第一篇：菠蘿蛋白酶純化方法總結(jié)

菠蘿蛋白酶的提取方法：

（1）沉淀法

沉淀法是粗提酶蛋白的方法之一，主要用于前期酶的初步分離和濃縮，常用的方法有鹽析法，有機(jī)溶劑沉淀法，聚乙二醇沉淀法，等電點(diǎn)沉淀法等。用新型吸附洗滌沉淀法和單寧沉淀法也可以提取菠蘿蛋白酶，操作簡單，產(chǎn)率也較高，但酶的產(chǎn)量與單寧的用量密切相關(guān)，而且所含單寧有毒，導(dǎo)致這種方法逐漸被淘汰了。以酒精為沉淀劑提取菠蘿蛋白酶時(shí)，酒精的加入量會(huì)對菠蘿蛋白酶產(chǎn)生較大的影響，酒精的濃度太低時(shí)，不能使菠蘿蛋白酶沉淀下來，濃度太高容易使酶變性失活。酒精的濃度為80%時(shí)，酶的收率最高。從茶葉中提取的多酚類物質(zhì)茶多酚也可用于菠蘿蛋白酶的分離，用0.5%的茶多酚提取物對菠蘿汁中菠蘿 蛋白酶進(jìn)行沉淀最多可達(dá)78%，其最大沉淀率明顯比單寧法高。（2）離子交換色譜法

離子交換色譜層析法是蛋白質(zhì)研究領(lǐng)域內(nèi)比較高效的純化技術(shù)，目前國外用于分離菠蘿蛋白酶常用的離子交換劑有Sephacryl S-200柱、Mono S陽離子交換劑、S-Sepharose、弱酸性陽離子交換樹脂、CM-纖維素陽離子交換柱、Q陰離子交換柱。國內(nèi)常用的有羧甲基纖維素（CMC）、二乙胺乙基纖維素（DEAE），酶的純化過程通常是將若干色譜純化技術(shù)聯(lián)合使用來實(shí)現(xiàn)的。Ota最早用SephadexG-75結(jié)合CM-SephadexC-25柱層析分離得到5種莖酶的組分。用DEAE-52離子交換柱層析結(jié)合Sephadex G-75分子篩柱層析色譜法純化果酶，能 獲得比活力為12.5U/mg的單一電泳純酶制劑。（3）固定化金屬離子親和色譜法

固定化金屬離子親和色譜法是以普通凝膠作為載體，連接上合適的螯合配體和足夠暴露的金屬離子，制成親和吸附劑，進(jìn)行分離純化蛋白質(zhì)的方法。此法介于高特異性的生物親和分離法和低特異性的離子交換色譜法之間，對組氨酸基團(tuán)有特異性。Huali Nie 等（2008）首次應(yīng)用固定化金屬親和膜（IMAM）—肽-尼龍膜，這是一種將七肽共價(jià)固定到復(fù)合膜上作為配體的新型尼龍膜，用其從菠蘿中分離和提純菠蘿蛋白酶，可使菠蘿蛋白酶純化 15.4 倍，回收率達(dá) 94.6%，而且不會(huì)造成任何變性。固定化金屬親和層析技術(shù)正逐漸被采用，Pawan Gupta等（2007）將菠蘿蛋白酶成功固定在亞氨基二乙酸載體瓊脂糖凝膠 6B 型中。Cu2+ 與亞氨基二乙酸（IDA）的絡(luò)合被用來作為螯合配體將單個(gè)組氨酸結(jié)合到菠蘿酶上。固定化高親和性載體的制備是試圖將可溶性交聯(lián)菠蘿蛋白酶制劑固定到銅-亞氨基二乙酸-瓊脂糖凝膠上。（4）超濾法

超濾法是在離心力或較高的壓力作用下，選擇適當(dāng)孔徑的超濾膜，使水和其他小分子物質(zhì)通過，而使所需酶蛋白截留的方法。利用超濾法提取酶蛋白，具有無相變、生物活性不易喪失、得率較高，不會(huì)改變?nèi)芤禾撬岜鹊忍攸c(diǎn)。用超濾法濃縮有機(jī)溶劑提取的菠蘿蛋白酶產(chǎn)品質(zhì)量好，對環(huán)境污染少，可以實(shí)現(xiàn)清潔生產(chǎn)，酶粉得率比高嶺土工藝高出47%。超濾法分離提取的粗酶比活力較單寧沉淀法高2.7倍，也比酒精沉淀法高。用超濾法濃縮提取菠蘿蛋白酶需要對操作條件進(jìn)行研究，盡最大可能提高超濾效果，促進(jìn)工業(yè)化生產(chǎn)。楊輝等研究認(rèn)為壓力差在300kPa，透過液通量為50L/m2·h時(shí)即能保持較大的流量，又不會(huì)對酶活造成損失。在對菠蘿汁進(jìn)行超濾的過程中，料液透過通量隨壓力差增加和循環(huán)速度的增大逐漸上升并趨于穩(wěn)定。用超濾法濃縮提取生物大分子時(shí)因不同膜材料的透過通量和截留率不同，而導(dǎo)致不同的分離特性。用聚丙烯腈膜（PAN）膜濃縮工藝較適合對菠蘿蛋白酶進(jìn)行超濾濃縮，可使果菠蘿酶回收率達(dá)93.3%，截留率達(dá)97.8%。用PSA膜超濾菠蘿皮汁制得的菠蘿蛋白酶酶活總回收率為65.7%。李興，林哲甫用二氧化鈦吸附菠蘿果汁中的菠蘿蛋白酶再用截留值2萬和5萬的超濾膜超濾濃縮，能獲得較高比活的果酶。得到的果酶活力回收率為54%，比活力為911單位/mg。目前將納米氧化鋅吸附、陶瓷膜超濾濃縮和冷凍干燥法結(jié)合的綜合性技術(shù)已達(dá)到國際先進(jìn)水平，創(chuàng)新性較好。(5)雙水相萃取法 利用兩種多聚物，或多聚物與鹽在水相中的不相容性，可以從細(xì)胞破碎后的細(xì)胞碎片中直接分離、純化并濃縮蛋白質(zhì)。該方法的優(yōu)點(diǎn)是比較溫和可在室溫下進(jìn)行，一般不造成酶的變性失活，還可提高其穩(wěn)定性。與其它分離純化方法相比，利用雙水相萃取法有很多優(yōu)點(diǎn)，如易于放大、成本低、可以連續(xù)操作、并且是環(huán)境友好的。這就使其成為分離純化生物分子的誘人的替代方法，在國外進(jìn)行了大量的應(yīng)用。B.Ravindra Babu等（2008）首次使用該法從菠蘿中分離純化菠蘿蛋白酶和多酚氧化酶的混合物，結(jié)果使菠蘿蛋白酶的純度提高4.0倍，得到約228%的活性回收率。雙水相萃取法提供了一種有效的、經(jīng)濟(jì)上可行的分離純化菠蘿蛋白酶的方法。在雙水相體系中用PEO–PPO–PEO 嵌段共聚物分離純化菠蘿蛋白酶，其活性回收范圍為7.5%~79.5%，純化倍數(shù)0.1~1.25倍。在雙水相體系中，各種參數(shù)如聚合物的分子質(zhì)量、聚合物和形成相的鹽濃度和分離體系的pH對分離純化的結(jié)果影響較大。(6)反膠團(tuán)萃取法

生物技術(shù)的發(fā)展為重要生物分子的生產(chǎn)開辟了一條新的途徑，在選擇性提取的生物分子中，逆膠束有機(jī)相很有潛力發(fā)展為液液萃取的生物分離技術(shù)。反膠團(tuán)是表面活性劑，使水滴穩(wěn)定分散在有機(jī)溶劑中，這種表面活性劑是雙親性的有機(jī)復(fù)合物，既親脂也親水。反膠團(tuán)萃取法有如下一些優(yōu)點(diǎn)：不會(huì)造成原有功能或活性的損失、界面張力較低、易于規(guī)?；?、有連續(xù)運(yùn)作的潛力。H.Umesh Hebbar等（2008）用溴化十六烷基三甲銨/異辛烷/正己醇/正丁醇和磺酸鈉/異辛烷的反膠束體系從菠蘿廢料的水提物中提取和初步純化菠蘿蛋白酶。用反向陽離子表面活性劑（CTAB）膠束體系能使菠蘿蛋白酶獲得一個(gè)較好的活性回收率可達(dá)106%，純化 5.2 倍，而采用陰離子表面活性劑（AOT）則沒有獲得較好的產(chǎn)率。(7)新型納米吸附劑法

隨著一種以氧化鐵納米粒子為核心，聚丙烯酸為離子交換組的新型磁性納米吸附劑的開發(fā)，其在生物分離和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域已經(jīng)被廣泛應(yīng)用。它具有高的離子交換容量和快速的吸附/解吸率。這種納米粒子用于菠蘿蛋白酶的分離是很有效的。近年來，納米纖維膜由于其非常大的表面積和體積比、優(yōu)越的機(jī)械性能引起人們的廣泛關(guān)注，Haitao Zhang 等（2010）通過一步靜電紡絲技術(shù)以二甲基乙酰胺為溶劑制備出超細(xì)聚丙烯腈（PAN）納米纖維膜，用化學(xué)的方法連接到殼聚糖的表面，共價(jià)連接到染料配體辛巴藍(lán)上制成染料固定化親和膜，而且可以重復(fù)使用，膜的再生顯示出良好的機(jī)械性和化學(xué)穩(wěn)定性。這種新開發(fā)的染料親和膜首次用于菠蘿蛋白酶的吸附，批次試驗(yàn)揭示出它具有一個(gè)很高的吸附菠蘿蛋白酶的能力，可以實(shí)現(xiàn)高效率的大規(guī)模的吸附，這種低非特異性結(jié)合的親和膜對于純化高純度的菠蘿蛋白酶是很有效的。

供試酶液的制備（納米二氧化鈦吸附法分離純化效果明顯好于高嶺土吸附法和超濾濃縮有機(jī)溶劑提取法，所得酶的比活力分別是后兩者的1.94倍和3.81倍）清洗后菠蘿莖在 4℃冷室中預(yù)冷 12h，組織搗碎機(jī)搗碎，加 1 倍 0.05mol/L，pH6.0 磷酸緩沖液（含 5 mmol/L 的 EDTA）浸提，緩慢攪拌，浸提 10min，4 層紗布過濾，離（4000rpm，15min），上清液即為供試酶液，蛋白質(zhì)含量為 1.62 mg/mL。（菠蘿果、皮中酶供試液制備方法同上）操作要點(diǎn)：選取干凈的菠蘿莖，除雜，清水中漂洗三次，瀝干，放入 4℃冷室中 預(yù)冷備用。預(yù)冷后莖用高速組織搗碎機(jī)打漿，加 0.05 mol/L，pH6.0 磷酸緩沖液浸提 10min，4 層紗布過濾，濾液在 4000 rpm 條件下，離心 15min，取上清液，放入 4℃冷室中備用。1.納米 TiO2吸附法

（納米 TiO2的用量直接影響吸附效果。用量不足，對酶的吸附不完全；用量過多，增加處理和洗脫難度，浪費(fèi)資源）（超濾過程中會(huì)發(fā)生濃差極化現(xiàn)象，導(dǎo)致菠蘿蛋白酶的損失。在壓力較低時(shí)，隨壓力增大，通量呈直線上升，但隨壓力增大，膜逐漸被壓實(shí)，濃差極化（膜分離過程中的一種現(xiàn)象，會(huì)降低透水率，是一個(gè)可逆過程。是指在超濾過程中，濃差極化由于水透過膜而使膜表面的溶質(zhì)濃度增加，在濃度梯度作用下，溶質(zhì)與水以相反方向向本體溶液擴(kuò)散，在達(dá)到平衡狀態(tài)時(shí)，膜表面形成一溶質(zhì)濃度分布邊界層，它對水的透過起著阻礙作用。）現(xiàn)象增加，膜通量增幅變緩。）

供試酶液中加納米 TiO2攪拌均勻→離心（4000 rpm，15min）→取沉淀用檸檬酸緩沖液洗脫→攪拌（30min）→離心（4000 rpm，15min）→取上清液→超濾濃縮→冷凍干燥→酶制品。操作要點(diǎn)： ① 吸附、洗脫：供試酶液置于玻璃或不銹鋼容器中，加入納米 TiO2攪拌均勻，吸20~30min，離心棄上清，沉淀用檸檬酸緩沖液洗脫，離心取上清。② 超濾：洗脫液先用截留分子量為 40KD 的超濾膜除去較大分子量的雜蛋白，再用截留分子量為 20KD 的超濾膜除去較小分子量的雜蛋白及其它小分子雜質(zhì)，采用加去離子水多次超濾。③ 冷凍干燥：據(jù)共晶點(diǎn)確定干燥參數(shù)。④ 納米 TiO2吸附能力再生：納米二氧化鈦吸附洗脫后，采用 0.1mol/LNaOH 溶液浸泡，再用去離子水洗滌至中性，干燥后進(jìn)行重吸附實(shí)驗(yàn)，吸附效果可恢復(fù) 90%以上。通過正交試驗(yàn)得影響實(shí)驗(yàn)效果的因素主次為：納米 TiO2用量＞吸附液 pH＞吸附時(shí)間＞吸附溫度 高嶺土吸附法（高嶺土吸附法生產(chǎn)工藝和操作都比較復(fù)雜，原材料消耗多，所需設(shè)備也多，酶活總回收率及純化倍數(shù)都較低，投資較大。）

供試酶液→加 4%高嶺土，攪 20min，10℃吸附 30~60min→靜置→吸出上清→沉淀用 16%NaOH 調(diào) pH6.5~7.0→加 7%~9%NaCl，攪 30min→壓濾，濾液用 1:3（體積比）鹽酸調(diào) pH5.0→攪拌→加濾液量 25%（NH4）2SO4→溶解→4℃靜置過夜→離心→沉淀→干燥（王平諸等，2002）。操作要點(diǎn)：

①吸附：將供試酶液加入吸附槽中攪拌，同時(shí)加入 4%的高嶺土，攪拌約 20min，在 10℃吸附 30~60min，用虹吸排掉上清液，收集高嶺土吸附物。

②洗脫：用 16%的 NaOH 溶液調(diào)節(jié)吸附物的 pH 至 7.0 左右，再加入吸附質(zhì)量為 7%~9%的工業(yè)食鹽，攪拌 30min 進(jìn)行洗脫，然后迅速壓濾，收集濾液。

③鹽析：將壓濾液收集在鹽析槽中，用 1:3 的鹽酸調(diào)節(jié) pH 至 5.0 左右，攪拌加入壓濾液質(zhì)量 25%的硫酸銨，待完全溶解后，4℃過夜；然后離心，收集沉淀鹽析物，干燥即為粗酶。

3.超濾濃縮有機(jī)溶劑沉淀提取

供試酶液→超濾濃縮→有機(jī)溶劑沉淀→干燥→酶制品。

操作要點(diǎn)：①超濾：供試酶液先用截留分子量為 40KD 的超濾膜除去較大分子量 的雜蛋白，再用截留分子量為 20KD 的超濾膜除去較小分子量的雜蛋白及 其它小分子雜質(zhì)。

②有機(jī)溶劑沉淀：將濃縮液降溫至 0~4℃，邊攪拌邊加入-20℃的 95% 乙醇，直至混合液中乙醇濃度為 50%，靜置，使酶沉淀，移出上清液，即 為濕酶。

③干燥：將濕酶在 0℃下減壓干燥即得菠蘿蛋白酶制品。2.4.4.5 離子交換層析條件的確定（D.R.馬歇克等，1999.）

pH：配制pH5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0 的0.01 mol/L Tris-磷酸鹽緩沖液（含0.01 mol/LNaCl及1 mmol/LEDTA）。量取離子交換樹脂 1mL，用蒸餾水充分沖洗，定量到 10mL 懸漿。取 7 個(gè) 2mL 離心管，每管加入 1mL 離子樹脂懸漿，分別用上述緩沖液平衡。去掉多余緩沖液。按納米二氧化鈦吸附法最佳條件制得供試酶樣品，配成一定濃度酶液。取 1mL 樣品與相應(yīng)緩沖液等量加入離子樹脂中，混勻，離心取上清液，測酶活性。離子強(qiáng)度：取 4 支 2mL 離心管各加入 1mL 離子樹脂懸漿，分別用含0.1mol/L、0.5mol/L、1.0mol/L、1.5mol/L NaCl 的初始 pH6.0 的 0.01 mol/LTris 緩沖液充分潤洗 1~4 號試管，使離子樹脂與相應(yīng)緩沖液平衡，去掉多余緩沖液，向各管中加入 1mL 樣品及等量緩沖液。混勻，靜置 10min，離心取上清，測酶活性。吸附容量：取4支2mL離心管加入同初始緩沖液平衡后的離子交換樹脂0.2mL。用離心管處理樣品，于1、2、3、4號管中各加入1mL、2mL、3mL、4mL的樣品?；靹?，離心取上清液，測酶活性。離子交換層析：（1）PH的確定pH6.0的0.01mol/LTris-磷酸鹽緩沖液（2）洗脫液的濃度采用 1.5mol/L 的 NaCl 溶液作為梯度洗脫的上限濃度。（3）吸附容量的測定為保證柱層析效率和菠蘿蛋白酶的回收率擬選擇 1mL 為最佳吸附容量。

離子交換法的詳細(xì)步驟.1 離子交換介質(zhì)處理與轉(zhuǎn)型

用初始緩沖液替換傾倒澄清掉 20%乙醇，并用初始緩沖液配成凝膠勻漿（凝膠占 75%，緩沖液占 25%），作真空脫氣處理備用。2 裝柱與平衡

將所有材料和試劑平衡至室溫，配制初始緩沖液為 20mM pH4.0 的醋酸緩沖液（含 0.01%的 EDTA）和洗脫液為 1M NaCl~20mM pH4.0 醋酸緩沖液（含 0.01%EDTA）。根據(jù)試驗(yàn)中柱子（1.1cm×30.0cm）的類型取所需量的凝膠，打開層析柱頂部，關(guān)閉出口，用 20mM pH4.0 的醋酸緩沖液潤濕層析柱柱內(nèi)及柱子底端并保持一小段液位，略高出濾膜，仔細(xì)驅(qū)除底端氣泡。將凝膠勻漿用玻璃棒引導(dǎo)邊攪拌邊沿著柱內(nèi)壁按同一方向連續(xù)傾倒入柱內(nèi)，防止空氣泡的產(chǎn)生，同時(shí)用緩沖液填充柱子的剩余部分。打開柱下口出水口夾子，使凝膠在柱內(nèi)自由沉降，裝上層析柱頂端柱頭，連接好洗脫液。打開蠕動(dòng)泵，調(diào)節(jié)流速，讓緩沖液按一定的流速 通過，穩(wěn)定柱子。用 3~4 倍柱體積的緩沖液平衡柱子，直至流出的平衡液和初始平衡液 pH 相等時(shí)表示已達(dá)到平衡。同時(shí)連接紫外檢測儀，等流出液在檢測儀上繪出的基線穩(wěn)定后平直即可。3 加樣

略微增大層析柱出口的流速，排除凝膠床表面緩沖液。打開層析柱頂塞，用移液管將透析至無 SO42-的酶蛋白溶液沿管壁從凝膠床表面上數(shù)毫米處緩慢流下。加樣時(shí)應(yīng)先沿柱內(nèi)壁轉(zhuǎn)動(dòng)一周，然后移至中心緩慢小心地將樣品溶液加到凝膠表面，最好避免破壞凝膠，以保持凝膠表面平坦。打開層析柱出口，讓蛋白質(zhì)樣品溶液進(jìn)入凝膠柱床內(nèi)，待液面重合時(shí)，可用少許起始緩沖液洗柱內(nèi)壁和床表面，關(guān)上層析柱出口。.4 洗脫

加樣后用足夠量的起始緩沖液淋洗，使未吸附的物質(zhì)被洗出，并達(dá)到充分平衡，在凝膠表面緩慢滴加洗脫液，加至洗脫液表面與柱口形成凸面，加入 1MNaCl~20mM pH4.0 醋酸緩沖液（含 0.01%EDTA）以 1mL/min 流速，開始洗脫，同時(shí)連接紫外檢測儀，調(diào)整橫流泵為 1mL/min，同時(shí)以自動(dòng)部分收集器收集，每5min 收集一管，分別測定每管的蛋白濃度及酶活。

二．蛋白含量測定方法

采用考馬斯亮蘭 G-250 法（George R，1973）測定蛋白質(zhì)含量：①標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液的配制：稱取 10mg 牛血清白蛋白溶于去離子水并定容至 100mL，配成 0.1mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液。②考馬斯亮蘭 G-250 染料試劑：稱 100mg 考馬斯亮蘭 G-250，溶于50mL 95%的乙醇后，再加入 120mL 85%的磷酸，用水稀釋至 1L，過濾后貯于棕色瓶中。③標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：取 7 支試管，編號后如表 1，混勻，放置 2min后，在 595nm 波長下比色測定（應(yīng)在 1h 內(nèi)完成），以牛血清白蛋白含量（μg）為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)。根據(jù)表 1 不同蛋白質(zhì)濃度樣品液分別測定吸光度，以蛋白含量為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：：y＝0.0028x+0.0743；R2=0.9996；式中：y 為吸光度，x 為蛋白質(zhì)濃度 μg/mL。

酶的活力測定：精密移取PH7.0的干酪酸溶液5ml與15ml的具塞試管中，置于37攝氏度恒溫水浴中保溫十分鐘，準(zhǔn)確取一定量的的供試菠蘿蛋白酶液，用酶液激活液（ph4.5L-cys胱氨酸和EDTA-2Na配置）稀釋至1ml，加入上述底物溶液中，搖勻，立即置入37攝氏度的恒溫水浴中，準(zhǔn)確反應(yīng)10min，加入5ml三氯乙酸溶液中，終止反應(yīng)，用力混勻，在37攝氏度恒溫水浴中靜置保溫30min，待蛋白凝聚沉淀，然后冷卻至室溫于3500rpm離心10min，取上清液于275nm波長下測為其吸光度A。另取等體積的供試酶液，按上述步驟操作，對換酶液和三氯乙酸的加入順序，測得吸光度A0。

菠蘿蛋白酶活性的單位定義：一個(gè)酶活力單位（U）定義為特定條件下（PH7.0 ,37加減1攝氏度）酶作用于干酪素底物1min產(chǎn)生1ug酪氨酸所需酶量。

第二篇：菠蘿蛋白酶的提取純化及化學(xué)修飾對其活性的影響

菠蘿蛋白酶的提取純化及化學(xué)修飾對其活性的影響 目的要求

1、掌握從原料物中提取活化分離菠蘿蛋白酶的方法。

2、學(xué)習(xí)酶活力測定的方法。

3、了解某些因素對菠蘿中菠蘿蛋白酶熱穩(wěn)定性的影響。

4、掌握用聚乙二醇對菠蘿蛋白酶進(jìn)行化學(xué)修飾的原理。

5、比較修飾酶與未修飾酶的活力。

二、實(shí)驗(yàn)原理

1、本實(shí)驗(yàn)先從新鮮的菠蘿汁中使用單寧沉淀法提取出菠蘿蛋白酶，菠蘿蛋白酶將酪蛋白水解產(chǎn)生酪氨酸，通過測定吸光度的變化，可以測得菠蘿蛋白酶的活力。

2、以陶瓷層析結(jié)合超濾法純化菠蘿蛋白酶，吸附材料化學(xué)性質(zhì)好，可用于柱層析。

3、溫度恒定時(shí),菠蘿中菠蘿蛋白的熱失活遵循一級蛻變規(guī)律dE/dt=-Kd*t,失活半壽期是常數(shù)，可以用作衡公菠蘿蛋白酶熱穩(wěn)定性的指標(biāo)。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用動(dòng)力學(xué)方法，以菠蘿蛋白酶的熱失活半衰期為熱穩(wěn)定性的指標(biāo)，定量研究了梭酸鹽和Ca2+,Zn2+士對菠蘿中菠蘿蛋白酶熱穩(wěn)定性的影響，以期找到一種高效、可行的增強(qiáng)菠蘿蛋白酶熱穩(wěn)定性的方法。

4、修飾的菠蘿蛋白酶對溫度和pH值的穩(wěn)定性均比天然酶有很大程度的提高。菠蘿蛋白酶是一種巰基蛋白酶,但它的穩(wěn)定性較差,影響了它的應(yīng)用。此外,菠蘿蛋白酶易受有關(guān)因素的影響而失活。聚乙二醇(PEG)為一種無毒且具親水性的免疫惰性大分子，本實(shí)驗(yàn)采用聚乙二醇對菠蘿蛋白酶進(jìn)行修飾,提高了其對環(huán)境的穩(wěn)定性,使其半衰期延長。實(shí)驗(yàn)材料 試劑和材料

1、新鮮菠蘿(0.735kg)、0.1mg/ml牛血清蛋白

2、檸檬酸鈉、單寧、0.1%EDTA溶液、1.5%氯化鈉溶液、1%酪蛋白溶液、1mol/L氫氧化鈉溶液、0.05mol/L磷酸緩沖液、激活劑

3、Brolain試劑、牛血清白蛋白、0.1mol/L檸檬酸鹽緩沖液、PEG活性酯。

（二）實(shí)驗(yàn)儀器

1、榨汁機(jī)；

2、離心機(jī)；

3、紫外可見分光光度計(jì)（1cm石英比色皿）；

4、恒溫水浴鍋（37℃）；

5、試管、試管架；

6、燒杯、容量瓶；

7、移液管；

四、試驗(yàn)方法

（一）從菠蘿中提取菠蘿蛋白酶 操作步驟：

將菠蘿切碎→加檸檬酸鈉，榨汁→菠蘿汁→紗布過濾→澄清液→2000r/min，7min離心→上清液→加Vc,0.2%單寧溶液攪拌15min,靜置40min4200r/min,5min離心→沉淀物→加100ml0.1%EDTA溶液，200ml1.5%氯化鈉液→4200r/min,5min離心→酶復(fù)合物→加適量1.5%氯化鈉溶液，4000r/min,7min離心→酶復(fù)合物沉淀→凍存?zhèn)溆?菠蘿蛋白酶活力的測定

1、取酶制品溶解于0.05mol/L磷酸緩沖液（PH7.0)至10ml,離心得上清液；

2、取5支試管，分別標(biāo)號1、2、3、4、5，各加1ml溶液酶和0.9m激活劑；

3、另取5支試管，分別對應(yīng)標(biāo)號1、2、3、4、5，各加1ml緩沖液和0.9ml激活劑；

4、將10支試管置于37℃水??；

5、然后按下表操作

試管號 1 標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白

（0.1mg/mL）

0

0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 0 待測酶蛋白

（mL）0

0

0

0

0

0

0

1.0 磷酸緩沖液

（mL）1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0

0 考馬斯亮藍(lán)

（mL）4 通過測定不同試管中菠蘿蛋白酶的吸光度A的值，進(jìn)而確定酶活力的大小。

（三）聚乙二醇對菠蘿蛋白酶的化學(xué)修飾 1.1修飾酶的制備

60gPEG6000溶于400mL干燥吡啶,加入1.01g琥珀酸酐后60℃保溫2h,然后在60℃減壓蒸餾除去溶劑。加入苯直至殘余物溶解,再加100mL冷己烷,4℃振蕩2h過濾,殘?jiān)苡谡麴s水后透析。PEG活性酯和菠蘿蛋白酶按摩爾比50：1投料,加入到0.1molPL檸檬酸鹽緩沖液中,4℃反應(yīng)4h。產(chǎn)物在pH4.6的檸檬酸緩沖液中透析,凍干后得到白色的PEG-菠蘿蛋白酶(修飾酶)。1.2 TNBS法測定修飾率

取1mL蛋白酶溶液(1mgPmL),加入1mL4 %的碳酸氫鈉溶液,1mL10%的十二烷基磺酸鈉溶液,20min 后加入1mL0.1%的TNBS 溶液,40℃保溫2h ,用0.5mL 1mol/L的鹽酸終止反應(yīng)。325nm測光吸收值。同樣濃度蛋白酶溶液在修飾后與修飾前的光吸收值之比即為殘留氨基率。修飾率=1-殘留氨基率

（四）某些因素對菠蘿中菠蘿蛋白酶熱穩(wěn)定性 1.1 菠蘿蛋白酶熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)方法

新鮮菠蘿榨汁100mL加人到55℃預(yù)保溫的一定濃度梭酸鹽溶液中，不同保溫時(shí)間測定菠蘿蛋白酶活力，按熱失活遵循一級蛻變規(guī)律dE/dt=-Kd*t方法求出菠蘿蛋白酶的半衰期。1.2 有機(jī)羧酸鹽對菠蘿蛋白酶熱穩(wěn)定性的影響。

pH7.0時(shí)草酸鈉對菠蘿蛋白酶有明顯穩(wěn)定作用，100 mmol/l草酸鈉使tl/2延長6倍，丁二酸、酒石酸甲鈉也有一定的保護(hù)作用。醋酸鈉、檸檬酸鈉、硼酸鈉都有一定程度的保護(hù)作用，且濃度變化對保護(hù)作用的影響不大。結(jié)果與討論

1、修飾率的測定

測定結(jié)果按下式進(jìn)行計(jì)算:修飾率= 1修飾后的光吸收值P修飾前的光吸收值= 113.2、章佩芬,郭勇,羅煥敏.菠蘿蛋白酶的研究與應(yīng)用進(jìn)展[J ].華西藥學(xué) 雜志,2002 ,17(2):1286.（五）結(jié)果討論

從上述結(jié)果可知菠蘿蛋白酶的比活力較低，可能的原因有：

1、所加入的有機(jī)酸單寧的量對菠蘿蛋白酶沉淀有的影響；

2、在實(shí)驗(yàn)中是否把單寧溶液弄混而導(dǎo)致菠蘿蛋白酶很少沉淀析出；

3、菠蘿蛋白酶對熱不穩(wěn)定，試驗(yàn)中溫度的控制是否合理；

4、在活力測定的步驟中所加入的酪蛋白的量不足，導(dǎo)致結(jié)果偏低；

5、在活力的測定步驟中，設(shè)置了幾個(gè)梯度，最后的結(jié)果中應(yīng)該有至少兩支試管中的溶液的吸光度的值相同，但本組實(shí)驗(yàn)沒有得到這種結(jié)果。

6、活力測定中，由于操作不當(dāng)，導(dǎo)致部分沉淀溶解在了上清液中，溶液微渾濁，對吸光度的測定有影響

第三篇：直鏈淀粉的分離純化--自己總結(jié)

橡實(shí)直鏈淀粉與支鏈淀粉的分離純化

謝 濤,陳建華,謝碧霞

(中南林學(xué)院資源與環(huán)境學(xué)院,中國湖南株洲412006)

1.2.3 橡實(shí)直鏈淀粉與支鏈淀粉的分離純化

取10 g橡實(shí)淀粉,先以少量的無水乙醇潤濕,再加200 mL 0.5 mol/L的NaOH溶液,在熱水浴中加熱分散至整個(gè)淀粉糊完全透明,冷至室溫,離心(6 000 r/min,20 min)除去不溶性雜質(zhì).淀粉糊以2 mol/L的HCl調(diào)至中性,再加90 mL正丁醇和異戊醇混合溶液,混合液中V(正丁醇)∶V(異戊醇)=3∶1,在沸水浴中加熱攪拌至整個(gè)體系透明,冷卻至室溫,置于7℃冰箱中過夜,離心(6 000 r/min,20 min),沉淀物和上清液分別處理如下.將沉淀物加入120 mL飽和的正丁醇水溶液,在沸水浴中加熱攪拌至溶液分散透明,冷至室溫,在7℃冰箱中過夜,離心(6 000 r/min,20 min).按上述步驟所得的沉淀物重復(fù)處理5~10次(即重結(jié)晶5~10次).然后將沉淀物浸于無水乙醇中24 h,再反復(fù)以無水乙醇洗滌沉淀后,置于室溫下真空干燥,此時(shí)得到的是純化的直鏈淀粉樣品.無水乙醇洗滌沉淀的目的是除去直鏈淀粉中所絡(luò)合的正丁醇.上清液中加入10 mL正丁醇于沸水浴中加熱攪拌至溶液分散透明,冷至室溫,在7℃冰箱中過夜,離心(6 000 r/min,20 min),重復(fù)上述操作2~3次.將上清液真空濃縮后,加入冷的無水乙醇進(jìn)行沉淀,再以無水乙醇洗滌沉淀物數(shù)次,室溫下真空干燥得到純化的支鏈淀粉樣品.芋頭淀粉的分離和純化

孫忠偉 張燕萍 向傳萬

(江南大學(xué)食品學(xué)院,無錫, 214036)

干燥的芋頭淀粉,用體積分?jǐn)?shù)85%甲醇脫脂24h后,用無水乙醇脫脂6h,在40℃干燥48h,待用。

1·3·2 直鏈淀粉與支鏈淀粉的分離與純化

1·3·2·1 直鏈淀粉與支鏈淀粉的粗分離

稱取10g芋頭淀粉,放入500mL燒杯中,加少量的無水乙醇,使樣品濕潤,再加入0·5mol/LNaOH溶液200mL。在沸水浴中加熱攪拌20~30min至完全分散。冷卻后離心(6000r/min,20min),去除未分散的殘?jiān)?沉淀部分)。用2mol/LHCl中和離心液,并加入100mL正丁醇-異戊醇(體積比3∶1)混合液,然后在沸水浴中加熱攪拌20 min,此時(shí)溶液透明,冷卻至室溫,移入2~4℃冰箱靜置24 h,離心(6 000 r/min, 20min),沉淀物即為粗直鏈淀粉,上清液即為粗支鏈淀粉溶液。分別收集備用。1·3·2·2 直鏈淀粉的純化

將沉淀物即粗直鏈淀粉全部轉(zhuǎn)移至裝有120mL正丁醇飽和水溶液,然后置沸水浴中攪拌直至溶液分散透明,再逐漸冷卻至室溫,移入冰箱內(nèi)(2~4℃)保持24 h,取出離心(6 000 r/min,20min),將得到的沉淀重復(fù)上述操作6次,然后將沉淀物浸入無水乙醇中24h,以無水乙醇洗滌沉淀數(shù)次,該沉淀于室溫下真空干燥,即得直鏈淀粉純品。無水乙醇沉淀的目的是除去直鏈淀粉中絡(luò)合的正丁醇。

1·3·2·3 支鏈淀粉的純化

支鏈淀粉溶液置于分液漏斗中靜置,取下層溶液加40mL正丁醇-異戊醇(體積

比1∶1)混和液,在沸水浴中加熱攪拌直至溶液分散透明,冷卻至室溫,移入冰箱于2~4℃靜置48h,離心(6000r/min,20min),去除沉淀物,用上清液重復(fù)上述操作3~5次,所得上清液減壓濃縮至原體積的一半,加入2倍體積的無水乙醇沉淀、離心,將沉淀溶于熱的200mL 0·5mol/L NaOH溶液中,離心去沉淀,離心液中再加入2倍體積的無水乙醇,將沉淀溶于200mL的蒸餾水中,用2倍體積的無水乙醇再沉淀,以無水乙醇洗滌數(shù)次,室溫下真空干燥,即得支鏈淀粉純品。

直鏈淀粉的分級制備研究

劉志強(qiáng),益小蘇

(浙江大學(xué)高分子科學(xué)與工程系,浙江杭州310027)

1.3 原淀粉的去脂處理

(1)將210 g丙三醇或正丁醇與去離子水配成醇濃度為70%或85%的處理液,倒入500 mL的三頸燒瓶中.加入16 g淀粉,配成固含量約5%的淀粉懸浮液.(2)將燒瓶放入超級恒溫水槽中,通氮?dú)獗Ｗo(hù),攪拌溶液.控制水浴溫度,使其在1~1.5 h中由

30℃上升至89℃.在89℃保持1 h后將燒瓶撤離水浴.(3)待燒瓶中的溶液冷卻至25℃,將其分成兩份,分別倒入500 mL的三頸燒瓶中,各加入300mL無水乙醇,攪拌1 h.(4)攪拌結(jié)束后,將懸浮液抽濾,用無水乙醇沖洗沉淀約3~4次,得到不含處理液的去脂淀粉.1.4 分散法分級

(1)將二甲基亞砜(DMSO)400 mL和去離子水100 mL倒入1 000 mL的燒杯,配成分散溶液.然后加入50 g淀粉,室溫下攪拌若干小時(shí)(4,8,18 h),溶液呈乳液狀.(2)將乳液倒入1 000 mL燒瓶中,在某一溫度(60,80,100℃)的恒溫水浴中攪拌加熱30 min,然后加入100 mL的正丁醇,同時(shí)不停地?cái)嚢? min.(3)將溶液撤離水浴,冷卻至室溫,溶液中有細(xì)針狀沉淀出現(xiàn).用高速沉淀機(jī)分離沉淀(2 000r/min,30 min).(4)取出沉淀于500 mL燒瓶中,加入200 mL的1% NaCl溶液,在80℃的恒溫水浴中加熱30min,此時(shí)沉淀完全溶解.緩慢滴加100 mL正丁醇于熱溶液中,同時(shí)用玻棒攪拌.(5)滴加結(jié)束后,將燒瓶撤離水浴,靜止冷卻至室溫.用高速沉淀機(jī)分離出沉淀(2 000 r/min, 30 min).(6)根據(jù)需要重復(fù)(4),(5)步,增加重結(jié)晶次數(shù).(7)取出沉淀置于培養(yǎng)皿,在70℃真空烘箱中干燥至恒重,得到直鏈級分.1.5 水浸法分級

(1)取8 g淀粉,350 mL去離子水倒入500 mL的三頸燒瓶中,配成濃度約為2%的淀粉懸浮液,用pH為6.3的磷酸緩沖液調(diào)節(jié)懸浮液的pH值為6.3.(2)將該懸浮液放入某一溫度(70,80,90,98℃)的恒溫水浴中,攪拌,通氮?dú)獗Ｗo(hù).(3)保持15 min后,立即把溶液轉(zhuǎn)移至薄壁塑料杯,放入冰鹽浴中進(jìn)行快速冷卻.(4)把已冷卻的懸浮液用離心沉淀機(jī)離心30 min,轉(zhuǎn)速為2 000 r/min.(5)抽取上層清液,將其在60℃水浴中加熱10 min后,緩慢滴加200 mL正丁醇,同時(shí)不停地?cái)嚢?直至白色細(xì)針狀沉淀生成.(6)用離心沉淀機(jī)分離沉淀(2000 r/min,10 min).(7)取出沉淀放入培養(yǎng)皿中,在70℃真空烘箱中干燥至恒重,得到完全干燥的直鏈級分.【玉米淀粉】

直鏈淀粉提純方法的研究

無錫輕工大學(xué)食品學(xué)院(214036)

楊光丁霄霖

2·3·3堿液分散法

先加少量無水乙醇將淀粉充分濕潤,加入0·5MNaOH溶液,沸水浴10~30min,用2NHCl溶液中和至pH7·5左右,加入丁醇-異戊醇(1∶1, v/ v),沸水浴10~30min,冷卻至室溫后,于4℃下靜置至少12h,離心(1000r/min)20min,得到沉淀物,加適量丁醇飽和水溶液,沸水浴15~30min,不斷攪拌,使沉淀物完全溶解,于4~25℃下靜置3~12h,離心(1000r/min)20min,得到沉淀;如此循環(huán)3次以上,然后分別用78%乙醇洗滌3次,用95%乙醇洗滌3次,用無水乙醇洗滌3次,于40℃下真空干燥,即得直鏈淀粉純品。

3·結(jié)果與分析

3·1堿液分散法

采用堿液分散法時(shí),加入丁醇后,靜置2~6h,即形成大量的沉淀,用普通離心機(jī)進(jìn)行離心,可以將沉淀很好地分離。但是,應(yīng)注意靜置的溫度不宜過低,否則,容易導(dǎo)致直鏈淀粉的老化。老化后的直鏈淀粉不溶于水,甚至加熱至沸騰也不溶解,給以后的使用帶來麻煩。直鏈淀粉老化主要是由直鏈淀粉結(jié)晶造成的,因此,隨著純化次數(shù)的增加,飽和丁醇水溶液的添加量也應(yīng)該相應(yīng)有所增加,使淀粉濃度適當(dāng)稀釋,盡量避免發(fā)生淀粉老化。

葛根直鏈淀粉和支鏈淀粉分離純化的研究

杜先鋒 許時(shí)嬰 王 璋

(無錫輕工大學(xué)食品學(xué)院,無錫,214036)

1.3.2 淀粉組分的分離和純化

取10g葛根淀粉,先以少量的無水乙醇潤濕,再加200ml 0.5mol/L NaOH溶液,在熱水浴中加熱分散至整個(gè)淀粉糊完全透明,冷至室溫,離心(6000r/min,20min)除

去不溶性雜質(zhì)。淀粉糊以2mol/L HCl調(diào)至中性,再加90ml正丁醇-異戊醇(3∶1,V∶V)溶液,在沸水浴中加熱攪拌至整個(gè)體系透明,冷卻至室溫,置于7℃冰箱中過夜,離心(6000r/min, 20min),沉淀物和上清液分別處理如下:

(1)沉淀物加120ml飽和的正丁醇水溶液,在沸水浴中加熱攪拌至溶液分散透明,冷至室溫,在7℃冰箱中過夜,離心(6000r/min,20min),所得的沉淀物按上述步驟重復(fù)操作5~10次(即重結(jié)晶5~10次),然后將沉淀物浸于無水乙醇中24h,再反復(fù)以無水乙醇洗滌沉淀,該沉淀物于室溫下真空干燥,得到純化的直鏈淀粉樣品。無水乙醇洗滌沉淀的目的是除去直鏈淀粉中所絡(luò)合的正丁醇。

(2)上清液中加入10ml正丁醇于沸水浴中加熱攪拌至溶液分散透明,冷至室溫,在7℃冰箱中過夜,離心(6000r/min,20min),重復(fù)上述操作2~3次。上清液經(jīng)真空濃縮后,加冷的無水乙醇進(jìn)行沉淀,再以無水乙醇洗滌沉淀物數(shù)次,室溫下真空干燥得到純化的支鏈淀粉樣品。

馬鈴薯直鏈淀粉與支鏈淀粉的分離方法

吉宏武丁霄霖

A無錫輕工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院

2.3淀粉的分散

稱取10g干淀粉分散于100ml,水中，然后慢慢地倒入1.3L0.15mol/LNaOH中，并輕輕攪拌均勻，靜置5min后加360ml5%NaCl溶液，用HCl中和至pH為6.5-7.5，在室溫下放置15-20h，分為兩層，將上清液吸出，經(jīng)兩次過濾，即為直鏈淀粉粗提液，下層膠體為支鏈淀粉粗提液。

2.4直鏈淀粉的純化

直鏈淀粉粗提液，按10:1體積比加入重蒸的正丁醇，在常溫下攪拌1h，靜置3h后，將部分沉淀物離心(3500r/min,20min)，沉淀物再用正丁醇攪拌飽和1h、靜置、離心，重復(fù)四次后，將沉淀物轉(zhuǎn)至無水乙醇中浸泡24h，再用乙醇洗滌幾次，在室溫下真空干燥，即為直鏈淀粉。

2.5支鏈淀粉的純化

支鏈淀粉粗提液經(jīng)離心后(30min,20°C,7000r/min)，棄去上清液，沉淀物加入適量的1%NaCl,并輕輕攪動(dòng)，放置15h左右，待其分層后，棄去上清液，部分沉淀物離心(30min,20°C,7000r/min)，棄去上清液，沉淀物再加入適量的1%NaCl,并輕輕攪動(dòng)，靜置、離心，重復(fù)四次后，將沉淀物轉(zhuǎn)至無水乙醇中放置一夜，再用無水乙醇洗滌3-5次，室溫下真空干燥，即為支錠淀粉純品。

[玉米淀粉]

直鏈淀粉和支鏈淀粉純品的提取及其鑒定

（江南大學(xué)食品學(xué)院，無錫）

洪雁顧正彪劉曉欣

1.2.1直鏈淀粉和支鏈淀粉的分離與純化

1.2.1.1直鏈淀粉與支鏈淀粉的粗分離

稱取10g玉米淀粉，加入少量無水乙醇分散并濕潤樣品，再加入350ml 0.5mol/L的氫氧化鈉，在沸水浴中攪拌10min，使溶液清澈透明，無結(jié)團(tuán)狀，冷卻后冷凍，高速離心（8000r/min）10min，用2mol/L的鹽酸中和至中性，加入100mL3:1丁醇(異戊醇的混合液，在沸水浴中加熱攪拌10min后，冷卻至室溫，于2-4°C的冰箱中靜置24h，取出，冷凍，高速離心（8000r/min）10min，得到的沉淀物為粗直鏈淀粉，離心液為粗支鏈淀粉。

1.2.1.2直鏈淀粉的純化

將粗直鏈淀粉沉淀全部移入丁醇飽和的200ml水中，加熱溶解至溶液透明，冷卻至室溫后放入2-4°C的冰箱中靜置24h，取出，冷凍，高速離心（8000r/min）20min，得沉淀物，再純化數(shù)次后，將沉淀物在砂芯漏斗中過濾，用無水乙醇洗滌數(shù)次，樣品在40°C的鼓風(fēng)干燥箱中干燥8h，即得純直鏈淀粉。

1.2.1.3支鏈淀粉的純化

將粗支鏈淀粉離心液在分液漏斗中靜置數(shù)分鐘后，分成三層，取下層乳膠體溶液，加40ml1:1丁醇(異戊醇的混合液，于沸水浴中加熱攪拌10min，冷卻后放入2-4°C的冰箱中靜置48h后，冷凍，高速離心（8000r/min）10min，離心液中緩緩加入二倍體積的無水乙醇，在2-4°C的冰箱內(nèi)靜置24h，將沉淀物溶于熱的0.5mol/L氫氧化鈉溶液，依上述方法純化數(shù)次，用無水乙醇脫水洗滌，樣品在40°C的鼓風(fēng)干燥箱中干燥8h，即得純支鏈淀粉。

第四篇：多糖的提取純化及分析鑒定方法研究

多糖的提取純化及分析鑒定方法研究

王霄

(合肥工業(yè)大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院，安徽 合肥230009)

摘要：詳細(xì)介紹了動(dòng)植物多糖的常見提取純化方法的最新研究進(jìn)展，并比較了各種方法的優(yōu)缺點(diǎn)。每種方法都有各自的優(yōu)缺點(diǎn)，在提取時(shí)應(yīng)根據(jù)所選材料的性質(zhì)選用不同的方法，有些方法在一定的條件下可與別的方法協(xié)同作用，并對糖的含量測定及分析鑒定方法的研究進(jìn)展作了概述。

關(guān)鍵詞：多糖；提取；純化；分析鑒定；研究進(jìn)展 中圖分類號：TU 411.01文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

Progress of Polysaccharides Extraction, Purification and Identification Methods

WANG Xiao

(School of Biological and Food Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)

Abstract: This paper reviews the extraction, purification and identification methods of animal and plantpolysaccharides, and compares the advantages and disadvantages of each mothed.Each mothed has its own advantages and disadvantages, appropriate mothed should be selected according to the nature of the chosen material, and some of these methods can be synergy with other methods under certain conditions.In addition, analysis and identification of polysaccharides are outlined.Key words: polysaccharides;extraction;purification;analysis and identification;research progress

菌來源的糖綴合物具有廣泛的藥理及生物活性

0多糖概述

多糖（polysaccharide）是由糖苷鍵結(jié)合的糖鏈，至少要超過10個(gè)以上的單糖組成的聚合糖高分子碳水化合物。由相同的單糖組成的多糖稱為多糖，如淀粉、纖維素和糖原；以沒的單糖組成的多糖稱為雜多糖，如阿拉伯膠是由戊糖和半乳糖等組成。多糖不是一種純粹的化學(xué)物質(zhì)，而是聚合程度不同的物質(zhì)的混合物。多糖類一般不溶于水，無甜味，不能形成結(jié)晶，無還原性和變旋現(xiàn)象。多糖也是糖苷，所以可以水解，在水解過程中，往往產(chǎn)生一系列的中間產(chǎn)物，最終完全水解得到單糖。

近年來，國際上對糖及糖復(fù)合物的研究己成熱點(diǎn)，糖類結(jié)構(gòu)測定和生物活性研究取得了明顯的進(jìn)展。大量實(shí)驗(yàn)事實(shí)揭示糖類是重要信息分子，參與許多生理和病理過程

[1-2]

[3]。

在對各種中藥材化學(xué)成分研究的過程中，人

們逐步提高了對植物多糖的關(guān)注。植物多糖研究比較深入的是茶多糖、菜籽多糖、南瓜多糖、苦瓜多糖、銀杏葉多糖、枸杞多糖等等，植物多糖在抗生素替代物及保健品領(lǐng)域已經(jīng)取得很好的應(yīng)用。多糖作為重要的生物活性物質(zhì)具有調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、降低糖脂、延緩衰老等活性，在醫(yī)療保健、食品、動(dòng)物養(yǎng)殖等領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景

[4-7]。

1多糖的提取工藝

1.1 水提醇沉法

水提醇沉法是提取多糖最常用的一種方法。多糖是極性大分子化合物，提取時(shí)應(yīng)選擇水、醇等極性強(qiáng)的溶劑。用水作溶劑來提取多糖時(shí)，可以用熱水浸煮提取，也可以用冷水浸提滲濾，然后將提取液濃縮后，在濃縮液中加乙醇，使其最

。到目前為止。己有

300余種多糖類化合物從天然產(chǎn)物中被分離出來，其中從中草藥、食藥用菌中提取的水溶性多糖最為重要。已發(fā)現(xiàn)有100多種中草藥、食藥用

終體積分?jǐn)?shù)達(dá)到70 %左右，利用多糖不溶于乙醇的性質(zhì)，使多糖從提取液中沉淀出來，室溫靜置5 h，多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)和得率均較高。影響多糖提取率的因素有：提取溫度、浸提料液比、提取時(shí)間以及提取次數(shù)等。為此，研究者對影響多糖提取工藝的這些因素進(jìn)行了大量研究。林娟[8]

等研究表明水提法提取甘薯多糖的優(yōu)化工藝條件為：提取溫度85℃，加水比1：7，提取時(shí)間2.5h，提取率為26．71％。劉永[9]

等研究表明：最佳提取條件為95℃，料液比1：20(g：mL)，提取時(shí)間2h，提取3次，茶葉多糖含量為35.92 mg/g。

水提醇沉法提取多糖不需特殊設(shè)備，生產(chǎn)工藝成本低，安全，適合工業(yè)化大生產(chǎn)，是一種可取的提取方法。但由于水的極性大，容易把蛋白質(zhì)、苷類等水溶性的成分浸提出來，從而使提取液存放時(shí)腐敗變質(zhì)，為后續(xù)的分離帶來困難，且該法提取比較耗時(shí)，提取率也不高[10]。

1.2酶法提取

酶技術(shù)是近年來廣泛應(yīng)用到有效成份提取中的一項(xiàng)生物技術(shù)，使用酶可降低提取條件，在比較溫和的條件下分解植物組織，加速有效成分的釋放或提取。此外，使用酶還可分解提取液中淀粉、果膠、蛋白質(zhì)等非目的產(chǎn)物。此法可使后續(xù)的濃縮和脫蛋白工藝更簡易、省時(shí)，粗多糖的純度更高。但會(huì)提高生產(chǎn)成本，對提取條件要求較高。楊云

[11]

等人采用的單酶法和復(fù)合酶法提取大棗多糖，單酶法提取多糖含量最高可達(dá)44.69％，而復(fù)合酶法多糖最高含量可達(dá)68.13％。1.3超聲波提取

超聲法是利用超聲波對細(xì)胞組織的破碎作用來提高多糖浸出率的，具有快速、安全、簡便、成本低、多糖提取率高，成分又不被破壞等優(yōu)點(diǎn)，但對提取設(shè)備要求較高。李進(jìn)偉

[12]

等通過響應(yīng)面

分析法考察超聲波功率、提取時(shí)間、提取溫度、料液比對棗多糖得率與純度的影響，得出棗多糖最佳的提取工藝條件為：超聲波功率86～96W，提取溫度45～53℃，提取時(shí)間20min，料液比1:20（g:ml），棗多糖得率7.63%，純度35.57%。與傳統(tǒng)的水浴浸提法相比，該方法不僅縮短了提取時(shí)間，且提高了棗多糖得率與純度。1.4微波提取

微波萃取是高頻電磁波穿透萃取媒質(zhì)，到達(dá)被萃取物料的內(nèi)部，能迅速轉(zhuǎn)化為熱能使細(xì)胞內(nèi)部溫度快速上升，細(xì)胞內(nèi)部壓力超過細(xì)胞壁承受力，細(xì)胞破裂，細(xì)胞內(nèi)有效成分流出，在較低的溫度下溶解于萃取媒質(zhì)，通過進(jìn)一步過濾和分離，獲得萃取物料。趙怡紅

[13]

等研究表明北冬蟲夏草

多糖微波提取最佳條件：微波功率550W、固液比l：30、提取時(shí)間30s、提取1次，多糖收率3.67％。劉青梅

[14]

等研究結(jié)果表明:對于紫菜多糖

提取微波提取優(yōu)于熱水提取,微波凍融提取效果最佳,提取率最高達(dá)7.45%,而熱水提取率為2.05%.影響微波浸提的主要因素為浸提時(shí)間,其次是微波功率和液固質(zhì)量比。優(yōu)選方案為微波功率200W、提取時(shí)間8 min、水與紫菜液固質(zhì)量比40:1。

1.5超臨界流體提取

超臨界流體提取法根據(jù)某些氣體在超臨界狀態(tài)下具有特殊的液相性質(zhì)，對一些組分有較好的溶解性，用來提取目的產(chǎn)物。一般采用CO2超臨界萃取多糖組分。朱俊玲

[15]

通過超臨界CO2流體

萃取處理蘆薈多糖，多糖得率為85.1％，是傳統(tǒng)方法的1.5倍。超臨界萃取的最佳工藝條件是乙醇用量為250 ml/100g蘆薈、萃取壓力為25 MPa、萃取溫度為35℃。1.6超濾法

超濾是一種膜分離技術(shù)。該技術(shù)應(yīng)用于多糖的提取，具有不損害活性、分離效率高、能耗低、設(shè)備簡單、可連續(xù)生產(chǎn)、無污染等優(yōu)點(diǎn)[16]。

1.7酸提法

有些多糖適合用稀酸提取，并且能夠得到更高的提取率。如趙宇等

[17]

對海蒿子多糖的提取方

法研究發(fā)現(xiàn)，從多糖提取得率來看，酸提法優(yōu)于傳統(tǒng)的水提法。不過此方法只在一些特定的植物多糖提取中占優(yōu)勢，目前報(bào)道的并不多。不過在操作上還是應(yīng)該嚴(yán)格控制酸度，因?yàn)樵谒嵝詶l件下可能引起多糖中糖苷鍵的斷裂。1.8堿提法

與酸提法類似，有些多糖在堿液中有更高的提取率，尤其是含有糖醛酸的多糖及酸性多糖。不過，也應(yīng)控制堿的濃度，因?yàn)橛行┒嗵窃趬A性較強(qiáng)時(shí)也會(huì)發(fā)生水解。

2多糖純化方法

2.1除蛋白

根據(jù)蛋白質(zhì)在氯仿等有機(jī)溶劑中變性的特點(diǎn)，用V（氯仿）∶V（戊醇或正丁醇）為5∶1 或4∶1，混合物劇烈振搖20～30 min，蛋白質(zhì)變性生成凝膠，離心分離，分去水層和溶劑層交界處的變性蛋白質(zhì)。此種只能除去少量蛋白質(zhì)，效

率不高，須反復(fù)多次，多糖有損失。但此方法比較溫和，在避免多糖降解上效果較好，如配合加入一些蛋白質(zhì)水解酶，用Sevage 法效果更佳。李婉婷

[18]

研究結(jié)果表明木瓜蛋白酶-Sevage法除

去款冬花多糖中的蛋白最為理想，該法的最佳工藝條件為：木瓜蛋白酶的酶底比為l％，pH值7.0，先在50℃水浴中酶解2h，再經(jīng)Sevage法脫蛋白3次，其蛋白脫除率為88.95％，多糖保留率為92.63％。2.2透析法

透析法是利用一定孔目的膜，使無機(jī)鹽或小分子糖透過，而將大分子的多糖截留下來從而達(dá)到純化多糖的目的。此法的關(guān)鍵是要選擇孔目合適的透析膜。纖維膜孔徑為2～3nm，可使單糖分子通過，分離效果較好，透析時(shí)常需要多次換水，溶液的pH值維持在6.0～6.5范圍內(nèi)。2.3凝膠柱層析法

凝膠柱層析法主要是根據(jù)多糖分子的大小和形狀不同而達(dá)到分離目的。但溶液流經(jīng)多孔性凝膠柱時(shí)，小分子已擴(kuò)散人孔中，各溶質(zhì)依分子量大小順序依次流出。此方法快速、簡單、條件溫和。常用的凝膠有葡聚糖凝膠(Sephadex)和瓊脂糖凝膠(Sephamse)，以不同濃度的鹽溶液和緩沖溶液作為洗脫劑。此法還可進(jìn)行多糖相對分子量的測定。王赫

[19]

采用Sephadex G-100凝膠色譜柱

分離純化，從龍膽水溶性多糖中分離純化得到2 種不同的均一多糖組分TP-

1、TP-2。2.4纖維素住層析法

纖維素陰離子交換劑柱層析對多糖的分離是利用pH 6時(shí)，酸性多糖能吸附于交換劑上，中性多糖不吸附，用pH相同離子強(qiáng)度不同的緩沖液將酸性強(qiáng)弱不同的酸性多糖分別洗脫出來。常用的陰離子交換纖維素有DEAE-纖維素和ECTEOLA纖維素。張?zhí)m杰

[20]

等就采用DEAE-纖維素柱分離

北五味子多糖，分別得到了白色結(jié)晶和黃色粉末兩種多糖產(chǎn)物。

3多糖的分析

3.1含量的測定

測定方法：硫酸-苯酚法、硫酸-蒽酮法、比色定量法、分光光度法、紙色譜法、離子交換色譜法、yaphe [21]

法、薄層色譜法、酶法、原子吸

收法

[22]、HPLC法、凝膠電泳法、親和電泳法連、續(xù)流動(dòng)分析法檢測法

[23]、次亞碘酸鹽定量法、蒽

酮-硫酸法（總糖）、DNS法

[24]

（還原法）、磷鉬

比色法、鄰鉀苯胺比色法等。每種方法只對某些多糖的測量效果好。比色法分光光度法離子交換色譜法酶法和電泳法等可同時(shí)用于多糖的定性定量分析。3.2純度鑒定

多糖是高分子化合物，其純品微觀上是不均一的，通常所說的多糖純品實(shí)質(zhì)上是一定分子量范圍的均一組分。多糖純度鑒定的常用方法：超離心、高壓電泳、凝膠層析、HPLC法等?，F(xiàn)在應(yīng)用較多的是HPLC法，旋光度測定[25]

也是純度

測定的一種方法。3.3分子量的測定

多糖分子量的測定是研究多糖性質(zhì)的一項(xiàng)重要工作常用方法：滲透壓法、蒸氣壓滲透劑法、端基法、粘度法、光散射法、凝膠色譜法、超過率法、沉淀法、凝膠電泳法、HPLC法、超離心分析法、分子篩色譜法、GPC法

[26]。

4多糖的鑒定

4.1 多糖一級結(jié)構(gòu)測定

多糖的一級結(jié)構(gòu)分析，主要是分析組成多糖的單糖類型、數(shù)目連接方式及苷建構(gòu)型。常用化學(xué)法和儀器分析法。多糖組分與分子比例測定法：部分酸解法、完全酶解法、色譜法；吡喃、呋喃環(huán)形式結(jié)構(gòu)的分析：紅外光譜；連接次序：選擇性光譜法、糖苷鍵順序水解、核磁共振； α-β-異頭異構(gòu)體：糖苷酶水解核磁共振；羥基被取代情況：甲基化反應(yīng)、氣相色譜、過碘酸氧化、Smith降解法和測硫酸基法（terho法）、核磁共振、質(zhì)譜法；糖鏈、肽鏈連接方式：單糖與氨基酸組成、稀堿水解法、肼解反應(yīng)；多糖結(jié)構(gòu)的分析方法很多，迄今沒有一種方法可以單獨(dú)完成多糖結(jié)構(gòu)的分析。儀器分析與化學(xué)方法相結(jié)合是常用的多糖結(jié)構(gòu)測定方法。4.2多糖高級結(jié)構(gòu)測定

目前研究多糖的二級結(jié)構(gòu)常用的手段是NMR技術(shù)，如2D-NMR，13C譜，通用的方法是將現(xiàn)代NMR技術(shù)與理論計(jì)算相結(jié)合通過一定的理論計(jì)算篩選構(gòu)象，主要的理論計(jì)算方法有從頭計(jì)算、豐度經(jīng)驗(yàn)計(jì)算及經(jīng)驗(yàn)力場計(jì)算

[27]

。圓二色

譜法（CD）也可用于糖的構(gòu)象分析,張麗萍等

[28]

應(yīng)用譜測定了金頂側(cè)耳多鍺的水溶液構(gòu)象近年來，以精確三維結(jié)構(gòu)知識為基礎(chǔ)揭示重要生命活

動(dòng)的規(guī)律已達(dá)到前所未有的深度和廣度[29]，多糖

作為一類重要的生物活性大分子其結(jié)構(gòu)的研究勢

必推動(dòng)對多糖的認(rèn)識向深層次發(fā)展。多糖的應(yīng)用展望

我國對多糖的研究起步較晚，但近年來的工作取得了較大的進(jìn)展，愈來愈多的多糖被發(fā)現(xiàn)并證實(shí)它們具有復(fù)雜廣泛的生物活性和功能。隨著對多糖生物活性的深入研究，多糖的生物活性機(jī)理，功效因子會(huì)更加明確，它的應(yīng)用領(lǐng)域也將會(huì)更加拓寬。然而，由于多糖本身結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，種類繁多，其結(jié)構(gòu)測定和分離純化有很大的難度；有些多糖在天然植物中的含量低且不易分離及多糖的藥理作用與諸多因素有關(guān)，給多糖的研究和應(yīng)用帶來許多的挑戰(zhàn)，這需要相關(guān)行業(yè)的人士共同應(yīng)對。

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644-651.

第五篇：銷售方法總結(jié)

無敵生意成交5步法：

一、破除舊的觀念，制造不滿意。先向用戶表明當(dāng)前的現(xiàn)狀是有問題的，但這個(gè)問題錯(cuò)不在于你，錯(cuò)在自己缺少某個(gè)東西，或是有個(gè)“第三者”在破壞你。比如賣鍋，先表明現(xiàn)在市面上的鍋在做菜時(shí)是有問題的，經(jīng)常容易糊鍋底，很難弄干凈。但這個(gè)問題不是你的錯(cuò)，不是因?yàn)槟阕霾思夹g(shù)不高明，而是因?yàn)槟闳鄙僖粋€(gè)永遠(yuǎn)不會(huì)糊鍋底的鍋，如果有了這樣一個(gè)鍋，你就永遠(yuǎn)不會(huì)做出糊鍋底的菜來。做生意的第一步，先找出當(dāng)前的毛病問題，找出能夠令人們不滿意的因素，告訴人們?yōu)槭裁床荒苡卯?dāng)前的產(chǎn)品。

二、為什么要選擇本行或本產(chǎn)品的類型。向人們表明在所有這類商品中只有我們的產(chǎn)品才是最棒最適合的，其他同行業(yè)中各種類型的產(chǎn)品都不是最佳選擇。比如人們想買飲品，飲料的種類有很多種，有礦泉水、茶飲料、果汁飲料、可樂飲料、咖啡飲料等等，向人們說明為什么自己的產(chǎn)品類型才是最適合人們使用的，從而幫人們確認(rèn)定位產(chǎn)品，覺得確實(shí)只有我們的產(chǎn)品才是最適合他們的。

三、說明自己品牌的優(yōu)勢，進(jìn)行價(jià)值分析。說明自己的產(chǎn)品結(jié)果好、速度快、很簡單、無風(fēng)險(xiǎn)。比如減肥產(chǎn)品的宣傳，三天減七斤（速度快），只要貼在肚臍上就可以輕松減肥，無需運(yùn)動(dòng)，睡一晚上等于運(yùn)動(dòng)八千里（很簡單），一個(gè)月最少減三十斤（結(jié)果好），絕對不反彈（無風(fēng)險(xiǎn)）。說明自己產(chǎn)品的獨(dú)特優(yōu)勢，從而增強(qiáng)人們的信心。

四、報(bào)價(jià)。先報(bào)高價(jià)，為后面的成交做掩護(hù)。舉出優(yōu)點(diǎn)，證明高價(jià)的合理性。比如三個(gè)月就可以回本，投資后很快就能收回成本，所以其實(shí)并不是很貴。最后突然降價(jià)，瞬間激發(fā)成交行動(dòng)。比如說現(xiàn)在購買，六折優(yōu)惠，到今天晚上十點(diǎn)之前就恢復(fù)原價(jià)，現(xiàn)在購買非常實(shí)惠，名額有限，先到先得等等。

五、行動(dòng)呼吁。講出你的聯(lián)系方法、購買方式、支付方法，說明你的售后服務(wù)、贈(zèng)品優(yōu)惠等措施，呼吁人們進(jìn)行購買，這樣就可以了。

這個(gè)生意成交5步法，就是熱銷的商家經(jīng)常采用的方法，通過這5個(gè)步驟，自己的產(chǎn)品都會(huì)成為熱銷的產(chǎn)品。

終端銷售5步法

第一步：打招呼。做推銷的銷售人員要接近顧客首先必須要做的當(dāng)然是向顧客打招呼。打招呼時(shí)要注意三點(diǎn)，熱忱、目光、笑容。第一點(diǎn)熱忱，不知大家注意過沒有，在主動(dòng)與別人打招呼時(shí)絕對會(huì)出現(xiàn)的情況就是打招呼的人熱情對方就跟著熱情，冷漠的給別人打招呼就會(huì)的 得到冷漠的回應(yīng)，所以我們在給顧客打招呼時(shí)一定要熱忱為先。你的熱忱會(huì)影響顧客的心情。終端銷售技巧第二個(gè)要點(diǎn)目光，用專注的目光盯住對方的眼 睛，這會(huì)給顧客一定的震撼作用會(huì)讓顧客心對你產(chǎn)生親近，有人覺得這樣做好像不太禮貌特別是男銷售員面對女顧客時(shí)，我只能告訴你，你這種想是大錯(cuò)特錯(cuò)。這樣說的道理其實(shí)很 簡單，一個(gè)人熱情的對你打招呼而且你發(fā)現(xiàn)他的眼睛有神的盯著你好像在說話，你的心理活動(dòng)會(huì)是什么樣的呢？一是覺得好奇，這個(gè)人怎么這樣看著我。二是有一絲 緊張又有點(diǎn)害怕（這點(diǎn)緊張害怕就會(huì)讓別人能在幾分鐘之內(nèi)控制你的思維），產(chǎn)生緊迫感，緊迫感使你緊張方亂，不知所措，此時(shí)你就可能接受他的安排了。三是覺 得興奮并開始對這個(gè)人產(chǎn)生好感（這也是美女一般很容易被大膽的人短時(shí)間追到手的原因）。而呆滯、散亂的目光只會(huì)給你帶來相反的效果。在此我不多說只要你隨 便找個(gè)人試驗(yàn)一下就明白了。第三點(diǎn)一定要有真誠的笑容，真誠的笑容會(huì)拉近你與顧客之間的距離，會(huì)將因目光給對方造成的那一絲緊張和害怕變成對你的尊重與心 理依靠。

終端銷售技巧第二步：介紹自己。不管是對陌生顧客還是對打過交道的顧客你都不要忘在打招呼后介紹自己來強(qiáng)化顧客 的記憶系統(tǒng)。介紹自己時(shí)也要注意三點(diǎn)，簡單、清楚、自信。一是要簡單，簡單的介紹不 但可以讓顧客一下子了解你也會(huì)為你下面的銷售工作留下足夠時(shí)間，還有就是簡單的就是顧客最容易記的，一個(gè)顧客記住了你，他 就可能給你介紹來更多顧客，也有利于建立與顧客今后的交易。二是要清楚，為什么要清楚我想不講大家都明白。三是自信，自信是最重要的，自信不但能影響你自 己還能控制顧客。

終端銷售技巧第三步：介紹產(chǎn)品。介紹產(chǎn)品時(shí)

1、把產(chǎn)品放到顧客手上，讓顧客參與進(jìn)來體驗(yàn)產(chǎn)品，這會(huì)讓他覺得產(chǎn)品 已經(jīng)是他的了，然后突然從顧客手拿回產(chǎn)品讓顧客產(chǎn)生失落感。善于利用失落感：適當(dāng)?shù)慕o對方失落感，會(huì)使對方失落和不甘心，從而使你的銷售活動(dòng)更順利。

2、介紹產(chǎn)品要簡潔，明了。盡量用顧客聽得懂語言介紹產(chǎn)品，最好不用讓顧客聽不明白的專業(yè)術(shù)語。

3、炒起價(jià)格要求火爆、真誠，用眼 睛注視顧客了解對方的心理活動(dòng)。炒價(jià)格就比較產(chǎn)品做活動(dòng)與平時(shí)的價(jià)格差，沒做活動(dòng)的產(chǎn)品就和同類比較貴的產(chǎn)品來比較，如果自己的產(chǎn)品是行業(yè)里最貴的就炒產(chǎn) 品的價(jià)值與價(jià)格之間的差，總之是讓顧客有賺錢的成就感就行。

終端銷售技巧第四步：成交。

一、成交時(shí)動(dòng)作要求專業(yè)化和恰到好處，專業(yè)化會(huì)讓對方覺得他的購買決定是對的。

二、提出顧客想了解的問題，并快速解答處理問題，不要讓顧客自己有過多的思考機(jī)會(huì)，要不然太多的異問不但會(huì)讓你手忙腳亂打破銷售進(jìn)程還會(huì)讓顧客疑慮越 來越多使你無法控制，動(dòng)搖顧客購買的決心。

三、要多用假設(shè)——假設(shè)成交、假設(shè)使用、舉例等。讓顧客感覺產(chǎn)品已經(jīng)是他的了。

終端銷售技巧第五步：再成交。乘勝追擊，抓住對方的購買動(dòng)機(jī)，再次刺激其購買欲望。善于利用擁有感：擁有感會(huì)使 對方無限滿足，從而忘記他的付出。做到這一點(diǎn)就可以堅(jiān)定顧客的信念不會(huì)后悔購買你的產(chǎn)品。

只要大家按上面的步驟將自己所銷售產(chǎn)品的過程進(jìn)行分解，進(jìn)行反復(fù)練習(xí)我相信就能做好一個(gè)終端營銷員。剛做銷售人員大都心情緊張，對顧客十分畏懼，此時(shí) 的唯一銷售法寶就是要多練習(xí)，忽略銷售對象，背誦銷售五步，背得流利樹立了自己的信心就可能實(shí)現(xiàn)銷售。

當(dāng)你了解了銷售五步后就要有自我表現(xiàn)欲，懂得利用對方心理和終端銷售技巧后就要開始使用自己的主觀思維制造氣氛，使對方在自己的安排下實(shí)現(xiàn)銷售目的。有非常強(qiáng)的自我表現(xiàn)能力的人，要了解對方的欲望。使對方在自己的強(qiáng)烈感染下實(shí)行銷售。

最后將銷售五步練習(xí)成自己的本能，跳出銷售做銷售。做這點(diǎn)你就不但可以成為優(yōu)秀的終端營銷員，你已經(jīng)可以勝任任何營銷職務(wù)了。