第一篇：土壤中放線菌的分離和純化實(shí)驗(yàn)

土壤中放線菌的分離和純化實(shí)驗(yàn)

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

1、制作MS培養(yǎng)基的方法，掌握母液的保存方法。

2、掌握培養(yǎng)基的滅菌方法。

掌握外植體的消毒和超凈工作臺(tái)的使用。

4、掌握放線菌的分離純化及染色的基本流程；

5、掌握高氏一號(hào)培養(yǎng)基的配制方法；

6、復(fù)習(xí)分離純化放線菌的基本操作技術(shù)、培養(yǎng)方學(xué)會(huì)使用高壓蒸汽滅菌鍋。

7、培養(yǎng)微生物實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)思路和動(dòng)手能力。

二、實(shí)驗(yàn)材料

高壓蒸汽鍋、培養(yǎng)瓶、石斛的愈傷組織、超凈工作臺(tái)，酒精燈、酒精棉球、鑷子、電子天平、稱量紙、燒杯、量筒、顯微鏡、三角錐形瓶、無(wú)菌培養(yǎng)皿、接種環(huán)、酒精燈、分析天平；接種環(huán)、載玻片、蓋玻片、玻璃珠、移液槍、剪刀

三、實(shí)驗(yàn)原理

植物組織培養(yǎng)即植物無(wú)菌培養(yǎng)技術(shù)，又稱離體培養(yǎng)，是根據(jù)植物細(xì)胞具有全能性的理論，利用植物體離體的器官(如根、莖、葉、莖尖、花、果實(shí)等）、組織（如形成層、表皮、皮層、髓部細(xì)胞、胚乳等）

第 1 頁(yè) 或細(xì)胞（如大孢子、小孢子、體細(xì)胞等）以及原生質(zhì)體,在無(wú)菌和適宜的人工培養(yǎng)基及溫度等人工條件下，能誘導(dǎo)出愈傷組織、不定芽、不定根，最后形成完整的植株的學(xué)科。

四、實(shí)驗(yàn)步驟

1、配制MS培養(yǎng)基8L，稱取馬鈴薯1600g、香蕉400g、蔗糖240g、活性炭8半勺、瓊脂80g、配制 母液。

2、配制培養(yǎng)液時(shí)應(yīng)注意：

①在使用提前配制的母液時(shí)，應(yīng)在量取各種母液之前，輕輕搖動(dòng)盛放母液的瓶子，如果發(fā)現(xiàn)瓶中有沉淀、懸浮物或被微生物污染，應(yīng)立即淘汰這種母液，重新進(jìn)行配制；為防止母液被微生物污染，有機(jī)母液放在冰箱里4℃保存；

②用量筒或移液管量取培養(yǎng)基母液之前，必須用所量取的母液將量筒或移液管潤(rùn)洗2次；

③量取母液時(shí)，最好將各種母液按將要量取的順序?qū)懺诩埳?，量?種，劃掉1種，以免出錯(cuò)。溶化瓊脂 用粗天平分別稱取瓊脂9 g、蔗糖30 g，放入1 000 mL的搪瓷量杯中，再加入蒸餾水750 mL，用電爐加熱，邊加熱邊用玻璃棒攪拌，直到液體呈半透明狀。然后再將配好的混合培養(yǎng)液加入到煮沸的瓊脂中，最后加蒸餾水定容至1 000 mL，攪拌均勻。

需要注意的是，在加熱瓊脂，制備培養(yǎng)基的過(guò)程中，操作者千萬(wàn)不能離開，否則沸騰的瓊脂外溢，就需要重新稱量、制備。此外，如果沒有搪瓷量杯，可用大燒杯代替。但要注意大燒杯底的外表面不能沾水，第 2 頁(yè) 否則加熱時(shí)燒杯容易炸裂，使溶液外溢，造成燙傷。調(diào)pH 用滴管吸取物質(zhì)的量濃度為1 mol/L的NaOH溶液，逐滴滴入溶化的培養(yǎng)基中，邊滴邊攪拌，并隨時(shí)用pH試紙測(cè)培養(yǎng)基的pH，一直調(diào)到培養(yǎng)基的pH為6（5.8~6.5）左右為止。培養(yǎng)基的分裝 溶化的培養(yǎng)基應(yīng)該趁熱分裝。分裝時(shí)，先將培養(yǎng)基倒入燒杯中，然后將燒杯中的培養(yǎng)基倒入錐形瓶（50 mL或100 mL）中。注意不要讓培養(yǎng)基沾到瓶口和瓶壁上。錐形瓶中培養(yǎng)基的量約為錐形瓶容量的1/5～1/4。每1 000 mL培養(yǎng)基，可分裝25～30瓶。培養(yǎng)基分裝完畢后，應(yīng)及時(shí)封蓋瓶口。用2塊硫酸紙（每塊大小約為9 cm×9 cm）中間夾1層薄牛皮紙封蓋瓶口，并用線繩捆扎。最后在錐形瓶外壁貼上標(biāo)簽。

3、高壓滅菌 培養(yǎng)基的高壓滅菌包括以下幾個(gè)步驟。

第一，碼放錐形瓶。將裝有培養(yǎng)基的錐形瓶直立于金屬小筐中，再放入高壓蒸氣滅菌鍋內(nèi)。如果沒有金屬小筐，可以在兩層錐形瓶之間放一塊玻璃板隔開。

第二，放置其他需要滅菌的物品。將其他需要滅菌的物品也放入高壓蒸氣滅菌鍋內(nèi)，如裝有蒸餾水的錐形瓶、帶螺口蓋的玻璃瓶、燒杯、廣口瓶（以上物品都要用牛皮紙封口），用報(bào)紙包裹的培養(yǎng)皿、剪刀、解剖刀、鑷子、濾紙、鉛筆等。

第三，滅菌。待需要滅菌的物品碼放完畢，蓋上鍋蓋。在98 kPa、121 ℃下，滅菌20 min。滅菌后取出錐形瓶，讓其中的培養(yǎng)基自然冷卻凝固后再使用。

第 3 頁(yè) 4,、再在操凈工上進(jìn)行消毒，先用紫外線照射30MIN，然后送風(fēng)，關(guān)閉紫外燈，改 用日光燈，對(duì)手用酒精進(jìn)行消毒，對(duì)培養(yǎng)基表面也要用酒精進(jìn)行消毒。準(zhǔn)備工作好了，就進(jìn)行接種。并且要在酒精燈旁邊進(jìn)行操作，避免污染。鑷子要在雙孔滅菌器上進(jìn)行滅菌。

4、接種完成后要整理工作臺(tái)，并且把培養(yǎng)瓶拿到培養(yǎng)架上進(jìn)行日光培養(yǎng)。

五、放線菌的提取步驟

5、（1）稱取土樣2.00g，在火焰旁加到一個(gè)盛有48ml無(wú)菌水并裝有玻璃珠的100ml錐形瓶中。振蕩20-30min，使樣品的菌體、芽孢或孢子均勻分散。靜止20-30s，標(biāo)記為編號(hào)1。

6、（2）按照一定的梯度進(jìn)行稀釋（該實(shí)驗(yàn)采用10倍梯度）

①取3個(gè)各裝有9.5ml無(wú)菌水的25ml錐形瓶，分別按照順序標(biāo)記好2、3、4.②在超凈工作臺(tái)上，用微量移液器從1號(hào)錐形瓶中移取0.5ml土壤懸液加到2號(hào)錐形瓶中，搖勻后，再用微量移液器從2號(hào)錐形瓶中移取0.5ml土壤懸液加到3號(hào)錐形瓶中，依此類推，7、分別將土壤懸液制成10-

1、10-

2、10-

3、10-

4、10-

5、10-

6、10-

7、10-

8、10-

9、10-10的土壤稀釋液。

六、稀釋涂布法分離土壤中放線菌

8、（1）倒平板

9、將配制好并且滅菌的高氏一號(hào)培養(yǎng)基加熱融化，待冷卻至55—60℃時(shí)，往高氏1號(hào)培養(yǎng)基中加入1ml的0.5%重鉻酸鉀, 然后分別倒平板。方法是在超凈工作臺(tái)，右手持盛培養(yǎng)基的三角燒瓶，置火焰旁

第 4 頁(yè) 邊，左手拿平皿并松動(dòng)瓶塞，用手掌邊緣和小指、無(wú)名指夾住拔出。令三角瓶瓶口在火焰上滅菌，左手將培養(yǎng)皿蓋在火焰附近打開一縫，迅速倒入培養(yǎng)液約15ml，加蓋后輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)基均勻分布，平置于桌面上，待冷凝后即成平板。共制備6個(gè)平板（一個(gè)稀釋度做3個(gè)平行樣品）。

10、（3）涂布平板

11、用1ml無(wú)菌吸管分別精確地吸取10-

4、10-

5、10-6的稀釋菌液1ml，對(duì)號(hào)放入編好號(hào)的無(wú)菌培養(yǎng)皿中，每一濃度對(duì)應(yīng)兩個(gè)平板。用無(wú)菌涂布棒（從濃度小液開始）將加入平板培養(yǎng)基上的土壤稀釋液在整個(gè)平板表面涂勻，涂完一個(gè)平板用酒精燈滅菌。

12、（4）倒置平板

13、將培養(yǎng)基平板倒置（防皿蓋的冷凝水下滴），置于28度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d14、15、5、放線菌的純化

16、（1）倒平板

同上

17、（2）平板劃線

18、將蘸有菌種的接種環(huán)在平板培養(yǎng)基上做以Z字行劃線，每劃完一次要充分燃燒接種環(huán)燒掉殘余微生物，再?gòu)纳弦淮蝿澗€處末點(diǎn)開始下一次劃線。劃線完畢后蓋上培養(yǎng)皿蓋，倒置與恒溫箱中培養(yǎng)。

6、放線菌的觀察玻璃紙法

19、將玻璃紙剪成培養(yǎng)皿大小，用舊報(bào)紙隔層疊好后滅菌。

第 5 頁(yè) 20、將高氏一號(hào)瓊脂培養(yǎng)基熔化后在火焰旁倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)，每皿倒15ml左右，待培養(yǎng)基凝固后，在無(wú)菌操作下用鑷子將無(wú)菌玻璃紙履蓋在瓊脂平板上即制成玻璃紙瓊脂平板培養(yǎng)基。

21、（3）用接種環(huán)挑取純化后的放線菌，在玻璃紙上劃線接種。

22、（4）將接種的玻璃紙瓊脂平板置28—30℃下培養(yǎng)。

23、（5）在培養(yǎng)至3天，5天，7天時(shí)，從溫室中取出平皿。在超凈工作臺(tái)上，打開培養(yǎng)皿，用無(wú)菌鑷子將玻璃紙與培養(yǎng)基分離，用無(wú)菌剪刀取小片玻璃紙置于載玻片上用顯微鏡觀察。

7、放線菌保藏

斜面低溫保藏法

長(zhǎng)后，棉塞部分用油紙包扎好，移至 2—8 ℃的冰箱中保藏，保存 2—4 個(gè)月，移種一次。

將純化培養(yǎng)后的放線菌接種在適宜的固體斜面培養(yǎng)基上，待菌充分生

第 6 頁(yè)

第二篇：實(shí)驗(yàn)二_____土壤中放線菌的分離

實(shí)驗(yàn)講義5 土壤中枯草芽孢桿菌分離方法

取土樣時(shí)最好選取如花壇等地方的土樣，去掉表層5~10cm的土壤后取樣。

放入100ml三角瓶中，加入30ml水，常壓加熱至水沸騰后維持20min，取出，置28-37攝氏度培養(yǎng)24-48h，液面則產(chǎn)生黃白色皮膜。用接種環(huán)取皮膜適量于無(wú)菌水中分散，稀釋涂布于蔗糖豆芽汁瓊脂平皿，置28-37攝氏度培養(yǎng)24-48h，挑取典型菌落。

實(shí)驗(yàn)6

土壤中放線菌的分離（實(shí)訓(xùn)）

實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?掌握配制合成培養(yǎng)基的一般方法。

2掌握稀釋倒平板法從土壤中分離放線菌的基本原理和基本操作技術(shù)。3掌握平板劃線法從土壤中分離放線菌的基本原理和基本操作技術(shù)。4掌握涂布平板法從土壤中分離放線菌的基本原理和基本操作技術(shù)。

實(shí)驗(yàn)材料：

藥品：可溶性淀粉、KNO3、NaCl、K2HPO4?3H2O、MgSO4?7H2O、FeSO4?7H2O、瓊脂。其他：高壓蒸汽滅菌鍋、扭力天平、藥匙、燒杯、量筒、玻璃棒、三角瓶、試管、牛皮紙、硫酸紙、線繩、無(wú)菌培養(yǎng)皿、鐵鍬、小鏟、酒精棉球、鑷子、玻璃鉛筆。

實(shí)驗(yàn)原理：

高氏一號(hào)合成培養(yǎng)基是培養(yǎng)放線菌的培養(yǎng)基。這種培養(yǎng)基是采用化學(xué)成分完全了解的純?cè)噭┡渲贫傻呐囵B(yǎng)基，高氏一號(hào)培養(yǎng)基：碳源為可溶性淀粉、氮源為KNO3、NaCl、K2HPO4?3H2O、MgSO4?7H2O 作為無(wú)機(jī)鹽，F(xiàn)eSO4?7H2O作為微生物的微量元素，提供鐵離子等組成。

放線菌是重要的抗生素產(chǎn)生菌，主要分布在土壤中，其數(shù)量?jī)H次于細(xì)菌，一般在中性偏堿性、有機(jī)質(zhì)豐富、通氣性好的土壤中含量較多。由于土壤中的微生物是各種不同種類微生物的混合體，為了研究某種微生物，就必須把它們從這些混雜的微生物群體中分離出來(lái)，從而獲得某一菌株的純培養(yǎng)。分離放線菌常用稀釋倒平板法。根據(jù)放線菌的營(yíng)養(yǎng)、酸堿度等條件要求，常選用合成培養(yǎng)基或有機(jī)氮培養(yǎng)基。如果培養(yǎng)基成分改變，或土壤預(yù)先處理（120℃熱處理1h），或加入某種抑制劑（如加數(shù)滴10%酚等），都可以使細(xì)菌，霉菌出現(xiàn)的數(shù)量大大減少，從而淘汰了其它雜菌。再通過(guò)稀釋法，使放線菌在固體培養(yǎng)基上形成單獨(dú)菌落，并可得到純菌株。

實(shí)驗(yàn)步驟：

1.高氏一號(hào)合成培養(yǎng)基的制備

高氏一號(hào)瓊脂培養(yǎng)基（培養(yǎng)放線菌用）

可溶性淀粉20g，硝酸鉀1g,氯化鈉0.5g，K2HPO4 ?3H2O 0.5g，MgSO4?7H2O 0.5g，F(xiàn)eSO4?7H2O 0.01g，瓊脂20g，水1000ml，pH7.2～7.4。

配制時(shí)，先用冷水，將淀粉調(diào)成糊狀，倒入煮沸的水中，在火上加熱，邊攪拌邊加入其他成分，溶化后，補(bǔ)足水分至1000ml。112℃滅菌20分鐘。

2.土壤中放線菌的分離（1）待測(cè)樣液的制備

選定取樣點(diǎn)（最好是有機(jī)質(zhì)含量高的菜地），按對(duì)角交叉（五點(diǎn)法）取樣。先除去表層約2cm的土壤，將鏟子插入土中數(shù)次，然后取2～10cm處的土壤。盛土的容器應(yīng)是無(wú)菌的。將5點(diǎn)樣品約1kg充分混勻，除去碎石、植物殘根等，土樣取回后應(yīng)盡快投入實(shí)驗(yàn)。

稱土樣1g于盛有99mL無(wú)菌水或無(wú)菌生理鹽水并裝有玻璃珠的三角瓶中，振蕩10～20min，使土樣中的菌體、芽孢或孢子均勻分散，此即為10-2濃度的菌懸液，靜置30s。另取裝有9ml無(wú)菌水的試管3支，編號(hào)10-

3、10-

4、10-5。用無(wú)菌吸管無(wú)菌操作取10-2濃度的土壤懸液1ml并加入編號(hào)10-3的無(wú)菌試管中，并吹吸吸管2~3次，使與9ml水混勻，即為10-3濃度的土壤稀釋液。依此類推，直到稀釋至10-5的試管中（每個(gè)稀釋度換1支無(wú)菌吸管）。稀釋過(guò)程需在無(wú)菌室或無(wú)菌操作條件下進(jìn)行。（2）稀釋倒平板法分離土壤中放線菌

-5-4-5-4取2支1毫升移液管分別從10、10菌懸液中吸取1毫升菌懸液，分別注入編號(hào)10、10的培養(yǎng)皿內(nèi)。將溫度為45～50℃的高氏一號(hào)培養(yǎng)基倒入上述各培養(yǎng)皿內(nèi)，輕輕旋轉(zhuǎn)使菌懸液充分混合均勻，凝固后，將培養(yǎng)皿倒扣放置在溫暖處（28℃左右），每天觀察培養(yǎng)基表面有無(wú)微生物菌落。（3）涂布平板法分離土壤中放線菌

取2套無(wú)菌平皿，在皿底貼上標(biāo)簽，注明土壤稀釋液的稀釋度（10-

4、10-5）、組別、姓名、操作日期等。每個(gè)稀釋度做一個(gè)培養(yǎng)皿。然后在每皿中倒入已溶化并冷至50℃左右的高氏一號(hào)培養(yǎng)基15~20ml左右，待冷凝成平板。

用無(wú)菌吸管從濃度最小稀釋液開始，每次吸取0.1ml加到一組相應(yīng)編號(hào)（10-5）的高氏一號(hào)平板上（每次吸取前，吸管要在液體內(nèi)吹吸幾次），再依次將10-4的土壤稀釋液加到相應(yīng)平板上。用無(wú)菌刮棒（從濃度小的稀釋液開始）將加入平板培養(yǎng)基上的土壤稀釋液在整個(gè)平板表面涂勻。（4）平板劃線法分離土壤中放線菌

取一培養(yǎng)皿置于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，左手將培養(yǎng)皿打開稍許，向培養(yǎng)皿內(nèi)注入熔化的營(yíng)養(yǎng)固體培養(yǎng)基10～12毫升，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿，使其中的培養(yǎng)基分布均勻，平放桌上，使其凝成平板。然后在皿底用蠟筆劃分A、B、C、D幾個(gè)區(qū)。每組兩個(gè)平板培養(yǎng)基。

將培養(yǎng)皿底部用姆指和無(wú)名指固定成傾斜狀態(tài)，在火焰旁將培養(yǎng)皿稍微打開。在此同時(shí)，用環(huán)狀接種針在火焰旁取少許10-2濃度的土壤稀釋液，迅速送入培養(yǎng)皿內(nèi)，在平板培養(yǎng)基的一邊，作第1次平行劃線 6～7條，轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿約70°角，用燒過(guò)冷卻的接種針，通過(guò)第1次劃線部分作第2次平行劃線，然后再用同樣方法，作第3次平行劃線。劃線時(shí)，接種針應(yīng)與平板表面成30°角左右。不要使接種針碰到培養(yǎng)皿邊緣，也不要將培養(yǎng)基劃破。（5）培養(yǎng)

接種完畢，將平皿放入28℃恒溫箱培養(yǎng)7天，觀察平皿上放線菌（主要是鏈霉菌）菌落。（6）挑菌落

待三種方法的平板長(zhǎng)出菌落后，鑒定微生物類群，并根據(jù)鏡檢結(jié)果，判斷是否已分離到了純菌種。如果菌種很純，則可轉(zhuǎn)移到斜面培養(yǎng)基上進(jìn)一步培養(yǎng)。轉(zhuǎn)種至斜面，菌種用牛皮紙包好，置4℃冰箱中保存。

準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：

問(wèn)曾老師借 無(wú)菌刮棒 打火機(jī) 酒精燈

無(wú)菌報(bào)紙包（1個(gè)）

99mL水/三角瓶（玻璃珠）

5支移液管 3支9mL水的試管

培養(yǎng)皿6套 槍頭（1mL/0.1mL）

高氏一號(hào)培養(yǎng)基500mL（150mL三角瓶2個(gè)，200mL試管）思考題：

1.檢查接種后培養(yǎng)物的生長(zhǎng)情況和染菌情況。

2.觀察與記錄以下內(nèi)容。

大小

形狀

邊緣顏色

表面代謝物

種類 3.如何區(qū)分放線菌和真菌、細(xì)菌？

放線菌菌落小而緊密、干燥、不透明、難以挑取，當(dāng)大量孢子覆蓋于菌落表面時(shí)，就形成表面為粉末狀或顆粒狀的典型放線菌菌落，由于基內(nèi)菌絲和孢子常有顏色，使得菌落的正反面呈現(xiàn)出不同的色澤。霉菌菌落的話應(yīng)該是比較大的，可能是大而疏松也可能大而緊密，其他一些跟放線菌都差不多，比如都是顏色多種多樣，與培養(yǎng)基緊密結(jié)合難于挑取。但在氣味上有很大差別，放線菌具有泥腥味，而霉菌具有霉味。還有一點(diǎn)就是放線菌菌落周圍瓊脂平面會(huì)有變形的現(xiàn)象。若稀釋平板的稀釋度不夠，放線菌會(huì)被抑制了或者菌落太小，而其他細(xì)菌的菌落又太多，不容易找到。

第三篇：實(shí)驗(yàn)2 土壤中稀有放線菌的分離--土壤樣品采集

實(shí)驗(yàn)2 土壤中稀有放線菌的分離--土壤樣品采集 1 目的

1.1 了解微生物分離和純化的原理 1.2 掌握常用的分離純化微生物的方法 2 原理

從混雜微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過(guò)程稱為微生物分離與純化。其基本原理是選擇適合于待分離微生物的生長(zhǎng)條件，如營(yíng)養(yǎng)成分、酸堿度、溫度和氧等要求,或加入某種抑制劑造成只利于該微生物生長(zhǎng)，而抑制其他微生物生長(zhǎng)的環(huán)境，從而淘汰一些不需要的微生物。土壤是微生物生活的大本營(yíng)，它所含微生物無(wú)論是數(shù)量還是種類都是極其豐富的。因此土壤是微生物多樣性的重要場(chǎng)所，是發(fā)掘微生物資源的重要基地，可以從中分離、純化得到許多有價(jià)值的菌株。本實(shí)驗(yàn)將采用不同的培養(yǎng)基從土壤中分離不同類型的微生物。3 材料 3.1 培養(yǎng)基

淀粉瓊脂培養(yǎng)基(高氏I號(hào)培養(yǎng)基)，牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基，查氏瓊脂培養(yǎng)基。3.2 儀器或其它用具 取樣鏟、塑料袋、記號(hào)筆、1．布點(diǎn)：按照土壤類型和作物種植品種分布，按土壤肥力高、中、低分別采樣。一般150-300畝（不同地區(qū)可根據(jù)情況確定）采取一個(gè)耕層混合樣，采樣點(diǎn)以鋸齒型或蛇型分布，要做到盡量均勻和隨機(jī)。應(yīng)用土壤底圖確定采樣地塊和采樣點(diǎn)，并在圖上標(biāo)出，確定調(diào)查采樣路線和方案。

2．采樣部位和深度：用取樣鏟，將表層5cm左右的浮土除去，取5～25cm處的土樣0.5-1kg，在采樣過(guò)程中，采取的混合樣一般都大于該重量，所以要去掉部分樣品，將所有采樣點(diǎn)的樣品攤在塑料布上，除去動(dòng)植物殘?bào)w、石礫等雜質(zhì)，將大塊的樣品整碎，混勻，攤成園形，中間劃十字分成四份，然后對(duì)角線去掉兩份，若樣品還多，將樣品再混合均勻，再反復(fù)進(jìn)行四分法，直至樣品最終重量要求0.5-1公斤（試驗(yàn)用的樣品2公斤）為止。如下示意圖。一用取土器或鋤頭直接挖入耕層取樣。每個(gè)點(diǎn)切取的土塊寬度、厚度應(yīng)基本一致。裝入事先準(zhǔn)備好的塑料袋內(nèi)扎好。北方土壤干燥，可在10～30cm處取樣。

3．采樣方法、數(shù)量：1)面積小，地勢(shì)平坦，肥力均勻的田塊，采用對(duì)角采樣法。2)面積中等，地勢(shì)平整，有些肥力差異的田塊采用棋盤式采樣法。3)面積大，地勢(shì)又不平坦，肥力不勻的田塊采用蛇型線采樣法。土樣由20個(gè)樣點(diǎn)組成。樣點(diǎn)分布范圍不少于3畝（各地可根據(jù)情況確定）。每個(gè)點(diǎn)的取土深度及重量應(yīng)均勻一致，土樣上層和下層的比例也要相同。采樣器應(yīng)垂直于地面，入土至規(guī)定的深度。采樣使用不銹鋼、木、竹或塑料器具。樣品處理、儲(chǔ)存等過(guò)程不要接觸金屬器具和橡膠制品，以防污染。每個(gè)混合樣品一般取1kg左右，如果采集樣品太多，可用“四分法”棄去多余土壤。

4．樣品編號(hào)和檔案紀(jì)錄：做好采樣記錄：土樣編號(hào)、采樣地點(diǎn)及經(jīng)緯度、土壤名稱、采樣深度、采樣日期、采樣人等。

第四篇：土壤中放線菌的采集、分離、培養(yǎng)、發(fā)酵及提取實(shí)驗(yàn)報(bào)告

土壤中放線菌的采集、分離、培養(yǎng)、發(fā)酵及提取

實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?/p>

1、從土壤中分離產(chǎn)抗生素的放線菌

2、放線菌的培養(yǎng)

3、放線菌的發(fā)酵產(chǎn)生活性物質(zhì)

4、放線菌產(chǎn)生的活性物質(zhì)提取。實(shí)驗(yàn)原理：

放線菌是一類呈菌絲狀生長(zhǎng)，主要以孢子繁殖。放線菌與人類的生產(chǎn)和生活關(guān)系極為密切，目前廣泛應(yīng)用的抗生素約80%是各種放線菌所產(chǎn)生的。

許多臨床應(yīng)用的抗生素均由土壤中分離的放線菌產(chǎn)生。采用選擇培養(yǎng)基可分離土壤中的放線菌。產(chǎn)抗生素的放線菌經(jīng)液體培養(yǎng)后，其分泌的抗生素存在于離心所得的上清液中，可采用微生物的抑菌試驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)，從而篩選到所需的抗生素產(chǎn)生菌，并對(duì)其進(jìn)一步培養(yǎng)，繁殖，發(fā)酵，最終提取我們所需的抗生素。實(shí)驗(yàn)器材：

1、土壤

2、培養(yǎng)基：高氏一號(hào)培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基

3、其他：重鉻酸鉀、培養(yǎng)皿、牛津杯、接種環(huán)、酒精燈，無(wú)菌涂棒、三角錐瓶、高壓蒸汽滅菌鍋、天平、藥匙、燒杯、量筒、玻璃棒、試管、牛皮紙、線繩等。實(shí)驗(yàn)步驟：

一、土壤放線菌株的采集

采集樣品：選定取樣點(diǎn)（最好是有機(jī)質(zhì)含量高的菜地），按對(duì)角交叉（五點(diǎn)法）取樣。先除去表層約2cm的土壤，將鏟子插入土中數(shù)次，然后取2～10cm處的土壤。將5點(diǎn)樣品約1kg充分混勻，除去碎石、植物殘根等。

樣品（土壤）處理：室溫風(fēng)干

二、土壤中放線菌的分離、培養(yǎng)

1、配制淀粉培養(yǎng)基

淀粉瓊脂培養(yǎng)基（高氏培養(yǎng)基）

可溶性淀粉2g；硝酸鉀0.1g；磷酸氫二鉀0.05g；氯化鈉0.05g；硫酸鎂0.05g；硫酸亞鐵0.001g；瓊脂2g；水100ml.先把淀粉放在燒杯里，用5ml水調(diào)成糊狀后，倒入95ml水，攪勻后加入其他藥品，使它溶解。加熱到煮沸時(shí)加入瓊脂，不停攪拌，待瓊脂完全溶解后，補(bǔ)足失水。調(diào)整PH到7.2-7.4，分裝后滅菌，備用。

2、土壤懸液梯度稀釋

① 將5.0g土壤加入到50ml滅菌的生理鹽水中，震蕩10min制備土壤懸液。

② 用無(wú)菌吸管吸取1ml土壤懸液，加入到9ml滅菌的生理鹽水中10倍稀釋。

③ 按1：:1稀釋至10-

3、10-

4、10-5，將3塊滅菌平板分別標(biāo)記10-

3、10-

4、10-5，稀釋過(guò)程應(yīng)在無(wú)菌條件下進(jìn)行。

3、將高氏一號(hào)培養(yǎng)基加熱溶化，待冷至55-60℃時(shí)，加入3%的重鉻酸鉀數(shù)滴（大約100ml加0.3ml），混合均勻。分別吸取0.1ml稀釋液于滅菌平皿中，再加入10-15ml恒溫于55℃的含有重鉻酸鉀的淀粉瓊脂培養(yǎng)基中，輕輕旋轉(zhuǎn)混合均勻。

4、平皿倒置于培養(yǎng)箱28℃恒溫培養(yǎng)一周左右。

5、將平皿上的放線菌菌落跳去在淀粉瓊脂平皿上四區(qū)劃線進(jìn)行分離純化，28℃恒溫培養(yǎng)一周左右，觀察放線菌菌落特征。

6、將純化好的菌落轉(zhuǎn)入到斜面，4℃條件下進(jìn)行保存。

三、抗菌譜的測(cè)定

1、挑取一個(gè)放線菌的菌落接種到含有250ml淀粉液體培養(yǎng)基的三角瓶，28℃恒溫培養(yǎng)一周左右。

2、將2ml培養(yǎng)8h的大腸桿菌分別加到200ml滅菌的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中混合均勻，每培養(yǎng)皿中倒入20ml，凝固后待用。

3、在上面培養(yǎng)皿中均勻放入4個(gè)牛津杯，每個(gè)牛津杯中加入1ml放線菌發(fā)酵培養(yǎng)液。培養(yǎng)皿放入37℃培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)12h。

4、測(cè)量抑菌圈的大小。

四、發(fā)酵

1、配制種子培養(yǎng)基

蔗糖22.5g，黃豆粉12.5g，磷酸氫二鉀0.2g，氯化鈉1g，硫酸鈉0.1g，硫酸亞鐵0.01g，碳酸鈣2g，蒸餾水1000ml，PH值7.2,121℃滅菌20min。

2、配制發(fā)酵培養(yǎng)基

蔗糖45g，黃豆粉25g，磷酸氫二鉀0.2g，氯化鈉1g，硫酸鈉0.1g，硫酸亞鐵0.01g，碳酸鈣3g，蒸餾水1000ml，PH7.2。121℃滅菌20min。

3、種子液的制備

將試管斜面菌種轉(zhuǎn)管活化，28℃培養(yǎng)7天后，以接種取一環(huán)孢子轉(zhuǎn)入裝有50ml種子培養(yǎng)基的250ml三角搖瓶中，于28℃200r/min-1 培養(yǎng)4天。

4、發(fā)酵培養(yǎng)

以6%的接種量將種子液轉(zhuǎn)接入裝有50ml初始發(fā)酵培養(yǎng)基的250ml三角搖瓶中，于28℃200r/min-

1培養(yǎng)4天。

5、活性檢測(cè)

發(fā)酵液經(jīng)4000r/ min-1 離心15min，取上清，杯碟法測(cè)定抗菌活性（同三）。

五、提取

1、發(fā)酵液經(jīng)4000r/ min-1 離心15min，取上清，用乙酸乙酯以1:1的比例進(jìn)行萃取。

2、活性檢測(cè)

將萃取液濃縮，杯碟法測(cè)定抗菌活性（同三）。

第五篇：環(huán)境中微生物的檢測(cè)和分離純化實(shí)驗(yàn)報(bào)告

環(huán)境中微生物的檢測(cè)和分離純化

一． 實(shí)驗(yàn)原理

1.微生物的分離與純化

土壤中含有豐富的微生物，可以從中分離純化得到很多有價(jià)值的菌株。

微生物常用的分離方法是平板分離法，根據(jù)某種微生物對(duì)生長(zhǎng)條件的不同要求供給它適宜的培養(yǎng)環(huán)境，再用稀釋涂布平板法或稀釋后平板劃線分離，純化該微生物，直到得到純菌株。

2.平板菌落計(jì)數(shù)法

將待測(cè)樣品經(jīng)適當(dāng)稀釋后，其中微生物充分分散成單個(gè)細(xì)胞，取一定量的稀釋樣液接種到平板上，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)，由每個(gè)單細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖而形成肉眼可見的菌落。統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)，根據(jù)其稀釋倍數(shù)和取樣接種量即可換算出樣品中含的菌落數(shù)。

二． 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

1.土壤稀釋溶液

2.取液器（1000ml 1支），培養(yǎng)箱，培養(yǎng)皿（12個(gè)），無(wú)菌有帽試管，三角瓶，無(wú)菌涂棒，接種環(huán)，1000ml無(wú)菌吸頭若干，記號(hào)筆，酒精燈，火柴，試管架。

三． 實(shí)驗(yàn)步驟

（一）.無(wú)菌平板制備

1.采用疊皿法把牛肉凍蛋白膏培養(yǎng)基倒入滅好菌的培養(yǎng)皿中，制作無(wú)菌平板

（二）.周圍環(huán)境中微生物的檢測(cè)

2.取一平板，分成6個(gè)區(qū)，做好標(biāo)記。同一個(gè)人同一根手指頭按如下要求用力一致進(jìn)行操作：分別用未洗過(guò)的手指頭，自來(lái)水打濕的手指頭，自來(lái)水認(rèn)真洗過(guò)的手指頭，洗手液洗過(guò)一遍的手指頭，洗過(guò)兩遍的，洗手液洗過(guò)又用酒精棉球消毒后的手指頭 在六個(gè)區(qū)上涂抹。（平板1）

3.取一平板，分區(qū)，分別用使用過(guò)的紙巾，硬幣，舊紙幣，餐卡在不同區(qū)拖動(dòng)。（平板2）

4.在培養(yǎng)基上方抖動(dòng)頭發(fā)數(shù)次。（平板3）

5.取一平板，分區(qū)，用無(wú)菌接種環(huán)分別蘸一滴自來(lái)水，河水，豆?jié){在不同區(qū)劃線。（平板4）

6.用無(wú)菌牙簽取一點(diǎn)牙垢在培養(yǎng)基上劃線。（平板5）

7.取兩個(gè)平板，一個(gè)打開在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上放置30分鐘，另一個(gè)在酒精燈火焰邊打開皿蓋1分鐘。（平板6）

8.取一平板，打開蓋，咳幾下。（平板7）

（三）.從土壤中分離微生物

1.采土樣

2.制備土壤稀溶液

3.涂布

吸取100ml稀釋好的土壤稀溶液，較均勻地滴在平板上，再用無(wú)菌涂棒涂布均勻，涂1—2分鐘

4.培養(yǎng)

將培養(yǎng)基平板倒置于37℃下培養(yǎng)24小時(shí)

5.菌落計(jì)數(shù)

四．實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1.平板1：從未洗到用酒精消毒總體趨勢(shì)是菌落數(shù)越來(lái)越少，用自來(lái)水洗過(guò)和用洗手液洗過(guò)一遍的菌落數(shù)差不多；

平板2：舊紙幣和硬幣的菌落數(shù)要多；

平板3：抖頭發(fā)的地方附近長(zhǎng)出許多菌落；

平板4：自來(lái)水菌落最多，其次是河水，河水的菌落分布成“牛”字形，和當(dāng)時(shí)劃線的形狀一樣，再其次是豆?jié){；

平板5：劃線的地方長(zhǎng)出許多菌落；

平板6：放在試驗(yàn)臺(tái)上的平板長(zhǎng)出各種形狀的菌斑菌塊，在酒精燈旁的基本沒有菌落；平板7：咳幾下的基本沒有菌落。

2.三張平板均被大片菌苔完全覆蓋，無(wú)法計(jì)數(shù)。

五． 實(shí)驗(yàn)討論

1.有關(guān)洗手液我了解到大部分洗手液都只有殺菌而沒有除垢作用，因?yàn)槠渲泻?0%到

70%的酒精，酒精含量低于60%，殺菌效果會(huì)很差，我們用的洗手液可能是酒精含量偏低，所以只用洗手液洗手是不夠的。最好的洗手方法是，先用肥皂洗手去除污垢，再使用洗手液殺菌潤(rùn)膚。錢上有很多細(xì)菌，少接觸，勤洗手。經(jīng)查閱有關(guān)資料我了解到，牙垢中的細(xì)菌主要是正?？谇粌?nèi)存在的鏈球菌、厭氧菌等。牙垢堆積到一定厚度之后，其內(nèi)部緊挨牙齒表面的細(xì)菌因?yàn)榕c空氣隔絕開始轉(zhuǎn)入無(wú)氧呼吸。無(wú)氧呼吸在此處產(chǎn)生的酸不能及時(shí)被唾液沖走，因此會(huì)腐蝕琺瑯質(zhì)中的礦物成分，并進(jìn)一步促進(jìn)齲齒的形成。在牙根處堆積的牙垢也會(huì)刺激牙齦，導(dǎo)致牙周炎等牙周疾病。所以要飯后刷牙?？諝庵杏卸喾N多樣的細(xì)菌?？葞紫聸]有細(xì)菌的原因可能是沒有使口腔中噴出的氣流或飛沫落到培養(yǎng)基上。

2.第二個(gè)實(shí)驗(yàn)失敗的原因可能是滴加的溶液過(guò)多，或是取液位置不對(duì)細(xì)菌濃度很大