第一篇：RNA抽提細(xì)節(jié)技巧小總結(jié)（共）

RNA抽提細(xì)節(jié)技巧小總結(jié)

對大部分實驗人員來說，RNA抽提比基因組DNA抽提要困難得多。事實上，現(xiàn)有的RNA抽提方法/試劑，如果用于從培養(yǎng)細(xì)胞中抽提RNA，比抽提基因組DNA更方便，成功率也更高。那為什么同樣的方法用于組織RNA的抽提，總會碰到問題呢？

組織RNA抽提失敗的兩大現(xiàn)象是：RNA 降解和組織內(nèi)雜質(zhì)的殘留。關(guān)于降解問題，首先看一下為什么從培養(yǎng)細(xì)胞中抽提RNA不容易降解?，F(xiàn)有的RNA抽提試劑，都含有快速抑制Rnase 的成分。在培養(yǎng)細(xì)胞中加入裂解液，簡單的混勻，即可使所有的細(xì)胞與裂解液充分混勻，細(xì)胞被徹底裂解。細(xì)胞被裂解后，裂解液中的有效成分立即抑制住細(xì)胞內(nèi)的Rnase，所以RNA得以保持完整。也就是說，培養(yǎng)細(xì)胞由于很容易迅速與裂解液充分接觸，所以其RNA不容易被降解；反過來講，組織中的RNA之所以容易被降解，是因為組織中的細(xì)胞不容易迅速與裂解液充分接觸所致。因此，假定有一種辦法，在抑制RNA活性的同時能使組織變成單個細(xì)胞，降解問題也就可以徹底解決了。液氮碾磨就是最有效的這樣一種辦法。但是，液氮碾磨方法非常麻煩，如果碰到樣品數(shù)比較多的時候更加會有此感覺。這樣就產(chǎn)生了退而求其次的方法：勻漿器。勻漿器方法沒有考慮細(xì)胞與裂解液接觸前如何抑制Rnase活性這個問題，而是祈禱破碎組織的速度比細(xì)胞內(nèi)的Rnase降解RNA的速度快。電動勻漿器效果較好，玻璃勻漿器效果較差，但總的來說，勻漿器方法是不能杜絕降解現(xiàn)象的。因此，如果抽提出現(xiàn)降解，原來用電動勻漿器的，改用液氮碾磨；原來用玻璃勻漿器的，改用電動勻漿器或者直接用液氮碾磨，問題幾乎100%能獲得解決。影響后續(xù)實驗的雜質(zhì)殘留問題，其原因比降解更多樣，解決方法相應(yīng)也不同。總之，如果出現(xiàn)降解現(xiàn)象或者組織內(nèi)雜質(zhì)殘留現(xiàn)象，則必須對具體實驗材料的抽提方法/試劑進(jìn)行優(yōu)化。優(yōu)化大可不必使用您的寶貴樣品：可以從市場上購買一些魚/雞之類的小動物，取相應(yīng)部分的材料用于RNA抽提，其它部分用于抽提蛋白質(zhì)——嘴用來碾磨，腸胃用來抽提。

究竟怎樣才能確保RNA抽提的成功率呢？實驗前選擇合適的方法/試劑，這是最重要的一步。好的方法/試劑在確保成功的同時，操作方便，經(jīng)濟(jì)實用。當(dāng)然，您的選擇可能仍然有問題，這就需要能正確分析實驗失敗的原因，以便改進(jìn)。

實驗前方法/試劑的選擇 0：抽提 RNA的目的

RNA用于不同的后續(xù)實驗，其質(zhì)量要求不盡相同。cDNA文庫構(gòu)建要求RNA完整而無酶反應(yīng)抑制物殘留；Northern對RNA完整性要求較高，對酶反應(yīng)抑制物殘留要求較低；RT-PCR對RNA完整性要求不太高，但對酶反應(yīng)抑制物殘留要求嚴(yán)格。投入決定產(chǎn)出，每次都以獲得最高純度的RNA為目的，勞民傷財。1：樣品的收集/保存 – 影響降解的因素

樣品離開活體/或者原來的生長環(huán)境后，樣品中的內(nèi)源酶即會開始降解RNA，降解速度與內(nèi)源酶含量及溫度有關(guān)。傳統(tǒng)上，只有兩個辦法可以徹底抑制內(nèi)源酶活性：立即加入裂解液并且徹底而迅速地勻漿；切成小塊后立即投入液氮冷凍。這兩個辦法都要求操作快速。后者適合所有的樣品，而前者只適合細(xì)胞及內(nèi)源酶含量較低的并且較容易勻漿的組織。具體地講，植物組織、肝臟、胸腺、胰腺、脾臟、腦、脂肪、肌肉組織等最好都先用液氮冷凍起來，再往下做。

2：樣品的破碎及勻漿 – 影響降解和得率的因素

樣品的破碎是為了徹底勻漿，勻漿是為了使RNA徹底完整地釋放出來。細(xì)胞無須破碎即可直接勻漿，組織需要破碎后才能勻漿，酵母菌和細(xì)菌需要先用相應(yīng)的酶破壁后才能勻漿。內(nèi)源酶含量較低并且較容易勻漿的組織可以在裂解液中通過勻漿器一次完成破碎和勻漿過

程；植物組織、肝臟、胸腺、胰腺、脾臟、腦、脂肪、肌肉組織等樣品，它們不是內(nèi)源酶含量高，就是不容易勻漿，所以必須將組織的破碎和勻漿分開操作。最可靠而且得率最高的破碎方法是使用液氮的碾磨，最可靠的勻漿方法是使用電動勻漿器。使用液氮碾磨要特別注意一點(diǎn)：在整個碾磨過程中，樣品不能融化，因為冷凍后內(nèi)源酶更容易起作用。3：裂解液的選擇 – 影響操作方便程度，內(nèi)源雜質(zhì)殘留的因素

常用的裂解液幾乎都能抑制 Rnase 活性，因此，選擇裂解液的重點(diǎn)是要結(jié)合純化方法一起考慮。只有一個例外：高內(nèi)源酶含量的樣品建議使用含苯酚的裂解液，以增加滅活內(nèi)源酶的能力。

4：純化方法的選擇 – 影響內(nèi)源雜質(zhì)殘留，抽提速度的因素

對于干凈的樣品，如細(xì)胞，手邊的幾乎任何純化方法都可以獲得滿意的結(jié)果。但對于許多其它樣品，尤其是植物、肝臟、細(xì)菌等雜質(zhì)含量很高的樣品，選擇合適的純化方法是至關(guān)重要的。柱離心式純化方法抽提速度快，能有效去除影響RNA后續(xù)酶反應(yīng)的雜質(zhì)，但價格較貴；使用經(jīng)濟(jì)而經(jīng)典的純化方法，如LiCl沉淀等，也可以獲得滿意的結(jié)果，但操作時間長。

RNA 抽提的―三大紀(jì)律八項注意‖

紀(jì)律一：杜絕外源酶的污染。

注意一：嚴(yán)格戴好口罩，手套。

注意二：實驗所涉及的離心管，Tip 頭，移液器桿，電泳槽，實驗臺面等要徹底處理。

注意三：實驗所涉及的試劑/溶液，尤其是水，必須確保RNase-Free。

紀(jì)律二：阻止內(nèi)源酶的活性

注意四：選擇合適的勻漿方法。

注意五：選擇合適的裂解液。

注意六：控制好樣品的起始量。

紀(jì)律三：明確自己的抽提目的

注意七：任何裂解液系統(tǒng)在接近樣品最大起始量時，抽提成功率急劇下降。

注意八：RNA 抽提成功的唯一經(jīng)濟(jì)的標(biāo)準(zhǔn)是后續(xù)實驗的一次成功，而不是得率。

RNase 污染的10大來源

1：手指頭 – 手指頭是外源酶的第一來源，所以必需戴手套并且頻繁更換。另外，口罩也必需戴，因為呼吸也是一個重要的酶來源。戴手套口罩的另外的好處是保護(hù)實驗人員。

2：槍頭，離心管，移液器 單純的滅菌是不能滅活RNase的，所以槍頭和離心管要用DEPC處理，即使是標(biāo)明為DEPC處理過的。移液器最好是專用的，用前用75%的酒精棉球搽拭干凈，尤其是桿子；另外，一定不要使用褪頭器。

3：水/緩沖液 一定要確保無RNase污染。

4：實驗臺面最起碼要用 75% 的酒精棉球搽拭干凈。

5：內(nèi)源 Rnase 所有組織均含內(nèi)源酶，故組織用液氮速凍是降低降解的最好辦法。液氮保存/碾磨方法的確不方便，但對有一些內(nèi)源酶含量很高的組織，卻是唯一的辦法。

6：RNA 樣品 RNA抽提產(chǎn)物可能都會含痕量的RNase污染。

7：質(zhì)粒抽提 質(zhì)粒抽提往往用到RNase降解RNA，殘留的RNase要用 Proteinase K 消化，PCI 抽提。

8：RNA 保存 即使低溫保存，痕量的RNase亦會導(dǎo)致RNA降解。長期保存RNA的最好辦法是鹽/醇懸液，因為醇在低溫時抑制所有的酶活性。

9：陽離子(Ca, Mg)在含這些離子時，80℃加熱5分鐘會導(dǎo)致RNA被剪切，故如果RNA需要被加熱，保存液需要含螯合劑(1mM Sodium Citrate, pH 6.4)。

10：后續(xù)實驗所用的酶 酶均有可能被Rnase污染。

RNase 和 DEPC 處理

1：高壓滅菌是可以滅活部分RNase A 的。實驗證明：37℃與RNA反應(yīng)，沒有滅菌的PBS活性點(diǎn)為100 pg/ml，滅菌后的活性點(diǎn)為100ng/ml。當(dāng)然，滅菌后RNase 仍然不能認(rèn)為沒有殘留。

2：DEPC在水中半衰期為30分鐘。經(jīng)15分鐘滅菌后可以認(rèn)為徹底破壞了0.1%DEPC中的DEPC，破壞后可以聞到一點(diǎn)氣味。

3：在1M Tris, 1M HEPES, 1M MOPS 中分別加入1ug/ml Rnase A和0.1%及1%DEPC。實驗結(jié)果提示，0.1% DEPC只對MOPS有效，而1% DEPC對三種試劑都有效。

4：0.01%DEPC，0.1% DEPC，1% DEPC有效去除的RNase A的濃度分別為：100ng/ml，500ng/ml，1 ug/ml。但要注意，DEPC 滅活后的副產(chǎn)品，對有些后續(xù)實驗是有影響的。

RNA 抽提的10大竅門

1：快速阻止Rnase活性樣品收集后快速冷凍，裂解時快速操作滅活Rnase。

2：選擇合適的抽提方法高核酶含量的組織，脂肪組織最好用含苯酚的方法。

3：預(yù)判質(zhì)量要求Northern，cDNA文庫構(gòu)建對完整性要求高，RT-PCR,RPA(Ribonuclease protection assay)對完整性要求不是很高。RT-PCR對純度(酶抑制物殘留)要求很高。

4：徹底勻漿是提高得率和降低降解的關(guān)鍵。

5：檢查 RNA 的完整性 電泳檢測，28S:18S =2:1是完整的標(biāo)志，1:1對大部分實驗也是可以接受的。

6：去除 DNA 用于 RT-PCR, array analysis 最好用Dnase I去除DNA。

7：降低外源酶的污染 不能從外面又導(dǎo)入酶。

8：低濃度的核酸濃縮時，要加入助沉淀試劑。但要防止助沉淀劑含酶及DNA污染。

9：徹底溶解 RNA，必要時可以65℃加熱5分鐘。

10：合適的保存方法 – 短時間可以–20℃保存，長期請保存于–80℃。提高 RNA 得率

首先要意識到不同得樣品其RNA含量差別很大。高豐度(2-4ug/mg)的如肝臟、胰腺、心臟，中豐度(0.05-2ug/mg)的如腦、胚胎、腎臟、肺、胸腺、卵巢，低豐度(<0.05ug/mg)的如膀胱、骨、脂肪。

1：裂解細(xì)胞使RNA釋放出來，RNA如果不被釋放出來，得率是會降低的。電動勻漿比其它勻漿方法效果更好，但也可能需要結(jié)合其它得方法，如液氮搗碎，酶消化(Lysozyme/Lyticase)。

2：抽提方法的優(yōu)化?；诒椒拥姆椒ǖ淖畲髥栴}是分層不徹底和部分RNA的丟失(不能全部將上清取出)。分層不徹底是因為核酸和蛋白質(zhì)含量高，可以用增加裂解液用量或者降低樣品量解決。脂肪組織要增加一步氯仿抽提。RNA的丟失可以用反抽方法或者去除有機(jī)層后再離心的方法降低?；谥x心式方法的最大問題是樣品過量。

經(jīng)典抽提小技巧

1：Phenol純化：將等體積的Phenol/Chloroform（1:1）加入，劇烈混勻1-2 分鐘，高速離心2分鐘，小心取上清(80-90%)，絕不能取到中間層。可以使用等體積的反應(yīng)液加入 Phenol/Chloroform 中，同樣再取出上清。將兩次的上清混在一起用于核酸沉淀，可以提高得率?；靹驎r不能太溫和，也不要試圖取出全部上清。

2：70-80% 乙醇洗滌：洗滌時，一定要將核酸懸浮起來，才能保證殘留的鹽被洗去。同時，在倒掉乙醇后，立即高速離心數(shù)秒，再用移液器去除殘留的乙醇。室溫靜置 5-10分鐘后，溶解。特殊組織的抽提

纖維組織：心臟/骨骼肌等纖維組織抽提RNA關(guān)鍵在徹底破碎組織。這些組織細(xì)胞密度低，故單位重量的組織RNA的含量就少，最好用盡可能多的起始量。一定要在冷凍條件下將組織徹底磨碎。

蛋白/脂肪含量高的組織：腦/植物脂肪含量高，PCI抽提后，上清含白色絮狀物，必須用氯仿再次對上清進(jìn)行抽提。

核酸/核酶含量高的組織：脾/胸腺等核酸和核酶含量很高。在冷凍條件下碾磨組織，再快速勻漿，能有效滅活核酶。但如果裂解液太粘稠(因為核酸含量高的緣故)，PCI抽提不能有效分層；加入更多裂解液可以解決此問題。多次PCI抽提可以去除更多殘留的DNA。如果加入醇后馬上有白色沉淀形成提示有DNA污染。溶解后用酸性PCI再次抽提，可以去除DNA污染。

植物組織：植物組織比動物組織更為復(fù)雜。一般，大家都是在液氮條件下對植物進(jìn)行碾磨的，所以內(nèi)源酶作用使RNA降解的現(xiàn)象不常見。如果降解問題不能解決，幾乎可以肯定是樣品中的內(nèi)含雜質(zhì)導(dǎo)致。許多植物的內(nèi)含雜質(zhì)都會殘留，之所以殘留，往往是因為這些雜質(zhì)與RNA有一些相似性：你沉淀我沉淀，你吸附我吸附。這些特點(diǎn)決定了它們是非常強(qiáng)的酶抑制劑。目前，商品化的RNA抽提試劑經(jīng)過調(diào)整大部分可以適合幾乎所有的動物組織，適合大部分植物組織RNA抽提試劑相對少一些。樣品凍融的影響

冷凍的樣品可能較大，用于抽提RNA之前，需要切割。切割過程中樣品往往出現(xiàn)融化。冷凍的樣品抽提RNA前可能還要稱重，這個過程肯定會出現(xiàn)融化。有時候，液氮碾磨過程中也會出現(xiàn)樣品的融化；或者冷凍樣品不經(jīng)過液氮碾磨直接加入裂解液中，在徹底勻漿前肯定會出現(xiàn)融化。實驗表明，冷凍組織在融化過程中比新鮮組織更容易發(fā)生RNA的降解?？赡艿脑蚴牵簝鋈谶^程破壞了細(xì)胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)，使內(nèi)源酶更容易與RNA直接接觸。RNA質(zhì)量的判斷

通常，使用電泳判斷RNA的完整性，使用A260/A280 判斷RNA的純度。理論上，完整的 RNA 擁有28S:18S = 2.7:1 的比例，大部分資料則強(qiáng)調(diào) 28S:18S = 2:1 的比例。事實是，除了細(xì)胞外，從其它樣品中抽提的RNA幾乎都得不到2:1 的比例(此結(jié)論使用 Agilent Bioanalyzer 獲得)。RNA的電泳結(jié)果受許多因素的影響，包括二級結(jié)構(gòu)、電泳條件、上樣量、被EB飽和的程度等。使用非變性電泳檢測RNA，以DNA Marker做對照，如果2kb處的28S和0.9kb處的18S條帶清晰，且28S:18S > 1，該完整性可以滿足絕大部分后續(xù)實驗要求了。A260/A280是一個給大家?guī)碓S多困惑的指標(biāo)。首先要明確該指標(biāo)用于核酸的原始含義是：純的RNA，其A260/280 = 2.0 左右。純RNA是?因‘，A260/A280 = 2是?果‘?，F(xiàn)在大家卻在拿A260/A280當(dāng)?因‘用，認(rèn)為―如果 A260/A280 = 2，所以 RNA 是純的‖，自然會產(chǎn)生困惑。有興趣的話，可以在您的RNA樣品中加入一點(diǎn)抽提中經(jīng)常使用的試劑，如苯酚、異硫氰酸胍、PEG 等，再測A260/A280比值?，F(xiàn)實是，許多抽提RNA時使用的試劑，以及樣品中的許多雜質(zhì)都在A260和A280處附近有吸收，對 A260/A280產(chǎn)生影響。目前最具有指導(dǎo)性的做法是：對RNA樣品在200-300 nm

范圍掃描。純 RNA的曲線具有如下特點(diǎn)：曲線平滑，A230和A260是兩個拐點(diǎn)，A300接近0，A260/A280 = 2.0左右，A260/A230 = 2.0 左右。如果沒有掃描數(shù)據(jù)，也一定要測定A260/A230 比值，因為該比值對所有影響酶反應(yīng)的雜質(zhì)的殘留更敏感。要考慮設(shè)備的線形范圍(A260 要處于 0.1 – 0.5 之間)。另外有兩個有用的現(xiàn)象：在水中測定 A260/A280，比值將變低 0.3 左右；而在 10mM EDTA 中測定的比值比在 1mM EDTA 中測定的高 0.2 左右。

第二篇：RNA抽提知識

RNA抽提

1：RNA抽提原理

簡單地講，RNA抽提包含樣品的裂解和純化兩大步驟。裂解是使樣品中的RNA游離在裂解體系中的過程，純化則是使RNA與裂解體系中的其它成分，如DNA、蛋白質(zhì)、鹽及其它雜質(zhì)徹底分離的過程。Trizol試劑的出現(xiàn)基本能解決絕大部分樣品RNA抽提，該方法已經(jīng)成為了 RNA 抽提的主流。

2：了解你的實驗樣品

如果你研究某個實驗樣品，并且要抽提它的RNA，以下的信息一定要先行收集：該樣品的RNA含量、酶含量、特殊雜質(zhì)含量。如果你對樣品的特點(diǎn)一無所知，當(dāng)樣品稍微有一點(diǎn)復(fù)雜時，抽提RNA的實驗就會碰到許多問題。以血液為例，如果你不知道鳥的血液中有核細(xì)胞的含量是人血的千倍左右，而使用人血一樣的起始量去抽提鳥血的基因組 DNA，怎么可能成功？失敗了又怎么知道原因所在？同時，只有對實驗樣品有所了解，才能正確選擇抽提方法。但同時提醒的是：沒有信息是可怕的，更可怕的是將錯誤的信息當(dāng)真的了。

3：實驗樣品量的取用

樣品與Trizol的比例。這個問題非常重要，應(yīng)該獲得足夠的重視。Trizol的Protocol，提供了一個簡單的比例，1ml 裂解液可以用于 50-100mg 組織或5-10X106個細(xì)胞；我的建議是，樣品量絕對要小于資料所提供的。起始樣品用多大，并沒有具體的說法。如果不是樣品量有限，則以能抽提出滿足數(shù)次成功實驗所需的RNA，作為決定樣品起始量的基礎(chǔ)，會比較合理的。不要因為 1ml 裂解液可以抽提 100mg 樣品，就一定使用 100mg 樣品。裂解液的用量，表面上與抽提的結(jié)果(純度及得率)沒有關(guān)系，然而，在實際操作中，對結(jié)果是有比較大的影響的。裂解液的用量原則是：確保能徹底裂解樣品，同時使裂解體系中核酸的濃度適中。濃度過低，將導(dǎo)致沉淀效率低，影響得率；濃度過高，去除雜質(zhì)的過程復(fù)雜且不徹底，導(dǎo)致純度下降。不同得樣品其RNA含量差別很大。高豐度(2-4ug/mg)的如肝臟，胰腺，心臟，中豐度(0.05-2ug/mg)的如腦，胚胎，腎臟，肺，胸腺，卵巢，低豐度(<0.05ug/mg)的如膀胱，骨，脂肪?？紤]后續(xù)實驗，一般情況下，高豐度的樣品取用量大概是10-20mg/ml Trizol,中豐度樣品50mg/ml Trizol,低豐度樣品我們可以根據(jù)客戶提供的實驗樣品量酌情取用。重申一下，不是越多越好，在考慮樣品在1ml Trizol里能充分裂解的同時，還得考慮大量的樣品可能也會帶來大量的雜質(zhì)！利用Trizol試劑抽提血清樣品時，Trizol /血清比值不要小于7/3。石蠟樣品由于RNA降解嚴(yán)重，含量大打折扣，所以取樣時應(yīng)該按低豐度樣品原則取用。

3：裂解方法

裂解的目的就是破壞細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，釋放出里面的RNA，使其溶解于裂解液中。絕大部分樣品的裂解，比如凍存的細(xì)胞，心、肝、脾、肺、腎等，利用Trizol試劑，普通的勻漿方法就可以達(dá)到滿意的效果！但是如果碰到比較特殊的樣品，我們可能要附加一些其他的輔助手段。1）骨骼。骨骼組織質(zhì)地堅硬，普通的勻漿器根本無法使其破碎，以致RNA不能完全釋放溶解在TRIZOL試劑中，碰到這種類型的樣品，我們必須先利用液氮把樣品破碎成粉末狀，Trizol懸浮混勻再利用Minibeadbeater勻漿5分鐘。取上清, 2000g 4℃離心5min再取上清 去沉淀。2）細(xì)菌 Trizol雖然對細(xì)胞的裂解效果出眾，但是對細(xì)菌堅韌的細(xì)胞壁還是無可奈何，這時我們可以利用超聲來輔助破壁。將細(xì)菌重懸于300ul的Trizol中，置于Bioruptor冰水浴中，M 檔 30s “on”、30“off”超聲處理1—2 min.取出用Trizol將體積補(bǔ)至1ml。3)酵母 酵母細(xì)胞跟細(xì)菌一樣，還是因為細(xì)胞壁的原因，不能充分裂解。Zymolyase在37℃ 40分鐘可以很好的消化掉酵母細(xì)胞壁，這里需要提醒的是消化緩沖液不能有外源性RNA酶污染，最好附加使用RNA酶抑制劑，做好了這點(diǎn)就不用擔(dān)心這步有RNA降解的問題。4）石蠟包埋樣品 石蠟包埋的組織樣品在加Trizol裂解前必須先脫蠟，脫蠟的效果直接影響后續(xù)實驗，所以我們?yōu)槭姑撓灣浞?，選用高溫脫蠟與二甲苯脫蠟相結(jié)合的兩步脫蠟法。脫蠟后加入Trizol勻漿。5）脂肪 脂肪組織可以直接用Trizol 勻漿，這里需要提醒的是脂肪組織勻漿后，需室溫靜置5min，再室溫7500g 離心5分鐘，去除上面的脂肪層再繼續(xù)后續(xù)實驗！

4：分相

Trizol里含有的物質(zhì)之一“酚”去除蛋白質(zhì)是有一定的飽和度的。超過了該飽和度，裂解體系中的蛋白質(zhì)不會被一次去除，裂解勻漿后的樣品，按1ml Trizol 加200ul 的氯仿，震蕩離心，絕大部分樣品在這一步是不需要用特殊方法對待的，但對于蛋白含量比較高的組織樣品必須要二次抽提，甚至多次抽提方可徹底去除。這里要著重提到的是血清樣品！離心分相后，取上清這一步是分相實驗的操作難點(diǎn)，一定要謹(jǐn)慎，萬不可混入有機(jī)相污染，原則是寧缺勿濫！

5:異丙醇的沉淀

異丙醇的沉淀，目的是使RNA從裂解體系中沉淀下來，從而實現(xiàn)RNA與其它雜質(zhì) – 主要是鹽 – 的分離。實際操作中，有的雜質(zhì)也會與RNA一起被醇沉淀下來，尤其是當(dāng)其它雜質(zhì)的濃度也比較高的時候。異丙醇的沉淀并不是非常特異性的，有機(jī)大分子及一些鹽，當(dāng)濃度達(dá)到一定水平后，都可能同步被沉淀下來。在不影響后續(xù)實驗的情況下，我們是可以忽略這些鹽污染。有些實驗樣品，由于前期用藥物或某種方法處理過，導(dǎo)致會殘留有一些特殊的雜質(zhì)，之所以殘留，往往是因為這些雜質(zhì)與RNA有一些相似性：你沉淀我沉淀，你吸附我吸附。這些特點(diǎn)決定了它們往往是非常強(qiáng)的酶抑制劑，對后續(xù)實驗影響非常大。這里介紹有幾種方法除去這些雜質(zhì)：1）TRIzol 提供的一個沉淀方案：一半異丙醇加一半高鹽溶液替代純粹的異丙醇，可以大大降低多糖殘留。2）介質(zhì)純化：遇到一些與RNA共同沉淀下來且影響后續(xù)實驗的一些雜質(zhì)，可以利用BioMag公司提供的連有 Oligo dT的磁珠純化出總RNA中的mRNA，這個方法優(yōu)點(diǎn)是基本能解決絕大多數(shù)有雜質(zhì)污染的總RNA（目前沒有遇到這種方法處理不了的），缺點(diǎn)是成本比較高。對與RNA含量少的樣品，直接異丙醇沉淀得率會很低，而且基本看不見沉淀物，這也會給后續(xù)的操作帶來很大的麻煩，進(jìn)一步損失RNA。遇到這種情況我們可以使用一種媒介(Golycogen)跟RNA共同沉淀下來，這種媒介物質(zhì)既能很好的跟RNA共同沉淀下來，又不會影響后續(xù)實驗。不要迷信試劑說明書里的標(biāo)準(zhǔn)方法；有時，使用標(biāo)準(zhǔn)方法碰到問題在標(biāo)準(zhǔn)方法中是找不到答案的，要具體問題具體分析。

6：洗滌

洗滌注意四點(diǎn)：首先一定要將沉淀懸浮起來；第二就是要有一定的時間，尤其是當(dāng)RNA沉淀比較大時 ；第三是少量多次；第四則是去上清要徹底。在異丙醇沉淀后，絕大多數(shù)時是能看見管底的白色沉淀，但還是有時候是看不見的，即使是加過Golycogen的。遇到這種情況不要慌，沒看見不等于沒有，遇到這種情況可以先用移液器小心的吸去上清，注意槍頭不要碰到管壁。加入75%乙醇，上下顛倒幾次，短暫離心后用移液器吸去上清，同時仔細(xì)觀察管壁是否有掛液。如果有，那沒問題，可以確定沉淀都附在管壁上了。

7：RNA的溶解和保存

純化后的RNA溶解以水為主，用無Rnase酶的水溶解的RNA基本上還算穩(wěn)定，其穩(wěn)定與溫度成反比，與濃度成正比。所以抽提好的RNA應(yīng)盡快保存在-70℃，避免反復(fù)凍融，同時注意不要把濃度稀釋的太低，大概保持在1000ng/ul。如果溫度合適，保存中RNA發(fā)生降解或者消失，其原因應(yīng)該是酶殘留導(dǎo)致的酶解。

8：RNA質(zhì)量的檢測問題

將抽提好的RNA直接用于后續(xù)的實驗，是唯一可靠的檢測方法；除此之外的檢測方法，都是相對的，不可全信。目前實驗室用于正式實驗前檢測RNA質(zhì)量的方法，一是電泳，二是NANO-Drop。電泳檢測的主要是RNA的完整性和大小，該方法還是比較可信的；同時電泳還可以用于估計核酸的濃度，其準(zhǔn)確度與經(jīng)驗有關(guān)；另外，電泳也可能提供某些雜質(zhì)污染的信息，但是同樣與經(jīng)驗有關(guān)。NANO-Drop檢測的是純度和核酸含量。然而，由于NANO-Drop不能確保非常準(zhǔn)確，所以，提供的結(jié)果并不十分可信。一般講，同時進(jìn)行NANO-Drop檢測和電泳檢測，綜合二者的結(jié)果，可以做出一個更合理的判斷。但由于這兩個方法都有缺陷，所以，即使出現(xiàn)壞的結(jié)果能用于后續(xù)實驗而好的結(jié)果卻不能用于后續(xù)實驗，也不用大驚小怪。（A260/A280 比值低 – 蛋白質(zhì)殘留但更可能是苯酚殘留。A260 值提示的含量與電泳檢測時提示的含量有可見的誤差可初步判斷是苯酚殘留。）

第三篇：血液總RNA抽提

血液總RNA抽提

1.取250ul血清加入750ul Trizol LS（用于液體中RNA的抽提）中，劇烈震蕩，靜置。2.加入200ul 三氯甲烷，劇烈震蕩，靜置10min。3.4度，12000g 離心15min。4.吸上清至新的EP管，加入500ul(與所吸出的上清比列為1:1)異丙醇，并加入1ul的糖原，輕輕上下顛倒混勻，-20度冰箱沉淀過夜。5.4度，12000g 離心15min。留沉淀（RNA），將上清倒掉，加入1ml 75%的乙醇（DEPC水配），上下顛倒，洗滌RNA沉淀。6.4度7500g離心10min。去上清，將沉淀晾干（不能太干）加入10ul左右的Rnase free 的水溶解即可。

第四篇：RNA的抽提與鑒定

RNA的抽提與鑒定

背景

核糖核酸(RiboNucleic Acid，簡稱RNA)是由至少幾十個核糖核苷酸通過磷酸二酯鍵連接而成的一類核酸,因含核糖而得名,簡稱RNA。

遺傳信息從DNA傳遞給RNA，再從RNA傳遞給蛋白質(zhì)，即完成遺傳信息的轉(zhuǎn)錄和翻譯的過程。也可以從DNA傳遞給DNA，即完成DNA的復(fù)制過程。這是所有有細(xì)胞結(jié)構(gòu)的生物所遵循的法則。在某些病毒中的RNA自我復(fù)制(如煙草花葉病毒等)和在某些病毒中能以RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄成DNA的過程(某些致癌病毒)是對中心法則的補(bǔ)充。

三種常見的RNA 1.mRNA 信使RNA 功能：蛋白質(zhì)合成的直接模板 2.tRNA 轉(zhuǎn)運(yùn)RNA 功能：氨基酸的運(yùn)載體

3.rRNA 核糖體RNA 功能：核糖體的組成成分，蛋白質(zhì)的合成場所

其他小分子RNA 1.hnRNA 核內(nèi)不均一RNA 成熟mRNA的前提 2.snRNA 核內(nèi)小RNA 參與hnRNA的剪接與轉(zhuǎn)運(yùn) 3.snoRNA 核仁小RNA rRNA的加工與修飾

4.scRNA/7SL-RNA 胞質(zhì)小RNA 蛋白質(zhì)內(nèi)置為定位合成信號識別體組成成分 5.siRNA 小的干擾RNA siRNA在RNA沉寂通道中起中心作用，是對特定信使RNA（mRNA）進(jìn)行降解的指導(dǎo)要素

實驗原理

細(xì)胞中的RNA可分為信使RNA，轉(zhuǎn)運(yùn)RNA和核糖體RNA三類，這三種類型的RNA都存在于細(xì)胞質(zhì)中，所以從不同組織中提取的總RNA的本質(zhì)就是細(xì)胞的裂解，RNA的釋放，通過不同的方式去除蛋白質(zhì)，DNA等雜質(zhì)，最終獲得高純度的RNA產(chǎn)品工藝。

實驗?zāi)康?/p>

1完整RNA的提取和純化,是進(jìn)行RNA方面的研究工作,如Nothern雜交、mRNA分離、RT-PCR、定量PCR、cDNA合成及體外翻譯等的前提。2臨床診斷中的應(yīng)用：病毒檢測等

RNA提取的方法及步驟

1提取總核酸，再用氯化鋰將RNA沉淀出來。（該方法將導(dǎo)致小分子量RNA的丟失，目前該方法的使用頻率已很低。）

2在酸性條件下抽提，酸性下DNA與蛋白質(zhì)進(jìn)入有機(jī)相而RNA留在水相，而達(dá)到分離RNA的目的。

根據(jù)所用蛋白質(zhì)變性劑種類不一樣分為以下兩種制備方法： 1胍鹽法：異硫氰酸胍和硫氰酸胍 2LiCl/尿素法 以胍鹽法最好，對于從那些RNase含量很高的組織（胰臟）中提取RNA特別有效，可使RNase迅速變性，制備的RNA有較高翻譯活性。

Trizol（異硫氰酸胍-苯酚法）

1由苯酚和硫氰酸胍等配制而成的單相的快速抽提試劑；

2可在破碎細(xì)胞、降解細(xì)胞其它成分的同時保持RNA的完整性；

3在氯仿抽提、離心分離后，RNA處于水相中，將水相轉(zhuǎn)管后用異丙醇沉淀RNA； Trizol可以從最少100個細(xì)胞或1mg組織中提取RNA。如果細(xì)胞量過少或組織來源特異，可以采用相應(yīng)試劑盒提取RNA。

Trizol法的原理

1異硫氰酸，β-巰基乙醇，SDS裂解細(xì)胞

2酸性條件（pH4.0)下酚、氯仿抽提，離心，蛋白質(zhì)，DNA和脂質(zhì)進(jìn)入有機(jī)相，而RNA存在于水相

3異丙醇沉淀水相中的RNA

Trizol法提取RNA操作步驟

1.剪碎的鼠肝中加入Trizol試劑，進(jìn)行機(jī)械勻漿，取1ml Trizol勻漿液于1.5ml離心管內(nèi)，室溫放置5分鐘，以充分裂解細(xì)胞。目的：變性劑充分作用裂解細(xì)胞，釋放核酸。2.每管加入200ul氯仿，振蕩混勻后室溫放置15min；注：禁用漩渦振蕩器，以免基因組DNA斷裂。

3.4℃ 12,000rpm離心15min；

4.吸取上層水相，至另一離心管中；注：不要吸取中間界面。目的：分離RNA、DNA、蛋白質(zhì)等。

5.加入0.5ml 異丙醇混勻，室溫放置5-10min；

6.4℃ 12,000g離心10min，棄上清，RNA沉于管底；目的：沉淀RNA。異丙醇會奪取大量RNA分子間的水分子，因此RNA分子之間就容易形成氫鍵而發(fā)生沉淀。7.按1ml 75%乙醇/ml Trizol加入75%乙醇，溫和振蕩離心管，懸浮沉淀。（此時可放-70℃保存）目的：洗滌RNA，去除殘余的鹽類等雜質(zhì)。8.4℃10000rpm離心5min，盡量棄上清。

9.短暫離心收集管壁液體并吸棄。室溫晾干2-3min。注：RNA樣品不要過于干燥，否則很難溶解。

10.用200ul(體積可根據(jù)RNA的沉淀量具體調(diào)整)DEPC處理的H2O溶解RNA樣品，溶解后立即置于冰上。注：H2O、TE或0.5%SDS均須用DEPC處理并高壓。

簡易TBE電泳觀察RNA的完整度 1制膠：瓊脂糖凝膠粉（0.7%），消毒TBE緩沖液，Goldview顯色劑

2上樣：10ul樣品（含上樣緩沖液）混勻后，加入凝膠孔中；上樣緩沖液（loading Buffer): 溴酚藍(lán)、二甲苯青FF、蔗糖，甘油 3電泳：電泳110V，15min。4紫外燈下觀察

RNA 質(zhì)量及純度的分析

方法

一、檢測RNA溶液的吸光度 260、320、230、280nm的吸光度分別代表核酸、背景（溶液渾濁度）、鹽濃度和蛋白質(zhì)的水平；

純的RNA，230：260：280＝1：2：1；

一般OD260/OD280= 1.8~2時，我們認(rèn)為RNA中蛋白或者時其他有機(jī)物的污染是可以容忍的； 當(dāng)R<1.8時，溶液中蛋白或者時其他有機(jī)物的污染比較明顯； 當(dāng)R>2.2時，說明RNA已經(jīng)水解成單核酸了； RNA濃度=OD260×40μg/ml×稀釋倍數(shù)。

方法

二、RNA的電泳圖譜

檢測28S和18S條帶的完整性和他們的比值，或者是mRNA smear的完整性。一般28S和18S條帶明亮、清晰、條帶銳利（指條帶的邊緣清晰），并且28S的亮度在18S條帶的兩倍以上，我們認(rèn)為RNA的質(zhì)量好。

方法

三、保溫試驗

RNA溶液在70℃的恒溫水浴中保溫1 h。另一份放置在-20℃冰箱中保存1 h。比較兩者的電泳條帶，說明RNase的污染情況。

如何盡量避免RNA的降解？

1及時處理樣本，或置液氮中保存

2試驗器皿及配置試劑用水用0.1%DEPC處理且高壓消毒 3盡可能早的去除組織與細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì) 4聯(lián)合使用RNase抑制劑

5操作過程中，戴手套口罩，避免空氣流通 6進(jìn)行完整性的檢測

第五篇：invitrogen trizol rna抽提說明書

RNA抽提全過程(TRIZOL)

一，準(zhǔn)備工作 1，實驗器具與材料：

（1）移液槍：1ml、200ul、10ul（2）吸頭：1ml、200ul、20ul

（3）吸頭臺：放置1ml吸頭的一個，放置200ul和20ul的吸頭一個（4）EP管1.5ml、100ul（5）玻璃研磨器（6）容量瓶：1000ml（7）鹽水瓶：100ml

（8）15ml塑料管一個（配75％乙醇用）

2，實驗器具的處理與準(zhǔn)備

（1）塑料制品：（包括吸頭、EP管等）

將塑料制品逐個浸泡于1‰DEPC水中（必要時小槍頭需要用吸管打入DEPC水）37℃過夜，然后送至高壓3次，后在80℃烘烤箱中烘干（或置于37℃中8小時左右烘干），試驗前將槍頭放入吸頭臺。或直接購買經(jīng)DEPC處理的槍頭和EP管,每盒大約30元,基本上試劑公司都可以購買。

（2）玻璃制品：（主要是玻璃研磨器）

先泡酸過夜，沖洗干凈后，在1‰DEPC水中泡8小時左右，37℃烘干，用蒙錫紙包裹送至干烤3次（或180度干烤）。（3）金屬制品：（鑷子等）

先洗干凈，再送干烤3次。（不需要泡DEPC水）3，試劑配制和準(zhǔn)備：

（1）DEPC水：泡實驗器具的DEPC水的配制：1000ml雙蒸水中加1mlDEPC，放在1000ml容量瓶中靜置4小時后備用。配75％乙醇的DEPC水的配制：100ml鹽水瓶內(nèi)裝40ml雙蒸水，加40ulDEPC，37℃過夜，送至高壓。

（2）75％乙醇（要在抽提時現(xiàn)配）：用無水乙醇和DEPC水配制（DEPC水:無水乙醇＝1:3），然后放于-20℃?zhèn)溆?。?）異丙醇：放入棕色瓶（4）氯仿：放入棕色瓶

（5）Trizol：100ml/瓶 存放于4℃

二，抽提時注意事項：

全程佩戴一次性手套和口罩，手套要勤換，避免戴上的一次性的手套接觸可疑污染物。

三，抽提步驟 1． 勻漿化作用

取約100mg鼠腦組織放于玻璃研磨器內(nèi)，先加0.2ml的Trizol溶液，研磨組織后，倒入1.5mlEP管中，再在研磨器內(nèi)加入0.8ml的Trizol溶液洗，后全部再倒入EP管中。顛倒混勻10下，室溫靜置5分鐘。2． 分離階段

每1mlTrizol中加0.2ml氯仿。蓋緊樣品管蓋，用手用力搖晃試管15秒，使其充分混勻，室溫靜置5分鐘。后12000rmp離心15分鐘。3． RNA的沉淀

將上層水相轉(zhuǎn)入新的1.5mlEP管中（約400-500ul），加入0.5ml異丙醇，混勻后放于-20℃中1小時，后12000rmp離心10分鐘。4． RNA的洗脫 小心倒掉上清，留取沉淀。加1ml現(xiàn)配的75%的乙醇（預(yù)冷）振蕩洗滌RNA沉淀一次，后7500rmp離心5分鐘。5． RNA的再溶解

小心倒掉上清，取沉淀置超凈工作臺開風(fēng)機(jī)吹干（約30分鐘，此時RNA沉淀變透明）。注意不能讓RNA沉淀完全干燥（會極大地降低它地可溶性）。再在管中加20ul的DEPC水溶解，在55-60℃下孵育10分鐘助溶。6，RNA的保存

提取的RNA保存于-70℃超低溫冰箱中，或立即用于逆轉(zhuǎn)錄。

TRIzol法抽提總RNA

組織100mg ↓

加1mlTRIzol ↓

研磨，勻漿（研磨時倒入液氮，研磨完后從研缽轉(zhuǎn)入EP管中，）（組織勻漿量>100mg時分裝1ml/每EP管）↓

顛倒混勻10下，室溫5分鐘 ↓

加氯仿1/5體積（0.2ml）（必須按總體積的1/5）↓

顛倒混勻15S，室溫5分鐘 ↓

4℃，離心12000rmp，15分鐘 ↓

轉(zhuǎn)上層水相（約400-500μl）于另一新1.5mlEP管中（注意勿吸入中間那層）↓

加等體積異丙醇（約400-500μl）↓

4℃，離心12000rmp，10分鐘 ↓

棄上清 ↓

加冰預(yù)冷的75%乙醇（用高壓后的DEPC水配）1ml ↓

4℃離心7500rmp，5分鐘 ↓

棄上清，超凈工作臺開風(fēng)機(jī)干燥約30分鐘（不能完全干燥）↓

溶于DEPC水中至50μl（此處可按照實際情況修改，有人用50，也有人用100）（可在55-60℃水中，<10分鐘助溶）↓

立即保存于-70℃超低溫冰箱中，或立即用于逆轉(zhuǎn)錄

RNA純度檢測及定量

從36μl中取6μl，用無RNA酶的水稀釋100倍至600μl，用DU70型分光光度儀分別測定樣品在260nm、280nm波長的光密度值，計算出RNA的濃度（μg/ml）。

純RNA樣品的A260/A280比值為1.7-2.1，若低于此值，表明存在蛋白質(zhì)污染，需重新用酚/氯仿抽提。RNA樣品的A260/A230比值應(yīng)大于2.0，若低于該標(biāo)準(zhǔn)，提示有變性緩沖液殘留需重新用乙醇沉淀RNA，然后用750ml/L的乙醇洗滌，以除去殘留的變性緩沖液。

RNA電泳

用無Rnase水配TAE電泳液，稱1.0g新開封的瓊脂糖，加TAE電泳液至100ml，煮沸，加溴乙錠20μl，降至室溫后灌膠置DEPC水處理過的電泳槽中，凝固20min，加TAE 緩沖液浸沒膠塊。取15μl RNA加6×RNA專用上樣緩沖液3μl，混勻，用移液槍將樣品加入上樣孔內(nèi)，待溴酚藍(lán)遷移至理想位置后，終止電泳，紫外燈下觀察、拍照。

上傳RNA電泳條帶如下

最下面條帶代表5s 色淺代表RNA基本無降解

如出現(xiàn)拖把狀條帶 則為降解較嚴(yán)重情況

但有時這種情況也可以照樣RT－PCR

我們同學(xué)就有在低溫冰箱放了幾個月的組織照樣可以出結(jié)果的