第一篇：PCR實(shí)驗(yàn)常見問題

【實(shí)驗(yàn)】PCR常見問題總結(jié)

作者: gene121(站內(nèi)聯(lián)系TA)發(fā)布: 2005-07-04 PCR產(chǎn)物的電泳檢測(cè)時(shí)間一般為48h以內(nèi)，有些最好于當(dāng)日電泳檢測(cè)，大于48h后帶型不規(guī)則甚致消失。一.假陰性，不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶

PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有①模板核酸的制備，②引物的質(zhì)量與特異性，③酶的質(zhì)量及活性 ④PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應(yīng)針對(duì)上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析研究。

模板：①模板中含有雜蛋白質(zhì)，②模板中含有Taq酶抑制劑，③模板中蛋白質(zhì)沒有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白，④在提取制備模板時(shí)丟失過多，或吸入酚。⑤模板核酸變性不徹底。在酶和引物質(zhì)量好時(shí)，不出現(xiàn)擴(kuò)增帶，極有可能是標(biāo)本的消化處理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應(yīng)固定不宜隨意更改。

酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時(shí)使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導(dǎo)致假陰性。需注意的是有時(shí)忘加Taq酶或溴乙錠。

引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對(duì)稱，是PCR失敗或擴(kuò)增條帶不理想、容易彌散的常見原因。有些批號(hào)的引物合成質(zhì)量有問題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對(duì)稱擴(kuò)增，對(duì)策為：①選定一個(gè)好的引物合成單位。②引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時(shí)做PCR有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時(shí)要平衡其濃度。③引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長(zhǎng)期放冰箱冷藏部分，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。④引物設(shè)計(jì)不合理，如引物長(zhǎng)度不 夠，引物之間形成二聚體等。

Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對(duì)PCR擴(kuò)增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴(kuò)增的特異性，濃度過低則影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶。

反應(yīng)體積的改變：通常進(jìn)行PCR擴(kuò)增采用的體積為20ul、30ul、50ul?；?00ul，應(yīng)用多大體積進(jìn)行PCR擴(kuò)增，是根據(jù)科研和臨床檢測(cè)不同目的而設(shè)定，在做小體積如20ul后，再做大體積時(shí)，一定要模索條件，否則容易失敗。

物理原因：變性對(duì)PCR擴(kuò)增來說相當(dāng)重要，如變性溫度低，變性時(shí)間短，極有可能出現(xiàn)假陰性;退火溫度過低，可致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率退火溫度過高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴(kuò)增效率。有時(shí)還有必要用標(biāo)準(zhǔn)的溫度計(jì)，檢測(cè)一下擴(kuò)增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。

靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列，其PCR擴(kuò)增是不會(huì)成功的。1假陽(yáng)性

出現(xiàn)的PCR擴(kuò)增條帶與目的靶序列條帶一致，有時(shí)其條帶更整齊，亮度更高。

引物設(shè)計(jì)不合適：選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性，因而在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性。需重新設(shè)計(jì)引物。

靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個(gè)基因組或大片段的交叉污染，導(dǎo)致假陽(yáng)性。這種假陽(yáng)性可用以下方法解決：①操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外。②除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或 器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及樣進(jìn)槍頭等均應(yīng)一次性使用。③必要時(shí)，在加標(biāo)本前，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，與引物互補(bǔ)后，可擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽(yáng)性的產(chǎn)生，可用巢式PCR方法來減輕或消除。2出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶

PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致，或大或小，或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶與非特異性擴(kuò)增帶。非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不完全互補(bǔ)、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環(huán)次數(shù)過多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn)，酶量過多有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。其對(duì)策有：①必要時(shí)重新設(shè)計(jì)引物。②減低酶量或調(diào)換另一來源的酶。③降低引物量，適當(dāng)增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。④適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點(diǎn)法(93℃變性，65℃左右退火與延伸)。3出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶

PCR擴(kuò)增有時(shí)出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引起。其對(duì)策有：①減少酶量，或調(diào)換另一來源的酶。②減少dNTP的濃度。③適當(dāng)降低Mg2+濃度。④增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。二.PCR污染與對(duì)策

PCR反應(yīng)的最大特點(diǎn)是具有較大擴(kuò)增能力與極高的靈敏性，但令人頭痛的問題是易污染，極其微量的污染即可造成假陽(yáng)性的產(chǎn)生。污染原因

(一)標(biāo)本間交叉污染:標(biāo)本污染主要有收集標(biāo)本的容器被污染，或標(biāo)本放置時(shí)，由于密封不嚴(yán)溢于容器外，或容器外粘有標(biāo)本而造成相互間交叉污染;標(biāo)本核酸模板在提取過程中，由于吸樣槍污染導(dǎo)致標(biāo)本間污染;有些微生物標(biāo)本尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴(kuò)散，導(dǎo)致彼此間的污染。

(二)PCR試劑的污染:主要是由于在PCR試劑配制過程中，由于加樣槍、容器、雙蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染.(三)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染:這是PCR反應(yīng)中最主要最常見的污染問題，因?yàn)镻CR產(chǎn)物拷貝量 大(一般為1013拷貝/ml)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于PCR檢測(cè)數(shù)個(gè)拷貝的極限，所以極微量的PCR產(chǎn)物 污染，就可造成假陽(yáng)就可形成假陽(yáng)性。

還有一種容易忽視，最可能造成PCR產(chǎn)物污染的形式是氣溶膠污染;在空氣與液體面摩擦?xí)r就可形成氣溶膠，在操作時(shí)比較劇烈地?fù)u動(dòng)反應(yīng)管，開蓋時(shí)、吸樣時(shí)及污染進(jìn)樣槍的反復(fù)吸樣都可形成氣溶膠而污染.據(jù)計(jì)算一個(gè)氣溶膠顆?？珊?8000拷貝，因而由 其造成的污染是一個(gè)值得特別重視的問題.(四)實(shí)驗(yàn)室中克隆質(zhì)粒的污染:在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室及某些用克隆質(zhì)粒做陽(yáng)性對(duì)照的檢驗(yàn)室，這個(gè)問題也比較常見。因?yàn)榭寺≠|(zhì)粒在單位容積內(nèi)含量相當(dāng)高，另外在純化過程中需用較多的用具及試劑，而且在活細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)粒，由于活細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖的簡(jiǎn)便性及具有很強(qiáng)的生命力，其污染可能性也很大。污染的監(jiān)測(cè)

一個(gè)好的實(shí)驗(yàn)室，要時(shí)刻注意污染的監(jiān)測(cè)，考慮有無污染是什么原因造成的污染，以便采取措施，防止和消除污染。對(duì)照試驗(yàn)

1.陽(yáng)性對(duì)照:在建立PCR反應(yīng)實(shí)驗(yàn)室及一般的檢驗(yàn)單位都應(yīng)設(shè)有PCR陽(yáng)性對(duì)照，它是PCR反應(yīng)是否成功、產(chǎn)物條帶位置及大小是否合乎理論要求的一個(gè)重要的參考標(biāo)志。陽(yáng)性對(duì)照要選擇擴(kuò)增度中等、重復(fù)性好，經(jīng)各種鑒定是該產(chǎn)物的標(biāo)本，如以重組質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照，其含量宜低不宜高(100個(gè)拷貝以下)，但陽(yáng)性對(duì)照尤其是重組質(zhì)粒及高濃度陽(yáng)性標(biāo)本，其對(duì)檢測(cè)或擴(kuò)增樣品污染的可能性很大。因而當(dāng)某一PCR試劑經(jīng)自己使用穩(wěn)定，檢驗(yàn)人員心中有數(shù)時(shí)，在以后的實(shí)驗(yàn)中可免設(shè)陽(yáng)性對(duì)照。

2.陰性對(duì)照:每次PCR實(shí)驗(yàn)務(wù)必做陰性對(duì)照。它包括①標(biāo)本對(duì)照:被檢的標(biāo)本是血清就用鑒定后的正常血清作對(duì)照;被檢的標(biāo)本是組織細(xì)胞就用相應(yīng)的組織細(xì)胞作對(duì)照。②試劑對(duì)照:在PCR試劑中不加模板DNA或RNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以監(jiān)測(cè)試劑是否污染。

3.重復(fù)性試驗(yàn)

4.選擇不同區(qū)域的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增 防止污染的方法

(一)合理分隔實(shí)驗(yàn)室:將樣品的處理、配制PCR反應(yīng)液、PCR循環(huán)擴(kuò)增及PCR產(chǎn)物的鑒定等步驟分區(qū)或分室進(jìn)行，特別注意樣本處理及PCR產(chǎn)物的鑒定應(yīng)與其它步驟嚴(yán)格分開。最好能劃分①標(biāo)本處理區(qū);②PCR反應(yīng)液制備區(qū);③PCR循環(huán)擴(kuò)增區(qū);④PCR產(chǎn)物鑒定區(qū)。其實(shí)驗(yàn)用品及吸樣槍應(yīng)專用，實(shí)驗(yàn)前應(yīng)將實(shí)驗(yàn)室用紫外線消毒以破壞殘留的DNA或RNA。

(二)吸樣槍:吸樣槍污染是一個(gè)值得注意的問題。由于操作時(shí)不慎將樣品或模板核酸吸入槍內(nèi)或粘上槍頭是一個(gè)嚴(yán)重的污染源，因而加樣或吸取模板核酸時(shí)要十分小心，吸樣要慢，吸樣時(shí)盡量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或產(chǎn)生氣溶膠污染。

(三)預(yù)混和分裝PCR試劑:所有的PCR試劑都應(yīng)小量分裝，如有可能，PCR反應(yīng)液應(yīng)預(yù)先配制好，然后小量分裝，-20℃保存。以減少重復(fù)加樣次數(shù)，避免污染機(jī)會(huì)。另外，PCR試劑，PCR反應(yīng)液應(yīng)與樣品及PCR產(chǎn)物分開保存，不應(yīng)放于同一冰盒或同一冰箱。

(四)防止操作人員污染，使用一次性手套、吸頭、小離心管應(yīng)一次性使用。(五)設(shè)立適當(dāng)?shù)年?yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照以能出現(xiàn)擴(kuò)增條帶的最低量的標(biāo)準(zhǔn)病原體核酸為宜，并注意交叉污染的可能性，每次反應(yīng)都應(yīng)有一管不加模板的試劑對(duì)照及相應(yīng)不含有被擴(kuò)增核酸的樣品作陰性對(duì)照。

(六)減少PCR循環(huán)次數(shù)，只要PCR產(chǎn)物達(dá)到檢測(cè)水平就適可而止。

(七)選擇質(zhì)量好的Eppendorf管，以避免樣本外溢及外來核酸的進(jìn)入，打開離心管前應(yīng)先離心，將管壁及管蓋上的液體甩至管底部。開管動(dòng)作要輕，以防管內(nèi)液體濺出。

第二篇：PCR實(shí)驗(yàn)室報(bào)批細(xì)節(jié)、注意事項(xiàng)、常見問題問答

報(bào) 批 細(xì) 節(jié)

1、技術(shù)檔案：

技術(shù)人員簡(jiǎn)歷表、培訓(xùn)檔案、要求有實(shí)質(zhì)性文件如每人的學(xué)歷證書、上崗證、科研成果（課題）、技術(shù)文章、獲獎(jiǎng)證書等的復(fù)印件

2、儀器檔案：

實(shí)驗(yàn)室所有儀器的購(gòu)買、使用、校正、放置地點(diǎn)、出廠編號(hào)、說明書復(fù)印件等

實(shí)驗(yàn)室所有儀器維護(hù)校正記錄如：加樣器、溫度計(jì)、溫濕度計(jì)需出具計(jì)量局校正報(bào)告文件（可每種只校正一套作為標(biāo)準(zhǔn)）。

擴(kuò)增儀需有儀器廠家專業(yè)技術(shù)人員維護(hù)校正報(bào)告，和校正后的參數(shù)。加樣器的出廠編號(hào)、使用時(shí)間、校正記錄。

5700維護(hù)后驗(yàn)證記錄—用同一公司或校準(zhǔn)試劑或用自制質(zhì)控血清并記錄數(shù)值

3、其他細(xì)節(jié): 垃圾處理：按生物污染性制品，交醫(yī)院統(tǒng)一處理。儀器簡(jiǎn)單操作流程

標(biāo)記筆、槍頭盒等一些小物品都要標(biāo)明分區(qū)。儀器的申請(qǐng)、采購(gòu)、使用、驗(yàn)證程序

樣本采集（針對(duì)臨床醫(yī)護(hù)人員）、運(yùn)輸、收集程序 樣品的唯一編號(hào)原則—應(yīng)區(qū)分開不同天、不同種類的標(biāo)本

標(biāo)本的保存程序—包括處理前、剛處理后、報(bào)告發(fā)放后的原始標(biāo)本（原則上至少保留一周）應(yīng)有專人負(fù)責(zé)。

檢測(cè)結(jié)果的保存、備份記錄、質(zhì)控記錄保存，除電腦記錄外應(yīng)有相應(yīng)的手抄記錄（類似于基因日檢測(cè)統(tǒng)計(jì)表類型的）。

抱怨記錄—應(yīng)有時(shí)間、事件（項(xiàng)目）、接待人、處理方法、處理結(jié)果、處理人簽字確認(rèn)

注 意 事 項(xiàng)

1、回答任何問題都應(yīng)與自己寫的SOP文件相一致.“寫你所做的,做你所寫的”.2、SOP文件不能寫的太虛,無法做到的東西不要寫,比如公司版的SOP文件里的加樣器的校準(zhǔn)一般實(shí)驗(yàn)室就做不到.模棱兩可也不要寫,比如“消毒時(shí)間一到兩小時(shí)”不能這樣寫,多少就是多少.3、處理標(biāo)本要在生物安全柜內(nèi),而加樣則在柜外.4、各區(qū)門口要貼有各區(qū)的工作制度,限入標(biāo)志.還要準(zhǔn)備兩個(gè)登記本,一個(gè)來記錄紫外消毒,一個(gè)來記錄工作人員出入.區(qū)內(nèi)還要有一個(gè)工作記錄本,用來記錄各區(qū)每天的工作內(nèi)容,便于監(jiān)測(cè)每天的工作全過程.5、每把槍的用途要清楚,不能弄亂.比如稀釋陽(yáng)模的槍和處理標(biāo)本的槍不可混用.6、普通離心機(jī)處理分泌物標(biāo)本時(shí)應(yīng)在離心后靜置20分鐘才能開蓋.(許斌這樣認(rèn)為)

7、所有儀器、設(shè)備都要有檔案卡.8、所有的清潔消毒要在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后馬上進(jìn)行,尤其是儀器、設(shè)備.像擴(kuò)增儀，每天都要清潔，做完的反應(yīng)管決對(duì)不能留在樣品槽內(nèi)。

9、各區(qū)的拖把、抹布不得混用,標(biāo)記清楚.10、生物防護(hù)意識(shí)要強(qiáng),手套要隨時(shí)更換.生物防護(hù)安全的保證要從三個(gè)方面:制度、硬件、意識(shí)。

11、爆管如何處理:立即停止實(shí)驗(yàn),水浴里的水要倒掉,沖洗.所有可能污染的地方要用消毒液擦洗,紫外照射,通風(fēng)排風(fēng).12、各區(qū)應(yīng)有日常工作核查表,做為每天工作記錄的補(bǔ)充.13、各區(qū)要有泡有消毒液的生物污物桶,用來處理生物垃圾.14、驗(yàn)收組帶來的標(biāo)本要按平時(shí)對(duì)待臨床標(biāo)本一樣處理,要有接收記錄,結(jié)果登記等.15、拒絕電話或代領(lǐng)等非正常方式發(fā)放報(bào)告單.16、存放標(biāo)本的冰箱要上鎖,鑰匙及電腦資料的密碼要由本科室人員專人保管.17、報(bào)告單上要注明試劑的檢測(cè)下限,不能寫成參考范圍.除了有操作者,還要有核校者,且兩者姓名除了電子打印還要用手簽.定量結(jié)果不能有陰陽(yáng)性提示,只能報(bào)數(shù)值.18、SOP文件中PE5700的溫濕度要求應(yīng)該為溫度15－30℃、濕度為< 80％。

19、SOP中

醫(yī)院申報(bào)實(shí)驗(yàn)室注意事項(xiàng)

專家組參觀實(shí)驗(yàn)室回答的問題

1，“你們的冰箱的鐵鏈我可以從底下抽上來，實(shí)驗(yàn)室能做好保密性嗎？

可以的，你們能做到就行，注意保密！

2，實(shí)驗(yàn)室需要配置冷凍離心機(jī)，生物安全柜，如果做HCV時(shí),注意重新添置新實(shí)驗(yàn)室。

3，生物防護(hù)中是否有銳器的防護(hù)注意事項(xiàng)？ 4，實(shí)驗(yàn)室的溫濕度計(jì)的放置位置？ 最好放在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)。

5，實(shí)驗(yàn)室中如何做好離心管抑制物的檢測(cè)？ 而非爆管、裂管的檢測(cè)！

6，在做HCV時(shí)規(guī)定從抽血化驗(yàn)到送達(dá)實(shí)驗(yàn)室要幾個(gè)小時(shí)要有明規(guī)定！3小時(shí)左右！

7，溶血標(biāo)本有何具體的判斷標(biāo)準(zhǔn)？脂血呢？

實(shí)驗(yàn)室末次會(huì)議的提問

1，你們單位（達(dá)安）試劑，當(dāng)我們新鮮標(biāo)本做HBV時(shí)，提取中40微升+40微升提取液處理，待放置過夜后，第二天加樣時(shí)，有的標(biāo)本特難取樣，有何處理辦法？ 2，實(shí)驗(yàn)室中垃圾你們?nèi)绾翁幚淼模?/p>

3，實(shí)驗(yàn)室中陰性標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)后變成陽(yáng)性你怎么辦？（我們實(shí)驗(yàn)室一共有三管陰性陰性對(duì)照，第一個(gè)陰性檢測(cè)管是試劑什么都不加，直接上機(jī)，第二個(gè)陰性檢測(cè)管是試劑中加入在實(shí)驗(yàn)開始時(shí)打開蓋的1.5離心管帶有蒸餾水的，第三個(gè)陰性檢測(cè)管是與實(shí)驗(yàn)一起提取的陰性血清。）4，實(shí)驗(yàn)中如果陽(yáng)性質(zhì)控，陽(yáng)性梯度，標(biāo)本呈陰性請(qǐng)分別解釋？ 5，實(shí)驗(yàn)室必須配置生物安全柜，高速離心機(jī)！

臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)驗(yàn)收現(xiàn)場(chǎng)問卷

（口試和/或筆試）

一.現(xiàn)有一個(gè)患者向你提出：“我在你們醫(yī)院檢測(cè)HBV DNA為陽(yáng)性，但在另一家醫(yī)院檢測(cè)為陰性，你們醫(yī)院是怎么做的檢測(cè)？”，此時(shí)，你怎么辦？

（該題主要是考實(shí)驗(yàn)室人員是否知道并遵守所制定的抱怨處理程序）

二．現(xiàn)有一個(gè)臨床大夫拿著幾張HBV DNA定量PCR檢驗(yàn)報(bào)告單找到PCR實(shí)驗(yàn)室，說：“你們的PCR結(jié)果到底準(zhǔn)不準(zhǔn)，我這個(gè)病人剛開始檢測(cè)，HBV DNA是57×10拷貝數(shù)/ml，用了拉米呋啶治療后二周，再檢測(cè)結(jié)果為3×107拷貝數(shù)/ml，降了不少，但再過二周檢測(cè)，又變成了6×107拷貝數(shù)/ml，升高不少，這到底是怎么回事？”，如果這個(gè)大夫剛好問的是你，你怎么辦？并如何解釋其提出的問題？

(該題除了考實(shí)驗(yàn)室人員是否知道并遵守所制定的抱怨處理程序外，還要求其對(duì)特定PCR檢驗(yàn)的批間變異有充分的認(rèn)識(shí))

回答思路：

這兩題分別對(duì)應(yīng)患者和臨床醫(yī)生提出的抱怨?？键c(diǎn)為你是否按照所制定的程序來處理：無論是患者還是醫(yī)生提出抱怨，我們都應(yīng)該“按照”程序先記錄抱怨人姓名、抱怨內(nèi)容等，然后等問題解決后記錄處理結(jié)果等，最后記錄反饋意見等。

注意：一般問題中出現(xiàn)“此時(shí)，你怎么辦？”，其考核的重點(diǎn)均為“形式”而非“內(nèi)容”。所以題目中無論病人抱怨的是服務(wù)態(tài)度不好還是結(jié)果報(bào)告不準(zhǔn)，醫(yī)生抱怨的是檢測(cè)結(jié)果和臨床診斷不符還是報(bào)告發(fā)放不及時(shí)，回答的方向都應(yīng)該是：“我們接待他們后，先在登記表上記錄抱怨的什么什么相關(guān)信息，做相應(yīng)處理，解決后記錄處理結(jié)果，最后填反饋表，歸檔總結(jié)，跟著以后改進(jìn)等等等等”。對(duì)各種具體問題的處理就按照實(shí)際情況來回答就行。

如果題目中出現(xiàn)要你具體“解釋某某提出的問題”時(shí)，這時(shí)是具體考察某一“內(nèi)容細(xì)節(jié)”了。第二題中看你對(duì)PCR檢驗(yàn)的批間變異有否充分的認(rèn)識(shí)：一般PCR檢測(cè)試劑盒存在著一定的批間甚至批內(nèi)差異，而且PCR檢測(cè)前處理也存在著一定的誤差，分析軟件相關(guān)參數(shù)的選擇也會(huì)使定量結(jié)果發(fā)生變動(dòng)，這是方法學(xué)造成的不可避免的事實(shí)。同一操作人、同一儀器、同一批號(hào)試劑、同一份標(biāo)本同時(shí)做多份平行管，得到的結(jié)果都會(huì)不盡相同。所以我們都會(huì)允許結(jié)果存在一定范圍的偏差，一般為一個(gè)數(shù)量級(jí)的拷貝數(shù)。5×107、3×107和6×107均在允許的誤差范圍內(nèi)，排除了各種影響因素后，出現(xiàn)這種情況很正常，這說明了該病人用藥效果不佳。若定量結(jié)果有1～2個(gè)數(shù)量級(jí)甚至更大的變化才能反映用藥療效。

三．現(xiàn)有一人打電話到科室，說：“我孩子在你們醫(yī)院做了一項(xiàng)丙肝的PCR檢測(cè)，名字叫XXX，請(qǐng)你告訴我檢測(cè)結(jié)果好嗎？”。如果是你剛好接了這個(gè)電話，你會(huì)怎樣去做？

（該題考的是實(shí)驗(yàn)室人員在患者要求以電子郵件、電話、傳真等方式傳遞報(bào)告時(shí)，是否能按相應(yīng)的程序去做）

回答思路： 也是考形式?！皩?duì)于這種非正常的報(bào)告發(fā)放形式，我們按照程序，是這樣這樣處理的?！币?yàn)楦鱾€(gè)醫(yī)院實(shí)際情況不同，所以無論你怎樣處理，只要程序中體現(xiàn)了對(duì)患者結(jié)果的保密原則，具體細(xì)節(jié)不會(huì)太要求。

在程序中按以下幾個(gè)方式寫都是可以的：

1、我們均不以任何非正常形式發(fā)放報(bào)告。（最干脆！就是有點(diǎn)不近人情，不過對(duì)我們來說省事）

2、實(shí)在有特殊情況，可以電話查結(jié)果，其它發(fā)放形式不行。但必須確認(rèn)身份，包括核對(duì)其所查詢的患者姓名、性別、年齡、檢測(cè)項(xiàng)目、送檢醫(yī)生、送檢日期、病區(qū)床號(hào)等情況，并提供患者ID號(hào)。

3、可以通過電話、圖文傳真、電子郵件等形式傳送結(jié)果，和上面一樣，需要核實(shí)身份。（最寬松了，不過麻煩了很多）

要注意的是：這些情況均應(yīng)明確告知查詢者，這幾種非正常形式發(fā)放的報(bào)告均僅為臨床提供參考，實(shí)驗(yàn)的最終結(jié)果以正式檢測(cè)報(bào)告單為準(zhǔn)。特殊情況報(bào)告發(fā)放后需詳細(xì)登記，簽署報(bào)告人姓名，實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)人簽字。

“報(bào)告的正確發(fā)放”為考核重點(diǎn)，一般可能還會(huì)引申出“你們是如何發(fā)放檢測(cè)結(jié)果報(bào)告？”之類的問題，按照程序中寫的實(shí)際情況回答就行的了。只要遵循保密原則就OK。

最簡(jiǎn)單的無非把事情都推給醫(yī)院：說門診患者報(bào)告單送至服務(wù)臺(tái)門診報(bào)告發(fā)放處，由那里的醫(yī)生確認(rèn)身份后發(fā)放。（具體她們是怎么確認(rèn)、確不確認(rèn)這已經(jīng)不關(guān)我們的事了）。

若寫病人到科室領(lǐng)報(bào)告也行，只是“我們?cè)趺创_認(rèn)病人身份”要在程序中體現(xiàn)：詢問相關(guān)信息、根據(jù)收費(fèi)單或病歷唯一條形碼（若醫(yī)院采用計(jì)算機(jī)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)）確認(rèn)等等。

四．現(xiàn)有你科室同事，拿了一份血清標(biāo)本給你，說：“這是我一個(gè)熟人的標(biāo)本，他要做HCV RNA檢測(cè)，剛好他還做生化和免疫檢測(cè)，我從生化標(biāo)本分了一些出來，給你做HCV RNA?！蹦阌X得這樣行嗎？為什么？

（該題主要是考實(shí)驗(yàn)室人員對(duì)有關(guān)標(biāo)本的收集程序是否清楚并遵守）

回答思路：

問到了“為什么？”表示具體考到細(xì)節(jié)了。按照我們的收集程序，做PCR尤其是RNA項(xiàng)目需要獨(dú)立取血，不能從其它檢測(cè)的標(biāo)本中分出一些來做。而且對(duì)RNA標(biāo)本的采集、保存、運(yùn)輸都有嚴(yán)格的要求。

一般驗(yàn)收組會(huì)對(duì)這類問題加以引申。問你每天標(biāo)本在哪兒采集？采血的人員有否經(jīng)過專門培訓(xùn)？采集的標(biāo)本如何保存？

還可以順便問你結(jié)果發(fā)放后的標(biāo)本如何保存、保存在哪兒？保存多久？甚至要你把這多久多久前的標(biāo)本拿出來給他們看。

五．某一天，你在做HBV DNA熒光定量PCR檢測(cè)（方法的定量測(cè)定范圍為103～107拷貝數(shù)/ml）中，發(fā)現(xiàn)有1份標(biāo)本的測(cè)定Ct值超出方法的測(cè)定上限，此時(shí)你怎么辦？對(duì)于沒有特異擴(kuò)增曲線的標(biāo)本你又怎么報(bào)告結(jié)果？

回答思路： 此為具體問題：題目已經(jīng)假設(shè)了方法的定量測(cè)定范圍為103～107拷貝數(shù)/ml，我們就按照這個(gè)假設(shè)來考慮。先看是否為特異擴(kuò)增的曲線（即看曲線是否為標(biāo)準(zhǔn)的S形曲線），若為標(biāo)準(zhǔn)S形曲線表示的確為陽(yáng)性標(biāo)本，Ct值超出檢測(cè)上限，表示未知標(biāo)本HBV DNA濃度過大，不在檢測(cè)線性范圍內(nèi)，應(yīng)該進(jìn)行濃度梯度稀釋（1/

10、1/100、1/1000??），重做實(shí)驗(yàn)，看哪個(gè)梯度處于線性范圍內(nèi)，得到原始濃度乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)即得。

若不是特異擴(kuò)增的曲線（也就是常見的那種前面翹、與閾值線有交點(diǎn)的陰性曲線，計(jì)算機(jī)不會(huì)具體分析，見有交點(diǎn)就給Ct值，而且Ct值還很小，小于測(cè)定上限的Cycle數(shù)），按陰性報(bào)。

六．在PCR檢測(cè)的核酸提取離心中，如發(fā)現(xiàn)有一管離心管出現(xiàn)破裂，此時(shí)你怎么辦？

（該題是考實(shí)驗(yàn)室人員對(duì)于其制定的實(shí)驗(yàn)室及儀器設(shè)備消毒清潔程序是否知道并遵守）

回答思路：

按照離心機(jī)的消毒清潔程序：必須先停止實(shí)驗(yàn)，將破裂管密封放入生物垃圾 桶，再用75%酒精擦拭離心室消毒，用移動(dòng)紫外燈照射30～60分鐘后才能開始實(shí)驗(yàn)。

可以引申出：離心管破裂，可能質(zhì)量有問題，為防止以后同類事情的發(fā)生，按照耗材質(zhì)檢程序進(jìn)行離心管質(zhì)檢實(shí)驗(yàn)，若不合格停止使用，重新購(gòu)買并進(jìn)行質(zhì)檢，合格的耗材才能使用。

七．有一個(gè)PCR實(shí)驗(yàn)室的熒光定量PCR儀如ABI 7000因某種原因搬動(dòng)到了另一個(gè)實(shí)驗(yàn)臺(tái)面，實(shí)驗(yàn)室只是將儀器外表面擦了擦，即用于常規(guī)擴(kuò)增檢測(cè)工作，你覺得該實(shí)驗(yàn)室做得對(duì)嗎？為什么？

（該題是考實(shí)驗(yàn)室人員對(duì)于其制定的PCR儀校準(zhǔn)程序是否知道并遵守）

回答思路：

考核實(shí)驗(yàn)室人員對(duì)于其制定的PCR儀校準(zhǔn)程序是否知道并遵守。儀器移動(dòng)應(yīng)該按照程序進(jìn)行校準(zhǔn)后才能重新用于常規(guī)擴(kuò)增檢測(cè)工作，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

7000型核酸擴(kuò)增熒光檢測(cè)儀為復(fù)雜精密儀器，其校準(zhǔn)工作需由專業(yè)工程師 進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)室聯(lián)系儀器廠家派技術(shù)人員來校準(zhǔn)儀器。

平時(shí)就算不搬動(dòng)儀器，實(shí)驗(yàn)室也應(yīng)與儀器廠家達(dá)成協(xié)議，定期校準(zhǔn)儀器。八．有一位實(shí)驗(yàn)室工作人員在做PCR實(shí)驗(yàn)中，一開始將化驗(yàn)單帶至標(biāo)本處理區(qū)，核酸提取完成后，進(jìn)入了擴(kuò)增區(qū)，但將化驗(yàn)單忘在了標(biāo)本處理區(qū)，此時(shí)，他應(yīng)該怎樣做？

（該題是考實(shí)驗(yàn)室人員對(duì)于其制定的實(shí)驗(yàn)室單一流向工作程序是否知道并遵守）

回答思路：

很簡(jiǎn)單，按照單一流向原則，該實(shí)驗(yàn)員不能直接回2區(qū)拿單，要么請(qǐng)其他當(dāng)日未進(jìn)過擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室的人員幫拿，要么嚴(yán)格按要求淋浴、換衣服后再次進(jìn)入2區(qū)拿化驗(yàn)單。

第三篇：PCR實(shí)驗(yàn)技術(shù)總結(jié)

PCR實(shí)驗(yàn)技術(shù)總結(jié)點(diǎn)擊次數(shù)：422 作者：佚名 發(fā)表于：2008-06-15 20:53 轉(zhuǎn)載請(qǐng)注明來自丁香園

來源：互聯(lián)網(wǎng)

PCR技術(shù)簡(jiǎn)史

一、PCR的最早設(shè)想

核酸研究已有100多年的歷史，本世紀(jì)60年代末、70年代初人們致力于研究基因的體外分離技術(shù)，Korana于1971年最早提出核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想：“經(jīng)過DNA變性，與合適的引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過程便可克隆tRNA基因”。

二、PCR的實(shí)現(xiàn)

1985年美國(guó)PE-Cetus公司人類遺傳研究室的Mullis 等發(fā)明了具有劃時(shí)代意義的聚合酶鏈反應(yīng)。其原理類似于DNA的體內(nèi)復(fù)制，只是在試管中給DNA的體外合成提供以致一種合適的條件---摸板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合適的緩沖體系，DNA變性、復(fù)性及延伸的溫度與時(shí)間。

三、PCR的改進(jìn)與完善

Mullis最初使用的DNA聚合酶是大腸桿菌DNA 聚合酶 I 的Klenow片段，其缺點(diǎn)是：①Klenow酶不耐高溫，90℃會(huì)變性失活，每次循環(huán)都要重新加。②引物鏈延伸反應(yīng)在37℃下進(jìn)行，容易發(fā)生模板和引物之間的堿基錯(cuò)配，其PCR產(chǎn)物特異性較差，合成的DNA片段不均一。此種以Klenow酶催化的PCR技術(shù)雖較傳統(tǒng)的基因擴(kuò)增具備許多突出的優(yōu)點(diǎn)，但由于Klenow酶不耐熱，在DNA模板進(jìn)行熱變性時(shí)，會(huì)導(dǎo)致此酶鈍化，每加入一次酶只能完成一個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)周期，給PCR技術(shù)操作程序添了不少困難。這使得PCR技術(shù)在一段時(shí)間內(nèi)沒能引起生物醫(yī)學(xué)界的足夠重視。

1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶進(jìn)行PCR，其擴(kuò)增的DNA片段很均一，真實(shí)性也較高，只有所期望的一種DNA片段。但每循環(huán)一次，仍需加入新酶。

1988年Saiki 等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌(thermus aquaticus)中提取到一種耐熱DNA聚合酶。此酶具有以下特點(diǎn)：①耐高溫，在70℃下反應(yīng)2h后其殘留活性大于原來的90%，在93℃下反應(yīng)2h后其殘留活性是原來的60%，在95℃下反應(yīng)2h后其殘留活性是原來的40%。②在熱變性時(shí)不會(huì)被鈍化，不必在每次擴(kuò)增反應(yīng)后再加新酶。③大大提高了擴(kuò)增片段特異性和擴(kuò)增效率，增加了擴(kuò)增長(zhǎng)度(2.0Kb)。由于提高了擴(kuò)增的特異性和效率，因而其靈敏性也大大提高。為與大腸桿菌多聚酶I Klenow片段區(qū)別，將此酶命名為Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase)。此酶的發(fā)現(xiàn)使PCR廣泛的被應(yīng)用。

PCR技術(shù)的基本原理

類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火--延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：

（一）模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；

（二）模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；

（三）引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。(Plateau)。到達(dá)平臺(tái)期所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。

PCR的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)

PCR的三個(gè)反應(yīng)步驟反復(fù)進(jìn)行，使DNA擴(kuò)增量呈指數(shù)上升。反應(yīng)最終的DNA 擴(kuò)增量可用Y＝(1＋X)n計(jì)算。Y代表DNA片段擴(kuò)增后的拷貝數(shù)，X表示平(Y)均每次的擴(kuò)增效率，n代表循環(huán)次數(shù)。平均擴(kuò)增效率的理論值為100%，但在實(shí)際反應(yīng)中平均效率達(dá)不到理論值。反應(yīng)初期，靶序列DNA片段的增加呈指數(shù)形式，隨著PCR產(chǎn)物的逐漸積累，被擴(kuò)增的DNA 片段不再呈指數(shù)增加，而進(jìn)入線性增長(zhǎng)期或靜止期，即出現(xiàn)“停滯效應(yīng)” 這種效應(yīng)稱平臺(tái)期數(shù)、PCR 擴(kuò)增效率及DNA聚合酶PCR的種類和活性及非特異性產(chǎn)物的竟?fàn)幍纫蛩?。大多?shù)情況下，平臺(tái)期的到來是不可避免的。

PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件

一、標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系：

10×擴(kuò)增緩沖液10ul 4種dNTP混合物各200umol/L 引物各10～100pmol 模板DNA0.1～2ug Taq DNA聚合酶2.5u Mg2+1.5mmol/L 加雙或三蒸水至100ul

二、PCR反應(yīng)五要素

參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+

（一）引物

引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴(kuò)增。

設(shè)計(jì)引物應(yīng)遵循以下原則：

1、引物長(zhǎng)度： 15-30bp，常用為20bp左右。

2、引物擴(kuò)增跨度： 以200-500bp為宜，特定條件下可擴(kuò)增長(zhǎng)至10kb的片段。

3、引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC最好隨機(jī)分布，避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

4、避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補(bǔ)，特別是3'端的互補(bǔ)，否則會(huì)形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶。

5、引物3'端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì)，以避免因末端堿基不配對(duì)而導(dǎo)致PCR失敗。

6、引物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn)，被擴(kuò)增的靶序列最好有適宜的酶切位點(diǎn)，這對(duì)酶切分析或分子克隆很有好處。

7、引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)的其它序列無明顯同源性。引物量： 每條引物的濃度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好，引物濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增，且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會(huì)。

（二）酶及其濃度

目前有兩種Taq DNA聚合酶供應(yīng)，一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶，另一種為大腸菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反應(yīng)約需酶量2。5U(指總反應(yīng)體積為100ul時(shí))，濃度過高可引起非特異性擴(kuò)增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少。

（三）dNTP的質(zhì)量與濃度

dNTP的質(zhì)量與濃度和PCR擴(kuò)增效率有密切關(guān)系，dNTP粉呈顆粒狀，如保存不當(dāng)易變性失去生物學(xué)活性。dNTP溶液呈酸性，使用時(shí)應(yīng)配成高濃度后，以1M NaOH或1M Tris。HCL的緩沖液將其PH調(diào)節(jié)到7.0～7.5，小量分裝，-20℃冰凍保存。多次凍融會(huì)使dNTP降解。在PCR反應(yīng)中，dNTP應(yīng)為50～200umol/L，尤其是注意4種dNTP的濃度要相等(等摩爾配制)，如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(shí)(偏高或偏低)，就會(huì)引起錯(cuò)配。濃度過低又會(huì)降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。dNTP能與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度降低。

（四）模板(靶基因)核酸

模板核酸的量與純化程度，是PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，傳統(tǒng)的DNA純化方法通常采用SDS和蛋白酶K來消化處理標(biāo)本。SDS的主要功能是： 溶解細(xì)胞膜上的脂類與蛋白質(zhì)，因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜，并解離細(xì)胞中的核蛋白，SDS 還能與蛋白質(zhì)結(jié)合而沉淀； 蛋白酶K能水解消化蛋白質(zhì)，特別是與DNA結(jié)合的組蛋白，再用有機(jī)溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質(zhì)和其它細(xì)胞組份，用乙醇或異丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作為模板用于PCR反應(yīng)。一般臨床檢測(cè)標(biāo)本，可采用快速簡(jiǎn)便的方法溶解細(xì)胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質(zhì)使靶基因游離，直接用于PCR擴(kuò)增。RNA模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。

（五）Mg2+濃度 Mg2+對(duì)PCR擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響，在一般的PCR反應(yīng)中，各種dNTP濃度為200umol/L時(shí)，Mg2+濃度為1.5～2.0mmol/L為宜。Mg2+濃度過高，反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，濃度過低會(huì)降低Taq DNA聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少。

三、PCR反應(yīng)條件的選擇

PCR反應(yīng)條件為溫度、時(shí)間和循環(huán)次數(shù)。

（一）溫度與時(shí)間的設(shè)置

基于PCR原理三步驟而設(shè)置變性-退火-延伸三個(gè)溫度點(diǎn)。在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)中采用三溫度點(diǎn)法，雙鏈DNA在90～95℃變性，再迅速冷卻至40 ～60℃，引物退火并結(jié)合到靶序列上，然后快速升溫至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。對(duì)于較短靶基因(長(zhǎng)度為100～300bp時(shí))可采用二溫度點(diǎn)法，除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一，一般采用94℃變性，65℃左右退火與延伸（此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性）。

1、變性溫度與時(shí)間

變性溫度低，解鏈不完全是導(dǎo)致PCR失敗的最主要原因。一般情況下，93℃～94℃lmin足以使模板DNA變性，若低于93℃則需延長(zhǎng)時(shí)間，但溫度不能過高，因?yàn)楦邷丨h(huán)境對(duì)酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或PCR產(chǎn)物完全變性，就會(huì)導(dǎo)致PCR失敗。

2、退火(復(fù)性)溫度與時(shí)間

退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素。變性后溫度快速冷卻至40℃～60℃，可使引物和模板發(fā)生結(jié)合。由于模板DNA 比引物復(fù)雜得多，引物和模板之間的碰撞結(jié)合機(jī)會(huì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于模板互補(bǔ)鏈之間的碰撞。退火溫度與時(shí)間，取決于引物的長(zhǎng)度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長(zhǎng)度。對(duì)于20個(gè)核苷酸，G+C含量約50%的引物，55℃為選擇最適退火溫度的起點(diǎn)較為理想。引物的復(fù)性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度：

Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)＋2(A+T)復(fù)性溫度=Tm值-(5～10℃)在Tm值允許范圍內(nèi)，選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合，提高PCR反應(yīng)的特異性。復(fù)性時(shí)間一般為30～60sec，足以使引物與模板之間完全結(jié)合。

3、延伸溫度與時(shí)間

Taq DNA聚合酶的生物學(xué)活性：

70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子

70℃ 60核苷酸/S/酶分子

55℃ 24核苷酸/S/酶分子

高于90℃時(shí)，DNA合成幾乎不能進(jìn)行。

PCR反應(yīng)的延伸溫度一般選擇在70～75℃之間，常用溫度為72℃，過高的延伸溫度不利于引物和模板的結(jié)合。PCR延伸反應(yīng)的時(shí)間，可根據(jù)待擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度而定，一般1Kb以內(nèi)的DNA片段，延伸時(shí)間1min是足夠 的。3～4kb的靶序列需3～4min；擴(kuò)增10Kb需延伸至15min。延伸進(jìn)間過長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增帶的出現(xiàn)。對(duì)低濃度模板的擴(kuò)增，延伸時(shí)間要稍長(zhǎng)些。

（二）循環(huán)次數(shù) 循環(huán)次數(shù)決定PCR擴(kuò)增程度。PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。一般的循環(huán)次數(shù)選在30～40次之間，循環(huán)次數(shù)越多，非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多。

PCR反應(yīng)特點(diǎn)

一、特異性強(qiáng)

PCR反應(yīng)的特異性決定因素為：

（一）引物與模板DNA特異正確的結(jié)合；

（二）堿基配對(duì)原則；

（三）Taq DNA聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性；

（四）靶基因的特異性與保守性。

其中引物與模板的正確結(jié)合是關(guān)鍵。引物與模板的結(jié)合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對(duì)原則的。聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性及Taq DNA聚合酶耐高溫性，使反應(yīng)中模板與引物的結(jié)合(復(fù)性)可以在較高的溫度下進(jìn)行，結(jié)合的特異性大大增加，被擴(kuò)增的靶基因片段也就能

保持很高的正確度。再通過選擇特異性和保守性高的靶基因區(qū)，其特異性程度就更高。

二、靈敏度高

PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的，能將皮克(pg=10-12)量級(jí)的起始待測(cè)模板擴(kuò)增到微克(ug=-6)水平。能從100萬個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞；在病毒的檢測(cè)中，PCR的靈敏度可達(dá)3個(gè)RFU(空斑形成單位)；在細(xì)菌學(xué)中最小檢出率為3個(gè)細(xì)菌。

三、簡(jiǎn)便、快速 PCR反應(yīng)用耐高溫的Taq DNA聚合酶，一次性地將反應(yīng)液加好后，即在DNA擴(kuò)增液和水浴鍋上進(jìn)行變性-退火-延伸反應(yīng)，一般在2～4 小時(shí)完成擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無放射性污染、易推廣。

四、對(duì)標(biāo)本的純度要求低

不需要分離病毒或細(xì)菌及培養(yǎng)細(xì)胞，DNA 粗制品及總RNA均可作為擴(kuò)增模板?？芍苯佑门R床標(biāo)本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等粗制的DNA擴(kuò)增檢測(cè)。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

可分為長(zhǎng)產(chǎn)物片段和短產(chǎn)物片段兩部分。短產(chǎn)物片段的長(zhǎng)度嚴(yán)格地限定在兩個(gè)引物鏈5'端之間，是需要擴(kuò)增的特定片段。短產(chǎn)物片段和長(zhǎng)產(chǎn)物片段是由于引物所結(jié)合的模板不一樣而形成的，以一個(gè)原始模板為例，在第一個(gè)反應(yīng)周期中，以兩條互補(bǔ)的DNA為模板，引物是從3'端開始延伸，其5'端是固定的，3' 端則沒有固定的止點(diǎn)，長(zhǎng)短不一，這就是“長(zhǎng)產(chǎn)物片段”。進(jìn)入第二周期后，引物除與原始模板結(jié)合外，還要同新合成的鏈(即“長(zhǎng)產(chǎn)物片段”)結(jié)合。引物在與新鏈結(jié)時(shí)，由于新鏈模板的5'端序列是固定的，這就等于這次延伸的片段3'端被固定了止點(diǎn)，保證了新片段的起點(diǎn)和止點(diǎn)都限定于引物擴(kuò)增序列以內(nèi)、形成長(zhǎng)短一致的“短產(chǎn)物片段”。不難看出“短產(chǎn)物片段”是按指數(shù)倍數(shù)增加，而“長(zhǎng)產(chǎn)物片段”則以算術(shù)倍數(shù)增加，幾乎可以忽略不計(jì)，這使得PCR的反應(yīng)產(chǎn)物不需要再純化，就能保證足夠純DNA片段供分析與檢測(cè)用。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的分析

PCR產(chǎn)物是否為特異性擴(kuò)增，其結(jié)果是否準(zhǔn)確可靠，必須對(duì)其進(jìn)行嚴(yán)格的分析與鑒定，才能得出正確的結(jié)論。PCR產(chǎn)物的分析，可依據(jù)研究對(duì)象和目的不同而采用不同的分析方法。

一、凝膠電泳分析 PCR產(chǎn)物電泳，EB溴乙錠染色紫外儀下觀察，初步判斷產(chǎn)物的特異性。PCR產(chǎn)物片段的大小應(yīng)與預(yù)計(jì)的一致，特別是多重PCR，應(yīng)用多對(duì)引物，其產(chǎn)物片斷都應(yīng)符合預(yù)訐的大小，這是起碼條件。

（一）瓊脂糖凝膠電泳： 通常應(yīng)用1～2%的瓊脂糖凝膠，供檢測(cè)用。

（二）聚丙烯酰胺凝膠電泳：6～10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離效果比瓊脂糖好，條帶比較集中，可用于科研及檢測(cè)分析。

二、酶切分析： 根據(jù)PCR產(chǎn)物中限制性內(nèi)切酶的位點(diǎn)，用相應(yīng)的酶切、電泳分離后，獲得符合理論的片段，此法既能進(jìn)行產(chǎn)物的鑒定，又能對(duì)靶基因分型，還能進(jìn)行變異性研究。

三、分子雜交： 分子雜交是檢測(cè)PCR產(chǎn)物特異性的有力證據(jù)，也是檢測(cè)PCR 產(chǎn)物堿基突變的有效方法。

（一）Southern印跡雜交： 在兩引物之間另合成一條寡核苷酸鏈(內(nèi)部寡核苷酸)標(biāo)記后做探針，與PCR產(chǎn)物雜交。此法既可作特異性鑒定，又可以提高檢測(cè)PCR產(chǎn)物的靈敏度，還可知其分子量及條帶形狀，主要用于科研。

（二）斑點(diǎn)雜交： 將PCR產(chǎn)物點(diǎn)在硝酸纖維素膜或尼膜薄膜上，再用內(nèi)部寡核苷酸探針雜交，觀察有無著色斑點(diǎn)，主要用于PCR產(chǎn)物特異性鑒定及變異分析。

四、核酸序列分析： 是檢測(cè)PCR產(chǎn)物特異性的最可靠方法。

PCR產(chǎn)物克隆方法

一、平端連接

通常情況下，PCR產(chǎn)物可直接與平端載體DNA進(jìn)行連接，但其連接效率效低。因?yàn)門aqDNA聚合酶具有非模板依賴性末端轉(zhuǎn)移酶活性，能在兩6條DNA鏈的3'末端加上一個(gè)多余的堿基，使合成的PCR產(chǎn)物成為3'突出一個(gè)堿基的DNA分子。這種DNA分子的連接效率很低。由于PCR產(chǎn)物的效率通過較高。在采用大量T4DNA連接酶并配以5-10u T4 RNA連接酶時(shí)，可顯著提高其連接效率。對(duì)于較短PCR產(chǎn)物，用PUS19的HincⅡ位點(diǎn)進(jìn)行克隆，以X－gal和IPTG篩選，?？傻玫阶懔恐亟M子。另一種提高克隆效率的途徑是先用Klenow大片段或T4DNA聚合酶消去3'末端突出堿基將PCR產(chǎn)物變成平端DNA，然后再用平端連接法克隆PCR產(chǎn)物。

二、粘端連接

（一）引物中設(shè)計(jì)入限制酶位點(diǎn)

由于PCR引物的5'末端可以增加一些非互補(bǔ)堿基，因此可以在兩引物的5'末端設(shè)計(jì)單限制酶或雙限制酶切位點(diǎn)。這樣得到的PCR產(chǎn)物用限制酶消化產(chǎn)生粘性末端，即可與有互補(bǔ)粘端的載體DNA重組。這種克隆方法效率較高，且當(dāng)兩引物中設(shè)計(jì)不同酶切位點(diǎn)時(shí)，可有效地定向克隆PCR產(chǎn)物。其缺點(diǎn)是需要加長(zhǎng)PCR引物，除限制酶識(shí)別序列外，還需要在其5'端多合成3-4個(gè)堿基以利于限制性內(nèi)切酶與PCR產(chǎn)物末端的穩(wěn)定結(jié)合。即使如此，其酶切效率也不夠高。其中尤以NotI、XhoI和XbaI等較為難切。采用突變PCR方法可克服上述缺點(diǎn)。該方法是通過在兩PCR引物序列中改變1至數(shù)個(gè)核苷酸創(chuàng)造出一個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。鑒于PCR引物的3'末端序列的互補(bǔ)性是PCR成功的關(guān)鍵，在PCR引物的中部或近5'端改變1個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)PCR擴(kuò)增效果影響不大。這種方法不需要增加PCR引物的長(zhǎng)度，而且酶切效果優(yōu)于5'加端法。對(duì)于特定DNA片段的克隆，此方法較為經(jīng)濟(jì)、實(shí)用。但對(duì)于基因診斷PCR產(chǎn)物的克隆，似乎5'加端法更為適宜。

（二）T4DNA聚合回切產(chǎn)生粘端

如PCR兩引物的5'末端是A或T，則可在其5'端分別加上CG和CCGG。用此二引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物在dATP和dTTP存在的情況下，用T4DNA聚合酶進(jìn)行處理，則T4DNA聚合酶因具有3'→5'外切酶活性而消去3'末端的G和C，產(chǎn)生AccI和XmaI粘性末端。此DNA片段直接與用AccI和XmaI切開的載體進(jìn)行連接。這種方法只需在PCR引物的5'端加2-4個(gè)堿基，但其可選擇的限制酶類有限。

三、T－vector法

TaqDNA聚合酶能在平端雙鏈DNA的3'末端加一個(gè)堿基，所加堿基幾乎全是腺苷。據(jù)此，Marchuk等人采用3'端突出一個(gè)胸苷的質(zhì)粒DNA來克隆PCR產(chǎn)物，其克隆效率比平端的連接至少高出100倍。他們用EcoRV將pBluescript切成平端，然后在2mmol/LdTTP存在下，用TaqDNA聚合酶催化pBluescript的兩個(gè)3'末端各加一處胸苷。因?yàn)樵?種dNTP都存在時(shí)，Taq聚合酶選擇性參入dATP，而當(dāng)僅一種dNTP存在時(shí)，它只能參入該種堿基。因此，在只加入ddTTP時(shí)，用TaqDNA聚合酶可使平端載體DNA轉(zhuǎn)變成3'末端突出一個(gè)胸苷的T尾載體，稱為T－vector。用這種T－vectorsk可以較有效地直接克隆PCR產(chǎn)物。Hotton等人也報(bào)道了另一種制備T－vector的方法。他們使用脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶在切成平端的載體DNA的3'末端加上一個(gè)胸苷。由于末端轉(zhuǎn)移酶可以催化多個(gè)堿基（ddTTP）作為底物，使平端載體DNA分子的兩個(gè)3'末端各加上一個(gè)T。用這種方法制備的T－vector的不同之處在于前者3'末端不能與待克隆PCR產(chǎn)物的5'末端連接，僅5'末端可與PCR產(chǎn)物的3'末端形成磷酸二脂鍵。

四、共環(huán)消解法

最近，Jung等人報(bào)道了一種有效的PCR產(chǎn)物克隆方法。用磷酸化的PCR引物擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物，先用T4DNA連接酶催化連接反應(yīng)，使5'端帶有限制酶切位點(diǎn)的擴(kuò)增DNA片段連接成共環(huán)結(jié)構(gòu)。然后再用相應(yīng)的限制酶進(jìn)行消化，產(chǎn)生粘端DNA片段。對(duì)于對(duì)稱性限制酶位點(diǎn)，只需在引蛾的5'末端加上一關(guān)識(shí)別序列，因?yàn)樵诖映晒箔h(huán)后能恢復(fù)限制酶切位點(diǎn)難于切開的缺點(diǎn)，且可用于雙限制酶切位點(diǎn)的設(shè)計(jì)，只不過有PCR產(chǎn)物共環(huán)化后，僅約1/4的限制酶切點(diǎn)得以恢復(fù)。故此法較適用于單限制酶位點(diǎn)的克隆。

五、無連接酶亞克隆法

無連接酶克隆法（ligase-free subcloning，LFS）是利用引物5'末端附加堿基修飾法，修飾堿基不是酶切位點(diǎn)，而是與某一質(zhì)粒兩端分別互補(bǔ)的堿基。兩引物的3'端約20-25個(gè)核苷酸分別與待擴(kuò)增DNA兩翼互補(bǔ)，5'端各有約24個(gè)核苷酸分別與線性化質(zhì)粒的3'端相同的附加序列。由于線性化質(zhì)粒的3'端序列各不相同，PCR片段可以通過選擇各引物的合適5'附加序列與引物3'端定向雜交。由此物a和b產(chǎn)生的兩端有附加序列的PCR產(chǎn)物與未反應(yīng)引物分離后，分別加入兩只含有線性化質(zhì)粒的反應(yīng)管中進(jìn)行第二次PCR。第1管中用引物a和c，引物a即為第一PCR擴(kuò)增的上游引物a，引物c為下游引物，與緊鄰5'端附加序列內(nèi)測(cè)的質(zhì)粒（+）鏈互補(bǔ)。同樣，第2管的引物為b和d，引物b與第一次PCR擴(kuò)增的下游引物b相同，引物d為上游引物，與緊鄰5'附加序列內(nèi)側(cè)的質(zhì)粒（-）鏈互補(bǔ)。

第二次PCR的第一循環(huán)中，PCR產(chǎn)物與質(zhì)粒均變性與復(fù)性。除自身復(fù)性產(chǎn)物（這種復(fù)性產(chǎn)物不被擴(kuò)增）外，PCR產(chǎn)物與質(zhì)?？赏ㄟ^各自3'端互補(bǔ)序列雜交成部分異源雙鏈，延伸時(shí)，重疊的3'端互為此物沿各自互補(bǔ)鏈延伸，結(jié)果可產(chǎn)生PCR片段與線性質(zhì)粒的“連接”。然后兩管中PCR擴(kuò)增各進(jìn)行15-20個(gè)循環(huán)。這便可產(chǎn)生大量一端管1）或另一端連接有PCR插入片段的質(zhì)粒。第二次PCR后將第1管與第2管反應(yīng)液混合，用堿變性雙鏈，中和后稀釋變性的DNA。反應(yīng)管中的單鏈DNA可以復(fù)性或幾種不同的產(chǎn)物，除各自本身復(fù)性產(chǎn)物外，管1產(chǎn)物ssDNA與管2中ssDNA可形成部分異源雙鏈DNA，并各自有一較長(zhǎng)的5'或3'懸端，這種長(zhǎng)的5'或3'懸端相互互補(bǔ)，在低DNA濃度時(shí)可復(fù)性產(chǎn)生環(huán)化DNA。

盡管這種環(huán)化的DNA有兩個(gè)缺口，但它們可以直接用來轉(zhuǎn)化受體大腸直桿菌。一旦進(jìn)入體內(nèi)，兩個(gè)缺口便共價(jià)連接，修復(fù)的質(zhì)粒即可復(fù)制，下面以從λ噬菌體DNA中擴(kuò)增-500bp片段，并克隆入pGem4Z載體中為例說明LFS法。

這種方法同樣適于復(fù)雜基因組中基因片段的克隆。需注意的是第一次PCR時(shí)兩引物的5'附加序列不應(yīng)太短以免影響第二次PCR時(shí)異源雙鏈的形成，以24個(gè)核苷酸較為合適。擴(kuò)增時(shí)若形成，引物二聚體，一定要去除，否則會(huì)嚴(yán)重影響轉(zhuǎn)化率。用LFS法已成功地克隆了長(zhǎng)達(dá)1.7kb的基因片段。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是：①可用于常規(guī)方法無法進(jìn)行亞克隆的片段；②適于任何PCR產(chǎn)物和任何質(zhì)粒；③可亞克隆特殊目的（如含點(diǎn)突變、缺失或插入等）片段；④在某些情況下，對(duì)已構(gòu)建了啟動(dòng)子或增強(qiáng)子等序列的載體，可使待表達(dá)片段插入定向合適位置；⑤較快，可在1d內(nèi)完成，較常規(guī)方法可靠，不需DNA連接酶。

DNA克隆是分子生物學(xué)的重要內(nèi)容。特定基因的克隆常因兩端缺乏合適限制酶切點(diǎn)而受因，cDNA的克隆通常也效率不高、篩選因難。采用PCR技術(shù)行DNA和cDNA的克隆，則可大大縮短克隆時(shí)間，比之全基因合成更為經(jīng)濟(jì)和方便，因而愈來愈受重視。用PCR方法進(jìn)行傳染性疾病和遺傳性疾病的診斷常遇到產(chǎn)物的異性問題和分型問題，采用產(chǎn)物克隆和測(cè)序方法，比之寡核苷酸探針雜交方法更為準(zhǔn)確。隨著PCR技術(shù)的不斷發(fā)展和推廣，新的PCR產(chǎn)物的克隆方法也將不斷出現(xiàn)。

PCR基礎(chǔ)的檢測(cè)工具的優(yōu)缺點(diǎn)

首先，PCR反應(yīng)是快速的。整個(gè)DNA提取，擴(kuò)增和檢測(cè)的過程通常少于6小時(shí)，如果反應(yīng)利用嵌套的引物，過程可能長(zhǎng)些。對(duì)于一些樣本來說，比如來自糞便和表皮，就需要在DNA提取中增加步驟。這樣就延長(zhǎng)了整個(gè)檢測(cè)的時(shí)間到14小時(shí)。

用購(gòu)買的核苷酸提取工具就能縮短檢測(cè)時(shí)間，機(jī)械進(jìn)行提取，使PCR方案最優(yōu)化或使用加快熱循環(huán)技術(shù)。有了優(yōu)化的樣本，快速提取和光循環(huán)熱循環(huán)，整個(gè)檢測(cè)時(shí)間能縮短到2小時(shí)。但通常是6-8小時(shí)。

于培養(yǎng)基基礎(chǔ)的方法2-5天的時(shí)間相比較，這是巨大的進(jìn)展了。這也比一些需要有精確計(jì)算結(jié)果的培養(yǎng)基濃縮的抗體檢測(cè)實(shí)驗(yàn)要快。當(dāng)購(gòu)買的實(shí)用抗體基礎(chǔ)的檢測(cè)工具比PCR基礎(chǔ)的方法快時(shí)，大部分這樣的化驗(yàn)只能用于非常有限的生物體上。

第二，PCR不需要培養(yǎng)。這是與PCR基礎(chǔ)的檢測(cè)的速度密切相關(guān)的。既然PCR是十分靈敏的（少到10 cfus的樣本就能被檢測(cè)），培養(yǎng)通常是沒必要的。大多數(shù)最新的實(shí)用PCR檢測(cè)工具需要有選擇性的濃縮，特別是當(dāng)樣本包括大量的PCR抑制劑時(shí)。用核苷酸提取方法能夠避免培養(yǎng)，核苷酸提取方法產(chǎn)生了PCR質(zhì)量的DNA并且優(yōu)化了PCR反應(yīng)。如果在大量樣本中檢測(cè)少量的病原體或者病源有機(jī)體在PCR靈敏度的極限以下的情況下，將需要使用培養(yǎng)。在一般情況下，使用培養(yǎng)的情況是很少的，去除了培養(yǎng)的步驟，時(shí)間將被節(jié)省下來。

比節(jié)省時(shí)間更重要的是，去除了培養(yǎng)，那些難以或不能培養(yǎng)的生物體就可以進(jìn)行檢測(cè)。這些生物體包括某種病毒、真菌、厭氧性生物和支原體。

第三，PCR的花費(fèi)合理。與培養(yǎng)或抗體基礎(chǔ)的化驗(yàn)相比，PCR基礎(chǔ)的診斷是十分經(jīng)濟(jì)的?？紤]到細(xì)菌的培養(yǎng)，有較昂貴的花費(fèi)。大多數(shù)樣本為了正確的鑒定需要培養(yǎng)和重復(fù)培養(yǎng)。這需要大量的手工時(shí)間（加上化驗(yàn)的花費(fèi)），也增加了污染的危險(xiǎn)。

作為比較，大多數(shù)抗體化驗(yàn)所需的手工時(shí)間很少但化驗(yàn)本身很昂貴。

PCR反應(yīng)的成分（引物，酶，dNTPs和緩沖液）的花費(fèi)比每次化驗(yàn)的花費(fèi)少40%，而反應(yīng)的時(shí)間包括核苷酸分離，通常在一小時(shí)以內(nèi)。當(dāng)然這依賴于樣本、技術(shù)員和用于分離核苷酸的技術(shù)。既然PCR所用的時(shí)間少，它的花費(fèi)也少。

但是，PCR需要熱循環(huán)，UV來源和一些類型的圖象捕獲裝置，因此PCR實(shí)驗(yàn)室的最初花費(fèi)是很高的。

這里討論另外一些在臨床領(lǐng)域的PCR使用的基本原理

第一，PCR不是抗原基礎(chǔ)的。

抗體基礎(chǔ)的檢測(cè)工具（ELISA和其他）不僅檢測(cè)直接抗病原體的人類抗體，而且能檢測(cè)病原體上的表面抗原。人類抗體檢測(cè)工具因此需要免疫反應(yīng)的存在，以及在正確檢測(cè)抗原存在之前抗體濃度的測(cè)定。在新近感染的情況下，這種測(cè)試不能檢測(cè)針對(duì)病原體的人類抗體，可能不能正確反映是否有感染。事實(shí)上，被感染的病人，沒有充足的時(shí)間來提高用于檢測(cè)的濃度。這是HIV抗體基礎(chǔ)檢測(cè)的通常的問題。由于相同的原因，這種類型的測(cè)試對(duì)檢測(cè)無免疫應(yīng)答患者的病原體存在困難。反過來講，抗體基礎(chǔ)的測(cè)試也會(huì)給出錯(cuò)誤相反的結(jié)果。

然而抗體基礎(chǔ)的檢測(cè)最大的問題是它不能檢測(cè)新的病原體亞型，由于表面抗原發(fā)生改變，而導(dǎo)致了錯(cuò)誤的陰性結(jié)果。（PCR基礎(chǔ)的檢驗(yàn)也可能由于DNA的變化、突變而遇到相似的問題。但PCR基礎(chǔ)的檢驗(yàn)?zāi)軌蜻M(jìn)行設(shè)計(jì)，使這些錯(cuò)誤的陰性結(jié)果最小化。）盡管有這些缺點(diǎn)，抗原基礎(chǔ)的檢測(cè)工具是十分重要的檢測(cè)方法，在大多數(shù)情況下比PCR檢測(cè)要迅速。

第二，檢驗(yàn)易按客戶的要求設(shè)置，以適合特殊的需要

通過簡(jiǎn)單使用不同的特殊目標(biāo)引物，工具能迅速設(shè)計(jì)，用于許多檢測(cè)。

第三，PCR容易使用，是由時(shí)間證實(shí)的技術(shù)

通過使用有商業(yè)價(jià)值的核苷酸提取產(chǎn)物，用于病原體檢測(cè)的樣本能在少于十分鐘的時(shí)間內(nèi)被例行操作。一旦進(jìn)行操作，樣本被加入反應(yīng)體系中，進(jìn)入熱循環(huán)。反應(yīng)完成后，樣本能被自動(dòng)系統(tǒng)或凝膠電泳所分析。

少數(shù)的PCR檢測(cè)將能完全自動(dòng)化。儀器將進(jìn)行所有操作，從樣品的準(zhǔn)備到分析結(jié)果。這樣的系統(tǒng)將十分昂貴，可能只能適應(yīng)制造商的平臺(tái)。這對(duì)大多數(shù)臨床實(shí)驗(yàn)室無吸引力，但當(dāng)價(jià)格下降后，將最終使PCR診斷自動(dòng)化。

第四篇：PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范

PCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室操作規(guī)范

一、PCR 實(shí)驗(yàn)室的設(shè)置及管理

1．目的：建立實(shí)驗(yàn)室的合理設(shè)置和科學(xué)管理，防止實(shí)驗(yàn)污染，保證檢測(cè)結(jié)果的可靠性。2．適用范圍：本程序適用于分子診斷室的設(shè)置、工作流程和日常管理等。3．負(fù)責(zé)人： 4．細(xì)則：

4．1流感實(shí)驗(yàn)室為急傳所的專業(yè)實(shí)驗(yàn)室，從事臨床標(biāo)本的基因擴(kuò)增檢測(cè)及相關(guān)科研工作等。4．2 本實(shí)驗(yàn)室采用實(shí)時(shí)熒光定量（定性）PCR 技術(shù)作為病毒基因診斷的主要手段，實(shí)驗(yàn)室分為三個(gè)區(qū)：試劑準(zhǔn)備區(qū)（第一區(qū)）、標(biāo)本處理區(qū)（第二區(qū)）、擴(kuò)增分析區(qū)（第三區(qū)）。每一工作區(qū)配備專用的設(shè)備、儀器、輔助設(shè)施、耗材、清潔用品、辦公用品、專用工作服，并有明顯的區(qū)分標(biāo)識(shí)。標(biāo)本的接收則在檢驗(yàn)科標(biāo)本接收處進(jìn)行。

4．3 各工作區(qū)專用的儀器設(shè)備、辦公用品、工作服、實(shí)驗(yàn)耗材和清潔用具等，不可混用。4．4 各工作區(qū)配置、功能和內(nèi)務(wù)管理見各相關(guān)SOP 文件。

4．5 嚴(yán)格遵守從“試劑準(zhǔn)備區(qū)→標(biāo)本處理區(qū)→擴(kuò)增分析區(qū)”的單一流向制度，不得逆向進(jìn)入前一工作區(qū)。

4．6 非本實(shí)驗(yàn)室工作人員，未經(jīng)許可不得入內(nèi)；進(jìn)修、實(shí)習(xí)或其他科室人員因科研活動(dòng)需要，進(jìn)入實(shí)驗(yàn)區(qū)域（試劑準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本處理區(qū)、擴(kuò)增分析區(qū)）需首先熟悉本程序的各項(xiàng)規(guī)定并嚴(yán)格遵守執(zhí)行，在本實(shí)驗(yàn)室人員監(jiān)督指導(dǎo)下進(jìn)行。4．7 實(shí)驗(yàn)完畢后做好清潔消毒工作。

二、PCR 實(shí)驗(yàn)室工作制度

1．目的 ：保持良好的工作環(huán)境，以確保檢測(cè)結(jié)果的可靠性，防止交叉污染，防止差錯(cuò)、事故及糾紛的發(fā)生。

2．適用范圍：所有本實(shí)驗(yàn)室人員。3．負(fù)責(zé)人： 4．細(xì)則： 4．1 本實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行臨床基因擴(kuò)增檢測(cè)及相關(guān)實(shí)驗(yàn)工作，不得進(jìn)行其它實(shí)驗(yàn)操作。4．2 各區(qū)的用品不得混用。

4．3 在各區(qū)的實(shí)驗(yàn)操作過程中，操作者必須戴手套和帽子，嚴(yán)格按照操作規(guī)程。4．4 試劑準(zhǔn)備區(qū)只能進(jìn)行試劑的貯存及配制等相關(guān)操作（見相關(guān)SOP 文件）。

4．5 標(biāo)本處理區(qū)只能進(jìn)行臨床標(biāo)本的保存，核酸提取、保存及其加入至擴(kuò)增反應(yīng)管和測(cè)定RNA 時(shí)cDNA 的合成（見相關(guān)SOP 文件）。

4．6 擴(kuò)增分析區(qū)只能進(jìn)行DNA 或cDNA 的擴(kuò)增、實(shí)時(shí)熒光PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的分析（見相關(guān)SOP 文件）。

4．7 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)嚴(yán)格執(zhí)行本實(shí)驗(yàn)室的各項(xiàng)操作規(guī)程，及時(shí)做好各種操作記錄，力求準(zhǔn)確、可靠。實(shí)驗(yàn)完畢，做好清潔、整理及分析統(tǒng)計(jì)等工作。

4．8 室內(nèi)儀器由專人負(fù)責(zé)，未經(jīng)許可，不得隨意使用或挪用；愛護(hù)使用儀器，定期進(jìn)行保養(yǎng)與維修。

4．9 愛護(hù)科室財(cái)產(chǎn)，注意安全；離開實(shí)驗(yàn)室前應(yīng)關(guān)好門窗，檢查水、電等。

三、PCR 實(shí)驗(yàn)室內(nèi)務(wù)管理制度

1．目的：保證實(shí)驗(yàn)室日常內(nèi)務(wù)管理及清潔工作順利進(jìn)行。2．適用范圍：實(shí)驗(yàn)室相關(guān)人員及相關(guān)清潔工人。3．負(fù)責(zé)人： 4．細(xì)則：

4．1 非本室工作人員未經(jīng)允許不得進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室。4．2 各區(qū)的用品不得混用。

4．3 實(shí)驗(yàn)人員要有強(qiáng)烈的時(shí)間觀念，按時(shí)上下班，不遲到、早退。

4．4 進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室的工作人員必須遵守實(shí)驗(yàn)室的單一流向的規(guī)定，禁止逆向走動(dòng)。

4．5 所有儀器（如PCR 擴(kuò)增儀）須有專人負(fù)責(zé)，并有使用維護(hù)記錄；實(shí)驗(yàn)人員必須熟悉儀器性能后方允許操作，并嚴(yán)格遵守操作規(guī)程。

4．6 所有試劑進(jìn)購(gòu)、配制、質(zhì)檢、使用均要有記錄，未經(jīng)允許不得隨意帶出本實(shí)驗(yàn)室。4．7 每天了解儀器運(yùn)轉(zhuǎn)情況及試劑使用情況，確保儀器整潔安全，試劑合格使用。4．8 各區(qū)的各種清潔消毒均應(yīng)有記錄，工作衣消毒時(shí)注意各區(qū)應(yīng)分開進(jìn)行處理。4．9 注意保持實(shí)驗(yàn)室衛(wèi)生整潔，嚴(yán)禁在室內(nèi)抽煙、吃零食，非實(shí)驗(yàn)操作人員應(yīng)盡量少入。4.10下班前檢查門、窗、水、電，節(jié)假日應(yīng)指定人員負(fù)責(zé)檢查實(shí)驗(yàn)室的儀器、設(shè)備。

四、PCR 實(shí)驗(yàn)室人員的配置及管理

1．目的：保證實(shí)驗(yàn)室有足夠數(shù)量的合格的具備開展該類實(shí)驗(yàn)?zāi)芰Φ膶?shí)驗(yàn)人員。2．適用范圍：適用于實(shí)驗(yàn)室人員配置、管理、培訓(xùn)及考核。3．負(fù)責(zé)人： 4．細(xì)則： 4．1 人員要求

4．1．1 本實(shí)驗(yàn)室工作人員應(yīng)為醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)專業(yè)或相關(guān)專業(yè)畢業(yè)，具有中級(jí)以上技術(shù)職稱或?qū)？埔陨蠈W(xué)歷。

4．1．2 實(shí)驗(yàn)室工作人員應(yīng)參加衛(wèi)生部或省臨檢中心舉辦的PCR 技術(shù)培訓(xùn)，并取得合格證。4．1．3 對(duì)于新進(jìn)入本室的人員，如尚未取得PCR 技術(shù)培訓(xùn)合格證，應(yīng)在實(shí)驗(yàn)室有培訓(xùn)合格證的上級(jí)技術(shù)人員的指導(dǎo)下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)工作，實(shí)驗(yàn)報(bào)告由有資格人員出具，并應(yīng)在最短的時(shí)間內(nèi)取得上崗培訓(xùn)合格證。4．2 人員配置

4．2．1 實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)工作需要配備足夠的工作人員。4．2．2 各級(jí)技術(shù)人員履行相應(yīng)的工作職責(zé)。4．3 人員培訓(xùn)及考核

4．3．1 實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)人或負(fù)責(zé)人指定人員參加每年衛(wèi)生部PCR 室間質(zhì)評(píng)總結(jié)會(huì)。

4．3．2 實(shí)驗(yàn)室工作人員每1～2 年至少參加1 次PCR 技術(shù)的省級(jí)或國(guó)家級(jí)繼續(xù)教育項(xiàng)目，參加相關(guān)學(xué)術(shù)交流會(huì)議。

4．3．3 安排未取得上崗培訓(xùn)合格證的工作人員在合適的時(shí)間內(nèi)參加技術(shù)培訓(xùn)。

4．3．4 科室不定期組織實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部實(shí)驗(yàn)人員學(xué)習(xí)、更新核酸擴(kuò)增方面的相關(guān)知識(shí)，提升自身的理論學(xué)習(xí)水平。特別是在標(biāo)本接收區(qū)采血、接收標(biāo)本的人員，需定期對(duì)其進(jìn)行有關(guān)核酸擴(kuò)增技術(shù)，標(biāo)本采集、保存、運(yùn)輸?shù)戎R(shí)的培訓(xùn)。一些科室的送檢標(biāo)本由該科室的人員送到標(biāo)本接收區(qū)，對(duì)這些臨床醫(yī)護(hù)人員也要定期進(jìn)行有關(guān)核酸擴(kuò)增技術(shù)，標(biāo)本采集、保存、運(yùn)輸?shù)戎R(shí)的培訓(xùn)。

4．3．5 本實(shí)驗(yàn)室工作人員每年進(jìn)行考核一次,考核內(nèi)容: a)日常工作質(zhì)量 b)室內(nèi)質(zhì)控測(cè)評(píng) c)室間質(zhì)控測(cè)評(píng) d)在抱怨處理中的表現(xiàn)

4．3．6 本實(shí)驗(yàn)室工作人員實(shí)行嚴(yán)格獎(jiǎng)懲制度,有下列表現(xiàn)者可受獎(jiǎng): a)工作質(zhì)量高, 質(zhì)控測(cè)評(píng)成績(jī)優(yōu)秀者

b)有科研能力,并有一定數(shù)量和質(zhì)量的論文發(fā)表 c)有獨(dú)創(chuàng)性工作成果,經(jīng)鑒定認(rèn)可者 d)受到有關(guān)部門或群眾嘉獎(jiǎng)?wù)?有下列情況者將受到懲處: a)工作質(zhì)量問題較多，質(zhì)控測(cè)評(píng)成績(jī)不合格； b)不遵守規(guī)章制度并造成一定影響； c)不求上進(jìn)。

4．3．7 本實(shí)驗(yàn)室工作人員獎(jiǎng)懲方法分精神及物質(zhì)兩類,經(jīng)實(shí)驗(yàn)室上報(bào)及有關(guān)部門批準(zhǔn)后執(zhí)行。

4．3．8 本實(shí)驗(yàn)室工作人員均建立業(yè)績(jī)檔案,實(shí)行能進(jìn)能出制度,不斷吸收高質(zhì)量人員,加強(qiáng)培訓(xùn)和提高,對(duì)于不適合本室工作的人員要及時(shí)調(diào)離。4．4 人員管理

4．4．1 實(shí)驗(yàn)室建立所有工作人員的技術(shù)檔案，包括：學(xué)歷、任職資格、發(fā)表論文、研究成果、培訓(xùn)等相關(guān)材料復(fù)印件。

4．4．2 技術(shù)檔案分文本檔案和電子檔案，文本檔案每年更新1 次，電子檔案隨時(shí)更新。

五、PCR 實(shí)驗(yàn)室清潔程序

1．目的：保證實(shí)驗(yàn)室環(huán)境的整潔，防止污染。

2．適用范圍：適于實(shí)驗(yàn)室工作環(huán)境、實(shí)驗(yàn)臺(tái)面、工作服、移液器等的清潔消毒工作。3．負(fù)責(zé)人： 操作人： 4．細(xì)則：

4．1 實(shí)驗(yàn)室地面必須平整、干凈，通道要利于通行，沒有無用的物品阻礙。

4．2 合理規(guī)劃實(shí)驗(yàn)室內(nèi)物品，做到擺放整齊、有序，無用的或使用效率低的物品放置到儲(chǔ)存處，常用的物品要容易尋找到。

4．3 抽屜、柜子、文件類物品要作好標(biāo)記，以方便識(shí)別。4．4 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后用2%戊二醛對(duì)臺(tái)面進(jìn)行清潔，并用移動(dòng)紫外燈進(jìn)行消毒。

4．5 每天對(duì)使用過的移液器用75%酒精進(jìn)行擦拭。每周1 次對(duì)移液器咀進(jìn)行75%酒精浸泡15 分鐘左右，若使用過程中發(fā)生污染應(yīng)隨時(shí)浸泡處理。

4．6 實(shí)驗(yàn)過程中如發(fā)生標(biāo)本或試劑外濺，應(yīng)立即用2%戊二醛滴上，濾紙蓋上半小時(shí)，然后用酒精擦洗，并用移動(dòng)紫外燈消毒。

4．7 每天實(shí)驗(yàn)前開啟各區(qū)的通風(fēng)系統(tǒng)，各區(qū)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，分別打開傳遞窗紫外燈、移動(dòng)紫外燈（對(duì)實(shí)驗(yàn)臺(tái)面消毒）、天花板紫外燈消毒實(shí)驗(yàn)室，每次開啟 30～60 分鐘。4．8 待紫外燈消毒時(shí)間足夠后，依次關(guān)閉各區(qū)紫外燈并記錄。

4．9 依次清潔三個(gè)區(qū)的實(shí)驗(yàn)臺(tái)面和地面，各區(qū)清潔消毒工具均專用，不可混用，注意按照單一方向流程的原則來進(jìn)行清潔。4．10 處理好各區(qū)廢棄物。

4．11 每周將工作服洗滌消毒，不同實(shí)驗(yàn)區(qū)的工作服隔開洗滌。

六、PCR 標(biāo)本唯一標(biāo)識(shí)編號(hào)規(guī)則

1．目的：保證標(biāo)本編號(hào)的唯一性，也是準(zhǔn)確發(fā)放報(bào)告的基礎(chǔ)。

2．適用范圍：使用核酸擴(kuò)增熒光檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室所開展的病毒以及基因檢測(cè)項(xiàng)目： 3．負(fù)責(zé)人： 操作人： 4．程序：

4．1 按檢測(cè)日期分類標(biāo)記

根據(jù)標(biāo)本送檢的日期，每天的標(biāo)本對(duì)應(yīng)標(biāo)記一種唯一的代號(hào)。4．2 按檢測(cè)類型分類標(biāo)記

根據(jù)檢測(cè)項(xiàng)目的不同，每種檢測(cè)項(xiàng)目對(duì)應(yīng)標(biāo)記一種唯一的代號(hào)。4．3 按驗(yàn)單接收順序編號(hào)

在同種檢測(cè)類型的驗(yàn)單中，按驗(yàn)單順序編號(hào)。4．4 特殊標(biāo)本的編號(hào)

如有特殊情況，應(yīng)在標(biāo)記前面增加特異字母區(qū)別開。4．5 編號(hào)步驟 a）對(duì)當(dāng)天送來的標(biāo)本，根據(jù)編號(hào)的基本原則編號(hào)，每個(gè)樣本的每個(gè)檢測(cè)項(xiàng)目對(duì)應(yīng)一個(gè)唯一的編號(hào)。

b）用筆在每張檢驗(yàn)申請(qǐng)單和對(duì)應(yīng)的樣品管上作好相同的標(biāo)記。

c）做好標(biāo)本的接收記錄，每個(gè)樣本的記錄都應(yīng)包括以下信息：接收時(shí)間、醫(yī)院、科室、送檢醫(yī)生、患者姓名、性別、年齡、標(biāo)本類別、標(biāo)本狀態(tài)、送標(biāo)本者、接收人、檢驗(yàn)單號(hào)、標(biāo)本唯一統(tǒng)編號(hào)等。

d）處理好樣品、點(diǎn)樣后，將反應(yīng)管放入擴(kuò)增儀上開始擴(kuò)增。

f）擴(kuò)增得到結(jié)果后，先在統(tǒng)計(jì)簿上填入結(jié)果，作好記錄，再一一把實(shí)驗(yàn)結(jié)果填入相應(yīng)申請(qǐng)單。

g）發(fā)放檢驗(yàn)報(bào)告單。

七、PCR 基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室的要求

1．目的：規(guī)定在各區(qū)內(nèi)所進(jìn)行的工作及其操作。2．適用范圍：所有在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行的工作。3．負(fù)責(zé)人： 操作人： 4．程序：

一、臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的設(shè)計(jì)

（一）臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室區(qū)域設(shè)計(jì)原則。原則上臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)當(dāng)設(shè)置以下區(qū)域：試劑儲(chǔ)存和準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增區(qū)、擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。這4個(gè)區(qū)域在物理空間上必須是完全相互獨(dú)立的，各區(qū)域無論是在空間上還是在使用中，應(yīng)當(dāng)始終處于完全的分隔狀態(tài)，不能有空氣的直接相通。根據(jù)使用儀器的功能，區(qū)域可適當(dāng)合并。例如使用實(shí)時(shí)熒光PCR儀，擴(kuò)增區(qū)、擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)可合并；采用樣本處理、核酸提取及擴(kuò)增檢測(cè)為一體的自動(dòng)化分析儀，則標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增區(qū)、擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)可合并。各區(qū)的功能是：

1.試劑儲(chǔ)存和準(zhǔn)備區(qū)：貯存試劑的制備、試劑的分裝和擴(kuò)增反應(yīng)混合液的準(zhǔn)備，以及離心管、吸頭等消耗品的貯存和準(zhǔn)備。

2.標(biāo)本制備區(qū)：核酸（RNA、DNA）提取、貯存及其加入至擴(kuò)增反應(yīng)管。對(duì)于涉及臨床樣本的操作，應(yīng)符合生物安全二級(jí)實(shí)驗(yàn)室防護(hù)設(shè)備、個(gè)人防護(hù)和操作規(guī)范的要求。

3.擴(kuò)增區(qū)：cDNA合成、DNA擴(kuò)增及檢測(cè)。

4.擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)：擴(kuò)增片段的進(jìn)一步分析測(cè)定，如雜交、酶切電泳、變性高效液相分析、測(cè)序等。

（二）臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的空氣流向。臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的空氣流向可按照試劑儲(chǔ)存和準(zhǔn)備區(qū)→標(biāo)本制備區(qū)→擴(kuò)增區(qū)→擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)進(jìn)行，防止擴(kuò)增產(chǎn)物順空氣氣流進(jìn)入擴(kuò)增前的區(qū)域?？砂凑諒脑噭﹥?chǔ)存和準(zhǔn)備區(qū)→標(biāo)本制備區(qū)→擴(kuò)增區(qū)→擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)方向空氣壓力遞減的方式進(jìn)行?？赏ㄟ^安裝排風(fēng)扇、負(fù)壓排風(fēng)裝置或其他可行的方式實(shí)現(xiàn)。

（三）工作區(qū)域儀器設(shè)備配置標(biāo)準(zhǔn)。

1.試劑儲(chǔ)存和準(zhǔn)備區(qū)。

（1）2～8℃和-20℃以下冰箱。

（2）混勻器。

（3）微量加樣器（覆蓋0.2-1000μl）。

（4）可移動(dòng)紫外燈（近工作臺(tái)面）。

（5）消耗品：一次性手套、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭。

（6）專用工作服和工作鞋(套)。

（7）專用辦公用品。

2.標(biāo)本制備區(qū)。

（1）2-8℃冰箱、-20℃或-80℃冰箱。

（2）高速離心機(jī)。

（3）混勻器。

（4）水浴箱或加熱模塊。

（5）微量加樣器（覆蓋0.2-1000μl）。

（6）可移動(dòng)紫外燈（近工作臺(tái)面）。

（7）生物安全柜。

（8）消耗品：一次性手套、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾芯）。

（9）專用工作服和工作鞋(套)。

（10）專用辦公用品。

（11）如需處理大分子DNA，應(yīng)當(dāng)具有超聲波水浴儀。

3.擴(kuò)增區(qū)。

（1）核酸擴(kuò)增儀。

（2）微量加樣器（覆蓋0.2-1000μl），（視情況定）。

（3）可移動(dòng)紫外燈（近工作臺(tái)面）。

（4）消耗品：一次性手套、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾芯）。

（5）專用工作服和工作鞋。

（6）專用辦公用品。

4.擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。

視檢驗(yàn)方法不同而定，基本配置如下：

（1）微量加樣器（覆蓋0.2-1000μl）。

（2）可移動(dòng)紫外燈（近工作臺(tái)面）。

（3）消耗品：一次性手套、加樣器吸頭（帶濾芯）。

（4）專用工作服和工作鞋。

（5）專用辦公用品。

上述各區(qū)域儀器設(shè)備配備為基本配備，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)當(dāng)根據(jù)自己使用的擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)或試劑的特點(diǎn)，對(duì)儀器設(shè)備進(jìn)行必要的增減。

二、臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室工作基本原則

(一)進(jìn)入各工作區(qū)域應(yīng)當(dāng)嚴(yán)格按照單一方向進(jìn)行，即試劑儲(chǔ)存和準(zhǔn)備區(qū)→標(biāo)本制備區(qū)→擴(kuò)增區(qū)→ 擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。

(二)各工作區(qū)域必須有明確的標(biāo)記，不同工作區(qū)域內(nèi)的設(shè)備、物品不得混用。

(三)不同的工作區(qū)域使用不同的工作服（例如不同的顏色）。工作人員離開各工作區(qū)域時(shí)，不得將工作服帶出。

(四)實(shí)驗(yàn)室的清潔應(yīng)當(dāng)按試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)→標(biāo)本制備區(qū)→擴(kuò)增區(qū)→擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)的方向進(jìn)行。不同的實(shí)驗(yàn)區(qū)域應(yīng)當(dāng)有其各自的清潔用具以防止交叉污染。

(五)工作結(jié)束后，必須立即對(duì)工作區(qū)進(jìn)行清潔。工作區(qū)的實(shí)驗(yàn)臺(tái)表面應(yīng)當(dāng)可耐受諸如次氯酸鈉的化學(xué)物質(zhì)的消毒清潔作用。實(shí)驗(yàn)臺(tái)表面的紫外照射應(yīng)當(dāng)方便有效。由于紫外照射的距離和能量對(duì)去污染的效果非常關(guān)鍵，因此可使用可移動(dòng)紫外燈（254nm波長(zhǎng)），在工作完成后調(diào)至實(shí)驗(yàn)臺(tái)上60～90cm內(nèi)照射。由于擴(kuò)增產(chǎn)物僅幾百或幾十堿基對(duì)（bp），對(duì)紫外線損傷不敏感，因此紫外照射擴(kuò)增片段必須延長(zhǎng)照射時(shí)間，最好是照射過夜。

(六)實(shí)驗(yàn)室的安全工作制度或安全標(biāo)準(zhǔn)操作程序，所有操作符合《實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求》（GB19489-2008）。

三、臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室各區(qū)域工作注意事項(xiàng)

(一)試劑儲(chǔ)存和準(zhǔn)備區(qū)。貯存試劑和用于標(biāo)本制備的消耗品等材料應(yīng)當(dāng)直接運(yùn)送至試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)，不能經(jīng)過擴(kuò)增檢測(cè)區(qū)，試劑盒中的陽(yáng)性對(duì)照品及質(zhì)控品不應(yīng)當(dāng)保存在該區(qū)，應(yīng)當(dāng)保存在標(biāo)本處理區(qū)。

(二)標(biāo)本制備區(qū)。由于在樣本混合、核酸純化過程中可能會(huì)發(fā)生氣溶膠所致的污染，可通過在本區(qū)內(nèi)設(shè)立正壓條件，避免從鄰近區(qū)進(jìn)入本區(qū)的氣溶膠污染。為避免樣本間的交叉污染，加入待測(cè)核酸后，必須蓋好含反應(yīng)混合液的反應(yīng)管。對(duì)具有潛在傳染危險(xiǎn)性的材料，必須在生物安全柜內(nèi)開蓋，并有明確的樣本處理和滅活程序。

(三)擴(kuò)增區(qū)。為避免氣溶膠所致的污染，應(yīng)當(dāng)盡量減少在本區(qū)內(nèi)的走動(dòng)。必須注意的是，所有經(jīng)過檢測(cè)的反應(yīng)管不得在此區(qū)域打開。

(四)擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。核酸擴(kuò)增后產(chǎn)物的分析方法多種多樣，如膜上或微孔板或芯片上探針雜交方法（放射性核素標(biāo)記或非放射性核素標(biāo)記）、直接或酶切后瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳、Southern轉(zhuǎn)移、核酸測(cè)序方法、質(zhì)譜分析等。本區(qū)是最主要的擴(kuò)增產(chǎn)物污染來源，因此必須注意避免通過本區(qū)的物品及工作服將擴(kuò)增產(chǎn)物帶出。在使用PCR-ELISA方法檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，必須使用洗板機(jī)洗板，廢液必須收集至1 mol/L HCl中，并且不能在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)傾倒，而應(yīng)當(dāng)至遠(yuǎn)離PCR實(shí)驗(yàn)室的地方棄掉。用過的吸頭也必須放至1 mol/L HCl中浸泡后再放到垃圾袋中按程序處理，如焚燒。

由于本區(qū)有可能會(huì)用到某些可致基因突變和有毒物質(zhì)如溴化乙錠、丙烯酰胺、甲醛或放射性核素等，故應(yīng)當(dāng)注意實(shí)驗(yàn)人員的安全防護(hù)。

八、PCR 廢棄物的處理程序

1．目的：保證實(shí)驗(yàn)室、實(shí)驗(yàn)人員和外部環(huán)境的安全。

2．適用范圍：核酸擴(kuò)增熒光檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室常用化學(xué)試劑（NaOH、EDTA、乙醇、生理鹽水等）、實(shí)驗(yàn)室廢棄物的處理； 3．負(fù)責(zé)人： 操作人： 4．細(xì)則：

4.1 科室職責(zé)應(yīng)對(duì)本室工作人員講明本程序在預(yù)防交叉、實(shí)驗(yàn)室污染及切斷傳播途徑中的重 要性，并要求嚴(yán)格執(zhí)行。

4.2 實(shí)驗(yàn)室所有垃圾，裝入專用污物袋內(nèi)，各區(qū)備有：生活垃圾袋（黑色）及生物污染垃圾 袋（黃色）。使用過的一次性消耗品(如試管、吸頭、離心管、等)，先放入10%次氯酸鈉溶 液中浸泡2～4 小時(shí)后，再放入黃色垃圾袋內(nèi)，使用過的手套、鞋套等直接放入黃色垃圾袋 內(nèi)集中處理。

4.3 夾取標(biāo)本的工具，如鉗、鑷、接種環(huán)、吸管等，用后均應(yīng)消毒清潔，進(jìn)行微生物檢驗(yàn)時(shí)，應(yīng)重新滅菌，金屬工具可燒灼滅菌或消毒液浸泡；玻璃制品干熱或壓力蒸汽滅菌。4.4 一次性塑料痰盂，用2%戊二醛液浸泡2～4小時(shí)后，放入黃色垃圾袋內(nèi)集中處理。4.5 廢棄標(biāo)本如血、尿、胸水、腹水、腦脊液、唾液、胃液、腸液、關(guān)節(jié)腔液等用10%的84 液浸泡2～4小時(shí)后，集中處理。

4.6 盛標(biāo)本的容器，若為一次性使用的紙質(zhì)容器及其外面包被的廢紙，放入污物袋里 處理；對(duì)可再次使用的玻璃、塑料或搪瓷容器，煮沸15 分鐘或加入10%次氯酸鈉溶液浸泡2～4 小時(shí)，消毒液每日更換，消毒后用洗滌劑及流水刷洗，瀝干，用于微生物培養(yǎng)采樣者，用壓力蒸汽滅菌后備用。

4.7 廢棄標(biāo)本及其容器裝入黃色垃圾袋內(nèi)、封閉，污物處理中心處理。

九、基因擴(kuò)增檢測(cè)實(shí)驗(yàn)及結(jié)果分析

1、目的：保證擴(kuò)增及結(jié)果分析的標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化。2．適用范圍：適用于本室使用的普通離心機(jī)。3．負(fù)責(zé)人： 操作人：

4、標(biāo)準(zhǔn)程序：

4.2.8 發(fā)放報(bào)告：及時(shí)登記檢測(cè)結(jié)果記錄，發(fā)放臨床報(bào)告。

4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果無效的判斷標(biāo)準(zhǔn)：出現(xiàn)下述四種情況中的任何一種或多種，當(dāng)次實(shí)驗(yàn)結(jié)果不可 發(fā)，查找原因，重做實(shí)驗(yàn)。4.3.1 陰性對(duì)照出現(xiàn)擴(kuò)增。4.3.2 陽(yáng)性對(duì)照無擴(kuò)增。

4.3.3 大批甚至所有的標(biāo)本都擴(kuò)增了。4.3.4 室內(nèi)質(zhì)控血清檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)失控情況，實(shí)驗(yàn)失控的具體標(biāo)準(zhǔn)詳見室內(nèi)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)操作程 序。

4.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效的判斷標(biāo)準(zhǔn)：達(dá)到下列要求后，當(dāng)次實(shí)驗(yàn)有效，可以發(fā)放結(jié)果。4.4.1 陰性對(duì)照沒有擴(kuò)增，陽(yáng)性對(duì)照擴(kuò)增。

4.4.2 陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品梯度曲線平滑均勻，斜率、截距和相關(guān)系數(shù)三個(gè)參數(shù)的數(shù)值均在范圍內(nèi)。4.4.3 室內(nèi)質(zhì)控血清檢測(cè)結(jié)果處于在控狀態(tài)，具體標(biāo)準(zhǔn)詳見

十、臨床標(biāo)本的保存操作程序

1．目的：臨床標(biāo)本正確保存，以便必要時(shí)復(fù)查。2．適用范圍：分子診斷室的所有臨床檢測(cè)標(biāo)本。3．負(fù)責(zé)人： 操作人： 4．程序：

4．1 處理前的標(biāo)本保存

a）全血標(biāo)本可4℃下短期（24h 內(nèi)）保存，長(zhǎng)期保存則需分離出血清（血漿），保存于-20℃下。

b）咽拭子、痰或胸腹水、腦脊液、膿液標(biāo)本短保存于-70℃下。4．2 報(bào)告發(fā)出后的標(biāo)本保存：

a）提取的核酸標(biāo)本當(dāng)天檢測(cè)可置4℃保存，如當(dāng)天不檢測(cè)應(yīng)置-20℃保存。報(bào)告發(fā)出后第二天丟棄。

b）原始血清/血漿樣本在報(bào)告發(fā)出后放入低溫冰箱-20℃保存1 個(gè)星期，以備復(fù)查。超過1 個(gè)星期保存期的標(biāo)本由室負(fù)責(zé)人酌情處理，一般按生物傳染性物品統(tǒng)一處理。

c）血清/血漿標(biāo)本放置低溫冰箱保存時(shí)須有記錄，按編號(hào)順序存放，并由專人負(fù)責(zé)管理。4．3 特殊標(biāo)本的處理：

對(duì)暫不檢測(cè)的項(xiàng)目和規(guī)定時(shí)間外收到的零散樣本，要隨時(shí)登記和交班，以免漏檢，遺失和延誤檢驗(yàn)。對(duì)特殊樣本或特殊病人的樣本，實(shí)行“首接”負(fù)責(zé)制，所謂特殊樣本是指難于采集的樣本，以及特殊病人的樣本一律實(shí)行“首接”負(fù)責(zé)制，無論那位工作人員，一旦收到樣本后，均須負(fù)其責(zé)任，不得以任何借口推托，及時(shí)和正確保管和轉(zhuǎn)送樣本到有關(guān)實(shí)驗(yàn)室或有關(guān)人員，同時(shí)作交班記錄和雙簽名。

十一、臨床標(biāo)本的采集、運(yùn)送、接收程序

1．目的：規(guī)范臨床待檢標(biāo)本的正確采集、送檢和處理。2．適用范圍：分子診斷室的所有臨床檢測(cè)標(biāo)本。3．負(fù)責(zé)人： 操作人： 4．程序： 4．1 標(biāo)本的采集

4．1．1 標(biāo)本由臨床各科室接受過臨床基因擴(kuò)增檢測(cè)有關(guān)標(biāo)本采集、保存、運(yùn)輸知識(shí)培訓(xùn)的醫(yī)護(hù)人員采集并送至實(shí)驗(yàn)室。4．1．2 標(biāo)本采集要求

a）血液標(biāo)本：用2ml 真空采集管或1.5ml 高壓滅菌離心管采集血液標(biāo)本，血標(biāo)本采集后在2 小時(shí)內(nèi)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室。離心（檢驗(yàn)單與標(biāo)本一道）后用一次性吸管吸取血清或血漿加入經(jīng)消毒的1.5ml 的離心管中，編號(hào)。

b）痰標(biāo)本：用帶蓋的無菌一次性塑料瓶收集清晨第一口痰標(biāo)本送檢。（對(duì)于無痰或少痰的患者，可用45℃加溫的100g/L NaCl 水溶液霧化吸入或改變體位以使痰液易于咳出；對(duì)于小兒可以輕壓胸骨柄上方以誘導(dǎo)咳痰，用消毒棉拭子刺激喉部引起咳嗽反射，用棉拭子采集標(biāo)本。）標(biāo)本在室溫下保存不能超過24 小時(shí)。4．2 標(biāo)本的運(yùn)送

標(biāo)本采集后，密閉、標(biāo)（貼）姓名，應(yīng)盡可能快的送至檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室，如運(yùn)送時(shí)間需2 小時(shí)以上，必須用冰盒送至實(shí)驗(yàn)室。4．5 接收

4．5．1 嚴(yán)格對(duì)各類樣本的查對(duì)和雙簽制度，對(duì)病房各樣本及時(shí)進(jìn)行驗(yàn)收，查對(duì)，不符合要求的樣本一律退回，并有書面記錄。

十二、PCR 生物安全防護(hù)措施

1．目的：預(yù)防工作人員在實(shí)驗(yàn)過程中被感染或污染。2．適用范圍：適用于本室所有工作人員。3．負(fù)責(zé)人： 操作人： 4．細(xì)則： 4．1 實(shí)驗(yàn)人員在實(shí)施生物防護(hù)措施時(shí)，應(yīng)嚴(yán)格遵守各項(xiàng)相應(yīng)的規(guī)章制度，建立起強(qiáng)烈的生物防護(hù)意識(shí)。

4．2 每天更換廢液缸的2%戊二醛溶液，并保證2%戊二醛溶液用量為廢液缸內(nèi)總液量的五分之一左右。

配置消毒液時(shí)，正確量取足量的消毒劑（用量杯，保證濃度），水的用量也要正確，缸體密封性良好。

4．3 實(shí)驗(yàn)臺(tái)面日常清潔時(shí)使用75%的酒精擦拭。

4．4 每區(qū)每次實(shí)驗(yàn)后紫外燈照射30～60 分鐘，如有需要可延長(zhǎng)照射時(shí)間。

4．5 所有來自病人的血液或體液標(biāo)本均應(yīng)視作傳染源，因此在標(biāo)本的采集、運(yùn)輸過程中，標(biāo)本容器應(yīng)完好無泄漏。

4．6 處理標(biāo)本時(shí)應(yīng)穿工作服、戴手套，以免沾上皮膚。如手或其它部位的皮膚沾上血液或體液標(biāo)本以及試劑，應(yīng)立即沖洗干凈。有下列情況之一者，需另外消毒：手接觸有傳染性的微生物，水龍頭、水池肥皂可能被污染，工作服可能被大量細(xì)菌污染。消毒劑可用“84”消毒液。4．7 在實(shí)驗(yàn)過程中，病人標(biāo)本（血液、體液）或試劑不慎濺入眼內(nèi)應(yīng)立即用清水洗。4．8 實(shí)驗(yàn)過程中在使用針具等銳器時(shí)，盡量小心防止受傷。若被銳器刺破時(shí)，應(yīng)立即脫下手套，盡量擠壓傷處，使血流出，然后用碘酒、酒精消毒，必要時(shí)進(jìn)行預(yù)防補(bǔ)救措施。4．9 在實(shí)驗(yàn)過程中病人標(biāo)本（血液、體液）外漏時(shí)，應(yīng)立即用2%戊二醛滴上，濾紙或紗布蓋上半小時(shí)，然后用酒精擦洗，并用紫外燈消毒。

4．10 實(shí)驗(yàn)完畢離開時(shí)，應(yīng)脫下所有該實(shí)驗(yàn)區(qū)個(gè)人防護(hù)裝備。4．11 實(shí)驗(yàn)完畢后應(yīng)對(duì)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行紫外消毒。

4．12 遇有意外事故應(yīng)立即報(bào)告科室負(fù)責(zé)人，當(dāng)事人應(yīng)立即注射相關(guān)疫苗或進(jìn)行預(yù)防性治療，并進(jìn)行醫(yī)學(xué)觀察，嚴(yán)重者應(yīng)報(bào)告技術(shù)負(fù)責(zé)人。

十三、PCR 實(shí)驗(yàn)室化學(xué)試劑配制程序

1．目的：保證實(shí)驗(yàn)中用到的各種溶液符合實(shí)驗(yàn)要求。

2．適用范圍：核酸擴(kuò)增熒光檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室常用溶液：4%NaOH 溶液、75%酒精、消毒劑（三氯異氰尿酸或 二氯異氰尿酸鈉）、2%戊二醛溶液等。3．負(fù)責(zé)人： 操作人： 4．程序： 4．4 化學(xué)試劑的配制：

4．4．1 用具：干燥潔凈的250ml 量桶一只，1000ml 量桶一只，1000ml 燒杯一只，三角燒瓶?jī)芍?，天平一架?00ml 塑料試劑瓶、2000ml 廣口瓶各一只。4．4．2 配制步驟：

4．4．2．1 配制4%NaOH 溶液: a）用天平稱取4 克分析純的NaOH 固體，置于一只三角燒瓶中。

b）用250ml 量桶準(zhǔn)確取100ml 水，緩緩注入盛放NaOH 固體的三角燒瓶中。c）搖蕩三角燒瓶使NaOH 固體充分溶解。

d）然后緩緩傾倒入100ml 塑料試劑瓶中密封保存?zhèn)溆谩?．4．2．2 配制消毒劑: a）一般桌面、器具和地面的消毒只要使有效氯達(dá)到500mg/L，即可達(dá)到消毒作用。

b）消毒劑為粉狀（20 克/袋），如配制一升的消毒劑溶液，則取500g，倒入燒杯中，緩緩加入1000ml水充分溶解，備用。

c）如需加大消毒力度，則有效氯濃度加大。4．4．2．3 配制2%戊二醛溶液: a）準(zhǔn)確量取戊二醛原液20ml 倒入1000ml 燒杯中。

b）量取980ml 水，緩緩倒入1000ml 燒杯中，混勻，加至2000ml 廣口瓶中備用。注意事項(xiàng)：每份配制好的溶液保質(zhì)期為14 天

十四、PCR 應(yīng)急處理程序

1．目的：在實(shí)際工作中，儀器設(shè)備發(fā)生故障、試劑盒發(fā)生質(zhì)量問題時(shí)，為保證檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性、及時(shí)，應(yīng)正確采取應(yīng)急措施，最大程度上避免或減輕不利影響。

2．適用范圍：適用于滿足核酸擴(kuò)增熒光檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)需要并可能對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果造成誤差的儀器設(shè)備和試劑盒。3．負(fù)責(zé)人： 4．細(xì)則： 4．1 核酸擴(kuò)增熒光檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室工作人員在職責(zé)范圍內(nèi)均有責(zé)任熟悉各種儀器和相關(guān)設(shè)備的性能、要求、維護(hù)和保養(yǎng)、常見故障的排除、尤其要嚴(yán)格按照操作規(guī)程操作。

4．2 工作人員在職責(zé)范圍內(nèi)均有責(zé)任有意識(shí)地注意以求及時(shí)發(fā)現(xiàn)并報(bào)告儀器設(shè)備和試劑盒的異常情況。

4．3 作為應(yīng)急處理，潛在著一定的可能影響檢測(cè)質(zhì)量的不確定因素。室負(fù)責(zé)人負(fù)責(zé)在第一時(shí)間檢查核實(shí)應(yīng)急措施的有效性。4．4 儀器設(shè)備故障

4．4．1 室負(fù)責(zé)人接到異常情況報(bào)警后，立即現(xiàn)場(chǎng)確認(rèn)異常情況的性質(zhì)：觀察有誤、誤操作、偶發(fā)現(xiàn)象或確屬不能立即排除的故障。

4．4．2 用紅牌故障標(biāo)志標(biāo)示故障儀器，以防被錯(cuò)誤使用。

4．4．3 有滿足要求的替用設(shè)備的，啟用替用設(shè)備（準(zhǔn)用儀器）。借用其他部門儀器設(shè)備時(shí)，及時(shí)聯(lián)系借用并核實(shí)該設(shè)備的使用狀態(tài)。替用、借用或備用設(shè)備的使用在滿足質(zhì)量要求的同時(shí)，必須同時(shí)滿足實(shí)驗(yàn)室管理措施（特別是防污染）的要求。

4．4．4 不能解決的問題，應(yīng)及時(shí)與供應(yīng)方會(huì)同解決。根據(jù)雙方合同約定，及時(shí)通知供應(yīng)方。供應(yīng)方技術(shù)支持人員將在規(guī)定的時(shí)間內(nèi)隨身攜帶備用設(shè)備到達(dá)現(xiàn)場(chǎng)。

4．4．5 儀器維修后，必須經(jīng)驗(yàn)收合格并供需雙方簽字，調(diào)試實(shí)驗(yàn)通過后才能重新啟用。取下紅色故障標(biāo)示（暫停使用），換上藍(lán)色正常標(biāo)示（正常使用）。4．4．6 科室主任須檢查并隨時(shí)跟蹤所采取措施的有效性。

4．4．7 對(duì)未能及時(shí)排除故障時(shí)，必須及時(shí)上報(bào)科室，在科主任批準(zhǔn)下，應(yīng)積極聯(lián)系附近的其他已得到衛(wèi)生部臨檢中心認(rèn)證的臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)，以滿足病人和臨床或科研需求。

4．5 試劑盒質(zhì)量發(fā)生問題，經(jīng)核實(shí)后，及時(shí)通知供貨商迅速更換另一批次試劑，使用前需先作質(zhì)量檢測(cè)，合格后方可使用。

4．6 儀器設(shè)備故障或試劑質(zhì)量問題不能得到解決，預(yù)期將會(huì)影響到檢測(cè)報(bào)告的及時(shí)發(fā)出，可將標(biāo)本送至其它已得到衛(wèi)生部臨檢中心認(rèn)證的臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室檢。4．7 影響到檢測(cè)報(bào)告發(fā)出的情況，應(yīng)在應(yīng)急處理記錄表作記錄。

十五、試劑的質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)操作程序 1．目的：保證每批用于臨床實(shí)驗(yàn)的試劑的質(zhì)量良好，符合要求。2．適用范圍：各種用于臨床實(shí)驗(yàn)的核酸擴(kuò)增熒光檢測(cè)試劑。3．負(fù)責(zé)人： 操作人： 4．程序：

4．1 收到試劑后，目測(cè)試劑是否處在凍存狀態(tài)。

4．2 核對(duì)試劑品種和數(shù)量并檢查包裝：外包裝（廠名廠址、、批準(zhǔn)文號(hào)、批號(hào)和有效期等）；內(nèi)包裝（試劑瓶完整性、試劑配備品種完整性、使用說明書有否等）。4．3 及時(shí)將試劑轉(zhuǎn)入－20℃冰箱保存。將上述檢測(cè)核對(duì)情況在記錄本上登記。

4．4 最遲在前批次試劑存量尚可維持常規(guī)實(shí)驗(yàn)一周時(shí)，按如下要求對(duì)新批號(hào)試劑進(jìn)行效驗(yàn)實(shí)驗(yàn)。

4．5 效驗(yàn)實(shí)驗(yàn)：

4．5．1 要求設(shè)置：空白對(duì)照、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照、室內(nèi)質(zhì)控各一，陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品梯度（104、105、106、108）。

4．5．2 出現(xiàn)如下情況中任何一種的，判斷為試劑不合格，不能用于臨床檢測(cè)： a）空白對(duì)照出現(xiàn)擴(kuò)增。如擴(kuò)增曲線CT 值大于25，需重復(fù)實(shí)驗(yàn)確證試劑污染。

b）陽(yáng)性對(duì)照和陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品均未檢出，或陽(yáng)性對(duì)照未檢出而陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品檢出率大幅下降，表示試劑失效或檢測(cè)靈敏度大幅下降。

4．5．3 陽(yáng)性對(duì)照未檢出，陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)正常，提示樣品提取液可能存在問題。重復(fù)新舊提取液陽(yáng)性對(duì)照實(shí)驗(yàn)，確定提取液失效問題。更換提取液后該批試劑方可使用。

4．5．4 空白對(duì)照無擴(kuò)增，陰性對(duì)照有擴(kuò)增，排除其他污染可能性后，提取液存在污染可能。單獨(dú)用提取液點(diǎn)樣上機(jī)，出現(xiàn)擴(kuò)增，需更換提取液后方可使用該批試劑。

4．5．5 陽(yáng)性對(duì)照檢出，陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品未檢出或擴(kuò)增曲線明顯系統(tǒng)性CT 值偏大5 個(gè)循環(huán)以上。提示陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品存在問題。更換陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品后該批試劑方可投入使用。

4．5．6 空白對(duì)照、陰性對(duì)照無擴(kuò)增，陽(yáng)性對(duì)照正常檢出，陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品導(dǎo)出的標(biāo)準(zhǔn)曲線之斜率（－2.9～－3.9）、截距（26～34）、相關(guān)性（﹤－0.99）均在使用范圍內(nèi)，表明該批試劑良好，可以投入臨床使用。4．6 將實(shí)驗(yàn)結(jié)果歸入記錄。

十六、離心機(jī)操作維護(hù)程序

1．目的：保證離心機(jī)的正常使用。

2．適用范圍：適用于本室使用的普通離心機(jī)。3．負(fù)責(zé)人： 操作人： 4.性能參數(shù):見說明書。5．程序：

5．1 離心機(jī)應(yīng)放置在水平堅(jiān)固的地板或平臺(tái)上，并力求使儀器處于水平位置以免離心時(shí)造成儀器振蕩。

5．2 打開電源開關(guān)，將預(yù)先平衡好的樣品對(duì)稱放置于轉(zhuǎn)頭的樣品架上，關(guān)閉機(jī)蓋。5．3 旋動(dòng)定時(shí)旋鈕設(shè)定離心時(shí)間，緩慢旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)速調(diào)節(jié)旋鈕使儀器轉(zhuǎn)速達(dá)到預(yù)定要求。5．4 離心完畢后，將轉(zhuǎn)速調(diào)節(jié)旋鈕調(diào)回零位，關(guān)閉電源開關(guān)。

5．5 待離心機(jī)完全停止轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)打開機(jī)蓋，取出離心樣品，再次關(guān)閉機(jī)蓋結(jié)束離心。5．6 離心室的清潔：為了避免樣本等殘留物的污染，應(yīng)經(jīng)常對(duì)離心機(jī)外殼和離心室進(jìn)行清潔處理。對(duì)離心室清潔，應(yīng)先打開離心機(jī)蓋，撥掉電源線，用專用設(shè)備將離心機(jī)轉(zhuǎn)子旋下，再用中性去污劑（70%的異丙醇/水混合物或乙醇去污染）清潔離心室；離心室內(nèi)的橡膠密封圈經(jīng)去污劑處理后，用水沖洗，再用甘油潤(rùn)滑。

5．7 轉(zhuǎn)子的清潔：轉(zhuǎn)子會(huì)被樣本殘留物污染，也可能會(huì)被某些化學(xué)試劑腐蝕，因此應(yīng)對(duì)轉(zhuǎn)子每月進(jìn)行清潔維護(hù)。每月用中性的清潔劑清潔轉(zhuǎn)子一次，并在儀器維護(hù)記錄本上作好記錄，以延長(zhǎng)轉(zhuǎn)子的壽命。6.儀器維護(hù)

(1)為確保安全和離心效果,儀器必須放置在堅(jiān)固水平的臺(tái)面上,塑料蓋門上不得放置任何物品,樣品必須對(duì)稱放置,并在開機(jī)前確保已擰緊螺母。

(2)應(yīng)經(jīng)常檢查轉(zhuǎn)頭及試驗(yàn)用的離心管是否有裂紋,老化等現(xiàn)象,如有須及時(shí)更換.(3)試驗(yàn)完畢后,需將儀器擦拭干凈,以防腐蝕.(4)如樣品比重超過1.2g/cm3,最高轉(zhuǎn)速n 按下式計(jì)算:n=nmax*√--1.2/樣呂比重.(5)當(dāng)電機(jī)碳刷長(zhǎng)度小于6mm 時(shí),必須及時(shí)更換.(6)在離心機(jī)未停穩(wěn)時(shí)不得開蓋.(7)儀器必須有可靠接地.(8)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,請(qǐng)關(guān)閉后面的電源開關(guān),撥掉電源插頭時(shí),請(qǐng)不要忘了打開后面的電源開關(guān).(9)該儀器在日常使用中請(qǐng)注意符合“5.6,5.7”要求。(10)嚴(yán)格按照儀器的開關(guān)機(jī)程序關(guān)機(jī)。7.期間核查

(1)本儀器不需要特別的周期間隔。

(2)校準(zhǔn)物均為與ICSH 之標(biāo)準(zhǔn)相符合的校準(zhǔn)物，測(cè)定值偏差均不超過其規(guī)定值。

十七、冰箱操作維護(hù)規(guī)程

1．目的：對(duì)冰箱進(jìn)行適當(dāng)?shù)木S護(hù)，以確保冰箱的正常使用。2．適用范圍：本實(shí)驗(yàn)室使用的各種品牌、型號(hào)的冰箱。3．負(fù)責(zé)人： 操作人： 4.性能參數(shù):見說明書。5．程序：

4．1 開、關(guān)機(jī)：冰箱按說明書要求放好后，插上電源線，冷藏室溫度開關(guān)置于4℃，冷凍室溫度開關(guān)置于-20℃，2 小時(shí)后用溫度計(jì)確認(rèn)。系統(tǒng)進(jìn)入正常運(yùn)行狀態(tài)后即可使用。4．2 外冰箱應(yīng)放置于水平地面并留有一定的散熱空間。外接電源電壓必須匹配，并要求有良好的接地線。

4．3 冰箱內(nèi)禁止存放與本實(shí)驗(yàn)室無關(guān)的物品。

4．4 放入冰箱內(nèi)的所有試劑、樣品、質(zhì)控品等必須密封保存。

4．5 保持冰箱出水口通暢；非自動(dòng)除霜冰箱應(yīng)在每月底除霜；月底清潔冰箱，清潔時(shí)切斷電源，用軟布蘸水擦拭冰箱內(nèi)外，必要時(shí)可用中性洗滌劑。4．6 每日觀察冰箱內(nèi)溫度并記錄于冰箱的質(zhì)控圖上。

4．7 若溫度超出規(guī)定范圍，調(diào)節(jié)溫控使其回到正常范圍，并進(jìn)行記錄。

4．8 若溫控調(diào)節(jié)無效，報(bào)請(qǐng)?jiān)O(shè)備科維修，修理后須驗(yàn)收合格并簽字后方能正常使用。6.儀器維護(hù)

(1)使用注意。該儀器在日常使用中請(qǐng)注意符合“4.注意事項(xiàng)”要求

(2)廢液瓶滿要及時(shí)倒掉廢液，切勿強(qiáng)行扯動(dòng)紅黃兩根管來打開瓶蓋，檢查廢液瓶是否漏氣，防止低真空出現(xiàn)。

(3)當(dāng)出現(xiàn)堵孔時(shí)，按自動(dòng)沖洗鍵沖洗管道。(4)嚴(yán)格按照儀器的關(guān)機(jī)程序關(guān)機(jī)。7.期間核查

(1 冰箱不需要特別的周期間隔。

(2)校準(zhǔn)物均為與ICSH 之標(biāo)準(zhǔn)相符合的校準(zhǔn)物，測(cè)定值偏差均不超過其規(guī)定值。

十八、生物安全柜操作維護(hù)規(guī)程

1．目的：正確使用生物安全柜。

2．適用范圍：本SOP 適用于本實(shí)驗(yàn)室使用的生物安全柜。3．負(fù)責(zé)人： 操作人： 4.性能參數(shù):見說明書。5．程序：

5．1 新安裝或長(zhǎng)期未使用的生物安全柜，使用前必須用超凈真空吸塵器或不產(chǎn)生纖維的物品認(rèn)真進(jìn)行清潔工作。

5．2 接通電源，使用前應(yīng)提前15～30 分鐘同時(shí)開啟紫外燈和風(fēng)機(jī)組工作。

5．3 當(dāng)需要調(diào)節(jié)風(fēng)機(jī)風(fēng)速時(shí)，用生物安全柜操作面板上的風(fēng)速調(diào)節(jié)鈕進(jìn)行調(diào)節(jié)。風(fēng)機(jī)、照明均由指示燈指示其工作狀態(tài)。

5．4 工作臺(tái)面上禁止存放不必要的物品，以保持工作區(qū)的潔凈氣流不受干擾。

5．5 禁止在工作臺(tái)面上記錄書寫，工作時(shí)應(yīng)盡量避免作明顯擾動(dòng)氣流的動(dòng)作；禁止在預(yù)過濾進(jìn)風(fēng)口部位放置物品，以免擋住進(jìn)風(fēng)口造成進(jìn)風(fēng)量減少，降低凈化能力。

5．6 使用結(jié)束后，用消毒液清理工作臺(tái)面后打開紫外燈，15～30 分鐘后關(guān)閉紫外燈，關(guān)閉生物安全柜電源。每次使用生物安全柜后，均需對(duì)其進(jìn)行清潔。

5．7 根據(jù)環(huán)境潔凈程度，定期將預(yù)過濾器中的濾料拆下清洗，一般間隔時(shí)間為3～6 個(gè)月。5．8 定期（一般每半年1 次）計(jì)測(cè)工作區(qū)風(fēng)速，如發(fā)現(xiàn)不符合技術(shù)參數(shù)要求，則可調(diào)大風(fēng)機(jī)供電電壓。當(dāng)風(fēng)機(jī)組電壓調(diào)到最大時(shí)，工作區(qū)風(fēng)速仍達(dá)不到0.3m/s，則必須更換高效空氣過濾器（由廠家或院儀器維修人員進(jìn)行）。

4．9 有相應(yīng)的維護(hù)記錄，長(zhǎng)期不使用的生物安全柜撥下電源插頭。6.儀器維護(hù)

(1)使用注意。該儀器在日常使用中請(qǐng)注意符合“4.注意事項(xiàng)”要求(2)廢液瓶滿要及時(shí)倒掉廢液，切勿強(qiáng)行扯動(dòng)紅黃兩根管來打開瓶蓋，檢查廢液瓶是否漏氣，防止低真空出現(xiàn)。

(3)當(dāng)出現(xiàn)堵孔時(shí)，按自動(dòng)沖洗鍵沖洗管道。(4)嚴(yán)格按照儀器的關(guān)機(jī)程序關(guān)機(jī)。7.期間核查

(1)PE-5700 基因擴(kuò)增儀的定標(biāo)不需要特別的周期間隔，本實(shí)驗(yàn)室PE-5700 基因擴(kuò)增儀執(zhí)行衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心的指定校準(zhǔn)。

(2)校準(zhǔn)物均為與ICSH 之標(biāo)準(zhǔn)相符合的校準(zhǔn)物，測(cè)定值偏差均不超過其規(guī)定值。

十九、移液器操作維護(hù)規(guī)程

1．目的：確保移液的精確性，正確使用移液器。2．適用范圍：本實(shí)驗(yàn)室使用的可調(diào)式移液器。3．負(fù)責(zé)人： 操作人： 4．程序： 4．1 移液器的使用

4．1．1 轉(zhuǎn)動(dòng)旋鈕設(shè)定移液量，設(shè)定的移液量不可超出該移液器規(guī)定的范圍。4．1．2 裝上配套的Tip。4．1．3 前進(jìn)移液法

a）將按鈕壓至第一停點(diǎn)位置；

b）將移液管管嘴浸入液面下2~3mm 深處，然后慢慢松開按鈕吸入液體。待移入管嘴吸滿液體后，將管嘴撤出液面，擦掉管嘴外側(cè)的所有液滴。

c）輕輕壓下操作按鈕至第一停點(diǎn)位置，放出液體。約1 秒鐘后，繼續(xù)將操作按鈕向下壓至第二停點(diǎn)位置。待管嘴液體放干凈后，將管嘴貼在容器瓶壁上防止形成液滴滴入瓶中，撤出管嘴。

d）松開按鈕使之回到起點(diǎn)位置。需要時(shí)，可更換管嘴繼續(xù)移液操作。4．1．4 倒退移液法：適用于高粘度液體及/或易起泡沫液體的移液。a）將操作按鈕向下壓至第二停點(diǎn)位置。

b）將移液管管嘴浸入試劑瓶液面下2~3mm 深處，然后慢慢松開鈕吸入液體。待移入管嘴吸滿液體后，將管嘴撤出液面，擦掉管嘴外側(cè)的所有液滴。c）輕輕壓下操作按鈕至第一停點(diǎn)位置，放出液體。

d）遺留在管嘴時(shí)的液體或者隨管嘴一起扔掉，或者放回原來的容器中。4．1．5 重復(fù)操作法：重復(fù)操作移液法可以快速、簡(jiǎn)便地重復(fù)轉(zhuǎn)移同體積的同種液體。a）將操作按鈕向下壓至第二停點(diǎn)位置。

b）將移液管管嘴浸入液面下2~3mm 深處，然后慢慢松開按鈕吸入液體。待移入管嘴吸滿液體后，將管嘴貼在容器瓶壁上防止形成液滴滴入瓶中。

c）輕輕壓下操作按鈕至第一停點(diǎn)位置，放出液體。待放完所需體積液體后，把按鈕停在第一停點(diǎn)位置，不包括在移液量之內(nèi)的少量液體仍留在管嘴內(nèi)，管嘴外的液滴則需包括在移液量之內(nèi)。

d）將管嘴浸入試劑液面下不遠(yuǎn)處，然后慢慢松開按鈕使管嘴重新吸入液體。(3)e）重復(fù)步序c）和d）繼續(xù)移液操作，就可重復(fù)轉(zhuǎn)移相同體積液體。4．2 移液器的維護(hù)

每天對(duì)使用過的移液器用75%酒精進(jìn)行擦拭。每周1 次對(duì)移液器咀進(jìn)行75%酒精浸泡15 分鐘左右，若使用過程中發(fā)生污染應(yīng)隨時(shí)浸泡處理。4．3 移液器的校準(zhǔn)

為確保移液器加樣的精確性和準(zhǔn)確性，正確使用移液器，需定期（一年）對(duì)移液器進(jìn)行校準(zhǔn) 4．3．1 校準(zhǔn)環(huán)境和用具要求室溫：20～25℃，測(cè)定中波動(dòng)范圍不大于±0.5℃。

電子天平：放置于無塵和震動(dòng)影響的臺(tái)面上，房間盡可能有空調(diào)。稱量時(shí)，為保證天平內(nèi)的濕度（相對(duì)濕度60～90%），天平內(nèi)應(yīng)放置一裝有10mL 蒸餾水的小燒杯。

小燒杯：5～10mL 體積。測(cè)定液體：溫度為20～25℃的去氣雙蒸水。選定校準(zhǔn)體積： a）擬校準(zhǔn)體積；

b）移液器標(biāo)定體積的中間體積。

c）最小可調(diào)體積（不小于擬定體積的10%）。如為固定體積移液器，則只有一種校準(zhǔn)體積。4．3．2 校準(zhǔn)步驟

a）將移液器調(diào)至擬校準(zhǔn)體積，選擇合適的吸頭； b）調(diào)節(jié)好天平；

c）來回吸吹蒸餾水3 次，以使吸頭濕潤(rùn)，用紗布拭干吸頭；

d）垂直握住移液器，將吸頭浸入液面2～3mm，緩慢（1～3 秒）一致地吸取蒸餾水 e）將吸頭離開液面，靠在管壁，去掉吸頭外部的液體；

f）將移液器以30℃角放入稱量燒杯中，緩慢一致地將移液器壓至第一檔，等待1～3 秒，再壓至第二檔，使吸頭里的液體完全排出； g）記錄稱量值； h）擦干吸頭外面； i）按上步驟稱量10 次； j）取10 次測(cè)量值的均值作為最后移液器吸取的蒸餾水重量，按表1 所列蒸餾水Z 因子計(jì)算體積；

k）按校準(zhǔn)結(jié)果調(diào)節(jié)移液器。4．3．3 比較校準(zhǔn)法

利用經(jīng)計(jì)量局校準(zhǔn)并頒發(fā)校準(zhǔn)報(bào)告之同型號(hào)移液器，在移液器量程范圍的高低兩個(gè)檔各選擇一個(gè)校準(zhǔn)點(diǎn)

(4)用電子天平稱量結(jié)果與已校準(zhǔn)移液器稱量結(jié)果進(jìn)行比較，完成校準(zhǔn)。

參考文件：

1.衛(wèi)生部辦公廳關(guān)于印發(fā)《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增管理辦法》的通知 2.衛(wèi)生部檢驗(yàn)中心《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室工作導(dǎo)則》 3.《實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求》（GB19489-2008）。

4.ISO15189 質(zhì)量管理體系范本文件（第六冊(cè)）

第五篇：PCR實(shí)驗(yàn)中的幾點(diǎn)體會(huì)

PCR實(shí)驗(yàn)中的幾點(diǎn)體會(huì)

PCR實(shí)驗(yàn)是一項(xiàng)對(duì)儀器設(shè)備、環(huán)境設(shè)施及操作步驟要求非常嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)過程中檢測(cè)目的成份會(huì)被擴(kuò)增放大到千百萬倍。因而實(shí)驗(yàn)過程中很小的一點(diǎn)誤差、非常微量的污染都可能導(dǎo)致結(jié)果錯(cuò)誤甚至實(shí)驗(yàn)失敗。我們?cè)趯?shí)際工作中，從環(huán)境控制到儀器維護(hù)及工作流程的每一步做到嚴(yán)格要求細(xì)致入微，樣本檢測(cè)、室內(nèi)質(zhì)控及室間質(zhì)評(píng)都取得了滿意成績(jī)，在此次PCR實(shí)驗(yàn)室復(fù)審中得到專家老師的肯定，現(xiàn)將我們?cè)诠ぷ髦姓J(rèn)為需地注意的地方提出來，以供商榷：

一、環(huán)境控制 為控制溫度而使用空調(diào)時(shí)必須特別注意避免污染。我們的做法是清潔空調(diào)過濾網(wǎng)，待干，紫外線消毒30分鐘，正反面相同。開機(jī)之前用1：100“84”消毒液浸濕的紗布包住出風(fēng)口，運(yùn)行30分鐘，使吸附空調(diào)機(jī)內(nèi)的灰塵。

二、試劑配制

所有的試劑都盡可能平衡到室溫后再使用。HBV-DNA檢測(cè)中的濃縮液及質(zhì)控物，融化后定量分裝離心管中，一次用不完的凍存到下次使用，避免反復(fù)凍融。

三、樣本制備

吸取上清液 吸頭不要接觸到離心管內(nèi)壁，盡量在離心管中央，懸停在液面下隨液面下降而逐漸下移，盡量吸凈上清液。

沉淀處理 HBV-DNA濃縮過程中的沉淀，用振蕩器很難完全分散也可能影響核酸的提取，導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果偏低。我們的做法是用一只小鑷子輕敲離心管底部使沉淀盡可能分散，充分混勻，然后點(diǎn)離一下。

提取 提取液是一種混懸液，易沉淀，加取過程中要不斷抽吸混勻。加樣 核酸的提取液2ul加入反應(yīng)管中，這一步移液器使用非常關(guān)鍵。首先保證移液器和吸頭是配套的，再就是吸頭是垂直于液面吸取樣本，移液時(shí)用力要均勻，盡可能一次性移出全部樣本。2ul移液器校正困難，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系不好時(shí)，可以考慮是否是移液器使用時(shí)間過久，應(yīng)該及時(shí)更換。

四、擴(kuò)增分析 擴(kuò)增儀最好先預(yù)熱一下，再使用。擴(kuò)增開始后應(yīng)注意觀察溫度曲線。不符合溫度變化規(guī)律的曲線如升溫曲線變得平坦提示儀器部分或全部加熱模塊功能損壞，從而導(dǎo)致結(jié)果錯(cuò)誤。在結(jié)果判定時(shí)應(yīng)注意分析擴(kuò)增曲線，曲線出現(xiàn)倒“S”形，常提示病毒含量較高，必須稀釋后復(fù)查。