第一篇：實(shí)驗(yàn)四 植物DNA的提取[定稿]

實(shí)驗(yàn)四

植物DNA的提取

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

掌握CTAB法從植物葉片提取DNA的原理和方法。采用CTAB法從植物葉片中提取基因組DNA，并進(jìn)行純度分析。

二、實(shí)驗(yàn)原理

1、核酸提取的基本原理

核酸是生物有機(jī)體中的重要成分，在生物體中核酸常與蛋白質(zhì)結(jié)合在一起，以核蛋白的形式存在。核酸分為脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)兩大類，在真核細(xì)胞中，前者主要存在于細(xì)胞核中，后者主要存在于細(xì)胞質(zhì)及核仁里。在制備核酸時(shí)，通過研磨破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，使核蛋白被釋放出來。

在濃氯化鈉溶液(1～2 mol／L)中，DNA核蛋白的溶解度很大，RNA核蛋白的溶解度很??；而在稀氯化鈉溶液(0.14 mol／L)中，DNA核蛋白的溶解度很小，RNA核蛋白的溶解度很大。因此，可利用不同濃度的氯化鈉溶液將DNA核蛋白和RNA核蛋白從樣品中分別抽提出來。分離得到核蛋白后，需進(jìn)一步將蛋白等雜質(zhì)除去，常采用的去除蛋白的方法有3種：①用含異戊醇的氯仿振蕩核蛋白溶液，使其乳化，然后離心除去變性蛋白質(zhì)，此時(shí)蛋白質(zhì)凝膠停留在水相和氯仿相中間，而DNA溶于上層水相。用兩倍體積的無水乙醇溶液將DNA鈉鹽沉淀出來。如果用酸性乙醇或冰乙酸來沉淀，得到的是游離的DNA。②用十二烷基硫酸鈉(SDS)等去污劑使蛋白質(zhì)變性，與核酸分離，從而從材料中直接提取出DNA。③用苯酚處理，然后離心分層，DNA溶于上層水相，蛋白變性后則停留在酚層內(nèi)。吸出上面水層，加兩倍體積的無水乙醇溶液，得到白色纖維狀DNA沉淀。反復(fù)使用上述方法多次處理DNA核蛋白溶液，就能將蛋白等雜質(zhì)較徹底地除去，得到較純的DNA制品。為了徹底除去DNA制品中混雜的RNA，可用RNA酶處理。生物材料中含有的脂肪物質(zhì)和大部分的多糖，在用鹽溶液分離核蛋白和用乙醇或異丙醇分級(jí)沉淀時(shí)即被除去。

在DNA提取、制備的過程中，核酸極不穩(wěn)定，許多因素可破壞其完整結(jié)構(gòu)：①化學(xué)因素，核酸的結(jié)構(gòu)在pH值4.0～11.0間較穩(wěn)定，pH值在此范圍外就會(huì)使核酸變性降解，故制備過程應(yīng)避免過酸過堿。②物理因素，DNA分子鏈很長(zhǎng)，是雙螺旋結(jié)構(gòu)，既有一定的柔性，又有一定的剛性，故強(qiáng)機(jī)械作用如劇烈攪拌會(huì)令DNA分子斷裂，不利于收集，應(yīng)加以避免。③酶的作用，細(xì)胞中普遍存在的核酸酶在細(xì)胞壁或膜遭到破壞時(shí)被釋放出來，它會(huì)降解DNA分子。故須用酶的變性劑、抑制劑使之失活。操作過程最好在低溫(0℃左右)下進(jìn)行。常用的酶抑制劑有檸檬酸鹽、氟化物、砷酸鹽、乙二胺四乙酸鹽、(ETDA-Na)等。SDS和苯酚作為蛋白變性劑，同時(shí)可使核酸酶被破壞而失活。

2、CTAB法和SDS法的提取原理

（1）CTAB法是一種快速簡(jiǎn)便的提取植物總DNA的方法.。CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）是一種陽離子型去污劑，它不僅能使蛋白質(zhì)變性，而且還能與核酸形成特異的核酸-CTAB復(fù)合物，這種復(fù)合物溶于高鹽緩沖液（≥0.7M NaCl），降低鹽濃度，通過超速離心能選擇性地沉淀核酸，并與多糖等可溶性雜質(zhì)分開，CTAB-核酸復(fù)合物再用70-75%乙醇浸泡可脫掉CTAB。提取時(shí)先將新鮮的葉片在液氮中研磨，破碎其細(xì)胞，然后加入CTAB分離緩沖液，將DNA溶解出來，再經(jīng)氯仿－異戊醇抽提除去蛋白質(zhì)，最后通過異丙醇沉淀或低鹽離心得到DNA。

（2）SDS法也是提取植物DNA的常用方法。先將新鮮的葉片在液氮中研磨以機(jī)械力破本碎細(xì)胞壁，然后加入SDS使細(xì)胞膜破裂，并同時(shí)將蛋白質(zhì)和多糖等雜質(zhì)與核酸分開。加入KAc可使SDS—蛋白質(zhì)復(fù)合物轉(zhuǎn)變?yōu)槿芙舛雀〉拟淃}形式，使沉淀更加完全。

3、DNA的濃度測(cè)定和純度分析

（1）定磷法：是對(duì)樣品中核酸（DNA和RNA）含量的準(zhǔn)確定量。將樣品中的核酸用強(qiáng)酸（硫酸或高氯酸）消化成無機(jī)磷，然后用定磷試劑對(duì)生成的無機(jī)磷酸進(jìn)行滴定。定磷試劑是酸性鉬酸銨溶液，鉬酸銨能與無機(jī)磷酸定量結(jié)合成磷鉬酸絡(luò)合物，該絡(luò)合物能被抗壞血酸等還原劑還原成蘭色的鉬藍(lán)，在660nm處有最大光吸收。

（2）紫外光吸收法：核酸及其衍生物的紫外吸收高峰在260nm。1ug/mL的DNA溶液A260=0.020，1ug/mL的RNA溶液或單鏈DNA的A260=0.022~0.024。1個(gè)A260相當(dāng)于50ug/mL的DNA、40ug/mL的RNA。蛋白質(zhì)的最大吸收在280nm，多糖的最大吸收在230nm。純的DNA的A260/A280在1.8左右，純的RNA的A260/A280在2.0左右。

三、試劑和器材：

(1)1M Tris-cl（pH8.0）：Tris l21.1g溶于蒸餾水，用濃HCl調(diào)至pH8.0以蒸餾水定容至1000ml(2)CTAB分離緩沖液： 2g CTAB，8.18g NaCL，0.74g EDTA.Na2.2H2O，10mL 1mol/L的Tris-HCL(pH8.0)，0.2mL巰基乙醇，加水定容到100mL。

(3)洗滌緩沖液（70%乙醇，10mmol/L乙酸銨）：70mL無水乙醇，0.077g乙酸銨，加水到100mL。(4)TE緩沖液：10mmol/L Tris-HCL（pH7.4），1mmol/L EDTA(5)氯仿:異戊醇=24:1(6)液氮

(7)研缽，恒溫水?。?7～100℃），離心機(jī)，離心管。

四、操作方法：

(1)將10mlCTAB分離緩沖液加入50ml離心管中，置于65℃水浴中預(yù)熱。(2)稱取1.5g葉片，置于預(yù)冷的研缽中，倒入液氮，盡快將葉片研碎。(3)取1g粉末直接加入預(yù)熱的CTAB分離緩沖液中，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)使之混勻。

(4)樣品于65℃保溫30分鐘，每5～10分鐘混勻一次。(5)加等體積（10ml）的氯仿－異戊醇，輕輕顛倒混勻。(6)室溫下4000r/min離心10分鐘。

(7)用膠頭滴管將上層水相吸入另一干凈的離心管中（注意不要吸動(dòng)懸浮的細(xì)胞碎片和中間白色的蛋白質(zhì)層），向離心管中加入2/3體積的異丙醇，輕輕混勻，使DNA析出。（有些情況下，這一步可以產(chǎn)生云霧狀的DNA析出，如果看不到云霧狀的DNA，樣品則可以在冰浴中放置數(shù)小時(shí)甚至過夜）。(8)用下述方法收集DNA：

如果呈云霧狀的DNA析出，則用玻璃棒在云霧狀的DNA中輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)，纏起DNA，然后將玻璃棒轉(zhuǎn)移至20mL洗滌緩沖液中浸泡洗滌10分鐘（不要將DNA沉淀從玻璃棒上弄掉）。

如果看不到云霧狀的DNA，可將離心管在4000r/min離心5分鐘，小心地倒掉上清液，在松散的沉淀上加20mL洗滌緩沖液，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)離心管，洗滌核酸沉淀10分鐘，然后離心，小心地倒掉上清液，讓DNA沉淀自然干燥20分鐘。(9)用玻璃棒纏出DNA，在室溫下使DNA自然干燥20分鐘。(10)

將自然干燥的DNA溶于1mLTE緩沖液中，—20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(11)

取100uL稀釋20倍，測(cè)定A260，A280，A230，或作出吸收波譜200~400nm并計(jì)算濃度和得率。

(12)

取5~10uLDNA溶液做0.7%的瓊脂糖電泳，檢查DNA的大小和質(zhì)量，以λ-DNA/HindⅢ做分子量標(biāo)準(zhǔn)，另取5uL做限制性酶切。

注意；所有操作均須溫和，避免劇烈震蕩。

五、思考題

1、CTAB、EDTA、巰基乙醇的作用是什么？

2、吸取樣品、抽提、及電泳時(shí)應(yīng)注意什么？為什么？

第二篇：實(shí)驗(yàn)四動(dòng)物血液中DNA的提取-教案

授課教師常祖明學(xué)生人數(shù) 55

課題血液基因組DNA的提取

授課類型新授課授課方法講授、演示 教學(xué)用具多媒體、實(shí)驗(yàn)室設(shè)備

教學(xué)目的掌握雞血DNA提取的原理及方法

教學(xué)重點(diǎn)理解實(shí)驗(yàn)過程中每一步操作的目的及原理 教學(xué)難點(diǎn) 教學(xué)過程

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

1.掌握雞血DNA提取的原理；

2.掌握雞血DNA提取的方法及操作過程。

二、實(shí)驗(yàn)原理

哺乳動(dòng)物的成熟紅細(xì)胞已經(jīng)高度分化，因而當(dāng)中沒有細(xì)胞核，無法提取DNA。禽類的血細(xì)胞則可以。禽類代謝旺盛，血液中紅細(xì)胞更多，而且紅細(xì)胞中有完整的細(xì)胞核、大量的染色體。且材料易得、經(jīng)濟(jì)。用雞血細(xì)胞做實(shí)驗(yàn)材料有兩個(gè)原因。一是因?yàn)殡u血細(xì)胞核的DNA含量豐富，材料易得；二是雞血細(xì)胞極易吸水脹破，而用動(dòng)物肝臟細(xì)胞作實(shí)驗(yàn)材料常常需要?jiǎng)驖{和離心，對(duì)設(shè)備要求較高，操作繁瑣，歷時(shí)較長(zhǎng)。

三、實(shí)驗(yàn)儀器 1.水浴鍋：55℃

2.離心機(jī)：8000轉(zhuǎn)、12000轉(zhuǎn) 3.離心管：5ml（120個(gè)）

4.移液槍：10μl、680μl、700μl、800μl、900μl、1ml 5.容量瓶：100ml 6.取血針及管

四、實(shí)驗(yàn)材料及藥品

實(shí)驗(yàn)材料：普通家雞：需血液4.08ml（每管136(l）1.無水乙醇

作用：DNA沉淀劑、洗滌劑。

商品信息：瓶/500ml，分析純AR。

理化性質(zhì)：無色澄清液體。有灼燒味。易流動(dòng)。極易從空氣中吸收水分，能與水和氯仿、乙醚等多種有機(jī)溶劑以任意比例互溶。

儲(chǔ)存：儲(chǔ)存于陰涼、通風(fēng)的庫房。遠(yuǎn)離火種、熱源。庫溫不宜超過30℃。保持容器密封。應(yīng)與氧化劑、酸類、堿金屬、胺類等分開存放，切忌混儲(chǔ)。采用防爆型照明、通風(fēng)設(shè)施。禁止使用易產(chǎn)生火花的機(jī)械設(shè)備和工具。

危害：易燃，具刺激性。蒸氣與空氣能形成爆炸性混合物，爆炸極限3.5%～18.0%（體積）。2.檸檬酸

作用：ACD抗凝血?jiǎng)┏煞种弧Ｔ诳鼓齽┲?，中和檸檬酸鈉的堿性。商品信息：分析純AR，白色塑料瓶/500g，理化性質(zhì)：無臭，有很強(qiáng)的酸味，白色粉末或顆粒，易溶于水和醇。在潮濕的空氣中微有潮解性。

儲(chǔ)存：在濕空氣中有輕微潮解，需陰涼密封干燥保存。

危害：檸檬酸濃溶液對(duì)黏膜有刺激作用。檸檬酸可燃。粉體與空氣可形成爆炸性混合物，遇明火、高熱或與氧化劑接觸，有引起燃燒爆炸的危險(xiǎn)。3.檸檬酸鈉

作用：ACD抗凝血?jiǎng)┏煞种?。能與血液中的鈣離子結(jié)合成螯合物，而使鈣離子失去凝血作用，從而阻止血液凝固。

商品信息：檸檬酸三鈉分析純500克/瓶。

理化性質(zhì)：有機(jī)化合物，外觀為白色到無色晶體。無臭, 有清涼咸辣味。常溫及空氣中穩(wěn)定, 在濕空氣中微有溶解性, 在熱空氣中產(chǎn)生風(fēng)化現(xiàn)象。加熱至150℃失去結(jié)晶水。易溶于水、可溶于甘油、難溶于醇類及其他有機(jī)溶劑，過熱分解，在潮濕的環(huán)境中微有潮解，在熱空氣中微有風(fēng)化，其溶液 pH 值約為8。儲(chǔ)存： 常溫密閉保存 危害：無毒 4.尿素

作用：禽血裂解液成分之一。尿素能非常有效地使蛋白質(zhì)變性，尤其能非常有效地破壞非共價(jià)鍵結(jié)合的蛋白質(zhì)。

商品信息：化學(xué)試劑分析純 500克/瓶（塑料瓶裝）理化性質(zhì)：無色柱狀結(jié)晶或白色結(jié)晶性粉末，溶于水，乙醇和苯，難溶于乙醚，不溶于氯仿。儲(chǔ)存：密封避光保存。

危害：避免與皮膚和眼睛接觸。5.十二烷基硫酸鈉(SDS)作用：禽血裂解液成分之一。裂解核酸-蛋白質(zhì)復(fù)合體，用于從蛋白質(zhì)中分離核酸。商品信息：500g/分析純AR。

理化性質(zhì)：白色或淡黃色粉末。溶解性：溶于水，呈透明溶液，溶液呈中性。易溶于熱水，溶于水，溶于熱乙醇，微溶于醇，不溶于氯仿、醚。儲(chǔ)存：密封陰涼干燥保存 防止受潮受熱 危害：對(duì)粘膜和上呼吸道有刺激作用，對(duì)眼和皮膚有刺激作用。可引起呼吸系統(tǒng)過敏性反應(yīng)。該品可燃，具刺激性，具致敏性。遇明火、高熱可燃。受高熱分解放出有毒的氣體。6.1M Tris-HCl(PH8.0)緩沖液

作用：禽血裂解液成分之一。提供一個(gè)緩沖環(huán)境，防止DNA被破壞 商品信息：瓶/100ml，無色、澄清溶液

理化性質(zhì)：Tris中文品名為三羥甲基氨基甲烷，瓶/500g。是一種白色結(jié)晶或粉末。溶于乙醇和水，微溶于乙酸乙酯、苯，不溶于乙醚、四氯化碳，對(duì)銅、鋁有腐蝕作用，有刺激性的化學(xué)物質(zhì)。

儲(chǔ)存：室溫保存。

危害：毒性低，可致癌，不要直接接觸皮膚。7.乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-2Na）

作用：配制0.5M EDTA（PH8.0）溶液。螯合Mg2+或Mn2+離子,抑制脫氧核糖核酸酶（DNase）活性，活性依賴于鈣離子，并能被鎂離子或二價(jià)錳離子激活。商品信息：瓶/250g。理化性質(zhì)：無味無臭或微咸的白色或乳白色結(jié)晶或顆粒狀粉末。溶于水，不溶于乙醇、乙醚，其水溶液pH值約為5.3?？捎蒃DTA與氫氧化鈉和碳酸鈣作用制得。

儲(chǔ)存：于陰涼、通風(fēng)的庫房。遠(yuǎn)離火種、熱源。應(yīng)與氧化劑分開存放，切忌混儲(chǔ)。配備相應(yīng)品種和數(shù)量的消防器材。儲(chǔ)區(qū)應(yīng)備有合適的材料收容泄漏物。

危害：對(duì)粘膜和上呼吸道有刺激作用。對(duì)眼睛、皮膚有刺激作用。本品可燃，具刺激性。8.蛋白酶K（共需300μl，每管10μl）作用：消化組蛋白，釋放出DNA；消化DNase，提高DNA產(chǎn)量 商品信息：（20mg/mL）1ml/支。

理化性質(zhì)：一種枯草蛋白酶類的高活性蛋白酶，從林伯氏白色念球菌中純化得到。儲(chǔ)存：保存在－20℃冰箱里，避免反復(fù)凍融，有效保證12月。危害：使用時(shí)注意不要接觸皮膚，以免損傷皮膚表面的蛋白質(zhì)。9.Tris飽和酚（共需60ml，每管2ml）作用：強(qiáng)蛋白質(zhì)變性劑。商品信息：瓶/250ml。理化性質(zhì)：為淺黃色透明液體，上層為Tris-HCl溶液，加有抗氧化的0.25% 8-羥基喹啉和0.1%的β-巰基乙醇。

儲(chǔ)存：4℃避光保存。

危害：Tris飽和酚有較強(qiáng)的腐蝕性，應(yīng)盡量避免皮膚直接接觸或吸入體內(nèi)。如發(fā)現(xiàn)變?yōu)辄S色或棕色，表明發(fā)生氧化，不能使用。10.氯仿（三氯甲烷）

作用：蛋白質(zhì)變性劑，加速有機(jī)相與液相分層，去除核酸溶液中的跡量酚。商品信息：瓶/500ml。

理化性質(zhì)：無色透明重質(zhì)液體，極易揮發(fā)，有特殊氣味。不溶于水，溶于醇、醚、苯。儲(chǔ)存：保存在密封的棕色瓶中。

危害：麻醉性。有致癌可能性。在光照下遇空氣逐漸被氧化生成劇毒的光氣。11.異戊醇

作用：減少蛋白質(zhì)變性操作過程中產(chǎn)生的氣泡。異戊醇可以降低表面張力，從而減少氣泡產(chǎn)生。另外，異戊醇有助于分相，使離心后的上層含DNA的水相、中間的變性蛋白相及下層有機(jī)溶劑相維持穩(wěn)定。商品信息：瓶/500ml。

理化性質(zhì)：無色液體，有不愉快的氣味。微溶于水，可混溶于醇、醚等有機(jī)溶劑。

儲(chǔ)存：儲(chǔ)存于陰涼、通風(fēng)的庫房。遠(yuǎn)離火種、熱源。庫溫不宜超過30℃。保持容器密封。應(yīng)與氧化劑、酸類等分開存放，切忌混儲(chǔ)。采用防爆型照明、通風(fēng)設(shè)施。禁止使用易產(chǎn)生火花的機(jī)械設(shè)備和工具。儲(chǔ)區(qū)應(yīng)備有泄漏應(yīng)急處理設(shè)備和合適的收容材料。

危害：吸入、口服或經(jīng)皮膚吸收有麻醉作用。其蒸氣或霧對(duì)眼睛、皮膚、粘膜和呼吸道有刺激作用，可引起神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂，長(zhǎng)時(shí)間接觸有麻醉作用。易燃，其蒸氣與空氣可形成爆炸性混合物，遇明火、高熱能引起燃燒爆炸。12.無水葡萄糖

作用：ACD抗凝血?jiǎng)┏煞种?。商品信息?00g/瓶。

理化性質(zhì)：無色結(jié)晶或白色結(jié)晶性粉末；無臭、味甜。水中易溶，在乙醇中微溶。儲(chǔ)存：無水葡萄糖易吸水結(jié)塊，因此應(yīng)密封保存。危害：無。

五、實(shí)驗(yàn)試劑 1.75%的乙醇

{75ml + 25ml水} → 100ml75%的乙醇

2.ACD抗凝劑 100ml（共需48ml，每管0.8ml）

{檸檬酸0.48g + 檸檬酸鈉1.32g + 葡萄糖1.47g} →加水至100ml，滅菌后備用。3.禽血裂解液 100ml（共需51ml，每管1.7ml）

{尿素12g + SDS 1g + 1M Tris-HCl(PH8.0)10ml + 0.5M EDTA(PH8.0)20ml} →加水定容至100ml，備用。

【0.5M EDTA（PH8.0）】的配制：100ml {水80ml + EDTA-2Na 18.61g} →用NaOH（約2g）調(diào)至PH8.0 →定容至100ml →分裝后高壓滅菌備用。注：需加入NaOH調(diào)至PH8.0才能完全溶解。4.氯仿-異戊醇（24:1）共需54ml，每管1.8ml {氯仿 96ml + 異戊醇 4ml} = 100ml，4℃保存

5.酚-氯仿-異戊醇（25:24:1）共需60ml，每管2ml {氯仿-異戊醇（24:1）40ml + Tris飽和酚40ml} = 80ml，4℃保存 6..TE緩沖液 PH8.0 50ml {10mM Tris-HCl（PH8.0）緩沖液 0.5ml + 0.5M EDTA（PH8.0）0.1ml} → →定容到50ml →高壓滅菌后冷卻4℃保存 【0.5M EDTA（PH8.0）】的配制：100ml {水 80ml + EDTA-2Na 18.61g} →用NaOH（約2g）調(diào)至PH8.0 →定容至100ml →分裝后高壓滅菌備用。注：需加入NaOH調(diào)至PH8.0才能完全溶解?！?0mM Tris-HCl（PH8.0）緩沖液】的配制：10ml {1M Tris-HCl PH8.0緩沖液100μl + 水9.9ml} →定容至10ml → 10mM Tris-HCl（PH8.0）緩沖液

六、實(shí)驗(yàn)步驟

1.采用翅靜脈采血，抽取血液5mL，溶于20mL 75%的乙醇中，振蕩混勻，配成家雞血樣25ml（酒精：血＝4：1）目的：乙醇可以抑制DNA水解酶的活性，防治DNA降解，并且75%有防止血液凝固的作用。75%乙醇效果比無水乙醇效果好，血樣不至于太干澀。酒精:血(4:1)混合的血樣保存時(shí)間長(zhǎng)，可達(dá)4個(gè)月。

2.取血樣(酒精:血＝4:1)680(L至5mL離心管中，8000轉(zhuǎn)離心1分鐘，棄上清； 目的：去除血樣中大部分的乙醇，保證后面蛋白酶K的活性。

3.加800(LACD搖勻，8000轉(zhuǎn)離心1分鐘，棄上清；再加800(LACD搖勻，8000轉(zhuǎn)離心1分鐘，棄上清；

目的：ACD抗凝劑可以螯合血液中的鈣離子，防治血細(xì)胞凝集成團(tuán)凝固，影響血細(xì)胞的破碎和對(duì)血細(xì)胞里DNA的提取。多次離心可以去除血樣中的乙醇，保證后面蛋白酶K的活性。4.加1700(L裂解液，10(L蛋白酶K（100(g），搖勻，55℃水浴保溫過夜； 目的：DNA裂解液的作用是破壞細(xì)胞膜、核膜,并使組織蛋白與DNA分離，抑制細(xì)胞中DNase的活性；而蛋白酶k的作用是將蛋白質(zhì)降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分離出來，蛋白酶k還可以消化DNAse，提高DNA產(chǎn)量。55℃水浴保溫過夜可以讓蛋白酶K充分發(fā)揮作用。

5.加2mL飽和酚，搖勻至無塊狀物，12000轉(zhuǎn)離心10分鐘；

目的：飽和酚是強(qiáng)蛋白質(zhì)變性劑，可以將蛋白質(zhì)及降解后的產(chǎn)物充分變性，變性后的蛋白質(zhì)溶解度減低，易沉淀。

6.吸取上層透明的DNA溶液至另一5mL離心管中，注意不要攪拌下層的酚－蛋白層；

目的：加入飽和酚后溶液分層，上層是透明的DNA溶液，再往下是變性的蛋白質(zhì)，飽和酚的比重最大在最下層。

7.加2mL酚-氯仿-異戊醇（25：24：1），搖勻至懸浮液，12000轉(zhuǎn)離心10分鐘； 目的：加入酚-氯仿-異戊醇進(jìn)一步去除DNA溶液中的殘留蛋白質(zhì)。

8.吸取上層DNA液于另一5mL離心管中，加1.8mL氯仿-異戊醇溶液，搖勻，12000轉(zhuǎn)離心10分鐘； 目的：由于酚與水有部分混溶，DNA水溶液中會(huì)混有部分酚，由于氯仿和酚互溶而不溶于水，用氯仿-異戊醇在抽提一次可以把酚帶走。

9.吸取上層DNA液900(L于另一5mL離心管中，加無水乙醇至滿，顛倒混合，試管中出現(xiàn)白色團(tuán)塊，即是DNA；

目的：DNA水溶液是DNA以水合狀態(tài)穩(wěn)定存在，當(dāng)加入乙醇時(shí)，乙醇與DNA不相溶但與水相溶，乙醇會(huì)奪去DNA周圍的水分子，使DNA失水而易于聚合收集。用無水乙醇的目的是乙醇中如果含有水，DNA會(huì)部分溶于水中，降低DNA沉淀的產(chǎn)量。

10.吸出試管中的無水乙醇，加75%的乙醇，混合，吸出75%的乙醇，重復(fù)2次；

目的：像前面步驟中加入的抗凝血?jiǎng)┲械臋幟仕徕c、葡萄糖，裂解液中的SDS、EDTA-2Na，在氯仿及醇中的溶解度低，經(jīng)乙醇沉淀后的DNA中會(huì)有以上雜質(zhì)存在。以上雜質(zhì)有個(gè)共同的特征就是都易溶于水，故用75%的乙醇洗滌，可以利用其中的15%的水溶解這些雜質(zhì)除去。11.將DNA自然晾干后溶入1000(L TE緩沖液，-20℃保存；

目的：乙醇已揮發(fā)除去，TE緩沖液一可以抑制Dnase活性，二維持一定堿性PH值，有助于DNA的溶解和穩(wěn)定。

七、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

1.在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)嚴(yán)格執(zhí)行無菌操作； 2.部分藥品有毒，操作中應(yīng)注意安全防護(hù)；

3.剛投入水浴時(shí)可以稍快速的晃動(dòng)，之后的晃動(dòng)一定要輕柔； 4.抽提時(shí)不要有太力振動(dòng)，操作也要仔細(xì)，盡量避免DNA斷裂；

5.吸出試管中的無水乙醇時(shí)用的槍頭一定要剪過的，這點(diǎn)很重要，過尖的槍頭會(huì)把DNA鏈弄斷。

八、思考題

1.本實(shí)驗(yàn)中幾次用到的不同濃度乙醇的作用是什么？

九、實(shí)驗(yàn)安排

全班55人，按照學(xué)號(hào)分組，每6人一組，共9組，最后一組7人。每組作3個(gè)離心管，共用一個(gè)研缽。

每3組（共18人9個(gè)離心管）共同進(jìn)行離心操作。

第三篇：實(shí)驗(yàn)四 植物RNA的提取及其電泳鑒定2

實(shí)驗(yàn)四 植物RNA的提取及其電泳鑒定

一、原理植物細(xì)胞內(nèi)含有細(xì)胞質(zhì)RNA、細(xì)胞核RNA和細(xì)胞器RNA。細(xì)胞質(zhì)RNA包括mRNA、rRNA、tRNA。細(xì)胞核RNA主要有細(xì)胞質(zhì)RNA的前體及小分子細(xì)胞核RNA(snRNA)、染色質(zhì)RNA(chRNA)等。細(xì)胞器RNA主要指線粒體RNA及葉綠體RNA。這些RNA統(tǒng)稱細(xì)胞總RNA，其中大量的是rRNA，占80％左右?；蜣D(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA在總RNA中只占1％～5％。不同的mRNA在分子大小、核苷酸序列，以及在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄水平等方面各不相同，但真核細(xì)胞mRNA 3ˊ末端都具有20～200個(gè)不等的多聚腺苷酸的尾，稱為poly(A)結(jié)構(gòu)。利用poly(A)結(jié)構(gòu)可以把mRNA從總RNA中分離出來。對(duì)于Northern雜交可以使用植物細(xì)胞總RNA，也可以使用由總RNA中分離出的mRNA。

植物細(xì)胞RNA提取中的主要問題是防止RNA酶的降解作用。RNA酶是一類水解核糖核酸的內(nèi)切酶，它與一般作用于核酸的酶類有著顯著的不同，不僅生物活性十分穩(wěn)定，耐熱、耐酸、耐堿，作用時(shí)不需要任何輔助因子，而且它的存在非常廣泛，除細(xì)胞內(nèi)含有豐富的RNA酶外，在實(shí)驗(yàn)環(huán)境中，如各種器皿、試劑、人的皮膚、汗液、甚至灰塵中都有RNA酶的存在。因而，生物體內(nèi)源、外源RNA酶的降解作用是導(dǎo)致RNA提取失敗的致命因素。

內(nèi)源RNA酶來源于材料的組織細(xì)胞，提取自始至終都應(yīng)對(duì)RNase活性進(jìn)行有效抑制。RNA提取過程中將蛋白質(zhì)變性劑與RNase抑制劑聯(lián)合使用效果較理想。蛋白質(zhì)變性劑包括酚、氯仿、SDS、Sarkosyl(十二烷酰肌氨酸鈉)、DOC(脫氧膽酸鈉)、鹽酸胍、異硫氰酸胍、4—氨基水楊酸鈉、三異丙基萘磺酸鈉等；RNA酶抑制劑有RNasin(RNase阻抑蛋白)、氧釩核糖核苷復(fù)合物等。

外源RNA酶的抑制主要是使用DEPC(焦碳酸二乙酯C2Hs-O-CO-O-CO-O-CxH5)，它能與RNase分子中的必需基團(tuán)組氨酸殘基上的咪唑環(huán)結(jié)合而抑制酶活性，用于水、試劑及器皿的RNase滅活。DEPC與肝素合用效果增強(qiáng)，值得注意的是DEPC在Tris溶液中很不穩(wěn)定，很快分解成CO2 及C2H5OH，因而不能用于Tirs溶液的RNase滅活。水及其它溶液的滅活一般使用0.05％～0.1％DEPC，37℃處理過夜，也有人采用磁攪0.5小時(shí)以上的做法。DEPC處理后的溶液還需高壓滅菌，以去除殘存的DEPC。若DEPC去除不凈，會(huì)破壞mRNA活性。不能高壓滅菌的試劑要使用經(jīng)過DEPC處理的滅菌蒸餾水配制，然后用0.22μm 濾膜過濾。含有Tris的試劑用經(jīng)DEPC處理過的水配制，再經(jīng)高壓消毒。玻璃器皿可以在180℃烘烤8小時(shí)以上，不能烘烤的器皿用0.1％的DEPC水處理過夜后再高壓滅菌。

提取全過程必須在清潔無塵的環(huán)境中進(jìn)行。操作人員要使用一次性的手套拿取物品，盡可能避免一切污染機(jī)會(huì)。提取時(shí)使用的器皿應(yīng)經(jīng)過硅烷化處理，以防止RNA被吸附在器皿壁上，造成損失。RNA電泳使用的電泳槽需用去污劑洗滌，水沖洗，乙醇干燥。再浸入3％ H202溶液中，室溫下放置10分鐘以上，再用DEPC溶液處理過的水沖洗干凈?？傊?，實(shí)驗(yàn)中所用的試劑、器皿都要經(jīng)過RNase滅活處理。盡管如此，有時(shí)還會(huì)出現(xiàn)在提取的后期RNA被降解的問題。這是因?yàn)镽Nase活性的抑制只是一個(gè)暫時(shí)的現(xiàn)象，一旦抑制劑濃度下降RNase就有可能恢復(fù)活性。對(duì)于RNA提取來說，這是一個(gè)潛伏的危險(xiǎn)。在提取的前階段，提取液中無疑是有足夠的抑制劑，但到了提取后期，抑制成分逐漸減少，殘存的RNase就會(huì)復(fù)活而引起RNA降解。另外，提取后期發(fā)生的RNase污染，那怕是極輕微的，也會(huì)使到手的產(chǎn)品降解，因而提取后期要更加小心。

影響植物RNA提取的另一個(gè)問題是水溶性的細(xì)胞代謝物如酚、多糖等易與RNA結(jié)合成膠凍狀的不溶物或有色的復(fù)合物，它們能影響RNA的質(zhì)量及產(chǎn)量。人們采用了多種處理方法來解決這個(gè)問題，如對(duì)組織提取液進(jìn)行高速離心去除多糖；采用低pH值的提取緩沖液抑制酚的解離及氧化；或用β—巰基乙醇、PVP來抑制酚類的干擾等。

（一）總RNA的提取

用于研究基因表達(dá)的總RNA提取時(shí)首先要考慮的問題是材料的選取及預(yù)處理。由于基因表達(dá)與生理狀態(tài)密切相關(guān)，因而取材時(shí)必須考慮材料的生理狀態(tài)，必要時(shí)還要對(duì)材料進(jìn)行預(yù)處理，即施加某種因素，誘導(dǎo)目的基因表達(dá)，如進(jìn)行光照、暗處理、或加入誘導(dǎo)物等。

材料的破碎與植物細(xì)胞總DNA的提取相同，采用液氮冷凍及在液氮中研磨。預(yù)處理過的材料要盡早地投入到液氮中，投入前要盡可能保持材料完整及新鮮，不要讓材料壓碎及破損。因?yàn)橹参锊牧显谄茡p時(shí)會(huì)引起多酚類物質(zhì)的積累及氧化，使組織變褐而影響RNA分離。細(xì)胞膜裂解也與DNA提取相同，主要使用SDS或Sakosyl、酚等。

由于細(xì)胞內(nèi)RNA主要以核蛋白體形式存在，所以總RNA提取的路線是細(xì)胞破碎，使核蛋白體從細(xì)胞內(nèi)釋放；采用使蛋白質(zhì)變性的做法，令核蛋白體解析，RNA迅速與蛋白質(zhì)分離，大量地釋放到溶液中；然后用酚、氯仿有機(jī)溶劑抽提，去除蛋白質(zhì)雜質(zhì)，使核酸進(jìn)入水相；再選擇性沉淀RNA，使之與DNA分離；所得RNA再進(jìn)行必要的純化，最后用乙醇或異丙醇沉淀RNA。

至于植物細(xì)胞總RNA的提取方法，同植物總DNA提取一樣，沒有一種固定的通用方法。文獻(xiàn)中報(bào)導(dǎo)的植物細(xì)胞總RNA的提取方法很多，但綜合起來看，分離的主要依據(jù)不外乎如下幾點(diǎn)：① 用酚及去污劑SDS或Sakosyl破碎細(xì)胞膜并去除蛋白質(zhì)；② 酚、氯仿反復(fù)抽提純化核酸；③ LiCl選擇性沉淀去除DNA及其它不純物；④ 3mol／L乙酸鈉(pH6)沉淀RNA，DNA在上清液中；⑤ CsCl密度梯度離心，去除多糖等雜質(zhì)，純化RNA。

目前用于Northern 雜交植物總RNA提取方法根據(jù)主要試劑可分為苯酚法、異硫氰酸胍（或CTAB）法及氯化鋰沉淀法：

1、苯酚法：該法利用苯酚協(xié)助破碎細(xì)胞；酚／氯仿變性蛋白質(zhì)并反復(fù)抽提核酸；3mol／L乙酸鈉選擇沉淀RNA；提取液中使用4—氨基水楊酸及三異丙基萘磺酸鹽抑制RNase活性。該方法操作簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)，可用于從植物葉、莖、根及萌發(fā)幼苗中提取總RNA或核RNA。

2、異硫氰酸胍法：異硫氰酸根及胍離子都是很強(qiáng)的蛋白質(zhì)變性劑。異硫氰酸胍與十二烷基肌氨酸鈉合用可使核蛋白體迅速解體；與還原劑β—巰基乙醇合用能強(qiáng)烈抑制RNase 活力，因而是制備RNA的一種常用試劑。

傳統(tǒng)的異硫氰酸胍法需利用CsCl離心分離RNA(沉到管底)。這種做法操作時(shí)間長(zhǎng)、設(shè)備要求高。經(jīng)改進(jìn)，目前使用的方法使操作大大地簡(jiǎn)化，并可同時(shí)提取多個(gè)樣品。做法是將異硫氰酸胍、β—巰基乙醇、十二烷基肌氨酸鈉三者合用，強(qiáng)有力抑制了RNA降解，增加了核蛋白體的解離，將大量的RNA釋放到溶液中，然后用酸性酚進(jìn)行抽提，既可保證RNA穩(wěn)定，又可抑制DNA解離，使DNA與蛋白質(zhì)一起沉淀，RNA被抽提進(jìn)入水相，用異丙醇沉淀RNA后，經(jīng)酚／氯仿再次抽提進(jìn)行純化。該方法提取的RNA 用于Northern 雜交可以得到滿意結(jié)果。

3、氯化鋰沉淀法：該方法的主要原理是在一定的pH條件下，Li+使RNA發(fā)生特異性沉淀，通過多級(jí)沉淀可提高RNA的純凈度。利用氯化鋰選擇性沉淀時(shí)，因提取緩沖體系不同有多種不盡相同的氯化鋰法，有的使用硼酸緩沖液，加入還原劑二硫蘇糖醇抑制RNase活性，用SDS變性核蛋白；有的使用Tris—HCl緩沖體系，用苯酚及蛋白酶K處理蛋白；還有的使用高濃度尿素變性蛋白質(zhì)同時(shí)抑制RNase。氯化鋰沉淀法雖也有效，但沉淀過程較為繁瑣，并存在著Li+的污染問題。

（二）mRNA的分離

從總RNA中分離mRNA主要是利用親和層析的原理。植物mRNA的3ˊ—端具有poly(A)結(jié)構(gòu)，可用oligo(dT)—纖維素(寡聚(dT)—纖維素)或Poly(U)—Sepharse(多聚(U)—瓊脂糖)親和層析技術(shù)來純化mRNA?？俁NA在流經(jīng)寡聚(dT)—纖維素層析柱時(shí)，在高鹽緩沖液作用下，mRNA 3／—端多聚(A)殘基與連接在纖維素柱上的寡聚(dT)殘基間配對(duì)，形成氫鍵，使mRNA被吸附在柱上。不具poly(A)結(jié)構(gòu)的RNA，不能發(fā)生特異性結(jié)合而從柱中流出。結(jié)合在柱上的mRNA可以用低鹽緩沖液或蒸餾水洗脫。因?yàn)樵诟啕}溶液中堿基間的氫鍵穩(wěn)定，在低鹽狀態(tài)下易解離，水打破poly(A)與(dT)間的氫鍵，使mRNA洗脫。

層析中涉及到的緩沖液有兩種，一是上樣緩沖液，也有人稱結(jié)合緩沖液。各文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)合緩沖液都由Tris·C1、EDTA、氯化物鹽類及去污劑組成。不同之處是有的使用0.5mol/L的NaCl、有的使用0.5mol／L的LiCl。不管使用哪種鹽，都為高濃度，以促進(jìn)poly(A)與寡聚(dT)結(jié)合。第二種是洗脫緩沖液，除Tris、去污劑的濃度減半外(也有Tris 量不減半的)，最大的變化是不含氯化物或含低濃度的LiCl。其作用是解除Poly(A)與寡聚(dT)的結(jié)合，使mRNA洗脫下來。

在沒有特制的層析柱時(shí)，可以用無菌硅化的巴斯德吸管或lml的注射器做層析柱，出口端用無菌硅烷化過的玻璃纖維填充。寡聚(dT)纖維素用上樣緩沖液懸浮后裝柱。柱體積在0.25ml左右。裝柱后用0.1mol/L 的NaOH 洗柱，上樣緩沖液平衡。RNA的樣品量一般在2~5mg，體積為lml左右。上樣前樣品要經(jīng)過變性處理，置沸水浴中加熱數(shù)分鐘后立即置冰浴中。上樣后就要立即收集流出液，這時(shí)流出液中可能含有一些未能與纖維素結(jié)合的mRNA。將流出液加熱至65℃維持6~7分鐘，然后快速冷卻再重新上樣，如此反復(fù)多次，以使mRNA充分被吸附在纖維素柱上，用5~10倍體積的結(jié)合緩沖液洗柱，這時(shí)rRNA、tRNA 等逐漸被冼脫，而mRNA掛在柱上。洗脫至流出液的OD260值幾乎為零，換用低鹽的洗脫緩沖液洗脫mRNA，部分收集器收集，測(cè)定每管中的mRNA濃度，合并含mRNA的洗脫液，用乙醇沉淀mRNA，于-70℃保存。

（三）RNA樣品質(zhì)量檢測(cè)

用于Northern雜交的RNA樣品應(yīng)是純凈的，無明顯的DNA、蛋白質(zhì)污染，無小分子有機(jī)物復(fù)合，無提取試劑的污染。分子完整，無嚴(yán)重降解。同DNA樣品質(zhì)量檢測(cè)相同，主要有紫外吸收法及瓊脂糖凝膠電泳法兩種。

1、紫外吸收法

① 純度檢測(cè)：在分光光度計(jì)上分別測(cè)定樣品在230nm、260nm、280nm的吸收值，計(jì)算A260/A280及A260／A230的比值。純凈的RNA樣品A260/A280的比值應(yīng)在1.7~2.0之間，若小于1.7則表明樣品中有蛋白質(zhì)或酚試劑污染。此時(shí)，可用等體積的酚／氯仿重新抽提去除蛋白質(zhì)；用氯仿、乙醚抽提去除殘酚。在抽提過程中RNA損失較大(約60％)。A260/A230的比值應(yīng)大于2.0，如小于2.0則表明RNA被異硫氰酸胍污染。這時(shí)可以通過乙醇或異丙醇重新沉淀(可反復(fù)幾次)來去除。關(guān)于DNA雜質(zhì)的存在與否紫外分光光度法不能予以明確說明。

② 濃度測(cè)定：純凈的RNA樣品(無DNA及核苷酸雜質(zhì))260nm的光吸收值等于1.0時(shí)，RNA的含量為37 μg/m1。根據(jù)此吸收值與濃度的關(guān)系可求出任一RNA樣品的濃度。

RNA含量(μg／m1)＝A × 稀釋倍數(shù)× 37 μg／m1 當(dāng)對(duì)含量要求不十分精確時(shí)，可近似認(rèn)為A260=1.0 時(shí)的RNA濃度為40μg/m1。測(cè)定時(shí)如果按如下做法可使計(jì)算簡(jiǎn)化：取4μl RNA樣品，加蒸餾水至lml，以蒸餾水或TE為空白測(cè)定A260值，該數(shù)值× 10 即為樣品RNA濃度(μg/μl)。

2、瓊脂糖凝膠電泳法

由于RNA分子結(jié)構(gòu)與DNA不同，因而RNA電泳時(shí)有著與DNA電泳的不同之處。因RNA為單鏈分子，鏈內(nèi)配對(duì)堿基很易通過氫鍵結(jié)合而形成二級(jí)以至三級(jí)結(jié)構(gòu)。不同的RNA分子空間結(jié)構(gòu)不同，因而RNA分子在未變性的條件下分子量與泳動(dòng)率無嚴(yán)格的相關(guān)性。在變性條件下電泳，破壞RNA的空間結(jié)構(gòu)，才能使RNA的泳動(dòng)距離與其分子量對(duì)數(shù)值成正比。變性后的RNA泳動(dòng)速度比天然RNA小1/2左右。在不需要測(cè)定RNA分子量時(shí)，使用濃度1.0％~1.4％的非變性瓊脂糖凝膠也可將不同的RNA分子分離。當(dāng)需要對(duì)所提取的RNA樣品進(jìn)行快速檢測(cè)時(shí)可使用非變性膠。

總RNA樣品中的主要成分是28S的rRNA、18S的rRNA及5SrRNA。電泳后在膠板上呈現(xiàn)三條明顯的條帶。在上樣量小時(shí)，5SrRNA的條帶有時(shí)顯示不清。若在變性膠上，這三條帶的遷移率分別與5.1kb、2.0kb 及0.12kb 的標(biāo)準(zhǔn)RNA的遷移率相近。從量上看，溴化乙錠染色后28SrRNA條帶的亮度應(yīng)為18SrRNA的兩倍。如果28SrRNA的亮度不如18SrRNA條帶，表明樣品中RNA有降解。發(fā)生降解的原因主要是RNase滅活不好，或操作中溫度過高。防止的方法是操作全過程在4℃低溫條件下或冰上進(jìn)行。操作中一次性手套要經(jīng)常更換，盡量避免RNase污染。

二、植物總RNA的提取方法

（三）TRIZOL法小量提取RNA（Invitrogen Co.）

1、于1.5ml離心管中加入1ml TRIZOL提取液；

2、稱取0.1g液氮研磨后的材料，轉(zhuǎn)移到提取液中，漩渦振蕩混勻，15-30℃靜置5min； 3、4℃，12000g，離心10min；取上清；

4、加0.2ml氯仿，劇烈搖動(dòng)15sec，15-30℃放置2-3min，4℃，12,000g，離心15 min；

5、取水相，加0.25ml異丙醇，0.25ml高鹽溶液，顛倒混勻，15-30℃放置10min，4℃，12,000g離心10 min，去上清；

6、用1ml冰預(yù)冷的75％乙醇洗滌沉淀，漩渦振蕩，4℃，7500g離心5min；

7、真空泵吸除乙醇，用DEPC-ddH2O溶解RNA，55-60℃溶解10min，迅速冰浴，稍離心

8、-20℃短時(shí)間保存，-80℃保存長(zhǎng)期保存。

高鹽溶液（100mL）：0.8M檸檬酸鈉 23.528g；1.2M NaCl 7.013g

三、RNA電泳檢測(cè)

在含有甲醛的凝膠上進(jìn)行的RNA電泳應(yīng)小心，甲醛蒸氣有毒，含有甲醛的溶液應(yīng)在化學(xué)通風(fēng)櫥內(nèi)配制，含甲醛溶液的電泳槽應(yīng)盡可能蓋嚴(yán)。操作步驟如下：

1、配制5×甲醛凝膠電泳緩沖液：0.1M MOPS（pH7.0）；40mM 乙酸鈉；5mM EDTA（pH8.0）

將20.6g 3-（N-瑪琳代）丙磺酸（MOPS）溶于800ml經(jīng)用DEPC處理的50mM乙酸鈉溶液。用2M氫氧化鈉將溶液的pH值調(diào)至7.0，加10ml經(jīng)用DEPC處理的0.5M EDTA(pH8.0)，在加經(jīng)用DEPC處理的水至溶液總體積為1L。上述溶液經(jīng)用0.2μm微孔濾膜過濾除菌，避光保存于室溫。光照或高壓后溶液逐漸變黃，淡黃色的緩沖液可正常使用，而深黃色緩沖液則不然。

2.、制備凝膠

將適量瓊脂糖溶于水（1%），冷卻至60℃，加入5×甲醛凝膠電泳緩沖液和甲醛至終濃度分別為1×和2.2M（將12.3M甲醛貯存液、瓊脂糖水溶液和5×甲醛凝膠電泳緩沖液按1:3.5:1.1比例混合即可）。再化學(xué)通風(fēng)櫥內(nèi)灌制凝膠，于室溫放置30分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間，使凝膠凝固。

3、在一滅菌的1.5ml離心管內(nèi)混合下列液體，以制備樣品：RNA（30μg）

4.5μl；5×甲醛凝膠電泳緩沖液

2.0μl；甲醛

3.5μl；甲酰胺

10.0μl 于65℃溫育15分鐘，冷浴冷卻，離心5秒鐘使管內(nèi)所有液體集中于管底。每一泳道至多可分析30μg RNA，通常用10-20μg細(xì)胞總RNA進(jìn)行Northern雜交，可以檢測(cè)高豐度mRNA（占mRNA總量的0.1%以上）。許多批號(hào)的試劑級(jí)甲醛溶液已足夠純，不需經(jīng)過任何預(yù)處理即可直接使用。但如果甲醛溶液呈黃色，需在溶液中加入Dowex XG8混合床樹脂置磁力攪拌器上攪拌1小時(shí)，再用Whatman1號(hào)濾紙過濾2次，進(jìn)行去離子甲醛應(yīng)分裝成小份，充氮保存于-70℃。

4、加2μl滅菌的并經(jīng)用DEPC處理的甲醛凝膠加樣緩沖液。

甲醛凝膠加樣緩沖液：50% 甘油；1mM EDTA（pH8.0）；0.25% 溴酚藍(lán)；0.25% 二甲苯青FF；

5、加樣前，將凝膠預(yù)電泳5分鐘，電壓降為5V/cm，隨后將樣品加至凝膠加樣孔?？捎靡阎笮〉腞NA作為分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物，如用18S和28SrRNA或者9S兔β-珠蛋白mRNA，這些RNA的長(zhǎng)度分別為6333、2366和710個(gè)核苷酸。也可以從BRL購置已知大小的RNA的混合物作為分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物。通常分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物的泳道位于凝膠邊緣，便于電泳后將其切去進(jìn)行溴化乙錠染色，可能的話在分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物以及欲轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜或尼龍膜的樣品之間留一個(gè)空白泳道。

6、將凝膠浸入1×甲醛凝膠加樣緩沖液中，3-4V/cm電壓降進(jìn)行電泳。電泳緩沖液不需進(jìn)行持續(xù)循環(huán)，電泳1-2小時(shí)后，收集并混合兩個(gè)液槽的緩沖液，再加入電泳槽中，即可繼續(xù)電泳。

7、電泳結(jié)束后（溴酚藍(lán)遷移出約8cm），切下分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物的凝膠，浸入溴化乙錠溶液（0.5μg/ml,用0.1M乙酸銨配制）中染色30-45分鐘。在凝膠旁放置一透明尺，在紫外燈下照像。測(cè)量照片上每個(gè)RNA條帶至加樣孔的距離，以RNA片段大小的1g對(duì)數(shù)值對(duì)RNA條帶的遷移距離作圖，用所得曲線計(jì)算從凝膠轉(zhuǎn)移到固相支持物后通過雜交所檢出的RNA分子的大小。

小心：溴化乙錠是一種強(qiáng)烈的誘變劑并有中度毒性，使用含有這種染料的溶劑時(shí)應(yīng)戴手套，用后應(yīng)進(jìn)行凈化處理。紫外線照射有危害，對(duì)眼睛尤甚。為盡量避免受到照射② RNA沉淀未完全溶解

2、A260/A280<1.65。可能的原因是：

① 檢測(cè)吸光度時(shí)，RNA樣品沒有溶于水，而溶于了TE中。低離子濃度和低pH值條件下A280值偏高② 樣品勻漿時(shí)加的試劑量太少③ 勻漿樣品時(shí)未在室溫放置5分鐘④ 吸取水相時(shí)混入了有機(jī)相⑤ RNA沉淀未完全溶解

3、RNA降解。可能的原因是：① 組織取出后沒有馬上處理或冷凍② 待提取RNA的樣品沒有保存于-60至-70℃，而保存在了-5至-20℃③ 細(xì)胞在用胰酶處理時(shí)過度④ 溶液或離心管未經(jīng)RNase去除處理⑤ 電泳時(shí)使用的甲醛pH值低于了3.5

4、DNA污染。可能的原因是：① 樣品勻漿時(shí)加的試劑量太少 ② 樣品中含有有機(jī)溶劑（如乙醇，DMSO等），強(qiáng)緩沖液或堿性溶液

五、植物RNA提取過程中難點(diǎn)的相應(yīng)對(duì)策

（一）酚類化合物的干擾及對(duì)策：

許多植物組織特別是植物的果實(shí)（如蘋果、櫻桃、李子、葡萄等）和樹木類植物中富含酚類化合物。酚類物質(zhì)的含量會(huì)隨著植物的生長(zhǎng)而增加。因而從幼嫩的植物材料中更容易提取RNA。此外，針葉類植物的針葉中多酚的含量比在落葉植物的葉子中要高得多。在植物材料勻漿時(shí)，酚類物質(zhì)會(huì)釋放出來，氧化后使勻漿液變?yōu)楹稚㈦S氧化程度的增加而加深，這一現(xiàn)象被稱為褐化效應(yīng)（browning effect）。被氧化的酚類化合物（如醌類）能與RNA穩(wěn)定地結(jié)合，從而影響RNA的分離純化。但Newbury等發(fā)現(xiàn)RNA提取的難易程度與材料中酚類物質(zhì)的總量之間并無相關(guān)性，因此認(rèn)為不是所有的酚類化合物都影響RNA的提取。但一般認(rèn)為所謂的“縮合鞣質(zhì)”即聚合多羥基黃酮醇類物質(zhì)（如原花色素類物質(zhì)）是影響RNA提取的一類化合物。目前去除酚類化合物的一般途徑是在提取的初始階段防止其被氧化，然后再將其與RNA分開。

1、防止酚類化合物被氧化的方法：

① 還原劑法：一般在提取緩沖液中加入(-巰基乙醇、二硫蘇糖醇（DTT）或半胱氨酸來防止酚類物質(zhì)被氧化，有時(shí)提取液中(-巰基乙醇的濃度可高達(dá)2％。(-巰基乙醇等還可以打斷多酚氧化酶的二硫鍵而使之失活。Su等認(rèn)為在過夜沉淀RNA時(shí)加入(-巰基乙醇（終濃度1％）可以防止在此過程中酚類化合物的氧化。硼氫化鈉（NaBH4）是一種可還原醌的還原劑，用它處理后提取緩沖液的褐色可被消減，醌類化合物可被還原成多酚化合物。

② 螯合劑法：螯合劑聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和聚乙烯聚吡咯烷酮（PVPP）中的CO－N＝基有很強(qiáng)的結(jié)合多酚化合物的能力，其結(jié)合能力隨著多酚化合物中芳環(huán)羥基數(shù)量的增加而加強(qiáng)。原花色素類物質(zhì)中含有許多芳環(huán)上的羥基，因而可以與PVP或不溶性的PVPP形成穩(wěn)定的復(fù)合物，使原花色素類物質(zhì)不能成為多酚氧化酶的底物而被氧化，并可以在以后的抽提步驟中被除去。用PVP去除多酚時(shí)pH值是一個(gè)重要的影響因素，在pH8.0以上時(shí)PVP結(jié)合多酚的能力會(huì)迅速降低〔11〕。當(dāng)原花色素類物質(zhì)量較大時(shí)，單獨(dú)使用PVPP無法去除所有的這類化合物，因而需要與其它方法結(jié)合使用。

③ Tris-硼酸法：如果提取緩沖液中含有Tris-硼酸（pH7.5），其中的硼酸可以與酚類化合物依*氫鍵形成復(fù)合物，從而抑制了酚類物質(zhì)的氧化及其與RNA的結(jié)合。這一方法十分有效，所以Lбpez-Gбmez等在提取緩沖液中不再加入其它還原劑。但如果Tris-硼酸濃度過高（＞0.2M）則會(huì)影響RNA的回收率。

④ 牛血清白蛋白（BSA）法：原花色素類物質(zhì)與BSA間可產(chǎn)生類似于抗原－抗體間的相互作用，形成可溶性的或不溶性的復(fù)合物，減小了原花色素類物質(zhì)與RNA結(jié)合的機(jī)會(huì)，因此提高了RNA的產(chǎn)量。BSA與PVPP結(jié)合使用提取效果會(huì)更好。由于BSA中往往含有RNase，因而在使用時(shí)要加入肝素以抑制RNase的活性。

⑤ 丙酮法：Schneiderbauer等用-70℃的丙酮抽提冷凍研磨后的植物材料，可以有效地從云杉、松樹、山毛櫸等富含酚類化合物的植物材料中分離到高質(zhì)量的RNA。

2、酚類化合物的去除：

通過Li+或Ca2+沉淀RNA的方法可以將未被氧化的酚類化合物去除。與PVP、不溶性PVPP或BSA結(jié)合的多酚，可以直接通過離心去除掉，或在苯酚、氯仿抽提時(shí)除去。Manning利用高濃度的2-丁氧乙醇（50％）來沉淀RNA，而多酚溶解于2-丁氧乙醇中而被除去。然后用含50％ 2-丁氧乙醇的緩沖液洗滌RNA沉淀以去除殘留的多酚。他認(rèn)為即使多酚被氧化，其氧化產(chǎn)物仍可以溶解在高濃度2-丁氧乙醇溶液中而被去除，無需再用NaBH4來處理。

（二）多糖的干擾及對(duì)策：

多糖的污染是提取植物RNA時(shí)常遇到的另一個(gè)棘手的問題。植物組織中往往富含多糖，而多糖的許多理化性質(zhì)與RNA很相似，因此很難將它們分開。在去除多糖的同時(shí)RNA也被裹攜走了，造成RNA產(chǎn)量的減少；而在沉淀RNA時(shí)，也產(chǎn)生多糖的凝膠狀沉淀，這種含有多糖的RNA沉淀難溶于水，或溶解后產(chǎn)生粘稠狀的溶液。由于多糖可以抑制許多酶的活性，因此污染了多糖的RNA樣品無法用于進(jìn)一步的分子生物學(xué)研究。在常規(guī)的方法中，通過SDS-鹽酸胍處理可以部分去除一些多糖；在高濃度Na+或K+離子存在條件下，通過苯酚、氯仿抽提可以除去一些多糖；通過LiCl沉淀RNA也可以將部分多糖留在上清液中。但即使通過這些步驟仍會(huì)發(fā)現(xiàn)有相當(dāng)多的多糖與RNA混雜在一起，所以還需要用更有效的方法來解決植物RNA分離純化時(shí)多糖污染的問題。

用低濃度乙醇沉淀多糖是一個(gè)去除多糖效果較好的方法。在RNA提取液或溶液中緩慢加入無水乙醇至終濃度10％～30％，可以使多糖沉淀下來，而RNA仍保留于溶液中。一般都是在植物材料的勻漿液中加入乙醇，如Lewinsohn等在從裸子植物的木質(zhì)莖中提取RNA時(shí)，在勻漿上清液中加入乙醇至終濃度10％以沉淀多糖。但Tesniere等在從葡萄漿果組織中提取RNA時(shí)，是在用CsCl超離心，乙醇沉淀之后的RNA溶液中加入終濃度30％乙醇來沉淀多糖的，進(jìn)一步純化了RNA樣品。

另一個(gè)常用的方法是醋酸鉀沉淀多糖法。Bahloul等在提取云杉組織的RNA時(shí)在勻漿上清液中加入1/3體積的5M醋酸鉀（pH4.8）溶液以沉淀多糖；Ainsworth在提取酸模植物花組織的RNA時(shí)加入的是1/5體積的5M醋酸鉀（pH4.8）溶液。Hughes等在提取棉花葉和花粉的RNA時(shí)是加1/3體積的8.5M醋酸鉀（pH6.5）溶液到勻漿液中以除去多糖等雜質(zhì)。在提取某些植物材料的RNA時(shí)，是將上述兩種方法結(jié)合使用。如Lбpez-Gбmez等在提取芒果中果皮的RNA時(shí)，是在勻漿液中加入0.25體積的無水乙醇和0.11體積的5M醋酸鉀溶液以去除多糖雜質(zhì)。Su等在去除褐藻的多糖時(shí)，單獨(dú)使用乙醇或醋酸鉀都無效，只有兩者結(jié)合使用效果最佳。Fang等認(rèn)為緩沖液中含有高濃度的NaCl有助于去除多糖。Chang等在提取松樹RNA時(shí)，緩沖液中NaCl的濃度為2.0M和1.0M，通過氯仿抽提和乙醇沉淀RNA將RNA與多糖分離。Manning是將胡蘿卜種子等材料苯酚提取后的上清液稀釋，調(diào)節(jié)Na+離子濃度至80mM，然后加入0.4體積的2-丁氧乙醇來沉淀去除多糖。

（三）蛋白雜質(zhì)的影響及對(duì)策：

蛋白質(zhì)是污染RNA樣品的又一個(gè)重要因素。由于RNase和多酚氧化酶亦屬于蛋白質(zhì)，因而要獲得完整的、高質(zhì)量的RNA就必須有效地去除蛋白雜質(zhì)。常規(guī)的方法是在冷凍的條件下研磨植物材料以抑制RNase等的活性；提取緩沖液中含有蛋白質(zhì)變性劑，如苯酚、胍、SDS、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）等，這樣在勻漿時(shí)可以使蛋白質(zhì)變性，凝聚；有的方法是利用蛋白酶K來降解蛋白雜質(zhì)。進(jìn)一步可以用苯酚、氯仿抽提去除蛋白質(zhì)。

Wilcockson利用蛋白質(zhì)與RNA在高氯酸鈉溶液中的溶解度不同將它們分離。在70％高氯酸鈉溶液中，RNA的溶解度大于蛋白質(zhì)的溶解度，因而將大部分蛋白質(zhì)沉淀下來。接著在離心上清液中加入兩倍體積的無水乙醇，這時(shí)RNA能沉淀下來而能溶于70％高氯酸鈉溶液中的殘留蛋白質(zhì)仍然留在上清液中。這樣可以除去絕大部分的蛋白質(zhì)。

（四）次級(jí)代謝產(chǎn)物的影響及對(duì)策：

從植物組織中提取高質(zhì)量RNA的另一個(gè)難點(diǎn)是許多高等植物組織尤其是成熟組織能產(chǎn)生某些水溶性的次級(jí)代謝產(chǎn)物，這些次級(jí)代謝產(chǎn)物很容易與RNA結(jié)合并與RNA共同被抽提出來而阻礙具有生物活性的RNA的分離。因不能確定這些次級(jí)產(chǎn)物具體是什么物質(zhì)，所以，目前還沒有什么特殊的方法來解決這個(gè)問題。Baker等綜合Hughes等的選擇性沉淀法、Chirgwin的氯化銫梯度離心法和Iversen等的RNA回收方法純化了松樹種子、成熟松樹針葉等植物組織的RNA。

由于植物組織特別是高等植物組織細(xì)胞內(nèi)外組成成分的復(fù)雜多樣性，使得植物組織RNA的提取相對(duì)于其它生物材料來說要困難的多。實(shí)踐中經(jīng)常會(huì)發(fā)現(xiàn)，即使同一種植物的不同組織其RNA提取方法會(huì)有很大的不同；含有某種干擾因素的不同植物材料，其適用的RNA提取方法可能不同；即使是同一種植物同一種組織材料，但來源于不同基因型植株，其RNA提取方法也可能不一樣。所以，對(duì)于某一植物或其組織來說，其相應(yīng)的RNA提取方法必需經(jīng)過摸索和實(shí)踐才能確立。

隨著植物分子生物學(xué)研究領(lǐng)域的拓寬，可以肯定地說，在作為其研究基礎(chǔ)的植物材料RNA提取過程中還會(huì)出現(xiàn)新的難點(diǎn)，但隨著不斷地探索和經(jīng)驗(yàn)的積累，科學(xué)工作者們一定會(huì)迅速地解決這些難點(diǎn)，為植物分子生物學(xué)的發(fā)展鋪平道路。

思考題

1、RNA純化過程中如何避免RNA酶的污染？

2、如何檢測(cè)已純化RNA的質(zhì)量？

第四篇：DNA提取問題集

DNA提取問題集

默認(rèn)分類 2009-12-31 18:59:50 閱讀155 評(píng)論0字號(hào)：大中小

提取植物DNA時(shí)遇到多糖成分的干擾，DNA質(zhì)量一直不高，如何消除多糖的影響？ 參考見解：一般來說，SDS法提取的DNA會(huì)還有較多的多糖，使DNA成膠凍狀。而CTAB法提取可基本上除去多糖。如果是植物材料本身含糖量比較高，可用以下方法試一試：

1、在 DNA 未溶出之前，先用一些緩沖液洗去多糖。如可用緩沖液：100 mmol/LTris-HCl(pH=8.0)、5 mmol/L EDTA和0.35 mol/L Sorbitol洗幾次。

2、使 DNA 提取液中的多糖先沉淀。在提取液中加入 0.35 倍體積的無水乙醇，迅速混勻，多糖會(huì)先沉淀。

3、沉淀 DNA 時(shí)，使多糖保留在溶液中。如用乙醇沉淀時(shí)，在待沉淀溶液中加入 1/2 體積的 5 mol/L NaCl，或加 NH4Ac 使終濃度為 10 mmol/L?；?0.5 mL DNA 液中加 0.12 5 mL 4 mol/L NaCl 和 0.625 mL 13% PEG 8000（冰浴 1 h）。

4、多糖和 DNA 的共沉淀物進(jìn)行再分離。如用 TE緩沖液反復(fù)清洗共沉淀 物，將清洗液合并再用醇沉淀 DNA，或?qū)⒊恋砦锶芙夂螅?jīng)瓊脂糖電泳，切下 DNA 部分再將膠回收，或者用多糖水解酶將多糖降解。還 有在提取緩沖液中加一定量的氯苯(1/2體積)，氯苯可以與多糖的羥基作用而去除多糖。

上述方法還可組合使用，以達(dá)到最佳效果。然而這些方法均會(huì)在一定程度上減低 DNA 的提取量；如果材料較少或要求較高，則可考慮用柱層析方法，使用對(duì) DNA 具有 特異性吸附的樹脂來純化 DNA。曾有文獻(xiàn)提到選用 Wizard Purification Kit，PRC-5 柱，Sephacryl S-1000 或 S-500，Qiagen Genomic tip 500/G，或者 CsCl 梯度離心純化 DNA。血樣4度保存了2月，現(xiàn)在按照酚常規(guī)提取方法不能提取出DNA，有什么解決辦法？ 參考見解：按照常規(guī)的酚/氯仿法不可能提不出來，下面是參考方法：

1、首先洗出白細(xì)胞，最好有1毫升以上血液。

2、加入5ml DNA提取緩沖液，(10m mol/L Tris-cl, 0.1 mol/L EDTA, o.5% SDS),混勻。

3、加入25ul 蛋白酶K ,使終濃度達(dá)到100ug/ml, 混勻，50℃水浴過夜。

4、用等體積的（酚，氯仿，異戊醇，25：24：1）混合物抽提一次，5000r/min，10min離心收集水相。

5、取水層，加入3倍體積-20℃預(yù)冷無水乙醇5000r/min，10min，75%乙醇5000r/min洗DNA，充分干燥將DNA溶于適量水中。

CTAB法提取水稻基因組DNA，TE 溶解后瓊脂糖膠電泳檢測(cè)，點(diǎn)樣孔附近有一條明顯的主帶。用MBI 公司產(chǎn)的限制性內(nèi)切酶酶切過夜，鑒定時(shí)發(fā)現(xiàn)DNA已經(jīng)被完全切爛，只在溴酚藍(lán)前存在微弱smear狀產(chǎn)物。換用NEB 公司產(chǎn)的酶，更換EP管，滅菌水之后重復(fù)幾次，結(jié)果還是如此。拿其他人的DNA 做對(duì)照，酶切結(jié)果正常。用異丙醇將DNA 重新沉淀，換了TE溶解，檢測(cè)主帶仍舊清晰，可是用酶切之后DNA還是被切爛。為什么？

參考見解：

1、公司的酶不行。

2、如做酶切，DNA最好不用異丙醇（因其不易揮發(fā)）而用無水乙醇沉淀。

3、酶量大或作用時(shí)間太長(zhǎng)了。

建議重提DNA，取少許用超純水溶解（非TE），按照說明書進(jìn)行酶切。要用新鮮樣品或液氮冷凍-70度保存的樣品。這樣通過降低內(nèi)切酶的活性減少DNA的降解；

要得到全血基因組DNA，可以先用分層液密度梯度離心將淋巴細(xì)胞分離嗎？這樣做，與沉淀全血細(xì)胞然后破壞紅細(xì)胞得到的結(jié)果有何差異？ 參考見解：

1、覺得還是先分離細(xì)胞好，因?yàn)镈NA和RNA大都是在細(xì)胞核內(nèi)，有紅細(xì)胞反而不太好。從血里面提RNA，用淋巴細(xì)胞分離液先分離有核細(xì)胞的，效果還是不錯(cuò)的。

2、現(xiàn)在提取全血的DNA,也就是提取淋巴細(xì)胞中的DNA，用密度梯度離心，只是富積淋巴細(xì)胞，能得到更多的DNA而已。一般如果DNA的量的要求不太多的話，沒必要。

3、如果對(duì)基因組的要求不高，可以試試這個(gè)方法。取EDTA-Na2抗凝血100μl加至1.5ml Eppendorf管中，加無菌重蒸水500μl；10 000r/分鐘離心3分鐘，棄凈上清；加20μl 5mol/L KI，旋渦振蕩30秒;0.9%NaCl 100μl,150μl氯仿/異戊醇(24∶1)，振蕩30秒；10 000r/分鐘離心5分鐘，吸上清100μl于另一Eppendorf管中，加異丙醇60μl，輕輕混勻，10 000r/分鐘離心5分鐘，棄上清；加冷無水乙醇1000μl，10 000r/分鐘離心5分鐘；棄去無水乙醇，37℃烤干；50μl無菌重蒸水或TE，混勻溶解備用。

從經(jīng)福爾馬林處理后的組織標(biāo)本中提取DNA可以嗎？

參考見解：可以的，國外有好多相關(guān)試劑盒，qiagen, roche等公司都有的。

100ml的大量提取，蛋白酶Ｋ是必需的嗎？它的作用是什么？用溶菌酶代替可以嗎？每次在用酚氯仿異戊醇抽提后，上層里面都是絮狀的蛋白質(zhì)，離心幾次都沉淀不下來，請(qǐng)問是哪里出了問題？

參考見解：一般來說，蛋白酶的作用是將蛋白質(zhì)消化成小的片段，促進(jìn)核酸與蛋白質(zhì)的分開，同時(shí)，也便于后面的純化操作以及獲得更純的核酸。而溶菌酶的作用是破壞微生物細(xì)胞壁，二者作用各異，不可替代。對(duì)于實(shí)驗(yàn)中的蛋白問題，建議離心后先用竹簽挑出蛋白，小心吸取上層清液，再重復(fù)抽提幾次試試。

一般植物DNA提取的時(shí)候都不加蛋白酶K，這樣提出來的DNA鏈上的組蛋白等未被蛋白酶消化，不是很難除去嗎？那DNA是不是不純？可以用來酶切嗎？

參考見解：蛋白酶k的主要作用并不是消化組蛋白，而是消化細(xì)胞，在動(dòng)物細(xì)胞DNA的提取也不加蛋白酶k也是可以的，植物細(xì)胞的較易破碎，不需要蛋白酶k的作用。protenase K作用：

1、消化組蛋白，釋放出DNA。

2、消化DNAse，提高DNA分子量。

建議還是加蛋白酶k為好，這樣提出來的 DNA分子量會(huì)高一點(diǎn)，且更純。提白粉孢子的總DNA，白粉孢子比較小，直接在研磨中加液氮研磨可以嗎？

參考見解：液氮研磨的方法應(yīng)該可行的，做動(dòng)物組織，植物組織多采用這種方法，植物纖維一樣可以用液氮研磨，要有耐心，邊加液氮邊研磨，研磨好后再抽提，應(yīng)該是可以的。在CTAB法提取DNA時(shí)，有一些品種沒有DNA析出，是什么原因？ 參考見解：

1、用預(yù)冷的異丙醇來沉淀試試，同時(shí)研磨的時(shí)候要研的非常非常的細(xì)。

2、沒有看到析出物并不代表沒有沉淀，可以繼續(xù)下一步試驗(yàn)，溶解的時(shí)候少加一點(diǎn)兒。

3、高離子強(qiáng)度下DNA與CTAB能形成共沉淀?？赡蹹NA就這樣留在沉淀里了。提取DNA配方

CTAB為十六烷基三甲基溴化銨，CTAB提取緩沖液的經(jīng)典配方

Tris-HCl(pH8.0)提供一個(gè)緩沖環(huán)境,防止核酸被破壞；

EDTA螯合Mg2+或Mn2+離子,抑制DNase活性；

NaCl 提供一個(gè)高鹽環(huán)境,使DNP充分溶解,存在于液相中；

Cβ-巰基乙醇是抗氧化劑,有效地防止酚氧化成醌,避免褐變,使酚容易去除基因組DNA。

CTAB 4g

NaCl 16.364 g

1M Tris-HCl 20ml(PH8.0)

0.5M EDTA 8ml，先用70ml ddH2O溶解, 再定容至200ml滅菌

冷卻后0.2-1% 2-巰基乙醇（400ul）氯仿-異戊醇（24：1）：先加96ml氯仿，再加4ml異戊醇，搖勻即可。

提取內(nèi)源核酸酶含量豐富的材料的DNA時(shí)，怎樣更好的抑制內(nèi)源核酸酶的活性？ 參考見解：在提取內(nèi)源核酸酶含量豐富的材料的DNA時(shí),可增加裂解液中螯合劑的含量,細(xì)胞裂解后的后續(xù)操作應(yīng)盡量輕柔。

用試劑盒對(duì)農(nóng)田土壤的的微生物群落DNA進(jìn)行提取，雖然總DNA提出來了，可是用細(xì)菌的通用引物進(jìn)行PCR的時(shí)候卻怎么也擴(kuò)不出來，請(qǐng)有沒有什么好的辦法可以解決這個(gè)問題？

參考見解：環(huán)境特別是土壤的樣品成分復(fù)雜，尤其是有腐殖酸具有和DNA類似的性質(zhì)，因此用一般的國內(nèi)試劑盒無法提純。應(yīng)當(dāng)選用自制的提取方法，在裂解液中加入要加入PVP。洗滌后硅膠膜上仍有雜色殘留？

參考見解：細(xì)胞裂解不充分，裂解液和樣品要快速充分混勻。洗滌產(chǎn)物中DNA量很少或沒有？ 參考見解：

1、樣品中細(xì)胞或者病毒濃度低。

2、裂解液和樣品混合不均勻造成細(xì)胞的裂解不充分。

3、蛋白酶K活性下降造成細(xì)胞裂解的不充分。

4、溫浴時(shí)間不夠造成的細(xì)胞裂解不充分或蛋白降解不完全，盡量把組織切成小塊，延長(zhǎng)溫浴時(shí)間，使裂解物中沒有顆粒狀物殘留。

5、在上柱前，裂解物中沒有加乙醇，或用低濃度乙醇代替無水乙醇。

6、DNA沒有有效洗脫，提高洗脫效率，可將離心柱在加入洗脫液后在室溫靜止至少1min，再離心。

7、洗脫液pH不合適，低pH值會(huì)減少DNA產(chǎn)率，確保洗脫液pH在7.0－8.5之間。8洗脫體積太大，超過200ul洗脫體積所得的DNA濃度會(huì)降低，但DNA總量不會(huì)減少。

第五篇：實(shí)驗(yàn)二 植物核酸的提取-教案

授課教師 學(xué)生人數(shù) 55 課 題 實(shí)驗(yàn)二 植物基因組DNA的提取 授課類型 新授課 授課方法 講授、演示 教學(xué)目的 掌握CTAB法提取植物基因組DNA的原理與方法 教學(xué)重點(diǎn) 理解每一步實(shí)驗(yàn)操作的目的 教學(xué)難點(diǎn) 實(shí)驗(yàn)操作過程中的一些注意事項(xiàng) 教學(xué)過程

一、背景知識(shí)

1.DNA在細(xì)胞中存在的位臵？植物細(xì)胞DNA存在的位臵和動(dòng)物細(xì)胞有何不同？（圖）教學(xué)用具 多媒體

2.DNA的存在形式

雙螺旋結(jié)構(gòu)圖

雙螺旋結(jié)構(gòu)組成

染色體是怎樣形成的？

一級(jí)結(jié)構(gòu)（核小體=雙螺旋+組蛋白）-二級(jí)結(jié)構(gòu)（螺線管）-三級(jí)結(jié)構(gòu)（超螺線管）-四級(jí)結(jié)構(gòu)（染色體）

真核生物基因組DNA是經(jīng)過四級(jí)包裝形成了染色體，先是DNA形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，再與組蛋白形成核小體（一級(jí)結(jié)構(gòu)），壓縮7倍，再形成螺旋管（二級(jí)結(jié)構(gòu)），壓縮6倍，之后再形成超螺旋管（三級(jí)結(jié)構(gòu)），壓縮40倍，最后超螺旋管壓縮形成染色體（四級(jí)結(jié)構(gòu)），再壓縮5倍，正常細(xì)胞中基因組DNA是以染色質(zhì)（相當(dāng)于一級(jí)結(jié)構(gòu)）形式存在，在細(xì)胞分裂的中期以染色體形式存在，真核生物細(xì)胞質(zhì)DNA主要是以裸露的環(huán)狀DNA形式存在，沒有核小體結(jié)構(gòu)。

3.遺傳物質(zhì)核酸除了DNA外還有另外一種，即RNA，它與DNA在結(jié)構(gòu)上的區(qū)別？（圖）

RNA基本單位中間的五碳糖是核糖，含氮堿基尿嘧啶（U）替代 胸腺嘧啶（T）4.核酸的理化性質(zhì)

（1）形狀：DNA為白色類似石棉樣的纖維狀物，RNA的純品呈白色粉末或結(jié)晶。

（2）溶解性：一般都溶于水，不溶于乙醇、異丙醇、氯仿等有機(jī)溶劑，它們的鈉鹽比游離酸易溶于水。（3）保存：在酸性溶液中，核酸易水解，中性或弱堿性溶液中較穩(wěn)定。

二、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

1.掌握CTAB法提取植物基因組DNA的原理 2.CTAB法提取植物基因組DNA的實(shí)驗(yàn)方法

三、實(shí)驗(yàn)原理

1.核酸在細(xì)胞中的存在方式，是以核酸-蛋白質(zhì)復(fù)合物的形式存在，如一級(jí)結(jié)構(gòu)核小體（圖）：DNA螺旋+組蛋白

2.通過低溫研缽破壞植物細(xì)胞壁

3.加入CTAB溶解細(xì)胞膜，CTAB與核酸形成核酸-CTAB復(fù)合物，使核酸與蛋白質(zhì)分離。

4.加入高鹽溶液溶解核酸-CTAB復(fù)合物，加入蛋白質(zhì)變性劑使蛋白質(zhì)變性沉淀出來，離心除去蛋白質(zhì)。5.加入核酸沉淀劑，溶解CTAB，并使和核酸沉淀出來，離心得到核酸沉淀。

四、實(shí)驗(yàn)儀器 1.水浴鍋

2.離心機(jī)（12管）：3臺(tái) 3.研缽：10個(gè)

4.移液槍（包括槍頭）：1ml、400ul

五、實(shí)驗(yàn)材料與藥品

實(shí)驗(yàn)材料：新鮮菠菜葉片 1.十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）

作用：溶解細(xì)胞膜并與核酸結(jié)合，便于分離核酸。商品信息：瓶裝/100g。

理化性質(zhì)：白色或淺黃色結(jié)晶體至粉末狀，有刺激氣味，易溶于異丙醇，可溶于水,震蕩時(shí)產(chǎn)生大量泡沫，化學(xué)穩(wěn)定性好，耐熱、耐光、耐壓、耐強(qiáng)酸強(qiáng)堿。有吸濕性，在酸性溶液中穩(wěn)定；溶于10份水，溶于熱水、乙醇、三氯甲烷,易溶于異丙醇水溶液,微溶于丙酮,不溶于乙醚和苯。

儲(chǔ)存：在陰涼，干燥，通風(fēng)良好的地方，遠(yuǎn)離不相容的物質(zhì)。危害：高毒，對(duì)皮膚及粘膜刺激性小，有輕微脫脂作用。2.1M Tris-HCl PH8.0緩沖液

作用：提供一個(gè)緩沖環(huán)境，防止核酸被破壞 商品信息：瓶/100ml，無色、澄清溶液

理化性質(zhì)：Tris中文品名為三羥甲基氨基甲烷，瓶/500g。是一種白色結(jié)晶或粉末。溶于乙醇和水，微溶于乙酸乙酯、苯，不溶于乙醚、四氯化碳，對(duì)銅、鋁有腐蝕作用，有刺激性的化學(xué)物質(zhì)。

儲(chǔ)存：室溫保存。

危害：毒性低，可致癌，不要直接接觸皮膚。3.乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-2Na）

作用：螯合Mg2+或Mn2+離子,抑制脫氧核糖核酸酶（DNase）活性，活性依賴于鈣離子，并能被鎂離子或二價(jià)錳離子激活。

商品信息：瓶/250g。

理化性質(zhì)：無味無臭或微咸的白色或乳白色結(jié)晶或顆粒狀粉末。溶于水，不溶于乙醇、乙醚，其水溶液pH值約為5.3?？捎蒃DTA與氫氧化鈉和碳酸鈣作用制得。

儲(chǔ)存：于陰涼、通風(fēng)的庫房。遠(yuǎn)離火種、熱源。應(yīng)與氧化劑分開存放，切忌混儲(chǔ)。配備相應(yīng)品種和數(shù)量的消防器材。儲(chǔ)區(qū)應(yīng)備有合適的材料收容泄漏物。

危害：對(duì)粘膜和上呼吸道有刺激作用。對(duì)眼睛、皮膚有刺激作用。本品可燃，具刺激性。4.Tris飽和酚

作用：強(qiáng)蛋白質(zhì)變性劑。商品信息：瓶/250ml。

理化性質(zhì)：為淺黃色透明液體，上層為Tris-HCl溶液，加有抗氧化的0.25% 8-羥基喹啉和0.1%的β-巰基乙醇。

儲(chǔ)存：4℃避光保存。

危害：Tris飽和酚有較強(qiáng)的腐蝕性，應(yīng)盡量避免皮膚直接接觸或吸入體內(nèi)。如發(fā)現(xiàn)變?yōu)辄S色或棕色，表明發(fā)生氧化，不能使用。5.β-巰基乙醇（2-巰基乙醇）

作用：提供一種還原劑，這樣酚類物質(zhì)（植物材料特別是老的材料中含有大量的酚類物質(zhì)）就不能被氧化成醌（醌易與DNA發(fā)生共價(jià)結(jié)合，使DNA發(fā)生褐變，從而影響你提DNA的實(shí)驗(yàn)）。巰基乙醇兼有消除CTAB震蕩時(shí)產(chǎn)生的泡沫的作用。

商品信息：瓶/100g。

理化性質(zhì)：無色透明液體，具有少許硫醇?xì)馕丁Ｒ兹苡谒?，乙醇和乙醚等有機(jī)溶劑，與苯可以任意比例混溶。水中溶解度：1mg/mL。

儲(chǔ)存：對(duì)空氣敏感，易吸潮。使容器保持密閉，儲(chǔ)存在陰涼、干燥通風(fēng)處。打開了的容器必須仔細(xì)重新封口并保持豎放位臵以防止泄漏。建議貯存溫度 2-8℃。

危害：高毒吸入、攝入或經(jīng)皮膚吸收后會(huì)中毒。對(duì)環(huán)境有危害，對(duì)水體可造成污染。本品可燃。6.氯化鈉（NaCl）

作用：CTAB-核酸復(fù)合物在高鹽溶液中易溶。商品信息：瓶/500g，分析純AR。

理化性質(zhì)：白色晶體狀。易溶于水、甘油，微溶于乙醇、液氨；不溶于濃鹽酸。在空氣中微有潮解性。穩(wěn)定性比較好。

儲(chǔ)存：儲(chǔ)存于陰涼、通風(fēng)的庫房。遠(yuǎn)離火種、熱源。應(yīng)與氧化劑分開存放，切忌混儲(chǔ)。危害： 7.無水乙醇

作用：DNA沉淀劑、洗滌劑。商品信息：瓶/500ml，分析純AR。

理化性質(zhì)：無色澄清液體。極易從空氣中吸收水分，能與水和氯仿、乙醚等多種有機(jī)溶劑以任意比例互溶。儲(chǔ)存：儲(chǔ)存于陰涼、通風(fēng)的庫房。遠(yuǎn)離火種、熱源。庫溫不宜超過30℃。保持容器密封。應(yīng)與氧化劑、酸類、堿金屬、胺類等分開存放，切忌混儲(chǔ)。采用防爆型照明、通風(fēng)設(shè)施。禁止使用易產(chǎn)生火花的機(jī)械設(shè)備和工具。

危害：易燃，具刺激性。蒸氣與空氣能形成爆炸性混合物，爆炸極限3.5%～18.0%（體積）。8.氯仿（三氯甲烷）

作用：蛋白質(zhì)變性劑，加速有機(jī)相與液相分層，去除核酸溶液中的少量酚（酚易溶于氯仿）。商品信息：瓶/500ml。

理化性質(zhì)：無色透明液體，極易揮發(fā)，有特殊氣味。不溶于水，溶于醇、醚、苯。儲(chǔ)存：保存在密封的棕色瓶中。

危害：麻醉性。有致癌可能性。在光照下遇空氣逐漸被氧化生成劇毒的光氣。9.異戊醇

作用：減少蛋白質(zhì)變性操作過程中產(chǎn)生的氣泡。異戊醇可以降低表面張力，從而減少氣泡產(chǎn)生。另外，異戊醇有助于分相，使離心后的上層含DNA的水相、中間的變性蛋白相及下層有機(jī)溶劑相維持穩(wěn)定。

商品信息：瓶/500ml。

理化性質(zhì)：無色液體，有不愉快的氣味。微溶于水，可混溶于醇、醚等有機(jī)溶劑。

儲(chǔ)存：儲(chǔ)存于陰涼、通風(fēng)的庫房。遠(yuǎn)離火種、熱源。庫溫不宜超過30℃。保持容器密封。應(yīng)與氧化劑、酸類等分開存放，切忌混儲(chǔ)。采用防爆型照明、通風(fēng)設(shè)施。禁止使用易產(chǎn)生火花的機(jī)械設(shè)備和工具。儲(chǔ)區(qū)應(yīng)備有泄漏應(yīng)急處理設(shè)備和合適的收容材料。

危害：吸入、口服或經(jīng)皮膚吸收有麻醉作用。其蒸氣或霧對(duì)眼睛、皮膚、粘膜和呼吸道有刺激作用，可引起神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂，長(zhǎng)時(shí)間接觸有麻醉作用。易燃，其蒸氣與空氣可形成爆炸性混合物，遇明火、高熱能引起燃燒爆炸。10.異丙醇

作用：DNA沉淀劑，DNA在異丙醇的溶解度更低，所以用異丙醇來沉淀更完全，而后由于異丙醇不易揮發(fā)，所以用乙醇洗去異丙醇，乙醇揮發(fā)快。用-20度預(yù)冷異丙醇沉淀效果較等體積乙醇沉淀好；異丙醇約和2.5倍體積的乙醇效果相當(dāng)；但DNA微溶于乙醇，使用乙醇沉淀會(huì)使部分DNA溶解損失；所以多選用-20度預(yù)冷異丙醇。一般6500倍到8000倍重力10分鐘就可以將異丙醇沉淀的核酸緊密的離到管底。

商品信息：棕色玻璃瓶/500ml。

理化性質(zhì)：無色透明具有乙醇?xì)馕兜目扇夹砸后w。有似乙醇和丙酮混合物的氣味，能與醇、醚、氯仿和水混溶，不溶于鹽溶液。

儲(chǔ)存：儲(chǔ)存于陰涼、通風(fēng)的庫房。遠(yuǎn)離火種、熱源。庫溫不宜超過30℃。保持容器密封。應(yīng)與氧化劑、酸類、鹵素等分開存放，切忌混儲(chǔ)。采用防爆型照明、通風(fēng)設(shè)施。禁止使用易產(chǎn)生火花的機(jī)械設(shè)備和工具。儲(chǔ)區(qū)應(yīng)備有泄漏應(yīng)急處理設(shè)備和合適的收容材料。

危害：微毒類，高濃度蒸氣具有明顯麻醉作用，對(duì)眼、呼吸道的黏膜有刺激作用，能損傷視網(wǎng)膜及視神經(jīng)。常溫下可引火燃燒，其蒸汽與空氣混合易形成爆炸混合物。11.PVP-40（聚乙烯吡咯烷酮）

作用：PVP是酚的絡(luò)合物，能與多酚形成一種不溶的絡(luò)合物質(zhì)，有效去除多酚，減少DNA中酚的污染；同時(shí)它也能和多糖結(jié)合，有效去除多糖。

商品信息：白色塑料瓶/100g。

理化性質(zhì)：白色或乳白色粉末或顆粒，有微臭。溶于水、堿、酸及極性有機(jī)溶劑。儲(chǔ)存：室溫干燥保存。危害： 12.液氮（LN2）

作用：低溫導(dǎo)致植物組織凍裂，方便研磨使細(xì)胞破碎，使DNA釋放完全；低溫情況下各酶處于低活性狀態(tài)，有利于抑制DNAase的作用，保護(hù)DNA。商品信息：分析純

理化性質(zhì)：-196℃。液態(tài)的氮?dú)狻Ｊ嵌栊缘?，無色，無臭，無腐蝕性，不可燃，溫度極低。儲(chǔ)存：儲(chǔ)存于陰涼、通風(fēng)的庫房。庫溫不宜超過30℃。危害：汽化時(shí)大量吸熱接觸造成凍傷。

六、實(shí)驗(yàn)試劑

1.氯仿-異戊醇（24:1）100ml-20ml=80ml {氯仿 96ml + 異戊醇 4ml} = 100ml，4℃保存 2.酚-氯仿-異戊醇（25:24:1）40ml {氯仿-異戊醇（24:1）20ml + Tris飽和酚20ml} = 40ml，4℃保存 3.TE緩沖液 PH8.0 50ml {10mM Tris-HCl（PH8.0）緩沖液 0.5ml + 0.5M EDTA（PH8.0）0.1ml} → → 定容到50ml → 高壓滅菌后冷卻4℃保存 ? 【0.5M EDTA（PH8.0）】的配制：100ml {蒸餾水 80ml + EDTA-2Na.2H2O 18.61g} → 用NaOH（約2g）調(diào)至PH8.0 → 定容至100ml → → 分裝后高壓滅菌備用。注：需加入NaOH調(diào)至PH8.0才能完全溶解。? 【10mM Tris-HCl（PH8.0）緩沖液】的配制：10ml {1M Tris-HCl PH8.0緩沖液100μl + 水9.9ml} → 定容至10ml → 10mM Tris-HCl（PH8.0）緩沖液 4.2%CTAB抽提液 250ml

{CTAB 4g + 無水乙醇 5ml + 水100ml} → 加入200ml燒杯中 → 加熱溶解 → 再依次加入 → → {5M NaCl 56ml + 1M Tris-HCl（PH8.0）20ml + 0.5M EDTA 8ml} → 定容至250ml → 高壓滅菌冷卻后加入 → {1%β-巰基乙醇（400ul）2ml + PVP-40 5g} → 4℃保存 ? ? 【5M NaCl溶液】配制：100ml {NaCl 29.22g + 水90ml} → 加熱到80℃溶解冷卻后 → 定容至100ml → 高壓滅菌備用 【1%（v/v）β-巰基乙醇】配制：10ml {β-巰基乙醇 100μl +水9.9ml} → 1%β-巰基乙醇10ml 5.蒸餾水

所有藥劑用水都要純凈水經(jīng)高壓滅菌冷卻

七、實(shí)驗(yàn)步驟

（一）實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

1.研缽、異丙醇-20℃預(yù)冷；【研缽10個(gè)、異丙醇75ml】

2.將2%CTAB抽提液從4℃冰箱內(nèi)取出在65℃水浴預(yù)熱；【CTAB抽提液30ml】 3.稱取30份新鮮菠菜葉片，每份1g，稱重時(shí)去葉脈；【菠菜葉片30g】 4.用蒸餾水沖洗葉片，濾紙吸干水分，將葉片用剪刀剪小?！鞠雌?、濾紙、剪刀】

5.實(shí)驗(yàn)器材：冰箱、65℃水浴鍋、液氮、10ml離心管90個(gè)、藥匙、移液槍（1ml、100μl、400μl）、離心機(jī)（10000r/min）

6.實(shí)驗(yàn)藥劑：酚-氯仿-異戊醇30ml（每管1ml）、氯仿-異戊醇60ml（每管2ml）、無水乙醇12ml（每管400 μl）、TE緩沖液3ml（每管100μl）

（二）破碎細(xì)胞，釋放溶解核酸

1.將葉片臵于預(yù)冷的研缽（實(shí)驗(yàn)前-20℃預(yù)冷）中，倒入液氮，盡快研磨成粉末；

? 目的：低溫導(dǎo)致植物組織凍裂，方便研磨使細(xì)胞破碎，使DNA釋放完全；低溫情況下各酶處于低活性狀態(tài)，有利于抑制DNase的作用，保護(hù)DNA。

2.將粉末加入10ml離心管中，加入 1ml預(yù)熱的CTAB 抽提緩沖液，輕輕攪動(dòng)搖勻； ? 目的：CTAB可以溶解細(xì)胞膜并與DNA結(jié)合，便于分離DNA。加入β-巰基乙醇和PVP-40的目的是減少植物中酚類物質(zhì)的影響。EDTA的作用是螯合Mg2+或Mn2+離子,抑制脫氧核糖核酸酶（DNase）活性，活性依賴于鈣離子，并能被鎂離子或二價(jià)錳離子激活。Tris-HCl提供一個(gè)緩沖環(huán)境，防止DNA被破壞。高鹽溶液可以更好的溶解核酸-CTAB復(fù)合物。

3.將離心管臵于 65℃的水浴中保溫40分鐘，期間每隔10分鐘輕輕搖晃幾次。? 目的：水浴使CTAB抽提液和葉片充分反應(yīng)。

（三）抽提去掉蛋白質(zhì)

1.將水浴的離心管取出，冷卻 2分鐘后，加入1ml酚-氯仿-異戊醇，振蕩 2分鐘，使兩者混合均勻，12000 r/min離心10分鐘； ? 目的：第一次離心溶液分3層，上-中-下層：CTAB-核酸-變性蛋白-有機(jī)溶劑

2.取上清液（含CTAB-核酸）至新的10 ml離心管中，加入2ml氯仿-異戊醇，輕輕顛倒離心管，混勻，12 000r/min離心10分鐘。? 目的：第二次離心進(jìn)一步去掉變性蛋白，去掉多余的酚

（四）沉淀核酸

1.小心取上清液（含CTAB-核酸）臵于一個(gè)新的10ml離心管中（盡量避免吸取中間層）,加入2.5ml的異丙醇（-20℃預(yù)冷），將離心管慢慢上下?lián)u動(dòng)30秒，使異丙醇與水層充分混合，室溫放臵15分鐘至能見到DNA絮狀物； ? 目的：異丙醇為DNA沉淀劑，異丙醇與CTAB互溶，但不與核酸相溶。用-20℃預(yù)冷的異丙醇沉淀效果較等體積乙醇沉淀好，異丙醇約和2.5倍體積的乙醇效果相當(dāng)，但核酸微溶于乙醇，使用乙醇沉淀會(huì)使部分核酸溶解損失；所以多選用-20度預(yù)冷異丙醇。核酸在異丙醇的溶解度更低，所以用異丙醇來沉淀更完全。異丙醇易溶于CTAB，但不與核酸相溶。2.10000r/min離心10分鐘,小心倒去上清液。? 目的：第三次離心使核酸沉淀到管底。

（五）核酸的洗滌

用400ul無水乙醇洗滌核酸沉淀直至無色，10000r/min離心10分鐘，傾去上清液晾干。? 目的：異丙醇不易揮發(fā)，所以用乙醇洗去異丙醇及多余的NaCl，乙醇揮發(fā)快。

（六）保存

向下層離心物中加入100μl TE緩沖液進(jìn)行溶解，臵于-20℃冰箱保存，以便下次課用。? 目的：一般長(zhǎng)期保存DNA，貯存在TE緩沖液中比較好。TE為含EDTA的Tris-HCl(PH 8.0)緩沖液：其中比較關(guān)鍵的成分是EDTA，日常環(huán)境中不可避免的存在DNase，而DNase的活性依賴于鈣離子，并能被鎂離子或二價(jià)錳離子激活。鎂離子存在條件下，DNase I可隨機(jī)剪切雙鏈DNA的任意位點(diǎn)；二價(jià)錳離子存在條件下，DNase I可在同一位點(diǎn)剪切DNA雙鏈，形成平末端，或1-2個(gè)核苷酸突出的粘末端。TE中含有的EDTA可以螯合金屬離子，從而使DNase失活。而Tris-HCl的作用主要是維持一定堿性PH值，有助于DNA的溶解和穩(wěn)定。不加EDTA也是可以的，而且EDTA會(huì)影響下游酶切，連接反應(yīng)以及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞的效率，如果接下來要做這些實(shí)驗(yàn)是應(yīng)該避免使用含EDTA的緩沖液的。短期儲(chǔ)存DNA也可以使用ddH2O，有助于DNA連接等效果。

八、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

1.在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)嚴(yán)格執(zhí)行無菌操作； 2.部分藥品有毒，操作中應(yīng)注意安全防護(hù)；

3.磨樣時(shí)最好是加液氮，磨樣速度要快，使材料處于低溫狀態(tài)； 4.剛投入水浴時(shí)可以稍快速的晃動(dòng)，之后的晃動(dòng)一定要輕柔； 5.抽提時(shí)不要有太力振動(dòng)，操作也要仔細(xì)，盡量避免DNA斷裂；

6.將異丙醇吸出時(shí)用的槍頭一定要剪過的，這點(diǎn)很重要，過尖的槍頭會(huì)把DNA鏈弄斷。

九、思考題

1.本實(shí)驗(yàn)中用到的各種試劑的作用是什么？ 2.本實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行了幾次離心操作，每次的目的？

十、實(shí)驗(yàn)安排

全班55人，按照學(xué)號(hào)分組，每6人一組，共9組，最后一組7人。每組作3個(gè)離心管，共用一個(gè)研缽。

每3組（共18人9個(gè)離心管）共同進(jìn)行離心操作。