第一篇：實(shí)驗(yàn)方案-樣本

第三節(jié) 汽車拖拉機(jī)試驗(yàn)計(jì)劃與組織

試驗(yàn)過程分試驗(yàn)準(zhǔn)備、試驗(yàn)實(shí)施和試驗(yàn)總結(jié)三個(gè)階段

一，試驗(yàn)準(zhǔn)備階段

1.制定試驗(yàn)大綱

試驗(yàn)大綱包括下列內(nèi)容：

(1)試驗(yàn)?zāi)康暮腿蝿?wù)》試驗(yàn)的目的決定了試驗(yàn)的類型、試驗(yàn)的規(guī)模與內(nèi)容

(2)試驗(yàn)內(nèi)容與條件》為完成試驗(yàn)任務(wù)所需的試驗(yàn)內(nèi)容、試驗(yàn)程序及試驗(yàn)工作量

(3)試驗(yàn)項(xiàng)目和測量參數(shù)》應(yīng)根據(jù)試驗(yàn)內(nèi)容，列出必須進(jìn)行的試驗(yàn)項(xiàng)目和每項(xiàng)目中必須測量的參數(shù)，并說明由測量參數(shù)求得最后性能指標(biāo)的方法，附必要的計(jì)算公式。

(4)試驗(yàn)儀器》根據(jù)試驗(yàn)項(xiàng)目和測量參數(shù)，選擇試驗(yàn)儀器設(shè)備，提出精度要求

(5)試驗(yàn)技術(shù)和方法》對試驗(yàn)人員的正確操作、檢測數(shù)據(jù)及確保試驗(yàn)成功是十分重要的，尤其要遵守標(biāo)準(zhǔn)的或法規(guī)規(guī)定的實(shí)驗(yàn)程序和方法。

(6)人員組織和分工》明確參加試驗(yàn)人員的職責(zé)，組成試驗(yàn)組織系統(tǒng)。

(7)試驗(yàn)進(jìn)度計(jì)劃》以便使試驗(yàn)工作協(xié)調(diào)和有計(jì)劃進(jìn)行

2.儀器設(shè)備準(zhǔn)備

根據(jù)試驗(yàn)大綱要求，準(zhǔn)備好所需儀器。所有測試儀器與設(shè)備都應(yīng)滿足試驗(yàn)的測量范圍、容量和精度的要求。試驗(yàn)前應(yīng)對各種傳感器進(jìn)行定度，定度的數(shù)據(jù)應(yīng)記錄并填入試驗(yàn)報(bào)告中。

3.人員配備和記錄表格準(zhǔn)備

二，試驗(yàn)實(shí)施階段

一般經(jīng)歷以下幾個(gè)過程：起動(dòng)預(yù)熱、工況監(jiān)測、采樣讀數(shù)和校核數(shù)據(jù)

三，試驗(yàn)總結(jié)階段

試驗(yàn)報(bào)告內(nèi)容一般包括：

○1問題的提出和簡要測試方案?！?試驗(yàn)條件描述，如地面狀況、測試工況、氣溫、風(fēng)向和風(fēng)速等。以便于試驗(yàn)結(jié)果比較和應(yīng)用結(jié)果時(shí)參考?！?試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)與試驗(yàn)方法?！?測試系統(tǒng)儀器選配?！?傳感器定度?！?數(shù)據(jù)處理方法、處理結(jié)果與誤差范圍?！?試驗(yàn)結(jié)果分析?！?結(jié)論?！?存在問題和進(jìn)一步的改進(jìn)意見?！?0附錄，如典型試驗(yàn)記錄曲線、數(shù)據(jù)處理結(jié)果表、試驗(yàn)規(guī)律曲線及工況照片等。

第二篇：課題實(shí)驗(yàn)方案

《如何培養(yǎng)中學(xué)生創(chuàng)造性思維》

課題實(shí)驗(yàn)方案

一、課題研究的目的和意義

1、課題提出的背景：培養(yǎng)中學(xué)生創(chuàng)造性思維是國內(nèi)外教育教學(xué)工作者共同面臨的一個(gè)焦點(diǎn)和難點(diǎn)問題。目前針對這一課題國內(nèi)外都在開展研究探索，并取得了大量成果。如美國在中小學(xué)各學(xué)科教學(xué)目標(biāo)中都增加了創(chuàng)新目標(biāo)，很大程度上推動(dòng)了創(chuàng)新教育的發(fā)展。我國近幾年結(jié)合中學(xué)課程改革的實(shí)踐很多學(xué)者都進(jìn)行了有益地探索，在此課題研究上取得了相當(dāng)大的進(jìn)展，豐富了相關(guān)的教育教學(xué)理論，并用于指導(dǎo)各學(xué)科教學(xué)實(shí)踐，提高了課堂教學(xué)的實(shí)效性和針對性。對于實(shí)施素質(zhì)教育起到了很大的推動(dòng)作用。

2、課題研究的意義：隨著經(jīng)濟(jì)社會(huì)的發(fā)展，人類進(jìn)入知識(shí)經(jīng)濟(jì)的時(shí)代，創(chuàng)新意識(shí)對于21世紀(jì)的發(fā)展至關(guān)重要。“創(chuàng)新是一個(gè)民族進(jìn)步的靈魂，是一個(gè)國家興旺發(fā)達(dá)的不竭動(dòng)力”。創(chuàng)造性思維能力是一種具有高度機(jī)動(dòng)性、靈活性、新穎性的思維活動(dòng)，它既是發(fā)散思維和聚合思維的統(tǒng)一，又是直覺思維與分析思維的綜合。課堂教學(xué)是知識(shí)傳播、掌握的主要基地，是培養(yǎng)創(chuàng)新才能和創(chuàng)新人才的搖籃。創(chuàng)造性思維能力是一個(gè)人綜合素質(zhì)的重要組成部分。中學(xué)生正處于人生成長的關(guān)鍵時(shí)期，因此，培養(yǎng)中學(xué)生的創(chuàng)造性思維能力，既是推進(jìn)新課程改革進(jìn)行素質(zhì)教育的重要任務(wù)，又關(guān)系到中學(xué)生能否全面提高自身素質(zhì)，為一生發(fā)展打下良好基礎(chǔ)。

二、課題研究的理論依據(jù) 課題實(shí)施的理論依據(jù)是科學(xué)發(fā)展觀及素質(zhì)教育理論、創(chuàng)新學(xué)習(xí)理論。圍繞中學(xué)生各學(xué)科教學(xué)改革實(shí)踐和學(xué)生的實(shí)際情況開展研究。堅(jiān)持一切從中學(xué)生實(shí)際出發(fā)，針對其生理特點(diǎn)、心理特征、學(xué)習(xí)基礎(chǔ)等現(xiàn)狀，以課堂教學(xué)為主陣地，以活動(dòng)為載體。充分發(fā)揮學(xué)生的主體作用和教師的主導(dǎo)作用，著力在課堂教學(xué)中引導(dǎo)學(xué)生善于發(fā)現(xiàn)問題，敢于質(zhì)疑和超越，勇于打破常規(guī)，進(jìn)行逆向思維，使學(xué)生在不斷積累知識(shí)，把握已知規(guī)律的基礎(chǔ)上，創(chuàng)新意識(shí)不斷得到激發(fā)，創(chuàng)造潛能不斷得到挖掘，創(chuàng)新能力不斷得到提高。

三、課題研究方法及過程

1、研究方法：立足于目前中學(xué)生實(shí)際，提出相關(guān)研究問題、研究目標(biāo)、形式和具體的切實(shí)可行的實(shí)施方案，按研究計(jì)劃有步驟、有秩序地開展研究實(shí)驗(yàn)活動(dòng)。在不斷發(fā)現(xiàn)問題，不斷解決問題的過程中，將理論與實(shí)踐有機(jī)結(jié)合起來，逐步獲得有價(jià)值的研究成果，最終結(jié)題。

2、研究的步驟：本課題研究周期為2年，自2008年7月至2010年6月，按計(jì)劃分為準(zhǔn)備與培訓(xùn)、實(shí)驗(yàn)與研究、總結(jié)成果三個(gè)階段。第一階段：準(zhǔn)備與培訓(xùn)（自2008年7月至2008年10月）（1）組成課題小組，確定研究方向，明確分工。（2）制定詳細(xì)具體一的課題研究方案。（3）收集整理國內(nèi)外相關(guān)理論研究資料。

（4）制定學(xué)習(xí)計(jì)劃，確定學(xué)習(xí)內(nèi)容，開展與本課題研究相關(guān)理論知識(shí)的學(xué)習(xí)與培訓(xùn)工作。

第二階段：實(shí)驗(yàn)與研究（自2008年10月至2010年1月）（1）進(jìn)行教育教學(xué)實(shí)驗(yàn)研究。在中學(xué)各學(xué)科課堂教學(xué)實(shí)踐中探索，培養(yǎng)學(xué)生創(chuàng)新思維的教學(xué)模式。

（2）課題組成員每月舉行一次小型座談會(huì)，做項(xiàng)目階段性的研究分析，不斷調(diào)整方案，完善過程，不斷取得階段性的成果。

第三階段：總結(jié)實(shí)驗(yàn)成果，指導(dǎo)教學(xué)實(shí)踐（自2010年1月至2010年6月）

（1）整理加工全部教學(xué)實(shí)踐材料和階段性的成果。（2）嘗試將研究理論成果推廣指導(dǎo)教學(xué)，達(dá)到研究的目標(biāo)。（3）課題組撰寫經(jīng)驗(yàn)論文。

四、課題研究的組織管理

1、課題組成員及其它分工為：

吳寶明

男

38歲

中學(xué)高級

課題總負(fù)責(zé)人 陳

超

女

30歲

中學(xué)一級

負(fù)責(zé)資料收集、打印 武

平

女

34歲

中學(xué)一級

負(fù)責(zé)教學(xué)實(shí)驗(yàn)

仇麗鵬

女

40歲

中學(xué)一級

負(fù)責(zé)組織協(xié)調(diào)、會(huì)議召集、記錄

姚智鑫

女

34歲

中學(xué)一級

負(fù)責(zé)教學(xué)實(shí)驗(yàn)

2、研究經(jīng)費(fèi)及保障

本研究課題受到了學(xué)校的高度重視和大力支持，所需人力、物力和經(jīng)費(fèi)確保及其足額到位。

第三篇：基因工程實(shí)驗(yàn)方案

實(shí)驗(yàn)

一、大腸桿菌質(zhì)粒的提取與電泳檢測

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

學(xué)習(xí)質(zhì)粒DNA提取的基本原理，理解各種試劑的作用，掌握質(zhì)粒最常用的提取方法，為基因工程提供載體原料。

二、實(shí)驗(yàn)原理

將一個(gè)有用的目的DNA片段通過重組DNA技術(shù)，送進(jìn)受體細(xì)胞中去進(jìn)行繁殖或表達(dá)的工具較載體。細(xì)菌質(zhì)粒是重組DNA技術(shù)中最常用的載體。質(zhì)粒是一種獨(dú)立于染色體外的穩(wěn)定的遺傳因子，為雙鏈、閉環(huán)的DNA分子，并以超螺旋狀態(tài)存在于宿主細(xì)胞總，大小從1—200kb不等。質(zhì)粒主要發(fā)現(xiàn)于細(xì)菌、放線菌和真菌細(xì)胞中，它具有自主復(fù)制和轉(zhuǎn)錄能力，能在子代細(xì)胞中保持恒定的拷貝數(shù)，并表達(dá)所攜帶的遺傳信息。質(zhì)粒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄依賴于宿主細(xì)胞編碼的某些酶和蛋白質(zhì)，如離開宿主細(xì)胞則不能復(fù)制，而宿主即使沒有質(zhì)粒也可以正常存活。但質(zhì)粒的存在使得宿主細(xì)胞具有一些額外的特性，如對抗生素的抗性等。常用的質(zhì)粒載體大小在2.7—10kb之間。如pBR32、pUC系列、pGEM系列和pBluescript(簡稱pBS)等。

細(xì)菌質(zhì)粒的提取是根據(jù)環(huán)狀質(zhì)粒DNA分子具有相對分子質(zhì)量小，易于復(fù)性的特點(diǎn)進(jìn)行的。在熱或堿性條件下DNA分子雙鏈解開，若此時(shí)將溶液置于復(fù)性條件，由于變性的質(zhì)粒分子能在較短時(shí)間內(nèi)復(fù)性而染色體DNA不能復(fù)性。用堿變性方法提取質(zhì)粒就是利用離子型表明活性劑SDS溶解細(xì)胞膜上的脂肪及蛋白，在pH高達(dá)12.6的堿性條件下染色體DNA氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而變性，成了雜亂無章的片段。而相對分子質(zhì)量較小的質(zhì)粒 DNA的大部分氫鍵也斷裂，但超螺旋共價(jià)閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的兩條互補(bǔ)鏈不完全分離，當(dāng)pH4.8的NaAc或KAc高鹽緩沖液調(diào)節(jié)pH至中性時(shí)，變性的質(zhì)粒DNA可以完全形成互補(bǔ)鏈，又恢復(fù)到原來的構(gòu)型。而染色體DNA不能恢復(fù)而形成纏連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，變性DNA與菌體的蛋白質(zhì)凝聚成塊。經(jīng)過離心，出去的沉淀是變性的染色體DNA和蛋白質(zhì)雜質(zhì)，而上清液中的質(zhì)粒DNA分子，則利用無水乙醇與鹽凝聚形成沉淀。由于乙醇沉淀的時(shí)候，不光DNA還有性質(zhì)相似的RNA也一起被沉淀下來。為了除去RNA，可以利用RNA酶進(jìn)行處理，其后采用苯酚使RNA酶失活。出去RNA酶活性往往會(huì)采用一些復(fù)合物如苯酚、氯仿等，并且苯酚不僅使RNA酶失活，還能有效去除菌體的蛋白質(zhì)等物質(zhì)。因?yàn)橹挥脽o水乙醇沉淀，樣品中還是混有蛋白質(zhì)。所以為了獲得高純度質(zhì)粒，應(yīng)在無水乙醇沉淀前，先用苯酚進(jìn)行處理，以便除去其中的蛋白質(zhì)。

三、實(shí)驗(yàn)試劑

1.含質(zhì)粒的大腸桿菌菌株

LB培養(yǎng)基：1%蛋白胨、0.5%酵母粉、1%Nacl、調(diào)pH7.2 抗生素：氨芐青霉素：母液100mg/mL，工作濃度100ug/mL 溶液I：50 mmol.L-1Tris-HCl，pH7.5，10 mmol.L-1 EDTA，pH8.0，高壓滅菌后室溫保存。

溶液II：0.2 M/LNaOH，1% SDS（以2M NaOH和10% SDS母液現(xiàn)用現(xiàn)配）溶液III：1.32 M KAc（pH4.8），(3mol/L NaAc)高壓滅菌后室溫保存。TE緩沖液（pH=8.0）：10mmol/LTris-Hcl/1mmol/LEDTA 2mg/mLRNase A溶解于10mmol/LTris-Hcl(pH7.5)、15mmol/LNacl 3mol/LNaAc(pH5.2 苯酚/氯仿/異戊醇（PCI）、冰冷無水乙醇、冰冷70%乙醇 堿裂解法小量提取質(zhì)粒DNA步驟如下：

（a）挑單菌落接種于含相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基中，37℃搖菌過夜。（b）每管取1ml菌液然后12,000 g離心30 秒，集菌。（c）加200 ?l溶液I，用振蕩器劇烈振蕩懸浮菌體。（d）加300 ?l新配制的溶液II，溫和顛倒混勻5次以上。

（e）溶液澄清后立即加入300 ?l預(yù)冷的溶液III，混勻后冰上放置5分鐘。（f）4℃、12000 g離心10（或5）分鐘。

（g）取上清，加入等體積的氯仿，顛倒混勻后，4℃、12000 g離心10 分鐘沉淀蛋白。

（h）吸取上清，加等體積異丙醇，混勻。室溫放置10分鐘。

（i）12000 g離心10 分鐘，棄上清，再用75%(v/v)乙醇洗滌沉淀，12000 g離心5分鐘。

(k)沉淀在37 ℃干燥后后溶于適量水或TE（50ul），（-20°C）保存?zhèn)溆谩Ｙ|(zhì)粒DNA的檢測:取5ul的質(zhì)粒與2ul的6×上樣緩沖液混合后，在0.7%凝膠上電泳檢測。

溶液I：50 mmol.L-1Tris-HCl，pH7.5，10 mmol.L-1 EDTA，pH8.0，高壓滅菌后室溫保存。溶液I的作用：

１、任何生物化學(xué)反應(yīng)，首先要控制好溶液的pH，因此可用適當(dāng)濃度和適當(dāng)pH值的Tris-HCl溶液。

２、大家知道EDTA是Ca2+和Mg2+等二價(jià)金屬離子的螯合劑，配在分子生物學(xué)試劑中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生長。在溶液I中加入高達(dá)10 mM的EDTA，無非就是要把大腸桿菌細(xì)胞中的所有二價(jià)金屬離子都螯合掉。

溶液II：0.2 M/LNaOH，1% SDS（以2M NaOH和10% SDS母液現(xiàn)用現(xiàn)配）用新鮮的0.4 N的NaOH和2％的SDS等體積混合后使用的。要新從濃NaOH稀釋制備0.4N的NaOH，無非是為了保證NaOH沒有吸收空氣中的CO2而減弱了堿性。其實(shí)破細(xì)胞的主要是堿，而不是SDS，所以才叫堿法抽提。事實(shí)上NaOH是最佳的溶解細(xì)胞的試劑，不管是大腸桿菌還是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，碰到了堿都會(huì)幾乎在瞬間就溶解，這是由于細(xì)胞膜發(fā)生了從bilayer（雙層膜）結(jié)構(gòu)向micelle（微囊）結(jié)構(gòu)的相變化所導(dǎo)致。

既然是NaOH溶解的細(xì)胞，那為什么要加SDS呢？那是為下一步操作做的鋪墊。這一步要記住兩點(diǎn)：第一，時(shí)間不能過長，千萬不要這時(shí)候去接電話，因?yàn)樵谶@樣的堿性條件下基因組DNA片斷會(huì)慢慢斷裂；第二，必須溫柔混合不然基因組DNA也會(huì)斷裂?；蚪MDNA的斷裂會(huì)帶來麻煩，溶液III：1.32 M KAc（pH4.8），(3mol/L NaAc)高壓滅菌后室溫保存。加入溶液III后出現(xiàn)大量沉淀，這與SDS的加入有關(guān)系。這其實(shí)是十二烷基硫酸鈉遇到鉀離子后變成了十二烷基硫酸鉀（potassium dodecylsulfate, PDS），而PDS是水不溶的，因此發(fā)生了沉淀。如此看來，溶液III加入后的沉淀實(shí)際上是鉀離子置換了SDS中的鈉離子形成了不溶性的PDS，而高濃度的鹽，使得沉淀更完全。大家知道SDS專門喜歡和蛋白質(zhì)結(jié)合，平均兩個(gè)氨基酸上結(jié)合一個(gè)SDS分子，鉀鈉離子置換所產(chǎn)生的大量沉淀自然就將絕大部分蛋白質(zhì)沉淀了，讓人高興的是大腸桿菌的基因組DNA也一起被共沉淀了。這個(gè)過程不難想象，因?yàn)榛蚪MDNA太長了，長長的DNA自然容易被PDS給共沉淀了，盡管SDS并不與DNA分子結(jié)合。

瓊脂糖電泳進(jìn)行鑒定質(zhì)粒DNA時(shí)，多數(shù)情況下你能看到三條帶。其實(shí)這三條帶以電泳速度的快慢排序，分別是超螺旋、開環(huán)和復(fù)制中間體（即沒有復(fù)制完全的兩個(gè)質(zhì)粒連在了一起）。如果你不小心在溶液II加入后過度振蕩，會(huì)有第四條帶，這條帶泳動(dòng)得較慢，遠(yuǎn)離這三條帶，是20-100kb的大腸桿菌基因組DNA的片斷。

實(shí)驗(yàn)

二、DNA片段（PCR或者酶切）的體外連接感受態(tài)細(xì)胞的制備重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化陽性克隆的篩選（抗性篩選、藍(lán)白斑篩選）

大腸桿菌質(zhì)粒DNA的提?。▔A裂解法）

此方法適用于小量質(zhì)粒DNA的提取提取的質(zhì)粒DNA可直接用于酶切PCR擴(kuò)增。1.取1.5ml細(xì)菌培養(yǎng)物于EP管中，4000rpm離心1分鐘，棄上清液，使細(xì)菌沉 淀盡量干燥；

2.將細(xì)菌沉淀重懸于用冰預(yù)冷的100μl 溶液I(50mmol/L葡萄糖，10mmol/L EDTApH8.0，25mmol/LTris-HClpH8.0)中，劇烈振蕩；

3.加入200μl 新配制的溶液II(0.2mol/LNaOH，1％SDS（m/v）)，蓋緊EP管 口，快速顛倒離心管5次，以混合混合物，確保離心管的整個(gè)內(nèi)表面與溶液 II接觸，不要渦旋，置于冰浴中；

4.加入150μl預(yù)冷溶液III(每100ml的溶液III中含60ml5mol/L乙酸鉀，11.5 ml冰乙酸，28.5mlH2O)，蓋緊EP管口，反復(fù)顛倒數(shù)次，使溶液III在粘稠 的細(xì)菌裂解物中分散均勻，之后將管置于冰上3~5分鐘； 5.在最大轉(zhuǎn)速下離心5min，取上清液于另一新EP管；

6.用兩倍體積的乙醇室溫沉淀雙鏈DNA，振蕩混合于室溫放置2分鐘，最大轉(zhuǎn) 速離心5分鐘；

7.小心吸去上清液，將離心管倒置于濾紙上，以使所有液體都流出，在將附于管壁的液滴除盡；

8.加1ml70％乙醇洗滌沉淀，振蕩混合，用12,000g離心2分鐘，棄上清，將 開口的EP管置于室溫使乙醇揮發(fā)，直至EP管中內(nèi)沒有可見的液體存在（5～ 10分鐘），用適量的ddH2O溶解；

9.用0.5μl的RNase37℃溫育5~10分鐘； 10.電泳鑒定。

乙醇沉淀DNA 1.加入1/10體積的乙酸鈉（3mol?L，PH=5.2）于DNA溶液中充分混勻，使其 最終濃度為0.3mol?L；

2.加入2倍體積用冰預(yù)冷的乙醇混合后再次充分混勻置于-20℃中15~30分鐘； 3.12,000g離心10分鐘，小心移出上清液，吸去管壁上所有的液滴；

4.加入1/2離心管容量的70％乙醇，12000g離心2分鐘，小心移出上清液，吸 去管壁上所有的液滴；

5.于室溫下將開蓋的EP管的置于實(shí)驗(yàn)桌上以使殘留的液體揮發(fā)至干； 6.加適量的ddH2O溶解DNA沉淀。

酶切

1.酶切前確定待切樣品的濃度, 并選擇合適的限制性內(nèi)切酶和配套Buffer。2.在離心管中加入如下成分： 10×Buffer 1μl 待切樣品xμl 酶 0.5-1μl 加水補(bǔ)足10μl 3.混勻樣品并短暫離心使樣品沉于管底。

4.將離心管置于37℃中溫育1-3hr，若待切樣品為PCR產(chǎn)物，則可將反應(yīng)時(shí)間 適當(dāng)延長。

5.用未酶切的質(zhì)粒作為對照，瓊脂糖電泳鑒定酶切結(jié)果。注：當(dāng)酶切樣品用于回收而不是鑒定時(shí)，可按比例適當(dāng)加大反應(yīng)體積。雙酶 切可選用二者活性都較高的Buffer或者通用Buffer，但要注意不能有星反應(yīng)。）

連接

1.連接前先電泳確定待連接載體與片段的濃度。2.在離心管中加入如下成分： 10×連接Buffer1μl 待連接的樣品（膠回收產(chǎn)物或PCR產(chǎn)物，載體與片段的mol比為1∶3-5）連接酶0.5-1μl 加水補(bǔ)足10μl 3.混勻樣品并短暫離心使樣品全部沉于管底。

4.將離心管置于連接酶要求的溫度孵育適當(dāng)?shù)臅r(shí)間（根據(jù)不同公司的酶的要求 而定，一般為22℃1-3hr或16℃連接過夜）。

連接完的樣品可直接用于轉(zhuǎn)化，也可放4℃冰箱短期保存。

感受態(tài)細(xì)胞的制備

1.挑取適當(dāng)菌株的E.coli單菌落接種于2mlSOB培養(yǎng)液中，37℃搖床過夜。2.取0.5-1ml過夜培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)種到50mlSOB中，18℃劇烈震蕩，直到A600 達(dá)到0.6。

3.將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到50ml離心管中，4℃4,000rpm/min 離心10min。同時(shí)在冰浴 上配置TB溶液。

4.棄上清，將離心管倒置于濾紙上，使培養(yǎng)液被吸干。

5.取1ml剛配的TB溶液打散菌體沉淀，再加入15mlTB（1/3體積的起始培養(yǎng) 液），冰浴10-15min，4℃4,000rpm/min 離心10min。

6.棄上清，沉淀重懸于4mlTB（1/12.5體積的起始培養(yǎng)液），冰浴10min。

7.加入280μl DMSO，緩緩滴入并輕輕搖晃，使其充分混合均勻，冰浴10min。8.將菌液分裝于EP管中，-80℃或液氮凍存。

9.取兩管感受態(tài)細(xì)胞分別加入1μl無菌ddH2O（陰性對照）和1μl純質(zhì)粒（陽性對照）進(jìn)行轉(zhuǎn)化（見后），以檢測感受態(tài)的質(zhì)量。陰性對照平板上應(yīng)該無菌落 生長，陽性對照平板上菌落數(shù)目的多少顯示感受態(tài)效率的高低。

注：上述溶液均需高壓蒸汽滅菌處理 0.1MK-Pipes(pH=6.7)的配制：

稱取3.02gPipes粉末溶于80mlddH2O中，此時(shí)粉末不能完全溶解，用10N KOH或KOH固體調(diào)節(jié)PH值，只有當(dāng)PH接近6.7時(shí)粉末才能完全溶解，此時(shí) 當(dāng)小心少量地加入KOH直至達(dá)到所需PH值。

轉(zhuǎn)化

1.取100μl感受態(tài)細(xì)胞于冰浴上融化。

2.加入1μl純質(zhì)?；蜻B接產(chǎn)物，輕輕吹打混勻，冰浴30min。3.將菌液放入42℃水浴中熱激90秒，立即放入冰浴中2min。4.加入0.9mlSOC，于37℃恒溫?fù)u床上200rpm×1hr溫育。

5.將菌液4000rpm/min離心3min，留200μl上清將菌體打散，均勻涂布于含適當(dāng)

抗生素的瓊脂平板表面，平板于37℃倒置培養(yǎng)過夜。

i.注：新倒的平板可于37℃培養(yǎng)箱中預(yù)先放置數(shù)小時(shí)至過夜干燥。ii.當(dāng)轉(zhuǎn)化的是TA克隆連接產(chǎn)物時(shí)可在菌液中加入8μl 1MIPTG 和40μl 20mg/mlX-gal以進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。

重組子的篩選和鑒定

重組子可通過酶切進(jìn)行鑒定，也可以利用擴(kuò)增引物通過PCR進(jìn)行鑒定，陽 性重組子能切出所需要的片段或得到相應(yīng)片段的PCR產(chǎn)物。

1.用牙簽挑取平板上的菌落接種于2ml含適當(dāng)抗生素的LB培養(yǎng)基中，37℃搖 床培養(yǎng)過夜。

2.次日取菌液0.2-0.5ml，13,000rpm×3min離心，棄上清，加入20μl ddH2O和 20μl 酚/氯仿，震蕩混勻，13,000rpm×5min離心。

3.取上清進(jìn)行瓊脂糖電泳，加入載體質(zhì)粒DNA作為陰性對照，根據(jù)質(zhì)粒大小 初步篩選重組子，重組子的泳動(dòng)速度應(yīng)該慢于載體質(zhì)粒。4.用堿法小量制備可能是重組子的質(zhì)粒DNA。

5.選取適當(dāng)?shù)拿?，對重組子進(jìn)行酶切分析，酶切體積均為10μl體系。酶切樣品 進(jìn)行瓊脂糖電泳鑒定是否有所需片段。

6.酶切分析正確的重組子分成兩份，一份進(jìn)行測序反應(yīng)，另外一份保種。7.若用PCR法鑒定，則在第2步時(shí)每個(gè)樣本取0.5-1.0μl 菌液為模板進(jìn)行PCR 反應(yīng)，每管反應(yīng)體系最低可少至10μl，PCR產(chǎn)物電泳，能得到所需條帶的樣 本進(jìn)一步提取質(zhì)粒酶切鑒定或送樣品測序。

第四篇：課題實(shí)驗(yàn)方案

《提高小學(xué)生計(jì)算能力實(shí)驗(yàn)與研究》

實(shí)

驗(yàn)

方

案

海豐縣陶河鎮(zhèn)中心小學(xué)課題組

一、課題的提出

《數(shù)學(xué)課程標(biāo)準(zhǔn)》明確指出：人人都能獲得良好的數(shù)學(xué)教育，不同的人在數(shù)學(xué)上獲得不同的發(fā)展。這已是當(dāng)今數(shù)學(xué)課堂教學(xué)中應(yīng)有的理念。計(jì)算是數(shù)學(xué)知識(shí)中的重要內(nèi)容之一，數(shù)學(xué)計(jì)算能力既是一項(xiàng)基本的數(shù)學(xué)能力，也是學(xué)習(xí)數(shù)學(xué)和其他學(xué)科的重要基礎(chǔ)。在小學(xué)數(shù)學(xué)教材中計(jì)算所處的位置非常重要，學(xué)生計(jì)算能力的高低直接影響著數(shù)學(xué)其他知識(shí)的學(xué)習(xí)：數(shù)學(xué)中有些概念的引入需要通過計(jì)算來進(jìn)行；數(shù)學(xué)應(yīng)用題的解題思路、步驟、結(jié)果也要通過計(jì)算來落實(shí)；幾何知識(shí)的教學(xué)要涉及周長、面積、體積的求法，這些公式的推導(dǎo)與運(yùn)用同樣離不開計(jì)算；至于簡易方程、比例和統(tǒng)計(jì)圖表等知識(shí)也無不與計(jì)算密切相關(guān)?？梢妼W(xué)生的計(jì)算能力是至關(guān)重要的。

綜上所述，提高學(xué)生的計(jì)算能力，有助于培養(yǎng)學(xué)生的數(shù)學(xué)素養(yǎng)，有助于培養(yǎng)學(xué)生解決問題的能力，有助于樹立學(xué)生認(rèn)真、細(xì)致、耐心、不畏困難的品質(zhì)。因此，如何提高學(xué)生的計(jì)算能力就成了小學(xué)數(shù)學(xué)教學(xué)重要研究的重要問題。

但是，在實(shí)際學(xué)習(xí)中學(xué)生在計(jì)算方面所反映出來的情況令人擔(dān)憂，學(xué)生的計(jì)算能力不高，由于計(jì)算錯(cuò)誤，直接導(dǎo)致部分學(xué)生的數(shù)學(xué)成績較差。特別是近幾年來，我鎮(zhèn)六年級數(shù)學(xué)畢業(yè)檢測的成績逐年下降，縱觀一份畢業(yè)檢測的數(shù)學(xué)試卷，單純計(jì)算一大題就安排30分以上，第1頁（共7頁）

相當(dāng)部分的學(xué)生得分都在15分以下。學(xué)生計(jì)算能力下降的原因是多方面的：這里面有主觀的因素（學(xué)生自身生理、心理方面的因素）；也有客觀的因素（包括家庭因素以及社會(huì)影響的因素等），我所在的陶河鎮(zhèn)的各小學(xué)都屬農(nóng)村小學(xué)，近幾年在我國加大城市化進(jìn)程中農(nóng)村人進(jìn)城成風(fēng)，陶河鎮(zhèn)也在所難免，造成學(xué)校規(guī)模越來越小，學(xué)生的整體素質(zhì)也大不如前，農(nóng)村的留守兒童也對學(xué)生的學(xué)習(xí)情緒造成一定的影響；還有教師平時(shí)教學(xué)的因素。

基于以上幾種原因，我們提出了“提高小學(xué)生計(jì)算能力實(shí)驗(yàn)與研究”這個(gè)課題。希望以此課題為突破口，跟隨新課標(biāo)的深化實(shí)施，我們面對21世紀(jì)的小學(xué)生，教學(xué)也要與時(shí)俱進(jìn)需要，尋求更好的教學(xué)方法，特別是在計(jì)算教學(xué)方面應(yīng)尋求創(chuàng)新，力求有新的突破。

二、課題研究的目的

1、通過本課題的研究，尋找學(xué)生學(xué)習(xí)非智力因素的影響，然后對癥下藥，排除學(xué)生學(xué)習(xí)的不利因素。使智力活動(dòng)與非智力活動(dòng)相互統(tǒng)一，協(xié)調(diào)一致，相互促進(jìn)，充分地調(diào)動(dòng)學(xué)生的主觀能動(dòng)性，讓學(xué)生養(yǎng)成良好的學(xué)習(xí)習(xí)慣，增強(qiáng)學(xué)習(xí)毅力和意志。

2.通過本課題的研究，找出造成學(xué)生計(jì)算失誤的原因及存在的心理障礙，采取積極的預(yù)防措施，培養(yǎng)學(xué)生在計(jì)算上的興趣，提高學(xué)生的計(jì)算能力

3．通過本課題的研究，提高學(xué)生計(jì)算的正確率、準(zhǔn)確率以及計(jì)算的靈活性，發(fā)展學(xué)生的數(shù)學(xué)思維。

4.通過本課題的研究，促使教師轉(zhuǎn)變教學(xué)觀念，努力營造學(xué)生喜歡的數(shù)學(xué)計(jì)算課堂。在創(chuàng)造性的開發(fā)學(xué)習(xí)資源、設(shè)計(jì)情景及教研的過程中實(shí)現(xiàn)教師專業(yè)的自我成長。在教師中形成敢于實(shí)踐，勇于創(chuàng)新的教研精神。

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三、課題研究的原則

1、導(dǎo)向性原則。小學(xué)數(shù)學(xué)計(jì)算教學(xué)應(yīng)體現(xiàn)數(shù)學(xué)課程標(biāo)準(zhǔn)的要求：體會(huì)四則運(yùn)算的意義，掌握必要的運(yùn)算技能，能準(zhǔn)確進(jìn)行計(jì)算。根據(jù)學(xué)生已有經(jīng)驗(yàn)、心理發(fā)展規(guī)律以及所學(xué)內(nèi)容的特點(diǎn)，采用逐步滲透、深化、螺旋上升的方式編排，以便逐步實(shí)現(xiàn)每一階段的學(xué)習(xí)目標(biāo)。

2、主體性原則。學(xué)生是學(xué)習(xí)的主體，所有的新知識(shí)只有通過學(xué)生自身的“再創(chuàng)造”活動(dòng)，才能納入其認(rèn)知結(jié)構(gòu)中，才可能成為有效的知識(shí)。因此，在評價(jià)時(shí)要尊重學(xué)生，以學(xué)生的基礎(chǔ)和年齡特征出發(fā)，投其所好，使他們主動(dòng)地得到發(fā)展。

3、差異性原則。學(xué)習(xí)心理學(xué)的研究表明，學(xué)生在發(fā)展上是存在差異的，要求沒有差異就意味著不要求發(fā)展。我們要尊重這個(gè)差異，為學(xué)生自由發(fā)展創(chuàng)造足夠的空間，實(shí)現(xiàn)不同的人在數(shù)學(xué)上獲得不同的發(fā)展。

4、激勵(lì)性原則。在教學(xué)中,應(yīng)激發(fā)學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣,使其形成強(qiáng)大的、持久的學(xué)習(xí)動(dòng)力,從而以極高的熱情進(jìn)行學(xué)習(xí),并積極引導(dǎo)他們向某一方面發(fā)展。這是挖掘?qū)W生潛能,提高教學(xué)質(zhì)量,加速人才培養(yǎng)的關(guān)鍵。

5、趣味性原則。有效的數(shù)學(xué)學(xué)習(xí)來自于學(xué)生對數(shù)學(xué)活動(dòng)的參與，而參與的程度卻與學(xué)生學(xué)習(xí)時(shí)產(chǎn)生的情感因素密切相關(guān)。學(xué)生對該知識(shí)感興趣，他就學(xué)得認(rèn)真，做得用心，因此，在設(shè)計(jì)教學(xué)時(shí)，要符合學(xué)生特點(diǎn)，要有趣、要貼近學(xué)生的生活實(shí)際。

四、課題研究的內(nèi)容 我們要研究的內(nèi)容如下：

1、非智力因素對學(xué)生學(xué)習(xí)習(xí)慣影響的分析研究。

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有的學(xué)生計(jì)算能力低，固然有概念不清、沒有真正理解算理、沒有熟練掌握算法等原因，但非智力因素的影響也是不可忽視的。非智力因素包括學(xué)生自身生理、家庭和社會(huì)等因素。

2、利用課堂教學(xué)提高學(xué)生計(jì)算能力的研究。

有關(guān)計(jì)算方面的基礎(chǔ)知識(shí)廣泛分布于小學(xué)數(shù)學(xué)的各冊教材中，要求每位數(shù)學(xué)教師必須熟悉各冊教材的教學(xué)要求，根據(jù)小學(xué)生的認(rèn)知規(guī)律、年齡特征以及知識(shí)基礎(chǔ)精心設(shè)計(jì)教案，靈活調(diào)控教學(xué)過程。在強(qiáng)化基礎(chǔ)知識(shí)的同時(shí)，還要注意培養(yǎng)能力，發(fā)展智力，尋找能夠提高學(xué)生計(jì)算速度和計(jì)算正確率的教學(xué)突破口和教學(xué)訓(xùn)練方法等策略。

3.教師教學(xué)方法的研究。

探索在新課程標(biāo)準(zhǔn)下以提高學(xué)生計(jì)算正確率和速度的指導(dǎo)為特點(diǎn)的課堂教學(xué)模式，要求教師在計(jì)算教學(xué)中與時(shí)俱進(jìn)更新教學(xué)理念。采取靈活多樣教學(xué)方法和教學(xué)技巧

五、課題研究的方法和措施

（一）課題研究的方法：

1、調(diào)查法：深入課堂教學(xué)實(shí)踐進(jìn)行實(shí)地調(diào)查，尋找錯(cuò)誤的原因。

2、文獻(xiàn)研究法：學(xué)習(xí)與本課題相關(guān)的基礎(chǔ)理論，并在科學(xué)理論的指導(dǎo)下來研究分析。

3、個(gè)案研究法：通過對典型錯(cuò)例和課例的分析，找到問題的實(shí)質(zhì)，研究解決問題的有效策略。同時(shí)找出具有普遍意義的、有借鑒價(jià)值的先進(jìn)經(jīng)驗(yàn)，宣傳推廣，為提高計(jì)算教學(xué)的針對性、有效性提供幫助。

4、行動(dòng)研究法：深入課堂，深入教研組，在調(diào)研中發(fā)現(xiàn)問題，針對問題研究對策；開展教學(xué)研究課比賽，給教師提供展示交流的平臺(tái)。

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5、經(jīng)驗(yàn)總結(jié)法。搜集整理課題研究材料，總結(jié)、分析課題研究的經(jīng)驗(yàn)，形成課題研究論文（報(bào)告）。

（二）課題研究的措施：

1、加強(qiáng)計(jì)算教學(xué)，上好新授課，引導(dǎo)學(xué)生主動(dòng)探索，透徹理解算理掌握法則。實(shí)錄計(jì)算教學(xué)實(shí)驗(yàn)課堂教學(xué)案例，依照新課程理論對案例進(jìn)行剖析。

2、培養(yǎng)學(xué)生認(rèn)真、細(xì)致、書寫工整、格式規(guī)范，認(rèn)真審題、分析、自覺檢查驗(yàn)算和獨(dú)立糾正錯(cuò)誤的良好習(xí)慣。

3、開展教學(xué)研究反思和以提高學(xué)生計(jì)算能力為主題的課堂教學(xué)研討活動(dòng)，在教師日常教學(xué)中不斷研究，不斷反思，積累教學(xué)成功的案例。

4、收集錯(cuò)題類型，做到對癥下藥。每堂新授課可以加入前一天作業(yè)中的易錯(cuò)處，讓學(xué)生改錯(cuò)。幾節(jié)新授課后，在練習(xí)課中安排一節(jié)專門以改錯(cuò)類型的課，以鞏固、運(yùn)用新知識(shí)為主要任務(wù)，目的是及時(shí)針對學(xué)生作業(yè)中輸出的錯(cuò)誤信息，集中分析訂正，使學(xué)生準(zhǔn)確掌握新知識(shí)，并在改錯(cuò)中化知識(shí)為能力。

六、課題研究的步驟

本實(shí)驗(yàn)周期為一年，分為三個(gè)階段進(jìn)行。

第一階段：2012年10月至2012年11月。主要組織理論學(xué)習(xí)，確立研究對象，研究目的，制訂實(shí)驗(yàn)方案。

第二階段：2012年11月至2013年5月。課題研究和實(shí)驗(yàn)過程。

1、深入了解學(xué)生計(jì)算能力的現(xiàn)狀及其計(jì)算能力差的根源。

2、召開研討會(huì)，對學(xué)生存在的計(jì)算問題進(jìn)行分析、比較和研究。

3、開展實(shí)驗(yàn)課，邀請名師工作室主持人呂崇平老師等專家指導(dǎo)。

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4、組織學(xué)生參與各種形式的課題實(shí)踐活動(dòng)，實(shí)驗(yàn)現(xiàn)狀分析調(diào)查，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，反復(fù)進(jìn)行探究活動(dòng)操作，積累資料。

5、召開經(jīng)驗(yàn)交流會(huì)，進(jìn)行階段性的成果總結(jié)，將優(yōu)秀課例、教案、論文。

第三階段：2013年5月至2013年7月。收集、整理實(shí)驗(yàn)資料，總結(jié)及撰寫實(shí)驗(yàn)報(bào)告、心得體會(huì)、論文。課題組寫出全程報(bào)告和收集有關(guān)數(shù)據(jù)、教案、課例、體會(huì)、論文向上匯報(bào)，注重“理論——實(shí)踐——理論”的升華過程。

七、課題研究達(dá)到的預(yù)期成果

1、教師探索“如何提高小學(xué)生計(jì)算能力研究”教學(xué)模式的論文2-4篇，分段總結(jié)并努力將成果發(fā)表于各級報(bào)刊上。

2、開展現(xiàn)場教學(xué)活動(dòng)，請專家、同仁指導(dǎo)，寫出優(yōu)秀課例及教案。

3、分階段形成階段實(shí)驗(yàn)報(bào)告和終期實(shí)驗(yàn)報(bào)告，寫出階段性實(shí)驗(yàn)報(bào)告和實(shí)驗(yàn)總結(jié)。

4、請有關(guān)科研單位對課題進(jìn)行結(jié)題評估，并把教學(xué)經(jīng)驗(yàn)推廣。

八、課題組織機(jī)構(gòu)及其分工

1、課題實(shí)驗(yàn)領(lǐng)導(dǎo)小組

組長：林少粒 副組長：陳鴻標(biāo) 陳可親 成員：黃偉慶 劉克引 鄧懷強(qiáng)

2、課題實(shí)驗(yàn)工作指導(dǎo)

呂崇平（名師工作室主持人）陳源德（海豐縣教育局教研室主任）

3、課題研究負(fù)責(zé)人：陳鴻標(biāo)（組織課題組實(shí)驗(yàn)教師開展理論學(xué)習(xí)；組織開展課題實(shí)驗(yàn)研究；組織課題組做好階段小結(jié)及各階段性評價(jià)；組織實(shí)驗(yàn)教師撰寫論文、案例，總結(jié)經(jīng)驗(yàn)，撰寫實(shí)驗(yàn)報(bào)告）。

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4、課題研究成員：陳鴻標(biāo)、鄧懷強(qiáng)、黃杰錦、劉克東、劉克專、劉惠雪、呂偉成、李賽賢（認(rèn)真學(xué)習(xí)課題相關(guān)的理論；做好學(xué)情調(diào)查、分析；開展實(shí)驗(yàn)研究；做好各階段的實(shí)驗(yàn)小結(jié)，撰寫案例、論文）。

九、課題研究實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)

本課題估計(jì)需要的經(jīng)費(fèi)不多，由主持人所在的學(xué)校自籌。

海豐縣陶河鎮(zhèn)中心小學(xué)課題組

2012年10月30日

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第五篇：分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方案

實(shí)驗(yàn)一 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)安全注意事項(xiàng)及分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室所需要的儀器設(shè)備的使用（2學(xué)時(shí)）實(shí)驗(yàn)二 分子材料的采集、保存和植物/動(dòng)物基因組DNA 的分離（8學(xué)時(shí)）實(shí)驗(yàn)三 DNA/RNA 的瓊脂糖凝膠檢測（4學(xué)時(shí)）實(shí)驗(yàn)三 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）（3學(xué)時(shí)）

實(shí)驗(yàn)四 PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠檢測與聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測（6學(xué)時(shí)）實(shí)驗(yàn)五 分子生物學(xué)軟件的使用（4學(xué)時(shí)）

實(shí)驗(yàn)六 生物信息學(xué)（3學(xué)時(shí)）生物信息獲取與利用 實(shí)驗(yàn)考試

實(shí)驗(yàn)三：瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA

【目的要求】

學(xué)習(xí)并掌握DNA瓊脂糖凝膠電泳基本原理和操作，了解如何通過電泳判斷DNA純度、含量和分子量。

【實(shí)驗(yàn)原理】

凝膠電泳是分離、純化和鑒定DNA的常用方法。因?yàn)镈NA分子是兩性解離分子，在pH高于其等電點(diǎn)（約3.5）的中性或堿性溶液中帶負(fù)電荷，在電場中向正極方向泳動(dòng)。DNA凝膠電泳的介質(zhì)主要有兩種：瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠。聚丙烯凝膠的孔徑較小，適合于分離5-500bp的小片段DNA；而瓊脂糖凝膠的孔徑較大，可以分離100bp-60kb的較大片段DNA。不同濃度的瓊脂糖凝膠適合于分離不同大小的DNA片段（表7-1）。

瓊脂糖是從海藻中提取出來的一種線狀高聚物，當(dāng)熔化后再凝固時(shí)就會(huì)形成固體基質(zhì)，具有多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，孔徑大小取決于瓊脂糖濃度。DNA在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)，受到電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)的雙重影響。電荷效應(yīng)由分子所帶的電荷量多少來決定，而分子篩效應(yīng)則與分子大小和構(gòu)象有關(guān)。在一定的電場強(qiáng)度下，DNA分子的泳動(dòng)速度主要取決于分子量大小和構(gòu)象。線狀雙鏈DNA分子在瓊脂糖凝膠介質(zhì)中的遷移率與其分子量的對數(shù)值成反比。分子越大，遷移速度越慢，從而可以將不同大小的DNA分子分開。因此，通過與DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量參照物（MW marker）的遷移率對照，可以鑒定DNA分子的大小。DNA分子的構(gòu)象也可以明顯影響其遷移率。在細(xì)胞內(nèi)質(zhì)粒DNA有3種構(gòu)象：超螺旋的共價(jià)閉環(huán)DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA），松弛型的開環(huán)DNA（open circular DNA，ocDNA）和線性DNA，在瓊脂糖凝膠電泳中，其泳動(dòng)速度依次為：cccDNA >線性DNA >ocDNA，因而未酶切的質(zhì)粒DNA在電泳中多顯示為3條帶，泳動(dòng)速度最快的超螺旋帶越亮，說明質(zhì)粒DNA提取質(zhì)量越好。

表7-1：不同濃度瓊脂糖凝膠對DNA的有效分離范圍

瓊脂糖濃度（%）線性DNA有效分離范圍(kb)0.3 5-60 0.6 1-20 0.7 0.8-10 0.9 0.5-7 1.2 0.4-6 1.5 0.2-4 2.0 0.1-3 DNA的遷移率還與電場強(qiáng)度（即單位長度的電壓降）有關(guān)，電場強(qiáng)度越大，泳動(dòng)速度越快。當(dāng)需要快速觀察電泳結(jié)果時(shí)，可以適當(dāng)加大電場強(qiáng)度。但是電泳分辨率會(huì)隨著電場強(qiáng)度的增大而縮小，因?yàn)楦叻肿痈咚倭鲃?dòng)時(shí)摩擦力增加，相對分子質(zhì)量與移動(dòng)速度就不一定成正比，因此一般電場強(qiáng)度應(yīng)不超過5V/cm。特別是當(dāng)需要較精確測定DNA片段大小、獲得理想的分辨率和漂亮的帶型時(shí)，應(yīng)該適當(dāng)降低電場強(qiáng)度，相應(yīng)的適當(dāng)延長電泳時(shí)間，并選用相對較低的凝膠濃度。

為了顯示凝膠中DNA的泳動(dòng)位置，需要加入染色劑染色。最常用的染色劑是溴化乙錠（ethidium bromide EB）。溴化乙錠可以嵌入核酸雙鏈的配對堿基之間，在紫外線的激發(fā)下發(fā)出橘紅色熒光。一般是在凝膠中直接加入終濃度為0.5μg/ml的溴化乙錠，這樣可以在電泳過程中隨時(shí)利用紫外燈觀察核酸的遷移情況。但是EB與DNA的結(jié)合會(huì)影響DNA的遷移率，因此對于需要較精確測定DNA片段大小、或需根據(jù)熒光強(qiáng)度測定DNA含量時(shí)，EB染色應(yīng)在電泳結(jié)束后再進(jìn)行（將凝膠浸入0.5μg/ml的溴乙錠水溶液中10min即可）。注意：EB是強(qiáng)誘變劑，使用EB必須戴一次性手套，不要灑在桌面地面上，被污染的物品必須專門處理后（加少量漂白粉可使EB分解），再徹底清洗或丟棄。

指示劑溴酚藍(lán)和二甲苯青的作用是指示樣品在凝膠中的遷移過程，以確定終止電泳時(shí)間。在0.6 %、1%、2%瓊脂糖凝膠電泳中，溴酚藍(lán)分別約與1kb、600bp、150bp雙鏈線狀DNA片段的遷移率大致相同。在1%瓊脂糖凝膠中，二甲苯青大致相當(dāng)于2kb雙鏈線狀DNA的位置。【試劑器材】

1．5×TAE：

2．10mg/ml溴化乙錠（EB），避光4℃保存。/ GoldView 常溫保存。3．6×上樣緩沖液（配方見附錄）4．（電泳）瓊脂糖

5． DNA、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

6．DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量marker（λDNA/HindIII）7．水平式電泳槽、電泳儀 8．透射式紫外燈 9．膠帶

10．微波爐或恒溫水浴 11．微量移液器 【操作步驟】

1．稱取瓊脂糖1g，置三角燒瓶中，加入1×TAE 100 ml，置沸水浴或微波爐中加熱，使充分溶解。注意：微波爐煮沸1次可能不能充分溶解，需取出混合后反復(fù)加熱1-2次，注意此時(shí)可能出現(xiàn)爆沸現(xiàn)象，避免蒸汽燙傷。

2．待瓊脂糖溶液冷卻至60-65℃左右時(shí)加入溴化乙錠/5ulGold View，使終濃度為0.5μg/ml，混勻。

3．用膠帶把制膠模具的兩端邊緣封好，置水平位置，選擇孔徑適宜的加樣孔模板（梳子），并垂直安插好。注意梳齒必須與模具底面保持一定距離（約0.5-1mm），防止樣品槽破裂，導(dǎo)致樣品泄漏。

圖3-1：凝膠灌膠過程示意圖

4．將冷卻至50-60℃左右的瓊脂糖溶液緩慢倒入制膠模具中，使凝膠液緩慢展開，直至形成厚度適當(dāng)（一般為0.3-0.5cm）的膠層。小心去除加樣孔周圍的氣泡。室溫靜置30-60分鐘。（如圖3-1）

5．瓊脂糖完全凝固后，小心取出梳子，去掉模具兩端的膠帶，將凝膠放入電泳槽中。6．電泳槽中注入適量0.5×TBE緩沖液，使液面高于凝膠約1mm左右。7．分別取5μl DNA或者2μl PCR產(chǎn)物和約0.5μg DNA分子量marker，加入1/5體積（2ul）的上樣緩沖液，混勻。

8．小心緩慢將樣品上樣于凝膠加樣孔中。記錄樣品加樣孔順序。

9．上樣完成后，盡快開始電泳，以防止樣品漂流。接通電源，注意正負(fù)極是否正確。調(diào)節(jié)電壓在1-5V/cm左右，樣品進(jìn)膠前電壓不要太高。電泳開始后不久就可以觀察到溴酚藍(lán)從加樣孔遷移到凝膠中。

10．根據(jù)指示劑遷移的位置，或根據(jù)反射紫外燈顯示的DNA遷移位置，判斷是否需要終止電泳。切斷電源后，取出凝膠。

11．將凝膠置于透射紫外燈上，打開紫外燈（注意盡量避免使用254nm短波紫外燈，并戴好防護(hù)眼鏡或防護(hù)罩），觀察染色后發(fā)出橘紅色熒光的DNA條帶，拍照記錄。

注意觀察樣品DNA條帶是否清晰，有無拖尾現(xiàn)象，條帶數(shù)量、大小是否正確，判斷樣品DNA分子大小，與預(yù)期大小是否相符，并目測粗略估算樣品DNA含量。【注意事項(xiàng)】

（1）凝膠不能有氣泡。（2）電泳是從負(fù)極到正極。

（3）EB是致癌劑，操作要帶手套?！緦?shí)驗(yàn)安排】

本實(shí)驗(yàn)一天內(nèi)可做完?！咀鳂I(yè)】

寫出實(shí)驗(yàn)步驟及注意事項(xiàng)。

相關(guān)溶液配制

1,50倍TAE緩沖液的配制(pH8.5)配方：2MTris-HAc、100mM EDTA 配制量：1L 配制方法：

1）稱取Tris堿242.3g，置于燒杯中

2）稱取EDTA固體29.3g或Na2EDTA-2H2O固體37.2g 3）加入700mLddH2O，溶解完全 4）加入57mLHAc，充分?jǐn)嚢?5）用HAc調(diào)pH至8.5 6）定容至1L，室溫保存

2，溴化乙錠(EB)【強(qiáng)致癌物】 配制量：100mL 配制方法：

1）1gEB于專用容器中

2）加入100mLddH2O,攪拌數(shù)小時(shí)至溶解完全 3）轉(zhuǎn)移至棕色瓶中，避光保存 3，6×上樣緩沖液Loading Buffer 配方：30mMEDTA；36%（V/V）丙三醇；0.05%溴酚藍(lán)；pH7.0 配制量：100mL 配置方法：

1）6mL EDTA（500mM，pH8.0）加入50ml ddH2O中 2）5mL 1%溴酚藍(lán) 3）取36mL丙三醇

4)用2N的NaOH調(diào)pH=7.0 5）定容至100mL 4，6×甘油上樣緩沖液Loading Buffer 配方、配制量：

成分及終濃度 0.15%溴酚藍(lán)

0.15%二甲苯靑EF 5mmol/L EDTA 50%甘油 水

配制10ml溶液各成分用量 1.5ml 1%溴酚藍(lán)

1.5ml 1%二甲苯靑EF

100ul 0.5mol/L EDTA(pH8.0)3ml 3.9ml

5.GoldView(GV)GoldView(GV)是一種可代替溴化乙錠（EB）的新型核酸染料，其靈敏度與EB相當(dāng)，使用方法與之完全相同，在100ml瓊脂糖膠溶液中加入5μl GoldView?即可。在紫外透射光下雙鏈DNA呈現(xiàn)綠色熒光，也可用于染RNA。

由于未發(fā)現(xiàn)GoldView?有致癌作用，且靈敏度與EB相當(dāng)，將有可能逐漸取代EB而得以廣泛應(yīng)用。

概 述

GoldView?是一種可代替溴化乙錠（EB）的新型核酸染料，采用瓊脂糖電泳檢測DNA時(shí)，GoldView?與核酸結(jié)合后能產(chǎn)生很強(qiáng)的熒光信號，其靈敏度與EB相當(dāng)，使用方法與之完全相同。在紫外透射光下雙鏈DNA呈現(xiàn)綠色熒光，而且也可用于染RNA。

通過Ames試驗(yàn)、小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)、小鼠睪丸精母細(xì)胞染色體畸變試驗(yàn)，致突變性結(jié)果均為陰性；而溴化乙錠（EB）是一種強(qiáng)致癌劑。因此用Goldview?代替EB不失為一種明智的選擇。

使用方法

1.將100ml瓊脂糖凝膠溶液（濃度一般為0.8%~2%）在微波爐中融化。

2.加入5ul GoldView，輕輕搖勻，避免產(chǎn)生氣泡。

3.冷卻至不燙手時(shí)倒膠，待瓊脂糖凝膠完全凝固后上樣電泳。

4.電泳完畢在紫外燈下觀察。若使用數(shù)碼相機(jī)照相記錄，則關(guān)閉相機(jī)的閃光燈，放在自動(dòng)檔即可；若使用凝膠成像系統(tǒng)照相，通過調(diào)節(jié)光圈、曝光時(shí)間，選擇合適的濾光片，可得到成像清晰、背景較低的照片。

注意事項(xiàng)

1.膠厚度不宜超過0.5cm，膠太厚會(huì)影響檢測的靈敏度。

2.加入GoldView的瓊脂糖凝膠反復(fù)融化可能會(huì)對核酸檢測的靈敏度產(chǎn)生一定影響，但不明顯。

3.通過凝膠電泳回收DNA片段時(shí)，建議使用GoldView染色，在自然光下切割DNA條帶，避免紫外線與EB對目的DNA產(chǎn)生的損傷，可明顯提高克隆、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)錄等分子生物學(xué)下游操作的效率。

4.雖然未發(fā)現(xiàn)GoldView有致癌作用，但對皮膚、眼睛會(huì)有一定的刺激，操作時(shí)應(yīng)戴上手套。