第一篇：藥用植物內(nèi)生放線菌的分離和生物學特性

藥用植物內(nèi)生放線菌的分離和生物學特性

摘要:【目的】探索藥用植物內(nèi)生環(huán)境可培養(yǎng)放線菌的分離、培養(yǎng)方法，總結藥用植物內(nèi)生放線菌的生物學特

性，探討其物種多樣性，挖掘新的微生物資源?！痉椒ā坎捎?10 種分離培養(yǎng)基對 37 個新鮮的藥用植物樣品

進行內(nèi)生放線菌的分離;通過比較，選擇適合植物內(nèi)生放線菌生長的培養(yǎng)條件;根據(jù)菌落形態(tài)和細胞特征觀 察結果，選擇其中 174 株菌測定 16S rRNA 基因序列，分析藥用植物內(nèi)生放線菌的多樣性;應用 Biolog GEN III 微孔培養(yǎng)、API 50CH 以及 API ZYM 試劑條測試 27 株代表菌株的生理生 化特性?！窘Y 果】分 離 得到 940 株植物內(nèi)生菌，分屬于 47 個屬，30 個科，其中放線菌 600 余株，分屬于 34 個屬，共發(fā)現(xiàn)潛在的新分類單元有 個;本研究中藥用植物內(nèi)生放線菌的培養(yǎng)條件是:PYG 培養(yǎng)基、pH7.2、28℃ － 32℃;菌株間的生物學特性的

差異與菌株系統(tǒng)進化關系呈正相關關系;不同環(huán)境植物的內(nèi)生菌菌株的生物學特性差異較大，相同環(huán)境的不

同植物內(nèi)生菌的生物學特性差異較小。【結論】藥用植物內(nèi)生放線菌物種豐富多樣;藥用植物內(nèi)生放線菌在 唯一碳源利用、發(fā)酵碳源產(chǎn)酸及酶學活性等生理生化特性方面沒有表現(xiàn)出和宿主植物的直接相關性，而是呈

現(xiàn)出和宿主植物的地理分布有一定的相關性。

關鍵詞:藥用植物，內(nèi)生放線菌，生物學特性，多樣性

中圖分類號:Q939 文獻標識碼:A 文章編號:0001-6209(2013)01-0015-09 藥用植物有著獨特的藥理活性，特別是在治療

一些疑難病癥上有著不可替代的作用。如茵陳主治

黃疸型肝炎、肝硬化、肝腹水等肝病;狼毒主治結核、氣喘等，還具有抗腫瘤的作用。藥用植物的有效成

分的提取和研究一直是國內(nèi)的熱門課題。1993 年，美國蒙大拿州立大學的 Stierle 研究小組首次從短葉

紫杉(Taxus breviforlia)中分離得到一株能合成抗癌

物 質(zhì) 紫 杉 醇 的 內(nèi) 生 真 菌 新 種 安 德 氏 紫 杉 霉 菌(Taxomyces andreanae)［1］，并證明內(nèi)生菌具有合成

與宿主植物相同或相似的活性成分的功能。由此掀

起了對藥用植物內(nèi)生菌研究的熱潮?！段⑸飳W通

報》編輯部的郝榮喬于 2009 年初對 2008 年的年度 點評中報道“植物內(nèi)生菌成為我國當前微生物研究

領域的熱點” ［2］

。的確，藥用植物內(nèi)生菌的研究和 有效開發(fā)對藥用植物資源、特別是瀕危植物資源的

保護具有重要的意義。

本研究選取采集自北京、貴州、云南和西藏等地 的藥用植物樣品 37 份，經(jīng)過表面消毒處理后，應用

放線菌分離培養(yǎng)技術從中分離放線菌菌株;根據(jù)菌

株的 16S rRNA 基因序列信息以及系統(tǒng)進化關系，探討藥用植物內(nèi)生放線菌的物種多樣性;通過生理

生化實驗測定，揭示藥用植物內(nèi)生放線菌的生物學 杜慧竟等: 藥用植物內(nèi)生放線菌的分離和生物學特性． /微生物學報(2013)53(1)ordination analysis，NTSYSpc v． 2.02)進行分析，構

建表型數(shù)值分類聚類圖，分析實驗菌株的生物學特 性。2 結果

2.1 菌種分離結果

從 37 份藥用植物中共分離、純化得到 940 株純

培養(yǎng)物(表 1)。從云南、貴州和西藏來源的植物樣

品中分離得到的放線菌的比例稍高于北京的植物樣

品;來源于植物根、莖、葉的菌株數(shù)量基本相當，沒有

明顯差異;和其它 9 種分離培養(yǎng)基相比較，丙酸鈉分

離培養(yǎng)基(M7)分離得到的放線菌數(shù)量占顯著優(yōu)勢。

表 1 藥用植物內(nèi)生菌分離結果統(tǒng)計

Table 1 The strains isolated from the medicinal plants Plant number Number of isolates Plant number Number of isolates Plant number Number of isolates Plant number Number of isolates P1 34 P11 6 P20 10 P29 64 P2 40 P12 18 P21 15 P30 2 P3 46 P13 10 P22 4 P31 8 P4 43 P14 1 P23 3 P32 44 P5 17 P15 8 P24 77 P33 45 P6 44 P16 15 P25 12 P34 31 P7 8 P17 14 P26 73 P35 34 P8 4 P18 1 P27 98 P36 12 P9 6 P19 12 P28 59 P37 3 P10 19

通過菌落形態(tài)以及菌株細胞顯微形態(tài)的初步觀

察結果以及菌株來源，選擇 174 株代表菌株進行

16S rRNA 基 因 序 列 測 定 和 比 對，結 果 顯 示，174 株

分離菌株隸屬于 30 個科、47 個屬，其中的放線菌 139 株，分屬于 34 個屬(圖 1)。以菌株的16S rRNA

基因序列與 NCBI 數(shù)據(jù)庫中有效描述菌種相似性 ＜

98.2% 作 為 操 作 分 類 單 元(taxanomic operational

units，OTU)的劃分 界 限 ［12 － 13］，其中有 22 株菌代表

了 7 個新的操作分類單元。

2.2 藥用植物內(nèi)生菌的生物學特性

為了比較研究藥用植物內(nèi)生放線菌的生物學特

性，選擇了 27 株分離菌株進行了生長溫度、pH 值、唯一碳源利用、利用碳源產(chǎn)酸以及酶學特性測試，其

中包含了 2 株藥用植物內(nèi)生細菌。來源于韓國菌種

保藏中心的 3 個典型培養(yǎng)物 KCTC 19272 T、KCTC 19469 T

和 KCTC 19037 T

(分離自不同土壤環(huán)境)同時 做了平行對照實驗(表 2)。起初，分離菌株在對應的原始分離培養(yǎng)基和繼

代培養(yǎng)基 PYG 上生長良好，但是隨著傳代次數(shù)的增

加，部分內(nèi)生菌生長變?nèi)?，甚至無法繼續(xù)傳代，而 3 株來源于土壤樣品的對照菌的生長狀態(tài)則幾乎不受

傳代次數(shù)的影響。內(nèi)生菌菌株的溫度生長范圍是

10℃ － 37℃，在 28℃ － 32℃ 生長 較 好;多 數(shù) 菌 株 在

pH 6.0 － 10 范圍 內(nèi) 都 能 生長，在 pH 中 性 至 弱 堿 性 條件下生長最佳。

本實驗中 27 株植物內(nèi)生菌對碳源的利用呈現(xiàn)

以下趨勢:菌株對二糖和多糖類的利用率最高，接下

來依次是單糖，脂類，氨基酸及衍生物。27 株植物

內(nèi)生菌中，50% 以上的菌株都能利用以下底物作為

唯一碳源和能量來源:亞碲酸鉀，丁酸鈉，甘露醇，纖

維二糖，葡萄糖，麥芽糖，松二糖，甘油，果糖，海藻

糖，蔗糖，水 楊 苷，甘 露 糖 和 醋 酸。在 菌 株 I10A-01402 的分類學研究 時，用 來 源于 土壤 環(huán)境 的近源

菌 N． koreensis 19272 T，N． ginsengisegetis KCTC 19469 T，N． alkalitolerans KCTC 19037 T 作為參比進行

了 Biolog Gen Ⅲ 唯 一 碳 源，API 50CH 產(chǎn) 酸 和 API ZYM 酶學特性測定和比較分析。植物內(nèi) 生 菌 I10A-

01402 以及其 它 26 株 內(nèi) 生 菌 都 能 夠利用 Biolog 微

孔板中葡聚糖和 D-麥芽糖，但是，來源于土壤環(huán)境 的 N． koreensis 19272 T，N． ginsengisegetis KCTC 19469 T

和 N． alkalitolerans KCTC 19037 T

等 3 株類諾

卡氏菌屬的菌株都不能利用這兩種糖;I10A-01402

不能利用 N-乙酰類化合物，其它 26 株內(nèi)生菌也都

不能或很少利用此類化合物，而這 3 株土壤來源的

菌株則全部能利用 N-乙酰類化合物作為唯一碳源

和能量來源。27 株藥用植物內(nèi)生菌和 3 株土壤來

源的參比菌株同化 API 50 CH 中的碳源并產(chǎn)酸的情

況以及酶學特性上也表現(xiàn)出較大的差異。本實驗中 株藥用植物內(nèi)生細菌和 28 株 放線菌 相 比較，細菌

能夠更多地利用 Biolog GenⅢ中列舉的唯一碳源，并且同化 API 50 CH 中單個碳源并產(chǎn)酸實驗的陽性 率也高一些，但在 API ZYM 酶學特性測試結果中沒 有明顯差異。

16S rRNA 基因 序 列 相 似 性 越 高 的 菌 株 的部 分

生理生化特性也趨于相近。例如，草藥菌屬菌株

(Herbiconiux sp．)I10A-01569、草 藥 菌 屬 菌 株

(Herbiconiux sp．)I10A-02268、草 藥 菌 屬 菌 株(Herbiconiux sp．)I10A-02292、寒 冷 桿 菌 屬 菌 株 171 材料和方法 1.1 材料

1.1.1 植物樣品:玉竹、黃精、知母、蒙古黃芪、肥皂

草、藿香、薄荷、金銀花、仙鶴草、櫻桃、大葉玉竹、白

芷、紫蘇、噴瓜、金銀木(橘色果實)、紅色果實金銀

木、虎杖、薯蕷和穿龍薯蕷等 19 份植物樣品采集自

北京(編號 P1 － P19)，大狼毒、狼毒大戟、瑞香狼毒、橙黃瑞香、藏茵陳和云南重樓等 6 份采自云南(P22 － P27)，貴 州重 樓 和 三 七 采 自 貴 州(P28，P29)，綿

頭雪蓮(P20)、包葉雪蓮(P21)以及其余 8 份(P30 － P37)等共 10 份采自西藏。共計 37 份藥用植物樣 品。

1.1.2 培養(yǎng)基:(1)內(nèi)生菌分離培養(yǎng)基: 使用了 10 種分離培養(yǎng)基(M1 － M10)，其中 M1 － M8 培養(yǎng)基是

本實驗室在紅樹植物內(nèi)生放線菌研究中使用的 8 種

內(nèi)生放線菌分離培養(yǎng)基 ［3］，M9 和 M10 的組成如下: M9(g / L): 檸檬酸 0.12，檸檬 酸 鐵 銨 0.12，硝

酸鈉 1.5，磷 酸 氫 二 鉀 0.4，硫 酸 鎂 0.1g，碳 酸 鈣

0.05，碳酸鈉 0.2，瓊脂 12，pH 7.2。M10(g / L): 甘露聚糖 2.0，酪素水解物 0.3，硝

酸鉀 0.1，海洋微量鹽 微量，復合維生素 微量，瓊

脂 12，pH 7.2。

(2)菌種純化和繼代培養(yǎng)培養(yǎng)基(g/L): 蛋白 胨 3，酵母浸膏粉 5，甘油 10，甜菜堿 1.25，丙酮酸 鈉 1.25，復合維生素 微量，瓊脂 12，pH 7.2。

1.1.3 抑制劑:抑制真菌和革蘭氏陰性細菌的抑制

劑的種類和劑量參見文獻［3］。

1.1.4 菌 株: 參 比 菌 株 人 參 地 類 諾 卡 氏 菌

(Nocardioides ginsengisegetis)KCTC 19469 T，韓國類

諾卡氏菌(Nocardioides koreensis)KCTC 19272 T 和 耐

堿類 諾 卡 氏 菌(Nocardioides alkalitolerans)KCTC 19037 T

來源于韓國典型培養(yǎng)物保藏中心(KCTC);其它實驗菌均為本研究的分離菌株。

1.1.5 主要試劑:硫 代 硫 酸 鈉、次 氯 酸 鈉、碳 酸 鈉、萘啶酮酸、制霉菌素、重鉻酸鉀等化學試劑均為國產(chǎn)

分析純試劑;PCR 擴增相關試劑和引物測序均來源

于生工生物工程(北京)，Biolog GEN III 微孔板和基

礎培養(yǎng)液購于美國 BIOLOG 中國代理，API 50CH 和

ZYM 試劑條及相關試劑購于生物梅里埃公司。

1.2 菌種分離和保藏 具體方法參見文獻［3］。

1.3 菌種初步鑒定和多樣性分析 菌種初步鑒定參照徐麗華等主編的《放線菌系 統(tǒng)學》 ［4］

相關方法操作。根據(jù)菌落和菌絲形態(tài)初步 觀察排除重復菌株，選擇代表 性菌 株測 定 其 16S

rRNA 基 因 序 列，并 將 結 果 提 交 EzTaxon 網(wǎng) 站

(http:/ /004km.cnparative studies of nucleotide sequences． Journal of Molecular Evolution，1980，16: 111-120．

［8］ Kimura M． The Neutral Theory of Molecular Evolution．

Cambridge: Cambridge University Press，1983． ［9］ Saitou N，Nei M． The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees． Molecular Biology and Evolution，1987，4: 406-425． ［10］ Tamura K，Dudley J，Nei M，Kumar S． MEGA4: Molecular evolutionary genetics analysis(MEGA)software version 4.0． Molecular Biology and Evolution，2007，24: 1596-1599．

［11］ Chen HH，Li WJ，Zhang YQ，Wang D，Tang SK． Study on isolation and systematic taxonomy of strains of genus Nesterenkonia． Acta Microbiologica Sinica，2004，44(6): 811-815．(in Chinese)陳華紅，李文均，張玉琴，王棟，唐蜀昆． 涅斯捷連科 氏菌屬 菌 株 的 分 離 及 系 統(tǒng) 學 研 究． 微 生 物 學 報． 2004，44(6): 811-815．

［12］ Keswani J，Whitman WB． Relationship of 16S rRNA

sequence similarity to DNA hybridization in prokaryotes．

International Journal of Systematic and Evolutionary

Microbiology，2001，51(2): 667-678． ［13］ Stackebrandt E，Ebers J． Taxonomic parameters

revisited: tarnished gold standards． Microbiol Today，2006，33，152-155． ［14］ Indananda C，Matsumoto A，Inahashi Y，Takahashi Y，Duangmal K，Thamchaipenet A． Actinophytocola oryzae gen． nov．，sp． nov．，isolated from the roots of Thai

glutinous rice plants，a new member of the family

Pseudonocardiaceae． International Journal of Systematic

and Evolutionary Microbiology，2010，60(5): 1141-1146． ［15］ Behrendt U，Schumann P，Hamada M，Suzuki KI，Sprer C，Ulrich A． Reclassification of Leifsonia ginsengi

(Qiu et al． 2007)as Herbiconiux ginsengi gen． nov．，comb． nov． and description of Herbiconiux solani sp．

nov．，an actinobacterium associated with the

phyllosphere of Solanum tuberosum L． International

Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2011，61(3):1039-1047．

［16］ Tao TS，Yue YY，Chen WX，Chen WF． Proposal of Nakamurella gen． nov． as a substitute for the bacterial genus Microsphaera Yoshimi et al． 1996 and Nakamurellaceae fam． nov． as a substitute for the illegitimate bacterial family Microsphaeraceae Rainey et al． 1997． International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2004，54: 999-1000．

［17］ Cho KM，Hong SY，Lee SM，Kim YH，Kahng GG，Lim YP，Kim H，Yun HD． Endophytic bacterial communities in ginseng and their antifungal activity against pathogens．

Microbial Ecology，2007，54(2): 341-351． ［18］ Amann RI，Ludwig W，Scheidler KH． Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation． Microbiological Reviews，1995，59(1): 143-169．

［19］ Xu HS，Roberts N，Singleton FL，Singleton R，Attwell W，Grimes DJ，Colwell RR． Survival and viability of nonculturable Esherichia coli and Vibro cholerae in the estuarine and marine envoroment． Microbial Ecology，1982，8(4): 313-323．

杜慧竟等: 藥用植物內(nèi)生放線菌的分離和生物學特性． /微生物學報(2013)53(1)Isolation and physiological characteristics of endophytic actinobacteria from medicinal plants Huijing Du，Jing Su，Liyan Yu，Yuqin Zhang * Institute of Medicinal Biotechnology，Chinese Academy of Medical Sciences ＆ Peking Union Medical College，Beijing 100050，China Abstract:［Objective］ To isolate，incubate and characterize cultivable endophytic antinobacteria from medicinal plants，and analyze the diversity of the endophytic antinobacteria，then explore the novel microbial resources． ［Methods］ Ten media were used to isolate endophytic antinobacteria from 37 fresh medicinal plant tissue samples． The optimal cultivation

conditions for endophytic antinobacteria were determined by comparison． Based on the morphology of the colonies and cells

of the new isolates，we chose174 isolates to analyze their 16S rRNA gene sequences and the diversity of the medicinal

plant endophytic antinobacteria． The physiological characteristics of 27 representative strains were studied using Biolog

GEN III MicroPlates，API 50CH and API ZYM kits． ［Results］ In total 940 endophytics affiliated to 47 genera of 30

families were isolated，among which more than 600 actinobacteria belonged to 34 genera and 7 unknown taxa． Good growth

of the endophytic antinobacteria on PYG(peptone-yeast-glycerol)medium with pH 7.2 at 28 － 32℃ was observed．

Physiological characteristics differences of these isolates related to their phylogenetic relationships． Greater differences

were shown among the strains from the same host plants than those from different plants grown in the same area．

［Conclusion］There are great diverse endophytic actinobacteria inside the medicinal plants． No direct relationship of the

endophytic actinobacteria from medicinal plants with the host plants in the sole carbon source utilization，fermentation of

carbon sources to produce acid and the enzyme activities was found，while it seemed that the physiological characteristics of the isolates related to the geographical distribution of their host．

Keywords: medicinal plants，endophytic actinobacteria，physiological characteristics，diversity

第二篇：水葫蘆論文：水葫蘆生防菌Cercosporasp.FJ24的分離、鑒定與生物學特性

水葫蘆論文：水葫蘆生防菌Cercosporasp.FJ24的分離、鑒定與生物學特性

【中文摘要】水葫蘆(Eichhornia crassipes)的蔓延在幾十個國家和地區(qū)造成了嚴重的環(huán)境問題,如何有效治理水葫蘆受到全球范圍內(nèi)的廣泛關注。其中,利用水葫蘆致病真菌進行治理,是一種備受重視的途徑。本文從福建省福州市郊區(qū)采集到被致病真菌強烈感染的水葫蘆植株,從葉片上分離得到了具有強致病性的真菌菌株FJ24。在對其致病性能進行試驗的基礎上,對其生物學特性進行了研究。通過形態(tài)學鑒定,初步認為FJ24屬于尾孢屬。進一步地在分子生物學水平上,對其ITS區(qū)、EF-1區(qū)、β-Tub區(qū)、His-H3區(qū)序列進行PCR擴增,通過測序,對比Genebank中已經(jīng)登錄的尾孢屬相應序列,構建系統(tǒng)發(fā)育樹,分析其分類地位。結果如下:證實其在7天內(nèi)能夠使試驗水葫蘆植株達到100%的發(fā)病率,3天、7天、14天、21天、28天病情指數(shù)分別達到了23.33%、44.17%、78.33%、92.50%、100%。FJ24菌株在PDA培養(yǎng)基上菌落呈灰白色、邊緣呈淡紅色,簇狀分布。菌絲大部分侵入培養(yǎng)基,邊緣清晰。分生孢子梗單生或2~12根簇生,不分枝,淺褐色,寬度較規(guī)則、直立或略有彎曲,63.4~247.6×2.5~5.5μm。分生孢子單生,無色至淺褐色,有多個橫隔,略有彎曲或無彎曲,線形、鞭型或蠕蟲型,56.0~312.2×2.0~7.8μm。初步鑒定其為尾孢屬。在PDA培養(yǎng)基上,FJ24菌株在全黑暗和光暗交替條件下生長速度較快,該菌在30°C下表現(xiàn)出最快生長速度,而且能長期保持,最適宜的PH條件為

中性偏堿性,在不同培養(yǎng)基上菌落形態(tài)存在一定差別,最適宜的培養(yǎng)基為MMA、MSDA、PDAY,該菌最適合利用的碳源和氮源分別為淀粉和乙酸銨。根據(jù)ITS區(qū)、EF-1區(qū)、β-Tub區(qū)、His-H3區(qū)序列的測序結果,構建系統(tǒng)發(fā)育樹,結果表明Cercospora sp.FJ24菌株與Cercospora piaropi的多個水葫蘆致病菌株存在著極高的同源性,序列相似度均達到了99%以上。生物學特性實驗和分子生物學分析均表明,基本可以認為Cercospora sp.FJ24是屬于Cercospora piaropi的。綜上所述,本文分離得到的Cercospora sp.FJ24具有開發(fā)成為水葫蘆生防制劑的潛力,同時由于該菌分離自我國本土,具有較高的安全性,因此對于水葫蘆的生物防治具有一定的參考價值。

【英文摘要】Spread of Water Hyacinth(Eichhornia crassipes)caused serious environmental problems in lots of countries and regions.The importance of controlling it was recognized throughout the world.Currently, controlling Water Hyacinth with pathogens gained more and more attention.A strain FJ24, with high pathogenicity against Water Hyacinth was isolated from heavily diseased Water Hyacinth collected from Fujian province.On the basis of determining the pathogenicity of FJ24 against Water Hyacinth, biological characteristics of the strain were studied.Using morphological identification , the strain was preliminarily considered as Cercospora.The strain was further analysed at the molecular level.Four

representative sequences of Cercospora sp.FJ24 including the ITS region,EF-1 region,β-Tub region and His-H3 region were sequenced and blasted with other signed Cercospora species on Genbank.Phylogenetic dendrogram were constructed to analyse the taxonomic position of Cercospora sp.FJ24.The results were as follows: The diseaed ratings of Cercospora sp.FJ24 reached 100% in 7 days;the diseased indexes were 23.33%,44.17%,78.33%,92.50% and 100% after 3 days ,7 days, 14 days, 21 days and 28 days respectively.Colony of Cercospora sp.FJ24 on PDA culture was hoar and its edge was light red, growing in cluster.Hypha almost invaded into the culture with clear edge.Conidiophores of Cercospora sp.FJ24 borne singly or in fascicles of 2 to 12, were light brown, septate, width regular, straight or lightly curved and no branched , measuring 63.4 to 247.6μm long and 2.5 to 5.5μm wide.Conidia developed singly , colourless or light brown with many transverse, measured 56.0 to 312.2μm long and 2.0 to 7.8μm wide.Preliminarily identify it as Cercospora.The colony of Cercospora sp.FJ24 grew best on PDA under the dark treatment of alternation illumination and darkness while the colony growed better on PDA under all darkness.The optimum temperature for colony longtime growth was found to be 30℃.The best colony growth was obtained at the condition of neutral pH or alkalescence.The fitting carbon and nitrogen source were amylum and ammonium acetate respectively.Cercospora sp.FJ24 presented varying morphological characteristics on different media tested, and the colonies grew best on MMA, PDAY and MSDA.Four phylogenetic trees were generated from the aligned ITS region,EF-1 region,β-Tub region and His-H3 region sequences.The treeing analyses showed that Cercospora sp.FJ24 presented highly homologous with many kinds of pathogenic strain in Cercospora piaropi.And the sequence similarities were above 99%.Biological characteristics of Cercospora sp.FJ24 and phylogenetic tree analyses indicated that Cercospora sp.FJ24 could be basically identified as Cercospora piaropi.The results listed above indicated that Cercospora sp.FJ24, isolated from this study, possessed the great potential to be developed into the fungal herbicide against Water Hyacinth.This research had positive significances for the biological control of exotic plants.【關鍵詞】水葫蘆 生防菌 Cercospora piaropi FJ24 鑒定 【英文關鍵詞】Water Hyacinth Pathogenic strain Cercospora piaropi FJ24 Identification 【目錄】水葫蘆生防菌Cercosporasp.FJ24的分離、鑒定與生物

學特性12-2312-15摘要5-7ABSTRACT7-9第一章 前言1.1 水葫蘆的生態(tài)學特性、分布和危害1.1.1 水葫蘆的生態(tài)學特性12-1

31.1.3 我國水葫蘆的危害情況

1.2.1 水葫蘆的物理

1.3 1.1.2 水葫蘆的分布13-1414-151.2 水葫蘆的防治15-21化學防治15-161.2.2 水葫蘆的生物防治16-21水葫蘆的綜合防治2121-23材料23準備2323-2

41.4 本研究的選題依據(jù)、目的和意義

2.1 實驗第二章 實驗儀器、材料與方法23-342.1.1 水葫蘆病樣采集232.1.3 菌株來源2

32.1.2 供試植株的2.2 主要儀器設備

2.3.1 基

2.3.3 2.3 固體培養(yǎng)基及其制備方法24-27

2.3.2 不同pH 值固體培養(yǎng)基24-25礎培養(yǎng)基24不同C、N 源固體培養(yǎng)基2525-27272.4 方法27-342.4.2 接種試驗27

2.3.4 其它種類固體培養(yǎng)基2.4.1 病原真菌的分離2.4.3 柯赫氏法則（Koch’s

2.4.5 Rule）驗證27-28致病性測定2828-2929

2.4.4 植物病害統(tǒng)計方法282.4.6 影響菌落生長的因素2.4.7 DNA 提取292.4.8 ITS 區(qū)序列擴增

2.4.10 系統(tǒng)發(fā)育3.1 水葫蘆病原

3.1.2 2.4.9 參考基因序列擴增29-30

第三章 結果與分析34-57分析30-34真菌FJ24 的分離34-36致病癥狀34-35

3.1.1 病原菌的分離34

3.1.3 柯赫氏法則驗證353.1.4 致病

性測定35-3636-37征36-3737-47

3.2 水葫蘆病原真菌FJ24 的形態(tài)學特征

3.2.2 分生孢子形態(tài)特3.2.1 菌落形態(tài)特征363.3 影響FJ24 菌落生長的因素研究3.3.1 光照對FJ24 菌落生長的影響37

3.3.2 不同光照條件下FJ24 生長曲線的測定37-38FJ24 菌落生長的影響38-39線的測定39-4040-4141-42

3.3.3 溫度對

3.3.4 不同溫度下FJ24 生長曲

3.3.5 PH 對FJ24 菌落生長的影響3.3.6 不同初始PH 下FJ24 生長曲線的測定3.3.7 碳源對FJ24 菌落生長的影響42

3.3.8 不同碳源下FJ24 生長曲線的測定42-43菌落生長的影響43-44測定4444-4545-4747-5750-52列54-57

3.3.9 氮源對FJ24

3.3.10 不同氮源下FJ24 生長曲線的3.3.11 不同培養(yǎng)基對FJ24 菌落生長的影響3.3.12 不同培養(yǎng)基中FJ24 生長曲線的測定3.4 Cercospora sp.FJ24 的分子生物學鑒定3.4.1 ITS 序列47-503.4.3 β-Tub 序列52-54第四章 討論57-62

3.4.2 EF-1 序列3.4.4 His-H3 區(qū)序4.1 關于Cercospora sp.FJ24 的鑒定574.2 關于Cercospora sp.FJ24 的生物學

4.3 Cercospora

4.4 關于特性及其對實際應用的指導意義57-59sp.FJ24 菌株作為真菌除草劑的開發(fā)前景59-60Cercospora sp.FJ24 菌株的安全性60-61草劑的開發(fā)前景61-62

4.5 水葫蘆真菌除

參考文獻

第五章 結論62-63

63-68附錄68-70致謝70-71攻讀碩士學位期間發(fā)表的論文71

第三篇：真菌的生物學特性

木霉菌屬于半知菌亞門、絲孢綱、絲孢目，粘孢菌類，是一類普遍存在的真菌。綠色木霉是木霉菌中具有重要經(jīng)濟意義的一種，目前在工業(yè)、農(nóng)業(yè)和環(huán)境科學等方面有著廣泛的用途。綠色木霉在自然界分布廣泛，常腐生于木材、種子及植物殘體上。綠色木霉能產(chǎn)生多種具有生物活性的酶系，如：纖維素酶、幾丁質(zhì)酶、木聚糖酶等。綠色木霉是所產(chǎn)纖維素酶活性最高的菌株之一，所產(chǎn)生的纖維素酶的降解作用，目前日益受到重視，國內(nèi)外對這方面的研究也很多。同時，綠色木霉又是一種資源豐富的拮抗微生物，在植物病理生物防治中具有重要的作用。它的作用機制有以下幾種：產(chǎn)生抗生素；重寄生作用，這是木霉菌作為拮抗菌最重要的機制；溶菌作用；競爭作用。

纖維單胞菌屬拉丁學名[Cellulomonas(Bergey et al.,1923),Clark,1952] 在幼齡培養(yǎng)物中細胞為細長的不規(guī)則桿菌，0.5～0.6μm×2.0～5.0μm，直到稍彎，有的呈 V字狀排列，偶見分支但無絲狀體。老培養(yǎng)物的桿通常變短，有少數(shù)球狀細胞出現(xiàn)。革蘭氏陽性，但易褪色。常以一根或少數(shù)鞭毛運動。不生孢，不抗酸。兼性厭氧，有的菌株在厭氧條件下可生長但很差。在蛋白胨-酵母膏瓊脂上的菌落通常凸起，淡黃色?；墚愷B(yǎng)菌，可呼吸代謝也可發(fā)酵代謝。從葡萄糖和其他碳水化合物在好氧和厭氧條件下都產(chǎn)酸。接觸酶陽性。能分解纖維素。還原硝酸鹽到亞硝酸鹽。最適生長溫度30℃。廣泛分布于土壤和腐敗的蔬菜。

康寧木霉菌絲有隔膜,蔓延生長,廣鋪于固體培養(yǎng)基上,菌外觀為淺綠,黃綠或綠色,反面無色,分生孢子.梗為菌絲的短側枝,其上對生或互生分枝,分枝上又可繼續(xù)分枝,形成2級,3級分枝,分枝末端即為瓶狀梗.分生孢子由小梗相繼生出面,靠黏液把它們聚成球形或近球形的孢子頭,分生孢子卵形成橢圓形,壁光滑.單個孢子近無色,形成堆狀為綠色,與此相似的還有綠色木霉!此菌有很強的纖維素霉及纖維,二糖淀粉酶等,它能利于農(nóng)副產(chǎn)品,如麥桿,木材,木屑等纖維素原料,使之轉(zhuǎn)變?yōu)樘琴|(zhì)原料

佛州側耳子實體覆瓦狀叢生。菌蓋直徑3~12cm，低溫時白色，高溫時帶青藍色轉(zhuǎn)黃色至白色，初半球形，邊緣完整，后平展成扇形或淺漏斗形，邊緣不齊或有深刻。菌肉稍薄，白色。菌褶淺黃白色，干時變淡黃色，稍密集至稍稀疏，延生，常在菌柄上形成脈絡狀。菌柄側生（有孢菌株），或偏心生至中央生（無孢菌株），細長，內(nèi)實，白色，長3~7cm，粗1~2cm，基部有時有白色絨毛。孢子印白色；孢子近柱形，6~9μm×2.5~3μm。

黑曲霉半知菌亞門，絲孢綱，絲孢目，叢梗孢科，曲霉屬真菌中的一個常見種。

分生孢子梗自基質(zhì)中伸出，直徑15～20pm，長約1～3mm，壁厚而光滑。頂部形成球形頂囊，其上全面覆蓋一層梗基和一層小梗，小梗上長有成串褐黑色的球狀分生孢子。孢子直徑2.5～4.0μm。分生孢子頭球狀，直徑700～800μm，褐黑色。菌落蔓延迅速，初為白色，后變成鮮黃色直至黑色厚絨狀。背面無色或中央略帶黃褐色。有時在新分離的菌株中能找到白色、圓形、直徑約1mm的菌核。分生孢子頭褐黑色放射狀，分生孢子梗長短不一。頂囊球形，雙層小梗。分生孢子褐色球形。

廣泛分布于世界各地的糧食、植物性產(chǎn)品和土壤中。是重要的發(fā)酵工業(yè)菌種，可生產(chǎn)淀粉酶、酸性蛋白酶、纖維素酶、果膠酶、葡萄糖氧化酶、檸檬酸、葡糖酸和沒食子酸等。有的菌株還可將羥基孕甾酮轉(zhuǎn)化為雄烯。生長適溫37℃，最低相對濕度為88%，能引致水分較高的糧食霉變和其他工業(yè)器材霉變。

側孢霉是一種嗜熱絲狀真菌,具有分解纖維素的特性.固體PDA培養(yǎng)條件下進行形態(tài)觀察表明,所采用的嗜熱側孢霉菌株,菌絲叢枝狀、有隔,分生孢子淺褐色,頂生或側生.利用ITS序列進行分子分類發(fā)現(xiàn)嗜熱側孢霉與嗜熱革節(jié)孢（Scytalidium thermophilium）及特異腐質(zhì)霉（Humicola insolens）2種嗜熱菌相距最近.嗜熱側孢霉的生長pH值范圍較寬,在初始pH值4.0-12.0的PDA平板上均可生長,以4.0-8.0時生長較好.以還原糖含量變化和蔗渣減少量為指標,以蔗渣為唯一碳源進行液體發(fā)酵

芽孢桿菌（Bacillaceae）

細菌的一科，能形成芽孢（內(nèi)生孢子）的桿菌或球菌。包括芽孢桿菌屬、芽孢乳桿菌屬、梭菌屬、脫硫腸狀菌屬和芽孢八疊球菌屬等。它們對外界有害因子抵抗力強，分布廣，存在于土壤、水、空氣以及動物腸道等處。芽孢桿菌bacillus 桿菌科的一屬細菌。為好氧或兼性厭氧的桿菌，一般為革蘭氏染色陽性。在某種環(huán)境下，菌體內(nèi)的結構發(fā)生變化，經(jīng)過前孢子階段，形成一個完整的芽孢。芽孢對熱、放射線和化學物質(zhì)等有很強的抵抗力。在化學組成方面，在芽孢內(nèi)含有大量營養(yǎng)細胞中不存在的二吡啶羧酸的鈣鹽；在結構方面，芽孢的原生質(zhì)外圍有三層膜，從內(nèi)到外是厚的皮層（cortex）、孢子殼和孢子外膜。在芽孢桿菌屬中，對種的劃分是以菌體的大小、孢子的形狀及其在菌體內(nèi)的位置、糖的利用及其產(chǎn)物、能否還原硝酸，以及在高濃度的食鹽條件下能否生長等為依據(jù)。廣泛分布在水、空氣和土壤中。代表種是枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。英語bacillus一詞，也可作桿菌或整個芽孢細菌的通稱。

球菌在微生物的檢驗中常用的是金黃色葡萄球菌 真菌（fungus；eumycetes）是具有真核和細胞壁的異養(yǎng)生物。種屬很多，已報道的屬達1萬以上，種超過10萬個。其營養(yǎng)體除少數(shù)低等類型為單細胞外，大多是由纖細管狀菌絲構成的菌絲體。低等真菌的菌絲無隔膜，高等真菌的菌絲都有隔膜，前者稱為無隔菌絲，后者稱有隔菌絲。在多數(shù)真菌的細胞壁中最具特征性的是含有甲殼質(zhì)，其次是纖維素。常見的真菌細胞器有：線粒體，微體，核糖體，液泡，溶酶體，泡囊，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，微管，鞭毛等；常見的內(nèi)含物有肝糖，晶體，脂體等。

真菌通常又分為三類，即酵母菌、霉菌和蕈菌（大型真菌），它們歸屬于不同的亞門。

大型真菌是指能形成肉質(zhì)或膠質(zhì)的子實體或菌核，大多數(shù)屬于擔子菌亞門，少數(shù)屬于子囊菌亞門。常見的大型真菌有香菇、草菇、金針菇、雙孢蘑菇、平菇、木耳、銀耳、竹蓀、羊肚菌等。它們既是一類重要的菌類蔬菜，又是食品和制藥工業(yè)的重要資源。[編輯本段]真菌的營養(yǎng)體

真菌營養(yǎng)生長階段的結構稱為營養(yǎng)體。絕大多數(shù)真菌的營養(yǎng)體都是可分枝的絲狀體，單根絲狀體稱為菌絲(hypha)。許多菌絲在一起統(tǒng)稱菌絲體(mycelium)。菌絲體在基質(zhì)上生長的形態(tài)稱為菌落(colnny)。菌絲在顯微鏡下觀察時呈管狀，具有細胞壁和細胞質(zhì)，無色或有色。菌絲可無限生長，但直徑是有限的，一般為2—30微米，最大的可達100微米。低等真菌的菌絲沒有隔膜(septum)稱為無隔菌絲，而高等真菌的菌絲有許多隔膜，稱為有隔菌絲。此外，少數(shù)真菌的營養(yǎng)體不是絲狀體。而是無細胞壁且形狀可變的原質(zhì)團(plasmodium)或具細胞壁的、卵圓形的單細胞。寄生在植物上的真菌往往以菌絲體在寄主的細胞間或穿過細胞擴展蔓延。

當菌絲體與寄主細胞壁或原生質(zhì)接觸后，營養(yǎng)物質(zhì)因滲透壓的關系進入菌絲體內(nèi)。有些真菌如活體營養(yǎng)生物侵入寄主后，菌絲體在寄主細胞內(nèi)形成吸收養(yǎng)分的特殊機構稱為吸器(hauStorium)。吸器的形狀不一，因種類不同而異，如白粉菌吸器為掌狀，霜霉菌為絲狀，銹菌為指狀，白銹菌為小球狀。有些真菌的菌絲體生長到一定階段，可形成疏松或緊密的組織體。苗絲組織體主要有菌核(sclerotium)、子座(stroma)和菌索(rhizomorph)等。菌核是由菌絲緊密交織而成的休眠體，內(nèi)層是疏絲組織，外層是擬薄壁組織，表皮細胞壁厚、色深、較堅硬。菌核的功能主要是抵抗不良環(huán)境。但當條件適宜時，菌核能萌發(fā)產(chǎn)生新的營養(yǎng)菌絲或從上面形成新的繁殖體。菌核的形狀和大小差異較大，通常似綠豆、鼠糞或不規(guī)則狀。子座是由菌絲在寄主表面或表皮下交織形成的一種墊狀結構，有時與寄主組織結合而成。子座的主要功能是形成產(chǎn)生抱子的機構，但也有度過不良環(huán)境的作用。菌索是由菌絲體平行組成的長條形繩索狀結構，外形與植物的根有些相似，所以也稱根狀菌索。菌索可抵抗不良環(huán)境，也有助于菌體在基質(zhì)上蔓延。

有些真菌菌絲或孢子中的某些細胞膨大變圓、原生質(zhì)濃縮、細胞壁加厚而形成厚垣孢子(chlamydospore)。它能抵抗不良環(huán)境，待條件適宜時，再萌發(fā)成菌絲。[編輯本段]真菌的繁殖體

當營養(yǎng)生活進行到一定時期時，真菌就開始轉(zhuǎn)入繁殖階段，形成各種繁殖體即子實體(fruitingbody)。真菌的繁殖體包括無性繁殖形成的無性孢子和有性生殖產(chǎn)生的有性孢子。

1．無性繁殖(asexual reproduction)

無性繁殖是指營養(yǎng)體不經(jīng)過核配和減數(shù)分裂產(chǎn)生后代個體的繁殖。它的基本特征是營養(yǎng)繁殖通常直接由菌絲分化產(chǎn)生無性孢子。常見的無性孢子有三種類型：

(1)游動孢子(zoospore)：形成于游動孢子囊(zoosporangium)內(nèi)。游動孢子囊由菌絲或孢囊梗頂端膨大而成。游動孢子無細胞壁，具1—2根鞭毛，釋放后能在水中游動。

(2)孢囊孢子(sporangiospore)：形成于孢囊孢子囊(sporangium)內(nèi)。孢子囊由孢囊梗的頂端膨大而成。孢囊孢子有細胞壁，無鞭毛，釋放后可隨風飛散。

(3)分生孢子(conidium)產(chǎn)生于由菌絲分化而形成的分生泡子梗(conidiophore)上，頂生、側生或串生，形狀、大小多種多樣，單胞或多胞，無色或有色，成熟后從袍子梗上脫落。有些真菌的分生抱子和分生孢子梗還著生在分生孢子果內(nèi)。袍子果主要有兩種類型，即近球形的具孔口的分生抱子器(pycnidium)和杯狀或盤狀的分生孢子盤(acervulus)。

2．有性生殖(sexualreproduction)真菌生長發(fā)育到一定時期(一般到后期)就進行有性生殖。有性生殖是經(jīng)過兩個性細胞結合后細胞核產(chǎn)生減數(shù)分裂產(chǎn)生袍子的繁殖方式。多數(shù)真菌由菌絲分化產(chǎn)生性器官即配子囊(gametangium)，通過雌、雄配于囊結合形成有性泡子。其整個過程可分為質(zhì)配、核配和減數(shù)分裂三個階段。第一階段是質(zhì)配，即經(jīng)過兩個性細胞的融合，兩者的細胞質(zhì)和細胞核(N)合并在同一細胞中，形成雙核期(N+N)。第二階段是核配，就是在融合的細胞內(nèi)兩個單倍體的細胞核結合成一個雙倍體的核(2N)。第三階段是減數(shù)分裂，雙倍體細胞核經(jīng)過兩次連續(xù)的分裂，形成四個單倍體的核(N)，從而回到原來的單倍體階段。經(jīng)過有性生殖，真菌可產(chǎn)生四種類型的有性孢子。

(1)卵孢子(oospore)：卵菌的有性孢子。是由兩個異型配子囊——雄器和藏卵器接觸后，雄器的細胞質(zhì)和細胞核經(jīng)授精管進入藏卵器，與卵球核配，最后受精的卵球發(fā)育成厚壁的、雙倍體的卵孢子。

(2)接合孢子(zygospore)：接合菌的有性孢子。是由兩個配子囊以配子囊結合的方式融合成1個細胞，并在這個細胞中進行質(zhì)配和核配后形成的厚壁孢子。

(3)子囊孢子(ascospore)：子囊菌的有性孢子。通常是由兩個異型配子囊——雄器和產(chǎn)囊體相結合，經(jīng)質(zhì)配、核配和減數(shù)分裂而形成的單倍體孢子。子囊孢子著生在無色透明、棒狀或卵圓形的囊狀結構即子囊(ascus)內(nèi)。每個子囊中一般形成8個子囊孢子。子囊通常產(chǎn)生在具包被的子囊果內(nèi)。子囊果一般有四種類型，即球狀而無孔口的閉囊殼(cletothecium)，瓶狀或球狀且有真正殼壁和固定孔口的子囊殼(perithecium)，由于座溶解而成的、無真正殼壁和固定孔口的子囊腔(locule)，以及盤狀或杯狀的子囊盤(9pothecium)。

(4)擔孢子(basidiospore)：擔子菌的有性孢子。通常是直接由“+”、“-”菌絲結合形成雙核菌絲，以后雙核菌絲的頂端細胞膨大成棒狀的擔子(basidium)。在擔子內(nèi)的雙核經(jīng)過核配和減數(shù)分裂，最后在擔子上產(chǎn)生4個外生的單倍體的擔孢子。

此外，有些低等真菌如根腫菌和壺菌產(chǎn)生的有性孢子是一種由游動配子結合成合子，再由合子發(fā)育而成的厚壁的休眠抱子(restingspore)。[編輯本段]真菌的起源和演化

關于真菌的起源和演化主要有兩派看法。一派認為真菌是由藻類演化而來。這些藻類因喪失色素而從自養(yǎng)變成異養(yǎng)，生理的變化引起了形態(tài)的改變。另一派認為除卵菌來自藻類外，其余的真菌來自原始鞭毛生物。

真菌是一項豐富的自然資源。人和動物每年消耗大量的真菌菌體和子實體；真菌也是重要的藥材。真菌的某些代謝產(chǎn)物在工業(yè)上具有廣泛用途，如乙醇，檸檬酸，甘油，酶制劑，甾醇，脂肪，塑料，促生素，維生素等。而且這些東西都能進行大規(guī)模的生產(chǎn)。在真菌的腐解作用中，它使許多重要化學元素得以再循環(huán)。真菌直接或間接地影響著地球生物圈的物質(zhì)循環(huán)和能量轉(zhuǎn)換。

真菌有以下幾種：

霉菌

亦稱“絲狀菌”。屬真菌。體呈絲狀，叢生，可產(chǎn)生多種形式的孢子。多腐生。種類很多，常見的有根霉、毛霉、曲霉和青霉等。霉菌可用以生產(chǎn)工業(yè)原料(檸檬酸、甲烯琥珀酸等)，進行食品加工(釀造醬油等)，制造抗菌素(如青霉素、灰黃霉素)和生產(chǎn)農(nóng)藥(如“920”、白僵菌)等。但也能引起工業(yè)原料和產(chǎn)品以及農(nóng)林產(chǎn)品發(fā)霉變質(zhì)。另有一小部分霉菌可引起人與動植物的病害，如頭癬、腳癬及番薯腐爛病等。

酵母菌

屬真菌。體呈圓形、卵形或橢圓形，內(nèi)有細胞核、液泡和顆粒體物質(zhì)。通常以出芽繁殖；有的能進行二等分分裂；有的種類能產(chǎn)生子囊孢子。廣泛分布于自然界，尤其在葡萄及其他各種果品和蔬菜上更多。是重要的發(fā)酵素，能分解碳水化合物產(chǎn)生酒精和二氧化碳等。生產(chǎn)上常用的有面包酵母、飼料酵母、酒精酵母和葡萄酒酵母等。有些能合成纖維素供醫(yī)藥使用，也有用于石油發(fā)酵的。

啤酒酵母（Saccharomyces）

屬酵母菌屬。細胞呈圓形、卵形或橢圓形。以出芽繁殖，能形成子囊孢子。在發(fā)酵工業(yè)上，可用來發(fā)酵生產(chǎn)酒精或藥用酵母，也可通過菌體的綜合利用提取凝血質(zhì)、麥角固醇、卵磷脂、輔酶甲與細胞色素丙等產(chǎn)品。

紅曲霉素（Monascuspurpureus）屬于囊菌綱，曲霉科。菌絲體紫紅色。無性生殖時，茵絲分枝頂端形成單獨的或一小串球形或梨形的分生抱子。有性生殖時，產(chǎn)生球形、橙紅色的閉囊果，內(nèi)生含有八個子囊孢子的子囊。紅曲霉可制紅曲、釀制紅乳腐和生產(chǎn)糖化酶等。

假絲酵母（Candida）

一屬能形成假菌絲、不產(chǎn)生子囊孢子的酵母。不少的假絲酵母能利用正烷烴為碳源進行石油發(fā)酵脫蠟，并產(chǎn)生有價值的產(chǎn)品。其中氧化正烷烴能力較強的假絲酵母多是解脂假絲酵母（C.lipolytica）或熱帶假絲酵母（C.tropicalis）。有些種類可用作飼料酵母；個別種類能引起人或動物的疾病。

白色念珠菌（Candidaalbicans）

或亦稱“白色假絲酵母”。一種呈橢圓形、行出芽繁殖的假絲酵母。通常存在于正常人的口腔、腸道、上呼吸道等處，能引起鵝口瘡等口腔疾病或其他疾病。

黃曲霉（Aspergillusflavus）

半知菌類，黃曲霉群的一種常見腐生真菌。多見于發(fā)霉的糧食、糧食制品或其他霉腐的有機物上。菌落生長較快，結構疏松，表面黃綠色，背面無色或略呈褐色。菌體由許多復雜的分枝菌絲構成。營養(yǎng)菌絲具有分隔；氣生菌絲的一部分形成長而粗糙的分生孢子梗，梗的頂端產(chǎn)生燒瓶形或近球形的頂囊，囊的表面產(chǎn)生許多小梗(一般為雙層)，小梗上著生成串的表面粗糙的球形分生孢子。分生孢子梗、頂囊、小梗和分生孢于合成孢子穗?？捎糜谏a(chǎn)淀粉酶、蛋白酶和磷酸二酯酶等，也是釀造工業(yè)中的常見菌種。近年來，發(fā)現(xiàn)其中某些菌株會產(chǎn)生引起人、畜肝臟致癌的黃曲霉毒素。早在六世紀時，《齊民要術》中就有用“黃衣”、“黃蒸”兩種麥曲來制醬的記載，這兩種黃色的麥曲，主要由黃曲霉一類微生物產(chǎn)生的大量孢子和蛋白酶、淀粉酶所組成。

白地霉（Geotrichumcandidum）

屬真菌。菌落平面擴散，組織輕軟，乳白色。菌絲生長到一定階段時，斷裂成圓柱狀的裂生抱子。菌體生長最適宜的溫度為28℃。常見于牛奶和各種乳制品(如酸牛奶和乳酪)中；在泡菜和醬上，也常有白地霉?？捎脕碇圃旌丝嗨?、酵母片等。

抗生菌

亦稱“拮(頡)抗菌”。能抑制別種微生物的生長發(fā)育，甚至殺死別種微生物的一些微生物。其中有的能產(chǎn)生抗菌素，主要是放線菌及若干真菌和細菌等。如鏈霉菌產(chǎn)生鏈霉素，青霉菌產(chǎn)生青霉素，多粘芽抱桿菌產(chǎn)生多粘菌素等。

假菌絲

某些酵母如假絲酵母經(jīng)出芽繁殖后，子細胞結成長鏈，并有分枝，稱為假菌絲。細胞間連接處較為狹窄，如藕節(jié)狀，一般沒有隔膜。

抗菌素

亦稱“抗生素”。主要指微生物所產(chǎn)生的能抑制或殺死其他微生物的化學物質(zhì)，如青霉素、鏈霉素、金霉素、春雷霉累、慶大霉素等。從某些高等植物和動物組織中也可提得抗菌素。有些抗菌素，如氯霉素和環(huán)絲氨酸，目前主要用化學合成方法進行生產(chǎn)。改變抗菌素的化學結構，可以獲得性能較好的新抗菌素，如半合成的新型青霉素。在醫(yī)學上，廣泛地應用抗菌素以治療許多微生物感染性疾病和某些癌癥等。在畜牧獸醫(yī)學方面，不僅用來防治某些傳染病，有些抗菌素還可用以促進家禽、家畜的生長。在農(nóng)林業(yè)方面，可用以防治植物的微生物性病害。在食品工業(yè)上，則可用作某些食品的保存劑。

病原性真菌

真菌（Fungus）在生物學分類上屬于藻菌植物中真菌超綱，具真核細胞型的微生物，它們在自然界分布廣泛，絕大多數(shù)對人有利，如釀酒、制醬，發(fā)酵飼料，農(nóng)田增肥，制造抗生素，生長蘑茹，食品加工及提供中草藥藥源（如靈芝、茯苓、冬蟲夏草等，都是真菌的產(chǎn)物或本身或利用真菌的作用所制備的）。對人類致病的真菌分淺部真菌和深部真菌，前者侵犯皮膚、毛發(fā)、指甲，為慢性，對治療有頑固性，但影響身體較小，后者可侵犯全身內(nèi)臟，嚴重的可引起死亡。此外有些真菌寄生于糧食、飼料、食品中，能產(chǎn)生毒素引起中毒性真菌病。

常見真菌培養(yǎng)基有：

配方一 薩市（Sabouraud’s）培養(yǎng)基

蛋白胨 10克 瓊脂 20克

麥芽糖 40克 水 1000毫升

先把蛋白胨、瓊脂加水后，加熱，不斷攪拌，待瓊脂溶解后，加入40克麥芽糖（或葡萄糖），攪拌，使它溶解，然后分裝，滅菌，備用。

本培養(yǎng)菌是培養(yǎng)許多種類真菌所常用的。

配方二 馬鈴薯糖瓊脂培養(yǎng)基

把馬鈴薯洗凈去皮，取200克切成小塊，加水1000毫升，煮沸半小時后，補足水分。在濾液中加入10克瓊脂，煮沸溶解后加糖20克（用于培養(yǎng)霉菌的加入蔗糖，用于培養(yǎng)酵母菌的加入葡萄糖），補足水分，分裝，滅菌，備用。

把這培養(yǎng)基的pH值調(diào)到7.2～7.4，配方中的糖，如用葡萄糖還可用來培養(yǎng)放線菌和芽孢桿菌。

配方三 黃豆芽汁培養(yǎng)基

黃豆芽 100克 瓊脂 15克

葡萄糖 20克 水 1000毫升

洗凈黃豆芽，加水煮沸30分鐘。用紗布過濾，濾液中加入瓊脂，加熱溶解后放入糖，攪拌使它溶解，補足水分到1000毫升，分裝，滅菌，備用。

把這培養(yǎng)基的pH值調(diào)到7.2～7.4，可用來培養(yǎng)細菌和放線菌。

配方四 豌豆瓊脂培養(yǎng)基

豌豆 80粒 瓊脂 5克

水 200毫升

取80粒干豌豆加水，煮沸1小時，用紗布過濾后，在濾液中加入瓊脂，煮沸到溶解，分裝，滅菌，備用。[編輯本段]真菌與生活

環(huán)境的再循環(huán)

真菌像細菌和微生物一樣都是分解者，就是一些分解死亡生物的有機物的生物。真菌將生物分解為各類無機物，使土地肥力增強。

食物與真菌

還有些真菌也成為重要的食物來源?？墒秤玫霓?00多種，如冬菇、草菇、木耳、云耳等。以及真菌所侵入后的生（動）物空殼，如冬蟲夏草。

還有的真菌用于食物加工，例如酵母菌用于面包等加工，釀酒也需要真菌。

致病的真菌

在農(nóng)業(yè)、林業(yè)和畜牧業(yè)中，真菌又有有害的一面。真菌能引起植物多種病害，從而造成巨大的經(jīng)濟損失。例如，1845年歐洲由于馬鈴薯晚疫病的流行摧毀了5／6的馬鈴薯，中國由于1950年的小麥銹病和1974年的稻瘟病而使小麥和水稻各減產(chǎn)60億千克。

真菌還可引起動、植物和人類的多種疾病，在人類主要有三種類型：①.真菌感染；②.變態(tài)反應性疾?。虎?中毒性疾病。

抗病的真菌

亞歷山大·弗萊明由于一次幸運的過失而發(fā)現(xiàn)了青霉素。有一次他外出度假時，把實驗室里在培養(yǎng)皿中正生長著細菌這件事給忘了。3周后當他回實驗室時，注意到在一個培養(yǎng)皿中長了一個霉菌斑。并且霉菌斑周圍的細菌都死了。

霉菌滲出了什么強有力的物質(zhì)？弗萊明稱為青霉素，并發(fā)現(xiàn)了它可以殺死許多致命性細菌。然而，因為青霉素在試管內(nèi)和血清混合后很快失活，弗萊明認為它不會在人和動物身上發(fā)生作用。

真菌與植物根系的關系

植物的根和真菌也有共生關系，和真菌共生的根稱為菌根。

外生菌根：真菌的菌絲在根的表面形成菌絲體包在幼根的表面，有時也侵入皮層細胞間，但不進入細胞內(nèi)，此時以菌絲代替了根毛的功能，增加了根系的吸收面積，如松等；

內(nèi)生菌根：菌絲通過細胞壁侵入到表皮和皮層細胞內(nèi)，加強吸收機能，促進根內(nèi)的物質(zhì)運輸，如柑橘、核桃等；

內(nèi)外生菌根：也有菌絲不僅包在幼根表面同時也深入到細胞中，稱內(nèi)外生菌根，如蘋果、柳樹等。

菌絲吸收水分、無機鹽等供給植物，同時產(chǎn)生植物激素和維生素B等促進根系的生長；植物供給真菌糖類、氨基酸等有機養(yǎng)料。

能形成菌根的高等植物2000多種，如側柏、毛白楊、銀杏、小麥、蔥等；

具菌根的植物在沒有真菌存在時不能正常生長，因此造林時須事先接種和感染所需真菌，以利于荒地上成功造林。

真菌【詞外小釋】

由菌絲組成，無根、莖、葉的分化，無葉綠素，不能自己制造養(yǎng)料，以寄生或腐生方式攝取現(xiàn)成有機物的低等植物獨立類群。真菌具有分解或合成許多種有機物的能力，可用于獲取維生素、抗菌素、酶等制劑，而有些真菌也可產(chǎn)生毒素，引起動植物中毒生病。由真菌所產(chǎn)生的毒素就稱之為真菌毒素。真菌作為病原微生物還能侵入人體和動物，引起毛發(fā)、皮膚、神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)和其他內(nèi)臟的病變。如頭皮屑和腳氣 贊同0| 評論

2009-3-23 12:03 48680009 | 二級

木霉:通常菌落擴展很快，特別在高溫高濕條件下幾天內(nèi)木霉菌落可遍布整個料面。菌絲生長溫度4—42℃，25—30℃生長最快，孢子萌發(fā)溫度10—35℃，15—30℃萌發(fā)率最高，25—27℃菌落由白變綠只需4—5晝夜，高溫對菌絲生長和萌發(fā)有利。孢子萌發(fā)要求相對濕度95%以上，但在干燥環(huán)境也能生長，菌絲生長pH值為3.5～5.8，在pH值4～5條件下生長最快。

纖維單胞菌:不生孢，不抗酸。兼性厭氧，有的菌株在厭氧條件下可生長但很差。在蛋白胨-酵母膏瓊脂上的菌落通常凸起，淡黃色?；墚愷B(yǎng)菌，可呼吸代謝也可發(fā)酵代謝。從葡萄糖和其他碳水化合物在好氧和厭氧條件下都產(chǎn)酸。接觸酶陽性。能分解纖維素。還原硝酸鹽到亞硝酸鹽。最適生長溫度30℃。廣泛分布于土壤和腐敗的蔬菜

酵母菌:同其它活的有機體一樣需要相似的營養(yǎng)物質(zhì)，象細菌一樣它有一套胞內(nèi)和胞外酶系統(tǒng)，用以將大分子物質(zhì)分解成細胞新陳代謝易利用的小分子物質(zhì)。象細菌一樣，酵母菌必須有水才能存活，但酵母需要的水分比細菌少，某些酵母能在水分極少的環(huán)境中生長，如蜂蜜和果醬，這表明它們對滲透壓有相當高的耐受性。酵母菌能在pH 值為3-7.5 的范圍內(nèi)生長，最適pH 值為pH4.5-5.0。在低于水的冰點或者高于47℃的溫度下, 酵母細胞一般不能生長，最適生長溫度一般在20℃~30℃之間。酵母菌在有氧和無氧的環(huán)境中都能生長，即酵母菌是兼性厭氧菌，在缺氧的情況下，酵母菌把糖分解成酒精和二氧化碳。在有氧的情況下，它把糖分解成二氧化碳和水，在有氧存在時，酵母菌生長較快。

第四篇：干細胞的生物學特性

干細胞的生物學特性

干細胞具有高度自我更新能力、高度繁殖和多向分化潛能，界定干細胞，有4條標準：1.干細胞可進行多次的，連續(xù)的，自我更新式的細胞分裂，這是維持群體穩(wěn)定的首要條件；2.起源于單一細胞的子細胞可分化超過1種以上的細胞類型，例如造血干細胞可分化為所有的血細胞，有些成熟干細胞只能分化成單一的細胞類型，例如角膜干細胞；3.當干細胞被移植入損傷的患者體內(nèi)時，它有重建原來組織的功能。4.不易確定的標準：即使無組織損傷，干細胞也能在體內(nèi)分化擴增，胚胎干細胞能完全符合上述標準，能以一種不確定的未分化狀態(tài)擴增，將其注入胚泡中，便能生成所有類型的細胞。

根據(jù)干細胞的發(fā)育階段，可將其分為胚胎干細胞（ESC）和成體干細胞（ASC），從干細胞到成熟細胞有許多分化階段，ESC和 ASC實質(zhì)上是發(fā)育的不同階段。胚胎干細胞即具有分化為機體任何一種組織器官潛能的細胞，包括胚胎干細胞、胚胎生殖細胞（EGC），成體干細胞具有自我更新能力，但通常只能分化為相應組織器官組成的“專業(yè)細胞”，它是存在于成熟個體各種器官中的干細胞，包括胚胎干細胞、造血干細胞、骨髓間質(zhì)干細胞

(Mesenchymal stem cell，MSCs)、神經(jīng)干細胞(Neural stem cell，NSCs)、肌肉干細胞(Muscle stem cell)、成骨干細胞(Osteogenic stem cell)、內(nèi)胚層干細胞(Endodermal stem cell)、視網(wǎng)膜干細胞(Retinal stem cell)、胰腺干細胞等等。

第五篇：實驗二_____土壤中放線菌的分離

實驗講義5 土壤中枯草芽孢桿菌分離方法

取土樣時最好選取如花壇等地方的土樣，去掉表層5~10cm的土壤后取樣。

放入100ml三角瓶中，加入30ml水，常壓加熱至水沸騰后維持20min，取出，置28-37攝氏度培養(yǎng)24-48h，液面則產(chǎn)生黃白色皮膜。用接種環(huán)取皮膜適量于無菌水中分散，稀釋涂布于蔗糖豆芽汁瓊脂平皿，置28-37攝氏度培養(yǎng)24-48h，挑取典型菌落。

實驗6

土壤中放線菌的分離（實訓）

實驗目的：1掌握配制合成培養(yǎng)基的一般方法。

2掌握稀釋倒平板法從土壤中分離放線菌的基本原理和基本操作技術。3掌握平板劃線法從土壤中分離放線菌的基本原理和基本操作技術。4掌握涂布平板法從土壤中分離放線菌的基本原理和基本操作技術。

實驗材料：

藥品：可溶性淀粉、KNO3、NaCl、K2HPO4?3H2O、MgSO4?7H2O、FeSO4?7H2O、瓊脂。其他：高壓蒸汽滅菌鍋、扭力天平、藥匙、燒杯、量筒、玻璃棒、三角瓶、試管、牛皮紙、硫酸紙、線繩、無菌培養(yǎng)皿、鐵鍬、小鏟、酒精棉球、鑷子、玻璃鉛筆。

實驗原理：

高氏一號合成培養(yǎng)基是培養(yǎng)放線菌的培養(yǎng)基。這種培養(yǎng)基是采用化學成分完全了解的純試劑配制而成的培養(yǎng)基，高氏一號培養(yǎng)基：碳源為可溶性淀粉、氮源為KNO3、NaCl、K2HPO4?3H2O、MgSO4?7H2O 作為無機鹽，F(xiàn)eSO4?7H2O作為微生物的微量元素，提供鐵離子等組成。

放線菌是重要的抗生素產(chǎn)生菌，主要分布在土壤中，其數(shù)量僅次于細菌，一般在中性偏堿性、有機質(zhì)豐富、通氣性好的土壤中含量較多。由于土壤中的微生物是各種不同種類微生物的混合體，為了研究某種微生物，就必須把它們從這些混雜的微生物群體中分離出來，從而獲得某一菌株的純培養(yǎng)。分離放線菌常用稀釋倒平板法。根據(jù)放線菌的營養(yǎng)、酸堿度等條件要求，常選用合成培養(yǎng)基或有機氮培養(yǎng)基。如果培養(yǎng)基成分改變，或土壤預先處理（120℃熱處理1h），或加入某種抑制劑（如加數(shù)滴10%酚等），都可以使細菌，霉菌出現(xiàn)的數(shù)量大大減少，從而淘汰了其它雜菌。再通過稀釋法，使放線菌在固體培養(yǎng)基上形成單獨菌落，并可得到純菌株。

實驗步驟：

1.高氏一號合成培養(yǎng)基的制備

高氏一號瓊脂培養(yǎng)基（培養(yǎng)放線菌用）

可溶性淀粉20g，硝酸鉀1g,氯化鈉0.5g，K2HPO4 ?3H2O 0.5g，MgSO4?7H2O 0.5g，F(xiàn)eSO4?7H2O 0.01g，瓊脂20g，水1000ml，pH7.2～7.4。

配制時，先用冷水，將淀粉調(diào)成糊狀，倒入煮沸的水中，在火上加熱，邊攪拌邊加入其他成分，溶化后，補足水分至1000ml。112℃滅菌20分鐘。

2.土壤中放線菌的分離（1）待測樣液的制備

選定取樣點（最好是有機質(zhì)含量高的菜地），按對角交叉（五點法）取樣。先除去表層約2cm的土壤，將鏟子插入土中數(shù)次，然后取2～10cm處的土壤。盛土的容器應是無菌的。將5點樣品約1kg充分混勻，除去碎石、植物殘根等，土樣取回后應盡快投入實驗。

稱土樣1g于盛有99mL無菌水或無菌生理鹽水并裝有玻璃珠的三角瓶中，振蕩10～20min，使土樣中的菌體、芽孢或孢子均勻分散，此即為10-2濃度的菌懸液，靜置30s。另取裝有9ml無菌水的試管3支，編號10-

3、10-

4、10-5。用無菌吸管無菌操作取10-2濃度的土壤懸液1ml并加入編號10-3的無菌試管中，并吹吸吸管2~3次，使與9ml水混勻，即為10-3濃度的土壤稀釋液。依此類推，直到稀釋至10-5的試管中（每個稀釋度換1支無菌吸管）。稀釋過程需在無菌室或無菌操作條件下進行。（2）稀釋倒平板法分離土壤中放線菌

-5-4-5-4取2支1毫升移液管分別從10、10菌懸液中吸取1毫升菌懸液，分別注入編號10、10的培養(yǎng)皿內(nèi)。將溫度為45～50℃的高氏一號培養(yǎng)基倒入上述各培養(yǎng)皿內(nèi)，輕輕旋轉(zhuǎn)使菌懸液充分混合均勻，凝固后，將培養(yǎng)皿倒扣放置在溫暖處（28℃左右），每天觀察培養(yǎng)基表面有無微生物菌落。（3）涂布平板法分離土壤中放線菌

取2套無菌平皿，在皿底貼上標簽，注明土壤稀釋液的稀釋度（10-

4、10-5）、組別、姓名、操作日期等。每個稀釋度做一個培養(yǎng)皿。然后在每皿中倒入已溶化并冷至50℃左右的高氏一號培養(yǎng)基15~20ml左右，待冷凝成平板。

用無菌吸管從濃度最小稀釋液開始，每次吸取0.1ml加到一組相應編號（10-5）的高氏一號平板上（每次吸取前，吸管要在液體內(nèi)吹吸幾次），再依次將10-4的土壤稀釋液加到相應平板上。用無菌刮棒（從濃度小的稀釋液開始）將加入平板培養(yǎng)基上的土壤稀釋液在整個平板表面涂勻。（4）平板劃線法分離土壤中放線菌

取一培養(yǎng)皿置于實驗臺上，左手將培養(yǎng)皿打開稍許，向培養(yǎng)皿內(nèi)注入熔化的營養(yǎng)固體培養(yǎng)基10～12毫升，輕輕轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿，使其中的培養(yǎng)基分布均勻，平放桌上，使其凝成平板。然后在皿底用蠟筆劃分A、B、C、D幾個區(qū)。每組兩個平板培養(yǎng)基。

將培養(yǎng)皿底部用姆指和無名指固定成傾斜狀態(tài)，在火焰旁將培養(yǎng)皿稍微打開。在此同時，用環(huán)狀接種針在火焰旁取少許10-2濃度的土壤稀釋液，迅速送入培養(yǎng)皿內(nèi)，在平板培養(yǎng)基的一邊，作第1次平行劃線 6～7條，轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿約70°角，用燒過冷卻的接種針，通過第1次劃線部分作第2次平行劃線，然后再用同樣方法，作第3次平行劃線。劃線時，接種針應與平板表面成30°角左右。不要使接種針碰到培養(yǎng)皿邊緣，也不要將培養(yǎng)基劃破。（5）培養(yǎng)

接種完畢，將平皿放入28℃恒溫箱培養(yǎng)7天，觀察平皿上放線菌（主要是鏈霉菌）菌落。（6）挑菌落

待三種方法的平板長出菌落后，鑒定微生物類群，并根據(jù)鏡檢結果，判斷是否已分離到了純菌種。如果菌種很純，則可轉(zhuǎn)移到斜面培養(yǎng)基上進一步培養(yǎng)。轉(zhuǎn)種至斜面，菌種用牛皮紙包好，置4℃冰箱中保存。

準備實驗內(nèi)容：

問曾老師借 無菌刮棒 打火機 酒精燈

無菌報紙包（1個）

99mL水/三角瓶（玻璃珠）

5支移液管 3支9mL水的試管

培養(yǎng)皿6套 槍頭（1mL/0.1mL）

高氏一號培養(yǎng)基500mL（150mL三角瓶2個，200mL試管）思考題：

1.檢查接種后培養(yǎng)物的生長情況和染菌情況。

2.觀察與記錄以下內(nèi)容。

大小

形狀

邊緣顏色

表面代謝物

種類 3.如何區(qū)分放線菌和真菌、細菌？

放線菌菌落小而緊密、干燥、不透明、難以挑取，當大量孢子覆蓋于菌落表面時，就形成表面為粉末狀或顆粒狀的典型放線菌菌落，由于基內(nèi)菌絲和孢子常有顏色，使得菌落的正反面呈現(xiàn)出不同的色澤。霉菌菌落的話應該是比較大的，可能是大而疏松也可能大而緊密，其他一些跟放線菌都差不多，比如都是顏色多種多樣，與培養(yǎng)基緊密結合難于挑取。但在氣味上有很大差別，放線菌具有泥腥味，而霉菌具有霉味。還有一點就是放線菌菌落周圍瓊脂平面會有變形的現(xiàn)象。若稀釋平板的稀釋度不夠，放線菌會被抑制了或者菌落太小，而其他細菌的菌落又太多，不容易找到。