第一篇：食用菌實驗-培養(yǎng)基制作

實驗二

母種培養(yǎng)基制作

一、實驗?zāi)康恼莆招泵嬖嚬芘囵B(yǎng)基的配制、消毒與滅菌等制作過程，為菌種轉(zhuǎn)管、組織分離制作母種打下基礎(chǔ)。

二、常用培養(yǎng)基配方

1．馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)

去皮馬鈴薯200克，葡萄糖20克，瓊脂20克，水1000毫升，pH自然。2.PDA綜合培養(yǎng)基

去皮馬鈴薯200克，葡萄糖20克，瓊脂20克，磷酸二氫鉀3.0克，硫酸鎂1.5克，維生素B10.05克，水1000毫升，pH自然。

三、實驗材料和用具

天平、電爐，18×180毫米試管，止水夾。紗布，棉塞，牛皮紙，皮筋，手套、菜板、刀、恒溫箱，三角漏斗、支架（每組一套）。手提式高壓滅菌鍋。馬鈴薯、葡萄糖、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、瓊脂等。

四、實驗步驟與方法 1．PDA培養(yǎng)基的配制 2．裝管、捆把 3．滅菌

鍋內(nèi)加適量水→ 滅菌物品放內(nèi)鍋→

加熱 → 壓力表0.05Pa 時放氣 →壓力表1.15Pa(121-126℃)時計時30分鐘。

4.擺斜面。滅菌后將試管取出斜放在一根1厘米左右厚的木板條上，使試管內(nèi)斜面的長度為試管長度的3／5。放置凝固后備用。

五、作業(yè)思考題

1．制作PDA培養(yǎng)基過程中，為什么要用牛皮紙將整捆的棉塞部分封蓋滅菌? 2．滅菌時，加熱水沸后，在鍋內(nèi)壓力升至0.5Pa 時，為什么要打開放氣閥? 3．寫出試管培養(yǎng)基制作的工藝流程。4．消毒與滅菌是同一概念嗎?為什么?

實驗三

原種培養(yǎng)基制作

原種即二級種，就是將試管中的母種，接入菌種瓶內(nèi)，等菌絲長滿后形成的菌種。

一、實驗?zāi)康?/p>

通過實驗初步掌握原種培養(yǎng)基的配料、裝瓶(袋)、滅菌、消毒、接種、培養(yǎng)等生產(chǎn)工藝流程。并了解原種培養(yǎng)基的不同配方及不同的制作方法。

二、實驗材料和用具 天平，立式或臥式高壓滅菌鍋，菌種瓶或菌種袋(菌種瓶口徑3厘米，容積750毫升)，塑料套環(huán)，塑料繩，擦布，錐形搗木。稱，大盆

麥粒，麥麩，棉籽殼，不銹鋼鍋，石膏，碳酸鈣，白糖，牛皮紙，皮筋，三、培養(yǎng)基配方

1．木屑米糠培養(yǎng)基(適用于香菇、木耳、猴頭菇、楊樹菇等木腐生類食用菌)：木屑(鋸木屑)78千克，米糠或麥麩20千克，石膏1千克，蔗糖(俗稱白糖)1千克。料水比為1：1．4～1．6，使含水量達(dá)到60%，即用手握抓材料時指縫現(xiàn)水而不滴水。

2．麥粒培養(yǎng)基(適用于平菇、草菇、猴頭、金針菇等)： 麥粒200千克，蔗糖2千克，碳酸鈣2千克，水500升。

3．棉籽殼培養(yǎng)基(適于多種食用菌)：

棉籽殼78%，麥麩10%，玉米粉10%，過磷酸鈣1%，白糖l%，水料比約1:1.1-1.2。

四、實驗步驟與方法 1．培養(yǎng)基的配制

1)木屑米糠培養(yǎng)基的配制：

拌料：根據(jù)計劃生產(chǎn)原種的數(shù)量，計算出各種原料的用量，分別稱取后，將不溶性輔料和主料摻拌均勻，將可溶性輔料加入水中溶解，逐漸潑入拌好的主料中，摻拌均勻，繼續(xù)加水拌料。拌料時，邊加水，邊測含水量，以便控制水分，不至過多或不足。含水量的測定：拌好料后，用手抓一把培養(yǎng)料在手中緊握，手指縫中有水滲出但不下滴為適宜。料水比約為1:1.2-1.4 裝瓶（袋）：將培養(yǎng)料裝入750毫升的菌種瓶(或500毫升罐頭瓶)中，邊裝邊搗實(但不宜過緊，太緊則透氣性差，菌絲生長不良)，以手按結(jié)實有彈性為宜，一直裝到菌種瓶的瓶肩處。

打孔：培養(yǎng)料裝好后，用錐形木棒從瓶中央向下打一個洞，洞深離瓶底部2～3厘米，這樣一是可以增加瓶內(nèi)氧氣；二是有助于菌絲沿著洞穴向下蔓延；三是便于固定菌種塊，不致游動而影響成活，有利于瓶下部菌絲生長良好。

擦瓶：打洞后，用濕毛巾或濕布多次將瓶口和瓶外粘附的培養(yǎng)料擦凈，擦干，以免接種后污染

包扎：塞上棉塞，用牛皮紙將瓶口及棉塞包住，用繩扎緊。也可在瓶口上先放一層牛皮紙，再蓋一層聚丙烯塑料薄膜，扎緊瓶口。2)棉籽殼培養(yǎng)基的配制：

棉籽殼原種培養(yǎng)基的配制方法同木屑培養(yǎng)基的相似，只是裝瓶時培養(yǎng)料的壓實要比木屑的緊，因棉籽殼顆粒較大，且能留有較多的空隙。3)麥粒培養(yǎng)基的配制：

浸料：將小麥粒用水浸4-8小時，煮沸20—30分鐘，煮沸的過程中就加入蔗糖。最后使麥粒熟而不開花。濾去水分(濾液可制母種培養(yǎng)基或栽培時拌料用)，攤在通風(fēng)處晾30—40分鐘，使麥粒表皮不濕為宜。

裝瓶：加入碳酸鈣，拌勻后裝瓶。裝瓶時要注意邊裝瓶邊將瓶輕輕地扣動，使瓶內(nèi)培養(yǎng)料松緊度上下一致，裝至粒面至瓶肩部。瓶口包扎同前。2．滅菌

包扎好的料瓶（袋）放入高壓滅菌鍋內(nèi)進(jìn)行滅菌。在1．5千克／平方厘米壓力下，滅菌2小時即可。如用土蒸鍋常壓滅菌，須將水燒開后繼續(xù)蒸10小時，緩慢降溫后取出使用。

六、作業(yè)思考題

1．原種培養(yǎng)基裝滿瓶后，為什么要用濕毛巾或濕布多次擦洗瓶外和瓶頸? 2．原種培養(yǎng)基裝好后，為什么要在當(dāng)天及時進(jìn)行滅菌? 3．原種培養(yǎng)基裝瓶后，用錐形搗木在其中內(nèi)插一個圓洞的目的是什么? 4．原種培養(yǎng)基裝滿瓶后，其瓶的上部培養(yǎng)料是松一些好，還是緊一些好?為什么? 5．培養(yǎng)料裝得過松過緊都將產(chǎn)生什么樣的結(jié)果?

第二篇：食用菌培養(yǎng)基原料及處理

食用菌培養(yǎng)基原料及處理

食用菌培養(yǎng)基原料及處理

一、培養(yǎng)基主料及處理

原則上凡不含有毒有害物質(zhì)和特殊異味的農(nóng)林副產(chǎn)品都可以作為食用菌栽培的培養(yǎng)料，一些富含木質(zhì)纖維素的野生材料也可作為培養(yǎng)料。農(nóng)副產(chǎn)品如稻草、麥秸、玉米芯、玉米秸、高粱秸、棉籽殼、廢棉、棉秸、豆秸、花生秸、花生殼、甘蔗渣、麥麩、稻糠、高粱殼、果園剪枝枝條、玉米皮、豆餅、花生餅、油菜餅、芝麻餅、棉仁餅等；林業(yè)副產(chǎn)品如樹枝、樹杈、樹墩、樹根、刨花、木屑等；野生材料如類蘆、象草、皇竹草等。另外，輕工業(yè)生產(chǎn)的副產(chǎn)品也可以作為食用菌栽培的培養(yǎng)料，如糠醛渣、酒糟、醋糟、廢紙漿等。

1、棉籽殼

棉籽殼成本較高，但棉籽殼栽培食用菌，明顯具有容易操作、發(fā)菌保險、產(chǎn)量穩(wěn)定等優(yōu)勢，相比而言，尤其對于初次栽培者來說，效益穩(wěn)定，讓人放心。

基本配方：棉籽殼250千克，過磷酸鈣5千克，尿素1千克，石膏粉3.5千克，食用菌三維營養(yǎng)精素120克（完成發(fā)酵后再加入并拌勻，下同）；4～9月份播種時，加入石灰粉5千克。

2、玉米芯

玉米芯由于該原料可作為木糖醇、糠醛等工業(yè)原料，故其近年來身價倍增，較之棉籽殼相差不大，其生物學(xué)效率也不相上下。其質(zhì)地疏松，粉碎后粒度較均勻、合適，富含糖分，非常適合菌類生產(chǎn)，用來生產(chǎn)常規(guī)菌類，其轉(zhuǎn)化率可達(dá)100%~150%。

玉米芯的營養(yǎng)很豐富，據(jù)測定，干玉米芯含粗脂肪0.7％，粗纖維28％，無氮浸出物58.4％，灰分2.0％，鈣0.1％，磷0.03％，是栽培平菇等食用菇的極好原料?；九浞剑?/p>

（1）玉米芯250千克，豆餅粉5千克，石灰粉5千克，石膏粉2千克，過磷酸鈣6千克，尿素1千克，菇病消5袋，食用菌三維營養(yǎng)精素120克。

（2）玉米芯250公斤、豆餅粉10公斤、石灰粉10公斤、石膏粉5公斤、過磷酸鈣10公斤、尿素2公斤、食用菌三維營養(yǎng)精素(拌料型)120克。

（3）玉米芯150公斤，豆秸粉100公斤，豆餅粉5公斤，石灰粉10公斤，石膏粉5公斤，過磷酸鈣10公斤，尿素1公斤，草木灰5公斤，食用菌三維營養(yǎng)精素120克。（4）選無霉的干玉米芯粉碎成小粒（比黃豆小），曬2天，然后在清水中浸泡一夜，撈出瀝干后分別加入1％的石膏粉、硫酸胺、過磷酸鈣和0.1％多菌靈（加入水中）拌勻，PH為5.4～7，含水量60％～70％（手握料指縫有水而不滴下）。（5）玉米芯粉100斤，石膏粉1斤，石灰3兩，含水量65％左右。

（6）玉米芯 78%、麩皮或米糠 20%、石膏粉 1%、蔗糖 1%，適于制作草菇、平菇、木耳、猴頭菇等木腐菌菌種。（7）玉米芯 80%、米糠 10%、玉米粉 8%、石膏粉 1%、復(fù)合肥1%(制原種改用0.2%磷酸二氫鉀)，適于制作平菇等菌種。

3、大豆秸稈

該原料含氮素物質(zhì)在所有秸稈類原料中是最高的。將其與玉米芯等混合使用，栽培效果十分理想。不足之處是質(zhì)地較硬，需經(jīng)粉碎之后使用為佳，其粉碎粒度控制于2~4mm，加大料水比至1:1.6~1.7，可使常規(guī)菌類轉(zhuǎn)化率達(dá)120~160%?；九浞绞牵河衩仔?00千克，豆秸150千克，石灰粉5千克，石膏粉2千克，過磷酸鈣6千克，菇病消5袋，食用菌三維營養(yǎng)精素120克。

4、花生殼

易于粉碎，含氮量高，不足之處是組織纖維化程度高，不利于菌絲分解利用，可加入30%的棉殼，并經(jīng)發(fā)酵處理，可取得與棉殼相仿的效果?；九浞剑?/p>

（1）花生殼 40%、玉米芯 38%、麩皮 20%、蔗糖 1%、石膏粉 1%，適于制金針菇菌種。

（2）花生殼 78%、米糠 20%、石膏粉 1%、蔗糖 1%，適于制作平菇、香菇、木耳、猴頭菇、靈芝等木腐菌菌種。

5、稻、麥秸

麥草、稻草類該類原料多用于栽培草菇、雙孢菇、姬松茸等品種，少有用于平菇、猴頭菇等生產(chǎn)的，這不是說完全不可取，而是說該材料起碼不是最佳選擇，尤其木腐菌中的香菇、猴頭、木耳等，發(fā)菌時間及出菇時間較長，作為草料，其成分多為纖維素，木質(zhì)素含量偏低，難以被菌絲長時間進(jìn)行分解而保持基本滿袋狀，故盡量用其生產(chǎn)草腐菌類。因其表層附生一層蠟質(zhì)層，不利于菌絲的吸收，可采用氧化鈣液浸泡的方式去除，用于側(cè)耳類，轉(zhuǎn)化率可達(dá)90%~100%；用于耳類生產(chǎn)，可達(dá)100%左右。

栽培雙孢菇配方：麥草或稻草3000千克，牛糞粉3000千克，過磷酸鈣60千克，尿素60千克，石灰粉80千克，石膏粉80千克，碳酸鈣90千克，食用菌三維營養(yǎng)精素（拌料型）1440克。

栽培草菇基本配方：麥草或稻草225千克，麥麩25千克，過磷酸鈣8千克，尿素1.5千克，石灰粉12千克，石膏粉4千克，菇病消5袋，食用菌三維營養(yǎng)精素120克。

6、棉稈屑

棉稈屑營養(yǎng)豐富，富含食用菌生長的各種營養(yǎng)成分，含粗蛋白5.6%、粗脂肪2.7%、粗纖維42.9%，再添加適量的營養(yǎng)配方，菌絲生長質(zhì)量、產(chǎn)量可與棉殼相媲美。用棉稈屑栽培平菇、香菇、金針菇、雞腿菇、木耳、銀耳、杏鮑菇、茶樹菇生物轉(zhuǎn)化率最低達(dá)120%，高達(dá)200%以上。粉碎后的棉稈屑，透氣性好，吸水性強(qiáng)。培養(yǎng)的菌絲潔白濃密粗壯，生長快而結(jié)實。

該原料與木屑類有點(diǎn)相似，并含有大量韌皮組織，十分有利于食用菌菌絲生長。絕大多數(shù)菇農(nóng)不愿使用它，是因為粉碎困難，普通粉碎機(jī)對其無可奈何，只有使用木片機(jī)械切碎，而后才能進(jìn)行打碎。

栽培平菇、雞腿菇配方：棉稈粉（0.5厘米以下）220千克，麥麩30千克，三元復(fù)合肥3千克，石灰粉10千克，石膏粉5千克，菇病消5袋，食用菌三維營養(yǎng)精素120克。用于栽培香菇時，可將其作為木屑對待進(jìn)行配方。但是，時下的棉花多為轉(zhuǎn)基因品種，所以，用棉稈粉栽培的產(chǎn)品，不可用于出口。

棉稈粉250公斤、豆餅粉10公斤、石灰粉12公斤、石膏粉5公斤、過磷酸鈣10公斤、尿素2.5公斤、食用菌三維營養(yǎng)精素(拌料型)120克。

7、泥炭

日本研究成功一種以２０％至３０％泥炭和含油脂的谷物（均以干物質(zhì)計）為主的混合培養(yǎng)基栽培食用菌的方法。在栽培前，把泥炭中的長纖維切斷、切碎，并加入可以有效地增加通氣量的大麥外皮、米糠、木屑混合物，然后裝瓶、滅菌、接種。配方合宜時每瓶平菇采收率達(dá)５５％，比單用木屑、米糖培養(yǎng)基栽培平菇采收率增加３０％。生長期可從５０天至５６天縮短到４０天。該培養(yǎng)基也適合栽培金針菇等食用菌。

8、麥殼

麥殼有兩種，一種是小麥殼，一種是燕麥殼。都是工廠的下腳料，麥殼里面有不低5%麥仁，燕麥殼有一層可溶性膳食纖維，碳氮比為20：1。營養(yǎng)高，所以不用添加麥麩或玉米粉?？梢杂脕碓耘嗥焦健⒉铇涔健⒔疳樄?、姬菇。以麥殼為主料培養(yǎng)料具有成本底、透氣性好、發(fā)菌快、產(chǎn)量高的特點(diǎn)。

以麥殼為主料栽培平菇配方：麥殼70%、木屑28%、生石灰1%、復(fù)合肥1%。發(fā)酵時間比棉籽殼為主料的要多一天。用甘蔗渣代替木屑效果更好。其他方面按以棉籽殼為主料栽培方法。

以麥殼為主料栽培茶樹菇配方：麥殼90%、茶籽粉8%、生石灰1%、復(fù)合肥1%。茶樹菇分解蛋白能力強(qiáng)，分解木質(zhì)素能力弱。所以不能用木屑。

9、油菜稈

油菜稈殼含粗蛋白3.14％、粗脂肪0.45％、粗灰分6.2％、氮1.5％、磷0.37％、鉀4.3％，是栽培食用菌的良好培養(yǎng)料。油菜稈殼培育食用菌時，事先應(yīng)仔細(xì)剔除發(fā)生霉變的部分，曝曬2～3天后，粉碎成綠豆大小，放冷水中浸泡12～24小時，天熱時間可短些，天冷時間稍長些，然后根據(jù)不同的食用菌品種。基本配方：

（1）草菇：油菜稈殼90％，石灰3％，草木灰5％，麥麩或米糠2％，含水適量。

（2）香菇：油菜稈殼78％、麥麩20％，石膏1％、糖1％、含水適量。

（3）平菇：①油菜稈殼98％、石膏1％、過磷酸鈣1％；②油菜稈殼與塘泥1∶1混合，另加入過磷酸鈣0.8％，磷酸二氫鉀0.1％；③油菜稈殼95.5％、石膏粉2％、過磷酸鈣2％、尿毒0.5％；④油菜稈殼91％、米糠5％、石膏2％、過磷酸鈣2％。

10、水葫蘆

水葫蘆粉碎渣栽培竹蓀、大球蓋菇等單核菌絲類食用菌，還可以種植出雙核菌絲類的銀耳。產(chǎn)量與現(xiàn)行用木屑、稻殼、刨花等為培養(yǎng)基的種植方式基本相同；但用水葫蘆粉碎渣作培養(yǎng)基因其易腐爛，生長期可提前約一個月。

11、野草

（1）幾種適宜栽培食用菌的野草

①蘆葦是一種多年生水生禾本科植物，植株高大，適應(yīng)性廣，耐澇。營養(yǎng)成份高于木屑。

②芒箕（別名雞腳茅）適應(yīng)性和生活能力強(qiáng)，耐旱，耐酸，自然資源豐富。其所含營養(yǎng)成份比雜木高，一年四季均可割。③五節(jié)芒（別名巴茅）屬禾本科高大野草，我國大部分地區(qū)均有分布，營養(yǎng)成份高于木屑，用來栽培食用菌應(yīng)在抽穗老化期采割。

（2）野草的采割加工

蘆葦，五節(jié)芝屬于禾本科植物，植株高大，不易干燥。應(yīng)在抽穗揚(yáng)花時采割，經(jīng)充分曬干后粉碎。芝箕慶在連續(xù)三至五個晴天后采割，曬干粉碎。粉碎野草宜選用２．２至２．８毫米孔徑的篩片，粉碎后的在原料需徹底干燥后防霉貯藏。（3）野草培養(yǎng)料配方

①五節(jié)芝、蔞芝箕４０％、麥麩１８％、白糖１％、石膏１％、多菌靈０．１％。

②蘆葦４５％、五節(jié)芝３８％、麥麩１５％、糖１％、石膏粉１％、多菌靈０．１％。

③蘆葦３０％、芝箕２５％、五節(jié)芝３０％、麥麩１５％、糖１％、碳酸鈣１％。

④五節(jié)芝５０％、芝箕２５％、麥麩１５％、玉米粉７％，碳酸鈣２％、尿素０．５％。

以上第一方和第二適宜栽培平菇、香菇、雞腿菇等，第三方和第四方適宜栽培木耳和金針菇。

12、松杉木屑

松、杉屑資源豐富，但因其含有烯萜類和芳香油類物質(zhì)，對菌絲有抑制作用。以下方法可解決這個問題。

（1）石灰水浸泡法：用2％～5％澄清石灰水浸泡松、杉木屑12～24小時。撈起后用清水沖洗至無混濁，瀝干水分，或曬干即可。

（2）水煮法：將松、杉木屑放入大鍋內(nèi)加1％～2％石灰水煮沸，不斷用木棒攪拌。2小時后，撈起，用清水沖洗干凈。（3）發(fā)酵法：將松、杉木屑拌入2％～3％石灰水，使含水量達(dá)65％，堆積發(fā)酵。當(dāng)料溫升至60℃以上時翻堆，以后每隔4～5天翻堆1次。共翻3～4次，歷時20多天。發(fā)酵好的料，沒有芳香氣味，手感柔軟，含水量達(dá)60％左右，拌料時基本不用加水。

以上方法處理過的松、杉木屑，摻入1/3闊葉木屑后栽培多種食用菌，效果更佳。

13、沼渣

沼渣180公斤、秸稈顆粒70公斤、石灰粉10公斤、石膏粉6公斤、三元復(fù)合肥1公斤、食用菌三維營養(yǎng)精素120克。

14、中藥渣 中藥渣130公斤、玉米芯100公斤、麥麩20公斤、石灰粉8公斤、石膏粉6公斤、尿素2.5公斤、過磷酸鈣5公斤、食用菌三維營養(yǎng)精素120克。

中藥渣120公斤，木屑100公斤，麥麩30公斤，石灰粉7公斤，石膏粉6公斤，尿素2.5公斤，過磷酸鈣5公斤，食用菌三維營養(yǎng)精素120克。

15、酒糟

酒糟(以干重計)200公斤、棉籽殼和木屑各25公斤、豆餅粉2公斤、過磷酸鈣5公斤、尿素1.5公斤、磷酸二氫鉀2公斤、石灰粉6公斤、石膏粉5公斤、食用菌三維營養(yǎng)精素120克。

16、糠醛渣

糠醛渣250公斤，豆餅粉10公斤，石灰膏20公斤，石膏粉5公斤，復(fù)合肥2公斤，賽百5袋，食用菌三維營養(yǎng)精素1袋。

糠醛渣100公斤，豆餅粉5公斤，熟石灰4公斤，石膏粉2公斤，復(fù)合肥2公斤。

17、甘蔗渣

甘蔗渣200公斤，棉子殼50公斤，豆餅粉3公斤，石灰粉3公斤，石膏粉2公斤，過磷酸鈣3公斤，尿素0.4公斤，磷酸二氫鉀1公斤。

木糖渣100公斤，豆餅粉5公斤，草木灰5公斤，熟石灰4公斤，石膏粉2公斤，過磷酸鈣3公斤，尿素1公斤。

19、幾點(diǎn)說明

第一，秸稈類原料，由于含碳量高、粉碎后顆粒偏細(xì)碎、吸水率高、通透性差，因此，生料栽培時易發(fā)燒，所以應(yīng)發(fā)酵處理或熟料栽培。

第二，凡是熟化過的原料，比如中藥渣、酒糟類原料，一般適合大場地晾曬處理，如果處理不及時，會很快發(fā)生雜菌，影響原料質(zhì)量，最好是做熟料栽培。

第三，沼渣類原料，質(zhì)量很不同，要根據(jù)沼氣發(fā)酵原料予以科學(xué)配方，比如，戶用型沼氣一般采用畜禽糞便及人糞尿等為發(fā)酵原料，該種沼氣池產(chǎn)出了沼渣，營養(yǎng)很豐富，用于栽培后的效果很理想；大型沼氣工程使用的原料如酒糟等，產(chǎn)出的沼渣營養(yǎng)較差，配料時應(yīng)予科學(xué)設(shè)計配方，合理調(diào)配輔料組分，否則，同為沼渣，生產(chǎn)效果會相差很大。

二、培養(yǎng)基常用輔料

食用菌培養(yǎng)基的組成除了棉子殼、秸稈、木屑等主料外，還要添加一些必需的輔料，約占培養(yǎng)基的5%—10%。其主要作用是：補(bǔ)足培養(yǎng)料中的營養(yǎng)成分，調(diào)節(jié)碳氮比例和酸堿度，改善培養(yǎng)基的理化性狀，促進(jìn)堆料中微生物的活動和繁殖，提高堆料發(fā)酵質(zhì)量等。

1、餅肥

是一類含氮量高、營養(yǎng)豐富的有機(jī)物質(zhì)。常用的有豆餅、菜子餅、棉子餅、花生餅等。是一種常用的富氮輔料，能促進(jìn)菌絲生長，增強(qiáng)長勢，提高產(chǎn)量。尤其是在以秸稈、木屑等為主料栽培食用菌時使用多。

2、麩皮與米糠

它以提供氮源為主，也含有能促進(jìn)菌絲蔓延所必須的大量維生素等營養(yǎng)物質(zhì)。陳舊的麩皮或米糠營養(yǎng)物質(zhì)大幅下降，并易孳生螨蟲，造成不良后果，因此要力求新鮮。

3、熟石灰

又叫消石灰、氫氧化鈣。其作用是：加快主料軟化；促進(jìn)主料分解；調(diào)節(jié)酸堿度；補(bǔ)充鈣元素；降解培養(yǎng)料中農(nóng)藥殘留；此外，石灰是常用的消毒劑、殺菌劑和防潮劑，被譽(yù)為蘑菇的“萬金油”。熟石灰吸收二氧化碳后，一部分變成輕質(zhì)碳酸鈣。熟石灰調(diào)節(jié)培養(yǎng)料酸度的能力比碳酸鈣強(qiáng)，比石膏速。熟石灰不能與銨態(tài)氮肥混用，也不能與水溶性磷肥混用。

4、石膏

又叫硫酸鈣，其作用是：使秸稈脫脂軟化；可直接補(bǔ)充培養(yǎng)基中硫、鈣的不足；能使氣態(tài)氮固定成化合態(tài)氮，利于游離在堆肥中氨氣的穩(wěn)定，減少氮素?fù)p失；加速培養(yǎng)料中基質(zhì)分解，促進(jìn)料中可溶性磷、鉀的釋放，供給菌絲吸收利用等。石膏屬中性弱酸鹽，雖不能快速轎正培養(yǎng)料的酸堿度，但具有緩沖作用，使培養(yǎng)料pH值不致發(fā)生大的變化。生產(chǎn)中其添加量一般為培養(yǎng)料干重的1%—2%。

5、糖

在培養(yǎng)料中添加糖分，主要是作培養(yǎng)初期碳源的補(bǔ)充，便于菌絲直接利用，并誘導(dǎo)纖維素酶的產(chǎn)生。生產(chǎn)上常用的糖有紅糖和白糖之分。紅糖較為經(jīng)濟(jì)，而且葡萄糖含量高出白糖10—20倍，并能滿足菌絲體在生長過程中對鐵、錳、鋅等微量元素的需求。但紅糖易結(jié)塊、反潮，在高溫高濕下酵母菌會在其上大量繁殖，易使培養(yǎng)料發(fā)酸。

6、尿素

是一種含氮素較高的速效性化學(xué)肥料。培養(yǎng)料中添加尿素是補(bǔ)充氮素不足，提高產(chǎn)量的措施之一。其用量一般為原料干重的0.3%以下。尿素添加量忌過高，否則不僅會殺傷菌絲，還會造成菇體生理失水，萎縮黃死。

7、過磷酸鈣

可彌補(bǔ)培養(yǎng)料中磷素、鈣素的不足，同時促進(jìn)微生物的分解活動，利于培養(yǎng)料的發(fā)酵腐熟。它是一種緩沖物質(zhì)，可使堆料中酸堿度不致變化過激，還具有改善培養(yǎng)料理化性狀的作用，磷本身又是子實體生長發(fā)育不可缺少的物質(zhì)，有促進(jìn)菌絲健壯生長的效果。其用量一般為1%。

8、碳酸鈣

蘑菇菌絲在含水較多的基質(zhì)中生長并不斷排出二氮化碳，而二氧化碳與碳酸鈣生成碳酸氫鈣，從而不斷為蘑菇提供鈣質(zhì)營養(yǎng)。其用量一般為培養(yǎng)料干重的1%—2%。

第三篇：食用菌栽培實驗

《食用菌栽培學(xué)》實驗一 斜面制作

一、實驗材料：馬鈴薯300g，瓊脂20g，二、實驗藥品：葡萄糖20g，三、實驗工具：水果刀、試管40支、漏斗

5、鐵架臺

5、止水夾

5、紗布三層、報紙若干、膠皮管

5、玻璃棒

1、鍋、電爐、天平、1000ML量筒、PH試紙、棉花塞（皮棉非脫脂棉）、皮筋或長繩若干、高壓鍋（手提式）、干凈毛巾、培養(yǎng)皿2個

《食用菌栽培學(xué)》實驗二 母種接種

一、實驗材料：實驗一制作出的無污染的試管斜面、食用菌專業(yè)母種（平菇）、二、實驗藥品：75%酒精棉球

三、實驗工具：鑷子

5、棉花若干、接種針（接種鋤）、酒精燈、火柴或火機(jī)、超凈工作臺、恒溫培養(yǎng)箱、冰箱 注：恒溫培養(yǎng)一周左右待菌絲體長滿斜面轉(zhuǎn)入冰箱冷藏室內(nèi)儲存

《食用菌栽培學(xué)》實驗三 食用菌菌絲體觀察

一、實驗材料：由實驗二轉(zhuǎn)管的母種

二、實驗工具：顯微鏡12臺、酒精燈、接種針、蒸餾水、載玻片

15、蓋玻片20 《食用菌栽培學(xué)》實驗四 食用菌栽培實驗（出菇實驗）一

一、實驗材料：玉米芯6.8KG、棉籽殼1KG、麩皮2KG、石膏粉0.1KG、碳酸鈣0.1KG

二、實驗工具：水桶、膠皮手套

12、聚丙烯袋（15CM*15CM）、繩子若干、高壓鍋、《食用菌栽培學(xué)》實驗四 食用菌栽培實驗（出菇實驗）二

一、實驗材料：由出菇實驗一所得高壓消毒的料袋、實驗二制作的母種、二、實驗工具：無菌室、酒精燈、75%酒精棉球、透氣的蓋子（食用菌專用若干），干凈的房子用作培養(yǎng)。定期進(jìn)行觀察，消過毒葡萄酒實驗室的框子4個

《食用菌栽培學(xué)》實驗四 食用菌栽培實驗（出菇實驗）三

待料袋菌絲長滿后一周左右打開袋口進(jìn)行澆水、觀察處菇情況

第四篇：實驗教案 培養(yǎng)基的制備

實驗一 培養(yǎng)基的制備

一目的要求 明確培養(yǎng)基的配制原理 通過對基礎(chǔ)培養(yǎng)基的配制，掌握配制培養(yǎng)基的一般方法和步驟 二 基本原理

不同培養(yǎng)基中含有不同的微生物生長所需要的營養(yǎng)物質(zhì)，其可供微生物生長繁殖用，為微生物提供C源、能源、N源和維生素。在配制固體培養(yǎng)基時還要加入一定量瓊脂作凝固劑。瓊脂在常用濃度下96度溶化，實際應(yīng)用時，一般在沸水中或下面墊以石棉網(wǎng)煮沸溶化，以免燒焦，瓊脂在40度時凝固，通常不被微生物分解利用，固體培養(yǎng)基中瓊脂含量根據(jù)瓊脂的質(zhì)量和氣溫的不同有所不同。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：

牛肉膏：3.0g,蛋白胨10.0g,NACl5.0g,水1000ml,pH 7.2-7.4.馬鈴薯培養(yǎng)基是霉菌的基本培養(yǎng)基，培養(yǎng)基配方如下： 馬鈴薯 100g 蔗糖 10g 瓊脂 10g 水500ml pH 自然 三器材：

1試劑或溶液：馬鈴薯、蔗糖、瓊脂、蒸餾水。

2儀器或其它用具：試管、三角瓶、燒杯、玻璃棒、天平、牛角勺，紗布、麻繩、牛皮紙、高壓滅菌鍋 四操作步驟 1稱量：

依次稱取馬鈴薯塊、蔗糖、，切碎的瓊脂放入三角瓶中并加入500ml蒸餾水 2 把三角瓶放入鍋中，鍋蓋好后放在電熱爐上加熱，等瓊脂溶解后取出三角瓶 3過濾：趁熱用多層紗布過濾，去除里面的雜質(zhì) 4分裝：將配制好的培養(yǎng)基分裝入試管。

5加塞：分裝完后在試管口塞上塞子，以阻止外界微生物進(jìn)入培養(yǎng)基造成污染，并保證有良好的勇氣性能。

6包扎：用牛皮紙再包扎瓶口，以防滅菌時弄濕棉塞。7滅菌：用高壓蒸汽鍋在0.1MP下滅菌20min 8擱置斜面：趁熱將試管里的培養(yǎng)基斜面，注意斜面的長度大約為試管長度的1/2 9無菌檢查 五：注意事項

1培養(yǎng)基配制后，必須立即滅菌

2分裝過程中，注意不要使培養(yǎng)基沾在管口上，以免沾在塞子上而引起污染

實驗二

革蘭氏染色法

一目的要求

1學(xué)習(xí)并初步掌握革蘭氏染色法

2了解革蘭氏染色法的原理及其在細(xì)菌分類鑒定中的重要性 二基本原理

革蘭氏染色法是1884年丹麥病理學(xué)家christain Gram 創(chuàng)立的而后作了些改進(jìn)，革蘭氏染色法是細(xì)菌學(xué)中最重要的鑒別染色法。革蘭氏染色法的基本步驟是：先用初染劑結(jié)晶紫進(jìn)行染色，再用碘液媒染，然后用乙醇脫色，最后用復(fù)染劑復(fù)染。經(jīng)此方法染色后，細(xì)胞保留初染劑藍(lán)紫色的細(xì)菌為革蘭氏陽性菌。如果細(xì)胞中初染劑被脫色劑洗脫而細(xì)菌染上復(fù)染劑的顏色，該菌屬于革蘭氏陰性菌。革蘭氏染色法將細(xì)菌分為革蘭氏陽性和革蘭氏陰性，是由這兩類細(xì)菌細(xì)菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和組成不同決定的。實際上，當(dāng)用結(jié)晶紫初染后，像簡單染色法一樣，所有細(xì)菌都被染成初染劑的藍(lán)紫色，碘作為媒染劑，它能結(jié)晶紫結(jié)合成結(jié)晶紫-碘復(fù)合物，從而增強(qiáng)了染料與細(xì)菌的結(jié)合力，當(dāng)用脫色劑處理時，兩類細(xì)菌的脫色效果是不同的，革蘭氏陽性細(xì)菌的細(xì)胞壁主要由肽聚糖形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)組成，壁厚、類脂含量低，用乙醇脫色時細(xì)胞壁脫水，使肽聚糖的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)孔徑縮水，透性降低，從而合結(jié)晶紫-碘復(fù)合物不易被洗脫，而保留在細(xì)胞內(nèi)，經(jīng)脫色和復(fù)染后仍保留初染劑 的藍(lán)紫色，革蘭氏陰性菌則不同，由于其細(xì)胞壁肽聚糖較薄、類脂含量高，所以當(dāng)脫色處理時，類脂質(zhì)被乙醇溶解，細(xì)胞壁透性增大，使結(jié)晶紫-碘復(fù)合物比較容易被洗脫出來，用復(fù)染劑復(fù)染后，細(xì)胞被染上復(fù)染劑的紅色。三器材

1菌種 大腸桿菌

2染色劑：革蘭氏染色液

（1）草酸銨結(jié)晶紫：A 液：結(jié)晶2g：95%乙醇20ml;

B 液：草酸銨0.8g;蒸餾水80ml;

混合AB兩液，靜置48h后使用（）(2)盧戈氏碘液

碘片1g;碘化鉀2g;蒸餾水30ml;(3)95%乙醇

（4）番紅復(fù)染液：番紅25g;95%乙醇 100ml 取上述配好的番紅乙醇溶液10ml和 80ml蒸餾水混勻即成。3儀器或其他用具

顯微鏡 酒精燈 載玻片 接種環(huán) 蒸餾水 四 操作步驟 1制片

（1）涂片：取載玻片，各滴一小滴蒸餾水于玻片中央，有接種環(huán)無菌操作挑取菌苔于水滴中，混合 并涂成薄膜。（2）干燥：室溫自然干燥

（3）固定：涂面朝上，通過2~3次 2 初染

滴加結(jié)晶紫染色1-2Min,水洗 3 媒染

用碘液沖去殘水，并用碘液覆蓋1min，水洗 用濾紙吸去玻片上的殘水，將玻片傾斜，在魄背景下，用滴管流加95的乙醇脫色，直到流出的乙醇無紫色時，立即水洗，脫色時間一般20-30min 5復(fù)染

用番紅復(fù)染2min,水洗。并用吸水紙吸干玻片上的殘水。6鏡檢

干燥后，用顯微鏡觀察。

菌體被當(dāng)成藍(lán)紫色的是革蘭氏陽性菌，被染成紅色的革蘭氏陰性菌。實驗三

酵母菌的形態(tài)觀察及死活細(xì)胞的的鑒別

一目的要求

1觀察酵母菌的形態(tài)及出芽生殖方式，學(xué)習(xí)區(qū)分酵母菌死活的實驗方法 2 掌握酵母菌的一般特征及其與細(xì)菌的區(qū)別 二基本原理

酵母菌是不運(yùn)動的單細(xì)胞真核微生物，共大小通常比常見細(xì)菌大幾倍甚至十幾倍，大多數(shù)酵母以出芽方式進(jìn)行無性繁殖，有的分裂繁殖有性繁殖通過接合產(chǎn)生子囊孢子，本實驗 通過美藍(lán)染水浸片來觀察酵母的形態(tài)和出芽生殖方式。美藍(lán)是一種無毒性的染料，它的氧化型呈現(xiàn)藍(lán)色，還原型無色。用美藍(lán)對酵母的活細(xì)胞進(jìn)行染色時，由于細(xì)胞的新陳代謝作用，細(xì)胞內(nèi)具有較強(qiáng)的還原能力，能使美藍(lán)由藍(lán)色的氧化型 變?yōu)闊o色的還原型，因此，具有還原能力的酵母活細(xì)胞是無色的，而死細(xì)胞或代謝微弱的衰老細(xì)胞則呈藍(lán)色或淡藍(lán)色，借此即可對酵母菌的死細(xì)胞和活細(xì)胞進(jìn)行鑒別。三器材

1菌種：釀酒酵母培養(yǎng)約2天的純培養(yǎng)物 2溶液或試劑：呂氏堿性美藍(lán)染色液

3儀器或其他用具：顯微鏡，載玻片 蓋玻片 四操作步驟

1美藍(lán)浸片的觀察

（1）在載玻片中央加一滴呂氏堿性美藍(lán)染色液，然后按無菌操作用接中環(huán)挑取水量酵母菌放在染液中，混合均勻。

（2）用鑷子取一塊蓋玻片，先將一邊與菌液接觸，然后慢慢將蓋玻片放下，使其不著邊際在菌液上

（3）將制片放置約3分鐘，鏡檢。先用低倍鏡，然后用高倍鏡觀察酵母的形態(tài)，和出芽情況。并根據(jù)顏色區(qū)別死活細(xì)胞。

（4）染色約0.5小時后再次進(jìn)行觀察，注意死細(xì)胞的數(shù)量是否增加。2 水—碘液浸片的觀察

在載玻片中央加一小滴革蘭氏染液用碘液，然后在其上加3小滴水，取少許酵母菌苔放在水—碘液中混勻，蓋上蓋玻片后鏡檢。五實驗結(jié)果

觀察的酵母菌的形成特征：

實驗四 霉菌的形態(tài)觀察

一實驗?zāi)康?/p>

1學(xué)習(xí)并掌握觀察霉菌的形態(tài)的基本方法 2了解甲類常見霉菌的基本形態(tài)特征。二實驗原理

霉菌可產(chǎn)生復(fù)雜的分枝的菌絲體，分基內(nèi)菌絲和氣生菌絲，氣生菌絲生長 到一寂階段分化產(chǎn)生繁殖菌絲，由繁殖菌絲產(chǎn)生孢子。霉菌菌絲體及孢子的形態(tài)特征是識別不同種類霉菌的重要依據(jù)。霉菌菌絲和孢子的寬度通常比細(xì)菌和放線菌粗得多。常是細(xì)菌菌體的幾倍到幾十倍，因此，用低倍顯微鏡即可觀察。觀察霉菌的形態(tài)有多種方法，常用的有下列三種：直接制片觀察法、載玻片培養(yǎng)觀察法，玻璃紙培養(yǎng)觀察法。三實驗器材

1菌種：黃典霉 青霉 產(chǎn)黃青霉 黑根霉 2溶液與試劑：呂氏美藍(lán)染色液 蒸餾水

3儀器或其他用具：顯微鏡 載玻片 蓋玻片 接種環(huán) 濾紙 四實驗步驟

1在載玻片中央加一滴呂氏堿性美藍(lán)染色液，然后按無菌操作用接種環(huán)挑取少量霉菌放在呂氏堿性美藍(lán)染色液中，混合均勻。

2用鑷子取一塊蓋玻片，先將一邊與菌液接觸，然后慢慢將蓋玻片放下使其蓋在菌液上。3將制片放置約3MIN后鏡檢，先用低倍鏡，后用高倍鏡，觀察霉菌的形態(tài)。五結(jié)果

六思考：霉菌的孢子有哪些形態(tài)。

實驗五

微生物的分離純化

一目的要求

掌握倒平板的方法和幾種常用的分離純化微生物的基本操作技術(shù) 二基本原理

從混雜的微生物群體中獲得只含一種工某一株微生物的過程為微生物的分離與純化。常用的方法有：

1簡易單細(xì)胞挑取法

它需要特制的顯微鏡操縱器或其它顯微技術(shù)，因而其使用受到限制。簡易單孢子分離法是一種不需要顯微單孢操縱器，直接在普通顯微鏡下利用低倍鏡分離單孢子的方法，它采用很細(xì)的毛細(xì)管吸取較稀的萌發(fā)的孢子懸液滴在培養(yǎng)皿蓋的內(nèi)壁上，在低倍鏡下逐個檢查微滳，將只含有一個萌發(fā)孢子的微滴放在一小塊營養(yǎng)瓊脂片，使其發(fā)育成微菌落，再將微菌落轉(zhuǎn)移2到培養(yǎng)基中，即可獲得公由單個孢子發(fā)育而成的純培養(yǎng)。2平板分離法

該方法操作簡便，普遍用于微生物的分離與純化，其基本原理包括兩方面：

（1）選擇適合待分離微生物生長條件，如營養(yǎng)、酸堿度、溫度和氧等要求或加入某種抑制劑造成只利于該微生物生長，而抑制其它微生物生長的環(huán)境，從而淘汰一些不需要的微生物。（2）微生物在固體培養(yǎng)基上生長形成的單個菌落，可以是由一個細(xì)胞繁殖而成的集合體，因此可以通過挑取單菌落而獲得一種純培養(yǎng)，獲取單個菌落的方法，可通過稀釋涂布平板或平板劃線等技術(shù)完成。三器材

1菌種：米曲霉

2培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基 馬鈴薯培養(yǎng)基 3溶液或試劑：試管、三角瓶、瓊脂

4儀器或其他用具：無菌玻璃棒、無菌吸管、接種環(huán)、無菌培養(yǎng)基、樣品 四操作步驟平板劃線分離法

1倒平板：按稀釋涂布平板法倒平板，并用記號筆標(biāo)明培養(yǎng)基名稱，樣品編號和實驗日期。2劃線：在近火焰處左手拿皿底，右手拿接種環(huán)，挑取樣品懸液一環(huán)在平板上劃線。劃線的方法很多，但無論采用哪種方法，其目的都是通過劃線將樣品在平板上進(jìn)行稀釋，使之形成 單個菌落。常用的劃線方法有下列二種：

（1）用接種環(huán)以無菌操作挑取樣品懸液一環(huán)，先平板培養(yǎng)基的一邊作第一次平等劃線3~4條，再轉(zhuǎn)動培養(yǎng)基約70度角，并將接種環(huán)上的剩余燒掉，待冷卻后通過第一次劃線部分作第二次平行劃線，再用同樣的方法通過第二次劃線部分作第三次劃線 和第四次交平行劃線。劃線完畢后，蓋上培養(yǎng)皿，倒置于溫箱培養(yǎng)。

（2）挑取有樣品的接種環(huán)在平板培養(yǎng)基上作連續(xù)劃線。劃線完畢后，蓋上培養(yǎng)皿蓋，倒置下載培養(yǎng)箱中。

（3）挑菌落 同稀釋涂布平板法，一直到分離的微生物認(rèn)為純化為止。五思考題。

第五篇：微生物實驗室培養(yǎng)基制作個人總結(jié)

一．培養(yǎng)基的制備

儀器材料 微波爐、高壓滅菌器、玻璃器皿、三角瓶，PH試紙、牛肉膏、蛋白胨、瓊脂、氯化鈉、氫氧化鈉。操作方法

１． 肉湯培養(yǎng)基制作 ⑴成分

肉浸膏（0.3%牛肉膏）500ml 蛋白胨 5g 氯化鈉 2.5g 磷酸氫二鉀 0.5g ⑵準(zhǔn)備工作 配制調(diào)節(jié)PH用的0.1M氫氧化鈉和1M氫氧化鈉溶液。⑶操作

①稱取牛肉膏，放入玻璃皿中，另入適量蒸餾水配成0.3%。②按比例加入適量蛋白胨、氯化鈉、磷酸氫二鉀攪拌。③攪拌加熱至完全溶解。

④PH值調(diào)至7.8，煮沸10min，站足水分。

⑤待冷至40～50℃時，過濾。濾液分裝于無菌試管內(nèi)（達(dá)試管的1/3）或每管加4-5ml。塞好棉塞。

⑥置高壓滅菌器內(nèi)高壓滅菌（121.3℃，20分鐘即可）2．普通瓊脂培養(yǎng)基制作

⑴成分 肉湯培養(yǎng)基 500ml 瓊脂 8-15g ⑵制法

①先矯正肉湯培養(yǎng)基PH值。

②加入適量瓊脂煮沸溶解，矯正PH值至7.4～7.6。③滅菌后使雜質(zhì)沉淀。

④取其上清液滅菌后分裝。倒入無菌平皿內(nèi)凝固即成普通瓊脂平板。

二、平板劃線接種法 【方法】

1． 在平板底面上用記號筆作好標(biāo)記，如菌種、班級，姓名、接種日期等，并在平板底面邊緣作一原劃線標(biāo)記。

2．右手拿接種環(huán)，燒灼滅菌并冷卻后，取混合菌液少許。3．左手斜持（45°角）瓊脂平板，略開蓋，平板在乙醇燈火焰左前上方約5～6cm距離。右手持已取標(biāo)本的接種環(huán)在瓊脂平板表面之一側(cè)邊緣，作原劃線，見圖5-2A。

4．接種環(huán)燒灼滅菌，冷卻后自原劃線末端沾取少許標(biāo)本，使接種環(huán)與平板表面成30～40°角，運(yùn)用腕力將接種環(huán)在平板上來回劃線，見圖5-2B。劃線要密但不能重疊，充分利用平板的表面積，不要劃破瓊脂表面，并注意無菌技術(shù)，避免空氣中細(xì)菌的污染。也可用分區(qū)劃線法，即從原劃線末端沾取標(biāo)本后只劃平板的1/5～1/4，劃畢燒灼滅菌接種環(huán)，冷后同樣劃線，共計4～5次。接種環(huán)燒灼滅菌后方可放下（圖5-2C、D、E）。

三.細(xì)菌在培養(yǎng)基中生長特性的觀察 1.瓊脂培養(yǎng)基 ⑴大小

⑵形狀：圓形、不整形、針尖狀、露滴狀、同心圓狀、顆粒狀。⑶邊緣：整齊、波浪狀、鋸齒狀、卷發(fā)狀。

⑷表面性狀：光滑、粗糙、同心圓狀、放射狀、皺狀、顆粒狀。⑸濕潤度：濕潤、干燥。

⑹隆起度：表面隆起、輕度隆起、中央隆起、扣狀扁平。

⑺色澤及透明度：無色、白色、黃色、橙色、紅色；透明、半透明、不透明。⑻質(zhì)地：堅硬、柔軟、粘稠。

⑼溶血性：α型溶血 菌落周圍有透明溶血環(huán)。

β型溶血 半透明帶綠色溶血環(huán)。

γ型溶血 不溶血。

藥物敏感試驗

基本原理

細(xì)菌對抗菌藥物的敏感試驗，通常簡稱為細(xì)菌的藥敏試驗。在給患傳染病動物進(jìn)行治療時，測定細(xì)菌對藥物的敏感性，不僅有助于選擇合適的藥物，而且可為藥物的用量提供依據(jù)。某種細(xì)菌對藥物的敏感度，是指抑制該細(xì)菌生長所需的最低藥物濃度。細(xì)菌在體外的敏感度和臨床的療效大體是符合的，但也有不一致者。目前供藥敏試驗的方法很多，可歸納為兩大類，即稀釋法和擴(kuò)散法。有的以抑制細(xì)菌生長為評定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)，有的則以殺滅細(xì)菌為標(biāo)準(zhǔn)。一般可報告為某菌對某抗菌藥物敏感、輕度敏感或耐藥。

稀釋法是將抗菌藥物稀釋為不同的濃度，作用于被檢菌株，定量測定藥物對細(xì)菌的最低抑菌濃度(minimal inhibition concentration, MIC)或最低殺菌濃度(minimal bacteriocidal concentration, MBC)，可在液體培養(yǎng)基或固體培養(yǎng)基中進(jìn)行。

擴(kuò)散法（diffusion method）是將抗菌藥物置于已接種待測細(xì)菌的固體培養(yǎng)基上（或內(nèi)），抗菌藥物通過向培養(yǎng)基內(nèi)的擴(kuò)散，抑制敏感菌的生長，從而出現(xiàn)抑菌環(huán)（帶）。藥物擴(kuò)散的距離越遠(yuǎn)，達(dá)到該距離的藥物濃度就越低，故可根據(jù)抑菌環(huán)的大小，判斷細(xì)菌對藥物的敏感度。抑菌環(huán)（帶）邊緣的藥物含量即該藥物的敏感度。此法操作簡便，容易掌握，但只用于定性。因受紙片含藥量不均及接種量等多種因素影響，結(jié)果不夠準(zhǔn)確，因此試驗時應(yīng)同時設(shè)立已知敏感度的標(biāo)準(zhǔn)菌株作為對照。

器材準(zhǔn)備

1．菌種 大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、炭疽桿菌。

2．藥敏試紙 含青霉素、鏈霉素、慶大霉素、氯霉素、磺胺嘧啶等藥敏試紙，分裝于滅菌平皿中。

3．培養(yǎng)基 普通肉湯、普通瓊脂平板培養(yǎng)基。

4．其他 95％酒精、小鑷子、麥?zhǔn)媳葷峁堋?mL刻度吸管、橡皮膠頭等。

實驗步驟

1．試管雙倍稀釋法

（1）抗生素原液的配制及保存：將抗生素制劑無菌操作溶于適宜的溶劑如蒸餾水、磷酸鹽緩沖液中，稀釋至所需濃度。抗生素的最初稀釋劑通常用蒸餾水，但是有些抗生素必須用其它溶劑作初步溶解。常用抗生素原液的溶劑和最初稀釋劑見表6-1。若制劑中可能含有雜菌，配制后宜用細(xì)菌濾器過濾除菌（可用玻璃濾器或微孔濾膜，孔徑0.22?m，但不可用纖維墊濾器）。分裝小瓶，在－20℃冷凍狀態(tài)下保存，可保存3個月或更久，每次取出一瓶保存于4℃冰箱，可用1周左右。

（2）培養(yǎng)基：一般采用普通肉湯培養(yǎng)基。如細(xì)菌生長緩慢，可加入0.25％～1％葡萄糖或5％～10％血清。

（3）方法：被測菌種懸液的制備：將較多量的菌種移種于肉湯培養(yǎng)管中，置37℃溫箱中培養(yǎng)6h（生長緩慢者可培養(yǎng)過夜），使生長濁度達(dá)9×108個/mL（相當(dāng)于麥?zhǔn)媳葷峁艿?管）。

抗生素溶液的雙倍連續(xù)稀釋：取13×100mm滅菌帶棉塞試管13支（管數(shù)多少可依具體需要而定）。另將上述菌液作1︰10 000倍稀釋（生長緩慢的細(xì)菌可稀釋1︰1 000或更少），除第1管加入稀釋菌液1.8mL外，其余各管均各加1.0mL。繼于第1管加入抗生素原液0.2mL，混合后吸出1.0mL加入第2管中，用同法依次稀釋至第12管，棄去1.0mL。第13管為生長對照。

表6-1 抗生素原液的溶劑和稀釋劑

抗生素

丁胺卡那霉素 氯芐青霉素 桿菌肽 羧芐青霉素 頭孢羥唑 頭孢唑林 頭孢甲氧霉素 頭孢菌素I 氯霉素 氯潔霉素 多粘菌素B或E 紅霉素

溶劑 蒸餾水

0.1mol/L PBS（pH值8.0）

蒸餾水 蒸餾水 蒸餾水 蒸餾水 蒸餾水

0.1mol/L PBS（pH值8.0）

甲醇 蒸餾水 蒸餾水 甲醇

稀釋劑 蒸餾水

0.1mol/L PBS（pH值8.0）

蒸餾水 蒸餾水 蒸餾水 蒸餾水 蒸餾水 蒸餾水 蒸餾水 蒸餾水 蒸餾水

0.1mol/L PBS（pH值8.0）慶大霉素 卡那霉素

新青霉素I、II、III 青霉素G 萘啶酸 鏈霉素 四環(huán)素 妥布霉素 萬古霉素

蒸餾水 蒸餾水 蒸餾水 蒸餾水 0.1mol/L NaOH

蒸餾水 蒸餾水 蒸餾水 蒸餾水

蒸餾水 蒸餾水 蒸餾水 蒸餾水 蒸餾水 蒸餾水 蒸餾水 蒸餾水 蒸餾水

培養(yǎng)及結(jié)果觀察：置37℃培養(yǎng)16～24h，觀察結(jié)果。凡藥物最高稀釋管中無細(xì)菌生長者，該管的濃度即為MIC。

MBC的測定：從無細(xì)菌生長的各管取材，分別劃線接種于瓊脂平板培養(yǎng)基，于37℃培養(yǎng)過夜（或48h），觀察結(jié)果。瓊脂平板上無細(xì)菌生長而含抗生素最少的一管，即為MBC。也可將上述各管在37℃繼續(xù)培養(yǎng)48h，無細(xì)菌生長的最低濃度即相當(dāng)于該抗生素的MBC。

結(jié)果報告：一般以MIC作為細(xì)菌對藥物的敏感度，如第1～8管無細(xì)菌生長，第9管開始有細(xì)菌生長，則把第8管抗生素的濃度報告為該菌對這種抗生素的敏感度；如全部試管均有細(xì)菌生長，則報告該菌對這種抗生素的敏感度大小為第1管中的濃度或?qū)υ撍幠退?；如除對照管外，全部都不生長時，則報告為細(xì)菌對該抗生素的敏感度等于或小于第12管的濃度，或高度敏感。

2．?dāng)U散法（K-B法）

（1）含藥濾紙片的制備：含有各種抗菌藥物的濾紙片是擴(kuò)散法中應(yīng)用最多的。目前，我國生產(chǎn)含藥濾紙片的單位不多，購買較為困難，即使購買也易過期失效，所以一般可應(yīng)用自制的藥敏濾紙片。其方法如下：

濾紙片：選用新華1號定性濾紙，用打孔機(jī)打成直徑為6mm的小圓片，根據(jù)需要將數(shù)片包成一紙包或放入帶棉塞的小瓶或小平皿內(nèi)，121℃滅菌15min，置100℃干燥箱內(nèi)烘干備用。

藥液的配制：常用藥物的配制方法及所用濃度見表6-2。

表6-2 藥敏紙片的制備及含藥濃度

藥 物 青霉素 劑 量 注射用粉劑

制備方法

20mg加pH值6.0 PB緩沖液15.5mL，取1mL加PB緩沖液9mL

20mg加pH值6.0 PB緩沖液20mL 20mg加pH值7.8 PB緩沖液 8mL 以pH值7.8 PB緩沖液作100倍稀釋 以pH值6.0 PB緩沖液稀釋 20mg加水20mL溶解

藥液濃度（?g/mL）

200 1 000 2 500 2 500 1 000 1 000

紙片含量（?g）10 25 25 10 10 新青霉素 注射用粉劑

注射用粉劑

鏈霉素

注射用針劑 注射用針劑

氯霉素

口服粉劑 土霉素 口服粉劑或片劑

25mg粉末，加2.5mol/L HCl 15mL 溶解后，以pH值6.0 PB緩沖液或水稀釋 000 1 000 1 000 1 000 1 000 1 000 1 500 3 000 3 000 1 000 3 000 1 000 1 000 1 000 1 000 10 000 10 000 1 000 10 000 10 000 10 000 125 10 10 10 10 10 10 30 30 10 300 10 10 10 10 100 100 100 100 100 100 1.25 四環(huán)素 口服粉(片)

同土霉素

劑

注射用粉劑 口服片劑

以生理鹽水稀釋 同土霉素

以pH值3.0 PB緩沖液溶解后以pH值6.0 PB緩沖液稀釋

以pH值8.2 PB緩沖液溶解后稀釋 以水溶解，以pH值7.8 PB緩沖液稀釋 同紅霉素

以pH值7.8 PB緩沖液稀釋 以pH值7.8 PB緩沖液稀釋 以pH值7.2 PB緩沖液稀釋 以pH值7.8 PB緩沖液稀釋

以1mol/L NaOH 1mL溶解1片，用pH6.0 PB緩沖液稀釋 以1mol/L NaOH 1mL溶解1片，用pH6.0 PB緩沖液稀釋

以二甲基酰胺或丙酮溶解 以水稀釋

以水或pH值8.2 PB緩沖液稀釋 100mg加2.5mol/L HCl 1.25mL，加水至5mL，以pH值6.0 PB緩沖液稀釋 100mg加水1mL，濃HCl 0.7mL溶解，以pH8.2 PB緩沖液稀釋

100mg加水2mL，濃HCl 0.5mL溶解，以pH8.2 PB緩沖液稀釋

100mg加濃HCl 1mL，溶解后以pH6.0 PB緩沖液稀釋

1片研碎后加水2mL，濃HCl 0.25mL，以pH值6.0及7.8 PB緩沖液稀釋 金霉素

口服粉劑

新霉素 紅霉素 口服片劑 注射用粉劑 注射用粉劑

卡那霉素

注射用針劑

慶大霉素 注射用針劑 多粘菌素 注射用粉劑 萬古霉素 注射用粉劑 呋喃妥因 粉劑或片劑 呋喃西林 粉劑或片劑 痢特靈 磺胺嘧啶片劑

粉劑或針劑

鈉

磺胺二甲基針劑

嘧啶

長效磺胺 片劑 周效磺胺 片劑 磺胺甲基異惡唑

磺胺5-甲氧嘧啶

磺胺增效劑

片劑 片劑 片劑

含藥紙片的制備：將滅菌濾紙片用無菌鑷子攤布于滅菌平皿中，以每張濾紙片飽和吸水量為0.01mL計，每50張濾紙片加入藥液0.5mL，不時翻動濾紙片，使濾紙片將藥液均勻吸凈，一般浸泡30min即可。然后取出含藥紙片置于一紗布袋中，以真空抽氣使之干燥?；蛑苯訉V紙片攤于37℃溫箱中烘干，烘烤的時間不宜過長，以免某些抗生素失效。對青霉素、金霉素等紙片的干燥宜用低溫真空干燥法。干燥后，立即裝入無菌的小瓶中加塞，置于干燥器內(nèi)保存，也可將紙片貯藏于－20℃或家用冰箱冰凍。少量供工作用的紙片從冰箱中取出后應(yīng)在室溫中放置1h，使紙片溫度和室溫平行，防止冷的紙片遇熱產(chǎn)生凝結(jié)水。

藥敏紙片的鑒定：取制好的紙片3張，以標(biāo)準(zhǔn)敏感菌株測其抑菌環(huán)，大小符合標(biāo)準(zhǔn)者則為合格。紙片的有效期一般為4～6個月。

（2）操作方法：K-B法是用含有一定量抗生素的藥敏紙片，貼在已接種試驗細(xì)菌的瓊脂平板上，經(jīng)37℃培養(yǎng)后，抗生素濃度梯度通過紙片上彌散作用而形成，在敏感抗生素的有效范圍內(nèi)，細(xì)菌的生長受到抑制，在有效范圍外，細(xì)菌能夠生長，故能形成一個明顯的抑菌環(huán)。以抑菌環(huán)的大小來判定試驗菌對某一抗生素是否敏感及敏感程度。

用接種環(huán)挑取菌落4～5個，接種于肉湯培養(yǎng)基中，置37℃培養(yǎng)4～6h。

菌液稀釋：用滅菌生理鹽水稀釋培養(yǎng)液使?jié)岫认喈?dāng)于硫酸鋇標(biāo)準(zhǔn)管（配制方法：1.175％氯化鋇0.5mL、1％硫酸溶液99.5mL，充分混勻，將此溶液置于與肉湯培養(yǎng)基相同的試管中，用前充分振搖）。

用無菌棉拭子蘸取上述肉湯培養(yǎng)液，在管壁上擠壓，除去多余的液體，用棉拭子涂滿瓊脂表面，蓋好平皿，在室溫下干燥5min，待平板表面稍干即可放置含藥紙片。

用滅菌鑷子以無菌操作取出含藥紙片貼在涂有細(xì)菌的平板培養(yǎng)基表面。一個直徑9cm的平皿最多只能貼7張紙片，6張紙片均勻地貼在離平皿邊緣15mm處，一張位于中心。貼紙片時要輕輕按壓，以保證與培養(yǎng)基密切接觸。將平皿放37℃恒溫箱，培養(yǎng)16～18h，觀察結(jié)果（如圖6-1）。結(jié)果判定：觀察含藥紙片周圍有無抑菌環(huán)，量取其直徑（包括紙片直徑）大小，用毫米數(shù)記錄，按抑菌環(huán)直徑的大小報告敏感、中度敏感和耐藥，具體標(biāo)準(zhǔn)見表6-3。

表6-3 抗菌藥物的抑菌環(huán)與敏感標(biāo)準(zhǔn)

抗菌藥物 丁胺卡那霉素 腸桿菌、腸球菌 葡萄球菌和青霉素敏感細(xì)菌 嗜血桿菌 桿菌肽 腸桿菌科 綠膿桿菌 先鋒霉素I 氯霉素 氯林可霉素 粘菌素

復(fù)方甲氧異惡唑 紅霉素 每片含藥量(?g)

耐藥 10 10 10 10 100 100 30 30 2 10 25 15

≤11 ≤11 ≤10 ≤19 ≤8 ≤17 ≤13 ≤14 ≤12 ≤14 ≤8 ≤10 ≤13

抑菌環(huán)的直徑（mm）

中等敏感 12～13 12～13 12～23

9～12 18～22 14～16 15～17 13～17 15～16 9～10 11～15 14～17

敏感 ≥14 ≥14 ≥24 ≥20 ≥13 ≥23 ≥17 ≥18 ≥18 ≥17 ≥11 ≥16 ≥18 慶大霉素 卡那霉素 甲氧苯青霉素 萘啶酸 新霉素 呋喃妥因 苯唑青霉素 青霉素G 葡萄球菌 其他細(xì)菌 30 5 30 30 300 1 10 10 300 10 300 300 10 30 2

≤12 ≤13 ≤9 ≤13 ≤12 ≤14 ≤10 ≤20 ≤11 ≤8 ≤11 ≤12 ≤12 ≤11 ≤9 ≤14

13～14 14～17 10～13 14～18 13～16 15～16 11～12 21～28 12～21 9～11 12～14 13～16 13～18 12～13 10～11 15～16

≥15 ≥18 ≥14 ≥19 ≥17 ≥17 ≥13 ≥29 ≥22 ≥12 ≥15 ≥17 ≥19 ≥14 ≥12 ≥17 多粘菌素B 鏈霉素 磺胺 四環(huán)素 妥布霉素 萬古霉素 氯潔霉素

注意事項

1．稀釋法

（1）接種量：接種細(xì)菌量的多少與MIC有一定關(guān)系。如用敏感的葡萄球菌對氯芐青霉素進(jìn)行檢測時，接種量增加1 000倍，MIC只略有增加，但對甲氧苯青霉素的敏感度則因接種量的不同而有較大變化，即使同一菌株，接種量小時為敏感，接種量增大時，其MIC則增加許多倍。

（2）培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件：培養(yǎng)基的組成成分應(yīng)保持恒定，外觀清晰透明，pH值適宜。為了觀察方便，還可向各管中加入葡萄糖及指示劑，以指示劑顏色的改變判定其是否生長。同時要注意選擇適宜的培養(yǎng)溫度，一般在12～18h觀察藥敏試驗結(jié)果。如時間過長，細(xì)菌將會在高濃度的藥物中生長。其原因，一是由于被輕度抑制的細(xì)菌開始繁殖，另一方面則是因為有些抗生素在37℃情況下不穩(wěn)定，在其被破壞之后，受抑制的細(xì)菌也會再次生長繁殖。

（3）對于一些色澤深或本身呈混濁的中草藥，其試管培養(yǎng)后不易觀察細(xì)菌的生長情況?？蓮呐囵B(yǎng)管移至平板培養(yǎng)基上，觀察各管中的細(xì)菌是否被殺死。這種方法只能測定藥物的最低殺菌濃度。

抑菌圈圖示

含藥紙片

抑菌圈

細(xì)菌菌苔（4）稀釋時，每一個稀釋度均應(yīng)更換吸管。菌液及抗生素的加量要準(zhǔn)確。

2．?dāng)U散法

（1）K-B紙片擴(kuò)散法必須使用Mueller-Hintion（MHA）培養(yǎng)基，因其解釋度的數(shù)據(jù)是用此培養(yǎng)基積累的，MHA培養(yǎng)基普通冰箱可保存2～3周，用前須放37℃10min，以使形成的水霧干燥。此培養(yǎng)基適合于快速生長的細(xì)菌，生長緩慢的細(xì)菌或厭氧菌，不宜采用K-B技術(shù)及其解釋標(biāo)準(zhǔn)。

（2）接種用的菌液濃度必須標(biāo)準(zhǔn)化，以細(xì)菌在平板上的生長恰呈融合狀態(tài)為標(biāo)準(zhǔn)，接種后應(yīng)及時貼含藥紙片和放入35℃（或37℃）培養(yǎng)。

（3）培養(yǎng)的溫度要恒定，時間為16～18h，結(jié)果不宜判讀過早。因培養(yǎng)過久，細(xì)菌能恢復(fù)生長，使抑菌環(huán)變小。培養(yǎng)時不應(yīng)增加CO2，以防某些抗菌藥物形成的抑菌圈大小發(fā)生改變及影響培養(yǎng)基的pH值。