第一篇：牛奶中酪蛋白和乳糖的分離、鑒定

牛奶中酪蛋白和乳糖的分離、鑒定(杜青 胡弘毅)

牛奶中酪蛋白和乳糖的分離、鑒定

杜青 胡弘毅

（化學(xué)與分子科學(xué)學(xué)院；湖北 武漢 430072）

摘要：本文介紹了從牛奶中分離酪蛋白和乳糖的方法，和鑒定酪蛋白的方法。關(guān)鍵詞：酪蛋白、乳糖、等電點(diǎn)、分離

1.引言

牛奶是營養(yǎng)最完備的食品之一，這一點(diǎn)已為許多人認(rèn)識并接受。尤其是在嬰兒及青少年時(shí)期，每天一定量的牛奶能促進(jìn)身體健康成長。牛奶的主要成分是水、蛋白質(zhì)、脂肪、糖和礦物質(zhì)，這些都是人體發(fā)育所必不可少的物質(zhì)。

牛奶中的蛋白質(zhì)主要是酪蛋白。酪蛋白是含磷蛋白質(zhì)的復(fù)雜混合物，在牛奶中以其鈣鹽形式存在，即酪蛋白鈣。利用蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最小的特性，把牛奶的ＰＨ值調(diào)到酪蛋白的等電點(diǎn)(ＰＨ =4.8)來沉淀分離酪蛋白。酷蛋白不溶于乙醇和乙醚，所以可用乙醇和乙醚將其中的脂肪洗滌除去。

牛奶中的糖主要是乳糖。乳糖是一種二糖。它是唯一由哺乳動物乳糖合成的糖，它是在乳腺中被合成的。乳糖是成長中的嬰兒建立其發(fā)育中的腦子和神經(jīng)組織所需的物質(zhì)。乳糖也是不溶于乙醇的，所以，當(dāng)

2.材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)儀器

恒溫水浴鍋、抽氣抽濾瓶、布氏漏斗、蒸發(fā)皿、燒杯600ml、100ml各一個(gè)、表面皿、天平、玻璃棒。

2.2 主要試劑

10%醋酸溶液、95%乙醇、乙醚、伊利牌純牛奶、精密PH試紙（PH=3~5）、碳酸鈣、濾紙、1%CuSO4溶液、10%NaOH溶液、茚三酮溶液。

2.3 實(shí)驗(yàn)過程

2.3.1 酪蛋白的分離

取三份20ml新鮮牛奶于100ml燒杯中，在恒溫水浴中加熱至45℃，邊攪拌邊慢慢加入10%醋酸溶液，通過PH試紙測量至牛奶PH分別為4.8、4.6和3.8。放置冷卻、澄清后，抽濾。注意先將上層清液濾出，再將沉淀傾入漏斗中。（濾完后，在濾液中加入少量粉狀碳酸鈣留作乳糖的分離。）再依次用95%乙醇、乙醇乙醚等體積混合液、乙醚洗滌酪蛋白。用乙醚洗滌時(shí)，注意用玻璃棒搗碎成團(tuán)的固體，并反復(fù)翻洗，保證脂肪被洗凈。將洗凈的酪蛋白移至表面皿上，自然晾干后稱重。

2.3.2 酪蛋白的鑒定（在酪蛋白分離后立即完成效果最好）

取少量酪蛋白顆粒于試管中，加入少量水溶解。

取10ml酪蛋白溶液，加入茚三酮溶液5滴，振蕩，放入沸水浴中加熱2分鐘，溶液呈淡紫色。（茚三酮反應(yīng)）

取10ml酪蛋白溶液，加入10% NaOH溶液2ml后，滴入1%CuSO4溶液1ml。振蕩試管，溶液呈藍(lán)紫色。（縮二脲反應(yīng)）

取10ml酪蛋白溶液，加入濃硝酸2ml后加熱，有黃色沉淀生成。再加入10%NaOH溶液2ml，沉淀為橘黃色。（蛋黃顏色反應(yīng)）

2.3.3 乳糖的分離

將2.3.1中濾液用傾潷法倒至蒸發(fā)皿中，用蒸汽浴濃縮至5ml后，將熱的混合物用布氏漏斗抽濾，除去沉淀的蛋白質(zhì)和殘余碳酸鈣。加熱濾液，在熱的溶液中加入95%乙醇18

ｍl，并繼續(xù)加熱，待其混合均勻后，趁熱過濾，濾液應(yīng)澄清。把濾液移至錐形瓶中，加塞，放置 1-2天，讓乳糖充分結(jié)晶。抽濾，分離出乳糖晶體，并用冷的95%的乙醇水溶液洗滌產(chǎn)物，待其干燥后稱重。

3．結(jié)果與討論

3.1不同PH值的酪蛋白的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象

PH值調(diào)到3.8的牛奶,酪蛋白迅速沉淀下來，抽濾的速度也很快，鑒定酪蛋白的幾個(gè)性質(zhì)試驗(yàn)現(xiàn)象都十分明顯，而且濾液十分澄清，但濾液中只析出微量絮狀乳糖?？赡苁撬岬臐舛忍?，乳糖被大量水解。

PH值調(diào)到4.8的牛奶，酪蛋白的沉淀速度很慢，抽濾的速度也很慢，而且抽不干，濾液是渾濁的。

PH值調(diào)到4.6的牛奶，酪蛋白沉淀速度和抽濾速度處于上面兩種情況的中間，得到3.1g 酪蛋白，性質(zhì)試驗(yàn)現(xiàn)象明顯。濾液略顯乳白色，得0.23g乳糖，乳糖呈片狀晶體。

3.2奶中脂肪的影響

脂肪也是牛奶的主要成分之一，約占牛奶的3.9%,在分離酪蛋白時(shí)，脂肪回夾雜在酪蛋白中一起沉淀出來。因此，在用乙醚洗滌酪蛋白時(shí)，應(yīng)把任何形狀的酪蛋白搗碎，并用玻璃棒攪拌約10min，盡可能出去脂肪。否則，酪蛋白長時(shí)間放置后會焦化變黃。

3.3碳酸鈣的作用

本實(shí)驗(yàn)中所使用的碳酸鈣，主要是用以中和過剩的乙酸，避免在后面的實(shí)驗(yàn)中乳糖在酸性條件下水解，從而影響收得率。

乙醇混入水溶液中時(shí),乳糖會結(jié)晶出來 ,從而達(dá)到

…?報(bào)名分離的目的。

第二篇：大豆分離蛋白的主要工藝流程

大豆分離蛋白的主要技術(shù)性能指標(biāo) 水份：≤6% 干基粗蛋白：≥90% 水溶氮指數(shù)：≥60% TPC：≤10000個(gè) 大腸桿菌：0個(gè) 色澤：淺黃/乳白

氣滋味：具有分離蛋白特有的氣滋味 PH值：6.8～7.2 密度：過200目篩95%，過270目篩 90% 產(chǎn)品的功能特性將根據(jù)不同應(yīng)用領(lǐng)域來確認(rèn)

乳化型：通過1（蛋白）：4（水）：4（脂肪）的測試，腸體光亮、有彈性，無油、水滲出。

高凝膠型：通過1（蛋白）：5（水）：2（脂肪）的測試，腸體光潔度好，有彈性，無油、水滲出。

高分散（注射）型：1:10(蛋白:水)試驗(yàn)：稍攪拌溶解，靜置三分鐘無分層，0.5mm注射針頭完全通過。大豆分離蛋白工藝流程

低溫豆粕——萃取——分離——酸沉——分離——水洗——分離——中和——?dú)⒕W蒸——干燥——超細(xì)粉碎——混合造?！獓娡俊Y選——金屬檢測——包裝 工藝簡要描述：

萃取：將大豆低溫豆粕置入萃取罐中按1：9的比例加入9倍的水，水溫控制為40C0，加入堿使溶液在PH為9的條件下低溫豆粕豆粕中的蛋白溶解于水中。

分離：將低溫豆粕溶液送入高速分離機(jī)，將混合溶液中的粗纖維（豆渣）與含有蛋白的水（混合豆乳）分離開。豆渣排到室外準(zhǔn)備作飼料銷售。混合豆乳回收置入酸沉罐中。

酸沉：利用大豆蛋白等電點(diǎn)為4.2的原理，加入酸調(diào)整酸沉罐中混合豆乳的PH到4.2左右。使蛋白在這個(gè)條件下產(chǎn)生沉淀。

分離：將酸沉后的混合豆乳送入分離機(jī)進(jìn)行分離，使沉淀的蛋白顆粒與水分離。水（豆清水）排入廢水處理場治理后達(dá)標(biāo)排放?；厥盏鞍滓海椋┑綍捍婀蕖?/p>

水洗：按1（凝乳）：4的比例加水入暫存罐中攪拌。使凝乳中的鹽份和灰份溶解于水中。

分離：將暫存罐中的凝乳液送入離心機(jī)進(jìn)行分離。水排入廢水處理場治理達(dá)標(biāo)排放，凝乳回收入中和罐。

中和：加入堿入中和罐，使凝乳的PH調(diào)整到7。殺菌：將中和后的凝乳利用140C0的高溫進(jìn)行瞬時(shí)殺菌 干燥：將殺菌后的溶解送入干燥塔，在干燥溫度為180C0的條件下將溶解干燥。

篩選：對干燥的大豆分離蛋白進(jìn)行初步篩選。使98%通過100目標(biāo)準(zhǔn)篩。

超微粉碎：用特殊超微粉碎機(jī)對產(chǎn)品進(jìn)行粉碎，使90%通過200目標(biāo)準(zhǔn)篩造粒：產(chǎn)品隨后進(jìn)行造粒設(shè)備進(jìn)行造粒，使產(chǎn)品粒度均勻。

篩選：對產(chǎn)品進(jìn)行進(jìn)一步篩選。

噴涂：在產(chǎn)品表面噴涂表面活性劑，提高產(chǎn)品乳化穩(wěn)定效果。金屬檢測：對產(chǎn)品進(jìn)行金屬檢測。

包裝：檢測后的產(chǎn)品進(jìn)行自動包裝系統(tǒng)，按規(guī)定的重量進(jìn)行包裝。

第三篇：細(xì)菌分離鑒定

細(xì)菌分離鑒定

目的要求：

熟悉臨床標(biāo)本中常見的病原性細(xì)菌的分離鑒定方法，細(xì)菌分離鑒定。

實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：

一、膿汁、咽拭子等標(biāo)本中病原性細(xì)菌的分離與鑒定

(一)標(biāo)本采集

1.膿拭子：用無菌棉簽蘸取患處深部膿液或分泌物少許，置入無菌空試管內(nèi)，送檢。

2.痰拭子：用消毒容器收集病人痰液，用無菌棉簽挑取膿稠痰塊，置入無菌空試管內(nèi)，送檢。

3.咽拭子：囑病人把口張大，用壓舌板壓住舌根，用無菌棉簽迅速蘸取咽部分泌物，置入無菌空試管內(nèi)，送檢。

4.血標(biāo)本：疑為敗血癥患者，在嚴(yán)格無菌操作下，靜脈采血，床旁直接加入含50ml的肉湯瓶內(nèi)，立即搖勻后送培養(yǎng)。

5.腦脊液：對疑似流腦患者，作腰椎穿刺取腦脊液，立即行直接床旁接種(送檢過程中應(yīng)注意保溫)。

6.尿道、陰-道分泌物：對可疑淋病患者，男性可從尿道取材，取材時(shí)導(dǎo)尿管應(yīng)進(jìn)入尿道1cm～2cm，如為剛排尿，應(yīng)等待1h左右;女性則可以從宮頸口取分泌物，當(dāng)內(nèi)窺器插入宮頸口后應(yīng)稍等片刻，再旋轉(zhuǎn)取出，取材應(yīng)立即送檢，不可放置冰箱。

(二)分離鑒定程序

待檢標(biāo)本可直接做涂片染色檢查鑒定，必要時(shí)可做分離培養(yǎng)、生化反應(yīng)及致病性鑒定。常見的致病性球菌檢查程序如下。

直接涂片、革蘭染色、鏡檢(形態(tài)、排列、染色性)

膿、痰、咽拭子

分泌物、腦脊液 觀察菌落性狀、溶血性、色素

血瓊脂平板→ 涂片、染色、鏡檢

↑ 挑取可疑菌落 生化反應(yīng)

血液、穿刺液 →肉湯培養(yǎng)基 純分離 致病性測定

↓ 藥敏試驗(yàn)

如培養(yǎng)液混濁時(shí)可涂片、染色、鏡檢

(三)常見臨床標(biāo)本的檢查方法

1．膿拭子

在膿汁中除了球菌外，也有桿菌存在，例如革蘭陽性的有炭疽桿菌、白喉?xiàng)U菌、結(jié)核桿菌、枯草桿菌等，革蘭陰性的有大腸桿菌、綠膿桿菌、變形桿菌等，此外尚可有真菌、放線菌、螺旋體等。

材料

(1)標(biāo)本：膿拭子

(2)培養(yǎng)基：血瓊脂平板

(3)兔血漿、白色濾紙片、無菌生理鹽水、載玻片

方法 膿汁 → 革蘭染色 → 鏡檢

↓ ↑

血瓊脂平板 →觀察菌落形態(tài)及溶血情況

↓

致病力試驗(yàn)

(1)將膿拭子作革蘭染色，鏡檢(先作培養(yǎng)再涂片以免污染)，鑒定材料《細(xì)菌分離鑒定》。標(biāo)本放置4℃冰箱保存，待報(bào)告發(fā)出后再丟棄。

(2)將膿汁涂布于血瓊脂平板上，再以滅菌接種環(huán)作劃線分離。置培養(yǎng)37℃培養(yǎng)18h～24h。

(3)經(jīng)培養(yǎng)后據(jù)菌落特點(diǎn)及涂片檢查結(jié)果進(jìn)行初步識別，根據(jù)需要再作進(jìn)一步鑒定。若菌落較大、溶血透明、產(chǎn)生金黃色色素、涂片為革蘭陽性球菌并成堆排列時(shí)可能系葡萄球菌，應(yīng)確定其為何種葡萄球菌;必要時(shí)再作血漿凝固酶試驗(yàn)及甘露醇發(fā)酵試驗(yàn)，確定其致病力。

2.咽拭子

咽喉中存在的細(xì)菌較多，可以有厭氧及需氧性鏈球菌、葡萄球菌、肺炎球菌、四聯(lián)球菌、腦膜炎球菌、卡他球菌、喉?xiàng)U菌、結(jié)核桿菌枯草桿菌、百日咳桿菌肺炎桿菌及綠膿桿菌等。此外也可有白色念珠菌奮森螺旋體等。本實(shí)驗(yàn)以咽拭子作為標(biāo)本，重點(diǎn)檢查病原性球菌。

材料

(1)標(biāo)本:咽拭子。

(2)培養(yǎng)基:血瓊脂平板。

方法

咽拭子

↓

血瓊脂平板

↓

觀察菌落形態(tài)及溶血性

↓

革蘭染色，鏡檢

取標(biāo)本涂布于血瓊脂平板，再以滅菌接種環(huán)劃線分離，置37℃培養(yǎng)18h～24h培養(yǎng)。標(biāo)本放置4℃冰箱保存，待報(bào)告發(fā)出后再丟棄。

可根據(jù)下述特點(diǎn)進(jìn)行鑒別：

(1)在菌落周圍產(chǎn)生2mm～4mm寬、界線分明、完全透明的溶血環(huán)、涂片為革蘭陽性球菌并呈鏈狀排列，可能是乙型溶血性鏈球菌。

(2)菌落細(xì)孝半透明、有草綠色溶血環(huán)、涂片為革蘭陽性球菌呈鏈狀排列，可能為甲型溶血性鏈球菌。需要進(jìn)一步與肺炎球菌區(qū)別時(shí)，可做膽汁溶菌試驗(yàn)及菊糖發(fā)酵反應(yīng)。

菌落細(xì)小半透明、不溶血、涂片為革蘭陽性鏈狀排列的球菌時(shí)，為丙型鏈球菌。

(4)菌落扁平邊緣隆起、中央稍凹、半透明、呈草綠色溶血、革蘭染色為陽性雙球菌、呈矛頭狀排列時(shí)為肺炎球菌，應(yīng)以膽汁溶菌及菊糖發(fā)酵反應(yīng)與甲型溶血性鏈球菌區(qū)分。

(5)菌落中等大孝表面光滑、呈灰色、革蘭染色為陰性雙球菌，呈腎形排列時(shí)，可能為腦膜炎球菌，需要進(jìn)一步作氧化酶試驗(yàn)及糖發(fā)酵試驗(yàn)(接種于含血清之葡、麥、蔗糖發(fā)酵管中)。

二、糞便標(biāo)本中腸道桿菌的分離與鑒定

(一)標(biāo)本收集

取患者的糞便或肛-門拭子。

(二)鑒定程序

腸道桿菌為一大群革蘭陰性桿菌，從形態(tài)及染色性上無法鑒別為何種菌，只能依靠生化反應(yīng)和血清學(xué)反應(yīng)進(jìn)行鑒定。

患者糞便(粘液、膿血)→腸道選擇、鑒別培養(yǎng)基(如ss、中國藍(lán)、伊紅美蘭)

↓

挑取可疑菌落(據(jù)大孝顏色、透明度而定)

↓

雙糖鐵及其他鑒別培養(yǎng)基

↓

據(jù)結(jié)果分析鑒定

↓

玻片凝集(做出特異性診斷)

葡萄糖乳糖動力H2S尿素

⊕⊕±--艾希菌屬非致病菌

⊕+---克雷伯菌屬

⊕±+++變形桿菌

⊕-++-乙型副傷寒致病菌

⊕-+±-甲型副傷寒

+-++-傷寒桿菌

+----痢疾桿菌

第四篇：水塔老陳醋大曲中酵母菌的分離鑒定 - 20150909

水塔老陳醋大曲中酵母菌的分離鑒定

摘要 目的：大曲是山西著名品牌水塔老陳醋發(fā)酵的主要原料，其富含多種微生物，研究大曲中酵母菌的組成對老陳醋的發(fā)酵生產(chǎn)有重要的指導(dǎo)意義。方法：采用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法，即通過富集培養(yǎng)再稀釋涂布、分離純化出21株酵母菌，對其進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、鏡檢，并且擴(kuò)增和測定了它們的5.8S-ITS、18S、26S D1/D2區(qū)序列，從分子水平上對這些菌株進(jìn)行了分類學(xué)鑒定。結(jié)果：測序結(jié)果與GenBank 中已知序列進(jìn)行比對，鑒定到2株弗比恩酵母，8株扣囊復(fù)膜酵母，6株異常威克漢姆酵母，3株葡萄牙棒孢酵母，2株東方伊薩酵母。結(jié)論：大曲中含有多種酵母菌，分離培養(yǎng)和分子生物學(xué)鑒定了酵母菌的種類，為純種制曲打下了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：大曲，酵母菌，分離，鑒定

大曲是我國傳統(tǒng)釀造酒和釀造食醋生產(chǎn)中主要的原料。大曲是酒和食醋釀造過程中重要的微生物、酶類、香氣物質(zhì)和香氣物質(zhì)前提的主要來源[1-2]。大曲中含有多種微生物，可起到糖化、發(fā)酵、增香的作用，直接或間接地影響酒和醋的風(fēng)味及口感。然而，大曲采用開放式富集培養(yǎng)，受場地、工具和制曲室環(huán)境以及水、空氣等多種因素影響，大曲質(zhì)量難以得到穩(wěn)定，同時(shí)富集式培養(yǎng)使大曲富含多種微生物，包括功能性微生物和無效、有害微生物，難以保證大曲的質(zhì)量穩(wěn)定[3]。酵母菌是大曲中主要的功能性微生物之一，影響酒和老陳醋的發(fā)酵生產(chǎn)及口感。分離鑒定大曲中酵母菌的組成，成了近幾年酒和食醋的研究熱點(diǎn)[4-9]。分離鑒定水塔老陳醋大曲中酵母菌的組成，對提高著名品牌水塔老陳醋的產(chǎn)量和質(zhì)量有很重要的意義。

采用富集培養(yǎng)再稀釋涂布、分離水塔老陳醋大曲中的酵母菌，之后對其進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、鏡檢，擴(kuò)增和測定它們的18S、5.8S-ITS、26S D1/D2區(qū)序列，從分子水平上對這些菌株進(jìn)行了分類學(xué)鑒定。分子生物學(xué)的鑒定方法不僅能夠快速的將各種酵母鑒定到屬或種, 而且鑒定的結(jié)果精確度更高。隨著數(shù)據(jù)庫中分子信息量的增加,近年來應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)鑒定酵母菌種的研究越來越廣泛[10-17]。

對酵母菌鑒定最常用的分子系統(tǒng)發(fā)育分析方法有18S、5.8S-ITS、26S D1/D2區(qū)等。酵母菌核糖體小亞基18S rRNA 存在不同保守程度序列的鑲嵌現(xiàn)象(從高度保守到半保守區(qū)到高可變區(qū))，使得該分子可以用來衡量較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系，也適宜于較近的親緣關(guān)系。這個(gè)區(qū)域大約有1800bp，含有不同變異率的區(qū)段，可以用于種、屬或更高等級分類群之間的系統(tǒng)關(guān)系研究[10-12]。酵母菌ITS區(qū)為核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，位于18S rDNA 和26S rDNA 之間，包括ITS1 和ITS2 兩個(gè)片斷，中間包含一個(gè)5.8S rDNA 片段。ITS 區(qū)域與rDNA 轉(zhuǎn)錄區(qū)相比具有較高的變異率，對于親緣關(guān)系較近的菌株間的區(qū)分是比較有效的。研究表明ITS 區(qū)域的差異大于1% 時(shí)就可能代表不同的種，然而對于不同的屬而言，情況會有所不同[11-18]。26S rDNA 的 Dl/D2 區(qū)域位于大亞基的5'端，序列長度在600bp 左右，該段區(qū)域具有較高的變異率，可以用于親緣關(guān)系較近的菌株之間的分類研究，目前已經(jīng)成為酵母鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析的重要“標(biāo)尺”。雖然酵母種內(nèi)26S D1/D2 區(qū)堿基差異小于1%的標(biāo)準(zhǔn)已被普遍接受，然而此數(shù)值仍是一個(gè)試驗(yàn)的經(jīng)驗(yàn)值[11-13,19-20]。

本研究采用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)和分子生物學(xué)相結(jié)合，分離鑒定著名品牌山西水塔老陳醋大曲中酵母菌的種類，研究與老陳醋發(fā)酵產(chǎn)香等相關(guān)菌種，同時(shí)也為食醋傳統(tǒng)工藝的研究、改造、純種制曲等提供指導(dǎo)。

1材料與方法

1.1材料與儀器設(shè)備

1.1.1 樣品和主要試劑

大曲由山西水塔醋液股份有限公司提供。YPD培養(yǎng)基購自北京博奧星。Dream Taq Green PCR Master Mix購自Fermentas;Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR購自寶生物工程有限公司；其它試劑購自北京化工廠。

1.1.2 儀器設(shè)備

滅菌鍋，無菌工作臺，生化培養(yǎng)箱，搖床，分光光度計(jì)，熒光顯微鏡（重慶奧特光學(xué)），GeneAmp PCR System 2720(ABI)，ChampGel凝膠成像分析系統(tǒng)（北京賽智）。1.2 方法

1.2.1

培養(yǎng)基和樣品制備

1.2.1.1 富集培養(yǎng)基

酵母粉1%，葡萄糖2%，蛋白陳2%，調(diào)pH至4.5培養(yǎng)基滅菌后再加入鏈霉素（終濃度30 ug/ml）、青霉素（終濃度為50 ug/ml），孟加拉紅0.033 mg/mL，以抑制細(xì)菌和霉菌生長。

1.2.1.2分離培養(yǎng)基

YPD培養(yǎng)基：酵母膏1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%，瓊脂粉2%。葡萄糖單獨(dú)115℃滅菌15 min，然后加入培養(yǎng)基中，倒平板。1.2.1.3樣品的處理

將曲塊經(jīng)過碾壓研磨后混勻過40目篩，保藏在4℃冰箱中備用。

1.2.2

酵母菌的分離

將10 g曲粉加入100 mL無菌水中，在28℃ 200 r/min下?lián)u20 min。取菌懸液3 mL接種于富集培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48 h后吸取5 mL稀釋涂布法分離，28℃培養(yǎng)2 d，觀察菌落形態(tài)，配合鏡檢菌種細(xì)胞形態(tài)，2～3 次純化后保存于4℃冰箱中。

1.2.3 菌種菌落形態(tài)和細(xì)胞形態(tài)鑒定

將酵母菌接種于YPD培養(yǎng)基中，培養(yǎng)3d后，觀察菌落形態(tài)特征和細(xì)胞形態(tài)。1.2.4酵母菌菌株基因組DNA的制備

取菌種，按方法Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR說明書制備基因組DNA。提取后的基因組DNA作為擴(kuò)增5.8S-ITS、18S、26S D1/D2區(qū)序列的模板。

1.2.55.8S-ITS、18S、26S的D1/D2 區(qū)序列擴(kuò)增

利用通用引物ITS1（引物序列：5'-ACGGGGGGTCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（引物序列：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）以菌株總DNA為模版進(jìn)行5.8S-ITS序列擴(kuò)增。利用通用引物EF3（引物序列：5'-TCCTCTAAATGACCAAGTTTG-3'）和EF4（引物序列：5'-GGAAGGGRTGTATTTATTAG-3'）以菌株總DNA為模版進(jìn)行18S序列擴(kuò)增。利用通用引物NL-1（引物序列：5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3'）和NL-4（引物序列： 5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'）以菌株總DNA為模版進(jìn)行26S的D1/D2 區(qū)擴(kuò)增。在50 μl PCR反應(yīng)體系中加入16 μl水、正向引物和反向引物各2 μl、5 μl 模版、25 μl Taq DNA聚合酶Mix。擴(kuò)增程序：95℃變性5 min后，95℃變性1 min、55℃退火1 min、72℃延伸2 min、共35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。電泳檢測目的條帶，擴(kuò)增產(chǎn)物送北京理化分析測試中心進(jìn)行測序。1.2.6 數(shù)據(jù)處理 將rDNA測序結(jié)果輸入數(shù)據(jù)庫http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/，使用BLAST程序與數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行比對分析。根據(jù)比對結(jié)果，找出與數(shù)據(jù)庫同源性最高的已知菌種，推測待定菌株可能的屬或種。

結(jié)果與分析

2.1酵母菌株分離結(jié)果和菌種菌落形態(tài)、細(xì)胞形態(tài)鑒定

從水塔老陳醋大曲中分離到優(yōu)勢酵母菌共21株。根據(jù)菌落形態(tài)特征和菌株細(xì)胞形態(tài)，將菌株進(jìn)行初步分類，選取具有代表性的10株菌株，分別編號為M10、Q28、M12、Q13、M17、Q10、M25、Q34、Q7、Q12。其菌落形態(tài)與細(xì)胞形態(tài)見圖1。

圖1酵母菌細(xì)胞形態(tài)顯微照片（1000×）和菌落形態(tài)

Fig.1 morphology under light microscope(1000×)and Colony morphology of yeast

2.2 分子鑒定結(jié)果

表1 5.8S-ITS測序比對分析

Table 1 5.8S-ITS sequence analysis of 21 yeast species 菌株

5.8S-ITS 測序比對分析

相似菌株 相似度

M10、Q28 M11、M17、M26、Q6、Q10、Q14、Q25、Q33 M12、Q3 M15、Q13、Q19、Q27 M25、Q2、Q34 Q7、Q12

Cyberlindnera fabianii strain BZR42 Saccharomycopsis fibuligera strain 3-1Y

100% 100%

Wickerhamomyces anomalus strain SX1 Pichia anomala strain CTSP F5 Clavispora lusitaniae isolate GK11 Issatchenkia orientalis strain zhuan 1.2 Pichia kudriavzevii clone STA197lsu

99% 100% 99% 99% 99%

表2 18s測序比對分析

Table 2.18s sequence analysis of 21 yeast species

菌株

18s 測序比對分析 相似菌株

相似度

M10、Q28 M11、M17、M26、Q6、Q10、Q14、Q25、Q33 M12、M15、Q3、Q13、Q19、Q27 M25、Q2、Q34 Q7、Q12

Cyberlindnera fabianii strain NRRL Y-1871 Saccharomycopsis fibuligera strain NRRL Y-2388

Wickerhamomyces anomalus strain TIBx229 Clavispora lusitaniae strain NRRL Y-11827 Candida ontarioensis strain BC 2A Pichia kudriavzevii isolate EM12 Issatchenkia orientalis

100% 99%

99% 99% 99% 99% 99%

表3 26S D1/D2測序比對分析

Table 3.26S D1/D2 sequence analysis of 21 yeast species

菌株

26S D1/D2 測序比對分析 相似菌株

相似度

M10、Q28 M11、M17、M26、Q6、Q10、Q14、Q25、Q33 M12、M15、Q3、Q13、Q27、Q19 M25、Q2、Q34 Q7、Q12

Cyberlindnera fabianii strain BZR42 Saccharomycopsis fibuligera strain s-5b-2 Wickerhamomyces anomalus strain XJHFS-1 Clavispora lusitaniae strain IMAU5Y028(G-1)Pichia kudriavzevii strain DMic 113897

Kluyveromyces marxianus strain IMAU4Y089(QH27-4)

Issatchenkia orientalis strain IMAU3Y005

99% 100% 100% 99% 99% 99% 99%

根據(jù)測序結(jié)果，鑒定到2株弗比恩酵母（Cyberlindnera fabianii strain BZR42，M10、Q28），8株扣囊復(fù)膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera strain s-5b-2，Q6、Q33、Q25、M11、M26、Q10、Q14、M17），6株異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus strain XJHFS-1，Q3、Q13、Q27、Q19、M15、M12），3株葡萄牙棒孢酵母（Clavispora lusitaniae strain IMAU5Y028，M25、Q2、Q34），2株東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis strain IMAU3Y005，Q7、Q12）。結(jié)論和討論

本研究按照酵母菌的富集分離培養(yǎng)方法分離山西老陳醋大曲中的酵母菌，利用形態(tài)學(xué)菌落形態(tài)和細(xì)胞形態(tài)初步鑒定為酵母菌。

利用通用引物ITS1和ITS4以菌株總DNA為模版進(jìn)行5.8S-ITS序列擴(kuò)增，擴(kuò)增到了酵母菌5.8S-ITS長度為350-650 bp。利用通用引物EF3和EF4以菌株總DNA為模版進(jìn)行18S序列擴(kuò)增，擴(kuò)增到酵母菌的18S長度為1500 bp左右。利用通用引物NL-1和NL-4以菌株總DNA為模版進(jìn)行26S的D1/D2 區(qū)擴(kuò)增，擴(kuò)增到酵母菌的26S D1/D2 區(qū)長度為500-600 bp。成功擴(kuò)增了21株的酵母菌的5.8S-ITS、18S、26S的D1/D2 區(qū)序列，并進(jìn)行了測序，測序結(jié)果與數(shù)據(jù)庫http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/進(jìn)行了比對，鑒定到2株弗比恩酵母，8株扣囊復(fù)膜酵母，6株異常威克漢姆酵母，3株葡萄牙棒孢酵母，2株東方伊薩酵母。

本研究發(fā)現(xiàn)5.8S-ITS序列、18S、26S D1/D2區(qū)在鑒定弗比恩酵母，扣囊復(fù)膜酵母，葡萄牙棒孢酵母，鑒定結(jié)果與模式菌種相識度高并且結(jié)果唯一。在鑒定Q3等菌種時(shí)，NCBI數(shù)據(jù)庫中庫比對結(jié)果與異常威克漢姆酵母、異常畢赤酵母相識度均為99%，不易鑒定最后是哪種菌。異常威克漢姆酵母，異常畢赤酵母，異常漢遜酵母，這三種酵母是同物異名，但最新的酵母分類學(xué)表明部分異常畢赤酵母更名為異常威克漢姆酵母[20]。在鑒定Q7等菌種時(shí)，與東方伊薩酵母、德里阿茲威畢赤酵母、馬克思克魯維酵母相識度均為99%，不易鑒定最后是哪種菌。東方伊薩酵母和庫德里阿茲威畢赤酵母也是同物異名，最新的分類學(xué)名稱是東方伊薩酵母。本文研究中發(fā)現(xiàn)，鑒定Q7菌種26S D1/D2區(qū)時(shí)，BLAST 比對結(jié)果與100個(gè)提交的基因序列，相識度在99%-100%，GenBank 數(shù)據(jù)庫中酵母菌生物部分 rDNA 序列多、亂，但完整的基因組序列僅有模式種釀酒酵母和弗比恩酵母。目前公共核酸序列數(shù)據(jù)庫酵母菌其它模式屬和模式種還存在數(shù)據(jù)不完整的問題。因此新增并完善已發(fā)現(xiàn)的酵母菌相關(guān)序列數(shù)據(jù)信息，建立一個(gè)準(zhǔn)確、精簡、完整的酵母菌序列參照數(shù)據(jù)庫顯得十分必要。

本研究對酵母菌鑒定中最常用的分子系統(tǒng)學(xué)方法鑒定結(jié)果進(jìn)行比較得出：它們的鑒定結(jié)果相互印證，可以確認(rèn)鑒定的結(jié)果。本研究通過最常用的分子系統(tǒng)發(fā)育學(xué)方法，即5.8S ITS、18S、26S rDNA D1/D2 區(qū)序列分析及GenBank 查詢和BLAST 比對，對分離自山西老陳醋釀造用大曲分離到的21株酵母菌進(jìn)行了分類鑒定，同時(shí)比較了它們在鑒定結(jié)果上的異同。本研究鑒定到8株扣囊復(fù)膜酵母，顏華等研究表明利用扣囊復(fù)膜酵母進(jìn)行生物發(fā)酵，直接將淀粉加工成人們所需要的各種產(chǎn)品而無需液化、糖化，可節(jié)約能源、降低成本，將具有深遠(yuǎn)的意義。而且，扣囊復(fù)膜酵母較傳統(tǒng)的釀酒酵母來說，具有更豐富的次生代謝[20]。分離到的幾種酵母菌將進(jìn)一步進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，測定發(fā)酵后產(chǎn)生的醇類、酯類及老陳醋特征型指紋圖譜物質(zhì)[1, 7, 9, 10, 22, 23, 24]。

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Super-vinegar Daqu Abstract: Daqu is the main raw material of the fermentation of Shuita Super-vinegar.It is rich in many microorganisms.The research on the composition of yeasts in Daqu has important directive significance for the fermentation of Super-vinegar.The 21 yeast strains are purified by traditional method which includes enrichment,dilution,coating etc.They are researched

by

morphological

observation

and

microscopic

examination.Their 5.8S-ITS,18S,26SD1/D2 domain sequences are amplified and measured to identify these strains in molecular taxonomy.The result of sequencing is intercompared with the known sequences in GenBank.It shows that these strains include 2 Cyberlindnera fabianii strains,8 Saccharomycopsis fibuligera strains,6 Wickerhamomyces anomalus strains,3 Clavispora lusitaniae strains,2 Issatchenkia orientalis strains.There are many yeast strains in Daqu.Their isolation,culture,identification in the molecular biology is the basis for culturing purified strain Daqu.Keyword:Daqu,Yeast,isolation,identification

第五篇：酸奶菌種的分離及鑒定

酸奶菌種的分離及鑒定

乳酸菌是指一群通過發(fā)酵糖類，產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌總稱。乳酸從形態(tài)上可分為球菌和桿菌，并且均為革蘭氏染色陽性、在缺少氧氣的環(huán)境中生長良好的兼性厭氧性或厭氧性細(xì)菌。目前，對乳酸菌的應(yīng)用研究，著重于食品（如發(fā)酵乳制品、發(fā)酵肉制品和泡菜）和醫(yī)藥工業(yè)等人類生活密切相關(guān)的領(lǐng)域。

目前市售的各種酸奶制品中, 作為發(fā)酵劑的乳酸菌, 通常為保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌這兩株菌。用嗜熱鏈球菌和保加利亞乳酸桿菌混合培養(yǎng)發(fā)酵的乳酸飲品能補(bǔ)充人體腸道內(nèi)的有益菌，維持腸道的微生態(tài)平衡，且含有易于吸收的營養(yǎng)素，具有抑制腐敗菌、提高消化率、防癌及預(yù)防一些傳染病等功效，并能為食品提供芳香風(fēng)味，使食品擁有良好的質(zhì)地。

保加利亞乳桿菌（L.Bulgarius）:長桿形，直徑1-3mm左右,能產(chǎn)生大量的乳酸。酸堿度方面,為耐酸或嗜酸性,因低 pH能防止一些微生物的生長;溫度方面,為嗜溫至少許嗜熱,最適生長溫度在37-45℃之間,對低溫非常敏感。

嗜熱鏈球菌（S.thermophilus）：卵圓形，直徑0.7－0.9微米，呈對或鏈狀排列，無運(yùn)動性。為健康人腸道正常菌群，可在人體腸道中生長、繁殖?？芍苯友a(bǔ)充人體正常生理細(xì)菌，調(diào)整腸道菌群平衡，抑制并清除腸道中對人具有潛在危害的細(xì)菌。

本研究對市售主要品牌酸奶中（河南花花乳業(yè)生產(chǎn)的酸奶）乳酸菌進(jìn)行了分離鑒定，并進(jìn)一步探討制備酸奶條件（溫度、時(shí)間等），以達(dá)到最佳的天然酸奶質(zhì)量效果。

一、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

（1）乳酸菌的分離純化

1．無菌操作倒平板、十倍稀釋、劃線分離，恒溫培養(yǎng)

2．菌落觀察與鏡檢 3．篩選生產(chǎn)用菌株（2）優(yōu)化酸奶制作條件

1．制備發(fā)酵液

2．不同條件下，接種發(fā)酵菌劑并發(fā)酵生產(chǎn) 3．觀察發(fā)酵情況

4．品嘗發(fā)酵產(chǎn)品，進(jìn)行質(zhì)量評價(jià) 5．記錄結(jié)果

二、實(shí)驗(yàn)器材

1）菌種：新鮮乳酸飲料（標(biāo)記只含有保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌）

2）試劑：脫脂奶粉、蔗糖、1.6%溴甲酚綠乙醇溶液(溴甲酚綠、無水乙醇)、酵母膏、瓊脂、革蘭氏染液（結(jié)晶紫染液、盧戈氏碘液、95%乙醇、沙黃）、75%乙醇、香柏油、1mol/L NaOH、1mol/L HCl、碳酸鈣；

0.4gNaOH固體、4.2ml濃HCL(分析純)、20gCaCO3固體、酵母膏20g、瓊脂30g

香柏油、脫脂奶粉100g、蔗糖10g；

3）儀器：高壓蒸汽滅菌鍋、恒壓干熱滅菌箱、超凈工作臺、光學(xué)顯微鏡、培養(yǎng)箱、pH試紙、酸乳瓶、培養(yǎng)皿（φ9或φ12）、試管、300ml三角瓶（帶玻珠）、移液管、天平、牛角匙、電爐、量筒、漏斗、漏斗架、玻璃棒、棉塞、吸管、線繩、標(biāo)簽、500ml錐形瓶、250ml錐形瓶、250ml燒杯、酒精燈、石棉網(wǎng)、接種針（環(huán)）、擦鏡紙

四、實(shí)驗(yàn)方法

4.1乳酸菌的分離純化 4.1.1分離

(1)配制BCG牛乳培養(yǎng)基，分裝三角瓶，包扎，滅菌備用。

BCG牛乳培養(yǎng)基配制

A溶液：脫脂乳粉100g,水500ml，加入1.6%溴甲苯酚綠（BCG）乙醇溶液1ml，80℃滅菌20min。（1.6%溴甲苯酚綠（BCG）乙醇溶液用1.6g溴甲酚綠加入20ml無水乙醇中，再加水至100ml制成）

B溶液：酵母膏10g，水500ml，瓊脂20g，PH6.8，121℃濕熱滅菌20min。以滅菌操作趁熱將A溶液和B溶液混合均勻后倒平板。（2）樣品的處理

按照無菌操作要求，從市售新鮮酸乳中吸取10ml檢樣，放入裝有90ml無菌水的三角瓶內(nèi)，振搖混勻。（3）分離方法 ①倒培養(yǎng)基

在無菌室，先用紫外線照射半小時(shí)把表面菌滅了，在通風(fēng)10min后，每培養(yǎng)皿傾注約15ml左右已溶化的BCG牛乳培養(yǎng)基，立即放在桌上搖勻，冷卻凝固后即成平板。②十倍稀釋法

將檢樣充分搖勻后，用十倍稀釋法稀釋成10-

1、10-

2、10-

3、10-

4、10-5各種稀釋度的樣品液。目的是為了確定哪個(gè)稀釋度最適宜。一般在培養(yǎng)基上長處50-300個(gè)菌落的稀釋度為最佳。③分離

在BCG牛乳培養(yǎng)基瓊脂平板上劃線分離，每稀釋度做兩個(gè)平皿。置40℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。如出現(xiàn)圓形稍扁平的黃色菌落及周圍培養(yǎng)基變?yōu)辄S色者初步定為乳酸菌。4.1.2鑒別

（1）配制脫脂乳試管培養(yǎng)基，分裝試管，包扎，滅菌備用。脫脂乳試管培養(yǎng)基成分：20g脫脂奶粉，285ml滅菌水。配制好的脫脂乳培養(yǎng)基分裝到15支試管中。

（2）選取經(jīng)初步鑒定的乳酸菌典型菌落，用接種環(huán)挑取轉(zhuǎn)至脫脂乳試管中，40℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8～24h。若牛乳出現(xiàn)凝固，無汽泡，呈酸性，涂片鏡檢細(xì)胞為桿狀或鏈球狀（兩種形狀的菌種分別選入），革蘭氏染色顯陽性，則可將其連續(xù)傳代4～6次，最終選擇出在3～6h能凝固的牛乳管，作菌種待用 4.2優(yōu)化酸奶制作條件（1）乳酸菌培養(yǎng)基的制作

將脫脂乳和水以1:7（W/V）的比例，同時(shí)加入6%的蔗糖，充分混合，于80～85℃滅菌10～15min，冷卻至35～40℃，作為制作飲料的培養(yǎng)基質(zhì)。即脫脂乳14.3g，無菌水100ml，蔗糖6g。（2）接種

將純種嗜熱乳酸鏈球菌、保加利亞乳酸桿菌及兩種等量混合菌液作為發(fā)酵菌劑，均以2～5%的接種量分別接入培養(yǎng)基質(zhì)中即為飲料發(fā)酵液。接種后搖勻，分裝到已滅菌的酸乳瓶中，每一種菌的發(fā)酵液重復(fù)分裝12瓶，將瓶蓋擰緊密封。（3）發(fā)酵

將接種后的酸乳瓶置30℃，36℃和42℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2或4h時(shí)。培養(yǎng)時(shí)注意觀察，出現(xiàn)凝乳后停止培養(yǎng)。然后轉(zhuǎn)入4～5℃冰箱中冷藏24h以上。經(jīng)此后熟階段，達(dá)到酸度適中（pH4～4.5）,凝塊均勻致密,無乳清晰出,無汽泡,獲得較好口感和特有風(fēng)味。（4）發(fā)酵產(chǎn)物鑒定——紙層析法 將分離的純菌種接種到乳酸菌葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基上，40℃培養(yǎng)48h。取產(chǎn)酸不產(chǎn)氣的液體試管中發(fā)酵液做紙層析。展開劑：水30mL、苯甲醇150mL、正丁醇150mL、甲酸3.3mL。顯色劑 ： 將1.6%的溴酚藍(lán)酒精溶液用0.1 mol／L的 NaOH調(diào)pH到6.7。顯色后，分別測定發(fā)酵液與2%標(biāo)準(zhǔn)乳酸的Rf值，確定發(fā)酵產(chǎn)物中是否有乳酸

五、預(yù)期結(jié)果

1．分離鑒定獲得嗜熱乳酸鏈球菌、保加利亞乳酸桿菌

2．獲得酸奶制作的最佳條件

六、實(shí)驗(yàn)進(jìn)度