìn)行，特別注意樣本處理及PCR產(chǎn)物的鑒定應(yīng)與其它步驟嚴(yán)格分開。最好能劃分①標(biāo)本處理區(qū);②PCR反應(yīng)液制備區(qū);③PCR循環(huán)擴(kuò)增區(qū);④PCR產(chǎn)物鑒定區(qū)。其實(shí)驗(yàn)用品及吸樣槍應(yīng)專用，實(shí)驗(yàn)前應(yīng)將實(shí)驗(yàn)室用紫外線消毒以破壞殘留的DNA或RNA。

(二)吸樣槍:吸樣槍污染是一個(gè)值得注意的問題。由于操作時(shí)不慎將樣品或模板核酸吸入槍內(nèi)或粘上槍頭是一個(gè)嚴(yán)重的污染源，因而加樣或吸取模板核酸時(shí)要十分小心，吸樣要慢，吸樣時(shí)盡量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或產(chǎn)生氣溶膠污染。

(三)預(yù)混和分裝PCR試劑:所有的PCR試劑都應(yīng)小量分裝，如有可能，PCR反應(yīng)液應(yīng)預(yù)先配制好，然后小量分裝，-20℃保存。以減少重復(fù)加樣次數(shù)，避免污染機(jī)會(huì)。另外，PCR試劑，PCR反應(yīng)液應(yīng)與樣品及PCR產(chǎn)物分開保存，不應(yīng)放于同一冰盒或同一冰箱。

(四)防止操作人員污染，使用一次性手套、吸頭、小離心管應(yīng)一次性使用。(五)設(shè)立適當(dāng)?shù)年栃詫?duì)照和陰性對(duì)照，陽性對(duì)照以能出現(xiàn)擴(kuò)增條帶的最低量的標(biāo)準(zhǔn)病原體核酸為宜，并注意交叉污染的可能性，每次反應(yīng)都應(yīng)有一管不加模板的試劑對(duì)照及相應(yīng)不含有被擴(kuò)增核酸的樣品作陰性對(duì)照。

(六)減少PCR循環(huán)次數(shù)，只要PCR產(chǎn)物達(dá)到檢測(cè)水平就適可而止。

(七)選擇質(zhì)量好的Eppendorf管，以避免樣本外溢及外來核酸的進(jìn)入，打開離心管前應(yīng)先離心，將管壁及管蓋上的液體甩至管底部。開管動(dòng)作要輕，以防管內(nèi)液體濺出。

第四篇：崗位標(biāo)準(zhǔn)和操作規(guī)范

辦公室崗位標(biāo)準(zhǔn)和操作規(guī)范

1、辦公室主任工作規(guī)范和崗位標(biāo)準(zhǔn)

（1）主持辦公室的全面工作，統(tǒng)籌安排室內(nèi)各人員的工作，做到既有分工又有合作，室內(nèi)工作運(yùn)轉(zhuǎn)有序。

（2）建立健全各項(xiàng)規(guī)章制度，把好文字材料關(guān)，確保各種材料按時(shí)按質(zhì)按量完成；做好信息新聞及宣傳報(bào)導(dǎo)工作，提高兩院的知名度，每年向民政局報(bào)送信息不少于12篇，縣電視臺(tái)宣傳兩院的工作不少于5次，并力爭(zhēng)市級(jí)報(bào)刊宣傳報(bào)導(dǎo)秭歸縣福利院的工作。同時(shí)完成民政局下達(dá)給兩院的各項(xiàng)工作任務(wù)。

（3）安排司機(jī)出車，在安排車輛上堅(jiān)持原則，不公車私用，在車況不好的情況下，堅(jiān)決不允許出車，避免安全事故發(fā)生。

（4）為領(lǐng)導(dǎo)當(dāng)好參謀助手，為領(lǐng)導(dǎo)提供準(zhǔn)確的信息，協(xié)助做好上傳下達(dá)和收發(fā)工作。

（5）協(xié)助做好來信來訪、接待及清潔衛(wèi)生工作。

2、辦公室秘書工作規(guī)范和崗位標(biāo)準(zhǔn)

（1）負(fù)責(zé)各種文書材料的起草、打印工作，注重提高材料質(zhì)量。

（2）負(fù)責(zé)各種報(bào)表工作，做到數(shù)據(jù)準(zhǔn)確無誤，前后邏輯貫通。

（3）做好來信來訪及接待工作，妥善處理上訪工作，接待過程中態(tài)度和藹，表達(dá)得當(dāng)，解決問題時(shí)不違背政策和原則。

（4）負(fù)責(zé)新聞信息、宣傳報(bào)導(dǎo)工作，每月向局報(bào)送信息2篇，主動(dòng)向縣廣播電視臺(tái)、《宜昌日?qǐng)?bào)》社及相關(guān)傳媒單位投遞稿件，努力提高兩院的知名度。

（5）做好清潔衛(wèi)生、收發(fā)及電話轉(zhuǎn)傳工作。主任外出時(shí)，主持辦公室的全面工作。

3、司機(jī)崗位規(guī)范和崗位標(biāo)準(zhǔn)

（1）車輛原則上只供本單位因工作需要使用，司機(jī)不得隨意出動(dòng)車輛，任何單位或個(gè)人用車必須經(jīng)辦公室主任批準(zhǔn)并由辦公室通知。

（2）單位領(lǐng)導(dǎo)或職工個(gè)人因私事原則上不得使用單位車輛，司機(jī)不得在沒有辦公室通知的情況下善自出車，否則，造成的一切后果由司機(jī)本人承擔(dān)。

（3）愛惜車輛，注意保修，經(jīng)常檢查車輛的性能及狀況，在車況不好的情況下不得勉強(qiáng)出車。

（4）安全第一，謹(jǐn)慎駕駛，遵守交通規(guī)則，如果不是由不可抗拒的原因造成的交通事故，其責(zé)任司機(jī)本人承擔(dān)。

（5）司機(jī)如果沒有出車任務(wù)，在辦公室待令，協(xié)助辦公室接聽電話及其它工作。

4、保管員崗位規(guī)范及工作標(biāo)準(zhǔn)

（1）負(fù)責(zé)院內(nèi)所有物資及財(cái)產(chǎn)的保管工作。

（2）對(duì)所有的物資及財(cái)產(chǎn)如實(shí)地清理、登記、造冊(cè)，做到賬賬相符、賬物相符。

（3）嚴(yán)格執(zhí)行財(cái)產(chǎn)進(jìn)、出庫登記制度、領(lǐng)取人簽字制度，弄清財(cái)產(chǎn)的來源、數(shù)量、流向及經(jīng)手人。丟失的財(cái)產(chǎn)實(shí)行追究賠償制，對(duì)低值易耗品做好損耗記錄。

（4）定期清倉，做好倉庫的清潔衛(wèi)生工作，防止物資腐爛、變質(zhì)、蟲蛀、鼠咬等。

財(cái)務(wù)室崗位標(biāo)準(zhǔn)和工作規(guī)范

1、會(huì)計(jì)崗位規(guī)范和崗位標(biāo)準(zhǔn)

（1）嚴(yán)格執(zhí)行《會(huì)計(jì)法》和財(cái)經(jīng)紀(jì)律，堅(jiān)持原則，秉公辦事，講究職業(yè)道德。

（2）做好本單位預(yù)算、決算及資金爭(zhēng)取工作，及時(shí)向領(lǐng)導(dǎo)反映財(cái)務(wù)收支狀況，一月向領(lǐng)導(dǎo)報(bào)告一次資金平衡表。

（3）堅(jiān)持“一支筆”審批制度，對(duì)不合理、不合法的單據(jù)堅(jiān)決不予入賬，確保資金使用的合法性。

（4）及時(shí)扎賬報(bào)賬、科學(xué)建賬，做到賬賬相符、賬物相符、賬錢相符。

（5）規(guī)范整理財(cái)務(wù)檔案，妥善保管會(huì)計(jì)憑證，確保財(cái)務(wù)工作清楚、明白、無誤。

（6）正確建賬，合理開支，財(cái)務(wù)工作經(jīng)得起相關(guān)單位的檢查和驗(yàn)收，不給單位、領(lǐng)導(dǎo)和個(gè)人帶來麻煩。

（7）對(duì)局財(cái)務(wù)股以指出已經(jīng)存在的問題必須予以糾正，并確保今后再不出現(xiàn)類似問題。

2、出納崗位規(guī)范和崗位標(biāo)準(zhǔn)

（1）嚴(yán)格執(zhí)行財(cái)經(jīng)紀(jì)律，堅(jiān)決執(zhí)行“一支筆”審批制度，合法使用各種原始憑證，合理開支經(jīng)費(fèi)。

（2）嚴(yán)格資金管理，不得擅自挪用、擠占、借支單位資金，開支經(jīng)費(fèi)必須經(jīng)院長(zhǎng)簽字認(rèn)可。

（3）對(duì)收取的經(jīng)費(fèi)及時(shí)存入銀行，辦公室內(nèi)不得存放現(xiàn)金；妥善保管各種憑證，避免現(xiàn)金、憑證意外丟失。

（4）及時(shí)匯總票據(jù)，單位職工因公預(yù)借經(jīng)費(fèi)，工作結(jié)束后及時(shí)報(bào)賬，職工個(gè)人不允許長(zhǎng)期占用公家資金。

（5）協(xié)助會(huì)計(jì)做好財(cái)務(wù)檔案的整理工作。

3、財(cái)務(wù)室考核細(xì)則

（1）使用、報(bào)銷不合格單據(jù)，發(fā)現(xiàn)一張扣1分。

（2）不經(jīng)院長(zhǎng)允許，擅自借支現(xiàn)金給他人，發(fā)現(xiàn)一次扣10分。

（3）經(jīng)相關(guān)部門和單位檢查，發(fā)現(xiàn)建賬不科學(xué)、不規(guī)范，一次扣10分；對(duì)單位造成重大影響的扣50分。

（4）該到位的經(jīng)費(fèi)不及時(shí)到位，一次扣5分；因工作力度不夠，造成有關(guān)單位取消到位資金的，一次扣50分。

（5）現(xiàn)金、憑證保管不當(dāng)造成丟失的，除賠償全部損失外，一次扣100分。

（6）檔案資料不全或整理不規(guī)范扣10分。

接待室崗位規(guī)范和工作標(biāo)準(zhǔn)

1、接待室工作人員必須遵守作息時(shí)間、堅(jiān)守接待崗位，按要求做好接待記錄。

2、努力學(xué)習(xí)，熟悉掌握院內(nèi)的各種情況及相關(guān)業(yè)務(wù)知識(shí)，掌握院內(nèi)的床位數(shù)、收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)、服務(wù)內(nèi)容、須知事項(xiàng)及院民守則，牢記《自費(fèi)代養(yǎng)合同書》中涉及的各項(xiàng)內(nèi)容，接待過程中做到有問必答。

3、對(duì)來院考察的老人或老人親屬態(tài)度和藹、熱情大方、主動(dòng)周到、使用文明用語，帶領(lǐng)老人到生活區(qū)、住宿區(qū)、娛樂區(qū)、健身區(qū)、休閑區(qū)參觀，如實(shí)地介紹各方面情況，客人來時(shí)熱情恭迎，客人走時(shí)主動(dòng)相送。

4、認(rèn)真仔細(xì)、客觀公正地對(duì)入院老人的身體狀態(tài)進(jìn)行評(píng)估，并確定老人的護(hù)理等級(jí)，征求老人對(duì)住房的要求，以確定收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)。若有對(duì)護(hù)理等級(jí)確定不準(zhǔn)的對(duì)象，及時(shí)向院領(lǐng)導(dǎo)報(bào)告，杜絕與老人或老人親屬發(fā)生爭(zhēng)執(zhí)。

5、評(píng)定護(hù)理等級(jí)時(shí)客觀公正，不得無故提高或降低老人的護(hù)理等級(jí)，一經(jīng)發(fā)現(xiàn)，將給予嚴(yán)厲處罰。

服務(wù)組崗位規(guī)范和崗位標(biāo)準(zhǔn)

1、服務(wù)組組長(zhǎng)崗位規(guī)范和崗位標(biāo)準(zhǔn)

（1）在院領(lǐng)導(dǎo)的領(lǐng)導(dǎo)下開展本組工作。

（2）起草本組的工作計(jì)劃、工作總結(jié)及其它文字材料并報(bào)院領(lǐng)導(dǎo)審閱。

（3）合理安排本組的值班次序，保持良好的上班秩序、工作秩序，完成本組的各項(xiàng)工作任務(wù)。

（4）制定老人娛樂、休閑、健身等活動(dòng)方案，并要求本工作人員按方案規(guī)定引導(dǎo)老人活動(dòng)。

（5）規(guī)范服務(wù)內(nèi)容，提高服務(wù)質(zhì)量，通過優(yōu)質(zhì)服務(wù)吸引更多的自費(fèi)代養(yǎng)老人。

（6）定期召開組內(nèi)職工會(huì)議，要求職工加強(qiáng)學(xué)習(xí)，努力提高自身素質(zhì)；積極探索科學(xué)的服務(wù)方法，提高服務(wù)質(zhì)量；對(duì)工作中存在的問題及時(shí)指出并予以糾正；解決工作中存在的其它問題。

（7）定期召開院民會(huì)議，對(duì)服務(wù)質(zhì)量是否滿意征求老人意見；向院民通報(bào)院內(nèi)的工作情況；向院民傳達(dá)本組的工作意愿及其它需要院民大會(huì)解決的問題。對(duì)院民宣傳健康衛(wèi)生知識(shí)及安全自衛(wèi)意識(shí)。

（8）定期組織“院民委員會(huì)”的老人召開會(huì)議，與老管會(huì)的同志一道制定“院民管理工作計(jì)劃”；評(píng)定老年人零花錢；匯總老人提出的意見及建議等，并將情況反饋到院領(lǐng)導(dǎo)，以便院領(lǐng)導(dǎo)掌握相關(guān)情況。

（9）規(guī)范本組的工作紀(jì)律、工作秩序、工作內(nèi)容，對(duì)本組人員嚴(yán)格要求，工作中嚴(yán)格按制度和程序辦事，對(duì)違反制度的同志堅(jiān)決按考核細(xì)則辦事，不當(dāng)“好人”，不循私情，不隱瞞事實(shí)依據(jù)。

（10）規(guī)范建立本組檔案資料，做好組內(nèi)的各項(xiàng)會(huì)議記錄，每周閱讀一次值班記錄，每月向院辦公室上報(bào)組內(nèi)考勤表并總結(jié)本月工作情況；規(guī)范整理院民檔案，做到檔案整理不漏人、不漏項(xiàng)。

（11）為每位新入院老人進(jìn)行初期評(píng)估、入住適應(yīng)計(jì)劃、定期評(píng)估及程序化個(gè)案服務(wù)方案。

2、服務(wù)組服務(wù)員崗位規(guī)范和崗位標(biāo)準(zhǔn)

（1）在組長(zhǎng)的領(lǐng)導(dǎo)下開展工作，服從安排，聽眾指揮，認(rèn)真做好本職工作。

（2）嚴(yán)格按《三個(gè)基本規(guī)范》的要求做好所有老人的日常生活及起居工作，根據(jù)不同老人的不同護(hù)理等級(jí)分別為老人洗漱、洗頭、洗澡、更衣、喂水喂飯、整理床鋪、大小便、服藥、翻身、修剪指甲、洗衣、洗被、洗窗簾等。

（3）幫助老人運(yùn)動(dòng)、健身、醫(yī)療，便于老人康復(fù)和保持良好的精神狀態(tài)，對(duì)因病住院或長(zhǎng)期臥床不起的老人進(jìn)行24小時(shí)守護(hù)，必要時(shí)必須安排處理能力較強(qiáng)的院民與其同住，以防發(fā)生意外。

（4）打掃室內(nèi)室外衛(wèi)生，保持24小時(shí)室內(nèi)明窗凈幾、室外干凈整潔。

（5）與老人交心談心并按要求做好談心記錄，每次交談時(shí)間不少于15分鐘，掌握每個(gè)老人的性格特點(diǎn)及飲食要求，做好當(dāng)班記錄，規(guī)范檔案資料，確保各項(xiàng)工作有據(jù)可查。

（6）工作過程中按程序和制度規(guī)范服務(wù)，嚴(yán)格作息時(shí)間，遵守工作紀(jì)律。

（7）堅(jiān)持“老人無過錯(cuò)”原則，不與老人發(fā)生爭(zhēng)執(zhí)，端正服務(wù)態(tài)度，講究工作方法，妥善處理工作中發(fā)生的矛盾和問題。遇到確實(shí)無法解決的事情及時(shí)向組長(zhǎng)或院領(lǐng)導(dǎo)反映。

（9）老人參加集體活動(dòng)、集體就餐以及健身等，工作人員必須跟隨左右，并護(hù)理介助、介護(hù)老人上下樓梯。

（10）鼓勵(lì)每個(gè)老人每天堅(jiān)持三個(gè)“半小時(shí)”，即早上半個(gè)小時(shí)鍛煉、中午半個(gè)小時(shí)休息、晚上半個(gè)小時(shí)新聞。

3、自理老人服務(wù)程序（三級(jí)護(hù)理）

（1）每天清掃房間一次，保持室內(nèi)無蠅、無蚊、無鼠、無蟑螂、無臭蟲、無異味。

（2）督促老人一周洗澡一次，衣著干凈得體，并勤換勤洗，冬、春、秋一周一次，夏季經(jīng)常換洗，確保身體無異味。

（3）協(xié)助整理床鋪及房間，被子半月清洗一次，特殊情況隨臟隨洗。

（4）督促老人洗頭、理發(fā)、修剪指甲，經(jīng)常清洗毛巾和臉盆。便器每周消毒一次

（5）服務(wù)人員24小時(shí)值班，實(shí)行程序化個(gè)案護(hù)理，視情況調(diào)整護(hù)理方案。

4、介助老人服務(wù)程序（二級(jí)護(hù)理）

（1）每天清掃房間一Ⅰ次，保持室風(fēng)無蠅、無蚊、無鼠、無蟑螂、無臭蟲、無異味。

（2）協(xié)助老人每周洗澡一次（夏季每周2次），提供干凈得體的服裝并定期換洗，冬、春、秋一周一次，夏季經(jīng)常換洗，特殊情況隨臟隨洗，確保身體無異味。

（3）協(xié)助整理床鋪及房間，被子半月清洗一次，特殊情況隨臟隨洗。

（4）定期為老人理發(fā)，協(xié)助老人洗頭、修剪指甲，毛巾、臉盆經(jīng)常清洗，便器每周消毒一次。

（5）攙扶老人大小便，Ⅰ級(jí)褥瘡發(fā)生率低于5%，Ⅱ級(jí)褥瘡發(fā)生率為零，入院前已經(jīng)發(fā)生的離外，但應(yīng)做好詳細(xì)記錄并盡可能提供防護(hù)措施。

（6）對(duì)患有傳染病的老人及時(shí)采取特殊保護(hù)措施，并對(duì)其隔離治療，以既不影響他人又尊重病患老人為原則。

（7）服務(wù)人員24小時(shí)值班，實(shí)行程序化個(gè)案護(hù)理，并視情況調(diào)整護(hù)理方案。

5、介護(hù)老人服務(wù)程序（一級(jí)護(hù)理）

（1）每天清掃房間一次，保持室內(nèi)無蠅、無蚊、無鼠、無蟑螂、無臭蟲、無異味。

（2）早晚為老人洗漱，每周為老人洗澡兩次，提供干凈得體的服裝并經(jīng)常換洗，冬、春、秋每周一次，夏季經(jīng)常換洗，特殊情況隨臟隨洗。

（3）幫助老人起床穿衣、睡前脫衣，為老人整理床鋪，被子半月清洗一次，特殊情況隨臟隨洗。

（4）定期為老人理發(fā)、修剪指甲、洗頭，經(jīng)常為老人清洗毛巾和臉盆，便器每周消毒一次。

（5）送飯到居室，喂水喂飯，幫助老人大小便，為行走不便的老人配備臨時(shí)使用的拐杖、輪椅和其它輔助器具。

（6）Ⅰ級(jí)褥瘡發(fā)生率低于5%，Ⅱ級(jí)褥瘡發(fā)生率為零，入院前已經(jīng)發(fā)生的離外。對(duì)因病情不能翻身而患褥瘡的情況應(yīng)有詳細(xì)記錄，并盡可能提供防護(hù)措施。

（7）幫助老人活動(dòng)、健身，對(duì)患有傳染病的老人采取特殊保護(hù)措施并對(duì)其隔離治療，以既不影響他人又尊重病患者為原則。

（8）服務(wù)人員24小時(shí)值班，實(shí)行程序化個(gè)案護(hù)理，實(shí)情況調(diào)整護(hù)理方案。

6、殘疾人服務(wù)程序

（1）每天清掃房間一次，做到室內(nèi)無蠅、無蚊、無鼠、無蟑螂、無臭蟲、無異味。

（2）協(xié)助殘疾人洗澡，夏季每周2次，其它季節(jié)每周1次，為殘疾人提供干凈得體的服裝并定期換洗，夏季經(jīng)常換洗，其它季節(jié)1 周1次，特殊情況隨臟隨洗。

（3）幫助殘疾人穿衣脫衣、整理床鋪，被子半月清洗一次，特殊情況隨臟隨洗。

（4）協(xié)助殘疾人理發(fā)，每月一次；協(xié)助殘疾人大小便；協(xié)助殘疾人洗頭、修剪指甲；口腔護(hù)理清潔無異味；毛巾、臉盆經(jīng)常清洗，便器每周消毒一次。

（5）為行走不便的殘疾人配備臨時(shí)使用的拐杖、輪椅和其它輔助器具。

（6）Ⅰ級(jí)褥瘡發(fā)生率低于5%，Ⅱ級(jí)褥瘡發(fā)生率為零，入院前已經(jīng)發(fā)生的離外，對(duì)因病情不能翻身而患褥瘡的情況應(yīng)有詳細(xì)記錄，并盡可能提供防護(hù)措施。

（7）視天氣情況每天帶殘疾人到戶外活動(dòng)1個(gè)小時(shí)或進(jìn)行其它健身鍛煉。

（8）特別保護(hù)女性智殘人的人身權(quán)益不受侵犯，對(duì)患有傳染病的殘疾人及時(shí)采取特殊保護(hù)措施，并對(duì)其隔離治療，以既不影響他人又尊重病患?xì)埣踩藶樵瓌t。

（9）服務(wù)人員24小時(shí)值班，實(shí)行程序化個(gè)案護(hù)理，視情況調(diào)整護(hù)理方案。

7、正班職責(zé)、工作程序及標(biāo)準(zhǔn)

（1）24小時(shí)值班，并負(fù)責(zé)轄區(qū)范圍內(nèi)的老人護(hù)理工作，當(dāng)班時(shí)間內(nèi)不得以任何理由擅自離開工作崗位。

（2）從早上6：30分開始，為老人打開水及洗臉?biāo)?/p>

（3）按要求打掃整理房間衛(wèi)生，該消毒的消毒，該清洗的清洗，同時(shí)負(fù)責(zé)老人起床、洗漱、梳理、大小便等工作。協(xié)助需要早鍛煉的老人進(jìn)行早鍛煉。

（4）招呼老人早餐，為介助、介護(hù)老人送飯到居室，并為需要喂飯喂水的老人喂飯喂水。早餐結(jié)束后清洗餐具。需要服藥的老人根據(jù)醫(yī)囑服藥。

（5）從8：30分開始，引導(dǎo)老人健身，根據(jù)不同老人的不同身體狀況、不同的健身器材，不同的運(yùn)動(dòng)性能，力爭(zhēng)每個(gè)老人都進(jìn)行鍛煉。這項(xiàng)工作11：00鐘結(jié)束。

（6）11：30分招呼老人午餐，工作內(nèi)容同（4）。

（7）12：30半鐘以前照顧老人午休，對(duì)特殊老人查房。要求每個(gè)老人至少午睡半個(gè)小時(shí)。

（8）午休結(jié)束后給老人打送洗澡水，為不能自理的老人洗澡、洗頭、修剪指甲等。

（9）下午引導(dǎo)老人看書、閱報(bào)、下棋、打牌、看電視等，并抽時(shí)間與個(gè)別老人談心，做好談心記錄，與一個(gè)老人的一次談心時(shí)間不得少于15分鐘。根據(jù)老人需要，把老人送到平臺(tái)上曬太陽。

（10）從5：00（夏季5：30）開始老人晚餐，工作內(nèi)容同。

（11）行政工作人員及副班下班后關(guān)好大門，老人不再外出。

（12）晚上組織老人看電視，陸續(xù)招呼老人就寢。晚上10：00鐘最后一次檢查老人的就寢情況，白天每隔一個(gè)小時(shí)查房一次，有特殊情況做好查房記錄。

（13）夜晚加強(qiáng)巡查發(fā)生意外情況及時(shí)、妥善處理，并向行政值班人員匯報(bào)。

8、副班職責(zé)、工作程序及標(biāo)準(zhǔn)

（1）早上8：00準(zhǔn)時(shí)上班，并按規(guī)定在記錄簿上簽字。

（2）首先協(xié)助正班到每個(gè)房間查房，準(zhǔn)確掌握每位老人的身體及生活情況。

（3）打掃健身房、活動(dòng)室、走廊、樓梯、大廳及室外衛(wèi)生，擦洗門窗、扶手及玻璃，24小時(shí)保持環(huán)境衛(wèi)生干凈整潔。

（4）協(xié)助正班組織老人健身、活動(dòng)。對(duì)有康復(fù)希望的老人耐心地指導(dǎo)老人康復(fù)健身。

（5）協(xié)助正班給老人送飯、送水。對(duì)生活不能自理的老人幫助其吃飯喝水。

（6）對(duì)不能自理的老人協(xié)助正班給老人洗澡、洗頭、換衣。

（7）若有老人生病住院，到醫(yī)院護(hù)理病人，并為病人送飯送水。

（8）若園田的任務(wù)特別緊急，需要搶種搶收，在院領(lǐng)導(dǎo)的統(tǒng)一安排下協(xié)助到園田勞動(dòng)。

（9）組織老人開展下午的活動(dòng)，同樣協(xié)助正班給老人送飯送水，需要喂飯喂水的幫助喂飯喂水。

（10）所有的工作結(jié)束后若沒有特殊事情5：00（夏季5：30）下班。若遇特殊情況，副班不能休息或不能下班回家的，服從組長(zhǎng)或院領(lǐng)導(dǎo)的統(tǒng)一安排。

9、交接班時(shí)間、程序及標(biāo)準(zhǔn)

（1）正班轉(zhuǎn)副班或副班、休假接正班的從早上8：00履行交接班手續(xù)。

（2）交接班時(shí)，交班人和接班人同時(shí)到每個(gè)房間對(duì)室內(nèi)衛(wèi)生、室內(nèi)布局及老人的身體狀況仔細(xì)地進(jìn)行檢查，發(fā)現(xiàn)問題及時(shí)指出。

（3）若有衛(wèi)生不到位，接班人可以拒絕接班；若有老人生病或身體的某一個(gè)部位受傷，應(yīng)查明原因，劃出責(zé)任界線并及時(shí)向組長(zhǎng)或院領(lǐng)導(dǎo)反映后再履行交接班手續(xù)。

（4）及時(shí)查明問題，問題查明后是交班人的責(zé)任由交班人負(fù)責(zé)。若接班人不認(rèn)真檢查，是交班者的責(zé)任但接班人沒有查出問題，一旦在交接班表上簽了字，所有的責(zé)任由接班人負(fù)責(zé)。

（5）檢查結(jié)束后，在一切正常的情況下，雙方履行交接班手續(xù)，交班人、接班人都在記錄簿上簽字。

10、房間標(biāo)準(zhǔn)

（1）衛(wèi)生到位，確保室內(nèi)無蠅、無蚊、無鼠、無蟑螂、無臭蟲，無異味，廁所無臭味。

（2）被子、床單、枕套衛(wèi)生干凈，擺放整齊。

（3）衣服、鞋子全部放到衣柜里面，床上、椅子上、柜子上不準(zhǔn)擺放。

（4）床頭柜、食品柜上面的東西干凈整齊，不凌亂，窗臺(tái)上不擺放任何東西。

（5）墻壁上面不亂釘亂掛，亂涂亂畫，窗簾整潔，不歪歪斜斜。

（6）衛(wèi)生間內(nèi)的洗漱用品、毛巾、開水瓶等擺放有序。

（7）臨時(shí)垃圾一律丟到垃圾簍里，垃圾袋隨臟隨換。

11、環(huán)境衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)

（1）24小時(shí)保持室內(nèi)外環(huán)境衛(wèi)生干凈整潔，隨時(shí)經(jīng)得起相關(guān)部門和相關(guān)人員的檢查和參觀。

（2）室內(nèi)玻璃每周擦洗一次，走廊、樓梯、寢室每天拖一次，健身房、活動(dòng)室每三天拖一次，地面隨臟隨掃。地面不得有垃圾和污物。

（3）每天擦拭扶手、桌椅、及室內(nèi)健身器材等一次，所有的器具上不得有灰塵。

（5）窗簾每一年清洗一次，特殊情況隨臟隨洗。

（6）每天打掃室外衛(wèi)生，必要時(shí)用水沖洗地面。地面不得有垃圾和其它雜物。

（7）愛惜公共財(cái)產(chǎn)，凡屬本組使用的一切用具均要干凈無污漬。

12、服務(wù)組考核細(xì)則

(1)嚴(yán)禁院民到鍋爐房打開水或提熱水，發(fā)現(xiàn)一次扣當(dāng)班人員10分；請(qǐng)?jiān)好裉衢_水、送熱水、掃地拖地或擦灰，造成院民摔傷、燙傷的，除全部支付院民醫(yī)藥費(fèi)外，一次扣100分。當(dāng)年考核按不合格等次計(jì)算。

（2）處理問題方法不當(dāng)，與老人惡言相加，一次扣10分。造成老人上訪或自費(fèi)老人離院的，一次扣50分；動(dòng)手傷害老人的，除給老人賠禮道歉、寫出書面檢討并支付老人的全部醫(yī)藥費(fèi)外，一次扣200分，并取消全年崗位津貼，情節(jié)嚴(yán)重的移交公安機(jī)關(guān)處理。造成老人意外傷亡的，只發(fā)基本生活費(fèi)；其他工作人員知道情況不及時(shí)處理也不予報(bào)告的，一次扣20分，并視情節(jié)輕重扣除崗位津貼。

（3）對(duì)重癥病人或突發(fā)病人，正班人員應(yīng)及時(shí)向醫(yī)生匯報(bào)或拿出其它緊急處理方案。必要時(shí)還要安排處理能力較強(qiáng)的院民與其同房居住，以防發(fā)生意外無人報(bào)告。若因安排不到位，報(bào)告不及時(shí)造成院民傷亡的，每發(fā)生一次扣當(dāng)班人員5-50分，并視情節(jié)輕重給予紀(jì)律處分。

（4）給不能自理的老人送飯不及時(shí)或送錯(cuò)房間，造成老人到院辦公室反映的一次扣4分，按服務(wù)程序應(yīng)該督促、幫助老人完成的日常生活起居，凡有一項(xiàng)不按規(guī)范到位的扣4分。

（5）清潔衛(wèi)生不到位或?qū)先藨B(tài)度不夠和藹，造成老人反映或經(jīng)檢查發(fā)現(xiàn)的，一次扣4分。

（6）經(jīng)老人反映，被子或衣服該洗的不洗，一件或一床扣2分；各級(jí)領(lǐng)導(dǎo)或部門來檢查，發(fā)現(xiàn)老人的衣服或被子特別臟，造成不良印象的一次扣20分；窗簾該洗的不洗，一幅扣4分。

（7）經(jīng)院領(lǐng)導(dǎo)突擊檢查，發(fā)現(xiàn)玻璃、窗臺(tái)、墻群、扶手、桌椅、健身器材等設(shè)施設(shè)備上有灰塵的，一件扣一分。若相關(guān)部門來院檢查指導(dǎo)工作，衛(wèi)生不到位，印象極差的一次扣20分。

（8）不經(jīng)組長(zhǎng)批準(zhǔn)，發(fā)生擅自調(diào)班現(xiàn)象的一次扣10分；上班時(shí)間內(nèi)不經(jīng)請(qǐng)假隨意外出的，一次扣10分；正班人員無緊要事情不得請(qǐng)人代班，自己離開崗位，每發(fā)生一次扣10分；不經(jīng)允許，擅自延長(zhǎng)休假時(shí)間的一次扣20分;曠工一天以上的，每天扣20分；曠工達(dá)一周以上的，作自動(dòng)離崗處理。不嚴(yán)格記載考勤，上報(bào)考勤不準(zhǔn)或有意弄虛作假的，一 13

次扣4分。當(dāng)班時(shí)間內(nèi)做與工作不相關(guān)的事情，發(fā)現(xiàn)一次扣1分。

（9）當(dāng)班記錄記錄不全或做虛假記錄的，一次扣4分；記錄不做，一次扣10分；不嚴(yán)格履行交接班手續(xù)的，一次扣20分；晚上10：00鐘不做一天中最后一次查房記錄的，一次扣4分。

（10）初期評(píng)估表、入住適應(yīng)計(jì)劃表、個(gè)案服務(wù)方案、定期評(píng)估表等資料填寫不全的，一人次扣4分。

（11）正班人員必須24小時(shí)堅(jiān)守工作崗位，正班人員中午睡覺或晚上10：00鐘以前就寢的一次扣4分；不論以什么理由（包括請(qǐng)人代班）參與打牌賭博的一次扣50分。

（12）按服務(wù)程序督促、幫助老人做好換季衣被、鞋襪的更換、清洗、存放工作，凡有一人不到位的，一人次扣4分；衣著不整潔、不干凈、凌亂不堪的，一人次扣2分；因工作人員工作方法不當(dāng)造成老人受傷的，一人次扣5-200分，并視情節(jié)輕重扣除全年的崗位津貼。

（13）嚴(yán)格執(zhí)行院民離院請(qǐng)銷假制度，凡院民離院請(qǐng)銷假制度不嚴(yán)，造成院民傷亡或走失的，一次扣100-200分，并取消全年的崗位津貼，只發(fā)給基本生活費(fèi)。

（14）每位工作人員應(yīng)加強(qiáng)團(tuán)結(jié)，顧全大局，全心全意為院民服務(wù)。若工作人員之間發(fā)生矛盾不能正確對(duì)待，不講團(tuán)結(jié)，不顧大局而在院內(nèi)吵鬧，造成不良影響的，每發(fā)生一次扣當(dāng)事人20分，一年內(nèi)達(dá)2次以上的作待崗處理，達(dá)3次以上的作開除處理。本組職工之間發(fā)生矛盾，組長(zhǎng)不予解決或解決不力的，發(fā)生一次扣組長(zhǎng)2分；院民發(fā)生矛盾，當(dāng)班人員不予解決或解決不力，發(fā)生一次扣當(dāng)班人員2分。

（15）凡本組工作人員一次扣分達(dá)50分以上的，組長(zhǎng)扣10分；本組人員扣全年崗位津的，組長(zhǎng)扣50分。

13、本制度從2010年1月1日起執(zhí)行。

生產(chǎn)后勤組崗位規(guī)范和崗位標(biāo)準(zhǔn)

1、事務(wù)長(zhǎng)崗位規(guī)范和崗位標(biāo)準(zhǔn)

（1）負(fù)責(zé)院民生活物資的采購工作。

（2）合理開支院民生活費(fèi)，發(fā)揮資金最大的使用效率，確保院民吃好、喝好，并確保當(dāng)月?lián)艹鰯?shù)與實(shí)際開支額控制在±5%之內(nèi)。

（3）與食堂工作人員建立相互通氣制度，征求食堂所需物資方面的建議，以便合理地采購物資。

（4）負(fù)責(zé)管好后勤賬目，建立后勤生活物資現(xiàn)金日記賬，賬目要求清楚，錢賬相符，按月扎賬。

（5）按月匯總原始憑證，建好生活檔案，檔案集中統(tǒng)一放置；按月匯總生活憑證，每月底向院領(lǐng)導(dǎo)報(bào)告當(dāng)月支出明細(xì)情況。

2、生產(chǎn)后勤組組長(zhǎng)崗位規(guī)范和崗位標(biāo)準(zhǔn)

（1）在院領(lǐng)導(dǎo)的領(lǐng)導(dǎo)下開展本組工作。

（2）起草本組的工作計(jì)劃、工作總結(jié)及其它文字材料并報(bào)院領(lǐng)導(dǎo)審閱。

（3）合理安排本組的值班次序，確保良好的上班秩序、工作秩序，完成本組的各項(xiàng)工作任務(wù)。

（4）每月定期召開膳食管理委員會(huì)的老人會(huì)議，同膳食管委會(huì)的老人一道安排好自費(fèi)代養(yǎng)老人、公費(fèi)供養(yǎng)院民一日三餐的周譜，合理調(diào)配老人生活，膳食達(dá)到80%以上的院民人滿意。

（5）定期召開組內(nèi)職工會(huì)議，要求職工加強(qiáng)學(xué)習(xí)，努力提高自身素質(zhì)；積極更新烹飪方法，提高烹飪質(zhì)量，為院民提供可口的飯菜；對(duì)工作中存在的問題及時(shí)指出并予以糾正。

（6）搞好園田的規(guī)劃及管理，定期召開生產(chǎn)勞動(dòng)人員會(huì)議，合理安排生產(chǎn)勞動(dòng)任務(wù)，確保時(shí)令蔬菜、肉類等自給自足。

（7）規(guī)范本組的工作紀(jì)律、工作秩序、工作內(nèi)容，對(duì)本組人員嚴(yán)格要求，工作中嚴(yán)格按制度和程序辦事，對(duì)違反制度的同志堅(jiān)決按考核細(xì)則辦事，不當(dāng)“好人”，不循私情，不隱瞞事實(shí)依據(jù)。

（8）同事務(wù)長(zhǎng)一起搞好物資采購及生活核算工作。

（9）規(guī)范建立本組檔案資料，完善組內(nèi)的各項(xiàng)會(huì)議記錄及進(jìn)餐記錄，每月向院辦公室上報(bào)本組的考勤表并總結(jié)本月的工作情況。

3、生產(chǎn)后勤組組員崗位規(guī)范和崗位標(biāo)準(zhǔn)

（1）在組長(zhǎng)的領(lǐng)導(dǎo)下開展工作，服從安排、聽眾指揮，認(rèn)真做好本職工作。

（2）嚴(yán)格執(zhí)行《食品衛(wèi)生法規(guī)》，嚴(yán)防食物中毒。

（3）合理調(diào)配全院老人一日三餐的生活，膳食口味達(dá)到80%以上的老人滿意。

（4）早餐要求多樣化，并視情況調(diào)整早餐種類；午餐、晚餐每餐不少于三個(gè)熟菜（不含淹菜）；飯菜的軟硬、口味符合大多數(shù)老年人的要求；為需要流食、半流食及軟食的老人制作流食、半流食及軟食。

（5）制做各種咸菜、淹菜及其它食品，增加花樣和品種，盡量滿足老人口味。

（6）做好后勤組轄區(qū)范圍內(nèi)的清潔衛(wèi)生工作，食堂用具干凈衛(wèi)生，擺設(shè)整齊有序；室內(nèi)無蚊、無蠅、無鼠、無蟑螂、無灰塵、無有毒有害物體。

（7）妥善保管生產(chǎn)后勤組的所有物資、財(cái)產(chǎn)及各種用具，愛惜公共財(cái)產(chǎn)，正確使用各種用具，注意特殊用具的操作程序（如鍋爐等）。

（8）按季節(jié)種好園田蔬菜，確保時(shí)令蔬菜自給自足；養(yǎng)好牲豬，盡量滿足豬肉自給自足。

（9）搞好各種物資的進(jìn)出庫記錄，做好進(jìn)餐記錄，建立健全生產(chǎn)后勤組各種檔案資料及記錄資料，做到每項(xiàng)工作有據(jù)可查。

4、正班工作程序及工作職責(zé)

（1）工作時(shí)間內(nèi)堅(jiān)守工作崗位，努力完成當(dāng)班工作。

（2）安排全院老人一日三餐的生活，并負(fù)責(zé)主廚。

（3）起早為老人準(zhǔn)備早餐，并注意早餐多樣化，按時(shí)開飯，按時(shí)提供開水和熱水。供應(yīng)開水及熱水時(shí)注意鍋爐的安全使用方法。

（4）早餐7：30——8：00準(zhǔn)時(shí)供應(yīng)；中餐11：30分；晚餐冬季5：00分，夏季5：30分。

（5）按一周菜譜為老人準(zhǔn)備中餐及晚餐,飯菜口味達(dá)到80%以上的老人滿意。根據(jù)服務(wù)人員的申報(bào)，負(fù)責(zé)安排好供養(yǎng)人員的整生生日餐、病號(hào)營(yíng)養(yǎng)飯以及需要流食、半流食、軟食的食物供應(yīng)。根據(jù)院領(lǐng)導(dǎo)的安排，做好客餐供應(yīng)。

（6）打掃轄區(qū)內(nèi)衛(wèi)生，定期進(jìn)行餐具消毒處理，防止病菌感染；清理食堂物資，各類食物分類存放，生熟不混放，防止食物變質(zhì)變味和食物中毒；做好各種賬目和記錄。

（7）根據(jù)季節(jié)和蔬菜品種制作各種淹菜、咸菜，該自己班上完成的工作不得拖到下一個(gè)班次。

（8）事務(wù)長(zhǎng)不在時(shí)，主動(dòng)安排當(dāng)日飯菜品種；食堂需要的其它物資均可代購。

5、副班工作程序及工作標(biāo)準(zhǔn)

（1）早上8：00鐘以前進(jìn)崗到位。

（2）打掃轄區(qū)范圍內(nèi)的室內(nèi)外衛(wèi)生，協(xié)助正班準(zhǔn)備中餐和晚餐。和正班一起為老人打飯。

（3）和正班人員一起做好各種淹菜、咸菜及其它工作。

（4）農(nóng)忙季節(jié)如果組長(zhǎng)需要與組長(zhǎng)一起到園田勞動(dòng)，無事時(shí)在食活動(dòng)，上班時(shí)間內(nèi)不得隨意到其它崗位串崗。

（5）下午開飯結(jié)束后可以回家休息，遇到中心工作或其它特殊情況服從統(tǒng)一安排。

6、交班時(shí)間、程序及標(biāo)準(zhǔn)

（1）正班轉(zhuǎn)副班或休假和副班或休假轉(zhuǎn)正班的時(shí)間為中午12：00鐘。

（2）交接班時(shí)必須履行簽字手續(xù)，交班人與接班人需同時(shí)對(duì)所有的物資進(jìn)行檢查核對(duì)，若有霉?fàn)€變質(zhì)的食物需立即報(bào)告并進(jìn)行處理，一旦發(fā)現(xiàn)其它問題要立即指出，此時(shí)發(fā)現(xiàn) 17 的問題接班人沒有責(zé)任，一切責(zé)任由交班人負(fù)責(zé)。交接班時(shí)沒有發(fā)現(xiàn)問題，交接結(jié)束后發(fā)現(xiàn)的問題一律由接班人負(fù)責(zé)。(3)雙方若不履行交接手續(xù)，在交接期間發(fā)現(xiàn)問題，一律視同交班人的責(zé)任。

7、生產(chǎn)后勤組考核細(xì)則

（1）不嚴(yán)格履行交接手續(xù)，發(fā)現(xiàn)一次扣2分。

（2）不按規(guī)定時(shí)間開飯和提供開熱水，提前或推遲達(dá)20分鐘以上者，一次扣4分。

（3）飯菜生熟不均，一次扣2分；淹菜、咸菜因方法不當(dāng)做不成功，造成原材料大量浪費(fèi)，一次扣4分。

（4）各種用具使用不當(dāng)，造成用具損壞的，一件扣4分；炊具洗滌不凈，消毒不到位，一件扣1分；衛(wèi)生不到位，食堂有蠅、蚊、鼠、蟑螂、蛆等，不及時(shí)采取措施處理的，一次扣10分；各類用具使用后不認(rèn)真收檢，到處亂扔，尤其是室外用具丟在室外，任其風(fēng)吹雨灑，日曬夜露，發(fā)現(xiàn)一次扣4分。

（5）不按程序使用鍋爐，造成嚴(yán)重事故的，一次扣100分；指使院民或其他人員操作鍋爐，發(fā)現(xiàn)一次扣10分；請(qǐng)?jiān)好竦藉仩t房上開水或熱水，發(fā)現(xiàn)一次扣10分；請(qǐng)?jiān)好裆祥_水或熱水被燙傷的，除支付全部醫(yī)藥費(fèi)外，一次扣100分。

（6）請(qǐng)?jiān)好竦绞程脦椭鍪?，造成院民受傷的，除支付全部醫(yī)藥費(fèi)外，一次扣50分。杜絕患傳染病者到食堂做事，發(fā)現(xiàn)一次扣20分。

（7）園田規(guī)劃不合理，季節(jié)上該種的蔬菜沒有種上，造成園田空閑，一次扣10分；種植的蔬菜管理不善，造成蔬菜不能自給的，一次扣5分；家禽家畜管理不善，造成家禽家畜死亡的，一次扣10分（人力不可抗拒的原因除外）。

（8）蔬菜收回食堂后，不及時(shí)處理，造成蔬菜大量浪費(fèi)甚至倒掉的，一次扣10分；事務(wù)長(zhǎng)不在，當(dāng)天生活安排不到位，造成院民為生活上訪告狀的，一次扣當(dāng)班人員10分。

（9）采購人員低值高價(jià)或數(shù)量不足，損失部分由采購人員賠償；驗(yàn)收人員不堅(jiān)持原則，隨意驗(yàn)收的，一次扣2分。

（10）食物保管不力，造成霉?fàn)€變質(zhì)的，一次扣10分；明知食物已經(jīng)不能食用而繼續(xù)食用的，一次扣10分；造成食物中毒的，只發(fā)基本生活費(fèi)并重新安排崗位，當(dāng)年考核按不合格計(jì)算；食物中毒造成人員傷亡的，移送公安機(jī)關(guān)處理。

（11）不經(jīng)組長(zhǎng)批準(zhǔn)，發(fā)生擅自調(diào)班現(xiàn)象的一次扣10分；上班時(shí)間內(nèi)不經(jīng)請(qǐng)假隨意外出的，一次扣10分；不經(jīng)請(qǐng)假，擅自延長(zhǎng)休假時(shí)間的，一次扣20分；曠工達(dá)一天以上的，每天扣20分；曠工達(dá)一周以上的，作自動(dòng)離崗處理。

（12）不嚴(yán)格記載考勤，上報(bào)考勤不準(zhǔn)或有意弄虛作假的，一次扣4分。

（13）當(dāng)班記錄記錄不全或做虛假記錄的，一次扣4分；記錄不做，一次扣10分。

（14）每位工作人員應(yīng)加強(qiáng)團(tuán)結(jié)，顧全大局，全心全意為院民服務(wù)。若工作人員之間發(fā)生矛盾不能正確對(duì)待，不講團(tuán)結(jié)，不顧大局而在院內(nèi)吵鬧，造成不良影響的，每發(fā)生一次扣當(dāng)事人20分；全年達(dá)2次以上的作待崗處理，達(dá)3次以上作開除處理。組內(nèi)職工發(fā)生矛盾，組長(zhǎng)不予解決或解決不力，發(fā)生一次扣組長(zhǎng)2分；在生產(chǎn)后勤組參加勞動(dòng)的院民發(fā)生糾紛，組長(zhǎng)或當(dāng)班人員不予解決或解決不力，發(fā)生一次扣組長(zhǎng)或當(dāng)班人員2分。

（15）處理問題方法不當(dāng)，與老人惡言相加，一次扣10分；造成老人上訪或自費(fèi)老人離院的，一次扣50分；動(dòng)手傷害老人的，除給老人賠禮道歉、寫出書面檢討并支付老人的全部醫(yī)藥費(fèi)外，一次扣100分，情節(jié)嚴(yán)重的移交公安機(jī)關(guān)處理。造成老人傷亡的，只發(fā)基本生活費(fèi)；其他工作人員知道情況不及時(shí)處理也不予報(bào)告的，一次扣20分，并視情節(jié)輕重只發(fā)基本生活費(fèi)。

8、本制度從2010年1月1日起執(zhí)行。

醫(yī)務(wù)室崗位規(guī)范和崗位標(biāo)準(zhǔn)

1、醫(yī)務(wù)室主任崗位規(guī)范和崗位標(biāo)準(zhǔn)

（1）在院領(lǐng)導(dǎo)的領(lǐng)導(dǎo)下開展工作。

（2）負(fù)責(zé)組內(nèi)工作計(jì)劃、工作總結(jié)及各項(xiàng)規(guī)章制度的起草工作，經(jīng)領(lǐng)導(dǎo)批準(zhǔn)后組織實(shí)施；不斷完善崗位規(guī)范及標(biāo)準(zhǔn)、職責(zé)、制度并經(jīng)常督促檢查，按時(shí)總結(jié)匯報(bào)；

（3）具體組織、實(shí)施全院的醫(yī)療、康復(fù)、預(yù)防、保健工作。

（4）帶頭執(zhí)行院內(nèi)的各項(xiàng)規(guī)章制度和操作規(guī)范，了解和掌握組內(nèi)工作狀況，做好本組與其它組之間的協(xié)調(diào)工作。

（5）經(jīng)常性地學(xué)習(xí)新技術(shù)、新療法，在工作中對(duì)有價(jià)值的病案進(jìn)行總結(jié)研究。

（6）負(fù)責(zé)院民的救治工作及請(qǐng)外院醫(yī)生會(huì)診，利用外院的醫(yī)療器械和技術(shù)開展醫(yī)療協(xié)作工作。

2、臨床醫(yī)師職責(zé)

（1）負(fù)責(zé)全院老人的醫(yī)療、預(yù)防保健及康復(fù)工作，擔(dān)任門診值班工作。

（2）對(duì)病員進(jìn)行檢查、診斷、治療、開寫醫(yī)囑并檢查執(zhí)行情況，同時(shí)還要做一些必要的其它檢查。

（3）書寫各項(xiàng)記錄，對(duì)新入院者及時(shí)體檢，及時(shí)寫出初期評(píng)估報(bào)告；做好查房記錄，做到處方規(guī)范、用藥合理、診斷明確。

（4）在治療疾病的同時(shí)，側(cè)重預(yù)防保健工作，防止流行性疾病及傳染病的發(fā)生和流行；對(duì)重大疾病及時(shí)報(bào)告并果斷采取措施。

（5）認(rèn)真執(zhí)行各項(xiàng)規(guī)章制度和技術(shù)操作常規(guī)，親自操作或指導(dǎo)服務(wù)人員進(jìn)行各種檢查和治療，嚴(yán)防差錯(cuò)事故。

（6）加強(qiáng)學(xué)習(xí)，不斷掌握新技術(shù)、新療法。

（7）隨時(shí)了解病人的思想、生活情況，征求病人對(duì)醫(yī)療護(hù)理工作的意見，做好病人的思想工作；控制好老人藥費(fèi)。

（8）堅(jiān)持每天查房，并做好查房記錄。

3、護(hù)士職責(zé)

（1）認(rèn)真執(zhí)行各項(xiàng)護(hù)理制度和技術(shù)操作規(guī)程，正確執(zhí)行醫(yī)囑，準(zhǔn)確及時(shí)完成各項(xiàng)護(hù)理工作，嚴(yán)格執(zhí)行查對(duì)制度，嚴(yán)防差錯(cuò)事故的發(fā)生。

（2）做好基礎(chǔ)護(hù)理和精神護(hù)理，經(jīng)常巡視院民住房，發(fā)現(xiàn)異常及時(shí)報(bào)告。

（3）認(rèn)真做好危重病人的搶救與護(hù)理。

（4）協(xié)助醫(yī)生做好各種診療工作。

（5）定期組織病人學(xué)習(xí)，宣傳健康保健知識(shí)，征求老人和家屬意見，改進(jìn)護(hù)理工作。

（6）做好消毒隔離、物資以及藥品材料的保管工作。

4、藥品管理及發(fā)放制度

為切實(shí)做好藥品的管理及發(fā)放工作，保障患者用藥安全，結(jié)合本院的實(shí)際情況，特制定以下制度：

（1）進(jìn)藥與驗(yàn)收：a、購藥應(yīng)以質(zhì)量為前提，從合法的醫(yī)藥公司進(jìn)貨，醫(yī)生進(jìn)藥采取誰進(jìn)藥誰負(fù)責(zé)的原則，對(duì)自己所購的藥品器械質(zhì)量負(fù)責(zé)。b、購藥應(yīng)有合法票據(jù)，并按規(guī)定建立購進(jìn)記錄，做到票、賬、貨相符。c、驗(yàn)收人員對(duì)購進(jìn)的藥品應(yīng)根據(jù)原始憑證嚴(yán)格驗(yàn)明藥品的合格證、藥品的通用名稱、規(guī)格、生產(chǎn)廠家、生產(chǎn)批號(hào)、有效期等。

（2）發(fā)藥與喂藥：a、調(diào)配處方必須核對(duì)患者姓名、藥品的名稱、數(shù)量、用法、用量、禁忌等。b、嚴(yán)格依據(jù)醫(yī)師的處方所列的藥品調(diào)配、發(fā)藥，不得擅自對(duì)處方所記載的藥品以及用法、用量作任何的增減、替代或變動(dòng)。c、發(fā)現(xiàn)有配伍禁忌或超劑量的處方，藥劑人員首先應(yīng)當(dāng)拒絕調(diào)配并與處方醫(yī)師取得聯(lián)系，必要時(shí)由處方師簽字更正。若處方師堅(jiān)持原處方，藥劑人員應(yīng)要求處方師重新簽字后方可調(diào)配。d、對(duì)生活能夠自理老人的藥品按處方核對(duì)后發(fā)至病人保管，并告知其用法、用量；對(duì)生活不能自理的老人或智商有問題的老人，其藥品放到值班室里，由當(dāng)班人員按醫(yī)囑按給服。

（3）登記、劃價(jià)與保管：a、每天登記好處方上的藥品，填寫好每天的處方數(shù)，并做好相關(guān)記錄。b、藥品價(jià)格略低于市場(chǎng)價(jià)，不得以任何形勢(shì)擅自提高或降低藥品價(jià)格。c、藥品保管賬目清楚，進(jìn)出賬目與實(shí)物相符；每月一扎賬，報(bào)

表到財(cái)務(wù)室。d、藥品一經(jīng)發(fā)至患者手中確認(rèn)無誤后，禁止退還和更換，禁止在藥房借、還、換藥品；e、藥品的儲(chǔ)存與存放必須分類。

（4）器械的管理：a、購進(jìn)的器械應(yīng)根據(jù)原始憑證嚴(yán)格驗(yàn)明其合格證、生產(chǎn)日期、名稱、規(guī)格、生產(chǎn)企業(yè)、生產(chǎn)批號(hào)等。b、一次性使用的醫(yī)療器械不得重復(fù)使用，使用過的應(yīng)按國(guó)家有關(guān)規(guī)定銷毀，并作記錄。

5、預(yù)防保健工作制度

（1）掌握全院老人的身體狀況，認(rèn)真做好傳染病的預(yù)防工作。

（2）每月開展一次健康知識(shí)講座活動(dòng)，做好全院健身保健及衛(wèi)生宣教工作。

（3）負(fù)責(zé)做好老人入院及定期體檢工作，掌握每個(gè)老人的健康狀況，提出保健防護(hù)措施。

（4）做好季節(jié)性的疾病預(yù)防工作。

（5）做好院民飲食保健及指導(dǎo)工作，參與討論制定食譜。

6、本制度從2010年1月1日起執(zhí)行。

第五篇：熒光PCR檢測(cè)原理

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光染料或熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)來實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板濃度進(jìn)行定量分析。其特點(diǎn)有：

(1)用產(chǎn)生熒光信號(hào)的指示劑顯示擴(kuò)增產(chǎn)物的量，進(jìn)行實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)連續(xù)的熒光監(jiān)測(cè)，避免終點(diǎn)定量的不準(zhǔn)確性，并且消除了標(biāo)本和產(chǎn)物的污染，且無復(fù)雜的產(chǎn)物后續(xù)處理過程。

(2)熒光信號(hào)通過熒光染料嵌入雙鏈DNA，或熒光探針特異結(jié)合木得檢測(cè)物等方法獲得，打打提高了檢測(cè)的靈敏度、特異性和精確性。Real-time O-PCR可以應(yīng)用于mRNA表達(dá)的研究、DNA拷貝數(shù)的檢測(cè)、單核苷酸多態(tài)性的測(cè)定、細(xì)胞因子的表達(dá)分析、腫瘤耐藥基因表達(dá)的研究以及病毒感染的定量監(jiān)測(cè)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的基本原理

在PCR反應(yīng)體系中加入熒光染料或熒光基團(tuán)，這些熒光物質(zhì)有其特定的波長(zhǎng)。儀器可以自動(dòng)檢出，利用熒光信號(hào)積累，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，在PCR循環(huán)中，測(cè)量的信號(hào)將作為熒光閾值的坐標(biāo)。并且引入一個(gè)——Ct值（Threshold cycle）概念，Ct值是指產(chǎn)生可被檢測(cè)到得熒光信號(hào)所需的最小循環(huán)數(shù)，是在PCR循環(huán)過程中熒光信號(hào)由本底開始進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)階段的拐點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的循環(huán)次數(shù)。熒光閾值相當(dāng)于基線熒光信號(hào)的平均信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。一般認(rèn)為在熒光閾值以上所測(cè)出的熒光信號(hào)是一個(gè)可信的信號(hào)，可以用于定義一個(gè)樣本的Ct值。通常用不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品的Ct值來產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后計(jì)算相對(duì)方程式。

方程式的斜度可以用來檢查PCR的效率，所有標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸分析需要存在一個(gè)高相關(guān)系數(shù)（R2＞0.99），這樣才能認(rèn)為實(shí)驗(yàn)的過程和數(shù)據(jù)是可信的，使用這個(gè)方程式計(jì)算出未知樣本的初始模板量。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀都有軟件，可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線中自動(dòng)地計(jì)算出未知樣本的初始模板量。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的應(yīng)用 1.基因工程研究領(lǐng)域

① 基因表達(dá)研究：對(duì)β地中海貧血癥患者β與γ珠蛋白mRNA水平進(jìn)行檢測(cè)，其結(jié)果特異性強(qiáng)、定量準(zhǔn)確，為了解β地中海貧血的分子病理機(jī)制及其臨床診斷提供了可靠的檢測(cè)數(shù)據(jù)。

② 轉(zhuǎn)基因研究：利用兩種發(fā)光探針及適當(dāng)?shù)难h(huán)閾值，擴(kuò)增一個(gè)轉(zhuǎn)移后的基因和一個(gè)對(duì)照基因，以分析轉(zhuǎn)基因老鼠接合性。該方法為45個(gè)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的同型結(jié)合及異質(zhì)結(jié)合提供了明確的鑒定結(jié)果。通過實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)，同型結(jié)合的異質(zhì)接合動(dòng)物交配后其子代中轉(zhuǎn)基因的傳遞情況符合孟德爾遺傳規(guī)律。這項(xiàng)技術(shù)在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物繁育及基因劑量功能效應(yīng)實(shí)驗(yàn)中將有很大的用途。③ 單核苷酸多態(tài)性（SNP）及突變分析：實(shí)時(shí)熒光定量PCR一個(gè)誘人的應(yīng)用前景是用于檢測(cè)基于兩條探針和基因組的不穩(wěn)定性?；蛲蛔兓趦蓷l探針，一條探針橫跨突變點(diǎn)，另一條為錨定探針，與無突變位點(diǎn)的靶序列雜交。兩條探針用兩種不同的發(fā)光基團(tuán)標(biāo)記。如靶序列中無突變，探針雜交便完全配對(duì)，如有突變，則探針與靶序列不完全配對(duì)，會(huì)降低雜交體得穩(wěn)定性，從而降低其熔解溫度（Tm）。這樣便可對(duì)突變和多態(tài)性進(jìn)行分析。2.醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域

① 病原體檢測(cè)：由于實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法可靠性和重復(fù)性好，并且操作簡(jiǎn)便、快速、結(jié)果判斷客觀，目前，人們用此方法對(duì)人類免疫缺陷病毒、肝炎病毒、結(jié)核桿菌、巨細(xì)胞病毒、EB病毒、流感病毒A、流感病毒B等病原體的檢測(cè)。熒光定量PCR問世后的幾年中，積累了大量有關(guān)病原體核酸量與感染性疾病發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后之間關(guān)系的資料，這些研究資料不斷豐富，將形成感染性疾病的臨床分子診斷標(biāo)準(zhǔn)。

② 藥物療效考核：利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)臨床樣品中與抗藥性相關(guān)的基因的表達(dá)。結(jié)果證明，實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)是定量檢測(cè)抗藥基因表達(dá)的可靠方法，應(yīng)用這種技術(shù)可以預(yù)測(cè)化療將引起的反應(yīng)。

③ 腫瘤基因檢測(cè)：腫瘤的本質(zhì)是細(xì)胞內(nèi)基因發(fā)生了變化，是一種多基因異常的疾病，這些異常變化用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法都可以檢測(cè)出來。

目前用此方法進(jìn)行過端粒酶hTERT基因、慢性粒細(xì)胞性白血病bcr/abl融合基因、腫瘤MDRI基因、白血病WTI基因、腫瘤ER基因、前列腺癌PSM基因、腫瘤相關(guān)的病毒基因等多種基因的表達(dá)檢測(cè)。隨著與腫瘤相關(guān)的新基因的不斷發(fā)現(xiàn)。熒光定量PCR技術(shù)將會(huì)在腫瘤的研究中發(fā)揮更大的作用。3.其他領(lǐng)域

用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對(duì)免疫組分進(jìn)行分析是其應(yīng)用的重要方面。

所謂實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。檢測(cè)方法

1.SYBRGreenⅠ法： 在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號(hào)，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會(huì)發(fā)射任何熒光信號(hào)，從而保證熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。SYBR定量PCR擴(kuò)增熒光曲線圖

PCR產(chǎn)物熔解曲線圖（單一峰圖表明PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的單一性）2.TaqMan探針法：

探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物的形成完全同步。服務(wù)流程

1.客戶認(rèn)真寫好訂單，提供待檢基因相關(guān)信息； 2.簽訂技術(shù)服務(wù)合同，支付預(yù)付款（30-50%)；

3.設(shè)計(jì)合成定量PCR引物（或客戶提供文獻(xiàn)引物委托本公司合成）； 4.DNA/RNA的抽提、定量、RNA反轉(zhuǎn)錄；

5.PCR預(yù)實(shí)驗(yàn)，主要檢測(cè)引物的特異性和擴(kuò)增效率； 6.正式定量實(shí)驗(yàn)：對(duì)所有樣品上機(jī)檢測(cè)； 7.實(shí)驗(yàn)結(jié)果和數(shù)據(jù)分析，形成報(bào)告。收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)

優(yōu)惠包干價(jià)：120元/樣/基因（SYBRgreenI法，相對(duì)定量）

（含RNA提取，反轉(zhuǎn)錄，引物合成費(fèi)用，上機(jī)測(cè)試費(fèi)用（3個(gè)重復(fù)）；一個(gè)內(nèi)參免費(fèi)（內(nèi)參3個(gè)重復(fù)）Ct值（Cycle threshold，循環(huán)閾值）的含義為：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)

（如圖1所示）。

1.熒光閾值（threshold）的設(shè)定

PCR反應(yīng)的前15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)作為熒光本底信號(hào)，熒光閾值的缺?。J(rèn)）設(shè)置是3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍，即：threshold = 10*SDcycle 3-15 2.Ct值與起始模板的關(guān)系

每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，公式如下。Ct=-1/lg(1+Ex)*lgX0+lgN/lg(1+Ex)n為擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)，X0為初始模板量，Ex為擴(kuò)增效率，N為熒光擴(kuò)增信號(hào)達(dá)到閾值強(qiáng)度時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的量。

起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)，縱坐標(biāo)代Ct值。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR所使用的熒光物質(zhì)可分為兩種：熒光探針和熒光染料?，F(xiàn)將其原理簡(jiǎn)述如下： 1.TaqMan熒光探針：PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5'－3'外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。而新型TaqMan-MGB探針使該技術(shù)既可進(jìn)行基因定量分析，又可分析基因突變（SNP），有望成為基因診斷和個(gè)體化用藥分析的首選技術(shù)平臺(tái)。

2.SYBR熒光染料：在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料非特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號(hào)，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會(huì)發(fā)射任何熒光信號(hào)，從而保證熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。SYBR僅與雙鏈DNA進(jìn)行結(jié)合，因此可以通過溶解曲線，確定PCR反應(yīng)是否特異。3.分子信標(biāo)：是一種在5和3末端自身形成一個(gè)8個(gè)堿基左右的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖環(huán)雙標(biāo)記寡核苷酸探針，兩端的核酸序列互補(bǔ)配對(duì)，導(dǎo)致熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)緊緊靠近，不會(huì)產(chǎn)生熒光。PCR產(chǎn)物生成后，退火過程中，分子信標(biāo)中間部分與特定DNA序列配對(duì)，熒光基因與淬滅基因分離產(chǎn)生熒光。1．傳統(tǒng)定量PCR方法簡(jiǎn)介

1）內(nèi)參照法：在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記，下游引物不標(biāo)記。在模板擴(kuò)增的同時(shí)，內(nèi)標(biāo)也被擴(kuò)增。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長(zhǎng)度不同，二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來，分別測(cè)定其熒光強(qiáng)度，以內(nèi)標(biāo)為對(duì)照定量待檢測(cè)模板。2）競(jìng)爭(zhēng)法：選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個(gè)新內(nèi)切位點(diǎn)的外源競(jìng)爭(zhēng)性模板。在同一反應(yīng)管中，待測(cè)樣品與競(jìng)爭(zhēng)模板用同一對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增（其中一個(gè)引物為熒光標(biāo)記）。擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競(jìng)爭(zhēng)性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個(gè)片段，而待測(cè)模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開，分別測(cè)定熒光強(qiáng)度，根據(jù)已知模板推測(cè)未知模板的起始拷貝數(shù)。

3）PCR－ELISA法：利用地高辛或生物素等標(biāo)記引物，擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合，再加入抗地高辛或生物素酶標(biāo)抗體－辣根過氧化物酶結(jié)合物，最終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實(shí)驗(yàn)，若加入內(nèi)標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)目的。2．內(nèi)標(biāo)在傳統(tǒng)定量中的作用

由于傳統(tǒng)定量方法都是終點(diǎn)檢測(cè)，即PCR到達(dá)平臺(tái)期后進(jìn)行檢測(cè)，而PCR經(jīng)過對(duì)數(shù)期擴(kuò)增到達(dá)平臺(tái)期時(shí)，檢測(cè)重現(xiàn)性極差。同一個(gè)模板在96孔PCR儀上做96次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，所得結(jié)果有很大差異，因此無法直接從終點(diǎn)產(chǎn)物量推算出起始模板量。加入內(nèi)標(biāo)后，可部分消除終產(chǎn)物定量所造成的不準(zhǔn)確性。但即使如此，傳統(tǒng)的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。3．內(nèi)標(biāo)對(duì)定量PCR的影響

若在待測(cè)樣品中加入已知起始拷貝數(shù)的內(nèi)標(biāo)，則PCR反應(yīng)變?yōu)殡p重PCR，雙重PCR反應(yīng)中存在兩種模板之間的干擾和競(jìng)爭(zhēng)，尤其當(dāng)兩種模板的起始拷貝數(shù)相差比較大時(shí)，這種競(jìng)爭(zhēng)會(huì)表現(xiàn)得更為顯著。但由于待測(cè)樣品的起始拷貝數(shù)是未知的，所以無法加入合適數(shù)量的已知模板作為內(nèi)標(biāo)。也正是這個(gè)原因，傳統(tǒng)定量方法雖然加入內(nèi)標(biāo)，但仍然只是一種半定量的方法。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測(cè)的局限，實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測(cè)一次熒光信號(hào)的強(qiáng)度，并記錄在電腦軟件之中，通過對(duì)每個(gè)樣品Ct值的計(jì)算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR無需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個(gè)基礎(chǔ)之上的： 1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時(shí)，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對(duì)數(shù)期），此時(shí)微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性極好，即同一模板不同時(shí)間擴(kuò)增或同一時(shí)間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的Ct值是恒定的。

2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知樣品進(jìn)行定量測(cè)定，因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。

外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)時(shí)熒光定量PCR是迄今為止定量最準(zhǔn)確，重現(xiàn)性最好的定量方法，已得到全世界的公認(rèn)，廣泛用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測(cè)等諸多領(lǐng)域。各級(jí)各類醫(yī)療機(jī)構(gòu)、大學(xué)及研究所、CDC、檢驗(yàn)檢疫局、獸醫(yī)站、食品企業(yè)及乳品廠等。

由于qPCR是實(shí)時(shí)定量檢測(cè)致病病原體基因核酸，因此它比化學(xué)發(fā)光、時(shí)間分辨、蛋白芯片等免疫學(xué)方法更具獨(dú)到優(yōu)勢(shì)。