梅毒實(shí)驗(yàn)室診斷

梅毒的實(shí)驗(yàn)室診斷方法主要有顯微鏡檢查法和血清學(xué)檢測法。

一、顯微鏡檢查法

（一）暗視野顯微鏡檢查

【基本原理】

梅毒硬下疳、扁平濕疣、黏膜斑等皮損的滲出液涂片，以及淋巴結(jié)穿刺液涂片等，在暗視野顯微鏡下，光線從聚光器的邊緣斜射到涂片上的梅毒螺旋體而發(fā)出亮光，從而可根據(jù)其特殊形態(tài)和運(yùn)動方式進(jìn)行檢測。

【儀器材料】

1．暗視野顯微鏡。

2．鈍刀（刮勺）、載玻片、蓋玻片、注射器具、無菌生理鹽水。

【標(biāo)本采集】

1．皮膚黏膜組織液：無菌生理鹽水浸濕的棉拭子擦去皮損表面的污物，鈍刀輕刮、擠壓皮損表層，取滲出液與預(yù)先滴加在載玻片上的生理鹽水混合后加蓋玻片鏡檢。

2．淋巴液：無菌操作下穿刺淋巴結(jié)，注入生理鹽水并反復(fù)抽吸2～3次，取少量的淋巴液直接滴于載玻片上，加蓋玻片鏡檢。

【操作步驟】

1．加鏡油：在暗視野顯微鏡的聚光器上滴加鏡油。

2．聚光：將標(biāo)本玻片置載物臺上，上升聚光器使鏡油接觸載玻片底面。

3．鏡檢：在鏡下觀察，尋找有特征形態(tài)和運(yùn)動方式的梅毒螺旋體。

【結(jié)果判讀】

XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX、告XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX梅毒螺旋體在暗視野顯微鏡鏡下表現(xiàn)為纖細(xì)、白色、有折光的螺旋狀微生物，長5～20mm，直徑小于0.2mm，有6～12個螺旋，具有旋轉(zhuǎn)、蛇行及伸縮等三種特征性的運(yùn)動方式。暗視野顯微鏡下發(fā)現(xiàn)有上述特征的螺旋體為陽性結(jié)果。

【結(jié)果報告】

1．陽性：見到上述特征的梅毒螺旋體。

2．陰性：未見到上述特征的梅毒螺旋體。

【臨床意義】

1．暗視野顯微鏡檢查陽性,可確診梅毒。

2．螺旋體檢查是診斷早期現(xiàn)癥梅毒的最好方法，世界衛(wèi)生組織指定為性病實(shí)驗(yàn)室必備項(xiàng)目之一。

3．如未見到梅毒螺旋體，并不能排除患梅毒的可能性，應(yīng)復(fù)查和血清學(xué)檢查。

【注意事項(xiàng)】

1.取材時盡量避免出血，以免影響鏡下觀察。

2.取材后應(yīng)立即置暗視野顯微鏡下觀察。

3.鏡下觀察時應(yīng)注意與其他螺旋體相鑒別。

（二）鍍銀染色檢查

【基本原理】

梅毒螺旋體具有親銀性，可被銀溶液染色，從而可以在鏡下觀察到梅毒螺旋體。

【儀器材料】

1．顯微鏡。

2．羅吉氏固定液、鞣酸媒染劑、Fontana氏銀溶液。

【標(biāo)本采集】

1.皮膚黏膜組織液：無菌生理鹽水浸濕的棉拭子擦去皮損表面的污物，鈍刀輕刮、擠壓皮損表層，取滲出液涂片。

2．淋巴液：無菌操作下穿刺淋巴結(jié)，注入生理鹽水并反復(fù)抽吸2～3次，取少量的淋巴液直接滴于載玻片上。

【操作步驟】

1．涂片干燥：將標(biāo)本涂于干凈載玻片作一薄片，于空氣中自然干燥。

2．固定：用固定液將涂片固定2～3分鐘。

3．洗滌：用無水乙醇洗滌玻片上的油污。

4．媒染：加媒染劑于涂片上，微加熱產(chǎn)生蒸汽，染30秒。

5．銀染：水洗，加銀染液于涂片上，微加熱產(chǎn)生蒸汽，染30秒。

6．鏡檢：水洗、待干，用油鏡檢查。

【結(jié)果判讀】

顯微鏡下見到染成棕褐色的梅毒螺旋體為陽性結(jié)果。

【結(jié)果報告】

1．陽性：見到染成棕褐色梅毒螺旋體。

2．陰性：未見到染成棕褐色的梅毒螺旋體。

【臨床意義】

同暗視野顯微鏡檢查法。

【注意事項(xiàng)】

應(yīng)注意與其他螺旋體加以鑒別。

二、血清學(xué)檢測法

（一）非梅毒螺旋體抗原血清試驗(yàn)

非梅毒螺旋體抗原血清試驗(yàn)，包括性病研究實(shí)驗(yàn)室（VDRL）試驗(yàn)、快速血漿反應(yīng)素（RPR）環(huán)狀卡片試驗(yàn)、甲苯胺紅不加熱血清試驗(yàn)（TRUST）等。

n

VDRL試驗(yàn)

【基本原理】

梅毒螺旋體感染人體后，宿主會產(chǎn)生抗類脂抗原的抗體（反應(yīng)素），與一定比例的心磷脂、卵磷脂及膽固醇混合物抗原反應(yīng)，可檢測梅毒患者血中的抗類脂抗原的抗體。

【儀器材料】

1.水平旋轉(zhuǎn)儀、顯微鏡。

2.試劑盒：VDRL抗原原液、VDRL緩沖液、抗原滴管及針頭、帶直徑14mm漆圈的玻璃反應(yīng)板、VDRL試驗(yàn)結(jié)果參照圖片。

3.30mL平底玻璃小瓶、生理鹽水。

【標(biāo)本采集】

1.血清：抽取靜脈血，室溫靜止凝固后，分離新鮮血清。也可采用凍存的血清。

2.腦脊液：采用腰椎穿刺術(shù)獲得，應(yīng)由相關(guān)專業(yè)人員操作。

【操作步驟】

1.VDRL抗原配制。

2.VDRL玻片定性試驗(yàn)

（1）滅活：血清標(biāo)本56℃滅活30分鐘。

（2）吸樣：吸取0.05mL血清放入反應(yīng)板圈中，將血清涂布到整個圈內(nèi)。

（3）加抗原：用標(biāo)準(zhǔn)針頭加入1滴抗原。

（4）反應(yīng)：將反應(yīng)板置水平旋轉(zhuǎn)儀上旋轉(zhuǎn)4分鐘，〔(180±5)次/分鐘〕，立即置低倍顯微鏡下觀察。

3.VDRL定量試驗(yàn)

（1）加稀釋液：在圈內(nèi)加入0.05mL生理鹽水（根據(jù)需要確定稀釋度）。

（2）樣本稀釋：吸取0.05mL樣本與各圈中鹽水作系列稀釋并涂布整個圈內(nèi)。

（3）以下步驟同定性試驗(yàn)（2）～（4）。

【結(jié)果判讀】

凝集反應(yīng)強(qiáng)度分級：

3＋

～

4＋：大的或中等大小的絮狀物，液體清亮

2＋：絮狀物較小，液體較清亮

1＋：絮狀物較小，均勻分布，液體混濁

±：抗原復(fù)合物顆粒稍粗

－：抗原顆粒均勻、細(xì)小

【結(jié)果報告】

1．定性試驗(yàn)：

（1）陽性：鏡下可見1＋～4＋的絮狀凝集物。

（2）陰性：不產(chǎn)生凝集反應(yīng)。

2．定量試驗(yàn)：

滴度：鏡下可見絮狀凝集物的血清最高稀釋倍數(shù)。

【臨床意義】

對一期、二期、潛伏期和晚期梅毒患者的敏感性分別為78%、100%、96%和71%。腦脊液VDRL陽性對神經(jīng)梅毒有診斷意義。

【注意事項(xiàng)】

1．VDRL用抗原需當(dāng)天配制。

2．試驗(yàn)反應(yīng)完畢，應(yīng)立即觀察結(jié)果。

n

RPR試驗(yàn)

【基本原理】

RPR試驗(yàn)是VDRL試驗(yàn)的一種改良方法。該法在心磷脂、卵磷脂和膽固醇等組成的抗原中加入活性炭顆粒，與待檢血清（漿）中的反應(yīng)素結(jié)合，形成肉眼可見的黑色絮狀物。

【儀器材料】

1．水平旋轉(zhuǎn)儀。

2．RPR試劑盒：RPR抗原、直徑為18mm圓圈的反應(yīng)卡片、抗原滴管、針頭。

【標(biāo)本采集】

1．血清：抽取靜脈血，室溫靜止凝固后，分離新鮮血清。也可采用凍存的血清。

2．血漿：各種抗凝劑制備的血漿。

【操作步驟】

1．定性試驗(yàn)

（1）

加樣：吸取0.05mL血清(漿)放在卡片圈中，并均勻地涂布在整個圈內(nèi)。

（2）加抗原：將抗原輕輕搖勻，用9號針頭[每毫升（60±1）滴]加1滴抗原。

（3）反應(yīng)：將卡片置水平旋轉(zhuǎn)儀旋轉(zhuǎn)8分鐘[（100±5）轉(zhuǎn)/分鐘]。立即在亮光下觀察結(jié)果。

2．定量試驗(yàn)

（1）稀釋液準(zhǔn)備：在圈內(nèi)加入0.05mL生理鹽水（根據(jù)需要確定稀釋度），勿將鹽水涂開。

（2）加樣：吸取0.05mL血清（漿）與各圈中鹽水作系列稀釋，并涂布整個圈內(nèi)。

（3）同定性試驗(yàn)（2）～（4）。

【結(jié)果判讀】

凝集反應(yīng)強(qiáng)度分級：

3＋

～

4＋：圓圈內(nèi)出現(xiàn)中到大的黑色絮狀物，液體清亮

2＋：圓圈內(nèi)出現(xiàn)小到中的黑色絮狀物，液體較清亮

1＋：圓圈內(nèi)出現(xiàn)小的黑色絮狀物，液體混濁

－：圓圈內(nèi)僅見碳顆粒集于中央一點(diǎn)或均勻分散

【結(jié)果報告】

1．定性試驗(yàn)：

（1）陽性：出現(xiàn)1＋～4＋強(qiáng)度的凝集反應(yīng)。

（2）陰性：不產(chǎn)生凝集反應(yīng)。

2．定量試驗(yàn)：

滴度：出現(xiàn)凝集反應(yīng)的血清最高稀釋倍數(shù)。

【臨床意義】

1．RPR試驗(yàn)適用于梅毒篩查、療效觀察、復(fù)發(fā)或再感染的檢查。

2．對未經(jīng)治療的一期、二期和潛伏梅毒患者的敏感性分別為86%、100%和98%。

【注意事項(xiàng)】

試驗(yàn)應(yīng)在23～29℃環(huán)境中進(jìn)行。

n

TRUST試驗(yàn)

TRUST試驗(yàn)是用甲苯胺紅顆粒代替RPR試驗(yàn)中的碳顆粒作為指示物，所以陽性結(jié)果為紅色絮狀物。其基本原理、儀器材料、標(biāo)本采集、操作步驟、結(jié)果判讀、結(jié)果報告、臨床意義及注意事項(xiàng)等與RPR試驗(yàn)基本相同。

（二）梅毒螺旋體抗原血清試驗(yàn)

梅毒螺旋體抗原血清試驗(yàn)是以梅毒螺旋體為抗原的特異性的抗原抗體反應(yīng)，用以檢測梅毒抗體，常用的方法有梅毒螺旋體明膠顆粒凝集試驗(yàn)（TPPA）、梅毒螺旋體血球凝集試驗(yàn)（TPHA）、熒光梅毒螺旋體抗體吸收試驗(yàn)（FTA-ABS）、梅毒螺旋體酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（TP-ELISA）和梅毒螺旋體蛋白印跡試驗(yàn)（TP-WB）等方法。

n

TPPA試驗(yàn)

【基本原理】

TPPA試驗(yàn)是用超聲裂解梅毒螺旋體制備的抗原，致敏明膠粒子，其致敏粒子與待檢血清中的抗梅毒螺旋體抗體結(jié)合，產(chǎn)生肉眼可見的凝集。

【儀器材料】

1.微量震蕩器。

2.試劑盒：“A”溶解用液、“B”標(biāo)本稀釋液、“C”致敏粒子、“D”未致敏粒子、“E”質(zhì)控血清。

3．U型反應(yīng)板。

【標(biāo)本采集】

同RPR試驗(yàn)。

【操作步驟】

1．試劑準(zhǔn)備：試驗(yàn)前將待檢樣本和試劑應(yīng)恢復(fù)到室溫。

2．加稀釋液：每份樣本做4孔，加B液至反應(yīng)孔內(nèi)，第1孔100μL，第2～4孔各25μL。

3．樣本稀釋：取血清25μL加至第1孔，混勻后取25μL至第2孔，連續(xù)倍比稀釋至第4孔，最后1孔混勻后棄去25μL。

4．加對照液：第3孔加D液25μL，第4孔加C液25μL。

5．混合：將反應(yīng)板置震蕩器震蕩30秒。

6．反應(yīng)：置濕盒內(nèi)，孵育2小時后，或放4℃冰箱過夜觀察結(jié)果。

【結(jié)果判讀】

觀察凝集反應(yīng)強(qiáng)度，分級如下：

4＋：

粒子光滑覆蓋整個孔底，有時邊緣有折疊

3＋：

粒子光滑覆蓋大部分孔底

2＋：

粒子光滑聚集覆蓋孔底，周圍有一細(xì)胞環(huán)

1＋：

粒子光滑集聚覆蓋孔底，周圍有一明顯細(xì)胞環(huán)

±：

粒子沉集孔底，中央形成一小點(diǎn)

－：

粒子緊密沉積孔底中央

【結(jié)果報告】

1．陽性：未致敏粒子不出現(xiàn)凝集（第3孔），血清1︰80以上稀釋與致敏粒子產(chǎn)生1＋～4＋凝集反應(yīng)。

2.陰性：未致敏粒子和致敏粒子均不產(chǎn)生凝集反應(yīng)。

【臨床意義】

1.TPPA可作為非梅毒螺旋體抗原血清試驗(yàn)(如RPR等)初篩陽性標(biāo)本的確證試驗(yàn)。

2．梅毒患者經(jīng)過抗梅治療后，TPPA試驗(yàn)仍可陽性，故TPPA試驗(yàn)陽性不能作為療效觀察的指標(biāo)。

3．TPPA陽性不能區(qū)分既往感染和現(xiàn)癥感染，應(yīng)結(jié)合非梅毒螺旋體抗原血清試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行診斷。

【注意事項(xiàng)】

1.試驗(yàn)結(jié)果為“可疑”時，應(yīng)選用其他的試驗(yàn)方法進(jìn)行復(fù)驗(yàn)。

2.如未致敏粒子出現(xiàn)凝集反應(yīng)，樣本進(jìn)行吸收后再進(jìn)行試驗(yàn)，或改用其他試驗(yàn)方法。

n

TPHA試驗(yàn)

【基本原理】

TPHA試驗(yàn)用超聲裂解的梅毒螺旋體菌體為抗原，致敏經(jīng)醛化、鞣化的羊或禽類紅細(xì)胞，與抗梅毒螺旋體抗體反應(yīng)，產(chǎn)生肉眼可見的抗原抗體凝集。

【儀器材料】

1.微量震蕩器。

2．TPHA試劑盒：“A”溶解用液、“B”標(biāo)本稀釋液、“C”致敏粒子、“D”

未致敏粒子、“E”質(zhì)控血清。

3.U型反應(yīng)板。

【標(biāo)本采集】

同RPR試驗(yàn)。

【操作步驟】

1．試劑準(zhǔn)備：試驗(yàn)前試劑恢復(fù)到15～25℃。

2．加稀釋液：加B液至反應(yīng)板，第1孔25mL，第2孔100mL，第3～5孔各加25mL。

3．樣本稀釋：取血清25mL加至第1孔，混勻后取25mL至第2孔，混勻后取25mL至第3孔，混勻后棄去25mL，再從第2孔取25mL至第4孔，混勻后取25mL至第5孔，混勻后棄去25mL。

4．加對照液：第3孔加D液（未致敏細(xì)胞）75μL，第4、5孔加C液（致敏細(xì)胞）各75mL。

5．混合：將反應(yīng)板置震蕩器震蕩30秒。

6．反應(yīng)：置濕盒內(nèi)，15～25℃孵育4小時，或放4℃冰箱過夜觀察結(jié)果。

【結(jié)果判讀】

同TPPA試驗(yàn)。

【結(jié)果報告】

同TPPA試驗(yàn)。

【臨床意義】

同TPPA試驗(yàn)。

【注意事項(xiàng)】

有些采用禽類紅細(xì)胞為載體的TPHA試驗(yàn)，血清不用吸收，可直接進(jìn)行試驗(yàn)。

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FTA-ABS試驗(yàn)

【基本原理】

以完整的梅毒螺旋體作為抗原，與經(jīng)吸收劑吸收的梅毒血清抗體反應(yīng)形成抗原抗體復(fù)合物，再加入熒光素（FITC）標(biāo)記的抗人免疫球蛋白，形成帶有熒光的抗原抗體復(fù)合物，在熒光顯微鏡下螺旋體顯出蘋果綠色熒光。

【儀器材料】

1．熒光顯微鏡。

2．試劑盒：梅毒螺旋體抗原片、吸收劑、熒光素標(biāo)記抗體、陽性對照血清、PBS緩沖液、固定劑。

3.血清稀釋板。

【標(biāo)本采集】

同VDRL試驗(yàn)。

【操作步驟】

1.血清滅活：將血清標(biāo)本于56℃滅活30分鐘，備用。

2.血清稀釋：待檢血清用吸收劑1：5稀釋，陽性血清及陰性血清分別用PBS緩沖液和吸收劑1:5稀釋。置37℃濕盒內(nèi)，30分鐘。

3.加樣：每次試驗(yàn)必須設(shè)PBS緩沖液、吸收劑、PBS液1︰5稀釋陽性和陰性血清及吸收劑1：5稀釋陽性和陰性血清共6個對照涂片。每個涂片分別加入10μL稀釋后的血清或緩沖液，置37℃濕盒內(nèi)，30分鐘。

4.洗滌：用PBS-

Tween-80液洗玻片2次，每次5分鐘，最后用蒸餾水洗一次，冷風(fēng)干燥。

5.加熒光抗體：每個涂片加10μL按要求稀釋的熒光抗體,置37℃濕盒內(nèi)30分鐘。

6.洗滌：同步驟4。

7.封片鏡檢：用固定劑封片，讀片。

【結(jié)果判讀】

1.陽性對照：無論P(yáng)BS緩沖液還是吸附劑稀釋，熒光強(qiáng)度應(yīng)相同。

2.陰性對照和空白對照：不產(chǎn)生熒光。

【結(jié)果報告】

1.陽性：熒光鏡下見到不同程度發(fā)綠色熒光的螺旋體。

2.陰性：無熒光或密螺旋體微顯淡綠色。

【臨床意義】

1.FTA-ABS是梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗(yàn)的“金標(biāo)準(zhǔn)”。

2．對未經(jīng)治療的一期、二期、潛伏梅毒和晚期梅毒患者的敏感性分別為84%、100%、100%和96%，特異性均可達(dá)97%。

3.其他同TPPA試驗(yàn)。

【注意事項(xiàng)】

1.抗原片每次洗滌要干凈，避免其他雜質(zhì)影響判讀結(jié)果。

2.試驗(yàn)需有高質(zhì)量熒光顯微鏡和技術(shù)熟練的操作人員。

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TP-ELISA試驗(yàn)

【基本原理】

TP-ELISA試驗(yàn)是用包被在固相板條上經(jīng)超聲裂解、純化處理或重組的梅毒螺旋體抗原，與待檢血清中的梅毒特異性抗體結(jié)合，再與酶標(biāo)記的抗人免疫球蛋白單克隆抗體反應(yīng)，形成抗原抗體復(fù)合物而使底物顯色。

【儀器材料】

1.酶標(biāo)儀、洗板機(jī)。

2．試劑盒組成：96孔反應(yīng)板、標(biāo)本稀釋液、洗滌液、酶結(jié)合物、底物液、終止液、陽性對照、陰性對照。

【標(biāo)本采集】

同RPR試驗(yàn)

【操作步驟】

1.加稀釋液：取標(biāo)本稀釋液加到反應(yīng)板孔內(nèi)。

2.孵育：分別加入陽性、陰性對照和待檢血清，置37℃孵育一定時間,洗板。

3.加酶結(jié)合物：加酶結(jié)合物，置37℃孵育一定時間,洗板。

4.加顯色劑：加底物，37℃避光孵育。

5.終止反應(yīng)：加終止液，酶標(biāo)儀測OD（光密度）值。

【結(jié)果判讀】

1．每次試驗(yàn)的陽性、陰性對照應(yīng)在規(guī)定的數(shù)值范圍內(nèi)

2．根據(jù)陽性、陰性O(shè)D值設(shè)定閾值（cut-off值）。

【結(jié)果報告】

1．陽性：標(biāo)本OD值大于或等于cut-off值。

2．陰性：標(biāo)本OD值小于cut-off值。

【臨床意義】

（1）適用于流行病學(xué)調(diào)查或大樣本量標(biāo)本的檢測。

（2）ELISA陽性不能區(qū)分既往感染和現(xiàn)癥感染，應(yīng)結(jié)合非梅毒螺旋體抗原血清試驗(yàn)(如RPR等)結(jié)果進(jìn)行診斷。

【注意事項(xiàng)】

1.不同批號試劑不能混用。

2.溫度和時間必須嚴(yán)格控制。

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TP-WB試驗(yàn)

【基本原理】

用超聲粉碎的梅毒螺旋體或梅毒螺旋體重組的不同抗原，印跡至硝酸纖維膜條上。通過酶聯(lián)反應(yīng)，可檢測梅毒血清中多種特異抗原成分的抗體。

【儀器材料】

1.水平搖床。

2.試劑盒:硝酸纖維膜條、酶標(biāo)抗體、陽性質(zhì)控血清、陰性質(zhì)控血清、底物液、終止液、標(biāo)準(zhǔn)陽性反應(yīng)帶結(jié)果參比圖譜。

【標(biāo)本采集】

同RPR試驗(yàn)

【操作步驟】

1．反應(yīng)：每反應(yīng)槽加2.0mL工作緩沖液，浸濕膜條5分鐘，加入0.02mL待檢樣本，置水平搖床上(50轉(zhuǎn)/分)，18～25℃反應(yīng)45分鐘。

2．洗滌：棄去反應(yīng)槽中液體，加入

2.0mL工作緩沖液，置水平搖床洗滌3次，每次5分鐘。

3．加酶結(jié)合物：

加入酶標(biāo)抗體，置水平搖床反應(yīng)30分鐘。

4．洗滌：同步驟2。

5．顯色：每槽加2.0mL底物，置水平搖床上反應(yīng)8～10分鐘。

6．終止:

待陽性對照帶顯色清晰，加入1.0

mL終止劑2分鐘后棄去槽中液體，用蒸餾水洗2次，用鑷子取出反應(yīng)條，置濾紙上。

【結(jié)果判讀】

1．根據(jù)陽性結(jié)果參比圖譜判定結(jié)果。

2.將試驗(yàn)的硝酸纖維膜條上端標(biāo)記線與參比標(biāo)記線對齊。

3．觀察45KD、17KD及15.5KD帶區(qū)顯色帶。

【結(jié)果報告】

1．陽性：

45KD、17KD及15.5KD帶區(qū)均出現(xiàn)顯色帶。

2．陰性：

45KD、17KD及15.5KD三個條帶均未顯色。

【臨床意義】

1．同TPPA試驗(yàn)

2．可以用于檢測IgM或IgG抗體。

【注意事項(xiàng)】

1．洗滌要充分，否則易造成試驗(yàn)?zāi)l帶背景的顏色偏深。

2．硝酸纖維膜條有對照反應(yīng)條帶，在試驗(yàn)中應(yīng)顯示，如未顯示，則試驗(yàn)無效。

3．當(dāng)45KD、17KD及15.5KD中只有一個或兩個條帶出現(xiàn)明顯色帶為可疑結(jié)果，需重新試驗(yàn)。

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快速免疫層析法

【基本原理】

利用免疫層析原理，采用吸附有顯色標(biāo)記的梅毒螺旋體重組抗原的濾紙條，快速檢測標(biāo)本中的梅毒螺旋體抗體。

【儀器材料】

試劑盒：測試板、一次性滴管。

【標(biāo)本采集】

同RPR試驗(yàn)，可用全血。

【操作步驟】

1．加樣：用一次性滴管滴加一定量標(biāo)本于加樣孔中。

2．加緩沖液：立即加入一定量的緩沖液。

3．觀察結(jié)果：規(guī)定時間內(nèi)判讀結(jié)果。

【結(jié)果判讀】

1.觀察質(zhì)控條帶,判斷試驗(yàn)有效性，如沒有出現(xiàn)質(zhì)控條帶，說明試驗(yàn)無效，需重復(fù)試驗(yàn)。

2．觀察標(biāo)本條帶。

【結(jié)果報告】

1．陽性:

出現(xiàn)標(biāo)本條帶和質(zhì)控條帶。

2．陰性：無標(biāo)本條帶，出現(xiàn)質(zhì)控條帶。

【臨床意義】

1．可以用于標(biāo)本的快速篩查。

2．快速檢測陽性不能區(qū)分既往感染和現(xiàn)癥感染，應(yīng)結(jié)合非梅毒螺旋體抗原血清試驗(yàn)(如RPR等)結(jié)果進(jìn)行診斷。

【注意事項(xiàng)】

1．試劑盒從冷藏環(huán)境中取出時，應(yīng)平衡至室溫后方可使用。

2．本試驗(yàn)方法存在一定的假陽性和假陰性。

三、其它方法

（一）梅毒IgM抗體的檢測

與其它細(xì)菌及病毒感染一樣，在梅毒中特異性IgM抗體的合成是第一次感染后的體液免疫應(yīng)答。在梅毒中螺旋體IgM抗體出現(xiàn)在早期梅毒患者中，在潛伏期及晚期患者也能發(fā)現(xiàn)。在自發(fā)痊愈的患者中IgM水平下降的速度比治療痊愈的患者慢。IgM分子大使其不能通過胎盤屏障及完整無損的血腦屏障。因此若在新生兒血中檢測到IgM抗體是兒童產(chǎn)前感染的診斷標(biāo)志；如在患者的完整無損的血腦屏障的腦脊液（CSF）中出現(xiàn)，則表示患有活動性神經(jīng)梅毒。在最近未接受治療的患者血液中或CSF中出現(xiàn)抗梅毒IgM抗體均表示需要治療。

測定IgM抗體方法的基本原理是采用分離柱，使血清中的IgM和IgG按其分子量大小在分離過程中的沉降速度不同，將IgM和IgG分別收集，再進(jìn)行FTA-ABS等試驗(yàn)。亦可采用抗IgM單克隆抗體的酶標(biāo)法、蛋白質(zhì)印跡法等進(jìn)行檢測。目前測定IgM抗體的方法的敏感性還很不理想，但是檢查到IgM抗體則有助于對以下病例中的試驗(yàn)結(jié)果更可靠的解釋：先天性梅毒、早期一期梅毒、晚期梅毒、非梅毒螺旋體試驗(yàn)的血清陽轉(zhuǎn)前的早期感染患者的判愈試驗(yàn)及有梅毒史或其它螺旋體感染史患者的再感染。

（二）胎傳梅毒(或先天梅毒)的實(shí)驗(yàn)室診斷

具有下列實(shí)驗(yàn)室四個指標(biāo)之一，可診斷為胎傳梅毒(或先天梅毒)：①暗視野檢查梅毒螺旋體陽性；②患兒非梅毒螺旋體血清抗體滴度持續(xù)上升；③患兒非梅毒螺旋體血清學(xué)定量試驗(yàn)結(jié)果比母親高4倍（低于或等于該值并不排除胎傳梅毒）；④患兒檢出19S-IgM抗體。

（三）神經(jīng)梅毒的實(shí)驗(yàn)室診斷

1．神經(jīng)梅毒的實(shí)驗(yàn)室診斷標(biāo)準(zhǔn)包括：①梅毒血清學(xué)檢查陽性；②腦脊液細(xì)胞計(jì)數(shù)或蛋白測定結(jié)果異常；③腦脊液VDRL試驗(yàn)陽性。

2．腦脊液VDRL試驗(yàn)是神經(jīng)梅毒的標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)，陽性結(jié)果可診斷為神經(jīng)梅毒，但該試驗(yàn)存在假陰性。

3．腦脊液的FTA－ABS試驗(yàn)陰性可排除神經(jīng)梅毒，但特異性不高，可能產(chǎn)生假陽性。

4．腦脊液檢查內(nèi)容

（1）細(xì)胞計(jì)數(shù)：正常時白細(xì)胞數(shù)應(yīng)小于3×106/L，若白細(xì)胞數(shù)大于10×106/L，提示中樞神經(jīng)系統(tǒng)有炎癥現(xiàn)象。

（2）蛋白質(zhì)量測定：總蛋白質(zhì)量正常為0.1～0.4g/L，神經(jīng)梅毒可稍升高，或高達(dá)1.0～2.0g/L。

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END

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