植物組織培養(yǎng)問(wèn)題釋疑

問(wèn)題一、在選修3的現(xiàn)代生物技術(shù)專(zhuān)題中，經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)許多影響操作的因素，如植物組織培養(yǎng)脫分化和再分化的影響因素。

植物組織培養(yǎng)的影響因素有哪些？

植物組培的影響因素

試題：（2018年4月浙江選考試題）取田間不同品種水稻的幼胚，先進(jìn)行，然后接種到培養(yǎng)基中培養(yǎng)，幼胚發(fā)生

形成愈傷組織，并進(jìn)行繼代培養(yǎng)。用含重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌侵染愈傷組織，再培養(yǎng)愈傷組織，以便獲得抗蟲(chóng)的轉(zhuǎn)基因水稻。影響愈傷組織能否成功再生出植株的因素有：培養(yǎng)條件如光溫、培養(yǎng)基配方如植物激素配比、以及

（答

2點(diǎn)即可）。

答案：消毒；脫分化；水稻的基因型、愈傷組織繼代的次數(shù)

解析：進(jìn)行組織培養(yǎng)前，要先對(duì)外植體（題中幼胚）進(jìn)行消毒，幼胚先發(fā)生脫分化形成愈傷組織。影響愈傷組織能夠成功再生出植株的因素有：培養(yǎng)條件如光溫、培養(yǎng)基配方如植物激素配比、以及水稻的基因型、愈傷組織繼代的次數(shù)等。

植物組織培養(yǎng)影響的因素有內(nèi)因和外因。

內(nèi)因

主要是遺傳特性和生理特性，不同的器官組織類(lèi)型產(chǎn)生的愈傷組織器官分化明顯不同，這是由基因型決定的；個(gè)體發(fā)育的年齡，如發(fā)育細(xì)嫩的組織容易脫分化為愈傷組織，也容易誘導(dǎo)器官分化；愈傷組織生理狀態(tài)，如繼代的次數(shù)越多，器官分化能力越差。

外因

主要有營(yíng)養(yǎng)條件（無(wú)機(jī)鹽、有機(jī)物、植物激素和天然復(fù)合物等）和環(huán)境條件（滲透壓、光照、溫度、濕度和pH等）。

[資料1]在快速繁殖顫楊時(shí)，如果我們將一個(gè)枝條平均分成三段，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，靠近頂端的那一段枝條的側(cè)芽離體培養(yǎng)時(shí)繁殖系數(shù)最高，中間的次之，基部的最低。

結(jié)論：外植體在植株上的著生位置對(duì)其脫分化及再分化有一定的影響。

[資料2]在MS培養(yǎng)基中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5mg/L的6-BA和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5mg/L的NAA，可誘導(dǎo)胡蘿卜形成愈傷組織；在MS培養(yǎng)基中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2mg/L的KT（激動(dòng)素）和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2mg/L的NAA，可誘導(dǎo)胡蘿卜生出叢芽；在MS培養(yǎng)基中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1mg/L的NAA，可誘導(dǎo)胡蘿卜生根。

結(jié)論：生長(zhǎng)素及細(xì)胞分裂素的比例可影響細(xì)胞的脫分化及再分化。

[資料3]將外植體培養(yǎng)在黑暗條件下，10天左右即可形成高度液泡化的愈傷組織，但是若將外植體培養(yǎng)在光照條件下，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞分化產(chǎn)生維管束等組織，而不形成愈傷組織。

結(jié)論：愈傷組織的形成需要避光。

[資料4]研究煙草組織培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，煙草芽的形成以28度為好，在12度以下，33度以上形成率均很低。

結(jié)論：脫分化及再分化都需要在適宜的溫度條件下進(jìn)行。

問(wèn)題二

大家都知道植物的全能性比動(dòng)物細(xì)胞容易得多，但植物組織培養(yǎng)也會(huì)受到許多因素的影響。浙科版選修3教材第23頁(yè)有一較大篇幅專(zhuān)門(mén)講了植物組織培養(yǎng)的影響因素（如下所示）。

選修3教材第23頁(yè)

影響植物組織培養(yǎng)全能性表現(xiàn)的因素有哪些？

典型試題解析

試題：（2018年4月浙江省選考試題）回答與基因工程和植物克隆有關(guān)的問(wèn)題。

（1）將含某抗蟲(chóng)基因的載體和含卡那霉素抗性基因的載體pBI121均用限制性核酸內(nèi)切酶EcoR

I酶切，在切口處形成。選取含抗蟲(chóng)基因的DNA片段與切割后的pBI121用DNA連接酶連接。在兩個(gè)片段相鄰處形成，獲得重組質(zhì)粒。

（2）已知用CaCl2處理細(xì)菌，會(huì)改變其某些生理狀態(tài)。取CaCl2處理過(guò)的農(nóng)桿菌與重組質(zhì)粒在離心管內(nèi)進(jìn)行混合等操作，使重組質(zhì)粒進(jìn)入農(nóng)桿菌，完成實(shí)驗(yàn)。在離心管中加入液體培養(yǎng)基，置于搖床慢速培養(yǎng)一段時(shí)間，其目的是，從而表達(dá)卡那霉素抗性基因，并大量增殖。

（3）取田間不同品種水稻的幼胚，先進(jìn)行，然后接種到培養(yǎng)基中培養(yǎng)，幼胚發(fā)生

形成愈傷組織，并進(jìn)行繼代培養(yǎng)。用含重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌侵染愈傷組織，再培養(yǎng)愈傷組織，以便獲得抗蟲(chóng)的轉(zhuǎn)基因水稻。影響愈傷組織能否成功再生出植株的因素有：培養(yǎng)條件如光溫、培養(yǎng)基配方如植物激素配比、以及

（答2點(diǎn)即可）。

答案：

（1）粘性末端；磷酸二酯鍵

（2）轉(zhuǎn)化；使CaCl2處理過(guò)的農(nóng)桿菌恢復(fù)細(xì)胞的正常狀態(tài)

（3）消毒；脫分化；水稻的基因型、愈傷組織繼代的次數(shù)

解析：

（1）用限制性核酸內(nèi)切酶EcoR

I酶切含某抗蟲(chóng)基因的載體和含卡那霉素抗性基因的載體pBI121，可在切口處形成黏性末端。用DNA連接酶連接含抗蟲(chóng)基因的DNA片段與切割后的pBI121，可在兩個(gè)片段相鄰處形成磷酸二酯鍵，獲得重組質(zhì)粒。

（2）取CaCl2處理過(guò)的農(nóng)桿菌與重組質(zhì)粒在離心管內(nèi)進(jìn)行混合等操作，使重組質(zhì)粒進(jìn)入農(nóng)桿菌，完成轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。在離心管中加入液體培養(yǎng)基，置于搖床慢速培養(yǎng)一段時(shí)間，其目的是：使CaCl2處理過(guò)的農(nóng)桿菌恢復(fù)細(xì)胞的正常狀態(tài)。

（3）在進(jìn)行植物組織培養(yǎng)時(shí)，取田間不同品種水稻的幼胚，先進(jìn)行消毒，以清除其表面附著的微生物；然后接種到培養(yǎng)基中培養(yǎng)，幼胚發(fā)生脫分化形成愈傷組織，并進(jìn)行繼代培養(yǎng)。影響愈傷組織能否成功再生出植株的因素有:培養(yǎng)條件如光溫、培養(yǎng)基配方如植物激素配比、以及水稻的基因型、愈傷組織繼代的次數(shù)等。

植物組織培養(yǎng)影響因素

在植物離體培養(yǎng)過(guò)程中，影響植物細(xì)胞形態(tài)發(fā)生的因素有外因和內(nèi)因。外因是培養(yǎng)植物細(xì)胞的培養(yǎng)基和環(huán)境條件。內(nèi)因是植物細(xì)胞遺傳性和生理狀態(tài)。

1.培養(yǎng)基與環(huán)境條件

（1）培養(yǎng)基

培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)類(lèi)物質(zhì)對(duì)植物細(xì)胞形態(tài)的發(fā)生有較大的影響。在對(duì)根和芽分化的研究中發(fā)現(xiàn)，根或芽分化取決于生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素的配比，這就是著名的控制器官分化的激素模式（如圖）。

一般情況下，對(duì)器官的發(fā)生不僅取決于兩種激素的配比，還與濃度有關(guān)。當(dāng)然，其他激素也有一定的作用。

培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分對(duì)器官分化和胚狀體的形成也有重要的作用。例如，生根培養(yǎng)對(duì)無(wú)機(jī)鹽離子的要求要低一些，常用減半的MS培養(yǎng)基。糖的種類(lèi)和濃度也影響器官分化和胚狀體的發(fā)生。

培養(yǎng)基的物理性質(zhì)，如pH、滲透壓、固態(tài)或液態(tài)對(duì)細(xì)胞形態(tài)的發(fā)生也有影響。培養(yǎng)基滲透壓是影響植物形態(tài)發(fā)生的重要因素，而糖對(duì)培養(yǎng)基滲透壓起決定作用。

（2）環(huán)境條件

光照和溫度對(duì)器官分化和胚狀體形成有重要影響。不同的組織培養(yǎng)對(duì)光的要求不同，影響器官分化和胚狀體形成的光包括光強(qiáng)、光周期和光質(zhì)。通常許多培養(yǎng)物需要1000－1500lx光強(qiáng)。光照長(zhǎng)度對(duì)正常光周期反應(yīng)的植物器官分化有影響。不同光質(zhì)中，紅光有利于光生長(zhǎng)。

一般培養(yǎng)的溫度25度左右，溫度在適當(dāng)范圍內(nèi)高低變化對(duì)器官發(fā)生的數(shù)量和質(zhì)量有影響。

2.培養(yǎng)材料的生理?xiàng)l件

（1）器官的組織類(lèi)型

不同植物的器官組織產(chǎn)生的愈傷組織器官分化明顯不同，且差異很大。這是有材料的基因型決定的，如胡蘿卜、煙草等培養(yǎng)物容易誘導(dǎo)器官形成，而棉花、豆類(lèi)等較難。同種植物不同器官組織形成的愈傷組織，一般在器官發(fā)生上差異不顯著。

（2）個(gè)體發(fā)育的年齡

外植體幼嫩比較容易形成愈傷組織，也容易誘導(dǎo)器官分化。

（3）愈傷組織生理狀態(tài)

愈傷組織年齡對(duì)器官分化也有影響，一般愈傷組織繼代次數(shù)越多，器官的分化能力越低。