第一篇：各省市PCR上崗證匯總大全

根據(jù)《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理辦法》，技術(shù)人員參加省臨檢中心的PCR上崗證培訓(xùn)班，經(jīng)過(guò)考核合格后方可從事臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)工作。

各省臨檢中心每年舉辦一次至兩次，詳見(jiàn)臨床檢驗(yàn)中心網(wǎng)站通知，上半年的培訓(xùn)已結(jié)束，具體情況如下：

1、天津

參加天津市臨床檢驗(yàn)中心培訓(xùn)，獲得“天津市臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員上崗證” 報(bào)名時(shí)間：2016年4月15日前（下次待定）

報(bào)名條件：開(kāi)展或擬開(kāi)展臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)項(xiàng)目的實(shí)驗(yàn)室人員；

從事分子生物學(xué)診斷技術(shù)（含分子病理）的人員；

其它相關(guān)人員。培訓(xùn)費(fèi)用：

1600元/人（含理論培訓(xùn)費(fèi)、實(shí)驗(yàn)材料費(fèi)、資料費(fèi)）、食宿自理

2、浙江省

參加“2016年浙江省臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量保證暨上崗培訓(xùn)班”，合格后頒發(fā)證書(shū)

報(bào)名時(shí)間：2016年3月28日

報(bào)名條件：通過(guò)驗(yàn)收的PCR實(shí)驗(yàn)室中從事PCR檢驗(yàn)的工作人員；

需領(lǐng)PCR上崗證的專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員。

培訓(xùn)費(fèi)用：理論課800元；實(shí)驗(yàn)操作800元；住宿費(fèi)150/天；其它費(fèi)用自理，回單位報(bào)銷(xiāo)

培訓(xùn)內(nèi)容：（1）PCR的基本原理與相關(guān)檢測(cè)技術(shù)及進(jìn)展；（2）臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)的質(zhì)量保證；（3）臨床PCR標(biāo)本的處理、模板制備及保存；（4）熒光PCR檢測(cè)的結(jié)果分析及常見(jiàn)問(wèn)題；（5）臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室的生物安全及防污染措施；（6）PCR實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)收中存在問(wèn)題與解決方案；（7）分子病理診斷中PCR質(zhì)控。

3、上海

“上海市醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)技術(shù)人員上崗培訓(xùn)暨分子診斷新技術(shù)學(xué)習(xí)班”，培訓(xùn)合格后，獲得“上海市臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員上崗證”，方可從事PCR檢驗(yàn)工作。

培訓(xùn)班不接受現(xiàn)場(chǎng)報(bào)名。

培訓(xùn)時(shí)間：2016年3月21日-25日 培訓(xùn)費(fèi)用：2000元/人

培訓(xùn)內(nèi)容：1．醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理辦法和工作導(dǎo)則；2．熒光定量PCR的原理與方法；3．臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)技術(shù)的質(zhì)量要求；4．臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)標(biāo)本管理、生物安全和防污染策略；5．臨床PCR檢測(cè)結(jié)果的分析、判斷和報(bào)告；6．分子診斷技術(shù)方法學(xué)性能驗(yàn)證；7．臨床PCR實(shí)驗(yàn)室常見(jiàn)問(wèn)題分析及整改措施；8．個(gè)體化醫(yī)學(xué)檢測(cè)技術(shù)及質(zhì)量控制。

4、北京

只查到2012年的 培訓(xùn)費(fèi)用：2800元

第二篇：PCR經(jīng)驗(yàn)總結(jié)

PCR經(jīng)驗(yàn)總結(jié)

實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：

（1）DNA處理最好用硅烷化塑料管以防粘附在管壁上，所有緩沖液吸頭、離心管等用前必須高溫高壓處理，常規(guī)消耗用品用后作一次性處理，避免反復(fù)使用造成污染。

（2）PCR操作應(yīng)戴手套并勤于更換，必要時(shí)應(yīng)戴好帽子和口罩，就像做手術(shù)一樣，要有“無(wú)菌觀念”。

（3）成套試劑，小量分裝，專(zhuān)一保存，防止它用。配制試劑用新器具，用后作一次性處理。（4）試劑管用前先瞬時(shí)離心（10s），使液體沉于管底，減少污染手套與加樣器機(jī)會(huì)。（5）最后加模板DNA，馬上蓋好，混勻，瞬時(shí)離心（10s），使水相與有機(jī)相分開(kāi)。加入模板且忌噴霧污染，所有非即用管都應(yīng)蓋嚴(yán)。加模板DNA后應(yīng)更換手套。（6）實(shí)驗(yàn)設(shè)陽(yáng)性、陰性對(duì)照。

還有諸如：移液槍用完要放到最大計(jì)量位置，防止久了彈簧失靈；防止RNA酶污染標(biāo)本；低溫下操作，防降解；試劑有致癌致畸作用，做好個(gè)人防護(hù)；頭腦中各操作步驟要清楚，不要加錯(cuò)試劑。

問(wèn)題及解決方案匯總：

一、假陰性，擴(kuò)增無(wú)條帶

PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有①模板核酸的制備，②引物的質(zhì)量與特異性，③酶的質(zhì)量及活性 ④PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應(yīng)針對(duì)上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析研究。

模板：①模板中含有雜蛋白質(zhì)，②模板中含有酶抑制劑，③模板中蛋白質(zhì)沒(méi)有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白，④在提取制備模板時(shí)丟失過(guò)多，或吸入酚。⑤模板核酸變性不徹底。在酶和引物質(zhì)量好時(shí)，不出現(xiàn)擴(kuò)增帶，極有可能是標(biāo)本的消化處理，模板核酸提取過(guò)程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應(yīng)固定不宜隨意更改。

酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時(shí)使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導(dǎo)致假陰性。需注意的是有時(shí)忘加Taq酶或溴乙錠。

引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對(duì)稱(chēng)，是PCR失敗或擴(kuò)增條帶不理想、容易彌散的常見(jiàn)原因。有些批號(hào)的引物合成質(zhì)量有問(wèn)題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對(duì)稱(chēng)擴(kuò)增，對(duì)策為：①選定一個(gè)好的引物合成單位。②引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無(wú)條帶，此時(shí)做PCR有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時(shí)要平衡其濃度。③引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長(zhǎng)期放冰箱冷藏部分，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。④引物設(shè)計(jì)不合理，如引物長(zhǎng)度不 夠，引物之間形成二聚體等。

Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對(duì)PCR擴(kuò)增效率影響很大，濃度過(guò)高可降低PCR擴(kuò)增的特異性，濃度過(guò)低則影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶。

反應(yīng)體積的改變：通常進(jìn)行PCR擴(kuò)增采用的體積為20ul、30ul、50ul?；?00ul，應(yīng)用多大體積進(jìn)行PCR擴(kuò)增，是根據(jù)科研和臨床檢測(cè)不同目的而設(shè)定，在做小體積如20ul后，再做大體積時(shí)，一定要模索條件，否則容易失敗。

物理原因：變性對(duì)PCR擴(kuò)增來(lái)說(shuō)相當(dāng)重要，如變性溫度低，變性時(shí)間短，極有可能出現(xiàn)假陰性;退火溫度過(guò)低，可致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率退火溫度過(guò)高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴(kuò)增效率。有時(shí)還有必要用標(biāo)準(zhǔn)的溫度計(jì)，檢測(cè)一下擴(kuò)增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。

靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列，其PCR擴(kuò)增是不會(huì)成功的。

二、假陽(yáng)性

出現(xiàn)的PCR擴(kuò)增條帶與目的靶序列條帶一致，有時(shí)其條帶更整齊，亮度更高。

引物設(shè)計(jì)不合適：選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性，因而在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性。需重新設(shè)計(jì)引物。

靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個(gè)基因組或大片段的交叉污染，導(dǎo)致假陽(yáng)性。這種假陽(yáng)性可用以下方法解決：①操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外。②除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或 器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及樣進(jìn)槍頭等均應(yīng)一次性使用。③必要時(shí)，在加標(biāo)本前，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性?？苫ハ嗥唇?，與引物互補(bǔ)后，可擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽(yáng)性的產(chǎn)生，可用巢式PCR來(lái)減輕或消除。

三、出現(xiàn)非特異擴(kuò)增帶

PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致，或大或小，或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶與非特異性擴(kuò)增帶。非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不完全互補(bǔ)、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過(guò)高、退火溫度過(guò)低，及PCR循環(huán)次數(shù)過(guò)多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量，往往一些來(lái)源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來(lái)源的酶則不出現(xiàn)，酶量過(guò)多有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。其對(duì)策有：①必要時(shí)重新設(shè)計(jì)引物。②減低酶量或調(diào)換另一來(lái)源的酶。③降低引物量，適當(dāng)增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。④適當(dāng)提高退火溫度或采用兩步法。

四、出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶

PCR擴(kuò)增有時(shí)出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過(guò)多或酶的質(zhì)量差，dNTP濃度過(guò)高，Mg2+濃度過(guò)高，退火溫度過(guò)低，循環(huán)次數(shù)過(guò)多引起。其對(duì)策有：①減少酶量，或調(diào)換另一來(lái)源的酶。②減少dNTP的濃度。③適當(dāng)降低Mg2+濃度。④增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。

五、出現(xiàn)大量引物二聚體

1.從引物自身著手，重新設(shè)計(jì)引物，這是最根本解決這一問(wèn)題的辦法； 2.可能模板有問(wèn)題；

3.模板濃度過(guò)小，適當(dāng)加大模板量；

4.Taq酶，引物，Mg2+濃度可能過(guò)高，可降低它們的濃度；

5.取你所要加的上下游引物混合后，在100攝氏度下的沸水中煮5分鐘，然后迅速拿出置于冰上瞬時(shí)冷卻，這時(shí)再加入反應(yīng)體系當(dāng)中，引物二聚體就會(huì)消失的；

6.所配Mix中加5%的甘油或者5%的DMSO，可以增強(qiáng)特異性；

7.PCR反應(yīng)體系的配制在冰上進(jìn)行，最后加Taq酶，PCR結(jié)束后，產(chǎn)物勿放置在室溫下過(guò)長(zhǎng)時(shí)間，有人認(rèn)為室溫下有些Taq酶會(huì)將多余的引物合成為二聚體。

8.增加循環(huán)數(shù)；

9.降低退火溫度后有條帶，則應(yīng)逐漸提高溫度，若提高溫度的同時(shí)產(chǎn)物量減少，則考慮增加鎂離子濃度（根據(jù)擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度而定，片段長(zhǎng)則相應(yīng)鎂離子濃度應(yīng)該高一些）；

10.若降低退火溫度，發(fā)現(xiàn)還是只有引物二聚體，而且鎂離子的濃度在20-25mM沒(méi)有區(qū)別，則考慮Buffer等試劑沒(méi)有完全融解、混勻，導(dǎo)致吸取的試劑濃度不對(duì)。11.以上次的PCR產(chǎn)物作模板二次PCR，可以提高引物與模板的特異性，減少引物二聚體，如果兩次時(shí)間間隔短的話，可以把原產(chǎn)物稀釋100－1000倍，如果間隔較長(zhǎng)可以稀釋50－100倍；

六、高GC與復(fù)雜結(jié)構(gòu)的模板處理

將模板置于95℃水浴鍋中處理10分鐘以上，然后置于冰上瞬時(shí)冷卻，可大大降低二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)PCR的影響。

七、長(zhǎng)片段與短片段拼接失敗（定點(diǎn)突變）

在做定點(diǎn)突變時(shí)，倘若突變位點(diǎn)距離基因的某一側(cè)較近（短片段<200bp）時(shí)，通常拼接困難或者難以通過(guò)電泳結(jié)果直觀判斷是否拼接成功。此時(shí)，可在短片段的上方（突變近5’端）或下方（突變近3’端）選取一條載體通用引物與基因另一條引物PCR（控制產(chǎn)物大小>300bp），然后再做基因拼接。確認(rèn)大小無(wú)誤后，再以此產(chǎn)物為模板，用基因首尾引物PCR即可。

八、Long PCR無(wú)條帶

對(duì)于>5Kb片段擴(kuò)增，常規(guī)PCR很難得到較好的條帶，建議①更換更適合于Long PCR的聚合酶；②添加PCR Enhancer調(diào)整體系；③設(shè)計(jì)多對(duì)引物分段擴(kuò)增。

PCR增強(qiáng)劑（PCR Enhancer）：

常見(jiàn)的添加劑有：DMSO，甘油，甲酰胺，硫酸銨，甜菜堿，BSA等，它們對(duì)PCR反應(yīng)的影響雖然有所不同，但都可提高PCR的擴(kuò)增效率。

1.DMSO：解除模板DNA局部二級(jí)結(jié)構(gòu)，增加引物與模板的特異性結(jié)合，使聚合酶更容易在二級(jí)結(jié)構(gòu)處延伸，但是對(duì)酶活有抑制作用，且當(dāng)其濃度大于10％時(shí)還會(huì)降低保真性。

2.甘油：可降低模板溶解溫度（Tm），提高產(chǎn)量，但是對(duì)酶活有抑制作用。3.甲酰胺：促進(jìn)某些“引物－模板”退火，降低帶有二級(jí)結(jié)構(gòu)的DNA的變性溫度。4.硫酸銨：增加反應(yīng)體系的離子強(qiáng)度，改變DNA的變性及退火溫度，調(diào)節(jié)酶活。5.甜菜堿：有利于DNA雙鏈的解開(kāi)，Polymerase的結(jié)合，提高PCR的效率。

第三篇：PCR學(xué)習(xí)心得

參加《臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員上崗培訓(xùn)

班》心得

本人于2015年3月10至15日參加了廣東省臨檢中心舉辦的臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員上崗培訓(xùn)班。通過(guò)學(xué)習(xí)，除了取得廣東省臨檢中心頒發(fā)的培訓(xùn)證書(shū)外，還極大的提高了理論和實(shí)驗(yàn)操作水平，現(xiàn)總結(jié)如下。

此次培訓(xùn)包括理論培訓(xùn)和實(shí)驗(yàn)操作。在理論培訓(xùn)課程當(dāng)中，衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心的李金明教授為我們?cè)敿?xì)講解了《臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)及質(zhì)量管理體系的建立》、《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)的質(zhì)量保證》等內(nèi)容。通過(guò)學(xué)習(xí)，了解到臨床PCR實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)必須遵循各區(qū)獨(dú)立、注意風(fēng)向、因地制宜，方便工作的原則。質(zhì)量管理的內(nèi)涵：寫(xiě)你所做的，做你所寫(xiě)的，記錄你已做的，分析你已做的。認(rèn)識(shí)到臨床標(biāo)本的正確采集、運(yùn)送、保存的重要性，是臨床檢驗(yàn)的質(zhì)量保證的關(guān)鍵性環(huán)節(jié)，是解決涉及實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)的醫(yī)患糾紛的方法之一。同時(shí)通過(guò)病例分析，對(duì)于臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)的檢驗(yàn)前，檢驗(yàn)中，檢驗(yàn)后的質(zhì)量控制，還有實(shí)驗(yàn)的結(jié)果處理和分析有了重新認(rèn)識(shí)。對(duì)于實(shí)驗(yàn)室是否出現(xiàn)污染的鑒別，以及出現(xiàn)污染的處理措施有了深刻了解。

臨床實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展現(xiàn)在經(jīng)歷了三個(gè)時(shí)代，分別是生化診斷時(shí)代，免疫診斷時(shí)代，和和現(xiàn)在的分子（基因）診斷時(shí)代，而現(xiàn)今時(shí)代的標(biāo)志性技術(shù)正是PCR技術(shù)，是反映疾病本質(zhì)的實(shí)驗(yàn)。正是有臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)技術(shù)在癌癥等疾病的診斷方面有了多方應(yīng)用，通過(guò)驅(qū)動(dòng)基因的選擇，為靶向治療患者延長(zhǎng)了生存期。為個(gè)體化診療中對(duì)疾病的鑒別診斷，診治方案的設(shè)定提供重要的參考依據(jù)，同時(shí)也為治療過(guò)程中臨床對(duì)于治療方案的調(diào)整提供依據(jù)。臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)技術(shù)在個(gè)體化診療中是不可或缺的一部分，是其重要的組成部分，具有強(qiáng)大的發(fā)展?jié)摿颓熬啊?/p>

實(shí)驗(yàn)操作內(nèi)容為EGFR突變基因檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中，通過(guò)認(rèn)真學(xué)習(xí)和細(xì)致聽(tīng)講帶教老師的規(guī)范實(shí)驗(yàn)操作，了解到了實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵操作，糾正了平常在臨床實(shí)際工作操作上的一些不良習(xí)慣，為日后規(guī)范檢驗(yàn)操作提供了基礎(chǔ)。通過(guò)分組親自操做實(shí)驗(yàn)，分析和判斷自己的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，做實(shí)驗(yàn)記錄筆記，基本掌握EGFR突變基因檢測(cè)。

通過(guò)為期六天的理論和實(shí)驗(yàn)培訓(xùn)，從中學(xué)習(xí)到了很多知識(shí)，掌握了嚴(yán)格的防污染以及污染的處理措施，了解到實(shí)驗(yàn)室設(shè)置的人流、物流、氣流的走向設(shè)計(jì)原則，解決了日常工作中的實(shí)際問(wèn)題，為日后臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)工作的開(kāi)展打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。了解到臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展方向，受益匪淺。

第四篇：PCR實(shí)驗(yàn)室

高端PCR實(shí)驗(yàn)室控制設(shè)計(jì)說(shuō)明

PCR實(shí)驗(yàn)室即分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，在醫(yī)療、科研、生物技術(shù)方面得到廣泛的應(yīng)用。因其在不同行業(yè)的應(yīng)用各有區(qū)別，在具體設(shè)計(jì)時(shí)也有不同之處，就醫(yī)療機(jī)構(gòu)的應(yīng)用而言，主要使用三區(qū)或四區(qū)設(shè)計(jì)，即試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣品提取區(qū)、擴(kuò)增分析區(qū)；此類(lèi)三區(qū)設(shè)計(jì)時(shí)候應(yīng)用于類(lèi)似熒光定量型或同類(lèi)PCR分析設(shè)備，及擴(kuò)增與分析過(guò)程在設(shè)備內(nèi)一次完成。而四區(qū)設(shè)計(jì)在三區(qū)的基礎(chǔ)上講擴(kuò)增分析區(qū)拆分為擴(kuò)增區(qū)與分析區(qū)適用于其他類(lèi)型的pcr設(shè)備及手工處理。

在PCR實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)上，經(jīng)過(guò)多年的經(jīng)驗(yàn)累積，已經(jīng)在一些關(guān)鍵技術(shù)上達(dá)成了共識(shí)。因?yàn)镻CR實(shí)驗(yàn)中所產(chǎn)生的DNA與RNA片段過(guò)于微小，以至于可以穿透高效過(guò)濾器，所以在實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)上已經(jīng)不在強(qiáng)制要求設(shè)計(jì)高效凈化系統(tǒng)，但是為了提高實(shí)驗(yàn)環(huán)境水平及保護(hù)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的敖貴設(shè)備方面，如果在具備條件的情況下可考慮追加高效空氣凈化系統(tǒng)；建議凈化級(jí)別萬(wàn)級(jí)。在PCR實(shí)驗(yàn)中所產(chǎn)生的DNA與RNA片段污染是一直以來(lái)PCR實(shí)驗(yàn)的重點(diǎn)問(wèn)題。此類(lèi)污染主要至上次試驗(yàn)中所產(chǎn)生的基因片段對(duì)下次試驗(yàn)產(chǎn)生的污染，而且一旦試驗(yàn)環(huán)境中的污染形成后很難處理。因?yàn)橄镜葌鹘y(tǒng)方式對(duì)于基因污染沒(méi)有很良好的效果。所以在PCR實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)中一般將整套實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)為全新風(fēng)型實(shí)驗(yàn)室，這樣而已通過(guò)有效的換氣次數(shù)來(lái)達(dá)到凈化室內(nèi)污染的作用。而在控制方面也有很多不同之處，因?yàn)楦鲉挝粚?duì)PCR實(shí)驗(yàn)的重視程度各有不同，所以在設(shè)計(jì)上也有不同，主要的控制設(shè)計(jì)有定送定排式壓力控制系統(tǒng)、變送定排式壓力控制系統(tǒng)變送變排式壓力控制系統(tǒng)。在控制設(shè)備方面也有很多區(qū)分如壓力無(wú)關(guān)型控制系統(tǒng)、壓力有關(guān)型控制系統(tǒng)。

根據(jù)業(yè)主要求，本PCR實(shí)驗(yàn)室為三區(qū)設(shè)計(jì)，各區(qū)可獨(dú)立使用，不設(shè)置高效過(guò)濾系統(tǒng)等相關(guān)要求，根據(jù)業(yè)主以上要求，我方給出的設(shè)計(jì)方案為壓力無(wú)關(guān)型變送變排壓力控制系統(tǒng)。本系統(tǒng)的特點(diǎn)是，設(shè)備啟動(dòng)后可根據(jù)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)使用節(jié)點(diǎn)調(diào)節(jié)送風(fēng)量及排風(fēng)量來(lái)控制各房間狀態(tài)，系統(tǒng)說(shuō)明見(jiàn)下圖

? 每個(gè)房間可分別控制，使用時(shí)通過(guò)房間開(kāi)關(guān)輸出啟動(dòng)信號(hào)，當(dāng)設(shè)備接到啟動(dòng)信號(hào)時(shí)設(shè)備運(yùn)行，運(yùn)行中根據(jù)管道壓力反饋決定變頻器大小，房間內(nèi)送排風(fēng)量由壓力無(wú)關(guān)型風(fēng)量調(diào)節(jié)閥控制。? 當(dāng)有多個(gè)房間開(kāi)啟或關(guān)閉時(shí)，設(shè)備更加管道壓力反饋，調(diào)節(jié)設(shè)備變頻器增加或減少送排風(fēng)量來(lái)穩(wěn)定管道壓力。各房間內(nèi)壓力又房間內(nèi)的壓力無(wú)關(guān)型定風(fēng)量閥進(jìn)行控制。

? 當(dāng)BSC（生物安全柜，B2全排）開(kāi)啟時(shí)BSC專(zhuān)用供風(fēng)機(jī)組運(yùn)行，BSC-供風(fēng)機(jī)-排風(fēng)機(jī)連鎖運(yùn)轉(zhuǎn)。

? 當(dāng)BSC做變風(fēng)量調(diào)節(jié)時(shí)，根據(jù)房間內(nèi)壓力變化，BSC專(zhuān)用供風(fēng)機(jī)組前安裝的壓力無(wú)關(guān)型變風(fēng)量調(diào)節(jié)閥根據(jù)壓力變化增減送風(fēng)量，確保房間壓力執(zhí)行在可控范圍內(nèi)。

? 當(dāng)房間不適用時(shí)，房間與緩沖間均關(guān)閉電動(dòng)密閉閥，確保房間處在密閉狀態(tài)避免布朗運(yùn)動(dòng)造成的可能污染風(fēng)險(xiǎn)。

? 房間換氣次數(shù)均按照一定凈化標(biāo)準(zhǔn)設(shè)計(jì)，當(dāng)室內(nèi)污染發(fā)生時(shí)，通過(guò)一定時(shí)間的換氣處理后，污染問(wèn)題可以基本解決。? 本系統(tǒng)如果業(yè)主需要，可在室內(nèi)送風(fēng)口末端加裝高效過(guò)濾設(shè)備，房間可升級(jí)為凈化型實(shí)驗(yàn)室。

? 壓力無(wú)關(guān)型風(fēng)閥簡(jiǎn)介：壓力無(wú)關(guān)型風(fēng)閥的特點(diǎn)是不會(huì)根據(jù)管道壓力的變化而影響風(fēng)閥內(nèi)部的送風(fēng)量，在一定管道壓力區(qū)間內(nèi)能夠自行調(diào)節(jié)閥體阻力，來(lái)穩(wěn)定送風(fēng)量，是高端實(shí)驗(yàn)室必備的關(guān)鍵部件，目前此類(lèi)閥體技術(shù)均有國(guó)外生產(chǎn)廠家控制，目前國(guó)內(nèi)主用使用的產(chǎn)品有妥思、文丘里、西門(mén)子等品牌。

第五篇：PCR實(shí)驗(yàn)室

簡(jiǎn)介

Pcr實(shí)驗(yàn)室又叫基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室。PCR是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction)的簡(jiǎn)稱(chēng)。是一種分子生物學(xué)技術(shù)，用于放大特定的DNA片段，可看作生物體外的特殊DNA復(fù)制。通過(guò)DNA基因追蹤系統(tǒng)，能迅速掌握患者體內(nèi)的病毒含量，其精確度高達(dá)納米級(jí)別，精確檢測(cè)乙肝病毒在患者體內(nèi)存在的數(shù)量、是否復(fù)制、是否傳染、傳染性有多強(qiáng)、是否必要服藥、肝功能有否異常改變能及時(shí)判斷病人最適合使用哪類(lèi)抗病毒藥物、判斷藥物療效如何、給臨床治療提供了可靠的檢驗(yàn)依據(jù)

條件

1、必須擁有標(biāo)準(zhǔn)的的PCR熒光實(shí)驗(yàn)室;實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)于1996年由美國(guó)Applied Biosystems公司推出 由于該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它 有特異性更強(qiáng)、有效解決PCR污染問(wèn)題、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)，目前已得到廣 泛應(yīng)用。本文試就其定量原理、方法及參照問(wèn)題作一介紹

2、檢測(cè)設(shè)備必須符合標(biāo)準(zhǔn)PCR熒光實(shí)驗(yàn)室設(shè)置要求;熒光定量PCR儀+實(shí)時(shí)熒光定量試劑+通用電腦+自動(dòng)分析軟件，構(gòu)成PCR-DNA/RNA實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)系統(tǒng)。

3、必須通過(guò)國(guó)家臨床檢驗(yàn)中心的驗(yàn)收和認(rèn)證;

4、檢測(cè)人員必須通過(guò)國(guó)家臨檢中心業(yè)務(wù)培訓(xùn)并取得合格證書(shū);PCR實(shí)驗(yàn)室內(nèi)工作人員必須參加由國(guó)家衛(wèi)生部或各省臨床檢驗(yàn)中心舉辦的臨床基因擴(kuò)增培訓(xùn)班，并持證上崗。PCR實(shí)驗(yàn)室通過(guò)驗(yàn)收，實(shí)驗(yàn)室至少必須應(yīng)有兩個(gè)以上持有“臨床基因檢測(cè)上崗證”。PCR實(shí)驗(yàn)室必須建立嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)室管理制度、建立標(biāo)準(zhǔn)化操作程序（SOP）、建立系列質(zhì)量管理文件等，確保實(shí)驗(yàn)室日常運(yùn)行符合國(guó)家衛(wèi)生部的要求，確保檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、確保實(shí)驗(yàn)室衛(wèi)生安全，確保實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期穩(wěn)定運(yùn)行

5、必須在無(wú)菌無(wú)塵環(huán)境下進(jìn)行操作

功能

能夠?qū)颊卟∏檫M(jìn)行科學(xué)、準(zhǔn)確、實(shí)時(shí)的掌控，并結(jié)合抗HBV與T細(xì)胞免疫來(lái)打破免疫耐受，阻斷肝病病毒復(fù)制的療法、有效的分解肝炎病毒，解決了乙肝病毒易變異、耐藥，病毒復(fù)制模板難以治療，人體免疫耐受狀態(tài)不易打破等醫(yī)學(xué)難題，能迅速消除臨床癥狀，而且有效抑制乙肝病毒復(fù)制，明顯加快e抗原、抗體的血清轉(zhuǎn)換速度，殺滅血液及肝細(xì)胞內(nèi)的病毒，為防止再感染提供了長(zhǎng)期保護(hù)，有效阻斷和逆轉(zhuǎn)肝纖維化、肝硬化進(jìn)程。

建立方法

1、建立樣品準(zhǔn)備區(qū)

這個(gè)區(qū)域?qū)ｉT(mén)用作樣品的準(zhǔn)備，在制備和操作用于核酸提取的試劑時(shí)應(yīng)該采取預(yù)防措施：⑴PCR產(chǎn)物和帶有要擴(kuò)增序列的DNA克隆不能在這個(gè)房間操作。⑵組織培養(yǎng)物、組織標(biāo)本和血清樣品都帶進(jìn)樣品準(zhǔn)備間處理，以根據(jù)應(yīng)用的需要提取DNA或RNA。⑶用于樣品處理的工具不能被用作普通分子克隆的工具，也不能用作操作靶序列。⑷DNA樣品應(yīng)該用有專(zhuān)門(mén)的防護(hù)或正壓活塞式移液管操作，以防止在吸取樣品時(shí)有氣溶膠遺留。⑸大體積樣品應(yīng)該用單獨(dú)包裝的無(wú)菌一次性移液管吸取。⑹管子打開(kāi)前都要簡(jiǎn)短離心以減少氣溶膠的產(chǎn)生，而且管子不能用力崩開(kāi)，這樣會(huì)產(chǎn)生氣溶膠。⑺任何時(shí)候都應(yīng)該穿實(shí)驗(yàn)服和帶手套，手套要經(jīng)常更換，尤其在抽提過(guò)程中每一步之間都要更換。實(shí)驗(yàn)服要專(zhuān)門(mén)用于樣品準(zhǔn)備間，經(jīng)常清洗。

2、樣品準(zhǔn)備和RNA-PCR RNA-PCR的額外步驟需要額外的樣品操作，這樣增加了樣品之間污染的機(jī)會(huì)。為了避免這一問(wèn)題，反轉(zhuǎn)錄一步可以在樣品準(zhǔn)備區(qū)進(jìn)行。在RNA-PCR中應(yīng)用UNG以防止污染的方法也有報(bào)道。

3、建立前PCR區(qū)。

該去專(zhuān)門(mén)用于準(zhǔn)備各種反應(yīng)，這個(gè)區(qū)域必須保持干凈，而且沒(méi)有來(lái)自克隆和樣品準(zhǔn)備的污染。前PCR區(qū)必須要有試劑和準(zhǔn)備，特別是專(zhuān)門(mén)用于前PCR區(qū)的正壓活塞式移液管。

4、PCR實(shí)驗(yàn)室試劑的操作。

⑴所用的所有溶液都應(yīng)該沒(méi)有核酸和（或）核酸酶（DNase和RNase）污染。⑵所有PCR試劑中使用的水都應(yīng)該是高質(zhì)量的－新鮮蒸餾的去離子水，用0.22μm過(guò)濾的，并且是高壓滅菌。⑶在20℃到25℃貯存的試劑建議加點(diǎn)像疊氮鈉一類(lèi)的抗微生物劑，在擴(kuò)增試劑或樣品制備試劑中加入0.025%的疊氮鈉不抑制擴(kuò)增反應(yīng)。⑷所用試劑都應(yīng)該以大體積配制，實(shí)驗(yàn)一下看試劑是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量進(jìn)行貯存。⑸所有試劑和樣品準(zhǔn)備過(guò)程中都要使用一次性滅菌的瓶子和管子。⑹新配制的試劑在用于準(zhǔn)備新的標(biāo)本之前應(yīng)該加以檢驗(yàn)。⑺樣品準(zhǔn)備和前PCR區(qū)所使用的移液管在不使用時(shí)都應(yīng)該小心保存。

5、在前PCR區(qū)建立PCR混合物。

⑴可以把即刻可用的“主混合物”溶液配好、分裝并保存在-20℃或4℃，在實(shí)驗(yàn)室只涉及到擴(kuò)增一種或少數(shù)幾種特異序列時(shí)這樣做很有用。⑵如果你的實(shí)驗(yàn)室使用多套引物，以致于配制包括所有試劑的單一反應(yīng)混合物不夠經(jīng)濟(jì)，可以考慮分裝保存夠一天的PCR成分。⑶作為一個(gè)規(guī)則，應(yīng)該保存一套陰性、弱陽(yáng)性和強(qiáng)陽(yáng)性對(duì)照樣品來(lái)分析樣品配制和PCR前過(guò)程的效率和潔凈程度。而且，你也希望通過(guò)使用一個(gè)已知的弱陽(yáng)性樣品來(lái)驗(yàn)證你的樣品緩沖液以證明里面不含擴(kuò)增抑制物。⑷陰性樣品要與每組樣品同時(shí)做，以分析是否存在樣品與樣品之間的污染以及是否存在PCR產(chǎn)物的污染，陰性對(duì)照應(yīng)該包括核酸以外的所有試劑。⑸當(dāng)做陽(yáng)性對(duì)照時(shí)，有兩個(gè)理由決定了應(yīng)該使用最少數(shù)量的核酸。⑹由于必須有對(duì)照反應(yīng)，對(duì)照模板的特點(diǎn)應(yīng)該予以考慮。

6、控制污染的方法。

已設(shè)計(jì)出很有力的酶學(xué)方法用來(lái)消除一種形式的污染—使用UNG，這一技術(shù)能有效地消除由PCR產(chǎn)物引起的污染。另一種控制污染的方法是使用紫外線，這種方法不能完全消除污染問(wèn)題，但可以將污染降低幾個(gè)數(shù)量級(jí)。

7、后PCR區(qū)PCR完成以后，需要分析樣品并解釋數(shù)據(jù)，應(yīng)該留出一個(gè)專(zhuān)門(mén)用于反應(yīng)后處理樣品的地方。后PCR活動(dòng)中使用的所用試劑、一次性耗材和儀器都必須是專(zhuān)門(mén)用于這一目的，決不能把實(shí)驗(yàn)室這一區(qū)域的試劑或儀器用于任何前PCR活動(dòng)