第一篇：《園藝植物組織培養(yǎng)實驗》教學(xué)大綱

《園藝植物組織培養(yǎng)實驗》教學(xué)大綱

課程編號：131010418s 適用專業(yè)：園藝專業(yè) 學(xué)時數(shù)：9 學(xué)分數(shù)：0.5 執(zhí)筆者：董華芳

編寫日期：2006年8月

一、課程的性質(zhì)和目的

《園藝植物組織培養(yǎng)實驗》園藝專業(yè)的必修課程，本課程任務(wù)是教授植物組織培養(yǎng)基本實驗技術(shù)及基礎(chǔ)理論，并培養(yǎng)學(xué)生運用所學(xué)知識和實驗方法進行實驗研究的能力，為學(xué)生以后從事相關(guān)工作或研究打下堅實基礎(chǔ)。

二、課程的教學(xué)內(nèi)容要求及學(xué)時分配

實驗一 玻璃器皿、用具和器械的洗滌和滅菌（1學(xué)時）

內(nèi)容要求：

學(xué)會正確洗滌玻璃器皿、用具，使之達到實驗的要求；學(xué)會正確使用高壓滅菌鍋，并對玻璃器皿、用具和器械的進行正確的滅菌。

教學(xué)要求：

掌握洗滌實驗用具和高壓滅菌的正確方法。實驗報告的要求：

寫出洗滌實驗用品的步驟和正確使用高壓滅菌的方法。

實驗二 母液的配制（2學(xué)時）

內(nèi)容要求：

學(xué)會使用1/10000精度的分析天平和電子天平。

學(xué)會正確配置貯備液，包括藥品的溶解、混藥的順序。教學(xué)要求：

掌握貯備液的配置方法。實驗報告的要求：

寫出配置貯備液的正確步驟并說明此實驗應(yīng)該注意的問題

實驗三 培養(yǎng)基的配制（2學(xué)時）

內(nèi)容要求：

學(xué)會熬制培養(yǎng)基。

學(xué)會正確分裝培養(yǎng)基及封口培養(yǎng)瓶。

培養(yǎng)基的正確滅菌。教學(xué)要求：

通過培養(yǎng)基的正確配置及滅菌，使我們對培養(yǎng)基的成分與性質(zhì)更加清楚，從而更好的利用它。

實驗報告的要求：

（1）寫出配置培養(yǎng)基的正確步驟

（2）試比較培養(yǎng)基的滅菌和玻璃器皿的滅菌有什么不同。

實驗四 植物莖尖快速繁殖技術(shù)（4學(xué)時）

內(nèi)容要求：

要求學(xué)生掌握植物快速繁殖的程序和操作方法，包括外植體的消毒、接種、繼代培養(yǎng)及污染原因的分析及控制方法。教學(xué)要求：

掌握莖尖剝離技術(shù)。實驗報告的要求： 寫出植物快速繁殖的程序和操作方法，包括外植體的消毒、接種、繼代培養(yǎng)及污染原因的分析及控制方法。

三、課程成績的考核辦法

實驗成績是由實驗指導(dǎo)教師依據(jù)學(xué)生在實驗中的表現(xiàn)，實驗完成情況以及撰寫實驗報告情況等綜合評定。每次實驗成績評定等級依次為：A、B、C、D等。

四、參考教材

1.《園藝植物離體培養(yǎng)學(xué)》，陳振光主編，中國農(nóng)業(yè)出版社，1996年 2.《園藝植物組織培養(yǎng)實驗指導(dǎo)書》，姜玲編, 1992年

第二篇：園藝植物栽培學(xué)教學(xué)大綱

《園藝植物栽培學(xué)》理論課程教學(xué)大綱

課程名稱： 園藝植物栽培學(xué)

課程類型: 專業(yè)基礎(chǔ)課 總 學(xué) 時： 45 學(xué)

分： 3 適用對象: 園藝專業(yè) 先修課程：植物學(xué)

一、課程性質(zhì)、目的和任務(wù)

園藝植物栽培學(xué)是園藝學(xué)的分支之一，主要研究園藝植物的栽培管理技術(shù)，是園藝生產(chǎn)的主要理論基礎(chǔ)。園藝植物栽培學(xué)著重闡述園藝植物栽培的基本原理，包括生長發(fā)育規(guī)律、園藝植物的繁殖、種植園的規(guī)劃設(shè)計和種植制度、栽培技術(shù)運用等原理。通過對本課程的學(xué)習(xí)，能夠掌握園藝品種資源的地理分布和栽培的適宜環(huán)境條件，能進行種植園的規(guī)劃設(shè)計，能掌握園藝植物的栽培管理技術(shù)等，勝任農(nóng)業(yè)科教、技術(shù)推廣等部門工作。

二、教學(xué)基本要求

了解園藝生產(chǎn)產(chǎn)業(yè)（園藝業(yè)）的內(nèi)涵及其在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)中的地位和作用，園藝植物資源的分類、分布及利用，掌握園藝植物的生長發(fā)育規(guī)律及其對環(huán)境條件的需求，通曉種植園的規(guī)劃設(shè)計及施工，能建立適應(yīng)當(dāng)?shù)貤l件的種植制度，通曉園藝植物栽培技術(shù)，并完整地掌握好某一類園藝植物的栽培技術(shù)。

三、課程的重點和難點

教學(xué)重點：園藝植物的生長發(fā)育規(guī)律，特別是以花、果和種子為最終產(chǎn)品的園藝植物的成花和座果機理；環(huán)境條件對園藝植物的影響；園藝植物的土肥水管理，特別是無土栽培、有機栽培和節(jié)水栽培植物的土肥水管理；園藝植物株形的培養(yǎng)與維護，特別是多年生植物的整形與修剪；設(shè)施栽培技術(shù)的應(yīng)用等。

教學(xué)難點：園藝植物的生長發(fā)育規(guī)律，特別是以花、果和種子為最終產(chǎn)品的園藝植物的成花和座果機理；提高園藝植物產(chǎn)量、品質(zhì)和栽培效益的關(guān)鍵栽培技術(shù)的綜合運用和優(yōu)化。

四、教學(xué)內(nèi)容、要求及學(xué)時分配

1．緒論（共4學(xué)時）

1.1園藝業(yè)發(fā)展簡史和現(xiàn)狀 了解 0.5 1.2園藝植物栽培的重要意義 了解 0.5 1.3園藝業(yè)發(fā)展前景和當(dāng)前的幾個熱點 理解 0.5 1.4園藝植物資源和分類 掌握 2 1.5觀賞園藝植物（含草坪草）的分類 掌握 0.5 2．園藝植物的生長發(fā)育（共12學(xué)時）2.1營養(yǎng)生長 理解 4 2.2生殖生長 掌握 4 2.3生長發(fā)育與環(huán)境條件 理解 2 2.4器官生長相關(guān)性 理解 1 2.5生長發(fā)育周期 掌握 1

3．園藝植物種植園的規(guī)劃設(shè)計和種植制度（共2學(xué)時）3.1種植園規(guī)劃設(shè)計 了解 0.5 3.2種植制度 理解 0.5 3.3園藝生產(chǎn)計劃的制定和實施 了解 0.5 3.4園藝生產(chǎn)技術(shù)檔案的建立和利用 了解 0.5 4．園藝植物的繁殖（共10學(xué)時）4.1育苗場地的條件與規(guī)劃 了解 0.5 4.2種子繁殖 理解 2 4.3嫁接繁殖 掌握 4 4.4扦插繁殖 掌握 1 4.5壓條繁殖 掌握 1 4.6分生繁殖 掌握 1 4.7組織培養(yǎng)及無病毒種苗繁殖 了解 0.5 5．園藝植物的定植（共2學(xué)時）5.1定植時期 掌握 0.5 5.2定植密度和定植方式 理解 0.5 5.3定植前種苗的準(zhǔn)備和整地 理解 0.5 5.4定植與定植后管理 理解 0.5 6．種植園的土肥水管理（共2學(xué)時）6.1土壤耕作方法 掌握 0.5 6.2土壤改良及消毒 掌握 0.5 6.3營養(yǎng)和施肥 掌握 0.5 6.4灌溉、排水和節(jié)水栽培 掌握 0.5 7．園藝植物的植株管理（共6學(xué)時）7.1植株生長控制的目的和意義 理解 0.5 7.2果樹與觀賞樹木的修剪技術(shù) 掌握 2 7.3果樹與觀賞樹木的樹形 掌握 2 7.4果樹修剪的實施 掌握 0.5 7.5草本植物的植株調(diào)整技術(shù) 掌握 0.5 7.6植物的觀賞應(yīng)用與造型 掌握 0.5 8．園藝植物產(chǎn)品器官管理（共4學(xué)時）8.1根用類園藝產(chǎn)品器官管理 掌握 0.5 8.2莖、葉用類園藝產(chǎn)品器官管理 掌握 0.5 8.3花類園藝產(chǎn)品器官管理 掌握 0.5 8.4果實類園藝植物產(chǎn)品器官管理 掌握 0.5 9．園藝產(chǎn)品的采收及采后管理（共2學(xué)時）9.1園藝產(chǎn)品的采收、分級、包裝 掌握 1 9.2貯藏原理與貯藏方法 了解 0.5 9.4其他采后處理措施、運輸、切花了解 掌握0.5 3 10.課程總結(jié)復(fù)習(xí)（共1學(xué)時）

五、考核方式

期末閉卷考試，考試范圍與分數(shù)比例如下：（1）緒論 2%（2）種類與分布 4%（3）生長發(fā)育 30%（4）規(guī)劃設(shè)計和種植制度 4%（5）繁殖 30%（6）定植 2%（7）土肥水管理 4%（8）植株管理20%（9）產(chǎn)品器官管理 2%（10）采收及采后管理 2%

六、推薦教材和教學(xué)參考書（黑體，小4號字）

1．教材：

李光晨，范雙喜主編《園藝植物栽培學(xué)——面向21世紀(jì)課程教材》,中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2007，第2版

2．參考資料：

（1）郗榮庭主編，果樹栽培學(xué)總論，農(nóng)業(yè)出版社，1999，第3版（2）浙江農(nóng)業(yè)大學(xué)主編，蔬菜栽培學(xué)總論，農(nóng)業(yè)出版社，1984，第2 版（3）劉海濤主編，花卉栽培基礎(chǔ)，廣東人民出版社，2001，第1版

大綱制訂人：王曉琴 制訂日期：2009-9-1

第三篇：植物組織培養(yǎng)論文

植物組織培養(yǎng)的發(fā)展及其應(yīng)用

劉兆書、王夢瑤、王瑞雄、尹樹明、左通通

（石河子大學(xué)，生命科學(xué)學(xué)院，新疆石河子，832000）

摘要:植物組織培養(yǎng)作為一種有效的技術(shù)手段已被廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)實踐的各個領(lǐng)域。本文從植物組織培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，總結(jié)了植物組織培養(yǎng)的發(fā)展歷史及發(fā)展現(xiàn)狀，重點介紹了組織培養(yǎng)技術(shù)在育種和脫毒快繁方面的應(yīng)用，為今后植物組織培養(yǎng)的進一步發(fā)展和應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：植物組織培養(yǎng)；發(fā)展；快繁；脫毒；育種

德國的植物生理學(xué)家Haberlandt提出細胞全能性理論以后，在無數(shù)科學(xué)家的努力下，植物組織培養(yǎng)經(jīng)過近百年的發(fā)展歷程后，該技術(shù)日趨完善和成熟，得到了廣泛的應(yīng)用。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，研究領(lǐng)域的不斷拓展與深入，植物組織培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用也越發(fā)的廣泛。育種方面的應(yīng)用非常廣泛，已經(jīng)形成了一門理論和技術(shù)；在工廠化育苗方面，產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟及社會價值;同時植物組織培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展也促進設(shè)施農(nóng)業(yè)、食品、工業(yè)、醫(yī)藥業(yè)等領(lǐng)域發(fā)展，現(xiàn)就植物組織培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用作簡單總結(jié)。

1、植物組織培養(yǎng)的發(fā)展

1.1植物組織培養(yǎng)的發(fā)展歷史

1838-1839年，德國的植物學(xué)家T.Schleidon和動物學(xué)家T.Schwann提出細胞學(xué)說。1902年德國的植物學(xué)家Haberlandt提出:高等植物的器官和組織，具有植物細胞全能性。1904年Harming在無機鹽和蔗糖溶液中對蘿卜和辣根菜的胚進行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)離體胚可以發(fā)育成熟，并提前萌發(fā)成小苗。1937年White發(fā)現(xiàn)了B族維生素，建立了第一個由已知化合物組成的培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基被定名為White培養(yǎng)基。同時法國的Gautherer和Nobecourt也發(fā)現(xiàn)了B族維生素的重要性，三個人被譽為植物組織培養(yǎng)學(xué)科的奠基人。1952年Morel和Martin通過莖尖分生組織的離體培養(yǎng)，從已受病毒侵染的大麗花中首次獲得脫毒植株。1953-1954年Muir利用震蕩培養(yǎng)和機械方法獲得了萬壽菊和煙草的單細胞，實施了看護培養(yǎng)，使單細胞培養(yǎng)獲得了成功。1957年Skoog和Miller提出生長素和細胞分裂素控制器官形成。1958年英國學(xué)者Steward通過體細胞胚胎發(fā)生途徑獲得了人工體細胞胚，這一實驗證實了Haberlandt的細胞全能性理論。到20世紀(jì)60年代組織培養(yǎng)進入快速發(fā)展階段，在基礎(chǔ)理論、實際操作方面不斷取得進展，比如在植物體細胞雜交、單倍體育種、種質(zhì)資源保存、快速育苗、人工種子制造、次生代謝物生產(chǎn)等方面取得了可喜的成果。

1.2植物組織培養(yǎng)發(fā)展現(xiàn)狀

1.2.1國內(nèi)的研究發(fā)展現(xiàn)狀 我國的組織培養(yǎng)與國外相比起步相對較晚，但發(fā)展卻比較快。20世紀(jì)70年代我國掀起了單倍體育種的高潮，在作物育種上取得了一些實用性的成果。據(jù)不完全統(tǒng)計，目前我國用花藥或花粉育出的植物已超過22科52屬160種。目前我國組培已經(jīng)進入了生產(chǎn)階段，實現(xiàn)了花卉、果樹、蔬菜等100多個品種的工廠化生產(chǎn)?；ɑ艹隹谀陝?chuàng)匯達800多萬美元。

1.2.2國外植物組織培養(yǎng)的研究發(fā)展現(xiàn)狀 國外的組培發(fā)展的比較快，20世紀(jì)70年代在美國形成了蘭花產(chǎn)業(yè)。80年代后，以商品為目的的組培苗生產(chǎn)量以20%-30%的速度遞增，年產(chǎn)組培苗在10萬株以上的植物微繁殖公司約占50%，年產(chǎn)量大于50萬株的公司約占25%，整個西歐年產(chǎn)組培苗達2億多株。

2、工廠化植物快繁及脫毒方面的應(yīng)用

組織培養(yǎng)技術(shù)有幾乎不受地理環(huán)境和季節(jié)的限制、遺傳背景一致、生長周期短、成本低等諸多優(yōu)點。同時，結(jié)合莖尖培養(yǎng)方法可以去除植物病毒、使植物復(fù)壯、提高質(zhì)量和產(chǎn)量，所以，離體快繁和植物脫毒是目前植物組織培養(yǎng)應(yīng)用最廣泛的一個方面，尤其在蘭花、名貴樹種、馬鈴薯、草毒等無性繁殖為主的植物顯的更是尤為重要。據(jù)估計，目前全球有關(guān)生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的年交易額約為1 500億美元，其中50%一60%與農(nóng)業(yè)有關(guān)。植物組培苗的貿(mào)易額約占總額的10%，即150億美元，并以每年15%速度遞增。

在我國，離體快繁育苗技術(shù)的開發(fā)應(yīng)用起步于20世紀(jì)80年代初。如華樂種苗有限公司，年生產(chǎn)能力在500萬株以上蘭花克隆苗，主要出口日本、美國、荷蘭、德國等，北京杉友蘭業(yè)生物科技有限公司，年生產(chǎn)能力為350萬株蘭花克隆苗，連云港振興恒巨生物科技有限公司，年生產(chǎn)蝴蝶蘭克隆苗3 000萬株，產(chǎn)品遠銷歐洲、美洲、亞洲等十多個國家和地區(qū)。據(jù)不完全統(tǒng)計植物快繁涉及觀賞植物、蔬菜、果樹、藥材等300種以上，其中觀賞園藝植物約200種，約占60%。在脫毒方面，如通過脫毒的馬鈴薯、甘蔗、甘薯、大蒜、草毒、香蕉平均可以增產(chǎn)30%以上，蘭花、水仙、康乃馨、大麗花通過脫毒后植株生長勢強、花色艷麗、花朵大、產(chǎn)量高。

3、在植物育種上的應(yīng)用

植物組織培養(yǎng)技術(shù)對培育優(yōu)良作物品種開辟了全新的途徑。目前，國內(nèi)外已把植物組織培養(yǎng)普遍應(yīng)用于作物育種，并在單倍體育種、胚胎育種、細胞融合育種、細胞突變育種、基因工程育種等方面取得了較大進展。3.1單倍體培養(yǎng)育種

通過對植物的花藥、花粉、未受精的子房或胚珠進行組織培養(yǎng)獲得單倍體(其中以花藥和花粉培養(yǎng)應(yīng)用最為廣泛)，單倍體在培養(yǎng)過程中利用秋水仙素處理，可使染色體加倍，成為純合二倍體植株，這種培養(yǎng)技術(shù)在育種上的應(yīng)用稱為單倍體育種。研究表明，常規(guī)育種一般需要8-10 天或更長的時間，而通過單倍體進行育種一般僅需要4-5 天的時間，單倍體育種具有程序簡單、育種周期短、基因型一次純合等優(yōu)點，單倍體育種是常規(guī)育種程序和方法的重大改革，尤其在林業(yè)等生長周期長的物種中效果更為顯著。因此，單倍體育種在國際上引起了很大的重視，各國紛紛開展單倍體育種方面的研究工作。3.2胚胎培養(yǎng)育種

植物的胚(包括成熟胚和幼胚)、胚珠、子房和胚乳的離體培養(yǎng)技術(shù)統(tǒng)稱為胚胎培養(yǎng)，其應(yīng)用領(lǐng)域主要包括胚胎發(fā)育機理、克服雜交不親合、胚胎拯救、克服自交不親和、克服珠心胚的干擾、打破種子體眠、獲得體細胞胚和人工種子等方面，因此在農(nóng)作物、園藝作物、林木和藥用植物上有著廣泛應(yīng)用。

在克服雜交不親合、克服自交不親和方面主要通過植物離體受精來實現(xiàn)，在廣義上通過離體柱頭授粉、離體子房授粉、離體胚珠授粉、離體精細胞和卵細胞融合等均稱做植物離體受精。但嚴(yán)格意義上的離體受精或試管受精是20世紀(jì)90年代精、卵離體融合成功。該技術(shù)不僅可以克服植物授粉不親和問題，還可以進行胚胎、種子和果實發(fā)育機理等基礎(chǔ)研究。人工分離的精細胞和卵細胞融合后進行合子胚培養(yǎng)，已在玉米、藥用牡丹、嬰粟、煙草等植物上獲得成功。植物離體受精技術(shù)是植物細胞工程中的重要實驗技術(shù)，為研究植物胚胎發(fā)育機理提供了新的實驗系統(tǒng)，為開發(fā)新的植物轉(zhuǎn)基因途徑提供了可能。

胚培養(yǎng)在打破種子體眠應(yīng)用較為廣泛，種子體眠的原因很多，利用組織培養(yǎng)方式打破種子體眠一般有種胚發(fā)育不全或種子含抑制物抑制種胚發(fā)芽2種情況，如胚乳發(fā)育尚不完全的蘭科種子可以通過組織培養(yǎng)的方式獲得再生植棵，而鶯尾屬、薔薇科、野麥等植物可以通過組織培養(yǎng)的方式打破抑制物對種子發(fā)芽的影響。另外，胚培養(yǎng)還可以應(yīng)用于胚胎拯救。

胚乳培養(yǎng)的主要目的是獲得具有利用價值的三倍體植株，再經(jīng)過染色體加倍獲得六倍體，從而育出多倍體新品種。目前有40多種植物的胚乳培養(yǎng)達到了不同程度的細胞分化或器官分化，不少植物已獲得了再生植株。我國在馬鈴薯、小麥、水稻、蘋果、桃、稱猴桃等多種植物上得到了胚乳再生植株。同時，胚乳培養(yǎng)產(chǎn)生的混倍體，可用于染色體工程方面的研究。3.3細胞融合培養(yǎng)育種

細胞融合所使用的材料一般是指利用除去植物細胞壁的裸露細胞即原生質(zhì)體，通過原生質(zhì)體融合，可克服種、屬以上植物有性雜交不親和性障礙，為廣泛重組遺傳物質(zhì)開辟了新途徑。同時，因去壁后的原生質(zhì)體消除了核酶等對外源DN A的破壞，為攜帶外源遺傳物質(zhì)的大分子滲入細胞創(chuàng)造條伴。另外，在有些沒有有性生殖能力或其有性生殖能力很低(如香蕉、木薯、馬鈴薯、甘蔗等)的植物作物改良中，體細胞雜交具有不可取代的重要性。通過大量的研究認為葉肉組織分離的原生質(zhì)體較好，遺傳性較為一致。在原生質(zhì)體融合方面主要有物理(如電融合)、化學(xué)(如高PIE高鈣、聚乙二醇)、生物(如仙臺病毒)等融合方式。3.4細胞突變體育種

在研究中發(fā)現(xiàn)，通過愈傷組織獲得的再生植株中常常出現(xiàn)基因型變異。這是因為無論是愈傷組織還是細胞培養(yǎng)，培養(yǎng)細胞均處在不斷分生狀態(tài)，容易受培養(yǎng)條件和外界環(huán)境(如物理因素、化學(xué)物質(zhì)等)的影響而產(chǎn)生誘變。利用這一特點結(jié)合人工誘變方法包括物理誘變(Y射線、X射線、電子束、離子束、激光、紫外線等)、化學(xué)誘變(甲基磺酸乙醋、秋水仙素、疊氮化鈉、平陽霉素、52BU ,EB等)和生物誘變(轉(zhuǎn)座子插入突變、跳躍基因等)獲得了一大批植物新品種和新材料。目前，這種方法已篩選出抗病、抗鹽、高賴氨酸、高蛋白、矮稈高產(chǎn)的植物突變體。

3.5基因工程育種

通過基因槍或農(nóng)桿菌進行植物基因工程育種的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一是建立一個高效的組織培養(yǎng)再生體系。植物遺傳轉(zhuǎn)化的理想受體系統(tǒng)應(yīng)具有高效穩(wěn)定的再生能力，研究認為用于基因轉(zhuǎn)化的受體系統(tǒng)，應(yīng)具有80%-90%的再生頻率，且每個外植體必須具有能再生的叢生芽，其芽數(shù)量越多越好。目前，用于遺傳轉(zhuǎn)化的受體主要有二種途徑，一是外植體在激素的誘導(dǎo)下產(chǎn)生愈傷組織后再培養(yǎng)成體細胞胚即體細胞胚發(fā)生途徑，二是誘導(dǎo)外植體產(chǎn)生單極性不定芽后再培養(yǎng)生成完整的再生植株即器官發(fā)生途徑。目前，與組培技術(shù)結(jié)合的轉(zhuǎn)基因的方法主要有農(nóng)桿菌介導(dǎo)和基因槍兩種方法。

參考文獻：

[1]郝玉華.我國植物組織培養(yǎng)的發(fā)展現(xiàn)狀與前景展望[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008（4）:20-23.[2]盛玉婷.植物組織培養(yǎng)技術(shù)及應(yīng)用進展[J].安徽農(nóng)學(xué)通報.2008(9):45-47.[3]李永欣,工義強.植物組織培養(yǎng)的應(yīng)用研究概述[J].江蘇林業(yè)科技,2005,32(3):44-46.[4]王家麟.植物組織培養(yǎng)及其應(yīng)用研究概況[J].黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006(3):86-89.[5]陳長征.植物組織培養(yǎng)脫毒快繁實驗技術(shù)綜述[J].安徽農(nóng)學(xué)通報，2010,16（14）:56-58.[6]梁一池,楊華.植物組織培養(yǎng)技術(shù)的研究進展[J].福建林學(xué)院學(xué)報.2002(8):23-26.

第四篇：《園藝植物生物技術(shù)》實驗教案

實驗一 現(xiàn)代生物技術(shù)實驗室與實驗儀器

一、實驗?zāi)康?/p>

實驗室和實驗儀器是開展現(xiàn)代生物技術(shù)研究的基礎(chǔ)平臺，對實驗室布局和儀器配置的掌握程度是學(xué)生知識結(jié)構(gòu)完整性的重要體現(xiàn)。通過現(xiàn)場參觀和老師講解加深同學(xué)們對現(xiàn)代分子生物學(xué)實驗室的規(guī)劃與布局及常用儀器設(shè)備的主要功能的認識，掌握高速冷凍離心機、PCR儀、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)等關(guān)鍵儀器的使用方法。

二、實驗場所選擇及實驗內(nèi)容

園藝學(xué)院植物分子生物技術(shù)實驗室與開展現(xiàn)代生物技術(shù)研究直接相關(guān)的實驗室分工與布局和主要相關(guān)儀器：如與組織培養(yǎng)有關(guān)的超凈工作臺、高壓滅菌鍋、接種至、培養(yǎng)室等；與分子生物學(xué)有關(guān)的高速冷凍離心機、PCR儀、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)等。

三、實驗方法與步驟

1、相關(guān)背景知識回顧：對課堂講述的各種生物技術(shù)如分子標(biāo)記、細胞和組織培養(yǎng)等操作過程進行回顧，重要指出每個環(huán)節(jié)要用到的必備儀器的作用、性能指標(biāo)、操作注意事項及儀器選購中應(yīng)注意的問題等。

2、每班分為兩小組簡要介紹現(xiàn)代生物技術(shù)實驗室的布局及功能分區(qū)情況；針對每個分區(qū)的重要儀器進行講述，結(jié)束時對所有參觀內(nèi)容進行簡要總結(jié)，并回答同學(xué)們的提問。

四、實驗注意事項

實驗有很多易損儀器或有毒試劑，參觀時要求同學(xué)們認真記錄，不要隨意動手，以保證儀器和人身安全。

五、思考題

1、根據(jù)參觀內(nèi)容，描述本次參觀有了解到的主要儀器的名稱、用途及使用中的注意事項。

2、一個現(xiàn)代化生物技術(shù)實驗室應(yīng)具備的基本功能的必備儀器有哪些？實驗二 質(zhì)粒DNA的提取、純化及檢測

一、實驗?zāi)康?/p>

質(zhì)粒是攜帶外源基因進入細菌中擴增或表達的主要載體，它在基因操作中具有重要作用。質(zhì)粒的分離與提取時最常用、最基本的實驗技術(shù)。質(zhì)粒的提取方法很多，大多包括3個主要步驟：細菌的培養(yǎng)、細菌的收集和裂解、質(zhì)粒DNA的分離和純化。本實驗以堿裂解法為例介紹質(zhì)粒的抽提過程，應(yīng)掌握堿裂解法抽提質(zhì)粒的原理、步驟及各試劑的作用。

二、實驗原理 在pH 12.0-12.6堿性環(huán)境中，細菌的線性大分子量染色體DNA變性分開，而共價閉環(huán)的質(zhì)粒DNA雖然變性但仍處于拓撲纏繞狀態(tài)。將pH調(diào)至中性并有高鹽存在及低溫的條件下，大部分染色體DNA、大分子量RNA和蛋白質(zhì)在去污劑SDS的作用下形成沉淀，而質(zhì)粒DNA仍然為可溶狀態(tài)。通過離心，可除去大部分細胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質(zhì)，質(zhì)粒DNA尚在上清液中，然后用酚、氯仿抽提進一步純化質(zhì)粒DNA。

三、主要儀器及試材

含有質(zhì)粒pUC18載體的大腸桿菌菌液及離心機、移液槍、離心管及質(zhì)粒DNA提取有關(guān)試劑。

液氮、及DNA提取有關(guān)試劑。

四、實驗方法與步驟

（一）試劑配制:

1、LB培養(yǎng)基:NaCl 10g，酵母提取物（Yeast extract）5g，蛋白胨（Peptone）10g，瓊脂粉15g，加ddH2O至1000ml。分裝至500ml三角瓶（250ml/瓶）。高壓滅菌15min，室溫貯存。

2、X-gal（20mg/ml）:20mg X-gal溶于1ml二甲基甲酰胺中，-20℃避光保存。

3、IPTG（200mg/ml）:1g IPTG溶于4ml去離子雙蒸水中，定容至5ml，過濾滅菌后-20℃保存。

4、Amp（100mg/ml）:1g Amp溶于4ml去離子滅菌雙蒸水中，定容至5ml，-20℃保存。

5、溶液I: 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl（pH 8.0），10mM EDTA（pH 8.0）。配制方法：1M Tris-HCl（pH 8.0）12.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。高壓滅菌15min，貯存于4℃。

6、溶液II:0.2N NaOH，1% SDS。配制方法：2N NaOH 1ml，10% SDS 1ml，加ddH2O至10ml，使用前臨時配制。

7、溶液III:醋酸鉀（KAc）緩沖液，pH 4.8。配制方法：5M KAc300ml，冰醋酸57.5ml，加ddH2O至500ml（視冰醋酸情況，也可按6:3:1配制），貯存于4℃。

8、TE:10mM Tris-HCl（pH 8.0），1mM EDTA（pH 8.0）。配制方法：1M Tris-HCl（pH 8.0）1ml，0.5M EDTA（pH 8.0）0.2ml，加ddH2O至100ml。高壓滅菌15min，貯存于4℃。

9、苯酚:氯仿:異戊醇（25:24:1）。

10、乙醇（無水乙醇、70%乙醇）。11、5×TBE:Tris-base 54g，硼酸27.5g，EDTA-Na·2H2O 4.65g，加ddH2O至1000ml。高壓滅菌15min，貯存于4℃。

12、溴化乙錠（EB）：10mg/ml

13、Rnase A（RNA酶A）:不含DNA酶（DNase-free）RNase A的10mg/ml，TE配制，沸水加熱15min，分裝貯存于-20℃。14、6×loading buffer（上樣緩沖液）:0.25%溴酚藍，0.25%二甲苯青FF，40%（W/V）蔗糖水溶液。15、1%瓊脂糖凝膠:稱取1g瓊脂糖與三角燒瓶中，加100ml 1×TBE，微波爐加熱至完全熔化，冷卻至60℃左右，加EB母液（10mg/ml）至終濃度0.5ug/ml（注意：EB為強誘變劑，操作時帶手套），輕輕搖勻，緩緩倒入架有梳子的電泳膠板中，勿使有氣泡，靜置冷卻30min以上，輕輕拔出梳子，放入電泳槽中（電泳緩沖液1×TBE），即可上樣。

（二）實驗步驟

1、取含有pUC18質(zhì)粒的大腸桿菌菌液于LB固體培養(yǎng)基上劃線37℃過夜培養(yǎng)。

2、用無菌牙簽或槍頭挑取LB固體培養(yǎng)基上生長的單菌落，接種于20ml含有Amp抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖床-250r/min過夜培養(yǎng)。

3、吸取1.5ml菌液，12000g離心1min，收集菌體，倒掉菌液；吸取1.5ml菌液，再次收集菌體，盡量將菌液倒干凈。

4、加入200ul預(yù)冷的溶液I，重新懸浮細胞，震蕩混勻（注意：應(yīng)徹底混勻沉淀或碎塊）。

5、加入400ul新配置的溶液II，輕柔顛倒混勻（不可劇烈震蕩），并將離心管置于冰上2-3min，使細胞膜裂解（溶液II為裂解液，故離心管中菌液逐漸變清）。

6、加入300ul預(yù)冷的溶液III，溫和顛倒混勻，見白色絮狀沉淀，置于冰上3-5min，使雜質(zhì)充分沉淀（溶液III為中和液，此時質(zhì)粒DNA復(fù)性，染色體和蛋白質(zhì)不可逆變性，形成不可溶復(fù)合物，同時K+使SDS-蛋白復(fù)合物沉淀）。

7、吸取800ul上清液（注意：不要吸到漂浮的雜質(zhì)）至另一Eppendorf管中，加入2/3體積的異丙醇或2.5倍體積的預(yù)冷無水乙醇，混勻，室溫放置5min，4℃離心12000g ×15min。

8、倒盡上清，加75%乙醇浸洗沉淀除鹽1-2次，4℃離心 10000g×10min，棄上清，將沉淀在室溫或超凈工作臺上風(fēng)干。

9、將沉淀溶于40ul 滅菌超純水或TE（含RNase A 20ug/ml），37℃水浴30min，以降解RAN，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

10、取制備的質(zhì)粒DNA 1-2ul，加適當(dāng)loading buffer混勻上樣，1%瓊脂糖凝膠2.5V/cm電泳1h進行檢測。

五、實驗注意事項

1、實驗中的液氮、氯仿、EB等都是有毒物質(zhì)，操作時應(yīng)注意防護，盡量減少臺面污染。

2、DAN電泳時只能由負極到正極，電泳時要注意電極是否正確。

3、質(zhì)粒電泳檢測一般有三條帶，分別為質(zhì)粒的超螺旋、開環(huán)、線型三種構(gòu)型。

六、思考題

簡述質(zhì)粒DAN提取的步驟。

實驗三 PCR技術(shù)

一、實驗?zāi)康?/p>

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）是一種體外核酸擴增系統(tǒng)，是分子克隆技術(shù)中常用技術(shù)之一。PCR具有反應(yīng)快速、靈敏、操作簡便等優(yōu)點，已廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)的各個領(lǐng)域。通過本實驗應(yīng)掌握PCR原理，學(xué)習(xí)PCR操作過程。

二、實驗原理

PCR是在模板DNA、引物和dNTPs的存在環(huán)境下依賴于DNA聚合酶的酶促反應(yīng)。PCR技術(shù)的特異性取決于引物和模板結(jié)合的特異性。反應(yīng)分為變性、退火、延伸三步，經(jīng)過一定的循環(huán)，介于兩個引物之間的特異DNA片段得到大量擴增。

三、主要儀器及試材

含有外源cDNA片段的質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)基因蘋果、番茄葉片總DNA；外源基因的特異引物及PCR儀與相關(guān)試劑。

四、實驗方法與步驟

1、調(diào)整模板濃度至5ng/ul。

2、按下列體系配制反應(yīng)混合液，混勻，離心5秒（注意加1滴礦物油覆蓋PCR管）。

Template DNA

2ul（20ng）10×buffer

2.0ul MgCl2（25mM）

1.5ul Primer F（10uM）

0.2ul Primer R（10uM）

0.2ul dNTPs（2mM）

2.0ul Taq（5U/ul）

0.2ul Add ddH2O to

20ul

3、PCR反應(yīng)循環(huán)條件設(shè)置：

95℃

3min

1cycle 94℃

1min

55℃

1min 72℃

90s

35cycles 72℃

10min

1cycle 4℃

forever

4、檢測：加2ul溴酚藍，混勻，短暫離心，取15ul反應(yīng)產(chǎn)物點樣電泳

5、在1%瓊脂糖凝膠上點樣電泳；EB染色，紫外觀察。

五、實驗注意事項

1、引物設(shè)計應(yīng)具有特異性，依靠引物設(shè)計軟件進行引物設(shè)計；引物分裝成多管，不宜反復(fù)凍融多次；

2、PCR反應(yīng)的各種成分不能遺漏，操作應(yīng)戴手套，冰上操作；

3、根據(jù)引物的Tm值和擴增片段長度以及PCR儀的特性來設(shè)定PCR循環(huán)條件；

4、注意分析電泳檢測PCR產(chǎn)物時出現(xiàn)拖帶或非特異性擴增帶、無DNA帶或DNA帶很弱的可能原因。

六、思考題

簡述PCR技術(shù)的原理和步驟。

第五篇：《園藝植物生物技術(shù)》實驗教案

《園藝植物生物技術(shù)》實驗教案

實驗一 現(xiàn)代生物技術(shù)實驗室與實驗儀器

一、實驗?zāi)康?/p>

實驗室和實驗儀器是開展現(xiàn)代生物技術(shù)研究的基礎(chǔ)平臺，對實驗室布局和儀器配置的掌握程度是學(xué)生知識結(jié)構(gòu)完整性的重要體現(xiàn)。通過現(xiàn)場參觀和老師講解加深同學(xué)們對現(xiàn)代分子生物學(xué)實驗室的規(guī)劃與布局及常用儀器設(shè)備的主要功能的認識，掌握高速冷凍離心機、PCR儀、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)等關(guān)鍵儀器的使用方法。

二、實驗場所選擇及實驗內(nèi)容

園藝學(xué)院植物分子生物技術(shù)實驗室與開展現(xiàn)代生物技術(shù)研究直接相關(guān)的實驗室分工與布局和主要相關(guān)儀器：如與組織培養(yǎng)有關(guān)的超凈工作臺、高壓滅菌鍋、接種至、培養(yǎng)室等；與分子生物學(xué)有關(guān)的高速冷凍離心機、PCR儀、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)等。

三、實驗方法與步驟

1、相關(guān)背景知識回顧：對課堂講述的各種生物技術(shù)如分子標(biāo)記、細胞和組織培養(yǎng)等操作過程進行回顧，重要指出每個環(huán)節(jié)要用到的必備儀器的作用、性能指標(biāo)、操作注意事項及儀器選購中應(yīng)注意的問題等。

2、每班分為兩小組簡要介紹現(xiàn)代生物技術(shù)實驗室的布局及功能分區(qū)情況；針對每個分區(qū)的重要儀器進行講述，結(jié)束時對所有參觀內(nèi)容進行簡要總結(jié)，并回答同學(xué)們的提問。

四、實驗注意事項

實驗有很多易損儀器或有毒試劑，參觀時要求同學(xué)們認真記錄，不要隨意動手，以保證儀器和人身安全。

五、思考題

1、根據(jù)參觀內(nèi)容，描述本次參觀有了解到的主要儀器的名稱、用途及使用中的注意事項。

2、一個現(xiàn)代化生物技術(shù)實驗室應(yīng)具備的基本功能的必備儀器有哪些？

實驗二 植物組織培養(yǎng)

一、實驗?zāi)康?/p>

植物組織培養(yǎng)是現(xiàn)代生物技術(shù)研究的重要技術(shù)手段，在原生質(zhì)體融合、病毒脫除、離體快繁及遺傳轉(zhuǎn)化等領(lǐng)域發(fā)揮著不可替代的作用。胡蘿卜以其培養(yǎng)體系成熟、再生容易而被視為組織培養(yǎng)的理想外植體材料，本實驗通過胡蘿卜的組織培養(yǎng)使同學(xué)們掌握基本培養(yǎng)基的配制、滅菌及培養(yǎng)的基本技能。

二、實驗原理

基于1902年德國科學(xué)家哈勃蘭特（Haberlandt）提出植物細胞的全能性理論，即指已分化的細胞仍然具有分化發(fā)育成新個體的潛能。在適宜的培養(yǎng)條件下，植物的細胞、組織或器官都具備再生成完整植物的能力。

三、主要儀器及試材

儀器：pH計、微波爐、高壓滅菌鍋、超凈工作臺、培養(yǎng)室、三角瓶、封口膜、無菌濾紙、手術(shù)刀片、鑷子、酒精燈、記號筆等

試材：新鮮胡蘿卜，培養(yǎng)基配制所需相關(guān)試劑

四、實驗方法與步驟

（一）培養(yǎng)基母液的配制（小規(guī)模實驗應(yīng)按比例減少，避免造成很大的浪費）：

1、大量元素(10倍液)：稱取下列藥品分別溶解定容到1升后，加到5升存儲瓶中。

KNO

395 g NH4NO3

82.5 g KH2PO

48.5 g MgSO4?7H2O

18.5 g CaCl2?2H2O

22.0 g 注意事項：

（1）配置母液前要仔細清洗存儲容器

（2）應(yīng)按照順序分別徹底溶解后混合，每加完一種藥品，搖動存儲瓶使其混合均勻；（3）溶解時最好加熱，以便充分溶解，避免沉淀的產(chǎn)生；

（4）夏季要用新制的蒸餾水，并加熱，這樣可以避免因為水中帶菌量過大而產(chǎn)生沉淀，同時可以減緩綠藻的生成；

（5）沉淀的產(chǎn)生一是由于溶解不充分就混合造成的渾濁型沉淀，所以配置時一定不要急；二是由于長菌而產(chǎn)生絮狀沉淀，所以要用新制的蒸餾水并加熱。

2、微量元素母液的配制(100倍液)：取少量(200-300ml)溫水依次加入下列藥品，每加一種藥品后攪拌溶解，最后定容到1L：

KI

0.083 g H3BO0.62 g ZnSO4*7H2O

0.86 g NaMoO4*2H2O

0.025 g CuSO4*5H2O

0.0025 g CoCl2*6H2O

0.0025 g

MnSO4*4H2O

2.23 g(MnSO4*H2O 1.69 g)注意：配好后在室溫下放置10 h以上再放入冰箱保存，即刻放入冰箱易產(chǎn)生結(jié)晶沉淀。配制過程中產(chǎn)生沉淀的原因有：1.前一個沒徹底溶解就加入了后一個藥品；2.蒸餾水pH 值過高，可加幾滴鹽酸校正。

3、甘氨酸和肌醇的配制(100倍液)：

甘氨酸：0.2 g溶解定容到1L；肌醇：10 g溶解定容到1L

4、鐵鹽的配制（100倍液）：

稱取EDTA 3.73 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 2.78 g，分別溶解后混合定容到1L，放入棕色細口瓶中，室溫放置10 h以上（防止結(jié)晶沉淀），然后放入4℃冰箱。

5、維生素B的配制（100倍液）：

VB組分 VB1(鹽酸硫氨素)VB6(鹽酸吡哆素)VB5(煙

酸)

改良MT 1g 1g 0.5g

MS 10 mg 50 mg 50 mg 分別稱取順序溶解在溫?zé)岬恼麴s水中，定容到1L。

注: 需要溶解完一個再加另一個；VB5不易溶解，需要攪拌，必要時可以加熱。

6、Vc的配制（100倍液）：

稱取Vc 0.5g 溶解在蒸餾水中，定容到1L即可。

7、其它溶液配制：

BA，NAA，IBA，GA3等激素類試劑可先用少量1N NaOH徹底溶解，再加水定容。配好后室溫放置一段時間，再放入冰箱中冷藏保存。有些試劑在乙醇或鹽酸中也可溶解，但比較而言，用堿溶解比較穩(wěn)定，不易產(chǎn)生沉淀。

注意：母液最好不要配制太多，如果配制的量較大，短時間內(nèi)用不完，最好分裝一部分到小的細口瓶中，在制作培養(yǎng)基時使用。這樣不容易產(chǎn)生沉淀。

（二）培養(yǎng)基配制

母液配好后，按以下體種（或質(zhì)量）量取，最后用蒸餾水定溶到1L,調(diào)節(jié)pH至5.8，用塑料燒杯放入微波爐中充分溶解后分裝滅菌。

大量元素(10倍液)

ml 微量元素(100倍)ml 甘氨酸和肌醇(100倍)

ml 鐵鹽（100倍）

ml 維生素B（100倍）ml Vc（100倍）

ml 蔗糖

g 瓊脂

7.5 g

（三）接種與培養(yǎng)

在超凈臺上接種后，用記號筆做好標(biāo)簽，放置到光照培養(yǎng)室中進行培養(yǎng)。

五、實驗注意事項

1、實驗中涉及到酒精及砷汞等危險品，注意人身安全的環(huán)境安全，廢液不要隨意亂倒。

2、外植體消毒及接種操作要規(guī)范，注意超凈臺的衛(wèi)生，養(yǎng)成良好的實驗習(xí)慣。

六、實驗結(jié)果處理

一星期后，統(tǒng)計污染率，并對未污染材料的生長狀況進行觀察，并分析產(chǎn)生污染的可能原因。

七、思考題

影響植物組織培養(yǎng)的因素有哪些？

主要參考文獻

1.張婭，曾君祉，周志勇，陳毓荃，黃華樑。胡蘿卜組織培養(yǎng)和高效遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立。植物學(xué)通報,2005，22:37-42。

2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國家重點實驗室柑橘課題組。實驗手冊，2002，武漢（課題組內(nèi)部資料）。實驗三 植物DNA的提取、純化及檢測

一、實驗?zāi)康?/p>

DNA 提取是開展分子生物學(xué)的重要前提之一，高質(zhì)量的DNA直接關(guān)系到分子標(biāo)記、基因克隆、圖譜構(gòu)建及功能基因組研究等工作的成敗。通過本實驗應(yīng)了解常用DNA提取方法的原理和技術(shù)，掌握改良CTAB法提取植物DNA以及DNA檢測技術(shù)，為將來從事園藝植物生物技術(shù)研究奠定基礎(chǔ)。

二、實驗原理

植物的遺傳物質(zhì)是DNA，植物細胞內(nèi)含有豐富的遺傳物質(zhì)。在機械研磨、高溫和去污劑的共同作用下，植物細胞破裂，DNA從細胞核釋放到提取緩沖液中。經(jīng)蛋白質(zhì)強變性劑處理結(jié)合離心，除去蛋白質(zhì)和色素等雜質(zhì)，再用乙醇沉淀便可獲得高純度的DNA。

DNA電泳是依據(jù)DNA帶負電荷，而不同濃度的瓊脂糖凝膠孔徑大小不同，在外加電場的作用下DNA由負極向正極移動，分子量小的移動快而分子量大的移動慢，最終達到不同分子量大小的DNA分離的目的。

三、主要儀器及試材

水浴鍋、離心機、移液槍、研缽、離心管、核酸電泳系統(tǒng)等；新鮮健康植物葉片，液氮、及DNA提取有關(guān)試劑。

四、實驗方法與步驟 1.藥品的配制: CTAB提取液：

(1)100 mM Tris-HCl(PH 8.0)，1.5 M NaCl，50 mM EDTA(PH 8.0)(2)1% PVP，2% CTAB(3)取少許(1)加到(2)中，攪拌成糊狀,后加(1)至足量，65℃水浴充分溶解備用。使用前要在65℃溫浴一會兒，然后加入1-4%巰基乙醇，混均勻。苯酚：氯仿：異戊醇（25∶24∶1）：

重蒸酚65℃水浴溶解，在燒杯中加入80ml溫?zé)岬恼麴s水，加入少許8-羥基喹啉，溶解后加入100ml重蒸酚，再加入100ml氯仿：異戊醇（24：1），加入20克Tris Base，磁力攪拌器上攪拌1.5 h左右至停止攪拌后很快分層，然后裝入棕色瓶中，4℃冰箱中儲存?zhèn)溆谩?.DNA的粗提

在裝有葉片的離心管中加入石英砂少許（約0.07克），用尖頭玻棒將材料研細后加入600 ul CTAB提取液，再繼續(xù)研磨一會兒使其懸浮均勻，然后在65℃水浴鍋中溫浴60分鐘，隔15分鐘取出上下輕輕顛倒幾次，水浴之后，加入500 ul苯酚：氯仿：異戊醇（25：24：1），上下晃動10分鐘以上，其間置于37℃水浴鍋中溫浴一會（冬季），使之充分混勻，然后10000-12000 rpm離心5-10分鐘，吸取上清液轉(zhuǎn)至另一離心管中，加入60 ul 5M NaCl，再加入-20℃冰凍無水乙醇1 ml，輕輕顛倒數(shù)次，混合均勻后冰凍30分鐘沉淀DNA，然后8000-10000 rpm離心5分鐘，棄上清液，加入1 ml 70%酒精浸泡2小時或過夜，8000 rpm離心5分鐘,棄酒精之后在工作臺上風(fēng)干DNA，注意不要過干，否則會使以后溶解困難。3.DNA的純化：

向風(fēng)干后的DNA中加入500 ul 1×TE，37℃水浴15-30分鐘至DNA完全溶解，加5 ul 5 mg/ml Rnase，37℃水浴6小時，然后加入700 μl苯酚：氯仿：異戊醇（25：24：1），上下顛倒離心管約10分鐘，至充分混勻，10000-12000 rpm離心5分鐘，吸取上層液至另一離心管中，加入700 μl氯仿：異戊醇（24：1），顛倒10分鐘（方法同上），10000 –12000 rpm離心5分鐘，吸取上層液至另一離心管中，加入60 μl 5M NaCl，再加入1 ml冷凍的無水乙醇，輕輕顛倒，然后在-20℃冰箱中置30分鐘沉淀DNA，8000-10000 rpm離心2-3分鐘，使DNA分散狀緊貼在管壁上，棄酒精，加70%酒精1ml浸泡，2小時后換一次，后浸泡過夜，8000 rpm離心3分鐘后棄酒精，風(fēng)干，加50-100 μl TE充分溶解備用。

4、DNA檢測

（1）取DNA原液15 μl稀釋至3.0 ml，用UV-1601型紫外分光光度計測定230 nm、260 nm及280 nm的吸光值。高質(zhì)量的DNA要求：A260/A230>2.0； 1.7

（3）向一定量的DNA中加入限制性內(nèi)切酶EcoR I至4-5 U/μg DNA，37℃消化過夜，用0.5×TBE，0.8%瓊脂糖凝膠2.5V/cm電泳3 h進行檢測。

五、實驗注意事項

1、實驗中的液氮、氯仿、苯酚、EB等都是危險或有毒物質(zhì)，操作時要戴手套，并在專門區(qū)域操作。

2、DAN電泳時只能由負極到正極，電泳時要注意電極是否正確。

六、思考題

簡述DAN提取的步驟及主要試劑的作用。

主要參考文獻

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國家重點實驗室柑橘課題組。實驗手冊，2002，武漢（課題組內(nèi)部資料）。實驗四 質(zhì)粒DNA的提取、純化及檢測

一、實驗?zāi)康?/p>

質(zhì)粒是攜帶外源基因進入細菌中擴增或表達的主要載體，它在基因操作中具有重要作用。質(zhì)粒的分離與提取時最常用、最基本的實驗技術(shù)。質(zhì)粒的提取方法很多，大多包括3個主要步驟：細菌的培養(yǎng)、細菌的收集和裂解、質(zhì)粒DNA的分離和純化。本實驗以堿裂解法為例介紹質(zhì)粒的抽提過程，應(yīng)掌握堿裂解法抽提質(zhì)粒的原理、步驟及各試劑的作用。

二、實驗原理 在pH 12.0-12.6堿性環(huán)境中，細菌的線性大分子量染色體DNA變性分開，而共價閉環(huán)的質(zhì)粒DNA雖然變性但仍處于拓撲纏繞狀態(tài)。將pH調(diào)至中性并有高鹽存在及低溫的條件下，大部分染色體DNA、大分子量RNA和蛋白質(zhì)在去污劑SDS的作用下形成沉淀，而質(zhì)粒DNA仍然為可溶狀態(tài)。通過離心，可除去大部分細胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質(zhì)，質(zhì)粒DNA尚在上清液中，然后用酚、氯仿抽提進一步純化質(zhì)粒DNA。

三、主要儀器及試材

含有質(zhì)粒pUC18載體的大腸桿菌菌液及離心機、移液槍、離心管及質(zhì)粒DNA提取有關(guān)試劑。

液氮、及DNA提取有關(guān)試劑。

四、實驗方法與步驟

（一）試劑配制:

1、LB培養(yǎng)基:NaCl 10g，酵母提取物（Yeast extract）5g，蛋白胨（Peptone）10g，瓊脂粉15g，加ddH2O至1000ml。分裝至500ml三角瓶（250ml/瓶）。高壓滅菌15min，室溫貯存。

2、X-gal（20mg/ml）:20mg X-gal溶于1ml二甲基甲酰胺中，-20℃避光保存。

3、IPTG（200mg/ml）:1g IPTG溶于4ml去離子雙蒸水中，定容至5ml，過濾滅菌后-20℃保存。

4、Amp（100mg/ml）:1g Amp溶于4ml去離子滅菌雙蒸水中，定容至5ml，-20℃保存。

5、溶液I: 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl（pH 8.0），10mM EDTA（pH 8.0）。配制方法：1M Tris-HCl（pH 8.0）12.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。高壓滅菌15min，貯存于4℃。

6、溶液II:0.2N NaOH，1% SDS。配制方法：2N NaOH 1ml，10% SDS 1ml，加ddH2O至10ml，使用前臨時配制。

7、溶液III:醋酸鉀（KAc）緩沖液，pH 4.8。配制方法：5M KAc300ml，冰醋酸57.5ml，加ddH2O至500ml（視冰醋酸情況，也可按6:3:1配制），貯存于4℃。

8、TE:10mM Tris-HCl（pH 8.0），1mM EDTA（pH 8.0）。配制方法：1M Tris-HCl（pH 8.0）1ml，0.5M EDTA（pH 8.0）0.2ml，加ddH2O至100ml。高壓滅菌15min，貯存于4℃。

9、苯酚:氯仿:異戊醇（25:24:1）。

10、乙醇（無水乙醇、70%乙醇）。11、5×TBE:Tris-base 54g，硼酸27.5g，EDTA-Na·2H2O 4.65g，加ddH2O至1000ml。高壓滅菌15min，貯存于4℃。

12、溴化乙錠（EB）：10mg/ml

13、Rnase A（RNA酶A）:不含DNA酶（DNase-free）RNase A的10mg/ml，TE配制，沸水加熱15min，分裝貯存于-20℃。14、6×loading buffer（上樣緩沖液）:0.25%溴酚藍，0.25%二甲苯青FF，40%（W/V）蔗糖水溶液。15、1%瓊脂糖凝膠:稱取1g瓊脂糖與三角燒瓶中，加100ml 1×TBE，微波爐加熱至完全熔化，冷卻至60℃左右，加EB母液（10mg/ml）至終濃度0.5ug/ml（注意：EB為強誘變劑，操作時帶手套），輕輕搖勻，緩緩倒入架有梳子的電泳膠板中，勿使有氣泡，靜置冷卻30min以上，輕輕拔出梳子，放入電泳槽中（電泳緩沖液1×TBE），即可上樣。

（二）實驗步驟

1、取含有pUC18質(zhì)粒的大腸桿菌菌液于LB固體培養(yǎng)基上劃線37℃過夜培養(yǎng)。

2、用無菌牙簽或槍頭挑取LB固體培養(yǎng)基上生長的單菌落，接種于20ml含有Amp抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖床-250r/min過夜培養(yǎng)。

3、吸取1.5ml菌液，12000g離心1min，收集菌體，倒掉菌液；吸取1.5ml菌液，再次收集菌體，盡量將菌液倒干凈。

4、加入200ul預(yù)冷的溶液I，重新懸浮細胞，震蕩混勻（注意：應(yīng)徹底混勻沉淀或碎塊）。

5、加入400ul新配置的溶液II，輕柔顛倒混勻（不可劇烈震蕩），并將離心管置于冰上2-3min，使細胞膜裂解（溶液II為裂解液，故離心管中菌液逐漸變清）。

6、加入300ul預(yù)冷的溶液III，溫和顛倒混勻，見白色絮狀沉淀，置于冰上3-5min，使雜質(zhì)充分沉淀（溶液III為中和液，此時質(zhì)粒DNA復(fù)性，染色體和蛋白質(zhì)不可逆變性，形成不可溶復(fù)合物，同時K+使SDS-蛋白復(fù)合物沉淀）。

7、吸取800ul上清液（注意：不要吸到漂浮的雜質(zhì)）至另一Eppendorf管中，加入2/3體積的異丙醇或2.5倍體積的預(yù)冷無水乙醇，混勻，室溫放置5min，4℃離心12000g ×15min。

8、倒盡上清，加75%乙醇浸洗沉淀除鹽1-2次，4℃離心 10000g×10min，棄上清，將沉淀在室溫或超凈工作臺上風(fēng)干。

9、將沉淀溶于40ul 滅菌超純水或TE（含RNase A 20ug/ml），37℃水浴30min，以降解RAN，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

10、取制備的質(zhì)粒DNA 1-2ul，加適當(dāng)loading buffer混勻上樣，1%瓊脂糖凝膠2.5V/cm電泳1h進行檢測。

五、實驗注意事項

1、實驗中的液氮、氯仿、EB等都是有毒物質(zhì)，操作時應(yīng)注意防護，盡量減少臺面污染。

2、DAN電泳時只能由負極到正極，電泳時要注意電極是否正確。

3、質(zhì)粒電泳檢測一般有三條帶，分別為質(zhì)粒的超螺旋、開環(huán)、線型三種構(gòu)型。

六、思考題

簡述質(zhì)粒DAN提取的步驟。

主要參考文獻

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國家重點實驗室柑橘課題組。實驗手冊，2002，武漢（課題組內(nèi)部資料）。

實驗五 PCR技術(shù)

一、實驗?zāi)康?/p>

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）是一種體外核酸擴增系統(tǒng)，是分子克隆技術(shù)中常用技術(shù)之一。PCR具有反應(yīng)快速、靈敏、操作簡便等優(yōu)點，已廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)的各個領(lǐng)域。通過本實驗應(yīng)掌握PCR原理，學(xué)習(xí)PCR操作過程。

二、實驗原理

PCR是在模板DNA、引物和dNTPs的存在環(huán)境下依賴于DNA聚合酶的酶促反應(yīng)。PCR技術(shù)的特異性取決于引物和模板結(jié)合的特異性。反應(yīng)分為變性、退火、延伸三步，經(jīng)過一定的循環(huán)，介于兩個引物之間的特異DNA片段得到大量擴增。

三、主要儀器及試材

含有外源cDNA片段的質(zhì)粒或轉(zhuǎn)基因蘋果、番茄葉片總DNA；外源基因的特異引物及PCR儀與相關(guān)試劑。

四、實驗方法與步驟

1、調(diào)整模板濃度至5ng/ul。

2、按下列體系配制反應(yīng)混合液，混勻，離心5秒（注意加1滴礦物油覆蓋PCR管）。

Template DNA

2ul（20ng）10×buffer

2.0ul MgCl2（25mM）

1.5ul Primer F（10uM）

0.2ul Primer R（10uM）

0.2ul dNTPs（2mM）

2.0ul Taq（5U/ul）

0.2ul Add ddH2O to

20ul

3、PCR反應(yīng)循環(huán)條件設(shè)置：

95℃

3min

1cycle 94℃

1min

55℃

1min 72℃

90s

35cycles 72℃

10min

1cycle 4℃

forever

4、檢測：加2ul溴酚藍，混勻，短暫離心，取15ul反應(yīng)產(chǎn)物點樣電泳

5、在1%瓊脂糖凝膠上點樣電泳；EB染色，紫外觀察。

五、實驗注意事項

1、引物設(shè)計應(yīng)具有特異性，依靠引物設(shè)計軟件進行引物設(shè)計；引物分裝成多管，不宜反復(fù)凍融多次；

2、PCR反應(yīng)的各種成分不能遺漏，操作應(yīng)戴手套，冰上操作；

3、根據(jù)引物的Tm值和擴增片段長度以及PCR儀的特性來設(shè)定PCR循環(huán)條件；

4、注意分析電泳檢測PCR產(chǎn)物時出現(xiàn)拖帶或非特異性擴增帶、無DNA帶或DNA帶很弱的可能原因。

六、思考題

簡述PCR技術(shù)的原理和步驟。

主要參考文獻

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國家重點實驗室柑橘課題組。實驗手冊，2002，武漢（課題組內(nèi)部資料

實驗六 PCR產(chǎn)物的TA克隆

一、實驗?zāi)康?/p>

采用同源序列法克隆特定基因或DNA片段是果樹上常用的分子克隆方法。相對于粘性末端來說，克隆具有平末端的雙鏈PCR產(chǎn)物效率較低。目前，有兩種方法可以采用，一種是在特異引物設(shè)計時引入酶切位點，另一種是TA克隆。通過本實驗應(yīng)掌握PCR產(chǎn)物TA克隆的原理，學(xué)習(xí)PCR產(chǎn)物純化及回收，以及PCR產(chǎn)物與TA克隆載體的連接。

二、實驗原理

TA克隆是利用耐熱聚合酶，如Taq聚合酶、Tfl、Tth等具有末端轉(zhuǎn)移酶活性，而不具有3’一5’外切酶的校準(zhǔn)活性，即在PCR產(chǎn)物的兩個3’末端加上未配對的單一A凸出尾，質(zhì)粒載體提供線性3’末端單一的T凸出尾，使該載體能夠直接與PCR產(chǎn)物高效連接。TA克隆技術(shù)比其它PCR克隆方法有更高的重組效率。

三、主要儀器及試材

PCR擴增產(chǎn)物、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（Promega公司）、pMD18-T載體（TaKaRa公司）以及感受態(tài)大腸桿菌、高速冷凍離心機、移液槍、瓊脂糖凝膠電泳等相關(guān)儀器及試劑。

四、實驗方法與步驟

1、PCR擴增片段純化回收

將PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，割膠，利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒收集PCR擴增產(chǎn)物，具體操作步驟參考試劑盒說明書進行。

2、連接反應(yīng) 反應(yīng)體系組成

pMD18-T

0.5-1.0 ul PCR fragment

1.0-4.5 ul ddH2O

0-3.0 ul Ligation Solution I

5.0 ul 混合后，置于室溫下放置數(shù)小時或過夜連接。

3、重組子轉(zhuǎn)化（熱激法）

1）在含適當(dāng)濃度的Ampicillin的LB平板上，涂抹4 ul IPTG（200mg/ml）和40 ul x-gal（20mg/ml），然后暗置30 min以上；

2）冰上冷凍新滅菌的1.5 ml 離心管； 3）取出感受態(tài)大腸桿菌，冰上放置凍融；

4）取新滅菌的1.5 ml 離心管，加入50 ul感受態(tài)細胞和10 ul連接反應(yīng)液，用移液槍輕輕吸打均勻，在冰上放置30 min；

5）熱激：將離心管在42 ℃下水浴90秒鐘。請勿搖動離心管； 6）冰鎮(zhèn)：快速將離心管轉(zhuǎn)移至冰浴，1-2分鐘；

7）復(fù)蘇：每管加400 ul液體LB培養(yǎng)基，在37 ℃搖床溫和搖動45 min-60 min； 8）涂皿：取150 ul均勻涂布于“1）”已制備好的LB平板上；

9）培養(yǎng)：在37 ℃下倒置培養(yǎng)12-16 h，即可觀察到藍白相間的菌落。白色菌落為含有外源插入片段的轉(zhuǎn)化子，藍色是載體自連的轉(zhuǎn)化子。轉(zhuǎn)化子可以在4 ℃下保持1個月；

10）單菌落培養(yǎng)：用滅菌的牙簽，挑選白色的單菌落到盛有含50 mg/ml Ampicillin的5 ml液體LB培養(yǎng)基的50 ml離心管中，在37 ℃搖床上培養(yǎng)過夜（12-16 h）。

4、質(zhì)粒DNA的分離 參考有關(guān)文獻。

5、檢測

采用相同的引物對進行PCR再擴增，或質(zhì)粒上根據(jù)插入片段兩端的酶切位點而進行限制性酶切，通過電泳可以檢測出片段是否克隆成功。

五、實驗注意事項

1、連接溫度不宜太高，連接溫度過高（>28℃）可使背景增加，使重組克隆菌減少。降低連接溫度可以提高白斑率；

2、熱激過程注意勿搖動離心管。

六、思考題

簡述PCR產(chǎn)物TA克隆的原理和步驟。

主要參考文獻

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國家重點實驗室柑橘課題組。實驗手冊，2002，武漢（課題組內(nèi)部資料。