第一篇：PCR 引物設計的原則和要點

PCR 引物設計的原則和要點

BIOX.CN2005-5-13 9:13:57 來源：生物中國人

引物設計有3 條基本原則：首先引物與模板的序列要緊密互補，其次引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結構，再次引物不能在模板的非目的位點引發(fā)DNA 聚合反應(即錯配)。引物設計應注意如下要點：引物的長度一般為15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不應大于38，因為過長會導致其延伸溫度大于74℃，不適于Taq DNA 聚合酶進行反應。引物序列在模板內應當沒有相似性較高，尤其是3’端相似性較高的序列，否則容易導致錯配。引物3’端出現3 個以上的連續(xù)堿基，如GGG 或CCC，也會使錯誤引發(fā)機率增加[2]。引物3’端的末位堿基對Taq 酶的DNA 合成效率有較大的影響。不同的末位堿基在錯配位置導致不同的擴增效率，末位堿基為A 的錯配效率明顯高于其他3 個堿基，因此應當避免在引物的3’端使用堿基A[3][4]。另外，引物二聚體或發(fā)夾結構也可能導致PCR 反應失敗。5’端序列對PCR 影響不太大，因此常用來引進修飾位點或標記物[2]。引物序列的GC 含量一般為40-60%，過高或過低都不利于引發(fā)反應。上下游引物的GC含量不能相差太大。引物所對應模板位置序列的Tm 值在72℃左右可使復性條件最佳。Tm 值的計算有多種方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo 軟件中使用的是最鄰近法(the nearest neighbor method)。

6?G 值是指DNA 雙鏈形成所需的自由能，該值反映了雙鏈結構內部堿基對的相對穩(wěn)定性。應當選用3’端?G 值較低（絕對值不超過9），而5’端和中間?G 值相對較高的引物。引物的3’端的?G 值過高，容易在錯配位點形成雙鏈結構并引發(fā)DNA 聚合反應[6]。引物二聚體及發(fā)夾結構的能值過高（超過4.5kcal/mol）易導致產生引物二聚體帶，并且降低引物有效濃度而使PCR 反應不能正常進行[8]。對引物的修飾一般是在5’端增加酶切位點，應根據下一步實驗中要插入PCR 產物的載體的相應序列而確定。

第二篇：PCR實驗室檢查要點(2016)

聚合酶鏈反應（PCR）檢驗實驗室

檢查要點指南（2016版）

聚合酶鏈反應檢驗實驗室是指通過基因擴增的方式檢測特定的DNA或RNA的檢驗實驗室。聚合酶鏈反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一種在體外特異性擴增靶DNA序列的技術，其基本過程為模板雙鏈DNA的變性、引物與模板DNA的退火和在DNA 聚合酶引導下的鏈延伸反應三個階段的多次循環(huán)。每一次循環(huán)后的擴增產物均可作為下一輪循環(huán)的模板，理論上，擴增產物量呈指數形式上升，即經過n個循環(huán)后，產物量增加到2n倍。PCR試劑操作簡單，短時間內在體外可獲得數百萬個特異靶DNA序列的復制，為臨床疾病的診斷、治療監(jiān)測和預后評估提供了一種極有幫助的實驗室輔助手段。

PCR檢驗實驗室是PCR試劑生產企業(yè)在產品檢驗過程中不可缺少的工作環(huán)境，其環(huán)境控制水平和質量管理水平直接影響著最終產品是否合格，能否放行。由于該產品本身的特殊性，《醫(yī)療器械生產質量管理規(guī)范附錄體外診斷試劑》、《醫(yī)療器械生產質量管理規(guī)范體外診斷試劑現場檢查指導原則》條款中，明確對PCR試劑的生產和檢驗環(huán)境做出規(guī)定。此外現行衛(wèi)生行業(yè)的法規(guī)、標準以及相關文獻中對于PCR檢驗實驗室均作出規(guī)定，主要涉及《全國臨床檢驗規(guī)程》（第三版）、《醫(yī)療機構臨床基因擴增管理辦法》（衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)〔2010〕194號）、《醫(yī)療機構臨床基因擴增檢驗實驗室工作導則》及《臨床診斷中聚合酶鏈反應（PCR）技術的應用》（WS/T 230-2002）等行業(yè)標準的相關要求。本檢查指南旨在幫助北京市醫(yī)療器械監(jiān)管人員增強對PCR檢驗相關過程的認知和把握，指導全市醫(yī)療器械監(jiān)管人員對PCR檢驗實驗室設計建設與質量控制的監(jiān)督檢查工作。同時，為PCR試劑生產企業(yè)在PCR檢驗實驗室的設計建造和管理要求提供參考。

當國家相關法規(guī)、標準、檢查要求發(fā)生變化時，應當重新討論以確保本檢查指南持續(xù)符合要求。

一、適用范圍

本檢查指南可作為北京市食品藥品監(jiān)督管理局組織、實施的體外診斷試劑產品注冊質量管理體系現場核查、《醫(yī)療器械生產許可證》現場核查、醫(yī)療器械生產監(jiān)督檢查等各項涉及PCR檢驗實驗室檢查的參考資料。

基因測序檢驗實驗室等涉及PCR試劑的相關部分應當參照本檢查指南執(zhí)行。

二、檢查要點

（一）現場查看生產企業(yè)PCR檢驗實驗室布局

生產企業(yè)應當提供PCR檢驗實驗室設計方案和/或平面設計圖（應當標明風向或壓差梯度）。

1.PCR檢驗實驗室與PCR試劑生產區(qū)域應當在各自獨立的建筑物或空間內，保證空氣不直接聯通，防止擴增時形成的氣溶膠造成交叉污染。

2.原則上PCR檢驗實驗室應當設臵以下區(qū)域：試劑儲存和準備區(qū)、標本制備區(qū)、擴增區(qū)、擴增產物分析區(qū)。根據使用儀器的功能，區(qū)域可適當合并。若使用實時熒光定量PCR儀且不需要進行后續(xù)產物分析工作，擴增區(qū)、擴增產物分析區(qū)可合并。若使用樣本處理、核酸提取及擴增檢測為一體的自動化分析儀，則標本制備區(qū)、擴增區(qū)、擴增產物分析區(qū)可合并。

3.各區(qū)域在物理空間上應當完全相互獨立，各區(qū)域無論是在空間上還是在使用中，應當始終處于完全的分隔狀態(tài)。不應當只是形式上的分區(qū)，不應當是一個區(qū)域嵌套一個區(qū)域。

4.各區(qū)域不應當有空氣的直接相通。擴增區(qū)與擴增產物分析區(qū)各區(qū)域宜采用獨立直排方式出風。采用空調機組方式的，PCR檢驗實驗室應當具備獨立空調機組；同時應當考慮停機后各房間空氣連通的可能性，采取必要的控制措施。

5.按照試劑儲存和準備區(qū)→標本制備區(qū)→擴增區(qū)→擴增產物分析區(qū)方向空氣壓力應當以遞減的方式進行，使得PCR檢驗實驗室的空氣流向應當按照試劑儲存和準備區(qū)→標本制備區(qū)→擴增區(qū)→擴增產物分析區(qū)方向進行，防止擴增產物順空氣氣流進入擴增前的區(qū)域?？諝饬飨驊敒閱蜗?，禁止下游污染上游。應當設臵合理的壓差梯度，并安裝壓差監(jiān)測裝臵，以有效證明空氣流向，壓差梯度不宜低于5帕。

6.設臵緩沖間的，緩沖間內通向內實驗室和走廊的門應當安裝連鎖裝臵或采取相應措施，避免出現兩個門同時打開的情況。

7.各區(qū)間若設臵傳遞窗，應當為雙側開門，要求密封嚴實，并且兩側的門應當為互鎖裝臵或采取相應措施保證兩側門不會同時開啟。

（二）現場查看儀器設施配臵 1.試劑儲存和準備區(qū)的功能：貯存試劑的制備、試劑的分裝和擴增反應混合液的準備，以及離心管、吸頭等消耗品的貯存和準備。配套用品一般應當包括：

（1）溫度調控范圍為2℃～8℃和（或）-20℃以下冰箱；（2）混勻器；（3）微量加樣器；（4）紫外消毒設備；

（5）消耗品：一次性手套、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭；（6）專用工作服和工作鞋(套)；（7）專用辦公用品。

2.標本制備區(qū)的功能：核酸（RNA、DNA）提取、貯存及加樣。配套用品一般應當包括：

（1）溫度調控范圍為2℃～8℃和（或）-20℃以下冰箱；（2）高速離心機；（3）混勻器；

（4）水浴箱或加熱模塊；（5）微量加樣器；（6）紫外消毒設備；（7）生物安全柜；

（8）消耗品：一次性手套、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶 濾芯）；

（9）專用工作服和工作鞋(套)；（10）專用辦公用品；

（11）如需處理大分子DNA，應當具有超聲波儀。

3.擴增區(qū)的功能：cDNA合成、DNA擴增及檢測。配套用品一般應當包括：

（1）核酸擴增儀；（2）微量加樣器；（3）紫外消毒設備；

（4）消耗品：一次性手套、一次性帽子、耐高壓處理的離心管和 加樣器吸頭（帶濾芯）；（5）專用工作服和工作鞋；（6）專用辦公用品。

4.擴增產物分析區(qū)的功能：擴增片段的進一步分析測定。視檢驗 方法不同而定，基本配臵如下：（1）微量加樣器；（2）紫外消毒設備；

（3）消耗品：一次性手套、一次性帽子、加樣器吸頭（帶濾芯）；（4）專用工作服和工作鞋；（5）專用辦公用品。5.設備的維護保養(yǎng)

應當建立設備維護保養(yǎng)規(guī)程，計量設備應當定期檢定。例如核酸擴增儀、微量加樣器、生物安全柜、離心機應當每年進行檢定或校準工作。

（三）現場檢查工作流程及注意事項 1.進入各工作區(qū)域應當嚴格按照單一方向進行，即試劑儲存和準備區(qū)→標本制備區(qū)→擴增區(qū)→ 擴增產物分析區(qū)。

2.各工作區(qū)域必須有明確的標記，不同工作區(qū)域內的設備、物品不得混用。

3.不同工作區(qū)域的工作服應當加以區(qū)分，不得混用（例如可以采用不同顏色）。

4.實驗室的清潔應當按照試劑貯存和準備區(qū)→標本制備區(qū)→擴增區(qū)→擴增產物分析區(qū)的方向進行。不同的實驗區(qū)域應當有其各自的清潔用具并防止交叉污染。實驗垃圾屬于醫(yī)療廢物的應當按照《醫(yī)療廢物管理條例》相關規(guī)定進行處理。

5.工作結束后，應當立即對工作區(qū)進行清潔及消毒。6.貯存試劑和用于標本制備的消耗品等材料應當直接運送至試劑貯存和準備區(qū)，不能經過擴增檢測區(qū)。應當對加樣吸頭、PCR反應管等消耗品處理，防止污染。試劑盒中的陽性對照品及質控品應當保存在標本處理區(qū)。試劑應當使用分子生物學級別試劑，使用的純化水應當高壓滅菌。質檢用于原輔料、半成品、成品檢驗用的PCR反應試劑應當有相應的質量標準及操作程序。

7.為避免樣本間的交叉污染，加入待測核酸后，應當蓋好含反應混合液的反應管。應當注意PCR反應液加樣的順序，應當為空白樣品→陰性對照→樣品→陽性對照。對具有潛在傳染危險性的材料，應當在生物安全柜內開蓋，并有明確的樣本處理和滅活程序。8.應當避免氣溶膠所致的污染，盡量減少在擴增區(qū)內的走動，擴增反應管不得在擴增區(qū)打開。

9.擴增產物分析區(qū)有可能存在某些可致基因突變和有毒物質如溴化乙錠、丙烯酰胺、甲醛或放射性核素等，應當注意實驗人員的安全防護。

（四）現場檢查人員培訓情況

參與PCR檢驗的工作人員應當具備相應的專業(yè)知識和技能，包括能熟練操作相關設備,明確整個工作的流程,掌握出現污染情況的處理方法以及實驗室質量控制方法和檢測結果的解釋。

檢查人員可以通過詢問或要求人員實際操作對其進行評價，也可以通過查閱人員培訓記錄，對其進行評價。

（五）現場檢查文件情況

在檢查過程中應當特別注意現場查看、詢問、記錄的實際情況與生產企業(yè)的文件規(guī)定、記錄的符合性。

附件：

理想的PCR檢驗實驗室設計

圖A 緩沖間為負壓的理想PCR檢驗實驗室設臵模式

圖B 緩沖間為正壓的理想PCR檢驗實驗室設臵模式

圖A和圖B所給出的PCR檢驗實驗室設臵圖是較為理想的設臵模式，建議企業(yè)參照此種模式設計并建立實驗室。

參考資料：

1.《關于發(fā)布醫(yī)療器械生產質量管理規(guī)范的公告》（國家食品藥品監(jiān)督管理總局公告2014年第64號）

2.《關于發(fā)布醫(yī)療器械生產質量管理規(guī)范附錄體外診斷試劑的公告》（國家食品藥品監(jiān)督管理總局公告2015年第103號）

3.《關于印發(fā)醫(yī)療器械生產質量管理規(guī)范現場檢查指導原則等4個指導原則的通知》（食藥監(jiān)械監(jiān)〔2015〕218號）

4.《生物安全實驗室建筑技術規(guī)范》（GB50346-2004）5.《實驗室生物安全通用要求》（GB19489-2008）

6.《臨床診斷中聚合酶鏈反應（PCR）技術的應用》（WS/T203-2002）7.全國臨床檢驗操作規(guī)程[第3版]，中華人民共和國衛(wèi)生部醫(yī)政司，2006年11月2日

8.Setting Up a PCR Laboratory—Theodore E.Mifflin，Department of Pathology, University of Virginia, Charlottesville, Virginia 22908 9.Establishment of PCR laboratory in developing countries—World Health Organization[SEA-HLM-419]

第三篇：引物設計-hyb總結

引 物 設 計

一.引物設計原則

首先引物與模板的序列要緊密互補，其次引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結構，再次引物不能在模板的非目的位點引發(fā)DNA聚合反應(即錯配)。

二.引物設計注意的要點

1.引物的長度一般為15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不應大于38，因為過長會導致其延伸溫度大于74℃，不適于Taq DNA聚合酶進行反應。

2.引物序列在模板內應當沒有相似性較高，尤其是3’端相似性較高的序列，否則容易導致錯配。引物3’端出現3個以上的連續(xù)堿基，如GGG或CCC，也會使錯誤引發(fā)機率增加。

3.引物3’端的末位堿基對Taq酶的DNA合成效率有較大的影響。不同的末位堿基在錯配位置導致不同的擴增效率，末位堿基為A的錯配效率明顯高于其他3個堿基，因此應當避免在引物的3’端使用堿基A。另外，引物二聚體或發(fā)夾結構也可能導致PCR反應失敗。5’端序列對PCR影響不太大，因此常用來引進修飾位點或標記物。

4.引物序列的GC含量一般為40-60%，過高或過低都不利于引發(fā)反應。上下游引物的GC含量不能相差太大。

5.引物所對應模板位置序列的Tm值在72℃左右可使復性條件最佳。Tm值的計算有多種方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo軟件中使用的是最鄰近法(the nearest neighbor method)。

6.ΔG值是指DNA雙鏈形成所需的自由能，該值反映了雙鏈結構內部堿基對的相對穩(wěn)定性。應當選用3’端ΔG值較低（絕對值不超過9），而5’端和中間ΔG值相對較高的引物。引物的3’端的ΔG值過高，容易在錯配位點形成雙鏈結構并引發(fā)DNA聚合反應。

7.引物二聚體及發(fā)夾結構的能值過高（超過4.5kcal/mol）易導致產生引物二聚體帶，并且降低引物有效濃度而使PCR反應不能正常進行。

8.對引物的修飾一般是在5’端增加酶切位點，應根據下一步實驗中要插入PCR產物的載體的相應序列而確定。

三.引物設計的步驟

1.打開NCBI的主頁，選擇UniSTS,填寫目的基因，選擇符合要求的引物，導入blast和primer5檢測是否符合要求，如果不符合要求再自己重新設計。

2.打開NCBI頁面，選擇Gene,填寫需要查找的基因及源種（例如小鼠mus）,找到mRNA的序列號，點擊打開，找到相應的mRNA，把序列或者mRNA的accession序號導出到word里面，找出含有內含子的位置，做好標記(從進入Gene頁面后，點擊Genbank,可以了解這個基因的大小，以及內含子與外顯子的大小)或者把mRNA的accession序號導入priemer Designing tool里面，擴增產物是200-250，TM 58-62，至少包含一個內含子，內含子長度可慢慢調試，最終要求Tm,GC%都比較接近，同時self3complementarity的值不能超過3，self complementarity不能超過6，這2個值越低越好。

3.根據引物設計原則，從mRNA序列中找相應的序列作為引物，上引物是5到3，下引物就是與mRNA序列反向互補的。

4.把設計的引物導入blast里檢測下在所有基因中是否有非特異性擴增。

5.把全部mRNA序列導入primer5中，查看引物的Tm,GC%含量，是否有發(fā)夾結構與二聚體結構，以及錯配率，得分，確定引物的可用性。

1.引物是如何合成的？

目前引物合成基本采用固相亞磷酰胺三酯法。DNA合成儀有很多種, 主要都是由ABI/PE 公司生產，無論采用什么機器合成，合成的原理都相同，主要差別在于合成產率的高低，試劑消耗量的不同和單個循環(huán)用時的多少。

亞磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速的偶聯以及起始反應物比較穩(wěn)定的特點。亞磷酰胺三酯法是將DNA固定在固相載體上完成DNA鏈的合成的，合成的方向是由待合成引物的3'端向5'端合成的，相鄰的核苷酸通過3'→5'磷酸二酯鍵連接。

第一步是將預先連接在固相載體CPG上的活性基團被保護的核苷酸與三氯乙酸反應，脫去其5'-羥基的保護基團DMT，獲得游離的5'-羥基；

第二步，合成DNA的原料，亞磷酰胺保護核苷酸單體，與活化劑四氮唑混合，得到核苷亞磷酸活化中間體，它的3'端被活化，5'-羥基仍然被DMT保護，與溶液中游離的5'-羥基發(fā)生縮合反應。

第三步，帶帽(capping)反應，縮合反應中可能有極少數5'-羥基沒有參加反應(少于2%)，用乙酸酐和1-甲基咪唑終止其后繼續(xù)發(fā)生反應，這種短片段可以在純化時分離掉。第四步，在氧化劑碘的作用下，亞磷酰形式轉變?yōu)楦€(wěn)定的磷酸三酯。

經過以上四個步驟，一個脫氧核苷酸被連接到固相載體的核苷酸上。再以三氯乙酸脫去它的5'-羥基上的保護基團DMT，重復以上步驟，直到所有要求合成的堿基被接上去。合成過程中可以觀察TCA處理階段的顏色判定合成效率。

通過氨水高溫處理，連接在CPG上的引物被切下來，通過OPC, PAGE等手段純化引物，成品引物用C18濃縮,脫鹽，沉淀。沉淀后的引物用水懸浮，測定OD260定量，根據定單要求分裝。

2.引物純化方式有哪些，如何選擇？

◆ C18柱脫鹽：有人稱其為簡易反相柱，它對DNA有特異性的吸附，可以被有機溶解洗脫，但不會被水洗脫，所以能有效地去除鹽分。它不能有效去除比目的片段短的小片段。實際上，它是一種脫鹽的作用。這種方法一般不會對普通PCR反應產生影響。對于需要用于測序、克隆的引物不能使用這個級別。

◆ OPC純化： OPC純化是根據DNA保護基（DMTr基）和Cartridge柱中樹脂間的親合力作用的原理進行純化目的DNA片段。OPC法純化的DNA純度大于95%。適用于40mer以下引物的純化?！?PAGE純：PAGE純化法是使用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，對DNA片段進行分離，然后從凝膠中回收目的DNA的方法。PAGE純化法也是一種非常有效的DNA純化方法，純化后的DNA純度大于95%，對長鏈Oligo DNA(大于50mer)的純化特別有效。

◆ HPLC純化：HPLC純化是使用高效液相色譜的原理，對DNA片段進行純化。純度可以大于

99%。主要用于短鏈和修飾引物的純化。該法的弱點是成本較高，批量生產效率不高。

3.引物的OD數如何定量？

答：引物合成引物OD數是這樣測定的：用紫外分光光度計，波長260nm，石英比色杯，光程為1厘米，測定溶液的光密度。測定時溶液的光密度最好稀釋到0.2-1.0之間。DNA干粉用一定體積的水充分振蕩溶解以后，用1ml水稀釋測OD值。需要根據稀釋倍數換算出母液的OD值。4.需要什么級別的引物？

答：引物常用的純化方式C18脫鹽，OPC純化，PAGE純化，HPLC純化。根據實驗需要，確定訂購引物的純度級別。

應用 引物長度要求 純度級別要求 一般PCR擴增 < 45base OPC >45 base PAGE 診斷PCR擴增 < 40base OPC, PAGE DNA測序 20base左右 OPC 亞克隆，點突變等 根據實驗要求定 OPC, PAGE，HPLC 基因構建（全基因合成）根據實驗要求定 PAGE 反義核酸 根據實驗要求定 PAGE 修飾引物 根據實驗要求定 PAGE, HPLC

5.最長可以合成多長的引物？

答：引物越長，出現問題的概率就越大。我們合成過120base的引物，但是產率很低。除非需要，建議合成片段長度不要超過80mer,按照目前的引物合成效率，80mer的粗產品，全長（還不一定正確）引物的百分比不會超過40%，后續(xù)處理還有丟失很多，最后的產量是很低。

6.需要合成多少OD數？

答：根據實驗目的確定。一般PCR擴增，2 OD引物，可以做200-500次50ul標準PCR反應。如果是做基因拼接或退火后做連接，1 OD就足夠了。但是有些研究人員，就做幾次PCR，但是卻要5-10 OD。做全基因構建的引物都比較長，但是我們有些研究人員也要求高OD數。片段越長, 最后全長得率就越低，出錯的幾率就越大。超出需要之外的OD數要求，其實也是對社會資源的一種浪費，同時也從一個側面反映了部分研究人員，特別是新手的自信心不足，總覺得需要重復多次才能成功。

7.如何檢測引物的純度？

答：實驗室方便的作法是用PAGE方法。使用加有7M尿素的16%的聚丙烯酰胺凝膠進行電泳。取0.2-0.5OD的引物，用尿素飽和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到飽和，上樣前加熱變性(95℃,2mins)。加入尿素的目的一是變性，二是增加樣品比重，容易加樣。600V電壓進行電泳，一定時間后(約2-3小時)，剝膠，用熒光TLC板在紫外燈下檢測帶型，在主帶之下沒有雜帶，說明純度是好的。如果條件許可，也可以用EB 染色或銀染方式染色。

8.如何計算引物的濃度？

答：引物保存在高濃度的狀況下比較穩(wěn)定。引物一般配制成10-50pmol/ul。溶解前您需要核對合成報告單和引物標簽上的引物OD數是否一致。如果不一致，請和我們聯系。我們可以根據生產記錄查到實際產量是多少。

一般情況下，我們建議將引物的濃度配制成50pmol/ul，加水的體積（微升）按下列方式計算：V(微升)= OD數*（乘）33 *（乘）*（乘）20000 /(除)引物的分子量。引物的分子量可以從合成報告單上獲得。如果需要配制成其他濃度，按上述公式換算。注意：1 OD260= 33 ug/ml.9.如何計算引物的Tm值？

答：引物設計軟件都可以給出Tm，引物長度，堿基組成，引物使用緩沖的離子強度有關。長度為25mer以下的引物，Tm計算公式為：Tm = 4℃(G + C)+ 2℃(A + T)對于更長的寡聚核苷酸，Tm計算公式為：

Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41(%GC)– 600/size 公式中，Size = 引物長度。

Tm的定義：Tm = Temperature at which 50% of a given oligonucleotide is hybridized to its complementary strand.In the absence of destabilizing agents, like formamide or urea, Tm will depend on 3 major parameters: The sequence: a GC-rich sequence has a higher melting temperature.The strand concentration: high oligonucleotide concentrations favor hybrid formation, which results in a higher melting temperature.The salt concentration: high ionic strength results in a higher Tm as cations stabilize the DNA duplexes.10.引物（含修飾）的分子量是如何確定的？

答：非修飾的引物的Molecular Weight在隨引物提供的報告單上都有明確的標示。如果需要估計一個引物的分子量按每個堿基的平均分子量為324.5，引物的分子量=堿基數 x 堿基的平均分子量?；虬聪铝泄接嬎鉓W=(NA * WA)+(NC * WC)+(NG * WG)+(NT * WT)+(Nmod * Wmod)＋（Nx * Wx）+(Ni* Wi)+16* Ns– 62.NA, NG, NC, NT, Ni分別為引物中堿基A或G或C或T或I的數量，WA, WC, WG, W, Wi分別為引物中堿基A或G或C或T或I的分子量，Nmod，Wmod 分別為修飾基團的數目和分子量。

對于混合堿基的分子量為混合堿基的分子量總合除以混合數，例如G+A混合的分子量為（313.21+329.21）/2 = 321.21。Ns為硫代數目，硫代每個位置增加分子量16。常規(guī)堿基分子量 Base Molecular Weight A 313.21 C 289.18 G 329.21 T 304.19 I 314.2 U 290.17

常規(guī)修飾基團分子量

5’-Biotin 405.45 3’-TAMARA 623.60 5’-(6 FAM)537.46 3’-Dabsyl 498.49 5’-HEX 744.13 3’-(6 FAM)569.46 5’-TET 675.24 3’-Amino Modifier C3 153.07 5’-Cy5 533.63 3’-Amino Modifier C7 209.18 5’-Cy3 507.59 3’-Thiol Modifier C3 154.12

11.如何溶解引物？

答：干燥后的引物質地非常疏松，開蓋前最好離心一下，或管垂直向上在桌面上敲敲，將引物粉末收集到管底。根據計算出的體積加入去離子無菌水或10mM Tris pH7.5緩沖液，室溫放置幾分鐘，振蕩助溶，離心將溶液收集到管底。溶解引物用的水一般不要用蒸餾水，因為有些蒸餾水的pH值比較低（pH4-5）,引物在這種條件下不穩(wěn)定。

12.如何保存引物？

答：引物合成后，經過一系列處理和純化步驟，旋轉干燥而成片狀物質。引物在溶解前，室溫狀態(tài)下可以長期保存。溶解后的引物-20度可以長期保存。如果對實驗的重復性要求較高，合成的OD數較大，建議分裝，避免反復凍融。修飾熒光引物需要避光保存。

13.合成的引物5’端是否有磷酸化

答：合成的引物5’為羥基，沒有磷酸基團。如果需要您可以用多核苷酸激酶進行5'端磷酸化，或者要求我們合成時直接在5'或3'端進行磷酸化，需要另外收費。

14.引物片段退火后不能連接到載體上是什么問題？

連接反應需要引物的5’磷酸基團。如果需要將合成的引物退火直接連接相應的載體上，引物需要磷酸化。磷酸化的產物如果還不能連接載體上，需要檢查載體的酶切效果，需要改善引物退火的條件。SiRNA分子具有特殊的對稱結構，退火的難度較大，退火時需要提高退火溫度。

15.測序發(fā)現引物有突變是怎么回事？

答：測序發(fā)現引物區(qū)域有突變，特別是40個堿基以下的引物, 發(fā)生的概率不大，但是肯定也會發(fā)生。用戶一般可以放心，引物序列一般都是通過電腦直接將您的序列COPY到合成儀的，堿基輸錯的機會不多。我們有一套控制辦法，預防堿基輸入錯誤。發(fā)生這種突變的原因有很多解釋，人們還沒有辦法徹底解決這個問題。引物合成的固相合成原理都一樣，采用的機器也基本相同，合成主要原料都是由可數的幾家跨國公司提供的，所有每個合成服務商遇到的問題也基本類似，沒有人可以超脫。

引物合成是一種多步驟的化學反應，合成效率最高也就是99%，副產品不可以避免。引物序列中插入突變往往是堿基重復，一般認為，偶連過程中，正在偶連的部分單體發(fā)生丟失DMT,導致單體又接了上去，故發(fā)生插入同一堿基的突變。至于缺失突變，一般認為是一般認為是帶帽(capping)反應不徹底造成的，Caping反應主要是封閉極少數5'-羥基沒有參加反應單體。被封閉的引物，在下一輪偶連時將不能繼續(xù)參與合成。對于堿基置換的突變，產生的原因一般認為是堿基不能100%脫保護，即引物上可能含有殘留保護基團，引物的這些區(qū)域不能很好地與互補鏈配對，當擴增的產品被亞克隆轉化到大腸桿菌中，可能被細菌中修復系統補上了非配對的堿基。置換突變通常發(fā)生在G 轉換成其它堿基。堿基G在一定條件下可以轉化為烯醇異構體（脫嘌呤），2,6 diaminopurine , DNA復制和擴增過程中DNA聚合酶將2,6 diaminopurine看作堿基A，測序就會發(fā)現堿基G-A置換。脫嘌呤現象在富含嘌呤的引物中發(fā)生的頻率較高。脫嘌呤的引物在引物后處理脫保護階段如果被降解，測序就會發(fā)現堿基G或A的缺失。

引物合成過程中，造成堿基插入，缺失，置換突變的因素客觀存在，有不少降低發(fā)生的頻率建議和措施，但是這些措施還停留在實驗室階段，還沒有能夠應用到規(guī)?；a中。

16.長鏈引物為什么出錯的幾率非常高？

答：引物合成時，每一步反應效率都不能達到100%，產生堿基插入，缺失，置換突變的因素客觀

條件都有一直存在。引物鏈越長，突變的頻率累加起來就越高。研究人員總希望合成的引物萬無一失，這種心情可以理解。但是猶如PCR擴增，不可能絕對保證擴增產物中沒有突變，引物合成也不可能保證100%正確。要知道，引物合成中發(fā)生錯誤（非人為因素）的頻率，比任何高保真高溫聚合酶PCR擴增過程所產生的頻率都要高。做引物合成，長鏈引物合成，您要有引物中部分引物可能有突變的思想準備。

17.如果測序發(fā)現突變，該如何處理？

答：對您遇到的困惑，我們表示同情。遇到這種情況，首先和我們取得聯系，我們的生產人員會檢查生產的原始記錄，主要是核對合成序列是否和定單一致，我們在電腦中保留所有原始數據。如果確認引物合成序列沒有輸錯，我們建議重新挑取克隆測序，您可能會找到正確克隆的。根據我們經驗，40個堿基以下的引物，測1-2個克隆就可以了；40個以上的特別是用于全片段拼接合成的，就需要多測一些了。一般情況下，每個克隆突變的位點都不一樣，提示正確的總是有的，就是如何找到它。您也可以要求我們將引物免費重合一次，不過重合的引物和第一次的引物一樣，都可能含突變，不會因為重合的引物就減少您的遇到問題的幾率。基因拼接過程中，如果發(fā)現一段區(qū)域突變點不多，就多測幾個，否則就重合一下引物。

18.引物是經過PAGE純化的，為什么還有堿基缺失或插入？

答：理論上分析型PAGE變性電泳，可以區(qū)分引物之間一個堿基的差別。但是制備PAGE電泳，上樣量都是非常大，電泳時的條帶非常寬，帶與帶之間有重疊，分辨率已下降，電泳后割帶回收目的引物時，很難說不割到差別僅幾個堿基的引物。國內有一個不好的現象，PAGE純化的引物，特別是長引物要的量都比較高，導致割的條帶有時可能比較寬。建議：您如果減少OD數，引物遇到的問題可能就會少一些。

19.TaqMan 探針設計的基本原則是什么？ 答：下列原則供您參考。

◆TaqMan 探針位置盡可能靠近擴增引物（擴增產物50-150bp），但不能與引物重疊?！糸L度一般為18-40mer?！鬐-C含量控制在40-80%左右。

◆避免連續(xù)相同堿基的出現，特別是要避免GGGG或更多G出現。◆在引物的5’端避免使用G?！暨x用比較多的堿基C。

◆退火溫度Tm控制在 68-70C左右。

有用的熒光染料參數

Name Name 吸收波長 發(fā)射波長 colors 6-FAM 6-carboxy-fluorescein 494nm 518nm Green TET 5-tetrachloro-fluorescein 521nm 538nm Orange HEX 5-hexachloro-fluorescein 535nm 553nm Pink TAMRA tetramethyl-6-carboxyrhodamine 560nm 582nm Rose ROX 6-carboxy-x-rhodamine 587nm 607nm Red Cy3 Indodicarbocyanine 552nm 570nm Red Cy5 Indodicarbocyanine 643nm 667nm Violet

20.Primer設計的基本原則是什么？

答：引物設計的下列原則供您參考?！粢镩L度一般在18-35mer?！鬐-C含量控制在40-60%左右?！舯苊饨?’端有酶切位點或發(fā)夾結構。

◆如果可能避免在3’端最后5個堿基有2個以上的G或C?！羧绻赡鼙苊庠?’端最后1個堿基為A。

◆避免連續(xù)相同堿基的出現，特別是要避免GGGG或更多G出現?！敉嘶饻囟萒m控制在 58-60C左右。

◆如果是設計點突變引物，突變點應盡可能在引物的中間。

21.為什么引物的OD260/OD280小于1.5 ？

答：我們多次接到類似的投訴：引物應該全是DNA,但是OD260/OD280的比值為什么那么低，怎么會有蛋白質污染？遇到這樣的投訴有時我們感到很是為難。投訴者有時心情很不好，還不聽解釋。撇開其他不談，引物化學合成，哪里有機會污染到蛋白質？

需要指出的是OD260/OD280的比值不能用來衡量引物的純度。OD260/OD280的比值過低一般是由于引物中C/T 的含量比較高所致。下表是一個20mer 同聚體引物的OD260/OD280的比值，清楚表明OD260/OD280的比值與引物的堿基組成密切相關。

A260/280 ratios of Crude 20-mer Oligos of Differing Base Compositions Base Composition A260/280 5-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3 2.50 5-GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG-3 1.85 5-CCCCCCCCCCCCCCCCCCCC-3 1.15 5-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3 1.14 5-AAAAAGGGGGTTTTTCCCCC-3 1.66

22.同樣的OD用PAGE檢測，EB染色為什么深淺不一？

答：通常可以用EB染色的方法來判斷雙鏈DNA的量(如質粒DNA)，因為EB可以嵌合到雙鏈DNA中。而合成的單鏈DNA，由于堿基組成不同，形成二級結構的可能性不同，EB的染色程度也會有差異，比如Oligo(dT)等不形成二級結構，EB染色效果就非常差。所以不要用EB染色的方法來定量，而用紫外分光光度計檢測。同樣道理，用EB染色來照片不適合所有引物。

23.引物不純會有什么后果？

答：引物不純可能會導致：1)非特異性擴增；2)無法用預先設計在引物5'端酶切位點的酶切開，特別是沒有保護堿基的引物；3)用于測序出現雙峰或亂峰。解決辦法重新合成或重新純化。

24.為什么我們的引物重合了幾遍都擴增不出來？

答：有些PCR擴增沒有成功，懷疑是引物不好。PCR擴增不成功的因素很多，需要您耐心地分析，最好在實驗時設置對照來判定原因。

如果您懷疑引物的問題，請您首先測定您溶解的引物的OD值，看實驗時加入的引物量是否正確。如果量是正常的，請您告訴我司您的引物編號，我們會復查留存樣品。如不明原因，我們免費為您重新合成一次。如果仍然不能擴增，請您查找其它原因。

25.已經溶解的引物，為什么原先使用正常，而過一段時間再使用就不好了？

答：如果您溶解引物的水PH過低或污染了菌或核酸酶，會使引物降解。使用時沒有充分解凍混合，液體不均勻也可能會造成引物加入量不準確。建議分裝引物，避免反復凍溶。建議使用10mM Tris pH7.5緩沖液溶解引物，因為有些蒸餾水的pH值比較低（pH4-5）, 引物在這種條件下不穩(wěn)定。還有一種可能性是引物沒有問題，而是PCR使用材料特別是模板的質量與先前使用的不完全一致。

26.引物質量好壞的判斷標準是什么？

答：合成的引物和您的定單序列一致，而不是能否擴增出您所需要的產物。

27.PCR擴增不出就引物有問題嗎？

答：基本不是。當今發(fā)展出各色各樣的PCR擴增技術，各色各樣的高溫聚合酶，就是來解決PCR擴增中遇到的擴不出，擴增效率低的問題。如槽式PCR就是擴增那些拷貝數很低的基因片段。有些重復片段的擴增, GC含量高的片段，非要采用特殊擴增手段才能擴增出了。

引物擴增不出，主要是下列兩種情況比較常見（1）RT-PCR。請注意，很多基因通過常規(guī)RT –PCR方法是很難不增出來的。RT-PCR成功的關鍵在于RT的反應的RNA質量和目標基因在特定組織和細胞中含量。（2）從基因組中擴增。一般情況下，基因在基因組中都是單拷貝，基因組作為模板需要嚴格控制用量?；蚪MDNA過高，會影響反應體系中的Mg和pH。

28.PCR擴增有很強的非特異條帶，說明引物有污染嗎？

答：不能。瞧，擴增目標很弱或沒有，道是非特異性條帶很亮，說明引物不純或有污染。一些用戶如是說。我們曾分析過一些非特異條帶，測序發(fā)現在這些非特異性片段的兩頭至少可以發(fā)現一條引物序列。我們只能說非特異性擴增一般是模板污染（如RNA中污染基因組）或擴增條件不合適所致。

第四篇：測序引物設計指引PCR引物設計方法1引物最好在cDNA的保守

測序引物設計指南

?PCR引物設計方法：

1.引物最好在模板cDNA的保守區(qū)內設計。

DNA序列的保守區(qū)是通過物種間相似序列的比較確定的。在NCBI上搜索不同物種的同一基因，通過序列分析軟件（比如DNAman）比對（Alignment），各基因相同的序列就是該基因的保守區(qū)。

2.引物長度一般在15~30堿基之間。

引物長度（primerlength）常用的是18-27bp，但不應大于38，因為過長會導致其延伸溫度大于74℃，不適于TaqDNA聚合酶進行反應。

3.引物GC含量在40%~60%之間，Tm值最好接近72℃。

GC含量（composition）過高或過低都不利于引發(fā)反應。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（meltingtemperature）是寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度。有效啟動溫度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估計引物的Tm值，則有效引物的Tm為55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使復性條件最佳。

4.引物3′端要避開密碼子的第3位。

如擴增編碼區(qū)域，引物3′端不要終止于密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發(fā)生簡并，會影響擴增的特異性與效率。

5.引物3′端不能選擇A，最好選擇T。

引物3′端錯配時，不同堿基引發(fā)效率存在著很大的差異，當末位的堿基為A時，即使在錯配的情況下，也能有引發(fā)鏈的合成，而當末位鏈為T時，錯配的引發(fā)效率大大降低，G和C錯配的引發(fā)效率介于A、T之間，所以3′端最好選擇T。

6.堿基要隨機分布。

引物序列在模板內應當沒有相似性較高，尤其是3’端相似性較高的序列，否則容易導致錯誤引發(fā)（Falsepriming）。降低引物與模板相似性的一種方法是，引物中四種堿基的分布最好是隨機的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不應超過3個連續(xù)的G或C，因這樣會使引物在GC富集序列區(qū)錯誤引發(fā)。

7.引物自身及引物之間不應存在互補序列。

引物自身不應存在互補序列，否則引物自身會折疊成發(fā)夾結構（Hairpin）使引物本身復性。這種二級結構會因空間位阻而影響引物與模板的復性結合。引物自身不能有連續(xù)4個堿基的互補。

兩引物之間也不應具有互補性，尤其應避免3′端的互補重疊以防止引物二聚體（Dimer與Crossdimer）的形成。引物之間不能有連續(xù)4個堿基的互補。

引物二聚體及發(fā)夾結構如果不可避免的話，應盡量使其△G值不要過高（應小于4.5kcal/mol）。否則易導致產生引物二聚體帶，并且降低引物有效濃度而使PCR反應不能正常進行。8.引物5′ 端和中間△G值應該相對較高，而3′ 端△G值較低。

△G值是指DNA雙鏈形成所需的自由能，它反映了雙鏈結構內部堿基對的相對穩(wěn)定性，△G值越大，則雙鏈越穩(wěn)定。應當選用5′端和中間△G值相對較高，而3′端△G值較低（絕對值不超過9）的引物。引物3′端的△G值過高，容易在錯配位點形成雙鏈結構并引發(fā)DNA聚合反應。（不同位置的△G值可以用Oligo6軟件進行分析）

9.引物的5′ 端可以修飾，而3′ 端不可修飾。

引物的5′端決定著PCR產物的長度，它對擴增特異性影響不大。因此，可以被修飾而不影響擴增的特異性。引物5′ 端修飾包括：加酶切位點；標記生物素、熒光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白質結合DNA序列；引入點突變、插入突變、缺失突變序列；引入啟動子序列等。

引物的延伸是從3′端開始的，不能進行任何修飾。3′端也不能有形成任何二級結構可能。

10.擴增產物的單鏈不能形成二級結構。

某些引物無效的主要原因是擴增產物單鏈二級結構的影響，選擇擴增片段時最好避開二級結構區(qū)域。用有關軟件（比如RNAstructure）可以預測估計mRNA的穩(wěn)定二級結構，有助于選擇模板。實驗表明，待擴區(qū)域自由能（△G°）小于58.6lkJ/mol時，擴增往往不能成功。若不能避開這一區(qū)域時，用7-deaza-2′-脫氧GTP取代dGTP對擴增的成功是有幫助的。

11.引物應具有特異性。

引物設計完成以后，應對其進行BLAST檢測。如果與其它基因不具有互補性，就可以進行下一步的實驗了。

值得一提的是，各種模板的引物設計難度不一。有的模板本身條件比較困難，例如GC含量偏高或偏低，導致找不到各種指標都十分合適的引物；用作克隆目的的PCR，因為產物序列相對固定，引物設計的選擇自由度較低。在這種情況只能退而求其次，盡量去滿足條件。

做RealTime時,用于SYBRGreenI法時的一對引物與一般PCR的引物,在引物設計上所要求的參數是不同的。

?總結：

1)避免重復堿基，尤其是G.2)Tm=58-60度。

3）GC=30-80%.4)3端最后5個堿基內不能有多于2個的G或C.5)正向引物與探針離得越近越好，但不能重疊。

6)PCR擴增產物長度：引物的產物大小不要太大，一般在80-250bp之間都可；80～150bp最為合適（可以延長至300bp）。

7)引物的退火溫度要高，一般要在60度以上；

要特別注意避免引物二聚體和非特異性擴增的存在。而且引物設計時應該考慮到引物要有不受基因組DNA污染影響的能力，即引物應該跨外顯子，最好是引物能跨外顯子的接頭區(qū)，這樣可以更有效的不受基因組DNA污染的影響。

至于設計軟件，PRIMER3，PRIMER5，PRIMEREXPRESS都應該可以的。

做染料法最關鍵的就是尋找到合適的引物和做污染的預防工作。對于引物，你要有從一大堆引物中挑出一兩個能用的引物的思想準備---尋找合適的引物非常不容易。

關于BLAST的作用應該是通過比對，發(fā)現你所設計的這個引物，在已經發(fā)現并在GENEBANK中公開的不物種基因序列當中，除了和你的目標基因之外，還有沒有和其他物種或其他序列當中存在相同的序列，如和你的目標序列之外的序列相同的序列，則可能擴出其他序列的產物，那么這個引物的特異性就很差，從而不能用。

第五篇：(北京市)PCR實驗室檢查要點

企業(yè)PCR檢驗實驗室布驗收注意事項

企業(yè)應當提供PCR實驗室設計方案和/或平面設計圖（應當標明風向或壓差梯度）。1.PCR檢驗實驗室與PCR產品生產區(qū)域應當在各自獨立的建筑物或空間內，保證空氣不直接連通，防止擴增時形成的氣溶膠造成交叉污染。

2.原則上PCR檢驗實驗室應當設置以下區(qū)域：試劑儲存和準備區(qū)、標本制備區(qū)、擴增區(qū)、擴增產物分析區(qū)，根據使用儀器的功能，區(qū)域可適當合并。若使用實時熒光定量PCR儀，且不需要進行后續(xù)產物分析工作，擴增區(qū)、擴增產物分析區(qū)可合并。若使用樣本處理、核酸提取及擴增檢測為一體的自動化分析儀，則標本制備區(qū)、擴增區(qū)、擴增產物分析區(qū)可合并。

3.各區(qū)域在物理空間上應當完全相互獨立，各區(qū)域無論是在空間上還是在使用中，應當始終處于完全的分隔狀態(tài)。不應只是形式上的分區(qū)，不應一個區(qū)域嵌套一個區(qū)域。

4.各區(qū)域不應有空氣的直接相通。擴增區(qū)與擴增產物分析區(qū)各區(qū)域宜采用獨立直排方式出風。

采用空調機組方式的，PCR實驗室應當具備獨立空調機組；同時應當考慮停機后各房間空氣連通的可能性，采取必要的控制措施。

5.按照試劑儲存和準備區(qū)→標本制備區(qū)→擴增區(qū)→擴增產物分析區(qū)方向空氣壓力應當以遞減的方式進行，使得PCR檢驗實驗室的空氣流向應當按照試劑儲存和準備區(qū)→標本制備區(qū)→擴增區(qū)→擴增產物分析區(qū)方向進行，防止擴增產物順空氣氣流進入擴增前的區(qū)域。

空氣流向應當為單向，禁止下游污染上游。應當設置合理的壓差梯度，并安裝壓差監(jiān)測裝置，以有效證明空氣流向，壓差梯度不宜低于5帕。

6.設置緩沖間的，緩沖間內通向內實驗室和走廊的門應當安裝連鎖裝置或采取相應措施，避免出現兩個門同時打開的情況。

7.試劑和標本通過機械連鎖不銹鋼（不建議使用電子連鎖方式）傳遞窗傳遞，保證試劑和標本在傳遞過程中不受污染（人物分流）。若設置傳遞窗，應當為雙側開門，要求密封嚴實，并且兩側的門應當為互鎖裝置或采取相應措施保證兩側門不會同時開啟。

理想的PCR實驗室布局圖：

8、潔凈實驗區(qū)的緩沖間部分面積不能超過主實驗室的八分之一,這是有規(guī)定的。

9、在實驗區(qū)的外墻上和各扇門上都安裝有風量可調的回風口，空氣通過回風口向室內換氣。

10、主體為彩鋼板、鋁合金型材。室內所有陰角、陽角均采用鋁合金50內圓角鋁，從而解決容易污染、積塵、不易清掃等問題。結構牢固，線條簡明，美觀大方，密封性好。

實驗室的墻體，包括頂棚，應結構牢固、氣密性好；所有陰角宜采用圓弧形線條過渡；墻體內壁光潔、不吸附、耐腐蝕、易清洗消毒；地面材料應滿足無縫隙、無滲漏、光潔、耐腐蝕的要求。

11、在三個實驗區(qū)和三個緩沖區(qū)頂部以及傳送窗內部安裝有紫外燈，供消毒用。在試劑準備區(qū)和標本制備區(qū) 還設置移動紫外線燈，對實驗桌進行局部消毒。天津市臨床檢驗中心需按照《醫(yī)療機構臨床基因擴增檢驗工作導則》對醫(yī)療機構臨床基因擴增檢驗實驗室的檢驗質量適時進行督查，并將檢查結果上報衛(wèi)計委。