第一篇：pcr檢測(cè)技術(shù)

《食品安全學(xué)》綜述

PCR快速檢測(cè)技術(shù)綜述

1．前言

聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）是80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)。它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、易自動(dòng)化等突出優(yōu)點(diǎn)；能在一個(gè)試管內(nèi)將所要研究的目的基因或某一DNA片段于數(shù)小時(shí)內(nèi)擴(kuò)增至十萬乃至百萬倍，是肉眼能直接觀察和判斷；可從一根頭發(fā)、一滴血、甚至一個(gè)細(xì)胞中擴(kuò)增出足量的DNA供分析研究和檢測(cè)鑒定。過去幾天幾個(gè)星期才能做到的事情，用PCR幾個(gè)小時(shí)便可完成。PCR技術(shù)是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的一項(xiàng)革命性創(chuàng)舉和里程碑。

該酶促反應(yīng)最基本的3個(gè)環(huán)節(jié)是：[1]模板DNA的變性，即在94℃下模板雙鏈DNA變?yōu)閱捂淒NA；[2]引物與模板鏈的特異性復(fù)性；[3]引物鏈的延伸。

2.研究的目的與意義

聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)建立以來，定性技術(shù)不斷改進(jìn)和完善，可以達(dá)到檢測(cè)單個(gè)靶序列的水平、但實(shí)際工作中常需要定量檢測(cè)標(biāo)本中核酸，而不是某一特定序列存在與否，借助PCR對(duì)基因快速、敏感、特異而準(zhǔn)確定量成為目前分子生物學(xué)技術(shù)研究的熱點(diǎn)之一。定量PCR旨在評(píng)估樣品中靶分子數(shù)，此測(cè)定可以是絕對(duì)的，如每微克樣本中靶DNA的分子數(shù)；也可以是相對(duì)定量，即與設(shè)定的內(nèi)參照或外參照比較而言。鑒于PCR方法主要有5個(gè)，即對(duì)PCR產(chǎn)物的直接定量、極限稀釋法、靶基因與參照基因的同步擴(kuò)增、競(jìng)爭(zhēng)性PCR和熒光定量PCR[1]。這幾種放啊各有利弊，對(duì)其選擇取決于靶基因的特性、對(duì)PCR產(chǎn)量的期望值、對(duì)準(zhǔn)確度的要求、需要相對(duì)還是絕對(duì)定量。

人類對(duì)于核酸的研究已經(jīng)有100多年的歷史。20世紀(jì)60年代末70年代初，人們致力于研究基因的體外分離技術(shù)。但是，由于核酸的含量較少，一定程度上限制了DNA的體外操作。Khorana于1971年最早提出核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想。但是，當(dāng)時(shí)的基因序列分析方法尚未成熟，對(duì)熱具有較強(qiáng)穩(wěn)定性的DNA聚合酶還未發(fā)現(xiàn)，寡核苷酸引物的合成仍處在手工、半自動(dòng)合成階段，這種想法似乎沒有任何實(shí)際意義。

1985年，美國(guó)科學(xué)家Kary Mullis在高速公路的啟發(fā)下，經(jīng)過兩年的努力，發(fā)明了PCR技術(shù)，并在Science雜志上發(fā)表了關(guān)于PCR技術(shù)的第一篇學(xué)術(shù)論文。從此，PCR技術(shù)得到了生命科學(xué)界的普遍認(rèn)同，Kary Mullis也因此而獲得1993年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。

但是，最初的PCR技術(shù)相當(dāng)不成熟，在當(dāng)時(shí)是一種操作復(fù)雜、成本高昂、“中看不中用”的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)。1988年初，Keohanog通過對(duì)所使用的酶的改進(jìn)，提高了擴(kuò)增的真實(shí)性。爾后，Saiki等人又從生活在溫泉中的水生嗜熱桿菌內(nèi)提取到一種耐熱的DNA聚合酶，使得PCR技術(shù)的擴(kuò)增效率大大提高。也正是由于此酶的發(fā)現(xiàn)使得PCR技術(shù)得到了廣泛地應(yīng)用，使該技術(shù)成為遺傳與分子生物學(xué) 分析的根本性基石。在以后的幾十年里，PCR方法被不斷改進(jìn)：它從一種定性的分析方法發(fā)展到定量測(cè)定；從原先只能擴(kuò)增幾個(gè)kb的基因到目前已能擴(kuò)增長(zhǎng)達(dá)幾十個(gè)kb的DNA片段。到目前為止，PCR技術(shù)已有十幾種之多，例如，將PCR與反轉(zhuǎn)錄酶結(jié)合，成為反轉(zhuǎn)錄PCR，將PCR與抗體等相結(jié)合就成為免疫PCR等。3.國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀

3.1.基礎(chǔ)研究方面的應(yīng)用

目前從事分子生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)室和研究人員，幾乎每天都在使用PCR，可以說幾乎沒有一個(gè)分子生物學(xué)家沒有使用過PCR。因此，PCR與分子克隆一樣是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)方法，可用于達(dá)到以下目的：

[1] 擴(kuò)增目的基因和鑒定重組子； [2]克隆基因；

[3]基因功能和表達(dá)調(diào)控的研究； [4]基因組測(cè)序； [5]制備單鏈模板； [6]致突變；

3.2.PCR在臨床上的應(yīng)用[2]

[1]在遺傳學(xué)上的應(yīng)用：人類的遺傳性疾病是因?yàn)槟骋粔A基序列發(fā)生了突變，使之缺失或形成某一限制性內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)，通過PCR結(jié)合限制片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析（PCR-RFLP），就可以從基因的水平對(duì)遺傳性疾病進(jìn)行分析。例如，血友病甲是一種常見的遺傳性出血性疾病，患者體內(nèi)缺乏凝血因子FVIII這是由于基因第14個(gè)外顯子的第336位氨基酸的編碼基因發(fā)生了突變，產(chǎn)生了一個(gè)新的PstI酶切點(diǎn)，因此可以使用PCR-RFLP對(duì)血友病進(jìn)行診斷。PCR還可以用來檢測(cè)遺傳性耳聾和Leber遺傳性視神經(jīng)病。

[2]在腫瘤研究中的應(yīng)用：PCR已日益廣泛應(yīng)用于腫瘤的病因與發(fā)病機(jī)理研究以及腫瘤診斷與治療的研究中。例如，差異顯示PCR技術(shù)能針對(duì)不同腫瘤尋找其特異而敏感的標(biāo)志物，并用于腫瘤早期診斷、判斷預(yù)后及療效評(píng)估。另一方面，在使用普通放療、化療的同時(shí)可結(jié)合定量PCR技術(shù)檢測(cè)微小殘留病灶，以進(jìn)一步改進(jìn)治療方案。此外，由于癌癥的發(fā)生在一定意義上是單個(gè)細(xì)胞分子發(fā)生變化，因而可以使用單細(xì)胞PCR技術(shù)對(duì)癌癥的發(fā)病機(jī)理進(jìn)行研究。[3]在基因分型中的應(yīng)用：當(dāng)進(jìn)行器官移植時(shí)并須先組織配型工作，此時(shí)常應(yīng)用序列特異性寡核苷酸多態(tài)性PCR（PCR-sequence specific oilgonucleotide polymorphism,PCR-SSOP）對(duì)人類白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen,HLA）進(jìn)行分型，使移植成功率大大提高。此外PCR-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性也可以用于對(duì)HLA的分型。3．3.在法醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用[3]

例如：最早應(yīng)用DNA限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性結(jié)合PCR-RFLP來進(jìn)行法醫(yī)學(xué)個(gè)體識(shí)別和親子鑒定。目前發(fā)現(xiàn)在真核生物基因組編碼和非編碼序列中的短串聯(lián)重復(fù)序列的重復(fù)次數(shù)在個(gè)體間存在著差異，因此可以使用短串聯(lián)重復(fù)PCR技術(shù)對(duì)其進(jìn)行分析。使用PCR技術(shù)進(jìn)行法醫(yī)鑒定的優(yōu)點(diǎn)是樣品用量小并且適于對(duì)高度降解材料的檢測(cè)。除剛才提到的之外，可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列（variable number tandem repeat,VN-TR）PCR也可以用于法醫(yī)學(xué)個(gè)體識(shí)別和親子鑒定。所以，綜上所述，PCR的確是一種分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)技術(shù)。在它30多年的發(fā)展中衍生出了諸如PCR-RFLP、PCR-SSOP、VN-TR，以及免疫PCR、致突變PCR和定量PCR等十幾種不同的技術(shù)方法。PCR技術(shù)可以為基因工程提供目的基因，并廣泛地應(yīng)用于個(gè)體識(shí)別、親子鑒定、免疫配型、疾病診斷等方面?？梢哉f，PCR已經(jīng)滲透到了生命科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。21世紀(jì)是生物工程的世紀(jì)。我相信，在今后的發(fā)展中PCR技術(shù)會(huì)不斷地得到擴(kuò)充和完善，PCR技術(shù)也將4.相關(guān)檢測(cè)技術(shù) 4.1.技術(shù)原理

DNA的半保留復(fù)制是生物進(jìn)化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈，在DNA聚合酶與啟動(dòng)子的參與下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則復(fù)制成同樣的兩分子挎貝。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，DNA在高溫下也能發(fā)生變性解鏈，當(dāng)溫度降低后又可以復(fù)性成為雙鏈。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復(fù)性，并設(shè)計(jì)引物做啟動(dòng)子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復(fù)制。

但是，DNA聚合酶在高溫時(shí)會(huì)失活，因此，每次循環(huán)都得加入新的DNA聚合酶，不僅操作煩瑣，而且價(jià)格昂貴，制約了PCR技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展。發(fā)現(xiàn)耐熱DNA聚合同酶--Taq酶對(duì)于PCR的應(yīng)用有里程碑的意義，該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活，不需要每個(gè)循環(huán)加酶，使PCR技術(shù)變得非常簡(jiǎn)捷、同時(shí)也大大降低了成本，PCR技術(shù)得以大量應(yīng)用，并逐步應(yīng)用于臨床。4.2.工作原理

類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火--延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR 擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；③引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍 4.3.工作步驟

標(biāo)準(zhǔn)的PCR過程分為三步：

1.DNA變性（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA 2.退火（25℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部雙鏈。

3.延伸（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右最佳的活性）的作用下，以dNTP為原料，從引物的5′端→3′ 端延伸，合成與模板互補(bǔ)的DNA鏈。每一循環(huán)經(jīng)過變性、退火和延伸，DNA含量既增加一倍?，F(xiàn)在有些PCR因?yàn)閿U(kuò)增區(qū)很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的時(shí)間內(nèi)復(fù)制完成，因此可以改為兩步法，即退火和延伸同時(shí)在60℃-65℃間進(jìn)行，以減少一次升降溫過程，提高了反應(yīng)速度 5.研究方案

醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)大致可分為形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)、血清免疫學(xué)和分子生物學(xué)幾大類，其分別代表幾代實(shí)驗(yàn)診斷技術(shù)。60年代DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)及半保留復(fù)制模式的出現(xiàn)，70年代基因重組及體外基因克隆技術(shù)、分子雜交技術(shù)的應(yīng)用使分子生物學(xué)在疾病診斷中得到了長(zhǎng)足的發(fā)展。特別是1985年Mullis發(fā)明了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)，使醫(yī)學(xué)界真正興起了基因診斷技術(shù)熱，成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)展的又一里程碑。用于臨床檢驗(yàn)的PCR技術(shù)與經(jīng)典的PCR反應(yīng)在操作上稍有區(qū)別，有其自己的特色。一般在樣品處理上，多采用非離子去污劑一次加熱處理，這種方法對(duì)DNA純化有限，但適應(yīng)臨床微量、快速的特點(diǎn)。另外PCR反應(yīng)體系中各組成成份往往都預(yù)分裝到反應(yīng)管中，既減少操作者的工作強(qiáng)度而且也減少了污染的機(jī)會(huì)，具有極高的使用價(jià)值。本公司率先研制并推出單管單人份的PCR診斷試劑，具有開創(chuàng)性意義。這些改進(jìn)都不影響PCR效果，同樣表現(xiàn)出高特異性、高敏感性、簡(jiǎn)便快捷等PCR最優(yōu)秀的特征，在常見傳染病、性病、腫瘤、遺傳病、寄生蟲病、優(yōu)生優(yōu)育、法醫(yī)學(xué)等廣泛領(lǐng)域中有相當(dāng)高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。5.1研究方法

① 早期診斷，因?yàn)镻CR擴(kuò)增極其敏感，理論上可檢出100CID/ml乙肝病毒的患者血清，在感染潛伏期即可被PCR法檢出。

② 對(duì)低持續(xù)感染乙肝病人的診斷，有些乙肝病人體內(nèi)的病毒長(zhǎng)期低復(fù)制感染，血清病毒濃度極低，一般酶標(biāo)試劑無法檢出，可以用PCR法檢出。

③ 療效跟蹤及病程判斷，因?yàn)镻CR能半定量檢測(cè)乙肝病毒基因，是病毒是否存在及其數(shù)量多少的最直接指標(biāo)。在治療過程中通過監(jiān)測(cè)血清或白細(xì)胞中病毒基因存在與否及其動(dòng)態(tài)變化即能準(zhǔn)確地了解病情。丙型肝炎病毒在血清中的濃度很低，丙肝病毒的分離尚未成功。目前用于丙肝病毒檢驗(yàn)的方法主要是ELISA法測(cè)定血清中的HCV抗體。由于HCV尚無法分離純化，所以用于包被的抗原是人工合成肽或基因工程蛋白，這些人工抗原與天然病毒抗原有一定的區(qū)別，理論上是存在假陽性或假陰性。同時(shí)血清中抗體的出現(xiàn)及動(dòng)態(tài)變化與病人病情無線性相關(guān)關(guān)系。RT－PCR技術(shù)使這些困難得到解決。HCV是RNA病毒，需先將病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA（RT）后再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，這種技術(shù)稱之為逆轉(zhuǎn)錄－PCR（RT－PCR）。PCR敏感性高可以檢測(cè)出血清中低濃度的病毒，了解病毒在體內(nèi)復(fù)制的動(dòng)態(tài)狀況。RNA純化要求嚴(yán)格，是RT－PCR的技術(shù)關(guān)鍵，本公司目前使用的高效基因釋放劑，聯(lián)合特異性固相基因吸附乳膠顆粒，對(duì)樣本中的RNA進(jìn)行分離純化，使這一問題得到解決。通常用于RNA→cDNA逆轉(zhuǎn)錄的酶大致可以分為二大類，即低溫逆轉(zhuǎn)錄酶，如AMV/MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，高溫逆轉(zhuǎn)錄酶，如Tth酶。Tth酶在錳離子作用下，具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性，Tth酶活性溫度高，可以使核酸充分線性化，提高逆轉(zhuǎn)錄效率及特異性。Tth酶在鎂離子的作用下，又具有DNA聚合酶活性，從而真正實(shí)現(xiàn)單管單酶單人份的擴(kuò)增要求，這樣就在不降低擴(kuò)增敏感性的條件下，一步完成擴(kuò)增，不僅簡(jiǎn)化操作，而且又減少污染，提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性。國(guó)內(nèi)本公司已采用這種技術(shù)推出單管單酶單人份的RT－PCR診斷試劑。丁型肝炎病毒是缺陷病毒，與乙型肝炎病毒協(xié)同感染。甲型肝炎病毒、戊型肝炎病毒主要存在于急性病人糞便樣本中，戊型肝炎病毒也長(zhǎng)期存在于血清中。在PCR檢測(cè)時(shí)，需注意取材的合理性。在消化道傳染性疾病中，另一類最重要的感染性疾病是幽門螺旋桿菌（HP）所引起的胃炎、胃潰瘍等。HP可以經(jīng)口－口途經(jīng)傳播并定位于胃粘膜上皮細(xì)胞，早期表現(xiàn)為淺表性胃炎，可發(fā)展成為胃潰瘍。我國(guó)胃炎發(fā)病率之高估計(jì)比乙型肝炎更嚴(yán)重，對(duì)HP的檢測(cè)應(yīng)受到廣大醫(yī)務(wù)工作者的重視。對(duì)HP的檢測(cè)可以用生化法測(cè)試尿素酶或用免疫法測(cè)試血清中對(duì)HP特異性抗體，也可對(duì)胃液、胃粘膜樣本進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)及菌種鑒定。PCR法檢測(cè)HP非常敏感且特異性高，有研究發(fā)現(xiàn)可以從病人的唾液或口腔含漱液中檢出HP.PCR法避免了取胃液及胃粘膜，減少病人痛苦，5.2.技術(shù)路線

PCR技術(shù)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)（PCR）是一種選擇性體外擴(kuò)增DNA或RNA片段的方法。具有特異性強(qiáng)、敏感性高、快速、簡(jiǎn)便、可擴(kuò)增RNA或cDNA、對(duì)起始材料質(zhì)量要求低等優(yōu)點(diǎn)。5.3.所用儀器與材料

引物: PCR產(chǎn)物的特異性主要取決于引物鏈的特異性。由于存在同源序列，隨意設(shè)計(jì)的引物鏈，其PCR產(chǎn)物在電泳分析時(shí)可能出現(xiàn)多條鏈，因此在設(shè)計(jì)引物鏈時(shí)應(yīng)充分考慮引物特異性。引物長(zhǎng)度一般為15-30個(gè)堿基,G+C含量為40-60%,濃度0.1-1umol/L。TaqDNA聚合酶：濃度為1-4ul/100ul。TaqDNA聚合酶單位用量增長(zhǎng)可能導(dǎo)致非特異DNA擴(kuò)增。模板DNA：應(yīng)避免混有任何蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑及能結(jié)合DNA的蛋白酶。DNA摸板的制備方法有加熱法、凍溶法、超聲波粉碎法、堿變性法、SDS裂解法等多種。

4×dNTPs ： dNTP儲(chǔ)存液pH應(yīng)為7.0，在反應(yīng)體系中，4種dNTP的濃度應(yīng)相同，每種dNTP的濃度以50-200 umol/L為宜。緩沖液及其他成份：PCR反應(yīng)體系中，一般采用Tris-HCl緩沖液。適宜的Mg2+濃度為高于dNTP總濃度0.2-2.5 mmol/L。

6．研究?jī)?nèi)容

PCR技術(shù)的出現(xiàn)對(duì)法醫(yī)學(xué)的發(fā)展也有不可低估的作用。在法醫(yī)物證如血斑、毛發(fā)、組織碎片等的確證，DAN多態(tài)性分析遠(yuǎn)比血清學(xué)或等方法確實(shí)可靠。早期DNA多態(tài)性分析主要使用Southern印跡雜交的方法。1985年Jeffreys首先采用肌紅基因第一個(gè)內(nèi)含子中的串聯(lián)重復(fù)序列作探針，從人的基因庫中篩選出小衛(wèi)量DNA，使用阿交法產(chǎn)生雜交圖譜即DNA指紋。這一技術(shù)成功地應(yīng)用于個(gè)人識(shí)別及親子鑒定。這種方法仍受到樣本量的限制，當(dāng)樣本DNA數(shù)量不足時(shí)或DAN嚴(yán)重降解則不能正常檢出。且雜交技術(shù)常使用同位素杯記探針要求較鎬的防護(hù)措施。PCR技術(shù)的出現(xiàn)，可以對(duì)極少量物證如一根毛發(fā)、一滴血液、極小精斑都可以進(jìn)行分析。在人類基因組中有許多由10-15bp核心順序構(gòu)成的串聯(lián)重復(fù)DNA序列，具有單位點(diǎn)特征的稱為VNTR結(jié)構(gòu)，多位點(diǎn)串聯(lián)成為衛(wèi)星DNA。6．1.檢測(cè)對(duì)象

常見的傳染性疾病有細(xì)菌、病毒、衣原體、支原體等，可引起消化、呼吸、循環(huán)、泌尿生殖等不同系統(tǒng)相應(yīng)的病變。消化系統(tǒng)感染性疾病在我國(guó)具有代表性意義的有肝炎、胃炎及腸道感染性疾病。引起肝炎的病原體主要包括乙型肝炎病毒（乙肝）、丙型肝炎病毒（丙肝），其它還有甲型肝炎病毒（甲肝）、丁型肝炎病毒（丁肝）、戊型肝炎病毒（戊肝）、庚型肝炎病毒（庚肝）等。這幾種肝炎病毒中只有乙型肝炎病毒是DNA病毒，其余均為RNA病毒。我國(guó)是乙肝高發(fā)區(qū)，乙肝病人為世界乙肝病人總數(shù)的50％。[4]乙肝病毒經(jīng)血液傳播，病毒主要在肝細(xì)胞中增殖，也可以長(zhǎng)期存留在骨髓細(xì)胞或外周血白細(xì)胞中。通常用PCR法檢測(cè)血清中的乙肝病毒。有報(bào)道用PCR法可以在淚液、乳汁、精液及血白細(xì)胞中檢出乙肝病毒，這些發(fā)現(xiàn)提示其它傳染途經(jīng)存在的可能 6．2檢測(cè)內(nèi)容

PCR反應(yīng)混合物經(jīng)過循環(huán)擴(kuò)增后，所需做的工作就是檢測(cè)反應(yīng)液中是否存在預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物及產(chǎn)物的特異性。目前已經(jīng)發(fā)展了許多檢測(cè)分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的方法。包括凝膠電泳、高壓液相色譜、核酸探針雜交、探針捕獲酶免疫分析、酶切圖譜分析、單鏈構(gòu)型多態(tài)性分析、核酸序列分析。

PCR技術(shù)類型[5]

免疫PCR技術(shù) 原位PCR技術(shù) 不對(duì)稱PCR技術(shù) 巢式PCR技術(shù) 反向PCR技術(shù) 逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)

復(fù)合PCR技術(shù)

彩色PCR技術(shù)

抗原捕獲PCR技術(shù) 增敏PCR技術(shù)

酶標(biāo)PCR技術(shù)

二溫式PCR技術(shù)

錨定PCR技術(shù)

定量PCR技術(shù)

毛細(xì)管PCR技術(shù)

多重PCR技術(shù)

巢式或套式PCR技術(shù) 7.預(yù)期目標(biāo)PCR 技術(shù)在大腸桿菌O157: H7檢測(cè)中

（1)簡(jiǎn)單PCR： Meng等以eae基因5′末端附近一段688bp DNA片段為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)了一對(duì)引物,擴(kuò)增產(chǎn)物為633bp的DNA片段。其退火溫度為60℃－63℃, 應(yīng)用煮沸法與基因釋放法,大腸桿菌O157: H7檢出限分別為25與38CFU/ml,檢測(cè)時(shí)間為3h。Thomas等用PCR擴(kuò)增了slt基因片段。引物： 正鏈5′-(TTTACGATAGACTTCTCGAC)-3', 反鏈5′-（CACATATAAATTATTTCGCTC）-3’

其PCR產(chǎn)物由凝膠電泳測(cè)定,檢測(cè)時(shí)間為ld。

徐建國(guó)等根據(jù)O157: H7 特有的hlyA、B基因序列設(shè)計(jì)了PCR引物,產(chǎn)物為338bp。

PCR技術(shù)在大腸桿菌O157: H7檢測(cè)中（2）多重PCR:由于鑒定O157: H7血清型不能僅僅依靠簡(jiǎn)單PCR,近年來國(guó)外學(xué)者對(duì)多重PCR方法在大腸桿菌O157: H7的診斷價(jià)值方面進(jìn)行了研究。Meng等同時(shí)擴(kuò)增了eae 上游基因片段、sitⅠ基因片段、sit Ⅱ基因片段,其長(zhǎng)度分別為633、210、484bp。此引物設(shè)計(jì)可有效區(qū)別O157: H7血清型與O55: H7、O55: NM。Fratamico等在一個(gè)單一反應(yīng)中同時(shí)擴(kuò)增了eae基因、slt Ⅰ、Ⅱ的保守序列及60MDa質(zhì)粒保守序列,其產(chǎn)物分別為1087、227、224、166bp。嚴(yán)笠選用針對(duì)大腸桿菌O157: H7志賀樣毒素Ⅰ、Ⅱ（SLT－Ⅰ、SLT－Ⅱ）和溶血素（Hly）基因的三對(duì)引物,在同一擴(kuò)增體系中進(jìn)行PCR,檢測(cè)12株不同來源的O157: H7大腸桿菌及其它致病性大腸桿菌及沙門菌、志賀菌15株。結(jié)果復(fù)合PCR方法較單一PCR方法具有較高的特異性，12株O157: H7取得了穩(wěn)定、可靠的陽性結(jié)果。能迅速、有效地與其它致病性大腸桿菌及沙門氏菌、志賀菌相鑒別。

PCR技術(shù)在大腸桿菌O157: H7檢測(cè)中的應(yīng)用（3）原位PCR: kurokawa等不用培養(yǎng)過程,直接用原位PCR技術(shù)結(jié)合落射顯微鏡,在單細(xì)胞水平快速檢測(cè)O157: H7。

4.23SrRNA在大腸桿菌O157: H7分型、檢測(cè)中

傳統(tǒng)的細(xì)菌分類方法主要依賴于細(xì)菌的形態(tài)學(xué)、代謝產(chǎn)物、酶活性和表面抗原等特征。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)理論和技術(shù)的迅速發(fā)展，微生物檢測(cè)進(jìn)入了基因時(shí)代，以核糖體核糖核酸序列為基礎(chǔ)的分類方法為微生物的鑒別提供了新的分子生物學(xué)方法。[6]如16srRNA、23srRNA、16-23srRNA區(qū)間序列分析等等，它完全不同于傳統(tǒng)方法，具有快速、簡(jiǎn)便、敏感和特異等優(yōu)點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)

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[2] 徐煥賓,賁昆龍,曾濤,李勁光;檢測(cè)HIV-1載量的熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)的建立及其應(yīng)用[J];中國(guó)病毒學(xué);2001年02期

[3] 顧鳴，韓偉.復(fù)合PCR鑒定沙門菌的方法.中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志[J]，2003，13(2):154-157 [4] 冉陸.腸出血性大腸埃希菌(EHEC)流行趨勢(shì).中國(guó)食品衛(wèi)生雜志[J]，1999，3:31-35 [5] 石嵐;實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)IgH基因重排的研究[D];昆明醫(yī)學(xué)院;2004年 [6] 王穎.食品安全學(xué)技能訓(xùn)練.2010.10

第二篇：熒光PCR檢測(cè)原理

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光染料或熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)來實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板濃度進(jìn)行定量分析。其特點(diǎn)有：

(1)用產(chǎn)生熒光信號(hào)的指示劑顯示擴(kuò)增產(chǎn)物的量，進(jìn)行實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)連續(xù)的熒光監(jiān)測(cè)，避免終點(diǎn)定量的不準(zhǔn)確性，并且消除了標(biāo)本和產(chǎn)物的污染，且無復(fù)雜的產(chǎn)物后續(xù)處理過程。

(2)熒光信號(hào)通過熒光染料嵌入雙鏈DNA，或熒光探針特異結(jié)合木得檢測(cè)物等方法獲得，打打提高了檢測(cè)的靈敏度、特異性和精確性。Real-time O-PCR可以應(yīng)用于mRNA表達(dá)的研究、DNA拷貝數(shù)的檢測(cè)、單核苷酸多態(tài)性的測(cè)定、細(xì)胞因子的表達(dá)分析、腫瘤耐藥基因表達(dá)的研究以及病毒感染的定量監(jiān)測(cè)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的基本原理

在PCR反應(yīng)體系中加入熒光染料或熒光基團(tuán)，這些熒光物質(zhì)有其特定的波長(zhǎng)。儀器可以自動(dòng)檢出，利用熒光信號(hào)積累，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，在PCR循環(huán)中，測(cè)量的信號(hào)將作為熒光閾值的坐標(biāo)。并且引入一個(gè)——Ct值（Threshold cycle）概念，Ct值是指產(chǎn)生可被檢測(cè)到得熒光信號(hào)所需的最小循環(huán)數(shù)，是在PCR循環(huán)過程中熒光信號(hào)由本底開始進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)階段的拐點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的循環(huán)次數(shù)。熒光閾值相當(dāng)于基線熒光信號(hào)的平均信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。一般認(rèn)為在熒光閾值以上所測(cè)出的熒光信號(hào)是一個(gè)可信的信號(hào)，可以用于定義一個(gè)樣本的Ct值。通常用不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品的Ct值來產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后計(jì)算相對(duì)方程式。

方程式的斜度可以用來檢查PCR的效率，所有標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸分析需要存在一個(gè)高相關(guān)系數(shù)（R2＞0.99），這樣才能認(rèn)為實(shí)驗(yàn)的過程和數(shù)據(jù)是可信的，使用這個(gè)方程式計(jì)算出未知樣本的初始模板量。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀都有軟件，可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線中自動(dòng)地計(jì)算出未知樣本的初始模板量。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的應(yīng)用 1.基因工程研究領(lǐng)域

① 基因表達(dá)研究：對(duì)β地中海貧血癥患者β與γ珠蛋白mRNA水平進(jìn)行檢測(cè)，其結(jié)果特異性強(qiáng)、定量準(zhǔn)確，為了解β地中海貧血的分子病理機(jī)制及其臨床診斷提供了可靠的檢測(cè)數(shù)據(jù)。

② 轉(zhuǎn)基因研究：利用兩種發(fā)光探針及適當(dāng)?shù)难h(huán)閾值，擴(kuò)增一個(gè)轉(zhuǎn)移后的基因和一個(gè)對(duì)照基因，以分析轉(zhuǎn)基因老鼠接合性。該方法為45個(gè)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的同型結(jié)合及異質(zhì)結(jié)合提供了明確的鑒定結(jié)果。通過實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)，同型結(jié)合的異質(zhì)接合動(dòng)物交配后其子代中轉(zhuǎn)基因的傳遞情況符合孟德爾遺傳規(guī)律。這項(xiàng)技術(shù)在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物繁育及基因劑量功能效應(yīng)實(shí)驗(yàn)中將有很大的用途。③ 單核苷酸多態(tài)性（SNP）及突變分析：實(shí)時(shí)熒光定量PCR一個(gè)誘人的應(yīng)用前景是用于檢測(cè)基于兩條探針和基因組的不穩(wěn)定性。基因突變基于兩條探針，一條探針橫跨突變點(diǎn)，另一條為錨定探針，與無突變位點(diǎn)的靶序列雜交。兩條探針用兩種不同的發(fā)光基團(tuán)標(biāo)記。如靶序列中無突變，探針雜交便完全配對(duì)，如有突變，則探針與靶序列不完全配對(duì)，會(huì)降低雜交體得穩(wěn)定性，從而降低其熔解溫度（Tm）。這樣便可對(duì)突變和多態(tài)性進(jìn)行分析。2.醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域

① 病原體檢測(cè)：由于實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法可靠性和重復(fù)性好，并且操作簡(jiǎn)便、快速、結(jié)果判斷客觀，目前，人們用此方法對(duì)人類免疫缺陷病毒、肝炎病毒、結(jié)核桿菌、巨細(xì)胞病毒、EB病毒、流感病毒A、流感病毒B等病原體的檢測(cè)。熒光定量PCR問世后的幾年中，積累了大量有關(guān)病原體核酸量與感染性疾病發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后之間關(guān)系的資料，這些研究資料不斷豐富，將形成感染性疾病的臨床分子診斷標(biāo)準(zhǔn)。

② 藥物療效考核：利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)臨床樣品中與抗藥性相關(guān)的基因的表達(dá)。結(jié)果證明，實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)是定量檢測(cè)抗藥基因表達(dá)的可靠方法，應(yīng)用這種技術(shù)可以預(yù)測(cè)化療將引起的反應(yīng)。

③ 腫瘤基因檢測(cè)：腫瘤的本質(zhì)是細(xì)胞內(nèi)基因發(fā)生了變化，是一種多基因異常的疾病，這些異常變化用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法都可以檢測(cè)出來。

目前用此方法進(jìn)行過端粒酶hTERT基因、慢性粒細(xì)胞性白血病bcr/abl融合基因、腫瘤MDRI基因、白血病WTI基因、腫瘤ER基因、前列腺癌PSM基因、腫瘤相關(guān)的病毒基因等多種基因的表達(dá)檢測(cè)。隨著與腫瘤相關(guān)的新基因的不斷發(fā)現(xiàn)。熒光定量PCR技術(shù)將會(huì)在腫瘤的研究中發(fā)揮更大的作用。3.其他領(lǐng)域

用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對(duì)免疫組分進(jìn)行分析是其應(yīng)用的重要方面。

所謂實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。檢測(cè)方法

1.SYBRGreenⅠ法： 在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號(hào)，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會(huì)發(fā)射任何熒光信號(hào)，從而保證熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。SYBR定量PCR擴(kuò)增熒光曲線圖

PCR產(chǎn)物熔解曲線圖（單一峰圖表明PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的單一性）2.TaqMan探針法：

探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物的形成完全同步。服務(wù)流程

1.客戶認(rèn)真寫好訂單，提供待檢基因相關(guān)信息； 2.簽訂技術(shù)服務(wù)合同，支付預(yù)付款（30-50%)；

3.設(shè)計(jì)合成定量PCR引物（或客戶提供文獻(xiàn)引物委托本公司合成）； 4.DNA/RNA的抽提、定量、RNA反轉(zhuǎn)錄；

5.PCR預(yù)實(shí)驗(yàn)，主要檢測(cè)引物的特異性和擴(kuò)增效率； 6.正式定量實(shí)驗(yàn)：對(duì)所有樣品上機(jī)檢測(cè)； 7.實(shí)驗(yàn)結(jié)果和數(shù)據(jù)分析，形成報(bào)告。收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)

優(yōu)惠包干價(jià)：120元/樣/基因（SYBRgreenI法，相對(duì)定量）

（含RNA提取，反轉(zhuǎn)錄，引物合成費(fèi)用，上機(jī)測(cè)試費(fèi)用（3個(gè)重復(fù)）；一個(gè)內(nèi)參免費(fèi)（內(nèi)參3個(gè)重復(fù)）Ct值（Cycle threshold，循環(huán)閾值）的含義為：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)

（如圖1所示）。

1.熒光閾值（threshold）的設(shè)定

PCR反應(yīng)的前15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)作為熒光本底信號(hào)，熒光閾值的缺省（默認(rèn)）設(shè)置是3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍，即：threshold = 10*SDcycle 3-15 2.Ct值與起始模板的關(guān)系

每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，公式如下。Ct=-1/lg(1+Ex)*lgX0+lgN/lg(1+Ex)n為擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)，X0為初始模板量，Ex為擴(kuò)增效率，N為熒光擴(kuò)增信號(hào)達(dá)到閾值強(qiáng)度時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的量。

起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)，縱坐標(biāo)代Ct值。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR所使用的熒光物質(zhì)可分為兩種：熒光探針和熒光染料?，F(xiàn)將其原理簡(jiǎn)述如下： 1.TaqMan熒光探針：PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5'－3'外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。而新型TaqMan-MGB探針使該技術(shù)既可進(jìn)行基因定量分析，又可分析基因突變（SNP），有望成為基因診斷和個(gè)體化用藥分析的首選技術(shù)平臺(tái)。

2.SYBR熒光染料：在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料非特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號(hào)，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會(huì)發(fā)射任何熒光信號(hào)，從而保證熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。SYBR僅與雙鏈DNA進(jìn)行結(jié)合，因此可以通過溶解曲線，確定PCR反應(yīng)是否特異。3.分子信標(biāo)：是一種在5和3末端自身形成一個(gè)8個(gè)堿基左右的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖環(huán)雙標(biāo)記寡核苷酸探針，兩端的核酸序列互補(bǔ)配對(duì)，導(dǎo)致熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)緊緊靠近，不會(huì)產(chǎn)生熒光。PCR產(chǎn)物生成后，退火過程中，分子信標(biāo)中間部分與特定DNA序列配對(duì)，熒光基因與淬滅基因分離產(chǎn)生熒光。1．傳統(tǒng)定量PCR方法簡(jiǎn)介

1）內(nèi)參照法：在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記，下游引物不標(biāo)記。在模板擴(kuò)增的同時(shí)，內(nèi)標(biāo)也被擴(kuò)增。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長(zhǎng)度不同，二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來，分別測(cè)定其熒光強(qiáng)度，以內(nèi)標(biāo)為對(duì)照定量待檢測(cè)模板。2）競(jìng)爭(zhēng)法：選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個(gè)新內(nèi)切位點(diǎn)的外源競(jìng)爭(zhēng)性模板。在同一反應(yīng)管中，待測(cè)樣品與競(jìng)爭(zhēng)模板用同一對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增（其中一個(gè)引物為熒光標(biāo)記）。擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競(jìng)爭(zhēng)性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個(gè)片段，而待測(cè)模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開，分別測(cè)定熒光強(qiáng)度，根據(jù)已知模板推測(cè)未知模板的起始拷貝數(shù)。

3）PCR－ELISA法：利用地高辛或生物素等標(biāo)記引物，擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合，再加入抗地高辛或生物素酶標(biāo)抗體－辣根過氧化物酶結(jié)合物，最終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實(shí)驗(yàn)，若加入內(nèi)標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)目的。2．內(nèi)標(biāo)在傳統(tǒng)定量中的作用

由于傳統(tǒng)定量方法都是終點(diǎn)檢測(cè)，即PCR到達(dá)平臺(tái)期后進(jìn)行檢測(cè)，而PCR經(jīng)過對(duì)數(shù)期擴(kuò)增到達(dá)平臺(tái)期時(shí)，檢測(cè)重現(xiàn)性極差。同一個(gè)模板在96孔PCR儀上做96次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，所得結(jié)果有很大差異，因此無法直接從終點(diǎn)產(chǎn)物量推算出起始模板量。加入內(nèi)標(biāo)后，可部分消除終產(chǎn)物定量所造成的不準(zhǔn)確性。但即使如此，傳統(tǒng)的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。3．內(nèi)標(biāo)對(duì)定量PCR的影響

若在待測(cè)樣品中加入已知起始拷貝數(shù)的內(nèi)標(biāo)，則PCR反應(yīng)變?yōu)殡p重PCR，雙重PCR反應(yīng)中存在兩種模板之間的干擾和競(jìng)爭(zhēng)，尤其當(dāng)兩種模板的起始拷貝數(shù)相差比較大時(shí)，這種競(jìng)爭(zhēng)會(huì)表現(xiàn)得更為顯著。但由于待測(cè)樣品的起始拷貝數(shù)是未知的，所以無法加入合適數(shù)量的已知模板作為內(nèi)標(biāo)。也正是這個(gè)原因，傳統(tǒng)定量方法雖然加入內(nèi)標(biāo)，但仍然只是一種半定量的方法。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測(cè)的局限，實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測(cè)一次熒光信號(hào)的強(qiáng)度，并記錄在電腦軟件之中，通過對(duì)每個(gè)樣品Ct值的計(jì)算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR無需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個(gè)基礎(chǔ)之上的： 1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時(shí)，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對(duì)數(shù)期），此時(shí)微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性極好，即同一模板不同時(shí)間擴(kuò)增或同一時(shí)間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的Ct值是恒定的。

2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知樣品進(jìn)行定量測(cè)定，因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。

外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)時(shí)熒光定量PCR是迄今為止定量最準(zhǔn)確，重現(xiàn)性最好的定量方法，已得到全世界的公認(rèn)，廣泛用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測(cè)等諸多領(lǐng)域。各級(jí)各類醫(yī)療機(jī)構(gòu)、大學(xué)及研究所、CDC、檢驗(yàn)檢疫局、獸醫(yī)站、食品企業(yè)及乳品廠等。

由于qPCR是實(shí)時(shí)定量檢測(cè)致病病原體基因核酸，因此它比化學(xué)發(fā)光、時(shí)間分辨、蛋白芯片等免疫學(xué)方法更具獨(dú)到優(yōu)勢(shì)。

第三篇：PCR及其改進(jìn)技術(shù)在食品安全檢測(cè)中的應(yīng)用

PCR及其改進(jìn)技術(shù)在食品安全檢測(cè)中的應(yīng)用

當(dāng)今社會(huì)，食品中存在的污染情況越來越嚴(yán)重。豬肉注水、奶粉摻假、蔬菜有機(jī)農(nóng)藥含量超標(biāo)等等，嚴(yán)重影響著人們的身體健康。PCR改進(jìn)技術(shù)可以簡(jiǎn)化檢測(cè)步驟、提高檢測(cè)精準(zhǔn)度，具有操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)速度快、檢測(cè)精度高等優(yōu)點(diǎn)，在食品安全檢測(cè)工作中的使用率高、使用范圍廣泛。

食品安全檢測(cè)的主要內(nèi)容

食品安全檢測(cè)的內(nèi)容比較復(fù)雜，涉及面廣泛，主要的檢測(cè)內(nèi)容是：食品污染成分、食品營(yíng)養(yǎng)成分、食品是否具有添加劑以及食品質(zhì)量的總體檢測(cè)等等。食品安全檢測(cè)的指標(biāo)主要包括：成分分析、農(nóng)藥殘留分析、食品添加劑分析、微量元素分析和有害物質(zhì)分析等。常用的食品安全就按冊(cè)方法有兩種：一種是傳統(tǒng)的常規(guī)分析法，一種是儀器分析法。儀器分析法是食品安全檢測(cè)中的最常用的方法。

食品安全檢測(cè)人員對(duì)食品檢測(cè)的檢驗(yàn)要求有三部分內(nèi)容：①要嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的分析步驟依次進(jìn)行，在實(shí)驗(yàn)室中，要對(duì)所有的不安全因素采取防護(hù)措施，其中，不安全因素都包括：爆炸、腐蝕、燒傷等等；②在實(shí)驗(yàn)室中，檢測(cè)人員需要準(zhǔn)確、詳細(xì)地記錄檢測(cè)的方法和數(shù)據(jù)等信息；③在食品安全檢測(cè)完成后，檢測(cè)人員需要檢測(cè)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)和整理工作。

PCR及其改進(jìn)技術(shù)概括

PCR的是指聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)或者多聚酶鏈反應(yīng)技術(shù)，常用于放大特定的DNA，主要優(yōu)點(diǎn)有簡(jiǎn)潔、方便、敏感、重復(fù)性好和自動(dòng)化等.傳統(tǒng)的PCR技術(shù)在很多方面存在著不足，經(jīng)過改進(jìn)后有了很多較為明顯的優(yōu)點(diǎn)，但是，實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)和多重PCR技術(shù)在某些方面仍然有問題。使用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)時(shí)首先需要有專門的儀器，技術(shù)成本高，存在的檢測(cè)結(jié)果偏差大。多重PCR技術(shù)具有非特性結(jié)合問題，在使用多重PCR技術(shù)時(shí)如果不注意觀察樣本和樣本之間的反應(yīng)和作用，會(huì)發(fā)生假陽性或者假陰性的問題。

傳統(tǒng)的PCR技術(shù)在食品檢測(cè)中的具體應(yīng)用

檢測(cè)食品中所含成分。比如，人們?cè)谫I肉的時(shí)候會(huì)考慮到肉里面有沒有摻假、是否注過水、屠宰前的家畜有沒有患有疾病等等。為了保證消費(fèi)者的合法權(quán)益和身體健康，食品安全檢測(cè)人員可以使用PCR技術(shù)方便、快捷的將食品中存在的不合格現(xiàn)象檢測(cè)出來，降低食品安全隱患。

用于檢測(cè)食品中的病菌。在1992年，有些相關(guān)報(bào)道中提出了PCR檢測(cè)技術(shù)，經(jīng)過多年的研究和實(shí)踐，將PCR技術(shù)應(yīng)用到食品安全檢測(cè)中得到了很大的回響。用PCR技術(shù)檢測(cè)食品中攜帶的病菌，例如，豬羊牛肉中的大腸桿菌。

檢測(cè)食品中包含的營(yíng)養(yǎng)成分。隨著人們生活水平的逐漸提升，人們?cè)絹碓阶⒅仞B(yǎng)生。食物中含有的營(yíng)養(yǎng)成分和主要物質(zhì)都是人們關(guān)心的重點(diǎn)。在走親訪友的時(shí)候，一般會(huì)送老人和孩子營(yíng)養(yǎng)價(jià)值比較高的禮品。有很多經(jīng)過加工的食品，人們對(duì)肉眼看不出食品質(zhì)量的好壞，那么如何判斷食品中含有的營(yíng)養(yǎng)成分，就需要食品檢測(cè)人員使用PCR技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。

PCR改進(jìn)技術(shù)在食品檢測(cè)中的具體應(yīng)用

PCR-DGGE在食品檢測(cè)中的應(yīng)用。DGGE技術(shù)又稱變性梯度凝膠電泳技術(shù)。PCR-DGGE技術(shù)是一種聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)和變性梯度凝膠電泳技術(shù)結(jié)合在一起的新技術(shù)，具有敏感性高、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。使用PCR-DGGE技術(shù)進(jìn)行食品檢測(cè)技術(shù)，可以將食品中DNA提取出來，利用食品的基因和食品的核酸對(duì)食品進(jìn)一步的監(jiān)測(cè)。比如：利用PCR-DGGE技術(shù)對(duì)奶酪進(jìn)行檢測(cè)，可以檢測(cè)出奶酪中存在乳桿菌、乳酸菌和乳球菌包括污染物等等。

實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)在食品檢測(cè)中的應(yīng)用。實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)是在PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上，結(jié)合熒光信號(hào)來進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)。實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)主要采用的是完全閉管檢測(cè)，實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)是PCR改進(jìn)技術(shù)中操作最方便、結(jié)果最準(zhǔn)確、用時(shí)最短的一種。在各種食品安全檢測(cè)中得到了廣泛使用。

多重PCR技術(shù)在食品檢測(cè)中的具體應(yīng)用。多重PCR技術(shù)是在傳統(tǒng)、單一的PCR技術(shù)基礎(chǔ)上改進(jìn)后的技術(shù)。多重PCR技術(shù)一次可以?z測(cè)出多種病菌，像是大腸埃希菌、沙門菌屬、霍亂弧菌等菌類均可一次檢測(cè)出來。多重PCR技術(shù)操作簡(jiǎn)單、快速、結(jié)果精準(zhǔn)，多用于對(duì)番茄、大豆、玉米等轉(zhuǎn)基因食品的檢測(cè)中。

隨著毒豆芽、瘦肉精、地溝油等各種食品污染問題的產(chǎn)生，人們對(duì)食品的質(zhì)量產(chǎn)生了很大的懷疑。一些黑心商家只注重經(jīng)濟(jì)效益，違規(guī)經(jīng)營(yíng)，生產(chǎn)食品質(zhì)量不合格。通過對(duì)食品進(jìn)行安全檢驗(yàn)，分析食品中所含的成分和營(yíng)養(yǎng)比例，促進(jìn)食品事物的健康、安全發(fā)展，提高人們的飲食安全。在食品安全檢測(cè)工作中使用PCR技術(shù)可以很大程度上解決食品安全中存在的問題。

作者簡(jiǎn)介：

陳冬梅，碩士，伊犁州食品藥品檢驗(yàn)所，高級(jí)工程師，食品負(fù)責(zé)人

第四篇：PCR技術(shù)原理及心得.

PCR技術(shù)原理與心得體會(huì)

PCR產(chǎn)物的電泳檢測(cè)時(shí)間一般為48h以內(nèi),有些最好于當(dāng)日電泳檢測(cè),大于48h 后帶型不規(guī)則甚致消失。

一.假陰性,不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶

PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有①模板核酸的制備,②引物的質(zhì)量與特異性,③酶的質(zhì)量及活性 ④PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應(yīng)針對(duì)上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析研究。

模板:①模板中含有雜蛋白質(zhì),②模板中含有Taq酶抑制劑,③模板中蛋白質(zhì)沒有消化除凈,特別是染色體中的組蛋白,④在提取制備模板時(shí)丟失過多,或吸入酚。⑤模板核酸變性不徹底。在酶和引物質(zhì)量好時(shí),不出現(xiàn)擴(kuò)增帶,極有可能是標(biāo)本的消化處理,模板核酸提取過程出了毛病,因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液,其程序亦應(yīng)固定不宜隨意更改。

酶失活:需更換新酶,或新舊兩種酶同時(shí)使用,以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導(dǎo)致假陰性。需注意的是有時(shí)忘加Taq酶或溴乙錠。

引物:引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對(duì)稱,是PCR失敗或擴(kuò)增條帶不理想、容易彌散的常見原因。有些批號(hào)的引物合成質(zhì)量有問題,兩條引物一條濃度高,一條濃度低,造成低效率的不對(duì)稱擴(kuò)增,對(duì)策為:①選定一個(gè)好的引物合成單位。②引物的濃度不僅要看OD值,更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳,一定要有引物條帶出現(xiàn),而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致,如一條引物有條帶,一條引物無條帶,此時(shí)做PCR有可能失敗,應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高,一條亮度低,在稀釋引物時(shí)要平衡其濃度。③引物應(yīng)高濃度小量分裝保存,防止多次凍融或長(zhǎng)期放冰箱冷藏部分,導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。④引物設(shè)計(jì)不合理,如引物長(zhǎng)度不夠,引物之間形成二聚體等。

Mg2+濃度:Mg2+離子濃度對(duì)PCR擴(kuò)增效率影響很大,濃度過高可降低PCR擴(kuò)增的特異性,濃度過低則影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶。

反應(yīng)體積的改變:通常進(jìn)行PCR擴(kuò)增采用的體積為20ul、30ul、50ul?；?00ul,應(yīng)用多大體積進(jìn)行PCR擴(kuò)增,是根據(jù)科研和臨床檢測(cè)不同目的而設(shè)定,在做小體積如20ul后,再做大體積時(shí),一定要模索條件,否則容易失敗。

物理原因:變性對(duì)PCR擴(kuò)增來說相當(dāng)重要,如變性溫度低,變性時(shí)間短,極有可能出現(xiàn)假陰性;退火溫度過低,可致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率退火溫度過高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴(kuò)增效率。有時(shí)還有必要用標(biāo)準(zhǔn)的溫度計(jì),檢測(cè)一下擴(kuò)增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度,這也是PCR失敗的原因之一。

靶序列變異:如靶序列發(fā)生突變或缺失,影響引物與模板特異性結(jié)合,或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列,其PCR擴(kuò)增是不會(huì)成功的。

二.假陽性,出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶 1.假陽性

出現(xiàn)的PCR擴(kuò)增條帶與目的靶序列條帶一致,有時(shí)其條帶更整齊,亮度更高。引物設(shè)計(jì)不合適:選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性,因而在進(jìn)行PCR 擴(kuò)增時(shí),擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短,容易出現(xiàn)假陽性。需重新設(shè)計(jì)引物。

靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染:這種污染有兩種原因:一是整個(gè)基因組或大片段的交叉污染,導(dǎo)致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決:①操作時(shí)應(yīng)小心輕柔,防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外。②除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外,所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及樣進(jìn)槍頭等均應(yīng)一次性使用。③必要時(shí),在加標(biāo)本前,反應(yīng)管和試劑用紫外線照射,以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片

段核酸污染,這些小片段比靶序列短,但有一定的同源性?？苫ハ嗥唇?與引物互補(bǔ)后,可擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物,而導(dǎo)致假陽性的產(chǎn)生,可用巢式PCR方法來減輕或消除。

2.出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶

PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致,或大或小,或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶與非特異性擴(kuò)增帶。非特異性條帶的出現(xiàn),其原因:一是引物與靶序列不完全互補(bǔ)、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低,及PCR 循環(huán)次數(shù)過多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量,往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn),酶量過多有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。其對(duì)策有:①必要時(shí)重新設(shè)計(jì)引物。②減低酶量或調(diào)換另一來源的酶。③降低引物量,適當(dāng)增加模板量,減少循環(huán)次數(shù)。④適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點(diǎn)法(93℃變性,65℃左右退火與延伸。

3.出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶

PCR擴(kuò)增有時(shí)出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量差,dNTP濃度過高,Mg2+濃度過高,退火溫度過低,循環(huán)次數(shù)過多引起。其對(duì)策有:①減少酶量,或調(diào)換另一來源的酶。②減少dNTP的濃度。③適當(dāng)降低Mg2+濃度。④增加模板量,減少循環(huán)次數(shù)。

三.PCR污染與對(duì)策

PCR反應(yīng)的最大特點(diǎn)是具有較大擴(kuò)增能力與極高的靈敏性,但令人頭痛 的問題是易污染,極其微量的污染即可造成假陽性的產(chǎn)生。污染原因

(一標(biāo)本間交叉污染:標(biāo)本污染主要有收集標(biāo)本的容器被污染,或標(biāo)本放置時(shí),由于密封不嚴(yán)溢于容器外,或容器外粘有標(biāo)本而造成相互間交叉污染;標(biāo)本核酸模板在提取過程中,由于吸樣槍污染導(dǎo)致標(biāo)本間污染;有些微生物標(biāo)本尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴(kuò)散,導(dǎo)致彼此間的污染。

(二PCR試劑的污染:主要是由于在PCR試劑配制過程中,由于加樣槍、容器、雙蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染.(三PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染:這是PCR反應(yīng)中最主要最常見的污染問題,因?yàn)镻CR產(chǎn)物拷貝量 大(一般為1013拷貝/ml,遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于PCR檢測(cè)數(shù)個(gè)拷貝的極限,所以極微量的PCR產(chǎn)物 污染,就可造成假陽就可形成假陽性。

還有一種容易忽視,最可能造成PCR產(chǎn)物污染的形式是氣溶膠污染;在空氣與液體面摩擦?xí)r就可形成氣溶膠,在操作時(shí)比較劇烈地?fù)u動(dòng)反應(yīng)管,開蓋時(shí)、吸樣時(shí)及污染進(jìn)樣槍的反復(fù)吸樣都可形成氣溶膠而污染.據(jù)計(jì)算一個(gè)氣溶膠顆?？珊?8000拷貝,因而由 其造成的污染是一個(gè)值得特別重視的問題.(四實(shí)驗(yàn)室中克隆質(zhì)粒的污染:在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室及某些用克隆質(zhì)粒做陽性對(duì)照的檢驗(yàn)室,這個(gè)問題也比較常見。因?yàn)榭寺≠|(zhì)粒在單位容積內(nèi)含量相當(dāng)高,另外在純化過程中需用較多的用具及試劑,而且在活細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)粒,由于活細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖的簡(jiǎn)便性及具有很強(qiáng)的生命力,其污染可能性也很大。污染的監(jiān)測(cè)

一個(gè)好的實(shí)驗(yàn)室,要時(shí)刻注意污染的監(jiān)測(cè),考慮有無污染是什么原因造成的污染,以便采取措施,防止和消除污染。

四.對(duì)照試驗(yàn)

1.陽性對(duì)照:在建立PCR反應(yīng)實(shí)驗(yàn)室及一般的檢驗(yàn)單位都應(yīng)設(shè)有PCR陽性對(duì)照,它是PCR反應(yīng)是否成功、產(chǎn)物條帶位置及大小是否合乎理論要求的一個(gè)重要的參考標(biāo)志。陽性對(duì)照要選擇擴(kuò)增度中等、重復(fù)性好,經(jīng)各種鑒定是該產(chǎn)物的標(biāo)本,如以重組質(zhì)粒為陽性對(duì)照,其含量宜低不宜高(100個(gè)拷貝以下,但陽性對(duì)照尤其是重組質(zhì)粒及高濃度陽性標(biāo)本,其對(duì)檢測(cè)或擴(kuò)增樣品污染的可能性很大。因而當(dāng)某一PCR試劑經(jīng)自己使用穩(wěn)定,檢驗(yàn)人員心中有數(shù)時(shí),在以后的實(shí)驗(yàn)中可免設(shè)陽性對(duì)照。

2.陰性對(duì)照:每次PCR實(shí)驗(yàn)務(wù)必做陰性對(duì)照。它包括①標(biāo)本對(duì)照:被檢的標(biāo)本是血清就用鑒定后的正常血清作對(duì)照;被檢的標(biāo)本是組織細(xì)胞就用相應(yīng)的組織細(xì)胞作對(duì)照。②試劑對(duì)照:在PCR試劑中不加模板DNA或RNA,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,以監(jiān)測(cè)試劑是否污染。

3.重復(fù)性試驗(yàn)

4.選擇不同區(qū)域的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增 五.防止污染的方法

(一合理分隔實(shí)驗(yàn)室:將樣品的處理、配制PCR反應(yīng)液、PCR循環(huán)擴(kuò)增及PCR產(chǎn)物的鑒定等步驟分區(qū)或分室進(jìn)行,特別注意樣本處理及PCR產(chǎn)物的鑒定應(yīng)與其它步驟嚴(yán)格分開。最好能劃分①標(biāo)本處理區(qū);②PCR反應(yīng)液制備區(qū);③PCR循環(huán)擴(kuò)增區(qū);④PCR產(chǎn)物鑒定區(qū)。其實(shí)驗(yàn)用品及吸樣槍應(yīng)專用,實(shí)驗(yàn)前應(yīng)將實(shí)驗(yàn)室用紫外線消毒以破壞殘留的DNA或RNA。

(二吸樣槍:吸樣槍污染是一個(gè)值得注意的問題。由于操作時(shí)不慎將樣品或模板核酸吸入槍內(nèi)或粘上槍頭是一個(gè)嚴(yán)重的污染源,因而加樣或吸取模板

核酸時(shí)要十分小心，吸樣要慢，吸樣時(shí)盡量一次性完成，忌多次抽吸，以免 交叉污染或產(chǎn)生氣溶膠污染。(三預(yù)混和分裝 PCR 試劑:所有的 PCR 試劑都應(yīng)小量分裝，如有可能，PCR 反應(yīng)液應(yīng)預(yù)先配制好，然后小量分裝，-20℃保存。以減少重復(fù)加樣次數(shù)，避免污染機(jī)會(huì)。另外，PCR 試劑，PCR 反應(yīng)液應(yīng)與樣品及 PCR 產(chǎn)物分開保存，不應(yīng)放于同一冰盒或同一冰箱。(四防止操作人員污染，使用一次性手套、吸頭、小離心管應(yīng)一次性使 用。(五設(shè)立適當(dāng)?shù)年栃詫?duì)照和陰性對(duì)照，陽性對(duì)照以能出現(xiàn)擴(kuò)增條帶的最 低量的標(biāo)準(zhǔn)病原體核酸為宜，并注意交叉污染的可能性，每次反應(yīng)都應(yīng)有一 管不加模板的試劑對(duì)照及相應(yīng)不含有被擴(kuò)增核酸的樣品作陰性對(duì)照。(六減少 PCR 循環(huán)次數(shù)，只要 PCR 產(chǎn)物達(dá)到檢測(cè)水平就適可而止。(七選擇質(zhì)量好的 Eppendorf 管，以避免樣本外溢及外來核酸的進(jìn)入，打開離心管前應(yīng)先離心，將管壁及管蓋上的液體甩至管底部。開管動(dòng)作要輕，以防管內(nèi)液體濺出。呵呵 其實(shí) DNA（或 RNA）的提取方法及 DNA 的質(zhì)量也很關(guān)鍵 例如：SDS 法和 CTAB 法提取的 DNA 與 RNA 的 PCR 結(jié)果有很大的差異的。呵呵。

第五篇：PCR技術(shù)的法醫(yī)學(xué)應(yīng)用

PCR技術(shù)的法醫(yī)學(xué)應(yīng)用

PCR技術(shù)可以從一滴血、一個(gè)細(xì)胞中擴(kuò)增出足量 DNA產(chǎn)物供分析檢驗(yàn)。PCR技術(shù)的應(yīng)用解決了許多以往血清學(xué)方法無能為力的問題，而且離體蛋白質(zhì)在自然界中的穩(wěn)定性遠(yuǎn)不如核酸。所以 DNA的PCR檢驗(yàn)具有獨(dú)到的優(yōu)越性。目前，人們已建立了各種生物樣品如血液、血斑、精液、性交混合物、肌肉、單根毛發(fā)、上皮細(xì)胞、牙齒、骨骼中制備 DNA的實(shí)驗(yàn)方法。目前PCR技術(shù)的法醫(yī)學(xué)應(yīng)用主要有： 1．VNTR多態(tài)性

該方法擴(kuò)增位點(diǎn)靶基因多態(tài)性串聯(lián)重復(fù)核心序列數(shù)目不同而形成。目前報(bào)道有十幾種，比較成熟的有APOB、PMCT118、P33.6、P33.4、PYNZ22等位點(diǎn)。該方法簡(jiǎn)單，結(jié)

果易分析，缺點(diǎn)是在片段長(zhǎng)度差異較大時(shí)，長(zhǎng)片段可能被漏擴(kuò)增，引起錯(cuò)誤判斷。2．性別鑒定

PCR性別鑒定目前應(yīng)用于各種生物檢材檢驗(yàn)。通過擴(kuò)增y染色體特異位點(diǎn)鑒定，用Alu序列作對(duì)照，也可以同時(shí)擴(kuò)增x、y染色體特異性片段進(jìn)行鑒定。3．STR分型檢驗(yàn)

STR為短串聯(lián)重復(fù)序列（Short Tandom Repeat）,形成多態(tài)性原理與VNTR相似，只是重復(fù)單位數(shù)3-6bp，片段長(zhǎng)度100-400 bp。STR與VNTR分布也不同，VNTR主要分布在染色體端粒，而STR則存在于整個(gè)基因組，估計(jì)人類基因組有50萬個(gè)STR位點(diǎn)，因此是巨大的遺傳差異研究對(duì)象。

STR位點(diǎn)的突出特點(diǎn)是基因組內(nèi)基因座多，多態(tài)片段短，在生物性檢材個(gè)人識(shí)別鑒定中實(shí)用價(jià)值極高，高度腐敗的檢材只要保存了靶DNA，STR位點(diǎn)就可能擴(kuò)增成功。STR的PCR擴(kuò)增時(shí)間短，變性、退火和延伸每步只需30~60S，可在一個(gè)半小時(shí)左右完成30個(gè)循環(huán)。檢測(cè)方法靈敏度高，甚至<1ng模板DNA都可擴(kuò)增出多態(tài)片段。STR的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)高分辨聚丙烯酰胺凝膠電泳，用等位基因梯階分子量標(biāo)準(zhǔn)物，即可準(zhǔn)確的判斷等位基因長(zhǎng)度?？色@得不連續(xù)的基因頻率分布，便于Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)和偶合概率計(jì)算。

1993年在英國(guó)Colin等報(bào)導(dǎo)用復(fù)合擴(kuò)增對(duì)12個(gè)STR位點(diǎn)進(jìn)行研究，總排除率達(dá)1x10-14，表明STR復(fù)合擴(kuò)增可以認(rèn)定同一。STR在法醫(yī)學(xué)中應(yīng)用優(yōu)點(diǎn)在于：

(1)操作方便簡(jiǎn)便，通過多位點(diǎn)累計(jì)，可以同一認(rèn)定；(2)靈敏度高，復(fù)合擴(kuò)增可以節(jié)約檢材；(3)片段較小，適宜部分降解DNA的擴(kuò)增。

4．線粒體測(cè)序技術(shù)

線粒體是真核細(xì)胞中與 能量代謝有關(guān)的細(xì)胞器，一個(gè)細(xì)胞中線粒體數(shù)的范圍約為1000~10000個(gè)，所以線粒體DNA分析比細(xì)胞核DNA分析要靈敏得多，線粒體測(cè)序分析另一特點(diǎn)是可以對(duì)無核細(xì)胞檢材，如毛干、紅細(xì)胞骨頭、指甲等進(jìn)行分析，而且細(xì)胞核DNA進(jìn)行測(cè)序分析必須用克隆的方法純化出單一的DNA分子才能進(jìn)行測(cè)序分析，而線粒體DNA可直接經(jīng)PCR擴(kuò)增測(cè)序。進(jìn)一步研究表明，線粒體是母系遺傳方式遺傳的，所以一母所生子女應(yīng)有相同的線粒體DNA序列。線粒體多變區(qū)在D區(qū)。擴(kuò)增D區(qū)多態(tài)片段測(cè)序，就可以進(jìn)行個(gè)體識(shí)別。

目前，世界上絕大多數(shù)法醫(yī) DNA鑒定實(shí)驗(yàn)室主要工作就是應(yīng)用STR-PCR分型檢驗(yàn)技術(shù)進(jìn)行個(gè)體識(shí)別、親權(quán)鑒定等工作。