第一篇：核酸抽提經(jīng)驗(yàn)及原理總結(jié)

核酸提取原理及經(jīng)驗(yàn)總結(jié)

一、核酸

核苷酸單體聚合而成的生物大分子，是生物細(xì)胞最基本和最重要的成分。一般認(rèn)為，生物進(jìn)化即始于核酸，因?yàn)樵谒猩镔|(zhì)中只有核酸能夠自我復(fù)制。今天已知核酸是生物遺傳信息的貯藏所和傳遞者。一種生物的藍(lán)圖就編碼在其核酸分子中。核酸是1869年米歇爾(F.Miescher)在膿液的白細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的。他當(dāng)時稱之為核素。阿爾特曼(R.Altmann)于1889年認(rèn)識其酸性后，定名為核酸。

二、核酸的分類和功能

核酸分為核糖核酸(RNA)和脫氧核糖核酸(DNA)兩大類。這兩類核酸有某些共同的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，但生物功能不同。DNA貯存遺傳信息，在細(xì)胞分裂過程中復(fù)制，使每個子細(xì)胞接受與母細(xì)胞結(jié)構(gòu)和信息含量相同的DNA；RNA主要在蛋白質(zhì)合成中起作用，負(fù)責(zé)將DNA的遺傳信息轉(zhuǎn)變成特定蛋白質(zhì)的氨基酸序列。核酸的基本結(jié)構(gòu)單元是核苷酸，核苷酸含有含氮堿基、戊糖和磷酸3種組分。堿基與戊糖構(gòu)成核苷，核苷的磷酸酯為核苷酸。DNA和RNA中的戊糖不同，RNA中的戊糖是D-核糖；DNA不含核糖而含D-2-脫氧核糖(核糖中2位碳原子上的羥基為氫所取代)。核酸就是根據(jù)其中戊糖種類來分類的，DNA和RNA的堿基也有所不同。下面我們看看DNA和RNA具體的差別：

（一）DNA的分子結(jié)構(gòu)

1.DNA的堿基組成規(guī)律：Chargaff等根據(jù)分析各種生物及其不同組織內(nèi)DNA樣品水解液中的堿基含量的結(jié)果，得出以下結(jié)論：1）同一生物不同組織的DNA樣品，其堿基成分含量相同。2）不同生物的DNA堿基成分含量不同。3）對某一生物講，其堿基成分的含量不受年齡、營養(yǎng)及環(huán)境變化等影響。4）在同一生物的DNA堿基含量是A=T，G=C，A+G=C+T，堿基之間的這種關(guān)系稱Chargaff法則。

2.DNA分子的基本結(jié)構(gòu)：核酸分子內(nèi)單核苷酸之間的連接鍵為3',5'-磷酸二酯鍵，是共價鍵。DNA分子的基本結(jié)構(gòu)就是許多脫氧核糖核苷酸借磷酸二脂鍵相互連接而成的多核苷酸鏈。DNA鏈中堿基 的組成和排列順序即為DNA的一級結(jié)構(gòu)。DNA的遺傳信息即儲存在DNA分子的堿基排列順序中。

.DNA分子的空間結(jié)構(gòu)：DNA的二級結(jié)構(gòu)是雙螺旋結(jié)構(gòu)，其特點(diǎn)為：1）兩條鏈方向相反、相互平行、主鏈?zhǔn)橇姿嵛焯擎?，處于螺旋外?cè)。2）堿基在螺旋內(nèi)側(cè)并配對存在，A與T配對的G與C配對，A與T之間二個氫鍵相連（A-T），G與C之間三個氫鍵相鏈（G-C）。3）螺旋直徑2nm，二個堿基對平面距0。34mm，10bp為一螺距，距離為3。4nm。4）穩(wěn)定因素主要是堿基之間的氫鍵和堿基對平面之間的堆積力。

（二）RNA的分子結(jié)構(gòu)

RNA的基本結(jié)構(gòu)是A、G、C、U四種堿基組成的核糖苷酸通過磷酸二酯鍵相鏈而成的多核苷酸鏈。有三種主要的RNA：據(jù)其作用可分轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（tRNA）、信使RNA（mRNA）和核蛋白體RNA（rRNA），它們的二級 結(jié)構(gòu)是單鏈局部雙螺旋，共中tRNA結(jié)構(gòu)較清楚：

1.tRNA tRNA一級結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是：1）核苷酸數(shù)目在70-90之間；2）含較多稀有堿基； 3）所有tRNA的3'末端均是-CCA的結(jié)構(gòu)。tRNA二級結(jié)構(gòu)特點(diǎn)： 呈三葉草形，有三環(huán)四臂。其中3'的氨基酸臂是攜帶氨基酸的位置，II環(huán)又稱反密碼環(huán)，此環(huán)頂端 由3個堿基組成反密碼子，起到識別mRNA上對于密碼子的作用。

2.Mrna mRNA是蛋白質(zhì)合成的模板，真核生物的mRNA的5'端有m7Gppp的帽子，3'末端有20-200多聚A的尾巴上述兩者之間為信息區(qū)，其中每三個相鄰堿基組成一個三聯(lián)體，代表一個氨基酸信號，即為密碼子。不同mRNA具有不同的密碼順序，決定蛋白質(zhì)多肽鏈的氨基酸排列順序（一級結(jié)構(gòu)）。

3.rRNA 核蛋白體RNA，它是細(xì)胞內(nèi)含量最多的RNA：rRNA與多種蛋白質(zhì)結(jié)合成核蛋白體，存在于胞漿，是蛋白質(zhì) 合成的部位。

三、核酸的理化性質(zhì)

RNA和核苷酸的純品都呈白色粉末或結(jié)晶，DNA則為白色類似石棉樣的纖維狀物。除肌苷酸、鳥苷酸具有鮮味外，核酸和核苷酸大都呈酸味。DNA、RNA和核苷酸都是極性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有機(jī)溶劑，它們的鈉鹽比游離核酸易溶于水，RNA鈉鹽在水中溶解度可達(dá)40g/L，DNA鈉鹽在水中為10g/L，呈黏性膠體溶液。在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或弱堿性溶液中較穩(wěn)定。天然狀態(tài)的DNA 是以脫氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于細(xì)胞核中。要從細(xì)胞中提取DNA 時，先把DNP抽提出來，再把P除去，再除去細(xì)胞中的糖，RNA 及無機(jī)離子等，從中分離DNA。

四、細(xì)胞裂解：

（一）裂解原理

在核酸提取過程中，細(xì)胞裂解是非常重要的。經(jīng)典的裂解液幾乎都含有去污劑(如

SDS、Triton X-100、NP-40、Tween 20 等)和鹽(如 Tris、EDTA、NaCl 等)。鹽的作用，除了提供一個合適的裂解環(huán)境(如 Tris)，還包括抑制樣品中的核酸酶在裂解過程中對核酸的破壞(如 EDTA)、維持核酸結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定(如 NaCl)等。去污劑則是通過使蛋白質(zhì)變性，破壞膜結(jié)構(gòu)及解開與核酸相連接的蛋白質(zhì)，從而實(shí)現(xiàn)核酸游離在裂解體系中。裂解體系中還可能加入蛋白酶，利用蛋白酶將蛋白質(zhì)消化成小的片段，促進(jìn)核酸與蛋白質(zhì)的分開，同時，也便于后面的純化操作以及獲得更純的核酸。也有直接使用高濃度的蛋白質(zhì)變性劑(如 GIT、GuHCl 等)裂解的，該方法已經(jīng)成為了 RNA 抽提的主流，卻不是基因組 DNA 抽提的主流。

（二）細(xì)胞的裂解方法

細(xì)菌細(xì)胞破碎方法有以下幾種：1）機(jī)械方法：超聲波處理法、研磨法、勻漿法，關(guān)于超聲波處理法，要設(shè)定好超聲時間和間隙時間，一般超聲時間不超過5秒，間隙時間最好大于超聲時間。2）化學(xué)試劑法：用含SDS或CTAB的溶液處理細(xì)胞，在一定的p H 環(huán)境和變性條件下,細(xì)胞破裂,蛋白質(zhì)變性沉淀,核酸被釋放到水相，p H 環(huán)境則由加入的強(qiáng)堿(NaOH)或緩沖液(TE、STE 等)提供，表面活性劑或強(qiáng)離子劑可使細(xì)胞裂解、蛋白質(zhì)和多糖沉淀,緩沖液中的一些金屬離子螯合劑(EDTA 等)可螯合對核酸酶活性所必須的金屬離子Mg2+、Ca2+ ,從而抑制核酸酶的活性,保護(hù)核酸不被降解。；3）反復(fù)凍融法：將細(xì)胞在-20度以下冰凍，室溫融解，反復(fù)幾次，由于細(xì)胞內(nèi)冰粒形成和剩余細(xì)胞液的鹽濃度增高引起溶脹，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)破碎。4）酶解法：加入溶菌酶或蝸牛酶、蛋白酶K等，都可使細(xì)胞壁破碎，核酸釋放。蛋白酶還能降解與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì),促進(jìn)核酸的分離。其中溶菌酶能催化細(xì)菌細(xì)胞壁的蛋白多糖N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸殘基間的β-(1 ,4)鍵水解。蛋白酶K能催化水解多種多肽鍵,其在65 ℃及有EDTA、尿素(1～4mol/ L)和去污劑(0.5 %SDS 或 1 %Triton X-100)存在時仍保留酶活性,這有利于提高對高分子量核酸的提取效率。在實(shí)際工作中,酶作用、機(jī)械作用、化學(xué)作用經(jīng)常聯(lián)合使用。具體選擇哪種或哪幾種方法可根據(jù)細(xì)胞類型、待分離的核酸類型及后續(xù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膩泶_定。

（三）裂解方法的評價

含蛋白酶的裂解方法，可以認(rèn)為是抽提基因組 DNA 的首選。裂解包括膜蛋白的游離和與基因組 DNA 相連接的蛋白質(zhì)的游離。蛋白酶的作用是使蛋白質(zhì)變小，故而對蛋白質(zhì)的游離有巨大的促進(jìn)作用；同時，巨大的基因組DNA 是很容易“纏”住大分子的東西的，蛋白質(zhì)被蛋白酶消化變小后，則不容易被基因組 DNA “纏”住，有利于蛋白質(zhì)在純化操作中的去除，使最終獲得的基因組 DNA 的純度更高。另外一個思路是，如果基因組 DNA與

蛋白質(zhì) “纏”在一起，在純化的過程中有兩種可能：如果基因組 DNA 的特性占優(yōu)勢，則純化時以 DNA 的形式被保留下來，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的殘留；如果蛋白質(zhì)的特性占優(yōu)勢，則純化時以蛋白質(zhì)的形式被去除，導(dǎo)致 DNA 的損失。當(dāng)然去污劑裂解方法，仍然在細(xì)胞基因組 DNA 抽提方面有優(yōu)勢，尤其是當(dāng)?shù)寐屎图兌纫蟛皇亲罡?，而?jīng)濟(jì)性及操作簡單很重要時。控制好裂解液/樣品的比例是該方法成功的關(guān)鍵。該方法結(jié)合高鹽沉淀，可以實(shí)現(xiàn)最簡單的操作，但純度及得率的穩(wěn)定性可能會比用 PC 抽提的差一些。

高濃度蛋白質(zhì)變性劑(如 GIT、GuHCl 等)的裂解方法，是抽提 RNA 的首選。總 RNA 的抽提，最重要的是快速裂解細(xì)胞膜，至于與基因組 DNA 相連接的蛋白質(zhì)的裂解以及基因組與蛋白質(zhì) “纏”住的問題，因?yàn)槎疾粫σ院蟮募兓a(chǎn)生大的影響，可以不考慮。高濃度蛋白質(zhì)變性劑能快速破壞細(xì)胞膜，進(jìn)而迅速抑制住細(xì)胞內(nèi)的 RNA 酶，從而確保了 RNA 的完整性。除了極少量不適用該方法的樣品 – 主要是植物，其它絕大部分樣品的 RNA 的抽提，都可以以高濃度的蛋白質(zhì)變性劑為基礎(chǔ)的。當(dāng)然有些樣品，如肌肉，即使是 RNA 抽提，也強(qiáng)烈建議使用含蛋白酶的裂解液(或者在操作中的某個時候使用蛋白酶消化蛋白質(zhì))，原因在于這些樣品中的蛋白質(zhì)，是非常難以去除的。該方法是獲得最大得率和最高純度的基礎(chǔ)。

含 CTAB 的裂解液，幾乎成為富含多糖的樣品，如細(xì)菌、植物的基因組 DNA 抽提的首選裂解方法。該方法成功與否與兩個因素有關(guān)：一是 CTAB 的質(zhì)量，二是洗滌的徹底程度。CTAB 的質(zhì)量對裂解效率有很大的影響，而且，似乎還說不清楚原因，因?yàn)榧词故峭还旧a(chǎn)的純度一樣的 CTAB，批號不同，效果就可能差別很大。洗滌去除 CTAB 要比其它的鹽難一些，同時，CTAB 的少量殘留也會對酶活性有巨大影響，所以洗滌是否徹底也是該方法成功與否的關(guān)鍵。裂解時的溫度，多使用 65C；但如果發(fā)現(xiàn)降解嚴(yán)重或者得率太低，可以試一下 37C – 45C 這個相對低溫的區(qū)域。

SDS 堿裂解法是質(zhì)粒抽提的首選裂解方法，具有快速、得率高、幾乎無基因組 DNA 污染的特點(diǎn)。控制好裂解液/菌體的比例和操作的溫和是該方法成功的關(guān)鍵。蛋白質(zhì)的沉淀效率在 4C 會更好一些，所以，加入溶液 III 后在 4℃ 靜置一段時間以及采用 4℃ 離心去蛋白質(zhì)，都可以提高質(zhì)量。該方法不一定要使用 PC 純化，但結(jié)合 PC 純化，可以獲得純度很高的質(zhì)粒。RNA 的去除可以靠在溶液 I 中加入 RNase A(100ug/ml)或者在最后的溶解液中加入 RNase A(25 ug/ml)來實(shí)現(xiàn)?？偟母杏X是，在溶液 I 中使用 RNase A，RNA 的殘留少一些。不過，經(jīng)典沉淀幾乎沒有辦法徹底去除 RNA 殘留。另外，對大質(zhì)粒(50 kb 以上)，該方法可能會有問題。

PCR 模板的簡易裂解方法，也是使用面很廣的一類方法。該方法的特點(diǎn)是無須純化，樣品被裂解后即可直接取裂解液用于 PCR，非?？焖佟Ｒ舱?yàn)椴患兓?，所以，假陰?即沒有擴(kuò)增出來的陽性)比例也比較高。該方法最簡單的就是反復(fù)凍融法，簡便快捷，不需任何化學(xué)試劑，凍融離心，PCR檢測就可以了。如果使用裂解法，哪么最簡單的裂解液就是水，復(fù)雜一點(diǎn)的就會含有一些不會抑制后續(xù)的 PCR 反應(yīng)，而且能提高裂解效率，甚至還可能部分消除樣品內(nèi)抑制 PCR 反應(yīng)雜質(zhì)的東西，如 Triton X-100、甲酰胺等。再復(fù)雜一點(diǎn)的就會含有諸如 Chelex 100 之類的能吸附部分雜質(zhì)的介質(zhì)。操作也非常簡單，多使用溫度的變化來實(shí)現(xiàn)樣品的裂解，如煮沸、或者高溫-低溫的多次循環(huán)等。該方法最適合從一大堆樣品中找出陽性樣品，但卻不適合用于判斷某一個樣品是陽性還是陰性。降低樣品使用量可以提高陽性率，因?yàn)闃悠妨康慕档?，同時意味著 PCR 的抑制物量的降低。

（四）樣品與裂解液的比例

選擇了合適的裂解液，下一步就是要控制好樣品與裂解液的比例。這個問題非常重要，但卻沒有獲得足夠的重視。嚴(yán)肅的參考資料，都應(yīng)該會提供一個簡單的比例，如 1ml 裂解液可以用于 T mg 組織或者 C 個細(xì)胞；建議:樣品量絕對要小于資料所提供的。起始樣品用多大，并沒有具體的說法。如果不是樣品量有限，則以能抽提出滿足數(shù)次成功實(shí)驗(yàn)所需的核酸量，作為決定樣品起始量的基礎(chǔ)，會比較合理的。不要因?yàn)?1ml 裂解液可以抽提 100mg 樣品，就一定使用 100mg 樣品。裂解液的用量，表面上與抽提的結(jié)果(純度及得率)沒有關(guān)系，然而，在實(shí)際操作中，對結(jié)果是有比較大的影響的。裂解液的用量原則是：確保能徹底裂解樣品，同時使裂解體系中核酸的濃度適中。濃度過低，將導(dǎo)致沉淀效率低，影響得率；濃度過高，去除雜質(zhì)的過程復(fù)雜且不徹底，導(dǎo)致純度下降。另外，裂解液的用量是以樣品中蛋白質(zhì)的含量為基準(zhǔn)的，而不是以核酸含量為基準(zhǔn)，這一點(diǎn)務(wù)必牢記。

五、核酸提取

核酸提取包含樣品的提取和純化兩大步驟。提取是使樣品中的核酸游離在裂解體系中的過程，純化則是使核酸與裂解體系中的其它成分，如蛋白質(zhì)、鹽及其它雜質(zhì)徹底分離的過程。

（一）DNA提取的幾種方法 濃鹽法 ：1）利用RNA和DNA在電解溶液中溶解度不同，將二者分離，常用的方法是用1M 氯化納提取化鈉抽提,得到的DNP粘液與含有少量辛醇的氯仿一起搖蕩,使乳化,再離心除去蛋白質(zhì),此時蛋白質(zhì)凝膠停留在水相及氯仿相中間，而DNA位于上層水相中,用2倍 體積95%乙醇可將DNA 鈉鹽沉淀出來； 2）也可用0.15 MNaCL液反復(fù)洗滌細(xì)胞破碎液除去RNP,再以1MNaCL提取脫氧核糖蛋白,再按氯仿---異醇法除去蛋白。兩種方法比較,后種方法使核酸降解可能少一些；3）以稀鹽酸溶液提取DNA 時，加入適量去污劑，如SDS可有助于蛋白質(zhì)與DNA 的分離。在提取過程中為抑制組織中的DNase對DNA 的降解作用,在氯化鈉溶液中加入檸檬酸鈉作為金屬離子的烙合劑。2 陰離子去污劑法：用SDS或二甲苯酸鈉等去污劑使蛋白質(zhì)變性,可以直接從生物材料中提取DNA。由于細(xì)胞中DNA與蛋白質(zhì)之間常借靜電引力或配位鍵結(jié)合,因?yàn)殛庪x子去污劑能夠破壞這種價鍵,所以常用陰離子去污劑提取DNA。苯酚抽提法： 苯酚作為蛋白變性劑,同時抑制了DNase的降解作用。用苯酚處理勻漿液時,由于蛋白與DNA 聯(lián)結(jié)鍵已斷,蛋白分子表面又含有很多極性基團(tuán)與苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。離心分層后取出水層，多次重復(fù)操作，再合并含DNA 的水相，利用核酸不溶于醇的性質(zhì)，用乙醇沉淀DNA。此時DNA是十分粘稠的物質(zhì)，可用玻璃漫漫繞成一團(tuán)，取出。此法的特點(diǎn)是使提取的DNA保持天然狀態(tài)。

4水抽提法：利用核酸溶解于水的性質(zhì),將組織細(xì)胞破碎后,用低鹽溶液除去RNA，然后將沉淀溶于水中，使DNA淀溶于水中充分溶解于水中,離心后收集上清液。在上清中加入固體氯化鈉調(diào)節(jié)至2.6M，加入2倍體積95%乙醇,立即用攪拌法攪出。然后分別用66%，80%,95%乙醇以及丙酮洗滌,最后在空氣中干燥,既得DNA樣品。此法提取的DNA中蛋白質(zhì)含量較高,故一般不用。為除蛋白可將此法加以改良,在提取過程中加入SDS。

（二）RNA提取

所有ＲＮＡ的提取過程中都有五個關(guān)鍵點(diǎn)，即１）：樣品細(xì)胞或組織的有效破碎；２）有效地使核蛋白復(fù)合體變性；３）對內(nèi)源ＲＮＡ酶的有效抑制；４）有效地將ＲＮＡ從ＤＮＡ和蛋白混合物中分離；5）對于多糖含量高的樣品還牽涉到多糖雜質(zhì)的有效除去。但其中最關(guān)鍵的是抑制ＲＮＡ酶活性。

1）總RNA的試劑盒快速提取 一些公司推出的總RNA提取試劑盒,該總RNA純化系統(tǒng)采用兩種著名的RNA酶抑制劑,異硫氰酸弧(GTC)和β-巰基乙醇,加上整個操作都在冰浴下進(jìn)行,這樣就能顯著降低RNA的降解速率。GTC和N-十二烷基肌氨酸鈉的聯(lián)合使用,將促使核蛋白復(fù)合體的解離,使RNA與蛋白質(zhì)分離,并將RNA釋放到溶液中。而進(jìn)一步從復(fù)合體中純化RNA,則根據(jù)Chomc zynski和Sacchi的一步快速抽提法進(jìn)行,采用酸性酚-氯仿混合液抽提。低pH值的酚將使RNA進(jìn)入水相,這樣使其與仍留在有機(jī)相中的蛋白質(zhì)和DNA分離。水相中的RNA可用異丙醇沉淀濃縮。進(jìn)一步將上述RNA沉淀復(fù)溶于GTC溶液中，接著異丙醇進(jìn)行二次沉淀，隨后用乙醇洗滌沉淀，即可去除所有殘留的蛋白質(zhì)和無機(jī)鹽，而RNA中如含無機(jī)鹽,則有可能對以后操作中的一些酶促反應(yīng)產(chǎn)生抑制。

2）氯化鋰法提取總RNA： 本方法用高濃度尿素變性蛋白并抑制RNA酶，用氯化鋰選擇沉淀RNA，其特別適合于從大量樣品中提取少量組織RNA，具有快速簡潔的長處，但也存在少量DNA的污染及RNA得率不高,小RNA片斷丟失的缺陷。）蛋白酶－熱酚法：本方法適合于病毒RNA的提取。

六、核酸純化

裂解完成后，液體體系中就包括了游離的核酸、蛋白質(zhì)及其它大分子雜質(zhì)、鹽：純化就是將核酸與其它游離成分分離的過程。就個人所知，目前在科研領(lǐng)域廣泛使用的核酸純化技術(shù)主要可以分為兩大類：使用介質(zhì)的和不使用介質(zhì)的，使用介質(zhì)的，一次就將核酸與其它所有雜質(zhì)分開；不使用介質(zhì)的，一定是首先將核酸和鹽與大分子雜質(zhì)分開，再通過沉淀核酸使核酸與鹽分開(PEG 沉淀和 LiCl 沉淀除外)。使用介質(zhì)的可以分為兩類：離子交換介質(zhì)和吸附介質(zhì)。不使用介質(zhì)的也分為兩類：使用苯酚/氯仿抽提的和不使用苯酚/氯仿抽提的。

（一）純化方法：下面比較一下具體的純化技術(shù)：

1）經(jīng)典的使用苯酚/氯仿抽提的純化技術(shù)：細(xì)胞裂解后離心分離含核酸的水相，加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25 24 1 ∶∶體積)混合液。依據(jù)應(yīng)用目的，兩相經(jīng)漩渦振蕩混勻(適用于分離小分子量核酸)或簡單顛倒混勻(適用于分離高分子量核酸)后離心分離。疏水性的蛋白質(zhì)被分配至有機(jī)相,核酸則被留于上層水相。酚是一種有機(jī)溶劑，預(yù)先要用STE 緩沖液飽和，因未飽和的酚會吸收水相而帶走一部分核酸。酚也易氧化發(fā)黃，而氧化的酚可引起核酸鏈中磷酸二酯鍵斷裂或使核酸鏈交聯(lián);故在制備酚飽和液時要加入82羥基喹嚀，,以防止酚氧化。氯仿可去除脂肪,使更多蛋白質(zhì)變性,從而提高提取效率。異戊醇則可減少操作過程中產(chǎn)生的氣泡。核酸鹽可被一些有機(jī)溶劑沉淀,通過沉淀可濃縮核酸,改變核酸溶解緩沖液的種類以及去除某些雜質(zhì)分子。典型的例子是在酚、氯仿抽提后用乙醇沉淀，在含核酸的水相中加入p H5.0～5.5，終濃度為0.3M 的NaAc 或KAc 后，鈉離子會中和核酸磷酸骨架上的負(fù)電荷，在酸性環(huán)境中促進(jìn)核酸的疏水復(fù)性。然后加入2～2.5 倍體積的乙醇,經(jīng)一定時間的孵育，可使核酸有效地沉淀。其他的一些有機(jī)溶劑[ 異丙醇、聚乙二醇(PEG)等]和鹽類(10.0mol/ L 醋酸銨、8.0mol/ L 的氯化鋰、氯化鎂和低濃度的氯化鋅等)也用于核酸的沉淀。

2）使用離子交換介質(zhì)的純化技術(shù)：將裂解液過柱，核酸被聯(lián)結(jié)在離子交換介質(zhì)上；

洗滌去除殘留的雜質(zhì)后，用高鹽緩沖液將核酸從介質(zhì)上洗脫下來。再經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)的乙醇/異丙醇沉淀、乙醇洗滌、干燥等操作，獲得純的核酸，溶解于合適的緩沖液中。3）使用吸附介質(zhì)的純化技術(shù)：將裂解液過柱，核酸被吸附介質(zhì)選擇性吸附；洗滌去除殘留的雜質(zhì)后，用水或者合適的低鹽緩沖液將核酸從介質(zhì)上洗脫下來，就可以直接用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

4)密度梯度離心法：密度梯度離心也用于核酸的分離和分析。雙鏈DNA、單鏈DNA、RNA 和蛋白質(zhì)具有不同的密度，因而可經(jīng)密度梯度離心形式形成不同密度的純樣品區(qū)帶，該法適用于大量核酸樣本的制備，其中氯化銫2溴化乙錠梯度平衡離心法被認(rèn)為是純化大量質(zhì)粒DNA 的首選方法。氯化銫是核酸密度梯度離心的標(biāo)準(zhǔn)介質(zhì),梯度液中的溴化乙錠與核酸結(jié)合，離心后形成的核酸區(qū)帶經(jīng)紫外燈照射，產(chǎn)生熒光而被檢測，用注射針頭穿刺回收后，通過透析或乙醇沉淀除去氯化銫而獲得純化的核酸。

注：但是在日常實(shí)驗(yàn)過程中，通常用的純化方法有主要有以下兩種，一是化學(xué)方法，即PC 抽提 + 醇沉淀；二是物理方法，即介質(zhì)純化。第一種方法是利用 PC 對裂解體系進(jìn)行反復(fù)抽提以去除蛋白質(zhì)，實(shí)現(xiàn)核酸與蛋白質(zhì)的分離；再用醇將核酸沉淀下來，實(shí)現(xiàn)核酸與鹽的分離。第二種方法則是利用某些固項(xiàng)介質(zhì)，在某些特定的條件下，選擇性地吸附核酸，而不吸附蛋白質(zhì)及鹽的特點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)核酸與蛋白質(zhì)及鹽的分離。高鹽沉淀去除蛋白質(zhì)是第一種純化方法的一個變體，省略了 PC 操作的麻煩。當(dāng)然，也有不純化的抽提方法，但是用途多局限于簡單的 PCR。其它雜質(zhì) – 如多糖、多酚等的去除，基本上都是在這兩種方法的基礎(chǔ)上，通過增加一些特別的試劑，或者增加一些額外的步驟來實(shí)現(xiàn)的。

（二）純化方法評價

PC(P是英文酚的縮寫，C是英文氯仿的縮寫)抽提/醇沉淀方法，是一個永不過時的方法。穩(wěn)定、可靠、經(jīng)濟(jì)、方便。PC抽提可以徹底去除蛋白質(zhì)，醇沉淀可以去除鹽，對于一般的干凈的樣品(雜質(zhì)為蛋白質(zhì))，該方法完全可以獲得高質(zhì)量的核酸。雖然每次 PC 抽提都會損失一部分核酸(因?yàn)椴豢赡軐⑺嗳恳迫?，以及低濃度核酸的醇沉淀效率低，但這些問題都可以靠操作的調(diào)整而得以解決或者減少影響。該方法的最大的問題是不適合大規(guī)模抽提。PC抽提是去除蛋白質(zhì)的一個非常有效的手段。苯酚能使蛋白質(zhì)變性，變性后的蛋白質(zhì)從水相中被析出，處于苯酚中或者苯酚/水相之間。PC 抽提的關(guān)鍵是，一要混勻徹底，二要用量足夠。徹底混勻，才能確保苯酚與蛋白質(zhì)的充分接觸，使蛋白質(zhì)完全變性。許多人總是擔(dān)心混勻的劇烈程度是否會對核酸，尤其是基因組 DNA 造成破壞，實(shí)際上大可不必如此小心。劇烈的混勻操作，是會部分打斷大分子的基因組 DNA，但該破壞作用不會強(qiáng)烈 到 DNA 變成 10kb 以內(nèi)的小片段。手劇烈晃動混勻后，基因組 DNA 的片段，大部分會大于 20kb，這個大小，除了一些特別的要求外，對 PCR 和酶切，都是完全適用的。如果要求的片段非常大，如構(gòu)建文庫用，則不能使用劇烈的混勻方法，而只能來回溫和顛倒混勻 – 此時的關(guān)鍵是：裂解液的比例要足夠大，使體系不要太粘稠。用量要足夠，是因?yàn)楸椒尤コ鞍踪|(zhì)是有一定的飽和度的。超過了該飽和度，裂解體系中的蛋白質(zhì)不會被一次去除，必須靠多次抽提，方可徹底去除。另外，體系太粘稠的壞處是，蛋白質(zhì)難以徹底去除，以及基因組 DNA 會斷裂得更厲害，所以要注意裂解液與樣品的比例。4C 離心操作有利于更徹底去除蛋白質(zhì)。PC 抽提的另外一個用途是，利用酸性酚可以部分去除 DNA 的特點(diǎn)，在 RNA 抽提時獲得 DNA 殘留極少的 RNA。不過有一點(diǎn)要提醒的是，有些植物樣品，在去除某些雜質(zhì)之前，是不能使用 PC 抽提的，否則核酸必定降解。

高鹽沉淀蛋白質(zhì)/醇沉淀方法，同樣也是一個非常不錯的方法。與 PC 抽提方法相比，除了純度的穩(wěn)定性可能要低一點(diǎn)外，該方法幾乎克服了 PC 抽提的所有缺點(diǎn)。更快、更輕松去除蛋白質(zhì)所伴隨的好處是，可以用于大規(guī)模抽提，不足是純度(蛋白質(zhì)殘留)不夠穩(wěn)定。蛋白質(zhì)的沉淀效率在 4C 會更好一些。

介質(zhì)純化方法，是一個越來越受到重視的方法。其最大特點(diǎn)是非常適合大規(guī)模核酸抽提，并且因?yàn)槭苋藶椴僮饕蛩赜绊懶?，純度的穩(wěn)定性很高(雖然純度不一定比PC 純化方法更高)。其致命弱點(diǎn)是樣品過量。介質(zhì)可以分為兩大類，一類是柱式的，即介質(zhì)被預(yù)先裝填在下面是通的柱子里；另外一類則是顆粒狀(如Glassmilk、磁性小珠等)。顆粒狀的介質(zhì)的純化操作與經(jīng)典的醇沉淀差別不大，都是通過數(shù)次的加液-倒液過程，干燥后，溶解即可獲得純化好的核酸。柱式純化的操作雖然也是有加液-倒液過程，但因?yàn)榧尤氲囊后w通過離心后會進(jìn)入另外一個離心管中，與含有核酸的柱子完全是分開的，所以洗滌更徹底，操作更省力(不用操心將核酸倒掉了，或者液體的殘留)。不過，介質(zhì)純化方法的成本是最高的。

（三）醇的沉淀

1）沉淀的原理目的：目的是使核酸從裂解體系中沉淀下來，從而實(shí)現(xiàn)核酸與其它雜質(zhì)–主要是鹽的分離。實(shí)際操作中，許多雜質(zhì)也會與核酸一起被醇沉淀下來，尤其是當(dāng)其它雜質(zhì)的濃度也比較高的時候。醇的沉淀并不是非常特異性的，任何有機(jī)大分子及一些鹽，當(dāng)濃度達(dá)到一定水平后，都可能同步被沉淀下來。

就核酸而言，標(biāo)準(zhǔn)的醇沉淀要求有一定的鹽及某一比例的醇用量，但這決不是說這些鹽是必不可少的或者醇的比例是不可更改的。實(shí)際操作中不難發(fā)現(xiàn)，當(dāng)裂解體系中核酸的濃度達(dá)到一定水平后，即使體系中不含教科書中建議的鹽，單獨(dú)使用醇也可以使核酸沉淀下來； 或者含有鹽，使用低比例的醇也可以使核酸沉淀下來(當(dāng)然，得率可能會降低)。知道這一點(diǎn)的意義在于：不要迷信標(biāo)準(zhǔn)方法的唯一性；相反，當(dāng)使用標(biāo)準(zhǔn)方法碰到問題 – 主要是純度問題時，完全可以通過調(diào)整沉淀?xiàng)l件來改善。最有參考價值的是 TRIzol 提供的一個沉淀方案：一半異丙醇加一半高鹽溶液替代純粹的異丙醇，可以大大降低多糖殘留。另外一個問題就是，要堅(jiān)信核酸的醇沉淀過程同樣也是其它雜質(zhì)的沉淀過程；調(diào)整醇沉淀的條件，雖然會降低核酸的得率，但因?yàn)榭梢源蟠筇岣呒兌取?/p>

2)沉淀劑的選擇： 醇沉淀使用異丙醇還是乙醇，我沒有發(fā)現(xiàn)這二者對質(zhì)量有大的影響，雖然許多人“發(fā)現(xiàn)”乙醇沉淀的核酸純度更高。異丙醇沉淀的核酸比較緊湊，帖壁緊，顏色不是很白；乙醇沉淀的核酸比較蓬松，容易從壁上移動，顏色比較白。這是現(xiàn)象，提示結(jié)論：異丙醇沉淀的核酸不容易丟掉，但比較難洗滌。結(jié)合丟失和洗滌兩個方面綜合考慮，則建議：少量核酸用異丙醇沉淀(量少，洗滌不是問題，不丟失為先)，大量核酸用乙醇沉淀(量大，丟失不是問題，洗滌方便為先)。至于異丙醇沉淀更容易沉淀下鹽的說法，我沒有碰到過(我?guī)缀醪皇褂玫蜏爻恋?，難道低溫沉淀比較容易出現(xiàn)鹽沉淀？)；我更覺得出現(xiàn)該現(xiàn)象的原因就在洗滌的不徹底。當(dāng)然，也不要忘記異丙醇沉淀的最大優(yōu)點(diǎn)是體積小，可以使絕大部分的小量抽提操作在 1.5ml 離心管內(nèi)完成。但由于其沉淀物很緊湊，洗滌時其中心部分不容易被洗滌到，所以，洗滌異丙醇沉淀的核酸的關(guān)鍵是：一定要使沉淀懸浮起來，一定要放置一段時間使沉淀最終變成蓬松的白色。如果再洗滌一次，質(zhì)量決不會有問題的。當(dāng)然，沉淀所用的試劑，不僅僅就乙醇和異丙醇，還有包括PEG、LiCl、CTAB 都可以用于核酸沉淀，雖然它們遠(yuǎn)沒有醇沉淀的高使用頻率，但卻各有特點(diǎn)。LiCl 可以沉淀 RNA 以去除 DNA，CTAB 可以從含多糖的裂解體系中將核酸沉淀下來。PEG 是沉淀病毒顆粒的方便手段。3)沉淀溫度的選擇：如果核酸抽提的起始樣品是雜質(zhì)比較多時，原則上不要使用低溫沉淀。低溫沉淀能提高沉淀效率：當(dāng)核酸濃度很低時，效果明顯；當(dāng)核酸濃度比較高時，效果不明顯，但卻會導(dǎo)致雜質(zhì)的大大增加。

（四）核酸的洗滌

1）洗滌原理與目的： 洗滌對于整個提取過程來說，也是非常重要的。洗滌，首先一定要將沉淀懸浮起來；第二就是要控制一定的時間，尤其是當(dāng)核酸沉淀比較大時(使核酸沉淀最終蓬松)；第三是少量多次；第四則是去上清要徹底。教科書中的操作基本上都是“倒掉上清后倒置在吸水紙上片刻”，這一描述本身沒有問題，且十分方便，但因?yàn)樗麃碜試猓匀痪陀辛恕八敛环钡膯栴}。如果離心管是經(jīng)過硅化的，因?yàn)橐后w幾乎不掛壁，所以上清

可以去除得非常徹底；好的管子，即使沒有經(jīng)過硅化，殘留量也非常少，也沒有什么問題；差的管子，液體的掛壁非?？捎^，其殘留量多到會影響后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。唯一不受管子質(zhì)量影響的操作，就是倒掉液體后再短暫離心，將殘液用移液器吸出。一定要牢記的是，殘液中都含有上一步操作中的雜質(zhì)，其殘留量與混勻程度、核酸沉淀的大小都有關(guān)。揮發(fā)時去掉的是乙醇，雜質(zhì)是不會被揮發(fā)去除的。這步，切忌不要用手甩，這樣容易將核酸甩掉。另外，核酸沉淀的大小及裂解液的裂解能力也決定了洗滌的強(qiáng)度。沉淀越大，裂解液的裂解能力越強(qiáng)，洗滌越要徹底：放置時間相對要長一點(diǎn)，洗滌次數(shù)也要考慮增加。當(dāng)然，乙醇濃度的選擇也非常重要，一般情況，洗滌一定要用室溫的 75% 乙醇。

（五）核酸的溶解和保存

1）核酸溶解：純化后的核酸，最后多使用水或者低濃度TE緩沖液溶解：其中 RNA 以水為主，DNA 則多以弱堿性的 Tris 或者 TE 溶解。經(jīng)典的 DNA 溶解方法多提倡使用 TE 溶解，其中原因是有人認(rèn)為 EDTA 可以減少 DNA 被可能殘留下來的 DNase 降解的風(fēng)險；如果操作過程控制得當(dāng)，DNase 的殘留幾乎是可以忽略的，完全可以直接使用 Tris 或者水(pH 接近7)溶解 DNA。

2）核酸保存：基本上，核酸在保存中的穩(wěn)定性，與溫度成反比，與濃度成正比。一般的我們選擇，-20℃ 或70℃ 保存的穩(wěn)定。如果溫度不合適，保存中核酸發(fā)生降解或者消失，首要原因是酶殘留導(dǎo)致的酶解，第二個原因則是保存核酸溶液的 pH 值不合適導(dǎo)致的水解(RNA 在弱酸性更穩(wěn)定，而 DNA 在弱堿性更合適)。還有一個不為人重視的，就是 EP 管對核酸的影響。首先一定要堅(jiān)信一點(diǎn)，那就是核酸一定會與裝它的容器的接觸面發(fā)生反應(yīng)，達(dá)到某種均衡。EP 管的材質(zhì)，首先可能吸附核酸，其次還可以誘導(dǎo)核酸的結(jié)構(gòu)發(fā)生某些變化，如變性。在核酸的濃度比較高時，這個現(xiàn)象可能觀察不到；當(dāng)核酸濃度很低時，則比較明顯了。在低濃度的核酸中加入 Geletin,Glycogen,BSA 可以穩(wěn)定核酸，雖然已經(jīng)為實(shí)驗(yàn)所證明，但許多實(shí)驗(yàn)人員并沒有將該建議當(dāng)回事?，F(xiàn)在制造 EP 管的材料遠(yuǎn)多于過去。這些新出現(xiàn)的材料，在強(qiáng)度、透明度等物理特征方面可能比原來的純 PP 材質(zhì)要好許多，但其化學(xué)特征，尤其是對核酸穩(wěn)定性的可能影響，遠(yuǎn)沒有研究透徹。正如現(xiàn)在的質(zhì)?？梢愿脑斓迷絹碓竭m用某些要求一樣，其負(fù)面產(chǎn)物可能是，抽提的質(zhì)粒電泳的構(gòu)型越來越多：除了原來的三種帶型外，還可能出現(xiàn) denatured cc、multimeric forms of cc 等等帶型。

（六）核酸的濃縮

應(yīng)用最廣的核酸濃縮法是乙醇沉淀法。在中等濃度單價陽離子存在下，加入一定量的乙醇后，所形成有核酸沉淀可經(jīng)離心而回收，甚至對低至pg量的DNA或RNA，也可定量回

收?；厥盏暮怂峥砂此铦舛?，再溶于適當(dāng)?shù)木彌_液中。

核酸濃縮的具體操作時，可向含樣品的小離心管中加入V/10單價陽離子鹽貯存液2V無水乙醇，混勻，放冰水浴中15～30min，取出目測平衡，0～4度，12000g，離心10min。吸棄上清，再另70%乙醇0.5～1ml，12000g，0～4度洗滌離心2min。吸棄上清，沉淀用油泵抽干或打開蓋子晾干后，溶于適當(dāng)體積的緩沖液中。單價陽離子鹽的選擇，主要基于下述

考慮：用醋酸銨可減少dNTP的共沉淀，但在以后要作核酸的磷酸化時應(yīng)避免用醋酸銨，因銨離子是T，多核苷酸激酶的強(qiáng)烈抑制劑。當(dāng)用較高濃度的乙醇沉淀RNA時，常用LiCl，因LiCl在乙醇中溶解度很高，不隨核酸共沉淀。含有SDS的核酸樣品，應(yīng)使用NaCl，這時該去垢劑要70%乙醇中仍保持可溶。DNA和RNA沉淀，大多使用醋酸鈉（pH5.2）。七 核酸質(zhì)量的檢測問題 將抽提好的核酸直接用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)，是唯一可靠的檢測方法；除此之外的檢測方法，都是相對的，而且并不十分可信。目前用于正式實(shí)驗(yàn)前檢測核酸質(zhì)量的方法，一是電泳，二是紫外分光光度儀。電泳檢測的主要是核酸的完整性和大小，只要核酸不是太小或者太大(超出電泳分離范圍)，該方法還是非常可信的；電泳還可以用于估計核酸的濃度，但其準(zhǔn)確度與經(jīng)驗(yàn)有關(guān)；另外，電泳也可能提供某些雜質(zhì)污染的信息，但是同樣與經(jīng)驗(yàn)有關(guān)。紫外分光光度儀檢測的是純度和核酸含量，然而，由于紫外分光光度儀不能確保非常準(zhǔn)確，而該儀器的靈敏度又非常高，所以，提供的結(jié)果并不十分可信。一般講，同時進(jìn)行紫外和電泳檢測，綜合二者的結(jié)果，可以做出一個更合理的判斷。但由于這兩個方法都有缺陷，所以，即使出現(xiàn)壞的結(jié)果能用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)而好的結(jié)果卻不能用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，也不用大驚小怪。

關(guān)于紫外分光光度儀的檢測。首先，不要使用不能選擇波長的儀器；使用那些已經(jīng)固定了波長的儀器，大概可以算是你夢魘的開始(沒有信息是可怕的，更可怕的是將錯誤的信息當(dāng)真，其中280、320、230、260nm下的吸光度分別代表了核酸、背景（溶液渾濁度）、鹽濃度和蛋白等有機(jī)物的值。)。其次，一定要經(jīng)常調(diào)較儀器；調(diào)較可以使用非常純的自備核酸，也可以使用苯酚。最后，要記住讀數(shù) A230 ：A260 ：A280 = 1：2(DNA 為 1.8)：1 為理論上的數(shù)據(jù)，實(shí)際測定時會有一些差別；但如果差別太大，就有問題了，有兩個值得商榷的觀點(diǎn)：如果 A260/A230 > 2 就是純的，如果 A260/A280 > 2 就是核酸降解。A260/A230 如果比 2.0 大許多，一定是有雜質(zhì)殘留的(具體是什么雜質(zhì)我不知道)。如果核酸抽提好后立即就測定，A260/A280 > 2.0 決不提示核酸降解，原因是：那些能導(dǎo)致 A260/A280 > 2.0 的核酸片段非常小，常規(guī)的沉淀是不可能將它們沉淀下來的；更可能的原因是：你儀器提供的 A260/A280 實(shí)際是 A262/A282 甚至 A264/A284 的值。純的核酸的

吸光值，在 A230 是谷底，在 A260 是峰頂，在 A280 則正好是半山坡。根據(jù)曲線在底和頂?shù)男甭首钚?，在半山坡的斜率最大的特點(diǎn)，不難得出如下結(jié)論：A230 和 A260 的讀數(shù)受儀器準(zhǔn)確性的影響比較小，而 A280 受儀器準(zhǔn)確性的影響比較大。

關(guān)于電泳檢測，觀察瓊脂凝膠中DNA的最簡單方法是利用熒光染料溴化乙錠進(jìn)行染色。該物質(zhì)含有一個可以嵌入DNA的堆積堿基之間的一個平面基團(tuán)，這個基團(tuán)的固定位置及其與堿基的密切接近，導(dǎo)致染料與DNA結(jié)合并呈現(xiàn)熒光，其熒光產(chǎn)率比游離染料溶液有所增加。DNA吸收254nm處的紫外輻射并傳遞給染料，而被結(jié)合的染料本身則在302nm和366nm有光吸收。這兩種情況下，被吸收的能量可在可見光譜紅橙區(qū)的590nm處重新發(fā)射出來。因此，當(dāng)凝膠中含有游離溴化乙錠時即可以檢測到少量的DNA。

建議先電泳檢測，再用紫外分光光度儀檢測。電泳后，可以看到哪些樣品根本就不能用(如降解太厲害)，以及核酸的大致濃度，這樣就為紫外分光光度儀的檢測提供了一個參考(降解的不必要測了，要測的該取多少量等)。

八、核酸中雜質(zhì)的去除 關(guān)于核酸分離純化階段中除去多糖、蛋白質(zhì)及不同類型核酸之間分離的一些方法，分別介紹如下：

（1）肝糖元、淀粉及粘多糖，由于其物理化學(xué)性質(zhì)與核酸有許多相似之處，常在提取液中殘存下來。除去的方法常有：①取材前盡量減少組織中多糖的含量，如先使動物饑餓數(shù)天然后殺死，可使細(xì)胞內(nèi)肝糖元大大減少。②加入淀粉酶，將大分子多糖分解為小分子，在以后純化步驟中逐漸被除去。③在濃磷酸鹽存在下，以2-甲氧基乙醇抽提核酸提取液，使多糖溶于下層水相，核酸在上面有機(jī)層中。④以鈣鹽沉淀DNA，再以草酸鉀處理，使之形成DNA鉀鹽回收，然后用離子交換法吸附DNA，使之與多糖分離。

（2）蛋白質(zhì)的除去：由于核酸在細(xì)胞內(nèi)以核蛋白體形式存在，不論采用哪種方法提取核酸，蛋白質(zhì)都不同程度地存在于體系中。因此，除去蛋白質(zhì)是核酸分離純化不可避免的步驟。常用方法有下列幾種：①加入去污劑如硫酸十二脂鈉，從提取到分離純化各階段均可反復(fù)使用此法。去污劑與氯仿法或苯酚法結(jié)合使用，效果更加理想。②氯仿-戊醇或辛醇對提取液搖蕩抽提，蛋白質(zhì)在氯仿-水界面形成凝膠，離心后除去，核酸留在水溶液中。此法在分離純化中也常反復(fù)使用。③苯酚水溶液抽提，在對氨基水楊酸等陰離子化合物存在下，DNA或RNA都可以進(jìn)入水相，蛋白質(zhì)則沉淀于酚層，然后取水相加入乙醇或2-乙氧基乙醇沉淀RNA或DNA，殘余的酚可用葡聚糖凝膠G-10或G-25除去。

（3）不同類型核酸的分離：兩種類型核酸的制備過程中，DNA制品中混雜著少量RNA或RNA制品中混雜著少量DNA是經(jīng)常發(fā)生的。由于DNA和RNA結(jié)構(gòu)和性質(zhì)都很相似，而且分子量都十分大，所以兩類核酸的分離是核酸純化工作中比較復(fù)雜和繁瑣的一步。從DNA中除去RNA的方法常有：①核糖核酸酸酶選擇地破壞RNA，這是比較有效的方法，但使用的核糖核酸酶中常含有極微量的脫氧核糖核酸酶，必須事先加熱處理除去，然后將純凈的核糖核酸酶與樣品溶液一起在37℃孵育數(shù)分鐘，就可達(dá)到破壞RNA的目的。②鈣鹽分步沉淀：在核酸溶液中加入1/10體積10%的氯化鈣溶液，使DNA與RNA均成為鈣鹽后，再利用DNA鈣鹽在2/10體積乙醇中能形成沉淀析出，RNA鈣鹽不形成沉淀而彼此分離。③活性炭吸附：將處理好的活性炭按1/15～1/20體積加入每毫升含有0。5～1mgDNA溶液中，0～4。C下攪拌1h，以31000×g離心1h，除去RNA后的DNA回收率可達(dá)94%。

在RNA制品中除去DNA，苯酚水溶液抽提是較有效和常用的方法。在沒有陰離子化合物存在下，以等體積90%苯酚水溶液反復(fù)抽提RNA，可以除去絕大部分DNA。此外，也可采用加入脫氧核糖核酸酶處理，破壞DNA，或參考上述DNA與RNA分離方法將DNA除去。

（4）同類核酸的分離 ：①RNA混合物的分離：經(jīng)過提取的初步純化的RNA制品中含有各類RNA和某些已降解的RNA混雜物。進(jìn)一步純化時，多應(yīng)用柱層析、梯度離心及逆流分溶等方法。例如tRNA與rRNA的分離用吸附于硅藻土表面的甲基化白蛋白柱吸附后，以不同梯度氯化鈉溶液洗脫，或用蔗糖梯度（頂部5%濃度，底部20%濃度）離心法分開。mRNA的代謝速度較快，在細(xì)菌中平均壽命為90min，在哺乳動物中約為幾小時至十幾小時，常用密度梯度離心法和DNA-瓊脂柱進(jìn)行分離。制備rRNA時，由于共沉作用，?；煊衜RNA，一般可用萘-1，5-二磺酸處理，使二者分開。各種tRNA的提純，通常采用逆流分溶法在磷酸緩沖液-甲酰胺-異丙醇系統(tǒng)下進(jìn)行，分離效果較好。②DNA混合物的分離：主要是變性或降解的DNA和天然的分離，常用磷酸鈣、ECTEOLA-纖維素、DEAE-纖維素和甲基化白蛋白柱層析，逆流分溶，梯度離心等方法。一個具有生物活性高度提純的DNA制品應(yīng)具有如下標(biāo)準(zhǔn)：不含有蛋白質(zhì)及多糖；不含有可透析的小分子雜物；在pH7時紫外吸收最大值在257～261μm之間，E（P）在6600左右；不含有RNA；固體為纖維狀，水溶液具有高的粘度并有流動雙折射作用；具有電泳均一性及超離心中單分散性；具有生物活性。

一、植物核酸提取

1976 年，Millgan 用Blin 和Stafford 描述的方法分離了植物DNA，然而這些DNA 是不能用于克隆的。在發(fā)明了去除植物DNA 上污染物的方法之后，人們可用分離動物組織DNA 的方法分離植物DNA。去除植物帶電高分子污染物的方法有核分離（Bickle 等1977）。CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）分離（Murray，Thompson 1980）和鹽酸／十二烷基肌氨酸鈉分離（Sung，Slightom 1981）等。在這些方法中，CTAB 方法因簡便、快速而使用最廣泛。收集和保存植物組織的方法對于 DNA 的產(chǎn)量和質(zhì)量也有很大影響。雖然已能成功地從植物標(biāo)本和化石中分離出 DNA（Doyle，Dickson 1987），但采用新鮮材料能產(chǎn)生最好的結(jié)果，特別是對于產(chǎn)生大量單寧、酚或其他次級代謝產(chǎn)物的種。如材料不能馬上進(jìn)行提取，應(yīng)保存在冷而濕的地方，例如在冰盒中。如有必要可以冷凍保存。如果沒有條件，最好在無水CaSO４瓶中快速干燥（Liston 等 1990）。DNA 的提取應(yīng)盡快進(jìn)行，以防其降解（Pyle，Adams1989）。提取DNA 的過程中有許多因素能導(dǎo)致DNA 降解。首先是物理因素。因?yàn)镈NA 分子量較大，機(jī)械張力或高溫很容易使DNA 分子發(fā)生斷裂。因此，在實(shí)際操作過程中應(yīng)盡可能輕緩，盡量避免過多的溶液轉(zhuǎn)移及劇烈的振蕩等，以減少機(jī)械張力對DNA 的損傷，同時也應(yīng)避免過高的溫度。其次，細(xì)胞內(nèi)源DNA 酶及細(xì)胞破裂釋放的次級產(chǎn)物也會導(dǎo)致DNA 降解。所以在提取DNA 的實(shí)驗(yàn)中，設(shè)計了許多可供選擇的分離緩沖液，以適應(yīng)不同的植物材料。分離緩沖液的pH 值有時需要進(jìn)行改進(jìn)，pH 應(yīng)避免接近降解酶的最適點(diǎn)。大多數(shù)降解酶和脂肪氧合酶pH 值的最適點(diǎn)在 5.0～6.0 之間，而DNA 酶pH 值最適點(diǎn)在 7.0 左右（Dunham，Bryant 1963）。由于在過酸的條件下，DNA 脫嘌呤會導(dǎo)致DNA 的不穩(wěn)定，極易在堿基脫落的地方發(fā)生斷裂，所以大多植物DNA 提取緩沖液的pH 值為8.0，有的甚至為9.0。緩沖液中包含了大量的復(fù)合物，如 EDTA（乙二胺四乙酸）、SDS（十二烷基硫酸鈉）、牛血清白蛋白（BSA）、β-巰基乙醇、谷胱甘肽、二硫蘇糖醇（DTT）、抗壞血酸（Vc）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、二乙基焦碳酸鹽（DEPC）、溴化乙錠（EB）等（Hallick等1977）。但由于上述物質(zhì)有些是抑制內(nèi)切酶和非特異性核酸酶的，所以在其后的步驟中要將其除去。分離DNA 與蛋白質(zhì)一般采用苯酚－氯仿抽取的方法。苯酚、氯仿對蛋白質(zhì)均有極強(qiáng)的變性作用，而對DNA 無影響。下面的方法描述DNA 與污染物多糖的分離，也可用陰離子交換層析儀來進(jìn)行。下面列出了3 種常見的分離植物總DNA 的方法。3 種方法溶解細(xì)胞膜和分離蛋白質(zhì)的方法不同，各有其優(yōu)、缺點(diǎn)。DNA制備

（一）植物總DNA的提?。〤TAB 緩沖液方法：這是最廣泛地用來分離植物DNA 的方法，對大多數(shù)植物種都適用，特別是當(dāng)樣本數(shù)量很小時。此法運(yùn)用陽離子去污劑CTAB 溶解植物細(xì)胞膜，并與DNA 形成一復(fù)合物。其優(yōu)點(diǎn)是不需要準(zhǔn)備大量的植物組織，而且適合像葉、根、種子、胚、胚乳、花粉和懸浮培養(yǎng)的組織等多種類型的組織（Rogers，Bendch 1985）。另外，此法對樣品數(shù)量的要求也不高，從小到毫克數(shù)量的標(biāo)本（木乃伊、化石）到許多克的新鮮材料均可使用（Golenberg 等 1990；Rogers Bendch 1985）。A ：CTAB 的實(shí)驗(yàn)方法

1．材料（1）2 倍CTAB 緩沖液： 100 mmol／dm３Tris-HCI，pH 值 8．0 1．4mol／dm３NaCI 20 mmol／dm３EDTA 2％ CTAB（W／V）1％ PVP-360（W／V）0．2％?-巰基乙醇（體積比，用前在通風(fēng)櫥中加）（2）清洗緩沖液： 76％乙醇 10 mmol／dm３乙酸銨（3）懸浮緩沖液： 10 mmol／dm３乙酸銨 0．25 mmol／dm３EDTA，pH 值 8． 2．步驟

1）加熱分離緩沖液、研缽、研杵到60℃。

2）在熱研缽中放人0．5～1．5g 新鮮或冰凍的葉子，用7．5ml 2 倍CTAB 分離緩沖液研磨（可加些石英砂幫助研磨）。對凍干的組織用1 倍CTAB 緩沖液研磨。把研碎的組織倒入50ml 管中，再用0．5ml 2 倍CTAB 緩沖液沖洗研缽，將沖洗液加到管中。

3）將試管在60℃下放置30～60 分鐘，然后輕輕振蕩，使之充分混合后降至室溫

4）在試管中加入10ml 氯仿－異戊醇（24：1）萃取液（如顏色深可再進(jìn)行一次），輕輕搖晃使其混合，在室溫下1500r／min 離心5 分鐘，使其分相。

5）將上層的水相倒入－15ml 管中，加2／3 體積的冷異丙醇，輕輕混合以沉淀核酸。如果

看不到核酸沉淀，可在－20℃下放置20 分鐘或更長時間。6）室溫下 800r／min 離心 3～5 分鐘，如果看不到小團(tuán)或沉淀，可在－20℃下放置 20分鐘再離心。

7）小心地倒掉上清液，不要倒掉核酸，這時的核酸一般松散地貼在管的底部，加 15ml清洗緩沖液，輕輕地旋轉(zhuǎn)清洗沉淀物，15～20 分鐘后核酸將變得更白。

8）室溫下800r／min 離心5 分鐘（如不充分，則加大離心速度或延長離心時間），倒掉清洗緩沖液，將管倒扣在紙巾上，讓沉淀物干燥，小心不要讓DNA 滑掉。

9）按沉淀物的大小用少量懸浮緩沖液（10～100 μl）懸浮DNA。l0）用100μg／ml RNAase 在 37℃下溫育 30～60 分鐘。11）如果組織包含單寧或其他次級產(chǎn)物，可以對 DNA 作進(jìn)一步純化（可用氯仿、苯酚純化）。一些材料可能需要用氯銫（CsCl）梯度純化。上述方法也可以進(jìn)行改進(jìn)，像巰基乙醇的濃度可以提高至 25mmol／dm３，也可加入 l％的抗壞血酸、DTT 等，CTAB 也可用 SDS 取代（Golenberg 等1990），也可用 TE（10mmol／dm３Tris-HCI，pH 值 8。0，lmmol／dm３EDTA）作懸浮緩沖液。B ：CTAB 沉淀法

1．材料 2 倍CTAB 分離緩沖液；沉淀緩沖液： 100 mmol／dm３Tris-HCI，pH 值 8．0；20 mmol／dm３EDTA；2％CTAB（w／V）。2．步驟

1）與A中前4 個步驟同。

2）吸取上層水相，將其例入一個15ml 管中。

3）加 3 倍體積的沉淀緩沖液，使NaCI 的濃度減少到 0．35mol／dm３，室溫下放置 30分鐘。

4）室溫下 2 000r／min 離心 5 分鐘，以沉淀 DNA。

5）根據(jù)沉淀物的大小，用少量的懸浮緩沖液（10～100μl）懸浮DNA。6）雖然氯仿或苯酚提取DNA 是有效的，但是對那些包含單寧或其他次級產(chǎn)物的組織，可以在氯化銫梯度上進(jìn)一步純化。

（二）從植物組織提取基因組DNA

1、材料

水稻幼苗或其它禾本科植物，李（蘋果）幼嫩葉子。

2、設(shè)備

移液器，冷凍高速離心機(jī)，臺式高速離心機(jī)，水浴鍋，陶瓷研缽，50ml離心管（有蓋）及5ml和1。5ml離心管，彎成鉤狀的小玻棒。

3、試劑

1）提取緩沖液Ⅰ：100mmol/L Tris·Cl, pH8。0, 20mmol/L EDTA, 500mmol/L NaCl, 1.5%SDS。

2）提取緩沖液Ⅱ：18。6g葡萄糖，6。9g二乙基二硫代碳酸鈉，6。0gPVP，240ul巰基乙醇，加水至300ml。3）80：4：16/氯仿：戊醇：乙醇 4）RnaseA母液：配方見第一章。

5）其它試劑：液氮、異丙醇、TE緩沖液，無水乙醇、70%乙醇、3mol/L NaAc。

4、操作步驟：

（一）水稻幼苗或其它禾木科植物基因組DNA提取

1）在50ml離心管中加入20ml提取緩沖液Ⅰ, 60℃水浴預(yù)熱。2）水稻幼苗或葉子5-10g, 剪碎, 在研缽中加液氮磨成粉狀后立即倒入預(yù)熱的離心管中, 劇烈搖動混勻, 60℃水浴保溫30-60分鐘(時間長,DNA產(chǎn)量高), 不時搖動。

3）加入20ml氯仿/戊醇/乙醇溶液, 顛倒混勻(需帶手套, 防止損傷皮膚)，室溫下靜置5-10分鐘, 使水相和有機(jī)相分層(必要時可重新混勻)。

4）室溫下5000rpm離心5分鐘。

5）仔細(xì)移取上清液至另一50ml離心管,加入1倍體積異丙醇,混勻,室溫下放置片刻即出現(xiàn)絮狀DNA沉淀。6）在1.5ml eppendorf中加入1ml TE。用鉤狀玻璃棒撈出DNA絮團(tuán),在干凈水紙上吸干,轉(zhuǎn)入含TE的離心管中,DNA很快溶解于TE。7）如DNA不形成絮狀沉淀,則可用5000rpm離心5分鐘, 再將沉淀移入TE管中。這樣收集的沉淀,往往難溶解于TE,可在60℃水浴放置15分鐘以上，以幫助溶解。

8）將DNA溶液3000rpm離心5分鐘, 上清液倒入干凈的5ml離心管。9）加入5μl RNaseA(10μg/μl), 37℃ 10分鐘, 除去RNA(RNA對DNA的操作、分析一般無影響，可省略該步驟）。

10）加入1/10體積的3mol/L NaAc及2×體積的冰乙醇,混勻,-20℃放置20分左右,DNA形成絮狀沉淀。

11）用玻棒撈出DNA沉淀,70%乙醇漂洗,再在干凈吸水紙上吸干。12）將DNA重溶解于1ml TE,-20貯存。

13）取2μl DNA樣品在0。7% Agarose膠上電泳, 檢測DNA的分子大小。同時取15μl稀釋20倍, 測定OD260/OD280, 檢測DNA含量及質(zhì)量。

[注意] 5g樣品可保證獲得500μg DNA, 足供RFLP、PCR等分析之用。

（三）從李(蘋果)葉子提取基因組DNA 1）取3-5克嫩葉, 液氮磨成粉狀。

2）加入提取緩沖液Ⅱ10ml, 再研磨至溶漿狀。10000rpm, 10min。3）去上清液,沉淀加提取液Ⅰ20ml, 混勻。65℃, 30-60min, 常搖動。4）同本節(jié)

（一）中步驟3-13操作。二 從動物組織提取基因組DNA

（一）動物組織提取基因組DNA

1、材料

哺乳動物新鮮組織。

2、設(shè)備

移液管、高速冷凍離心機(jī)、臺式離心機(jī)、水浴鍋。

3、試劑

1、分離緩沖液：10mmol/L Tris·Cl pH7。4, 10mmol/L NaCl, 25mmol/L EDTA。其它試劑：10% SDS，蛋白酶 K(20mg/ml或粉劑)，乙醚，酚：氯仿：異戊醇(25：24：1)，無水乙醇及70%乙醇，5mol/L NaCl，3mol/L NaAc，TE。

4、操作步驟：

1）切取組織5g左右,剔除結(jié)締組織,吸水紙吸干血液,剪碎放入研缽(越細(xì)越好)。

2）倒入液氮,磨成粉末,加10ml分離緩沖液。3）加1ml 10% SDS, 混勻,此時樣品變得很粘稠。

4)加50ul或1mg 蛋白酶 K, 37℃保溫1-2小時, 直到組織完全解體。

5)加1ml 5mol/L NaCl, 混勻,5000rpm離心數(shù)秒鐘。

6)取上清液于新離心管，用等體積酚：氯仿：異戊醇(25：24：1)抽提。待分層后,3000rpm離心 5分鐘。

7)取上層水相至干凈離心管, 加2倍體積乙醚抽提(在通風(fēng)情況下操作)。8)移去上層乙醚,保留下層水相。

9)加1/10 體積3mol/L NaAc, 及2倍體積無水乙醇顛倒混合沉淀DNA。室溫下靜止10-20分鐘，DNA沉淀形成白色絮狀物。10)用玻棒鉤出DNA沉淀,70%乙醇中漂洗后,在吸水紙上吸干,溶解于1ml TE中,-20℃保存。

11)如果DNA溶液中有不溶解顆粒,可在5000rpm短暫離心,取上清;如要除去其中的RNA,可加5μl RNaseA(10μg/μl), 37℃保溫30分鐘, 用酚抽提后, 按步驟9-10重沉淀DNA 12）以分光光度計測定DNA 的濃度（260nm），260／280nm 的光密度比值應(yīng)在 1．8 以上，否則提示可能有蛋白質(zhì)或苯酚的污染。13）以TE 溶液將DNA 樣品稀釋成所需的工作液的濃度。

14）取2μl 左右的樣品進(jìn)行電泳檢測，以判斷 DNA 是否有降解以及是否需要消除RNA(二）微量動物組織樣品的總DNA 提取方法

從微量組織中提取DNA 的方法是1989 年由Singer-Sam（Walsh 等1991）發(fā)展起 的。此方法的基本原理是采用 BioRad Chelex 100（一種螯合劑）提取DNA。此方法簡便

快速，提取后的DNA 樣品可以直接作為PCR 的模板。具體的操作步驟如下：

1）取一小塊冰凍的組織（少于1mg，可用經(jīng)消毒的槍頭鉆?。?～3 根帶有毛根的毛發(fā)（需先經(jīng) 90％、70％的乙醇和滅菌水依次清洗，并剪去毛干部分），或 1～5μl 血液，加入經(jīng)過高溫消毒的離心管中。離心管內(nèi)事先加入 500μl 5％的Chelex 溶液。

2）將樣品管在56℃下放置1 小時或更長時間，直至組織樣品成粉末狀（不同組織所需時 間各不相同）。3）在振蕩器上振蕩10～15 秒鐘。4）在 95～100℃下煮 15～40 分鐘。5）在振蕩器上振蕩10～15 秒鐘。

6）將樣品管在4℃下保存，進(jìn)行PCR 反應(yīng)之前再次離心，使Chelex 顆粒沉淀。取上清液（1～10μl）作為DNA 模板。

（三）陳舊、古老DNA 樣品的提取方法

對于陳舊、古老DNA 的研究始于80 年代中期。1985 年，Paabo 采用克隆的手段首次從古埃及木乃伊中提取并測定了一段DNA 序列。然而，較為廣泛地開展對古老DNA 的研究是在多聚酶鏈?zhǔn)骄酆戏磻?yīng)（PCR）發(fā)明以后才開始的（Mullis，F(xiàn)allona 1987）。

經(jīng)過一定時期的物理、化學(xué)作用（幾十年至幾百萬年）的DNA 往往存在比較嚴(yán)重的降解，DNA 片段常常僅有幾百個bp 的長度，并且可能存在堿基的修飾和一些抑制PCR 反應(yīng)的物質(zhì)。因此，在從陳舊或古老樣品中提取DNA 時，最為關(guān)鍵的問題就是防止現(xiàn)代DNA 的 污染。進(jìn)行DNA 提取操作的所有器皿、器械和試劑均要進(jìn)行滅菌處理，提取過程應(yīng)在超凈臺中進(jìn)行。此外，提取時應(yīng)設(shè)陰性對照，以監(jiān)測是否存在外源DNA 的污染。下面介紹的是一種較為簡便的提取方法。1）取樣品少許（如哺乳動物的皮張可取 1cm × 1cm 見方的小塊），用剪刀、手術(shù)刀等器械對樣品表面進(jìn)行處理，除去最容易遭受外來污染的表層。對于骨骼、琥珀等堅(jiān)硬的樣品則需要用小鋼鉆等特殊器械從內(nèi)部取得樣品。

2）經(jīng)過表面處理的樣品用90％乙醇、70％乙醇和去離子水依次進(jìn)行清洗。

3）在滅菌的 Eppendorf 管中加入 200μl 去離子水、10μl 蛋白酶K（10mg／ml）和 1／10 體積的（20μl）10％的β-巰琉基乙醇。處理過的樣品放入上述溶液前要盡可能剪碎。4）在56℃下消化48 小時。

5）樣品管中加入等體積的5％～10％的Chelex100 溶液，在旋渦混合器上振蕩5～10秒鐘，然后在98℃下放置20～60 分鐘。6）振蕩混合5～10 秒鐘，并使之冷卻至室溫。7）12 000r／min 離心 5～10 分鐘。

8）小心取出上層清液，置另一干凈的管中保存。

（三）細(xì)菌基因組DNA的制備

1、材料 細(xì)菌培養(yǎng)物。

2、設(shè)備

移液管, 高速冷凍離心機(jī), 臺式離心機(jī)，水浴鍋。

3、試劑

1）CTAB/NaCl溶液：4。1g NaCl溶解于80ml H2 O,緩慢加入10g CTAB,加水至100ml。

2）其它試劑：氯仿：異戊醇(24：1)，酚：氯仿：異戊醇(25：24：1)，異丙醇，70% 乙醇，TE，10% SDS，蛋白酶 K(20mg/ml或粉劑)，5mol/L NaCl。

4、操作步驟：

1）100ml 細(xì)菌過夜培養(yǎng)液, 5000rpm離心10分鐘, 去上清液。2）加9。5ml TE懸浮沉淀, 并加0。5ml 10% SDS, 50μl 20mg/ml(或1mg干粉)蛋白酶 K, 混勻, 37℃保溫1小時。3）加1。5ml 5mol/L NaCl, 混勻。

4）加1。5ml CTAB/NaCl溶液, 混勻, 65℃保溫20分鐘。5）用等體積酚：氯仿：異戊醇(25：24：1)抽提, 5000rpm離心10分鐘, 將上清液移至干凈離心管。

6）用等體積氯仿：異戊醇(24：1)抽提, 取上清液移至干凈管中。7）加1倍體積異丙醇, 顛倒混合, 室溫下靜止10分鐘，沉淀DNA。8）用玻棒撈出DNA沉淀, 70%乙醇漂洗后, 吸干,溶解于1ml TE,-20℃保存。如DNA沉淀無法撈出,可5000rpm離心, 使DNA沉淀。9）如要除去其中的RNA, 可以按本章第三節(jié)中操作步驟處理。

（五）真菌DNA的提取

1）取真菌菌絲0。5g, 在液氮中迅速研磨成粉； 2)加入4mL提取液，快速振蕩混勻；

3)加入等體積的4mL的氯仿：異戊醇(24：1)，渦旋3～5min（此處是粗提沒有加酚，可以節(jié)約成本的喲?。?； 4)1000rpm，4℃，5min；

5)上清用體積的氯仿：異戊醇(24：1)再抽提一次（10,000 rpm，4℃離心5 min）；

6)取上清，加入2/3倍體積的-20℃預(yù)冷異丙醇或2。5倍體積的無水乙醇沉淀, 混勻, 靜置約30 min；

7)用毛細(xì)玻棒挑出絮狀沉淀, 用75%乙醇反復(fù)漂洗數(shù)次, 再用無水乙醇漂洗1次, 吹干，重懸于500 ；

8)加入1 ul RNaseA（10 mg/mL），37℃處理1 hr；

9)用酚（pH8。0）：氯仿：異戊醇(25：24：1)和氯仿：異戊醇(24：1)各抽提1次（10,000 rpm，4℃離心5 min）；

10)取上清，1/10V 3M NaAc,2。5V體積的無水乙醇,-70℃沉淀30 min以上；

11)沉淀用75%乙醇漂洗，風(fēng)干, 溶于200 ulTE中，-20 ℃保存?zhèn)溆?。RAN提取

(一）細(xì)菌RNA的制備 1）菌體培養(yǎng)簡略。

2）離心收集菌體菌體 經(jīng)離心（5000g，5min）后，懸浮于終止緩沖液中（200mM Tris-HCl，pH8。0;20 mM EDTA;20 mM Na2N3;20 mM 金精三羧酸(ATA)）3)菌體裂解

加入STET緩沖液(8% 蔗糖;5% Triton X-100;50mM EDTA;50mM Tris-HCl pH 7。0)懸浮加入0。2 M 的VRC(0。2M和10 mM的氧釩核苷復(fù)合物)4)RNA提取 加入0。5 V的苯酚振蕩1 min,0。5 V氯仿振蕩1 min,10 000 g, 10 min,水相加入1/10 V的NaAc, 2 V的無水乙醇10000 g, 10 min沉淀溶于0,2 M 的VRC,以酚-氯仿抽提兩次 5)RNA純化 重溶沉淀于DEPC(焦碳酸二乙酯)處理的水中,加入CsCl溶液,于室溫離心(200000 g,1 h)回收RNA沉淀,溶于DEPC處理的水中,加入1/10 V的3 M的NaAc, 2 V的乙醇,離心后 6．RNA的溶解 將RNA沉淀溶于水中(二)植物組織細(xì)胞RNA的制備 1)細(xì)胞處理： 將植物組織置于液氮中凍結(jié)，研成粉末，加入勻漿緩沖液，高速勻漿，后高速離心（20000g，10 min）2)RNA提?。荷锨逡褐屑尤朐硗?4%),等體積的酚,低溫振蕩5min，200000 g, 10 min 3)重復(fù)該步驟一次 4)RNA沉淀： 于上清液中加入KAc至終濃度為0。2 M,加兩倍體積 的無水乙醇,于0oC 30 min，30000g,20 min 5)RNA的溶解：沉淀溶于水中或TE緩沖液(三)哺乳動物細(xì)胞質(zhì)RNA的制備 1)細(xì)胞培養(yǎng)： 人工組織培養(yǎng)2)細(xì)胞裂解：以含磷酸緩沖液（PBS）的生理鹽水洗細(xì)胞懸浮于預(yù)冷的溶胞緩沖液中，加入24%的蔗糖，1%的NP-40溶胞緩沖液 3)去蛋白： 加入Protease K，于37 oC溫育30 min，酚抽提 4)去DNA：乙醇沉淀,懸浮于DNA消化液(DNase I, 0.2% SDS)5)沉淀RNA： 加入終濃度為0。3 M的NaAc, 2V 無水乙醇于-20 oC 2 h, 離心收集RNA。

（四）真菌菌絲的總RNA的提取

RNA提取緩沖液（CTAB）：2% CTAB（W/V），2% 聚乙烯吡咯烷酮PVP（W/V），100 mM Tris-HCl（pH8.0，DEPC處理的水配置），25mM EDTA, 0.5g/L 亞精胺Spermidine，2.0M NaCl，2%巰基乙醇（V/V，使用前加入）。由于在高溫滅菌條件下，Tris-HCl要和DEPC發(fā)生反應(yīng)，所以配RNA提取緩沖液時直接用DEPC 處理的水配制即可。SSTE：1 M NaCl，0.5% SDS（W/V），10 mM Tris-HCl pH8。0，1。0 mM EDTA 10M LiCl 直接用蒸餾水配10M LiCl，加1‰的DEPC過夜后，高溫滅菌。

3M NaAc 氯仿：異戊醇（24：1）酚（pH4.5）：氯仿：異戊醇（25：24：1）DEPC處理水 用1‰的DEPC處理蒸餾水過夜，高溫滅菌 無水乙醇 70%酒精。

1）實(shí)驗(yàn)開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱，離心管中加入ME（巰基乙醇）（10mL 加80ul，50mL中加入300ul）；

2）取約0.8g菌絲體（液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了），在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末，裝入50 mL離心管，按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液，顛倒混勻； 3)65℃水浴3-10 min，期間混勻2-3次；

4）加入等體積的酚（注意是酸酚pH4.5）：氯仿：異戊醇（25：24：1）抽提（10,000 rpm，4℃，5 min）；

5）取上清，等體積的氯仿：異戊醇（24：1）抽提（10,000 rpm，4℃，5 min）；

6)加入1/4V體積10M LiCl溶液，4℃放置6hr以上(或過夜)； 7）10,000 rpm，4℃離心20 min； 8）棄上清，用500 ulSSTE溶解沉淀；

9）酚：氯仿：異戊醇（25：24：1）抽提兩次, 氯仿：異戊醇（24：1）抽提1次（10,000 rpm，4℃，5 min）； 10）加2V體積的無水乙醇，在-70℃冰箱沉淀30 min以上； 11）12,000 rpm，4℃離心20 min；

12）棄上清。沉淀用70%酒精漂洗一次，干燥； 13）加200 ul的DEPC處理水溶解；

14）用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質(zhì)量（在抽提過程中，若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多，可以增加抽提次數(shù)）； PCR 小量制備法

此方法的優(yōu)點(diǎn)是一次可以提純很多樣品，比較快速，而且小于10mg（50mm）的新鮮葉子材料就可以產(chǎn)生足夠的DNA，產(chǎn)生的DNA 對雜交實(shí)驗(yàn)是可用的（Millgan 1992）。這個方法存在的問題是DNA 沉淀物可能不夠緊密，或不一定能形成一緊密的DNA 沉淀。1.材料

分離緩沖液：200 mmol／dm３Tris-HCI，pH 值 8．0；250 mmol／dm３NaCI；25 mmol／dm３EDTA；0．5 ％ SDS。2.步驟

（1）用1．5ml 離心管研磨小的組織樣品?？扇」芸诖笮〉男迈r葉子（＜10mg），凍在液氮中的葉子也可用。

（2）在研碎的樣品中加 400μl 的分離緩沖液，用適合的速度渦旋 10 秒鐘，以分散開樣品。（3）在室溫下將1．5ml 離心管中樣品離心 12～15 分鐘，沉淀細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)。（4）搜集300μl 的上清液，棄去沉淀。（5）在上清液中加300μl 預(yù)冷異丙醇，倒轉(zhuǎn)樣品1～3 次，使之充分混合，在室溫下至少放置5 分鐘。

（6）將微離心管中的樣品在室溫下離心20 分鐘，以搜集沉淀的DNA。（7）棄去上清液，用300μl 80％的乙醇室溫下沉淀 10 分鐘。（8）室溫下離心樣品12 分鐘，棄去上清液。

（9）用300μl 80％的乙醇再洗后，室溫下離心 5 分鐘，棄去上清液。

（10）室溫下干燥樣品1 小時或?qū)悠贩胚^夜。（11）用 100μl TE 懸浮樣品。

第二篇：核酸抽提經(jīng)驗(yàn)及原理

核酸抽提經(jīng)驗(yàn)及原理

核酸抽提經(jīng)驗(yàn)及原理 1：核酸抽提原理 簡單地講，核酸抽提包含樣品的裂解和純化兩大步驟。裂解是使樣品中的核酸游離在裂解體系中的過程，純化則是使核酸與裂解體系中的其它成分，如蛋白質(zhì)、鹽及其它雜質(zhì)徹底分離的過程。經(jīng)典的裂解液幾乎都含有去污劑(如 SDS、Triton X-100、NP-40、Tween 20 等)和鹽(如Tris、EDTA、NaCl 等)。鹽的作用，除了提供一個合適的裂解環(huán)境(如 Tris)，還包括抑制樣品中的核酸酶在裂解過程中對核酸的破壞(如 EDTA)、維持核酸結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定(如 NaCl)等。去污劑則是通過使蛋白質(zhì)變性，破壞膜結(jié)構(gòu)及解開與核酸相連接的蛋白質(zhì)，從而實(shí)現(xiàn)核酸游離在裂解體系中。裂解體系中還可能加入蛋白酶；利用蛋白酶將蛋白質(zhì)消化成小的片段，促進(jìn)核酸與蛋白質(zhì)的分開，同時，也便于后面的純化操作以及獲得更純的核酸。也有直接使用高濃度的蛋白質(zhì)變性劑(如GIT、GuHCl 等)裂解的，該方法已經(jīng)成為了 RNA 抽提的主流，卻不是基因組 DNA 抽提的主流。最常用的純化方法，一是PC 抽提 + 醇沉淀，二是介質(zhì)純化。第一種方法是利用 PC對裂解體系進(jìn)行反復(fù)抽提以去除蛋白質(zhì)，實(shí)現(xiàn)核酸與蛋白質(zhì)的分離；再用醇將核酸沉淀下來，實(shí)現(xiàn)核酸與鹽的分離。第二種方法則是利用某些固項(xiàng)介質(zhì)，在某些特定的條件下，選擇性地吸附核酸，而不吸附蛋白質(zhì)及鹽的特點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)核酸與蛋白質(zhì)及鹽的分離。高鹽沉淀去除蛋白質(zhì)是第一種純化方法的一個變體，省略了 PC操作的麻煩。當(dāng)然，也有不純化的抽提方法，但是用途多局限于簡單的 PCR。其它雜質(zhì) – 如多糖、多酚等-的去除，基本上都是在這兩種方法的基礎(chǔ)上，通過增加一些特別的試劑，或者增加一些額外的步驟來實(shí)現(xiàn)的。2：了解你的實(shí)驗(yàn)樣品 如果你研究某個實(shí)驗(yàn)樣品，并且要抽提它的核酸，以下的信息一定要先行收集：該樣品的核酸含量、酶含量、特殊雜質(zhì)含量。如果你對樣品的特點(diǎn)一無所知，當(dāng)樣品稍微有一點(diǎn)復(fù)雜時，抽提核酸的實(shí)驗(yàn)就會碰到許多問題。以血液為例，如果你不知道鳥的血液中有核細(xì)胞的含量是人血的千倍左右，而使用人血一樣的起始量去抽提鳥血的基因組 DNA，怎么可能成功？失敗了又怎么知道原因所在？同時，只有對實(shí)驗(yàn)樣品有所了解，才能正確選擇裂解方法。絕大部分情況下，使用新鮮樣品可以獲得最好的結(jié)果。對一些雜質(zhì)含量高的樣品，如果使用新鮮樣品抽提基因組 DNA 是碰到雜質(zhì)殘留過大的問題，可以試一下-20C保存一天后再抽提的對策，可能會有意想不到的效果。樣品如果因?yàn)槟承┰虮仨毾刃斜４妫惨群喕幌聵悠罚貉鹤詈弥槐４嬗泻思?xì)胞；將樣品分割后保存，避免反復(fù)凍融。如果實(shí)驗(yàn)室不具備合適的保存條件，將樣品先裂解后再保存，是一個不錯的選擇。3：裂解方法的評價 含蛋白酶的裂解方法，可以認(rèn)為是抽提基因組 DNA 的首選。裂解包括膜蛋白的游離和與基因組 DNA相連接的蛋白質(zhì)的游離。蛋白酶的作用是使蛋白質(zhì)變小，故而對蛋白質(zhì)的游離有巨大的促進(jìn)作用；同時，巨大的基因組 DNA是很容易“纏”住大分子的東西的，蛋白質(zhì)被蛋白酶消化變小后，則不容易被基因組 DNA“纏”住，有利于蛋白質(zhì)在純化操作中的去除，使最終獲得的基因組 DNA 的純度更高。另外一個思路是，如果基因組 DNA 與蛋白質(zhì)“纏”在一起，在純化的過程中有兩種可能：如果基因組 DNA 的特性占優(yōu)勢，則純化時以 DNA的形式被保留下來，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的殘留；如果蛋白質(zhì)的特性占優(yōu)勢，則純化時以蛋白質(zhì)的形式被去除，導(dǎo)致 DNA 的損失。有些樣品，如肌肉，即使是RNA 抽提，也強(qiáng)烈建議使用含蛋白酶的裂解液(或者在操作中的某個時候使用蛋白酶消化蛋白質(zhì))，原因在于這些樣品中的蛋白質(zhì)，是非常難以去除的。該方法是獲得最大得率和最高純度的基礎(chǔ)。不使用蛋白酶的去污劑裂解方法，仍然在細(xì)胞基因組 DNA抽提方面有優(yōu)勢，尤其是當(dāng)?shù)寐屎图兌纫蟛皇亲罡?，而?jīng)濟(jì)性及操作簡單很重要時?？刂坪昧呀庖?樣品的比例是該方法成功的關(guān)鍵。該方法結(jié)合高鹽沉淀，可以實(shí)現(xiàn)最簡單的操作，但純度及得率的穩(wěn)定性可能會比用 PC 抽提的差一些。高濃度蛋白質(zhì)變性劑(如 GIT、GuHCl 等)的裂解方法，是抽提 RNA 的首選?？?RNA 的抽提，最重要的是快速裂解細(xì)胞膜，至于與基因組 DNA 相連接的蛋白質(zhì)的裂解以及基因組與蛋白質(zhì)“纏”住的問題，因?yàn)槎疾粫σ院蟮募兓a(chǎn)生大的影響，可以不考慮。高濃度蛋白質(zhì)變性劑能快速破壞細(xì)胞膜，進(jìn)而迅速抑制住細(xì)胞內(nèi)的 RNA酶，從而確保了 RNA 的完整性。除了極少量不適用該方法的樣品 – 主要是植物，其它絕大部分樣品的 RNA的抽提，都可以以高濃度的蛋白質(zhì)變性劑為基礎(chǔ)的。該方法也可用于基因組 DNA 抽提，非?？焖俸唵?，但純度不是很高。含 CTAB的裂解液，幾乎成為富含多糖的樣品，如細(xì)菌、植物的基因組 DNA 抽提的首選裂解方法。該方法成功與否與兩個因素有關(guān)：一是 CTAB的質(zhì)量，二是洗滌的徹底程度。CTAB 的質(zhì)量對裂解效率有很大的影響，而且，似乎還說不清楚原因，因?yàn)榧词故峭还旧a(chǎn)的純度一樣的CTAB，批號不同，效果就可能差別很大。洗滌去除 CTAB 要比其它的鹽難一些，同時，CTAB的少量殘留也會對酶活性有巨大影響，所以洗滌是否徹底也是該方法成功與否的關(guān)鍵。裂解時的溫度，多使用65C；但

如果發(fā)現(xiàn)降解嚴(yán)重或者得率太低，可以試一下 37C – 45C 這個相對低溫的區(qū)域。SDS堿裂解法是質(zhì)粒抽提的首選裂解方法，具有快速、得率高、幾乎無基因組 DNA污染的特點(diǎn)?？刂坪昧呀庖?菌體的比例和操作的溫和是該方法成功的關(guān)鍵。蛋白質(zhì)的沉淀效率在 4C 會更好一些，所以，加入溶液 III 后在 4C靜置一段時間以及采用 4C 離心去蛋白質(zhì)，都可以提高質(zhì)量。該方法不一定要使用 PC 純化，但結(jié)合 PC 純化，可以獲得純度很高的質(zhì)粒。RNA的去除可以靠在溶液 I 中加入 RNase A(100ug/ml)或者在最后的溶解液中加入 RNase A(25 ug/ml)來實(shí)現(xiàn)?？偟母杏X是，在溶液 I 中使用 RNase A，RNA 的殘留少一些。不過，經(jīng)典沉淀幾乎沒有辦法徹底去除 RNA 殘留。另外，對大質(zhì)粒(50 kb 以上)，該方法可能會有問題。PCR模板的簡易裂解方法，也是使用面很廣的一類方法。該方法的特點(diǎn)是無須純化，樣品被裂解后即可直接取裂解液用于PCR，非?？焖?。也正因?yàn)椴患兓?，假陰?即沒有擴(kuò)增出來的陽性)比例也比較高。該方法最簡單的裂解液就是水，復(fù)雜一點(diǎn)的就會含有一些不會抑制后續(xù)的 PCR 反應(yīng)，而且能提高裂解效率，甚至還可能部分消除樣品內(nèi)抑制PCR 反應(yīng)雜質(zhì)的東西，如 Triton X-100、甲酰胺等。再復(fù)雜一點(diǎn)的就會含有諸如 Chelex 100之類的能吸附部分雜質(zhì)的介質(zhì)。操作也非常簡單，多使用溫度的變化來實(shí)現(xiàn)樣品的裂解，如煮沸、或者高溫-低溫的多次循環(huán)等。該方法最適合從一大堆樣品中找出陽性樣品，但卻不適合用于判斷某一個樣品是陽性還是陰性。降低樣品使用量可以提高陽性率，因?yàn)闃悠妨康慕档?，同時意味著 PCR 的抑制物量的降低。選擇了合適的裂解液，下一步就是要控制好樣品與裂解液的比例。這個問題非常重要，但卻沒有獲得足夠的重視。嚴(yán)肅的參考資料，都應(yīng)該會提供一個簡單的比例，如1ml 裂解液可以用于 T mg 組織或者 C個細(xì)胞；我的建議是，你的樣品量絕對要小于資料所提供的。起始樣品用多大，并沒有具體的說法。如果不是樣品量有限，則以能抽提出滿足數(shù)次成功實(shí)驗(yàn)所需的核酸量，作為決定樣品起始量的基礎(chǔ)，會比較合理的。不要因?yàn)?1ml 裂解液可以抽提 100mg 樣品，就一定使用 100mg樣品。裂解液的用量，表面上與抽提的結(jié)果(純度及得率)沒有關(guān)系，然而，在實(shí)際操作中，對結(jié)果是有比較大的影響的。裂解液的用量原則是：確保能徹底裂解樣品，同時使裂解體系中核酸的濃度適中。濃度過低，將導(dǎo)致沉淀效率低，影響得率；濃度過高，去除雜質(zhì)的過程復(fù)雜且不徹底，導(dǎo)致純度下降。另外，裂解液的用量是以樣品中蛋白質(zhì)的含量為基準(zhǔn)的，而不是以核酸含量為基準(zhǔn)，這一點(diǎn)務(wù)必牢記。4：純化方法評價 PC 抽提/醇沉淀方法，是一個永不過時的方法。穩(wěn)定、可靠、經(jīng)濟(jì)、方便。PC抽提可以徹底去除蛋白質(zhì)，醇沉淀可以去除鹽，對于一般的干凈的樣品(雜質(zhì)為蛋白質(zhì))，該方法完全可以獲得高質(zhì)量的核酸。雖然每次 PC抽提都會損失一部分核酸(因?yàn)椴豢赡軐⑺嗳恳迫?，以及低濃度核酸的醇沉淀效率低，但這些問題都可以靠操作的調(diào)整而得以解決或者減少影響。該方法的最大的問題是不適合大規(guī)模抽提。PC抽提是去除蛋白質(zhì)的一個非常有效的手段。苯酚能使蛋白質(zhì)變性，變性后的蛋白質(zhì)從水相中被析出，處于苯酚中或者苯酚/水相之間。PC抽提的關(guān)鍵是，一要混勻徹底，二要用量足夠。徹底混勻，才能確保苯酚與蛋白質(zhì)的充分接觸，使蛋白質(zhì)完全變性。許多人總是擔(dān)心混勻的劇烈程度是否會對核酸，尤其是基因組 DNA 造成破壞，實(shí)際上大可不必如此小心。劇烈的混勻操作，是會部分打斷大分子的基因組 DNA，但該破壞作用不會強(qiáng)烈到 DNA變成 10kb 以內(nèi)的小片段。手劇烈晃動混勻后，基因組 DNA 的片段，大部分會大于 20kb，這個大小，除了一些特別的要求外，對 PCR和酶切，都是完全適用的。如果要求的片段非常大，如構(gòu)建文庫用，則不能使用劇烈的混勻方法，而只能來回溫和顛倒混勻 –此時的關(guān)鍵是：裂解液的比例要足夠大，使體系不要太粘稠。用量要足夠，是因?yàn)楸椒尤コ鞍踪|(zhì)是有一定的飽和度的。超過了該飽和度，裂解體系中的蛋白質(zhì)不會被一次去除，必須靠多次抽提，方可徹底去除。另外，體系太粘稠的壞處是，蛋白質(zhì)難以徹底去除，以及基因組 DNA會斷裂得更厲害，所以要注意裂解液與樣品的比例。4C 離心操作有利于更徹底去除蛋白質(zhì)。PC 抽提的另外一個用途是，利用酸性酚可以部分去除 DNA的特點(diǎn)，在 RNA 抽提時獲得 DNA 殘留極少的 RNA。不過有一點(diǎn)要提醒的是，有些植物樣品，在去除某些雜質(zhì)之前，是不能使用 PC抽提的，否則核酸必定降解。高鹽沉淀蛋白質(zhì)/醇沉淀方法，同樣也是一個非常不錯的方法。與 PC抽提方法相比，除了純度的穩(wěn)定性可能要低一點(diǎn)外，該方法幾乎克服了 PC抽提的所有缺點(diǎn)。更快、更輕松去除蛋白質(zhì)所伴隨的好處是，可以用于大規(guī)模抽提，不足是純度(蛋白質(zhì)殘留)不夠穩(wěn)定。蛋白質(zhì)的沉淀效率在 4C會更好一些。介質(zhì)純化方法，是一個越來越受到重視的方法。其最大特點(diǎn)是非常適合大規(guī)模核酸抽提，并且因?yàn)槭苋藶椴僮饕蛩赜绊懶。兌鹊姆€(wěn)定性很高(雖然純度不一定比PC純化方法更高)。其致命弱點(diǎn)是樣品過量。介質(zhì)可以分為兩大類，一類是柱式的，即介質(zhì)被預(yù)先裝填在下面是通的柱子里；另外一類則是顆粒狀(如Glassmilk、磁性小珠等)。顆粒狀的介質(zhì)的純化操作與經(jīng)典的醇沉淀

差別不大，都是通過數(shù)次的加液-倒液過程，干燥后，溶解即可獲得純化好的核酸。柱式純化的操作雖然也是有加液-倒液過程，但因?yàn)榧尤氲囊后w通過離心后會進(jìn)入另外一個離心管中，與含有核酸的柱子完全是分開的，所以洗滌更徹底，操作更省力(不用操心將核酸倒掉了，或者液體的殘留)。不過，介質(zhì)純化方法的成本是最高的。5：醇的沉淀 醇的沉淀，目的是使核酸從裂解體系中沉淀下來，從而實(shí)現(xiàn)核酸與其它雜質(zhì) – 主要是鹽 –的分離。實(shí)際操作中，許多雜質(zhì)也會與核酸一起被醇沉淀下來，尤其是當(dāng)其它雜質(zhì)的濃度也比較高的時候。醇的沉淀并不是非常特異性的，任何有機(jī)大分子及一些鹽，當(dāng)濃度達(dá)到一定水平后，都可能同步被沉淀下來。就核酸而言，標(biāo)準(zhǔn)的醇沉淀要求有一定的鹽及某一比例的醇用量，但這決不是說這些鹽是必不可少的或者醇的比例是不可更改的。實(shí)際操作中不難發(fā)現(xiàn)，當(dāng)裂解體系中核酸的濃度達(dá)到一定水平后，即使體系中不含教科書中建議的鹽，單獨(dú)使用醇也可以使核酸沉淀下來；或者含有鹽，使用低比例的醇也可以使核酸沉淀下來(當(dāng)然，得率可能會降低)。知道這一點(diǎn)的意義在于：不要迷信標(biāo)準(zhǔn)方法的唯一性；相反，當(dāng)使用標(biāo)準(zhǔn)方法碰到問題 – 主要是純度問題 –時，完全可以通過調(diào)整沉淀?xiàng)l件來改善。最有參考價值的是 TRIzol提供的一個沉淀方案：一半異丙醇加一半高鹽溶液替代純粹的異丙醇，可以大大降低多糖殘留。另外一個問題就是，要堅(jiān)信核酸的醇沉淀過程同樣也是其它雜質(zhì)的沉淀過程；調(diào)整醇沉淀的條件，雖然會降低核酸的得率，但因?yàn)榭梢源蟠筇岣呒兌?。如果核酸抽提的起始樣品是比較“臟”的，原則上不要使用低溫沉淀。低溫沉淀能提高沉淀效率：當(dāng)核酸濃度很低時，效果明顯；當(dāng)核酸濃度比較高時，效果不明顯，但卻會導(dǎo)致雜質(zhì)的大大增加。醇沉淀使用異丙醇還是乙醇，我沒有發(fā)現(xiàn)這二者對質(zhì)量有大的影響，雖然許多人“發(fā)現(xiàn)”乙醇沉淀的核酸純度更高。異丙醇沉淀的核酸比較緊湊，帖壁緊，顏色不是很白；乙醇沉淀的核酸比較蓬松，容易從壁上移動，顏色比較白。這是現(xiàn)象，提示結(jié)論：異丙醇沉淀的核酸不容易丟掉，但比較難洗滌。結(jié)合丟失和洗滌兩個方面綜合考慮，則建議：少量核酸用異丙醇沉淀(量少，洗滌不是問題，不丟失為先)，大量核酸用乙醇沉淀(量大，丟失不是問題，洗滌方便為先)。至于異丙醇沉淀更容易沉淀下鹽的說法，我沒有碰到過(我?guī)缀醪皇褂玫蜏爻恋?，難道低溫沉淀比較容易出現(xiàn)鹽沉淀？)；我更覺得出現(xiàn)該現(xiàn)象的原因就在洗滌的不徹底。當(dāng)然，也不要忘記異丙醇沉淀的最大優(yōu)點(diǎn)是體積小，可以使絕大部分的小量抽提操作在 1.5ml離心管內(nèi)完成。但由于其沉淀物很緊湊，洗滌時其中心部分不容易被洗滌到，所以，洗滌異丙醇沉淀的核酸的關(guān)鍵是：一定要使沉淀懸浮起來，一定要放置一段時間使沉淀最終變成蓬松的白色。如果再洗滌一次，質(zhì)量決不會有問題的。PEG、LiCl、CTAB 都可以用于核酸沉淀。雖然它們遠(yuǎn)沒有醇沉淀的高使用頻率，但卻各有特點(diǎn)。LiCl 可以沉淀 RNA 以去除 DNA，CTAB 可以從含多糖的裂解體系中將核酸沉淀下來。PEG 是沉淀病毒顆粒的方便手段。6：洗滌 洗滌首先一定要將沉淀懸浮起來；第二就是要有一定的時間，尤其是當(dāng)核酸沉淀比較大時(使核酸沉淀最終蓬松)；第三是少量多次；第四則是去上清要徹底。教科書中的操作基本上都是“倒掉上清后倒置在吸水紙上片刻”，這一描述本身沒有問題，且十分方便，但因?yàn)樗麃碜試?，自然就有了“水土不服”的問題。如果離心管是經(jīng)過硅化的，因?yàn)橐后w幾乎不掛壁，所以上清可以去除得非常徹底；好的管子，即使沒有經(jīng)過硅化，殘留量也非常少，也沒有什么問題；差的管子，液體的掛壁非?？捎^，其殘留量多到會影響后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。唯一不受管子質(zhì)量影響的操作，就是倒掉液體后再短暫離心，將殘液用移液器吸出。一定要牢記的是，殘液中都含有上一步操作中的雜質(zhì)，其殘留量與混勻程度、核酸沉淀的大小都有關(guān)。揮發(fā)時去掉的是乙醇，雜質(zhì)是不會被揮發(fā)去除的。另外，核酸沉淀的大小及裂解液的裂解能力也決定了洗滌的強(qiáng)度。沉淀越大，裂解液的裂解能力越強(qiáng)，洗滌越要徹底：放置時間相對要長一點(diǎn)，洗滌次數(shù)也要考慮增加。最關(guān)鍵的，洗滌一定要用室溫的 75% 乙醇。7：核酸的溶解和保存 純化后的核酸，最后多使用水或者低濃度緩沖液溶解；其中 RNA 以水為主，DNA 則多以弱堿性的 Tris 或者 TE 溶解。經(jīng)典的 DNA溶解方法多提倡使用 TE 溶解，認(rèn)為 EDTA 可以減少 DNA 被可能殘留下來的 DNase 降解的風(fēng)險；如果操作過程控制得當(dāng)，DNase的殘留幾乎是可以忽略的，完全可以直接使用 Tris 或者水(pH 接近7)溶解 DNA?；旧希怂嵩诒４嬷械姆€(wěn)定性，與溫度成反比，與濃度成正比。雖然也有部分實(shí)驗(yàn)人員發(fā)現(xiàn)，-20C 保存的 DNA 比-70C 保存的穩(wěn)定，我卻寧可認(rèn)為這是個例。如果溫度合適，保存中核酸發(fā)生降解或者消失，首要原因是酶殘留導(dǎo)致的酶解，第二個原因則是保存核酸溶液的 pH 值不合適

導(dǎo)致的水解(RNA在弱酸性更穩(wěn)定，而 DNA 在弱堿性更合適)。還有一個不為人重視的，就是 EP管對核酸的影響。首先一定要堅(jiān)信一點(diǎn)，那就是核酸一定會與裝它的容器的接觸面發(fā)生反應(yīng)，達(dá)到某種均衡。EP管的材質(zhì)，首先可能吸附核酸，其次還可以誘導(dǎo)核酸的結(jié)構(gòu)發(fā)生某些變化，如變性。在核酸的濃度比較高時，這個現(xiàn)象可能觀察不到；當(dāng)核酸濃度很低時，則比較明顯了。在低濃度的核酸中加入 Geletin,Glycogen,BSA 可以穩(wěn)定核酸，雖然已經(jīng)為實(shí)驗(yàn)所證明，但許多實(shí)驗(yàn)人員并沒有將該建議當(dāng)回事。現(xiàn)在制造 EP 管的材料遠(yuǎn)多于過去。這些新出現(xiàn)的材料，在強(qiáng)度、透明度等物理特征方面可能比原來的純 PP材質(zhì)要好許多，但其化學(xué)特征，尤其是對核酸穩(wěn)定性的可能影響，遠(yuǎn)沒有研究透徹。正如現(xiàn)在的質(zhì)?？梢愿脑斓迷絹碓竭m用某些要求一樣，其負(fù)面產(chǎn)物可能是，抽提的質(zhì)粒電泳的構(gòu)型越來越多：除了原來的三種帶型外，還可能出現(xiàn) denatured cc、multimeric forms of cc 等等帶型。8：核酸質(zhì)量的檢測問題 將抽提好的核酸直接用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)，是唯一可靠的檢測方法；除此之外的檢測方法，都是相對的，而且并不十分可信。目前用于正式實(shí)驗(yàn)前檢測核酸質(zhì)量的方法，一是電泳，二是紫外分光光度儀。電泳檢測的主要是核酸的完整性和大小，只要核酸不是太小或者太大(超出電泳分離范圍)，該方法還是非?？尚诺模浑娪具€可以用于估計核酸的濃度，但其準(zhǔn)確度與經(jīng)驗(yàn)有關(guān)；另外，電泳也可能提供某些雜質(zhì)污染的信息，但是同樣與經(jīng)驗(yàn)有關(guān)。紫外分光光度儀檢測的是純度和核酸含量，然而，由于紫外分光光度儀不能確保非常準(zhǔn)確，而該儀器的靈敏度又非常高，所以，提供的結(jié)果并不十分可信。一般講，同時進(jìn)行紫外和電泳檢測，綜合二者的結(jié)果，可以做出一個更合理的判斷。但由于這兩個方法都有缺陷，所以，即使出現(xiàn)壞的結(jié)果能用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)而好的結(jié)果卻不能用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，也不用大驚小怪。關(guān)于紫外分光光度儀的檢測。首先，不要使用不能選擇波長的儀器；使用那些已經(jīng)固定了波長的儀器，大概可以算是你夢魘的開始。(沒有信息是可怕的，更可怕的是將錯誤的信息當(dāng)真。)其次，一定要經(jīng)常調(diào)較儀器；調(diào)較可以使用非常純的自備核酸，也可以使用苯酚(后者是我目前每次都使用的方法，非常簡單；具體道理可以見我以前的帖。)最后，要記住讀數(shù) A230 : A260 : A280 = 1 : 2(DNA 為 1.8): 1為理論上的數(shù)據(jù)，實(shí)際測定時會有一些差別；但如果差別太大，就有問題了。有兩個值得商榷的觀點(diǎn)：如果 A260/A230 > 2就是純的，如果 A260/A280 > 2.3 就是核酸降解。A260/A230 如果比 2.0 大許多，一定是有雜質(zhì)殘留的(具體是什么雜質(zhì)我不知道)。如果核酸抽提好后立即就測定，A260/A280 > 2.3 決不提示核酸降解，原因是：那些能導(dǎo)致A260/A280 > 2.3 的核酸片段非常小，常規(guī)的沉淀是不可能將它們沉淀下來的；更可能的原因是：你儀器提供的 A260/A280實(shí)際是 A262/A282 甚至 A264/A284 的值。純的核酸的吸光值，在 A230 是谷底，在 A260 是峰頂，在 A280則正好是半山坡。根據(jù)曲線在底和頂?shù)男甭首钚?，在半山坡的斜率最大的特點(diǎn)，不難得出如下結(jié)論：A230 和 A260的讀數(shù)受儀器準(zhǔn)確性的影響比較小，而 A280 受儀器準(zhǔn)確性的影響比較大。建議先電泳檢測，再用紫外分光光度儀檢測。電泳后，可以看到哪些樣品根本就不能用(如降解太厲害)，以及核酸的大致濃度，這樣就為紫外分光光度儀的檢測提供了一個參考(降解的不必要測了，要測的該取多少量等)。9：問題解答 A 抽提過程中的現(xiàn)象及可能的原因 I：核酸不溶解或者難溶解 – 蛋白質(zhì)殘留(雖然目前更多的資料強(qiáng)調(diào)的是過分干燥所致。)。75%乙醇洗滌后，如果是空氣干燥，幾乎不可能過分干燥的，尤其是在南方潮濕的地方。佐證實(shí)驗(yàn)：撕取少量 Merck 的絲狀CT DNA到一個離心管中，加入無水乙醇；10 分鐘后徹底去除乙醇；待乙醇完全揮發(fā)后，加入 TE，10 分鐘后溶液就非常均勻而粘稠了。II：使用異丙醇沉淀核酸，沉淀為白色 – 多糖殘留。III：核酸溶解后為乳白色 – 多糖殘留。IV：75% 乙醇洗滌異丙醇沉淀的核酸時，沉淀變大了 – 見 10-III。B 紫外檢測 I：A260/A280 比值低 – 蛋白質(zhì)殘留。但如果操作過程中使用了苯酚，則更可能是苯酚殘留。II：A260 值提示的含量與電泳檢測時提示的含量有可見的誤差 – 苯酚殘留。C 電泳中的現(xiàn)象及可能的原因 I：加樣孔有熒光 – 首先一定有 DNA 的滯留；其次多含蛋白質(zhì)殘留；如果是比較特殊的樣品，其雜質(zhì)也可能導(dǎo)致熒光。蛋白質(zhì)幾乎不會被 EB染色，能出現(xiàn)熒光，則一定含有核酸。非常巨大的基因組DNA(>50kb)，如果使用普通的瓊脂糖電泳，往往不能電泳出孔，單獨(dú)就可能滯留在加樣孔中產(chǎn)生熒光。更多的時候，是比較大的 DNA與殘留的蛋白質(zhì)結(jié)合后，電泳不能出孔

而在孔中產(chǎn)生熒光。酶反應(yīng)產(chǎn)物，如果沒有經(jīng)過純化去除酶，也非常容易在孔中出現(xiàn)熒光，其原因是酶與核酸幾乎都有比較強(qiáng)的結(jié)合能力(基因組 DNA 的PCR產(chǎn)物電泳往往在孔中都有熒光，而且熒光強(qiáng)度與體系的特異性成反比。)。如果是植物樣品，還可能由其它雜質(zhì)殘留引起。我的經(jīng)驗(yàn)是：蛋白殘留的熒光有點(diǎn)發(fā)悶，其它雜質(zhì)殘留亮得很刺眼，且薄得銳利。II：總 RNA 非變性電泳顯示過多的條帶 – 根本就不是問題。III：總 RNA 非變性電泳顯示 28S 不如 18S 亮，但條帶清晰無彌散 – 多提示 28S 沒有被 EB 飽和。RNA 殘留多時，基因組 DNA 的電泳也會有相似現(xiàn)象。簡單的補(bǔ)染可以解決此問題。再次電泳時，或者降低上樣量，或者增加膠中 EB 的量。D 降解的現(xiàn)象、原因及對策 降解的現(xiàn)象，如果拋開問題電泳所致，可以簡單總結(jié)如下：主帶不再突出，向小片段方向發(fā)生彌散，亮度比較均衡地衰減。如果同時還伴隨下列的一個或者多個現(xiàn)象，則需要更進(jìn)一步的檢測：加樣孔非常的亮、彌散發(fā)生在主條帶位置的上下兩個方向、從加樣孔即開始發(fā)生彌散。以現(xiàn)在的裂解液的裂解能力而言，降解的發(fā)生主要是在徹底勻漿之前，只有極少量由不干凈的溶解液導(dǎo)致。以總 RNA 抽提為例，本站就有帖總結(jié)為：總RNA 的質(zhì)量由高到低依次為懸浮細(xì)胞、貼壁細(xì)胞、組織(此處的質(zhì)量不僅指純度，也指完整性才對)。徹底裂解懸浮細(xì)胞的時間最短，徹底裂解組織的時間最長，這就是降解多發(fā)生在徹底勻漿之前的一個佐證。再看一看新鮮樣品和冷凍保存樣品，非常嚴(yán)格的冷凍保存和勻漿操作的確可以確保冷凍樣品的核酸的質(zhì)量；但是，有許多實(shí)驗(yàn)室并不具備嚴(yán)格的保存手段，實(shí)驗(yàn)人員的操作也并非完美，其結(jié)果就是核酸的降解。RNA 抽提受的影響因素太多，就以基因組 DNA 的抽提為例看一看吧。假定消化使用的是含蛋白酶 K的溶液，無論你使用的是新鮮樣品還是冷凍保存樣品，如果混勻徹底，可以預(yù)期的降解為：細(xì)胞 – 不應(yīng)該降解，碾碎的組織 – 不應(yīng)該降解，大塊組織(包括鼠尾)–部分降解。如果電泳發(fā)現(xiàn)新鮮的細(xì)胞和碾碎的新鮮組織發(fā)生了降解現(xiàn)象，該現(xiàn)象是假象；如果電泳發(fā)現(xiàn)冷凍的細(xì)胞和碾碎的冷凍組織發(fā)生了降解現(xiàn)象，該現(xiàn)象不是假象，就是樣品在保存中已經(jīng)降解了。說得更極端一點(diǎn)，即使蛋白酶 K 失活了，消化試劑的裂解能力也足以保證細(xì)胞的基因組 DNA在抽提過程中間不被降解。減少或者杜絕核酸降解，一定要將重點(diǎn)放在樣品被徹底勻漿之前。樣品的保存在前面已經(jīng)說過了，不重復(fù)。其次就是要縮短樣品從脫離原來的生存環(huán)境或者低溫到被徹底勻漿之間的時間。E 后續(xù)酶反應(yīng)失敗 資料書中連篇累牘的原因我就不說了，因?yàn)槎紝?。我相信因?yàn)榇蠹沂紫认嘈诺木褪撬鼈?，所以碰到問題首先一定會從那些方面著手。如果三次實(shí)驗(yàn)后，問題還沒有解決，那么 90%的可能在于洗滌方式的不嚴(yán)格導(dǎo)致的小分子物的殘留。小分子物像刀，可以陸續(xù)“殺”死很多酶；大分子物如蛋白質(zhì)，像繩子，只能“捆住”一個目的核酸或者酶。更嚴(yán)格的洗滌可以解決該問題。F 蛋白質(zhì)是如何殘留的 PC 純化：a-取上清時取到中間層及下層；b-PC 用量不足；c-混勻不徹底；d-溶解于上清中的少量 PC 中含有的蛋白質(zhì)。高鹽沉淀：a-取上清時取到了蛋白沉淀；b-裂解不徹底；c-裂解液用量不足，使裂解體系太粘稠；d-溶解度問題(可以使用低溫沉淀加以改善)。介質(zhì)：a-裂解不徹底；b-裂解體系太粘稠。G 小分子物質(zhì)(苯酚、鹽)是如何殘留的 醇沉淀：洗滌不徹底。其原因與管子、操作手法等有關(guān)。介質(zhì)：顆粒狀介質(zhì)的原因與醇沉淀相同。柱式的幾乎都是柱子設(shè)計上的缺陷所致，極少數(shù)由操作者未嚴(yán)格按要求操作所致。10：某些我使用的操作手法 實(shí)驗(yàn)做多了，的確希望能偷點(diǎn)懶；偷懶也有講究，否則就是偷雞不成失把米。下面就是一些在確保抽提成功前提下的通用操作方法；有些看起來很麻煩，但請想一想抽提失敗后的再次抽提，應(yīng)該是可以算偷懶的方法了： I：混勻操作(1.5ml 離心管內(nèi))– 如果液體體積在 100ul 以內(nèi)，用指頭彈擊尖底混勻；在100-400ul 之間，用振蕩器混勻；大于400ul，用手晃動混勻：晃動時使離心管底永遠(yuǎn)處于斜上位置，頻率要快。II：PC 抽提時上清的移取 – 離心管傾斜，根據(jù)上清的量選擇不超過 200ul 的移液器，在外面先壓下移液器，再將 tip 移入上清。Tip 要盡可能靠近液面，tip 的尖嘴接觸內(nèi)壁，緩緩松手吸取上清?？啥啻我迫。珱Q不要使用 1ml 移液器。III：核酸的洗滌 – 核酸沉淀后離心，將上清倒掉。如果核酸是來源于雜質(zhì)比較多的樣品(如植物、動物肝臟、細(xì)菌等)，則在加入 75%乙醇之前，再將離心管短暫離心后，用移液器將殘留液體徹底吸出，否則，75% 的乙醇非常容易將殘留液體中的多糖等雜質(zhì)給沉淀下來。移取 75%乙醇使用一次性的塑料吸管，加入后將核酸徹底懸浮起來，置于室溫一段時間(時間長短取決于

沉淀大小)，期間多混勻幾次。如果去除 75%乙醇的操作是“離心后倒掉再短暫離心后吸出殘留液體”，則洗滌 2 次；如果去除 75% 乙醇的操作是“離心后倒掉”，則洗滌 3次，但最后一次仍然采用“離心后倒掉再短暫離心后吸出殘留液體”。這樣洗滌的目的，是確保小分子物的殘留低于 10 萬分之一(最大殘留不高于10uM 級)。11：一些特別的問題 a：EP 管的問題 幾乎沒有人會認(rèn)為 EP 管的質(zhì)量會與核酸抽提的操作有關(guān)，與某些現(xiàn)象(如核酸在-20C 保存一天后發(fā)生了降解)有關(guān)系，但事實(shí)是，EP 管的質(zhì)量的確與核酸抽提的質(zhì)量以及核酸保存時的穩(wěn)定性有關(guān)。硅化可以提供最高質(zhì)量的 EP 管，使某些奇怪的現(xiàn)象消失或者大大減輕。最糟糕的 EP 管對液體有較強(qiáng)的吸附力，在傾倒液體時殘留多，核酸在管中保存的過程中會發(fā)生變性。這樣的管子是很有市場的，因?yàn)楸阋?；而正因?yàn)楸阋耍洳牧峡偸遣涣钊朔判牡?。我個人認(rèn)為，只有硅化過的 EP 管，才可能按照標(biāo)準(zhǔn)操作獲得滿意的結(jié)果。否則，某些操作步驟必須調(diào)整，才可以獲得穩(wěn)定的質(zhì)量。b：核酸抽提中的溫度問題 核酸抽提中的溫度問題，也是一個值得關(guān)注的問題。首先要明確的一點(diǎn)是，任何一個溫度條件，對某些方面有利，同時也一定會有不利的一面。如沉淀，低溫操作會提高得率，但也會增加雜質(zhì)的殘留。任何一步操作該用什么溫度為好，應(yīng)該是利弊權(quán)衡的結(jié)果。基本上，除了一些特殊的步驟，如消化等外，用室溫是最好的選擇。那些認(rèn)為“低溫操作可以防止或者減少降解”之類的理由，并沒有多少可操作性的。低溫的確可以減低酶的活性，但低溫同時也降低了這些酶被裂解液中的試劑滅活或者抑制的速度，此消彼長，沒有辦法給出結(jié)論的。就 RNA 抽提而言，徹底勻漿前在冰上操作可以降低 RNA 被降低的風(fēng)險，徹底勻漿后的溫度對RNA 的完整性影響已經(jīng)不會大的；如果發(fā)現(xiàn)影響很大，說明 RNase沒有被裂解液有效抑制，提示裂解液的用量不足。更沒有道理的是認(rèn)為低溫沉淀和低溫洗滌可以防止降解了。事實(shí)上，核酸一旦被沉淀下來，對酶的耐受力是很強(qiáng)的，這就是核酸保存在醇溶液中最穩(wěn)定的理論基礎(chǔ)。如果說沉淀使用低溫還可以提高得率，洗滌使用低溫又是為什么？徹底的錯誤而已。c：如何閱讀操作手冊 拿到操作手冊后，要倒著閱讀：先閱讀問題解答，再看操作步驟下面的說明，再看操作步驟。問題解答是別人在使用過程中曾經(jīng)碰到過的問題集錦，操作步驟下面的說明是商家的警告。沒有一個商家會將他的操作步驟寫得非常復(fù)雜，因?yàn)檫@是滿足使用人員習(xí)慣的結(jié)果。一句話，PS 和 By the Way之類的話中含有真正的有用素材。12：延伸的思考 a：標(biāo)準(zhǔn)化的概念 所謂的標(biāo)準(zhǔn)化，指的是一套程序，確保不同的人能獲得質(zhì)量接近的產(chǎn)物的程序。標(biāo)準(zhǔn)化并不是以獲得最高質(zhì)量為目標(biāo)，而是以穩(wěn)定為目標(biāo)。標(biāo)準(zhǔn)化的核心是質(zhì)控。事實(shí)上，核酸抽提的每一步操作，都有一個核心；重要的是找到可觀察的指標(biāo)或者現(xiàn)象作為參考，從而確保實(shí)驗(yàn)的成功。如懸浮的核心是沒有塊狀物的存在，徹底消化的核心是沒有塊狀物的存在，PC 抽提的核心是混勻-兩相成為乳狀，取上清的核心是用小一點(diǎn)的移液器移取液體，吸取時 Tip的尖頭盡可能接近液面，吸取速度要慢，并且要留下 1mm以上的液體不要再吸。去上清的核心是先倒空，再短暫離心將殘留液體離到管低，用移液器徹底移出。洗滌的核心是徹底懸浮沉淀，并且要放置一段時間(時間長短與沉淀大小有關(guān))使沉淀內(nèi)部也能被洗滌到。按這樣的方法抽提的核酸，其質(zhì)量是非常穩(wěn)定的。柱離心式實(shí)際上就是非常標(biāo)準(zhǔn)化的核酸沉淀與洗滌的操作。一般而言，如果嚴(yán)格按照操作步驟去做了，柱式操作出問題，系統(tǒng)性的與試劑盒有關(guān)，偶然性的與操作有關(guān)。這一點(diǎn)，應(yīng)該是可以理解的。一個方法，其標(biāo)準(zhǔn)化程度越高，其穩(wěn)定性就越好。步驟越少，標(biāo)準(zhǔn)化就越容易。產(chǎn)品的開發(fā)也要以高標(biāo)準(zhǔn)化程度為目標(biāo)。b：QC 的概念 QC(質(zhì)控)概念遠(yuǎn)沒有 QT(質(zhì)檢)概念深入人心。最高境界的產(chǎn)品追求的是免檢，或者是Trouble-free。另外，現(xiàn)在的許多產(chǎn)品也是不允許 QT 的(因?yàn)槭且淮涡缘?，因此就只能靠 QC 來保證質(zhì)量了。QC是將精力集中在過程中：原料、操作等。只要嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)去做，最終的結(jié)果就有保證。事實(shí)上，很多實(shí)驗(yàn)人員是不做檢測而直接將抽提好的核酸用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的；他們之所以可以這么做，是因?yàn)樗麄冇幸鉄o意之中非常的注意 QC。也有不少人，尤其是新手，Pay no attention toQC，只知道最后的 QT。一旦發(fā)現(xiàn)問題，就去逆推原因；但因?yàn)檫^程中所出現(xiàn)的現(xiàn)象根本就沒有注意，幾乎不可能準(zhǔn)確找出真正的原因的。如果 QC做得好，最后的 QT 是否全部做/部分做/完全不做，取決于時間、經(jīng)驗(yàn)、后續(xù)實(shí)驗(yàn)的成本等因素。

c：其它 核酸抽提的每一步操作，都是利弊權(quán)衡的結(jié)果。消化要徹底，時間就會長；PC抽提時多取上清，得率會提高，但增加了蛋白質(zhì)污染的風(fēng)險；沉淀使用低溫且延長時間，得率會提高，但增加了雜質(zhì)污染的風(fēng)險 …不足詳列?？傊怂岢樘崾撬囆g(shù)，可以根據(jù)自己的樣品及當(dāng)時的情況，對操作步驟進(jìn)行適當(dāng)?shù)膬?yōu)化。d：實(shí)驗(yàn)的思維 核酸抽提的成功，就是每一步都沒有失敗。這不是玩文字游戲，而是告訴你做實(shí)驗(yàn)的良好思維。就如同小學(xué)基礎(chǔ)沒有打好，早晚會發(fā)現(xiàn)大問題一樣，做實(shí)驗(yàn)決不要以成功為喜悅，以失敗為痛苦。要保證實(shí)驗(yàn)成功，絕對不能有“這個操作應(yīng)該沒有問題”，“用這個可能不會有問題”之類的僥幸心理。去掉任何一個可能使實(shí)驗(yàn)失敗的因素，這才是實(shí)驗(yàn)該有的出發(fā)點(diǎn)。用這樣的出發(fā)點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)幾乎沒有不成功的，所以說，實(shí)驗(yàn)成功沒有什么快樂；實(shí)驗(yàn)的快樂來自于：發(fā)現(xiàn)自認(rèn)為不會導(dǎo)致失敗的某因素實(shí)際會導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)的失敗。學(xué)到了這樣的知識，才有快樂的理由。e：EB 在 NA 抽提中的運(yùn)用 EB 在 NA抽提中的應(yīng)用，用于電泳，人皆盡知；用于 gDNA 抽提時提高蛋白質(zhì)與 gDNA 的分離效率，卻似乎沒有人再考慮了，因?yàn)榇蠹叶寂率褂?EB。在NA 抽提中涉及到 EB 的另外一大類，就是膠回收操作了；EB 在膠回收中扮演的角色，就不完全是正面的。如果 NA 與 EB充分接觸，EB 就會以每隔數(shù)個堿基的頻率均勻地插入 NA 之中。EB的這種插入，無疑更可能破壞核酸雙鏈的穩(wěn)定性，使核酸由雙鏈變成單鏈的壓力增加。如果核酸比較短，而錯配又多(錯配的后果之一也是核酸容易由雙鏈變成單鏈)，EB 的插入將更容易導(dǎo)致變性的出現(xiàn)。這個觀點(diǎn)有如下的實(shí)驗(yàn)報告佐證：有相當(dāng)部分的 PCR產(chǎn)物膠回收實(shí)驗(yàn)，都報告說回收后的電泳結(jié)果是：目的條帶變淡或者消失，同時出現(xiàn)了一條小的原來不存在的條帶。壇中曾有文描述他做膠回收的程序：兩邊加 Marker，中間加產(chǎn)物；電泳過程不含 EB。電泳結(jié)束后，縱向割下 Marker 條帶用 EB染色后，放回膠原來的位置。開紫外，根據(jù) Marker的位置割下目的條帶，再回收。這是個笨辦法，但這樣使用的人一定是聰明人。如果這個辦法仍然不能消除變性，則只能使用高保真的酶了。f：蛋白質(zhì)殘留的影響問題(探討，沒有證據(jù))一直對蛋白質(zhì)殘留不抱好感，卻也沒有將它看成威力無比。本節(jié)考慮的是蛋白質(zhì)對酶反應(yīng)的影響問題，為方便表述，我將殘留的蛋白質(zhì)分成同源的(與核酸或者酶有同一或者相似的來源，如細(xì)菌)和異源的(與核酸或者酶沒有同一或者相似的來源)兩種。先看異源蛋白質(zhì)的影響：內(nèi)切酶幾乎都在保存液中添加有 500ug/ml 的 BSA，BSA 是改善 PCR 結(jié)果的一個選項(xiàng)，BSA是穩(wěn)定低濃度核酸的一個選項(xiàng)。幾乎都是正面的?？梢钥吹?，異源蛋白質(zhì)對酶反應(yīng)沒有抑制作用，甚至還有促進(jìn)作用(雖然都是以 BSA 為例)。再看同源蛋白質(zhì)的影響：AMBION 公司有一個非常有特點(diǎn)的產(chǎn)品 “Cells-to-cDNA Kit”。細(xì)胞裂解后不去除蛋白質(zhì)就直接用于RT-PCR。該例子應(yīng)該可以說明，與核酸同源的蛋白質(zhì)的殘留對 RT-PCR不一定有影響。另外一個例子是質(zhì)粒的酶切。質(zhì)粒酶切是比較容易出現(xiàn)一些靠 PC 純化一次就可以解決的問題的；因?yàn)?PC純化基本上就是去除蛋白質(zhì)，所以可以認(rèn)為質(zhì)粒抽提中殘留的蛋白質(zhì)對酶切是有巨大影響的。各位看官是否注意到這兩個例子的最大區(qū)別在什么地方？區(qū)別在于殘留的蛋白質(zhì)究竟是與核酸同源還是與蛋白質(zhì)同源。事實(shí)是，質(zhì)粒抽提中殘留的蛋白質(zhì)是宿主菌的(Ecoli或者其它)，與質(zhì)粒并不同源；而內(nèi)切酶卻是來自于 Ecoli 或者其表弟表妹的，與宿主菌的蛋白質(zhì)同源性是非常高才對。還有一個現(xiàn)象：EcoR I的 Star Activity 是最明顯的，其它來源于 Ecoli 的酶的該活性也不差，這是為什么？ 寫到這，我頭有點(diǎn)痛了，因?yàn)槲覜]有辦法證明；就是有人提供了證明，我暫時也看不到用途。畢竟，酶反應(yīng)不是受單一因素影響的。如果說該思考有什么現(xiàn)實(shí)意義，那就是：殘留蛋白質(zhì)的危害可能被夸大；許多實(shí)驗(yàn)在重復(fù)失敗，只是因?yàn)槟阕プ〉南右煞覆皇钦鎯?。更大膽的假設(shè)是：BSA 可以用于某些核酸抽提，以更徹底去除與酶同源的蛋白質(zhì)殘留。g：無介質(zhì)的核酸抽提裂解液(不含苯酚)的展望(供核酸抽提產(chǎn)品生產(chǎn)商及潛在的生產(chǎn)商參考)經(jīng)典的醇沉淀和洗滌，在無介質(zhì)核酸抽提技術(shù)中，幾乎是不可或缺的，盡管微調(diào)可以帶來一些意想不到的效果。能展望的，也只有裂解液了?，F(xiàn)在的裂解液，都沒有同步去除蛋白質(zhì)的功能；蛋白質(zhì)的去除，或者靠裂解后再加入苯酚抽提去除蛋白質(zhì)，或者靠加入高鹽溶液去除蛋白質(zhì)，效果也不錯。能做的改進(jìn)，看起來也就只有配制出這樣一種裂解液：裂解效率高(得率的保證)，同時蛋白質(zhì)可以靠離心去除(操作簡化了)。簡單地講，下面提供的是目前可以想象的結(jié)合有高得率、高純度、操作最簡單諸多特點(diǎn)的操作步驟(以細(xì)胞為例。組織搗碎后也適用)： 在樣品中加入裂解液，混勻后，靜置使裂解徹底。高速離心后，蛋白質(zhì)沉淀在離心管的底部，上清則為核酸。將上清轉(zhuǎn)移到預(yù)

先已經(jīng)加入了醇的離心管中，輕輕混勻后，用一個小鉤撈出大的絮狀沉淀(以DNA 為主)到另外一個離心管中；撈不起來的(主要是 RNA)用離心沉底。分別洗滌蛋白質(zhì)沉淀，DNA絮狀沉淀和 RNA 離心的沉淀，再分別溶解，就可以同步獲得 DNA/RNA/蛋白質(zhì)了。h：醇沉淀的語言 Flash – 從低濃度核酸沉淀?xiàng)l件的改變看核酸是如何形成沉淀的 核酸醇沉淀的原理，按照分子克隆中的描述，是用陽離子中和了磷酸根的負(fù)電荷后，核酸“無性”結(jié)合才能沉淀下來。低濃度核酸沉淀的條件一般要做如下改變：使用長時間的低溫、使用更高比例的醇、使用 tRNA 之類的東西。下面就用 Flash 語言的特點(diǎn)，描述一下“無性”的核酸是如何結(jié)合的。溶液中的單個核酸，雖然是“無性”的，對其它的核酸，仍然是有引力的(大小與距離相關(guān))；同時，核酸分子受到的另外一個力，來自分子運(yùn)動。在一般情況下，核酸之間的引力比分子運(yùn)動產(chǎn)生的力小許多；只有當(dāng)核酸之間的距離足夠近時，引力才能克服分子運(yùn)動產(chǎn)生的力，使兩個核酸結(jié)合到一起。結(jié)合在一起的兩個核酸又共同對其它的核酸產(chǎn)生引力(該引力比單個核酸的要大)，結(jié)合上更多的核酸 … 最終沉淀下來了。低溫和更高濃度的醇都有利于降低分子運(yùn)動產(chǎn)生的力，tRNA能提高總核酸濃度進(jìn)而通過與目的核酸的結(jié)合提高了目的核酸之間的引力，所以低濃度核酸的沉淀?xiàng)l件如上。至于 2價鎂離子有利于低濃度核酸的沉淀原因，可能是鎂離子要被同一核酸分子的兩個磷酸根結(jié)合，這種結(jié)合的結(jié)果是核酸分子變得更立體了（團(tuán)狀）：引力越集中，對外就越大。i：從柱離心式產(chǎn)品的流行看經(jīng)典方法的缺點(diǎn)（或者操作重點(diǎn)）柱式方法的風(fēng)行是無法否定的現(xiàn)實(shí)。下面通過柱式方法與經(jīng)典方法的比較，看一看如何注意經(jīng)典方法的操作重點(diǎn)。裂解，二者幾乎沒有任何區(qū)別。去蛋白質(zhì)，柱式靠的是柱材料對蛋白質(zhì)吸附力低這一特點(diǎn)，將蛋白質(zhì)殘留控制在比較低的水平(并不是/也不能徹底去除)；經(jīng)典方法最常用的是 PC 抽提，可以將蛋白質(zhì)去除得更徹底一些。其它大分子雜質(zhì)這三個特點(diǎn)決定了柱式的洗滌效率比經(jīng)典的洗滌效率高，所以，柱式純化的核酸純度比較高。結(jié)論是：裂解和去蛋白質(zhì)的能力，經(jīng)典方法不次于柱式方法；去除其它大分子雜質(zhì)，經(jīng)典方法不如柱式；洗滌能力，按目前各種參考書中的介紹去做，幾乎沒有辦法超過柱式方法。你看一看上面柱式方法洗滌的特點(diǎn)，經(jīng)典洗滌方法哪一條強(qiáng)調(diào)了。再想一想你是如何手工洗衣服的，象不象柱式洗滌的特點(diǎn)，就應(yīng)該不會有疑問的吧。難道過去的核酸沉淀洗滌方法有錯誤？那倒不是。真正的原因是，過去核酸抽提使用的小分子物(鹽等)，多是后續(xù)酶反應(yīng)中會使用到的或者起碼少量的殘留不會抑制后續(xù)酶反應(yīng)的；現(xiàn)在抽提中使用的東西就不一樣了，都是一些對蛋白質(zhì)有強(qiáng)烈作用的東西，而且濃度還非常高。過去有資料強(qiáng)調(diào)測 A230 值嗎？自打 Guanidine Thiocyanate 開始廣泛用于核酸抽提后，A260/A230比值的測定成為檢測質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的一個非常重要的指標(biāo)了。如果將洗滌操作更強(qiáng)化及嚴(yán)格一點(diǎn)，對于一般比較干凈的樣品，你會發(fā)現(xiàn)經(jīng)典方法抽提的核酸完全可以達(dá)到非常好的質(zhì)量的。柱式就還留下一個“快”的特點(diǎn)，當(dāng)然應(yīng)該說是“更快”。有一個無心插柳的結(jié)果供分享：加入醇沉淀基因組 DNA時，將沉淀挑到另外一個離心管中，挑不起來的離心使之沉淀；同樣洗滌/干燥/溶解后，同時電泳。電泳顯示：離心沉淀的加樣孔幾乎無熒光，20kb左右有一條亮帶；挑出來的加樣孔熒光非常強(qiáng)烈，從加樣孔到 20kb 之間有彌散帶，但沒有清晰的主帶。

第三篇：RNA抽提知識

RNA抽提

1：RNA抽提原理

簡單地講，RNA抽提包含樣品的裂解和純化兩大步驟。裂解是使樣品中的RNA游離在裂解體系中的過程，純化則是使RNA與裂解體系中的其它成分，如DNA、蛋白質(zhì)、鹽及其它雜質(zhì)徹底分離的過程。Trizol試劑的出現(xiàn)基本能解決絕大部分樣品RNA抽提，該方法已經(jīng)成為了 RNA 抽提的主流。

2：了解你的實(shí)驗(yàn)樣品

如果你研究某個實(shí)驗(yàn)樣品，并且要抽提它的RNA，以下的信息一定要先行收集：該樣品的RNA含量、酶含量、特殊雜質(zhì)含量。如果你對樣品的特點(diǎn)一無所知，當(dāng)樣品稍微有一點(diǎn)復(fù)雜時，抽提RNA的實(shí)驗(yàn)就會碰到許多問題。以血液為例，如果你不知道鳥的血液中有核細(xì)胞的含量是人血的千倍左右，而使用人血一樣的起始量去抽提鳥血的基因組 DNA，怎么可能成功？失敗了又怎么知道原因所在？同時，只有對實(shí)驗(yàn)樣品有所了解，才能正確選擇抽提方法。但同時提醒的是：沒有信息是可怕的，更可怕的是將錯誤的信息當(dāng)真的了。

3：實(shí)驗(yàn)樣品量的取用

樣品與Trizol的比例。這個問題非常重要，應(yīng)該獲得足夠的重視。Trizol的Protocol，提供了一個簡單的比例，1ml 裂解液可以用于 50-100mg 組織或5-10X106個細(xì)胞；我的建議是，樣品量絕對要小于資料所提供的。起始樣品用多大，并沒有具體的說法。如果不是樣品量有限，則以能抽提出滿足數(shù)次成功實(shí)驗(yàn)所需的RNA，作為決定樣品起始量的基礎(chǔ)，會比較合理的。不要因?yàn)?1ml 裂解液可以抽提 100mg 樣品，就一定使用 100mg 樣品。裂解液的用量，表面上與抽提的結(jié)果(純度及得率)沒有關(guān)系，然而，在實(shí)際操作中，對結(jié)果是有比較大的影響的。裂解液的用量原則是：確保能徹底裂解樣品，同時使裂解體系中核酸的濃度適中。濃度過低，將導(dǎo)致沉淀效率低，影響得率；濃度過高，去除雜質(zhì)的過程復(fù)雜且不徹底，導(dǎo)致純度下降。不同得樣品其RNA含量差別很大。高豐度(2-4ug/mg)的如肝臟，胰腺，心臟，中豐度(0.05-2ug/mg)的如腦，胚胎，腎臟，肺，胸腺，卵巢，低豐度(<0.05ug/mg)的如膀胱，骨，脂肪?？紤]后續(xù)實(shí)驗(yàn)，一般情況下，高豐度的樣品取用量大概是10-20mg/ml Trizol,中豐度樣品50mg/ml Trizol,低豐度樣品我們可以根據(jù)客戶提供的實(shí)驗(yàn)樣品量酌情取用。重申一下，不是越多越好，在考慮樣品在1ml Trizol里能充分裂解的同時，還得考慮大量的樣品可能也會帶來大量的雜質(zhì)！利用Trizol試劑抽提血清樣品時，Trizol /血清比值不要小于7/3。石蠟樣品由于RNA降解嚴(yán)重，含量大打折扣，所以取樣時應(yīng)該按低豐度樣品原則取用。

3：裂解方法

裂解的目的就是破壞細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，釋放出里面的RNA，使其溶解于裂解液中。絕大部分樣品的裂解，比如凍存的細(xì)胞，心、肝、脾、肺、腎等，利用Trizol試劑，普通的勻漿方法就可以達(dá)到滿意的效果！但是如果碰到比較特殊的樣品，我們可能要附加一些其他的輔助手段。1）骨骼。骨骼組織質(zhì)地堅(jiān)硬，普通的勻漿器根本無法使其破碎，以致RNA不能完全釋放溶解在TRIZOL試劑中，碰到這種類型的樣品，我們必須先利用液氮把樣品破碎成粉末狀，Trizol懸浮混勻再利用Minibeadbeater勻漿5分鐘。取上清, 2000g 4℃離心5min再取上清 去沉淀。2）細(xì)菌 Trizol雖然對細(xì)胞的裂解效果出眾，但是對細(xì)菌堅(jiān)韌的細(xì)胞壁還是無可奈何，這時我們可以利用超聲來輔助破壁。將細(xì)菌重懸于300ul的Trizol中，置于Bioruptor冰水浴中，M 檔 30s “on”、30“off”超聲處理1—2 min.取出用Trizol將體積補(bǔ)至1ml。3)酵母 酵母細(xì)胞跟細(xì)菌一樣，還是因?yàn)榧?xì)胞壁的原因，不能充分裂解。Zymolyase在37℃ 40分鐘可以很好的消化掉酵母細(xì)胞壁，這里需要提醒的是消化緩沖液不能有外源性RNA酶污染，最好附加使用RNA酶抑制劑，做好了這點(diǎn)就不用擔(dān)心這步有RNA降解的問題。4）石蠟包埋樣品 石蠟包埋的組織樣品在加Trizol裂解前必須先脫蠟，脫蠟的效果直接影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)，所以我們?yōu)槭姑撓灣浞?，選用高溫脫蠟與二甲苯脫蠟相結(jié)合的兩步脫蠟法。脫蠟后加入Trizol勻漿。5）脂肪 脂肪組織可以直接用Trizol 勻漿，這里需要提醒的是脂肪組織勻漿后，需室溫靜置5min，再室溫7500g 離心5分鐘，去除上面的脂肪層再繼續(xù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)！

4：分相

Trizol里含有的物質(zhì)之一“酚”去除蛋白質(zhì)是有一定的飽和度的。超過了該飽和度，裂解體系中的蛋白質(zhì)不會被一次去除，裂解勻漿后的樣品，按1ml Trizol 加200ul 的氯仿，震蕩離心，絕大部分樣品在這一步是不需要用特殊方法對待的，但對于蛋白含量比較高的組織樣品必須要二次抽提，甚至多次抽提方可徹底去除。這里要著重提到的是血清樣品！離心分相后，取上清這一步是分相實(shí)驗(yàn)的操作難點(diǎn)，一定要謹(jǐn)慎，萬不可混入有機(jī)相污染，原則是寧缺勿濫！

5:異丙醇的沉淀

異丙醇的沉淀，目的是使RNA從裂解體系中沉淀下來，從而實(shí)現(xiàn)RNA與其它雜質(zhì) – 主要是鹽 – 的分離。實(shí)際操作中，有的雜質(zhì)也會與RNA一起被醇沉淀下來，尤其是當(dāng)其它雜質(zhì)的濃度也比較高的時候。異丙醇的沉淀并不是非常特異性的，有機(jī)大分子及一些鹽，當(dāng)濃度達(dá)到一定水平后，都可能同步被沉淀下來。在不影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)的情況下，我們是可以忽略這些鹽污染。有些實(shí)驗(yàn)樣品，由于前期用藥物或某種方法處理過，導(dǎo)致會殘留有一些特殊的雜質(zhì)，之所以殘留，往往是因?yàn)檫@些雜質(zhì)與RNA有一些相似性：你沉淀我沉淀，你吸附我吸附。這些特點(diǎn)決定了它們往往是非常強(qiáng)的酶抑制劑，對后續(xù)實(shí)驗(yàn)影響非常大。這里介紹有幾種方法除去這些雜質(zhì)：1）TRIzol 提供的一個沉淀方案：一半異丙醇加一半高鹽溶液替代純粹的異丙醇，可以大大降低多糖殘留。2）介質(zhì)純化：遇到一些與RNA共同沉淀下來且影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)的一些雜質(zhì)，可以利用BioMag公司提供的連有 Oligo dT的磁珠純化出總RNA中的mRNA，這個方法優(yōu)點(diǎn)是基本能解決絕大多數(shù)有雜質(zhì)污染的總RNA（目前沒有遇到這種方法處理不了的），缺點(diǎn)是成本比較高。對與RNA含量少的樣品，直接異丙醇沉淀得率會很低，而且基本看不見沉淀物，這也會給后續(xù)的操作帶來很大的麻煩，進(jìn)一步損失RNA。遇到這種情況我們可以使用一種媒介(Golycogen)跟RNA共同沉淀下來，這種媒介物質(zhì)既能很好的跟RNA共同沉淀下來，又不會影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)。不要迷信試劑說明書里的標(biāo)準(zhǔn)方法；有時，使用標(biāo)準(zhǔn)方法碰到問題在標(biāo)準(zhǔn)方法中是找不到答案的，要具體問題具體分析。

6：洗滌

洗滌注意四點(diǎn)：首先一定要將沉淀懸浮起來；第二就是要有一定的時間，尤其是當(dāng)RNA沉淀比較大時 ；第三是少量多次；第四則是去上清要徹底。在異丙醇沉淀后，絕大多數(shù)時是能看見管底的白色沉淀，但還是有時候是看不見的，即使是加過Golycogen的。遇到這種情況不要慌，沒看見不等于沒有，遇到這種情況可以先用移液器小心的吸去上清，注意槍頭不要碰到管壁。加入75%乙醇，上下顛倒幾次，短暫離心后用移液器吸去上清，同時仔細(xì)觀察管壁是否有掛液。如果有，那沒問題，可以確定沉淀都附在管壁上了。

7：RNA的溶解和保存

純化后的RNA溶解以水為主，用無Rnase酶的水溶解的RNA基本上還算穩(wěn)定，其穩(wěn)定與溫度成反比，與濃度成正比。所以抽提好的RNA應(yīng)盡快保存在-70℃，避免反復(fù)凍融，同時注意不要把濃度稀釋的太低，大概保持在1000ng/ul。如果溫度合適，保存中RNA發(fā)生降解或者消失，其原因應(yīng)該是酶殘留導(dǎo)致的酶解。

8：RNA質(zhì)量的檢測問題

將抽提好的RNA直接用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)，是唯一可靠的檢測方法；除此之外的檢測方法，都是相對的，不可全信。目前實(shí)驗(yàn)室用于正式實(shí)驗(yàn)前檢測RNA質(zhì)量的方法，一是電泳，二是NANO-Drop。電泳檢測的主要是RNA的完整性和大小，該方法還是比較可信的；同時電泳還可以用于估計核酸的濃度，其準(zhǔn)確度與經(jīng)驗(yàn)有關(guān)；另外，電泳也可能提供某些雜質(zhì)污染的信息，但是同樣與經(jīng)驗(yàn)有關(guān)。NANO-Drop檢測的是純度和核酸含量。然而，由于NANO-Drop不能確保非常準(zhǔn)確，所以，提供的結(jié)果并不十分可信。一般講，同時進(jìn)行NANO-Drop檢測和電泳檢測，綜合二者的結(jié)果，可以做出一個更合理的判斷。但由于這兩個方法都有缺陷，所以，即使出現(xiàn)壞的結(jié)果能用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)而好的結(jié)果卻不能用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，也不用大驚小怪。（A260/A280 比值低 – 蛋白質(zhì)殘留但更可能是苯酚殘留。A260 值提示的含量與電泳檢測時提示的含量有可見的誤差可初步判斷是苯酚殘留。）

第四篇：小鼠基因組DNA抽提原理、儀器試劑和操作步驟

小鼠基因組DNA抽提原理、儀器試劑和操作步驟

一、原理與意義

先用細(xì)胞裂解液對已制備好的組織勻漿充分裂解，然后用蛋白酶去除其中的蛋白，再用氯仿一次抽提（無需用酚抽提）、預(yù)備液沉淀、RNase去除 RNA、乙醇再沉淀即可得到完整DNA。該方法適用于從人或動物的各種組織、血液、培養(yǎng)細(xì)胞、G+/G-細(xì)菌中快速抽提基因組DNA。抽提出來的DNA能用于幾乎所有的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，如DNA梯度分析、PCR、限制性內(nèi)切酶反應(yīng)、克隆、Southern Blot分析等。

二、試劑及其配制

抽提試劑盒購于上海生工公司，內(nèi)含以下試劑：

1、TE緩沖液：PH8.0，由10 mM Tris HCl和1 mM EDTA配成。

2、RNase A（3 mg）：使用前加入300 ul無菌雙蒸水，煮沸10 min后使其自然冷卻后使用，-20 ℃凍存。

3、Proteinase K（12 mg）：使用前加入600 ul無菌水，分裝成小份，-20 ℃凍存。

4、Cell Lysis Solution與Precipitation Solution：溶液出現(xiàn)絮狀沉淀50 ℃加熱溶解后使用。5、1.2 mol/L NaCl。冰冷乙醇和氯仿自備。

三、實(shí)驗(yàn)器材

水浴鍋、普通冰箱、1.5/2 ml離心管、移液器及槍頭、紫外分光計、離心管架、剪刀、鑷子、濾紙等。

四、操作步驟

1、組織勻漿制備：取30 mg左右新鮮組織，加600 ul TE緩沖液，手工勻漿數(shù)次。

2、細(xì)胞裂解：吸取300 ul勻漿加600 ul Cell Lysis Solution，混勻。

3、消化蛋白：再加入9 ul Proteinase K（可適當(dāng)增加）混勻，置于55 ℃水浴30 min以上（可達(dá)2.5 h），其間上下混勻幾次。

4、氯仿抽提：加入600 ul氯仿（用戶自備），輕柔上下混勻，不能太劇烈，以保證DNA的完整性。

5、沉淀：在臺式離心機(jī)上，10000轉(zhuǎn)/分，室溫離心2 min。此時應(yīng)分成三層，基因組DNA在上層中，如未能分層，表明樣品與氯仿未混勻（可通過延長離心時間或增加離心速度獲得上清）。取500 ul上清液，置于無菌1.5 ml離心管中，加入500 ul Precipitation Solution，混勻多次至出現(xiàn)絮狀物，室溫靜置2 min。10000轉(zhuǎn)/分，離心2 min。

6、去除RNA：棄除上清，注意不要倒掉沉淀，立即加入100 ul 1.2 mol/L NaCl，輕輕振蕩直至DNA樣品完全溶解，加入3 ul RNase A，置于37 ℃ 10 min，以去除RNA。

7、沉淀DNA：加入300 ul冰冷乙醇（終濃度為75%，沉淀效果最佳），-20 ℃放置10 min。10，000轉(zhuǎn)/分，離心2 min。倒掉乙醇，倒置室溫干燥10~15 min。若DNA量多，可再重復(fù)沉淀一次。DNA用TE緩沖液或100 ul三蒸水溶解。

五、注意事項(xiàng)

1、應(yīng)避免多次凍融樣品，因?yàn)槊看蝺鋈诙即蟠蠼档屯暾鸇NA的產(chǎn)率。

2、加氯仿充分混勻，若離心后上清不到500 ul，可適當(dāng)延長離心時間或增加離心速度。

3、吸取DNA上清時，可用剪刀稍剪槍頭尖部，以防止虹吸現(xiàn)象。

4、操作步驟中許多數(shù)值可進(jìn)行成比例改變，如上清與預(yù)備液按1：1，氯化鈉與無水乙醇按1：3等。

5、轉(zhuǎn)錄活性很高的組織或細(xì)菌中通常含有大量的RNA，他們可能與DNA一起被分離出來。RNA的存在并不影響PCR反應(yīng)。如果需要制備RNA-free的基因組DNA?？稍诘?步加入200 ul的RNase A，37 ℃保溫10 min即可。

6、用分光光度計測量DNA含量按1 OD260=50 mg基因組DNA；進(jìn)行0.7%瓊脂糖凝膠電泳判定DNA的完整性，也可以判定樣品中是否有RNA。本試劑盒可抽提長抵達(dá)50kb以上的DNA。一般在 DNA樣品，OD260/OD280比值大于1.8，可能存在RNA；OD260/OD280比值小于1.6，可能存在蛋白質(zhì)或酚。但RNA樣品中 OD260/OD280比值小于2可能存在蛋白質(zhì)或酚，均需要進(jìn)一步純化。

7、通常50ul體系PCR反應(yīng)中用1~5 ul DNA。

第五篇：酵母抽提物生產(chǎn)流程

酵母提取物

前處理和自溶：

廢酵母→清水洗滌→過濾→酵母泥→加水調(diào)至含干酵母10％～15％→調(diào)pH至4．5→夾層熱保溫45℃～55℃→自溶24小時。

自溶期間每隔1小時開動攪拌2～5分鐘，攪拌有利于酶類和酵母內(nèi)大分子物質(zhì)充分接觸，提高單位接觸面底物的濃度，從而加快細(xì)胞內(nèi)酶的反應(yīng)速度。

為了加速細(xì)胞的自溶，還可添加2％～3％的氯化鈉，其對提高抽提物得率和上清液氨基氮含量有一定促進(jìn)作用。

酶解：

自溶結(jié)束后，在自溶酵母液中加入0.2％復(fù)合酶，調(diào)整物料pH為7．0，在50℃條件下酶解24小時。酶解結(jié)束后，經(jīng)納米對撞機(jī)在150MP～200MP下進(jìn)行破碎。其作用原理是：物料形成150MP以上的高壓射流，經(jīng)分流裝置被分成兩股，然后，兩股高壓射流體在一個腔體內(nèi)發(fā)生對撞，產(chǎn)生瞬時高壓使振蕩片振蕩，形成頻率高達(dá)20000赫茲以上的超聲波，酵母細(xì)胞在對撞和超聲波的強(qiáng)大壓力的共同作用下發(fā)生納米級破碎。經(jīng)納米對撞機(jī)處理后，用顯微鏡檢測，混合物料中大多數(shù)為空腔細(xì)胞和大量碎片，酵母細(xì)胞壁的破碎率可達(dá)97．9％，抽提物得率為91．8％。破碎液經(jīng)進(jìn)一步純化、濃縮后可制得淡黃色的膠木抽提物制品。

采用上述方法制得的酵母抽提物，肌苷酸（I）含量為1．27g／100g，鳥苷酸（G）含量為1．498g／100g牞（I＋G）為2．76g／100g。與日本日研公司同類產(chǎn)品相比，指標(biāo)分別提高294．4％、626．82％、413．96％。具體工藝：廢酵母預(yù)處理【120目過篩→脫苦→調(diào)整母液濃度(10%~15%)→加促進(jìn)劑（2%Nacl）→自溶（溫度50℃，pH5.2～6.0，24h）】→酶解（0.2%,pH7.0，50℃，24h）→納米對撞機(jī)破碎（150MP～200MP，循環(huán)2～4次）→加麥芽根酶解酶（70℃，3～4h）→加熱滅酶（95℃，10分鐘）→離心分離→酵母上清液濃縮→酵母抽提物產(chǎn)品。

以上所述啤酒酵母抽提物的提取技術(shù)，其關(guān)鍵點(diǎn)是將傳統(tǒng)的自溶、酶解方法與先進(jìn)的納米破碎技術(shù)相結(jié)合，利用高壓撞擊作用破碎酵母細(xì)胞壁，從而使其內(nèi)容物最大限度溶出，提高制品中氨基酸含量。