第一篇：研究生分子生物學(xué)課程學(xué)習(xí)體會(huì)及建議

研究生分子生物學(xué)課程學(xué)習(xí)體會(huì)及建議

一個(gè)學(xué)期的分子生物學(xué)課程就要結(jié)束了，這一學(xué)期，對(duì)于我一個(gè)跨專業(yè)的學(xué)生來說，還是學(xué)習(xí)到很多知識(shí)的的。

剛開始還是很沒有信心能聽懂這門課程，老師考慮到我們跨專業(yè)的同學(xué)，對(duì)很多基礎(chǔ)知識(shí)的講解都是很仔細(xì)的，給了我一些信心。分子生物學(xué)課程的學(xué)習(xí)讓我初步建立了分子的概念，掌握了以中心法則為核心的最基本的分子生物學(xué)知識(shí)。圍繞著中心法則，我們學(xué)習(xí)了DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯的機(jī)制，從根本上了解了中心法則的作用機(jī)理。了解了蛋白的表達(dá)過程是一個(gè)多分子協(xié)同作用的結(jié)果，每一步都經(jīng)過著嚴(yán)格的調(diào)控，對(duì)這些基本概念和過程的理解為今后的科研奠定了基礎(chǔ)。但是核酸到底是什么樣子，什么是質(zhì)粒，什么是轉(zhuǎn)化，生物大分子之間的相互作用這樣的概念對(duì)我來說還是有點(diǎn)模糊。部分章節(jié)的思維導(dǎo)圖的制作也對(duì)我們受益匪淺，既幫助我們復(fù)習(xí)了所需知識(shí)，也鍛煉了我們總結(jié)表達(dá)的能力，同時(shí)也在無形中加強(qiáng)了我們同學(xué)之間的交流。

我覺得美中不足的地方就是沒有實(shí)驗(yàn)課的安排。沒有實(shí)踐操作，一切都是在紙上談兵。其次就是沒有布置一些有查閱文獻(xiàn)的作業(yè)，對(duì)我這個(gè)跨專業(yè)的人來說，對(duì)新的領(lǐng)域還是存在一些迷茫的地方，所以我希望老師能夠通過布置作業(yè)給我指點(diǎn)方向。

第二篇：溫醫(yī)研究生分子生物學(xué)課程總結(jié)

這份是2014級(jí)某人整理的，基本上都是上課涉及到的內(nèi)容，里面“生物大分子（DNA,RNA,蛋白質(zhì)）提取分離純化的具體方法沒有，分子生物學(xué)新技術(shù)幾個(gè)名解就寫啦CEMS，miRNA太多（可能是熱點(diǎn)吧?），RT-PCR沒有具體，基因診斷實(shí)例缺。其他的基本上都有啦。

分子生物學(xué)：從分子水平研究生物分子的結(jié)構(gòu)與功能從而闡明生命現(xiàn)象本質(zhì)和生命過程規(guī)律的一門交叉科學(xué) ；主要研究遺傳信息的傳遞（復(fù)制）、保持（損傷和修復(fù)）、基因的表達(dá)（轉(zhuǎn)錄和翻譯）與調(diào)控。遺傳學(xué)角度：基因（gene）：是指攜帶有遺傳信息的DNA或RNA序列，也稱為遺傳因子。

分子生物學(xué)角度：基因（gene）：是合成有功能的蛋白質(zhì)或RNA所必需的全部DNA，包括編碼蛋白質(zhì)或RNA的核酸序列及為保證轉(zhuǎn)錄所必需的調(diào)控序列。

結(jié)構(gòu)基因 ：可被轉(zhuǎn)錄成mRNA，并可翻譯成多肽，構(gòu)成結(jié)構(gòu)蛋白或催化各種生化反應(yīng)的酶。調(diào)節(jié)基因 ：指某些可調(diào)節(jié)、控制結(jié)構(gòu)基因表達(dá)的基因。

編碼區(qū)：能夠編碼產(chǎn)生蛋白質(zhì)的序列，包括外顯子與內(nèi)含子。前導(dǎo)區(qū)：位于編碼區(qū)上游，相當(dāng)于mRNA5′端非編碼區(qū)。

調(diào)節(jié)區(qū)：包括啟動(dòng)子和增強(qiáng)子等基因編碼區(qū)的兩側(cè)，也稱為側(cè)翼序列。

斷裂基因（splite gene）：真核生物結(jié)構(gòu)基因，由若干個(gè)編碼區(qū)和非編碼區(qū)互相間隔開但又連續(xù)鑲嵌而成，去除非編碼區(qū)再連接后，可翻譯出由連續(xù)氨基酸組成的完整蛋白質(zhì)，這些基因稱為斷裂基因 基因組（genome）：是指一個(gè)物種的單倍體的染色體所攜帶的全部遺傳信息。

C值（C value）：一種生物體單倍體基因組的DNA含量總是恒定的，它通常稱為該物種DNA的C值。C值矛盾：生物體的進(jìn)化程度與基因組大小之間不完全成比例的現(xiàn)象（又稱：C值悖論，C value paradox）

必需基因：指關(guān)系到生物體存活的基因，可通過基因突變的方法確定致死位點(diǎn)的數(shù)量，以得知基因組必需基因的數(shù)量

重疊基因（overlapping gene）是指兩個(gè)或兩個(gè)以上的基因共有一段DNA序列，或是指一段DNA序列成為兩個(gè)或兩個(gè)以上基因的組成部分。

多順反子mRNA：DNA序列中功能相關(guān)的蛋白質(zhì)的基因叢集在基因組的一個(gè)或幾個(gè)特定的部位，形成一個(gè)功能單位或轉(zhuǎn)錄單元，它們可被一起轉(zhuǎn)錄成含有多個(gè)mRNA的分子。病毒基因組的結(jié)構(gòu)與功能特征？ ① 病毒基因組基因組很小，且大小相差較大。② 病毒基因組可以由DNA組成，或由RNA組成。③ 多數(shù)RNA病毒的基因組是由連續(xù)的RNA鏈組成； ④ 基因重疊。⑤ 基因組的大部分可編碼蛋白質(zhì)，只有非常小的一部份不編碼蛋白質(zhì)。⑥ 形成多順反子結(jié)構(gòu)（polycistronie）。⑦ 病毒基因組都是單倍體（逆轉(zhuǎn)錄病毒除外）。⑧ 噬菌體（細(xì)菌病毒）的基因是連續(xù)的，而少數(shù)真核細(xì)胞病毒的基因是不連續(xù)的。

類核（nucleoid）：是指原核生物基因組通常由一條環(huán)狀的雙鏈DNA分子組成，在細(xì)胞中與蛋白質(zhì)結(jié)合成染色體的形式，在細(xì)胞內(nèi)形成一個(gè)致密的區(qū)域。原核生物基因組的一般特點(diǎn) 基因組較?。?06bp～107bp）

功能上相關(guān)的幾個(gè)結(jié)構(gòu)基因串聯(lián)在一起組成操縱子(operon)結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)基因均為單拷貝基因（除18s、28s、5s rRNA及tRNA基因外）

不編碼的DNA序列約占全基因組的10%以內(nèi)（比真核生物少得多）：基因組中幾乎沒有重復(fù)序列，基因間幾乎沒有間隔，基因內(nèi)沒有內(nèi)含子（古細(xì)菌除外）。不編碼部分通常包含調(diào)控基因表達(dá)的序列

DNA分子中有各種功能區(qū)，如復(fù)制起始區(qū)OriC，復(fù)制終止區(qū)TerC，轉(zhuǎn)錄起始區(qū)和終止區(qū)等，這些區(qū)域往往有反向重復(fù)序列，能形成特殊的結(jié)構(gòu)。

多順反子：即數(shù)個(gè)功能相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因串聯(lián)在一起，受同一個(gè)調(diào)節(jié)區(qū)的調(diào)節(jié)。

轉(zhuǎn)座子：能在基因組中從一個(gè)位點(diǎn)移至另一位點(diǎn)的DNA序列稱為轉(zhuǎn)座因子（transposable element），又稱為可轉(zhuǎn)座元件。

插入序列(insertion sequence，IS)：2 000bp以內(nèi)，兩端正向重復(fù)序列（direct repeats，DR）、反向重復(fù)序列（inverted repeats，IR），中間1kb左右的編碼序列，僅編碼和轉(zhuǎn)座有關(guān)的轉(zhuǎn)座酶。

復(fù)合型轉(zhuǎn)座子(composite transposon)：2 000～20 000bp之間，兩端由一對(duì)IS元件組成，帶有與轉(zhuǎn)座作用有關(guān)的基因和其他基因。

質(zhì)粒（plasmid）：是指一類染色體外具有自主復(fù)制能力的環(huán)狀雙鏈DNA分子，屬染色體外基因組。

共價(jià)閉環(huán)DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA）沒有游離的末端，每條鏈上的核苷酸通過共價(jià)鍵彼此頭尾相連，這種結(jié)構(gòu)稱為,常形成超螺旋結(jié)構(gòu)。

嚴(yán)緊控制（stringent control）型質(zhì)粒：其復(fù)制常與宿主的繁殖偶聯(lián)，拷貝數(shù)較少，每個(gè)細(xì)胞中只有1個(gè)到十幾個(gè)拷貝。

松弛控制（relaxed control）型質(zhì)粒：其復(fù)制與宿主不偶聯(lián)，每個(gè)細(xì)胞中有幾十到幾百個(gè)拷貝。質(zhì)粒的穩(wěn)定性：質(zhì)粒在宿主細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定地存在而不丟失稱為質(zhì)粒地穩(wěn)定性。

質(zhì)粒的不相容性：兩種不同的質(zhì)粒因利用同一復(fù)制和維持機(jī)制，在復(fù)制和隨后向子代細(xì)胞分配的過程中會(huì)發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)，從而不能在同一宿主細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定存在，其中一種質(zhì)粒將被丟失的現(xiàn)象。

原核生物基因組的一般特點(diǎn)？

1.基因組較?。?06bp～107bp）。

2.操縱子結(jié)構(gòu)是原核生物基因組的功能單位。

3.結(jié)構(gòu)基因均為單拷貝基因（除18s、28s、5s rRNA及tRNA基因外）。

4.不編碼的DNA序列約占全基因組的10%以內(nèi)（比真核生物少得多）：基因組中幾乎沒有重復(fù)序列，基因間幾乎沒有間隔，基因內(nèi)沒有內(nèi)含子（古細(xì)菌除外）。5.不編碼部分通常包含調(diào)控基因表達(dá)的序列

6.DNA分子中有各種功能區(qū)，如復(fù)制起始區(qū)OriC，復(fù)制終止區(qū)TerC，轉(zhuǎn)錄起始區(qū)和終止區(qū)等，這些區(qū)域往往有反向重復(fù)序列，能形成特殊的結(jié)構(gòu)。

真核生物基因組的結(jié)構(gòu)與功能特點(diǎn)

1.基因組DNA與蛋白質(zhì)結(jié)合形成染色體，儲(chǔ)存于細(xì)胞核內(nèi)，除配子細(xì)胞外，體細(xì)胞內(nèi)基因組是雙份的（即雙倍體，diploid），有兩份同源的基因組。

2.基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為單順反子。一個(gè)結(jié)構(gòu)基因經(jīng)過轉(zhuǎn)錄生成一個(gè)mRNA分子，再翻譯生成一條多肽鏈。3.存在重復(fù)序列，重復(fù)次數(shù)可達(dá)百萬次以上。4.基因組中不編碼的區(qū)域多于編碼的區(qū)域。

5.大部分基因含有內(nèi)含子，因此，基因是不連續(xù)的（斷裂基因，split gene）

6.基因組遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于原核生物的基因組，具有許多復(fù)制起始點(diǎn)，而每個(gè)復(fù)制子的長(zhǎng)度較小

rDNA：rRNA基因通常集中成簇存在，而不是分散于基因組中，這樣的區(qū)域稱為rDNA，如染色體的核仁組織區(qū)（nucleolus organizer region）即為rDNA區(qū)。

反向重復(fù)序列 ：是指兩個(gè)相同順序的互補(bǔ)拷貝在同一DNA鏈上的反向排列。

衛(wèi)星DNA ：是另一類高度重復(fù)序列，這類重復(fù)序列的重復(fù)單位一般由2-10bp組成，成串排列。

DNA多態(tài)性：是指DNA序列發(fā)生變異從而導(dǎo)致的個(gè)體間核苷酸序列的差異，主要包括：?jiǎn)魏塑账岫鄳B(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）和串聯(lián)重復(fù)序列多態(tài)性（tandem repeats polymorphism）

SNP：是由基因組DNA上的單個(gè)堿基的變異引起的DNA序列多態(tài)性。是人群中個(gè)體差異最具代表性的DNA多態(tài)性，相當(dāng)一部分還直接或間接與個(gè)體的表型差異、對(duì)疾病的易感性或抵抗能力、對(duì)藥物的反應(yīng)性等相關(guān)。SNP被認(rèn)為是一種能穩(wěn)定遺傳的早期突變。

多基因家族（multi gene family）：是指由某一祖先基因經(jīng)過復(fù)制和變異所產(chǎn)生的一組基因。

珠蛋白基因家族：家族的不同成員成簇地分布在不同染色體上，但核酸序列高度同源，編碼一組功能上緊密相關(guān)的蛋白質(zhì)。

假基因(pseudogene)：具有與功能基因相似的序列，但由于有許多突變以致失去了原有的功能，不能轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后生成無功能的蛋白質(zhì)的基因，常用ψ表示。

高等動(dòng)物線粒體基因組具有獨(dú)特的特點(diǎn)？

1.母系遺傳。

2.線粒體DNA損傷后不易修復(fù)，突變率較高。3.遺傳密碼與通用遺傳密碼存在差別。

遺傳圖譜（genetic map）：又稱連鎖圖譜(linkage map)，它是以具有遺傳多態(tài)性的遺傳標(biāo)記為“路標(biāo)”，以遺傳學(xué)距離為圖距的基因組圖。

遺傳多態(tài)性：在一個(gè)遺傳位點(diǎn)上具有一個(gè)以上的等位基因，在群體中的出現(xiàn)頻率皆高于1% 遺傳學(xué)距離：在減數(shù)分裂中，兩個(gè)位點(diǎn)之間進(jìn)行交換、重組的百分率，1%的重組率稱為1cM 物理圖譜（physical map）：利用限制性內(nèi)切酶將大分子DNA切成片段，再根據(jù)重疊序列確定片段間連接順序，以及遺傳標(biāo)志之間物理距離〔堿基對(duì)(bp)或千堿基(kb)或兆堿基(Mb)〕為路標(biāo)的圖譜。序列圖譜：是分子水平上最高層次，最為詳盡的物理圖譜，可得到全部的DNA序列。

基因圖譜（轉(zhuǎn)錄圖譜）：在識(shí)別基因組所包含的蛋白質(zhì)編碼序列的基礎(chǔ)上繪制的結(jié)合有關(guān)基因序列、位置及表達(dá)模式等信息的圖譜。

基因定位克隆：是指利用微衛(wèi)星和SNP全基因組掃描來搜索與疾病性狀緊密相關(guān)的位點(diǎn)，從而確定疾病相關(guān)基因的位置并進(jìn)一步獲得克隆。

宏基因組：是指生境中全部微小生物遺傳物質(zhì)的總和。

宏基因組學(xué)：就是以環(huán)境樣品中的微生物群體基因組為研究對(duì)象, 以功能基因篩選和測(cè)序分析為研究手段,通過非培方法進(jìn)行某個(gè)特殊生態(tài)環(huán)境中微生物群落的鑒定。

蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics): 指應(yīng)用各種技術(shù)手段來研究蛋白質(zhì)組的一門新興科學(xué)，其目的是從整體的角度分析細(xì)胞內(nèi)動(dòng)態(tài)變化的蛋白質(zhì)組成成份、表達(dá)水平與修飾狀態(tài)，了解蛋白質(zhì)之間的相互作用與聯(lián)系，揭示蛋白質(zhì)功能與細(xì)胞生命活動(dòng)規(guī)律。

雙向凝膠電泳技術(shù)（2-DE）：2-DE是指第一向的固相pH梯度（immobilized pH gradient，IPG）等電聚焦電泳與第二向SDS-PAGE組成的分離系統(tǒng)，也稱雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳，簡(jiǎn)稱2-DE。等電聚焦電泳是基于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)（pI）的差異進(jìn)行分離，SDS-PAGE則是根據(jù)蛋白質(zhì)分子量（Mw）的不同進(jìn)行分離。

等電點(diǎn)：在某一pH的溶液中，氨基酸解離成陽離子和陰離子的趨勢(shì)及程度相等，所帶凈電荷為零，呈電中性，此時(shí)溶液的pH稱為該氨基酸的等電點(diǎn)。

等電聚焦電泳: 利用具有pH梯度的支持介質(zhì)分離等電點(diǎn)不同的蛋白質(zhì)的電泳技術(shù)。

等點(diǎn)聚焦：就是在電泳槽中放入載體兩性電解質(zhì)，當(dāng)通以直流電時(shí)，兩性電解質(zhì)即形成一個(gè)由陽極到陰極逐步增加的pH梯度，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)放進(jìn)此體系時(shí)，不同的蛋白質(zhì)即移動(dòng)到或聚焦于與其等電點(diǎn)相當(dāng)?shù)膒H位置上； 優(yōu)點(diǎn)：有很高的分辨率

缺點(diǎn)：一是電聚焦要求用無鹽溶液，而在無鹽溶液中蛋白質(zhì)可能發(fā)生沉淀；

二是樣品中的成分必需停留于其等電點(diǎn)，不適用在等電點(diǎn)不溶或發(fā)生變性的蛋白質(zhì)。

2-DE原理

第一向電泳―IPG等電聚焦電泳在電場(chǎng)中電泳基質(zhì)形成一個(gè)從正極到負(fù)極不斷增大的pH梯度，由于蛋白質(zhì)為兩性電解質(zhì)，帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)分子向正極移動(dòng)，帶正電荷的蛋白質(zhì)分子向負(fù)極移動(dòng)，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)分子運(yùn)動(dòng)到各自的pI處時(shí)，所帶凈電荷變?yōu)榱?，于是停止遷移而留在該位置上。這種不同的蛋白質(zhì)分別聚集在各自的pI處，形成一條狹窄穩(wěn)定的區(qū)帶而彼此分開的現(xiàn)象稱為等電點(diǎn)聚焦。

第二向電泳―SDS-PAGE 在PAGE系統(tǒng)中加入SDS和還原劑后所組成的電泳系統(tǒng)。SDS是一種陰離子去垢劑，疏水端能插入蛋白質(zhì)分子內(nèi)，破壞蛋白質(zhì)分子內(nèi)的氫鍵及疏水作用，改變蛋白質(zhì)分子的三級(jí)和四級(jí)結(jié)構(gòu)；還原劑則斷裂蛋白質(zhì)分子內(nèi)的二硫鍵，使蛋白質(zhì)分子去折疊，結(jié)構(gòu)變得舒展。蛋白質(zhì)分子與SDS充分結(jié)合后，形成帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物，所帶負(fù)電荷大大超過蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，消除了不同分子間原有電荷的差異。蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物在聚丙烯酰胺凝膠電泳系統(tǒng)中的遷移率不再與電荷相關(guān)，而主要取決于蛋白質(zhì)的分子量大小。

酵母雙雜交技術(shù)(yeast two-hybrid system)一種用于研究蛋白質(zhì)相互作用的方法手段，它利用酵母細(xì)胞內(nèi)的真核表達(dá)系統(tǒng)，將兩種外源蛋白質(zhì)的基因分別與酵母轉(zhuǎn)錄因子的兩個(gè)功能結(jié)構(gòu)域融合，通過質(zhì)粒導(dǎo)入酵母細(xì)胞，以酵母細(xì)胞表型的改變作為外源蛋白是否發(fā)生相互作用的篩選標(biāo)志。

基因工程（gene engineering）：又稱DNA重組技術(shù)（DNA recombination），是指將外源基因通過體外重組后導(dǎo)入受體細(xì)胞，并使其能在受體細(xì)胞內(nèi)復(fù)制和表達(dá)的技術(shù)。

分子克?。╩olecular cloning）：是指將目的DNA片段與載體重組，然后導(dǎo)入受體細(xì)胞，并在受體細(xì)胞中復(fù)制、擴(kuò)增，以獲得該DNA分子大量拷貝的技術(shù)。

限制性核酸內(nèi)切酶（restriction endonuclease）：簡(jiǎn)稱限制酶，是一類能識(shí)別和切割雙鏈DNA特定核苷酸序列的核酸水解酶。

回文結(jié)構(gòu)（palindrome structure）：指雙鏈DNA分子上按對(duì)稱軸排列的反向互補(bǔ)序列（常為限制酶所識(shí)別）。粘性末端（sticky end）：指限制酶錯(cuò)位切開兩條對(duì)稱軸互補(bǔ)DNA雙鏈所產(chǎn)生的末端。平末端（blunt end）：指限制酶平齊切開兩條對(duì)稱軸互補(bǔ)DNA雙鏈所產(chǎn)生的末端。同工異源酶（isoschizomers）：指來源不同，但能識(shí)別和切割同一位點(diǎn)的酶。

同尾酶（isocaudarner）：指識(shí)別序列不同，但能產(chǎn)生相同粘性末端的酶。

Taq DNA聚合酶（簡(jiǎn)稱Taq 酶）：是一種耐熱的DNA聚合酶，分子量為65Kd，最佳作用溫度是70~80℃，Taq酶具有→聚合酶活性和依賴于聚合作用的→外切酶活性。逆轉(zhuǎn)錄酶（reverse transcriptase）：是依賴RNA的DNA聚合酶，它以RNA為模板，4種dNTP為底物，催化合成DNA，此過程稱為逆轉(zhuǎn)錄過程。逆轉(zhuǎn)錄酶是多功能酶。RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性（RDDP），核糖核酸酶H活性（RNaseH），DNA聚合酶活性（DDDP）。

末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT，簡(jiǎn)稱末端轉(zhuǎn)移酶）：分子量為60Kd，在二價(jià)陽離子存在下，催化脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移到單鏈或雙鏈DNA分子的末端-OH上。

DNA連接酶（DNA ligase）：主要功能是催化兩個(gè)互補(bǔ)粘性末端或平末端雙鏈DNA分子的磷酸基團(tuán)與羥基形成磷酸二酯鍵，將具有相同粘性末端或平末端的DNA連接起來。

堿性磷酸酶（alkaline phosphatase）：催化去除DNA、RNA或dNTP上的 5?-磷酸基團(tuán)。核酸酶S1：可水解雙鏈DNA、RNA或DNA-RNA雜交分子中的單鏈部分。

載體（vector）：指能攜帶外源DNA片段導(dǎo)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增或表達(dá)的工具。載體的本質(zhì)為DNA?？寺≥d體：能將外源DNA在受體細(xì)胞中復(fù)制、擴(kuò)增并產(chǎn)生足夠量目的DNA的載體。

克隆載體應(yīng)具備的特征

1.能自我復(fù)制并具較高的拷貝數(shù)。2.分子量一般< 10Kb。3.帶有遺傳篩選標(biāo)記。

4.有適當(dāng)?shù)南拗泼该盖形稽c(diǎn)，便于外源DNA的插入和篩選。

多克隆位點(diǎn)（multiple cloning sites，MCS）：載體上具有的多個(gè)限制酶的單一酶切位點(diǎn)。質(zhì)粒：細(xì)菌染色體以外的小分子雙鏈環(huán)狀DNA，能自我復(fù)制并表達(dá)所攜帶的遺傳信息。

質(zhì)?？寺≥d體的主要用途：

① 用于保存和擴(kuò)增< 2Kb目的DNA。

② 構(gòu)建cDNA文庫(kù)。

③ 目的DNA的測(cè)序。

④ 作為核酸雜交時(shí)的探針來源。

溶菌性噬菌體：指噬菌體感染細(xì)胞后，連續(xù)增殖，直到細(xì)菌裂解，釋放的噬菌體又可感染其它細(xì)菌。

溶原性噬菌體：指噬菌體感染細(xì)胞后，可將自身的DNA整合到細(xì)菌的染色體中，和細(xì)菌染色體一起復(fù)制。粘粒載體：由質(zhì)粒和λ噬菌體的cos位點(diǎn)構(gòu)建而成。

表達(dá)載體:是指能將外源基因在受體細(xì)胞中有效轉(zhuǎn)錄和正確翻譯的載體。

報(bào)告基因：是指處于待測(cè)基因下游并通過轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平來反映上游待測(cè)基因功能的基因，又稱報(bào)道基因。?噬菌體載體的用途

1.用作一般的克隆載體。

2.用于構(gòu)建基因組或cDNA文庫(kù)（<22Kb）。3.用于抗體庫(kù)或隨機(jī)肽庫(kù)的構(gòu)建。4.核酸的序列分析。

粘粒載體組成：

1.質(zhì)粒復(fù)制的起始位點(diǎn)(Ori)。2.攜帶抗藥基因。

3.用于插入目的基因的單一酶切位點(diǎn)。4.噬菌體的cos位點(diǎn)。

真核基因在原核細(xì)胞中表達(dá)需要保證外源基因：

1.插入方向的正確性； 2.受原核啟動(dòng)子的控制；

3.必須能在原核細(xì)胞中有效轉(zhuǎn)錄和有效翻譯。

終止子：一個(gè)基因的末端有一特定的DNA序列，它具有被RNA聚合酶識(shí)別并停止轉(zhuǎn)錄的功能。

原核細(xì)胞表達(dá)載體的類型

1.非融合型表達(dá)載體：產(chǎn)生外源蛋白，易被原核細(xì)胞蛋白酶降解。如pKK223-3質(zhì)粒載體。

2.分泌型表達(dá)載體：產(chǎn)生帶信號(hào)肽的分泌型融合蛋白，可減少外源蛋白被降解以及使蛋白質(zhì)能在細(xì)胞外正確折疊，易提取。如PINlll系列。

3.融合型表達(dá)載體：產(chǎn)生由較短的原核細(xì)胞多肽和真核細(xì)胞蛋白質(zhì)構(gòu)成的融合蛋白，具有抗原性，較天然的外源蛋白穩(wěn)定。如pGEX系列。

基因工程的基本步驟

1.目的基因的獲取 2.載體的選擇

3.目的基因和載體的連接 4.重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞 5.重組體的篩選和鑒定

目的基因的獲取

1．從基因文庫(kù)中獲取 2.逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA 3．人工合成DNA片段

4．直接從染色體DNA中分離目的基因

目的基因：指被研究的某一基因或DNA序列，即需要克隆或表達(dá)的基因。

基因組文庫(kù)（genomic library，G-文庫(kù)）：是指含有某種生物全部基因隨機(jī)片段的重組DNA克隆群。轉(zhuǎn)化（transformation）：是指以質(zhì)粒DNA或以它為載體構(gòu)建的重組子導(dǎo)入細(xì)菌的過程。

感受態(tài)細(xì)胞(competent cell)：細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)改變、通透性增加并具有攝取外源DNA能力的細(xì)胞。重組體的篩選

① 根據(jù)載體的抗藥性標(biāo)志篩選

1.根據(jù)載體抗藥性標(biāo)志插入失活選擇

2.?-半乳糖苷酶基因失活篩選（藍(lán)白斑篩選法）3.根據(jù)插入的外源性基因的性狀進(jìn)行篩選 4.核酸雜交技術(shù)篩選

藍(lán)白斑篩選：某些質(zhì)粒載體帶有大腸桿菌乳糖操縱子的lacZ?基因，該基因含一段編碼?-半乳糖苷酶氨基末端145個(gè)氨基酸?-肽的DNA片段，此片段能與宿主細(xì)胞所編碼的缺陷型?-半乳糖苷酶實(shí)現(xiàn)基因內(nèi)?-互補(bǔ)，形成完整的?-半乳糖苷酶，催化指示劑底物X-gal 形成藍(lán)色產(chǎn)物，結(jié)果重組克隆呈藍(lán)色菌落。當(dāng)外源基因插入lacZ?基因中MCS，lac ?-肽基因閱讀框架被破壞，細(xì)菌內(nèi)將無?-半乳糖苷酶活性，結(jié)果重組克隆呈白色菌落。

重組體的鑒定

1.2.3.4.根據(jù)重組子大小鑒定 酶切鑒定 PCR鑒定

DNA序列分析鑒定

核酸變性：在某些理化因素的作用下，維系DNA分子二級(jí)結(jié)構(gòu)的氫鍵和堿基堆積力受到破壞，DNA由雙螺旋變成單鏈過程。

增色效應(yīng)：DNA變性時(shí)其溶液OD260增高的現(xiàn)象。

解鏈曲線：如果DNA是熱變性而導(dǎo)致增色效應(yīng)，以溫度對(duì)A260的關(guān)系作圖，所得的曲線稱為解鏈曲線。

融解溫度（melting temperature，Tm）：在熱變性過程中，紫外吸收增加達(dá)到最大值的50%時(shí)的溫度稱為DNA的解鏈溫度或融解溫度。

Tm的影響因素

1.DNA分子大小和堿基的組成 2.溶液的離子強(qiáng)度 3.pH值 4.變性劑

復(fù)性（renaturation）：指變性 DNA 在適當(dāng)條件下，二條互補(bǔ)鏈全部或部分恢復(fù)到天然雙螺旋結(jié)構(gòu)的現(xiàn)象，它是變性的一種逆轉(zhuǎn)過程。

退火（annealing）：熱變性DNA一般經(jīng)緩慢冷卻后即可復(fù)性，此過程稱之為“退火”。

核酸復(fù)性的影響因素

1.溫度和時(shí)間 2.DNA濃度

3.DNA分子大小和復(fù)雜度 4.離子強(qiáng)度

核酸分子雜交（molecular hybridization）:兩條DNA鏈或兩條RNA鏈或一條DNA鏈和一條RNA鏈按堿基互補(bǔ)的原則締合成異質(zhì)雙鏈的過程稱為分子雜交或核酸分子雜交。

核酸探針（nucleic acid probe)：是指能與特定核苷酸序列發(fā)生特異性互補(bǔ)雜交，雜交后可用特殊方法檢測(cè)的已知被標(biāo)記的核酸分子。

選擇探針的基本原則.高度特異性

2.探針的來源是否方便 3.制備探針的難易程度

核酸探針的類型

1.基因組DNA探針 2.cDNA探針 3.RNA探針 4.寡核苷酸探針

cDNA(complementary DNA)：是指與mRNA互補(bǔ)的DNA分子。

固相分子雜交：是將待測(cè)的靶核苷酸鏈預(yù)先固定在固體支持物上，然后放入含有標(biāo)記探針的雜交液中，進(jìn)行雜交反應(yīng)后，使雜交分子留在支持物上，故稱固體雜交。

正向斑點(diǎn)雜交：簡(jiǎn)稱斑點(diǎn)雜交，將待檢樣品（DNA、RNA 或細(xì)胞）直接點(diǎn)到膜上，烘烤固定。

反向斑點(diǎn)雜交：將不同的探針分別點(diǎn)到尼龍膜等固相介質(zhì)上，再將已標(biāo)記的待測(cè)DNA樣本與之雜交，經(jīng)洗滌去除未結(jié)合的DNA樣本。

寡核苷酸探針設(shè)計(jì)原則

① 探針長(zhǎng)度：一般要求在10～50bp。

②

G／C含量為40％～60％。

③

探針分子中應(yīng)避免互補(bǔ)序列。

④

避免同一堿基連續(xù)出現(xiàn)，一般不能多于4個(gè)，如GGGG-或-CCCC-。

⑤

借助計(jì)算機(jī)相應(yīng)軟件與已知的各種基因序列進(jìn)行同源性比較。

理想的探針標(biāo)記物應(yīng)具有以下特點(diǎn)：

① 檢測(cè)物要靈敏、特異、穩(wěn)定、簡(jiǎn)便。② 標(biāo)記物與探針結(jié)合后，應(yīng)不影響雜交反應(yīng)，尤其是雜 交特異性、穩(wěn)定性和Tm值。③ 標(biāo)記物對(duì)環(huán)境污染小，對(duì)人體無損傷，價(jià)格低廉。④ 標(biāo)記物對(duì)檢測(cè)方法無干擾。

分子雜交技術(shù)一般流程

1.探針制備及標(biāo)記（同位素或非同位素）

2.待測(cè)核酸樣品制備（分離，純化）3.雜交（液相，固相，原位雜交）4.雜交后處理（去掉非特異雜交分子）5.顯示結(jié)果（顯色，發(fā)光，放射自顯影）6.結(jié)果分析

Northern印跡雜交與Southern印跡雜交的不同點(diǎn) ① RNA提取過程中需特別注意RNA酶的污染。② 所用器材最好與Southern印跡實(shí)驗(yàn)分開使用。③ RNA變性的方法：變性劑為甲醛或聚乙二醛，不能用堿變性。

④ 印跡前將含變性劑的凝膠用水沖洗掉，再印跡、雜交。⑤ 如果測(cè)定RNA片段大小，可在同一塊膠上加分子量標(biāo)記物一同電泳，之后將標(biāo)記物切下、上色、照像，樣品膠則進(jìn)行Northern轉(zhuǎn)印。⑥ 轉(zhuǎn)印后不能用低鹽緩沖液洗膜。

正向斑點(diǎn)雜交：簡(jiǎn)稱斑點(diǎn)雜交，將待檢樣品（DNA、RNA 或細(xì)胞）直接點(diǎn)到膜上，烘烤固定。

反向斑點(diǎn)雜交：將不同的探針分別點(diǎn)到尼龍膜等固相介質(zhì)上，再將已標(biāo)記的待測(cè)DNA樣本與之雜交，經(jīng)洗滌去除未結(jié)合的DNA樣本。

菌落雜交：將細(xì)菌從培養(yǎng)平板轉(zhuǎn)移到硝酸纖維濾膜上，然后將濾膜上的菌落裂解以釋放出DNA，將DNA烘干固定于膜上與32P標(biāo)記的探針雜交，放射自顯影檢測(cè)菌落雜交信號(hào)，并與平板上的菌落對(duì)位。

夾心雜交法：設(shè)計(jì)兩條能與目的基因序列互補(bǔ)但又不重疊的探針，一個(gè)稱為捕獲探針，另一個(gè)稱為檢測(cè)探針，目的基因被夾在兩個(gè)探針之間。

微板酶聯(lián)雜交的優(yōu)點(diǎn)

① 捕獲探針共價(jià)結(jié)合在微孔板上，不僅結(jié)合牢固而且結(jié)合量大，因而捕獲能力很強(qiáng)。② 捕獲探針豎直地而不是平躺地“包被”在微孔板表面，因而與目的片段的雜交效率很高。③ 檢測(cè)探針5’端、3’端均標(biāo)記生物素，等量檢測(cè)探針結(jié)合親合素-辣根過氧化物酶的量增加。

原位雜交（In situ hybridization）：是以特定標(biāo)記的已知序列的核酸分子作為探針與細(xì)胞或組織切片中核酸進(jìn)行雜交并對(duì)其檢測(cè)的方法。

原位雜交的應(yīng)用

① 正常或異常染色體的基因定位。② 應(yīng)用核酸探針與細(xì)胞內(nèi)RNA進(jìn)行雜交用于檢測(cè)該組織細(xì)胞中特定基因表達(dá)水平。③ 應(yīng)用特異的病原體核酸作為探針對(duì)組織、細(xì)胞進(jìn)行雜交，以檢測(cè)有無該病原體的感染等。

原位雜交基本流程

1.細(xì)胞或組織切片的處理：玻片清洗、組織和細(xì)胞的固定 2.增強(qiáng)組織的通透性和核酸探針的穿透性 3.預(yù)雜交 4.雜交

5.雜交后漂洗 6.結(jié)果檢測(cè)

熒光原位雜交（fluorescence in-situ hybridization, FISH）：是一種利用非放射性的熒光信號(hào)對(duì)原位雜交樣本進(jìn)行檢測(cè)的技術(shù)。

基因芯片(gene chip)：又稱DNA芯片（DNA chip）或DNA微陣列（DNA microarray），是指集成了大量DNA片段的玻璃片或纖維膜等載體。

雜交條件優(yōu)化

1、探針的選擇 ① 檢測(cè)單個(gè)堿基改變選用寡核苷酸探針。② 檢測(cè)單鏈靶序列選用與其互補(bǔ)的DNA單鏈探針或RNA探針。③ 長(zhǎng)的雙鏈DNA探針特異性較強(qiáng)，適宜檢測(cè)復(fù)雜的靶核苷酸序列和病原體。④ 100bp左右的探針適合原位雜交。2.探針的標(biāo)記方法

①在檢測(cè)單拷貝基因序列時(shí)，應(yīng)選用標(biāo)記效率高、顯示靈敏的探針標(biāo)記方法。

②在對(duì)靈敏要求不高時(shí)，可采用保存時(shí)間長(zhǎng)的生物素探針技術(shù)和價(jià)廉的HRP顯示系統(tǒng)等。

3、探針的濃度

①隨探針濃度增加，雜交率也增加，在較窄的范圍內(nèi)，隨探針濃度增加，敏感性增加。

② 膜雜交中32P標(biāo)記探針與非放射性標(biāo)記探針的用量分別為5～10ng/ml和25～1000ng/ml。

③原位雜交中，一般各種標(biāo)記探針，其用量均為0.5～5.0μg/ml。

4、雜交最適溫度 ① 若反應(yīng)溫度低于Tm 10～15℃，堿基順序高度同源的互補(bǔ)鏈可形成穩(wěn)定的雙鏈，錯(cuò)配對(duì)減少。② 一般情況下，在不含變性劑甲酰胺時(shí)，大多數(shù)雜交反應(yīng)在65℃進(jìn)行，當(dāng)含50%甲酰胺時(shí)，在42℃進(jìn)行。

5、反應(yīng)時(shí)間和洗膜溫度 ① 雜交時(shí)間短了，反應(yīng)無法完成；長(zhǎng)了引起非特異結(jié)合增多。一般雜交20 h左右。② 雜交后的最終洗膜溫度一般應(yīng)低于Tm值5~12℃進(jìn)行。

基因芯片的應(yīng)用

1.基因表達(dá)水平的檢測(cè)

2.基因突變和多態(tài)性的檢測(cè)

3.基因芯片在藥物篩選中的應(yīng)用 4.預(yù)防醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用

5.基因芯片在疾病診斷中的應(yīng)用：感染性疾病診斷、遺傳性疾病的診斷

基因診斷：分子診斷，通過分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)技術(shù)，直接檢測(cè)遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)和表達(dá)是否異常，從而對(duì)疾病做出判斷的方法?；蛟\斷特點(diǎn)：

1.靈敏度高，特異性強(qiáng)。2.可以進(jìn)行病因診斷。

3.病原體診斷時(shí)所耗時(shí)間短，同時(shí)可以檢查成百上千個(gè)病原體 4.在癥狀出現(xiàn)前作出前瞻性診斷。遺傳性疾病的基因診斷策略 1.直接診斷策略 2.間接診斷策略

感染性疾病的基因診斷策略 1.一般性檢出策略 2.完整檢出策略 腫瘤的基因診斷策略 1.檢測(cè)腫瘤相關(guān)基因 2.檢測(cè)腫瘤相關(guān)病毒基因 3.檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物 4.表觀遺傳學(xué)檢測(cè)

基因治療（Gene therapy）：將具有正常功能的基因置換或增補(bǔ)患者體內(nèi)有缺陷的基因，從而達(dá)到治療疾病的目的。

廣義概念，將某種遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到患者細(xì)胞內(nèi)，使其在體內(nèi)發(fā)揮作用，最終達(dá)到治療疾病的目的?；蛑委煹谋貍錀l件： 1.分子缺陷清楚

2.可以得到相應(yīng)基因的克隆 3.病理生理機(jī)制已知 4.有利的風(fēng)險(xiǎn)-利益比 5.治療基因可以被調(diào)控 6.合適的靶細(xì)胞 7.有效安全 8.相關(guān)法規(guī)健全 基因治療的總體策略 針對(duì)致病基因：

（1）基因矯正（gene correction）

對(duì)于致病基因中的異常堿基進(jìn)行精確修復(fù)，使其恢復(fù)正常功能；

（2）基因置換（gene replacement）

用正?；蛟谠惶鎿Q致病基因，使細(xì)胞DNA完全恢復(fù)正常狀態(tài)；

（3）基因增補(bǔ)（gene augmentation）

將正?；?qū)牖颊唧w細(xì)胞內(nèi)，使其整合到染色體中一起表達(dá)，以補(bǔ)償缺陷基因的功能，但致病基因未去除；

（4）基因表達(dá)調(diào)節(jié)（modulation）

指將特定的反義核酸、RNA干擾或核酶等技術(shù)抑制目的基因表達(dá)從而消除致病基因的作用。針對(duì)非致病基因：（1）自殺基因

這種基因?qū)胧荏w細(xì)胞后可產(chǎn)生一種酶，它可將原無細(xì)胞毒性或低毒藥

物前體轉(zhuǎn)化為細(xì)胞毒物質(zhì)，將細(xì)胞受體細(xì)胞殺死，這種基因被稱為“自殺基因”。自殺基因?qū)肽[瘤細(xì)胞后，可將腫瘤細(xì)胞殺死。但對(duì)正常細(xì)胞則無傷害作用。

（2）免疫基因治療

將某些細(xì)胞因子（IL-

2、GM-CSF等）基因?qū)肽[瘤患者體內(nèi)，以增強(qiáng)患者的抵抗力。

（3）耐藥基因治療

在腫瘤化療過程中，把產(chǎn)生抗藥物毒性的基因?qū)牖颊唧w內(nèi)，從而使患者能耐受更大劑量的化療。

基因治療的基本程序

1.目的基因的選擇和獲取

2.目的基因與轉(zhuǎn)運(yùn)載體結(jié)合 3.靶細(xì)胞的確認(rèn)

4.載體攜帶外源基因進(jìn)入細(xì)胞 5.外源基因的整合

6.外源基因的表達(dá)及檢測(cè)

7.治療作用及穩(wěn)定性、安全性評(píng)價(jià) 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的特點(diǎn)

（1）結(jié)構(gòu)和感染過程與普通逆轉(zhuǎn)錄病毒相似；

（2）可使靶細(xì)胞變成穩(wěn)定表達(dá)目的基因的轉(zhuǎn)化細(xì)胞；（3）感染靶細(xì)胞后不擴(kuò)散；

（4）假病毒感染靶細(xì)胞的效率非常高；（5）不感染非增殖細(xì)胞。缺點(diǎn):

①容量小，只能容納8kb-10kb的外源基因片段；

②血清補(bǔ)體能使之失活；

③病毒滴度低，低于治療大腫瘤需要的滴度；

④病毒整合到DNA后，可能引起插入突變和激活癌基因的可能；

⑤宿主范圍有限，只感染增殖細(xì)胞，故在應(yīng)用上有一定局限性。腺病毒載體特點(diǎn)（1）宿主范圍廣

（2）腺病毒蛋白表達(dá)不以宿主增殖為必要條件（3）可獲得高病毒效價(jià)（4）重組體非常穩(wěn)定（5）不會(huì)引起腫瘤（6）有較高的安全性

（7）無包膜，不易被補(bǔ)體滅活，可直接在體內(nèi)應(yīng)用（8）不整合入染色體 痘苗病毒載體

優(yōu)點(diǎn)：

1.宿主范圍廣泛且易于培養(yǎng)，容易獲得高滴度的病毒顆粒。

2.允許在同一或不同非必需區(qū)插入多個(gè)基因，以表達(dá)多種或一種外源蛋白。缺點(diǎn)：細(xì)胞毒性；病毒能被人體的補(bǔ)體系統(tǒng)滅活并降解

單純皰疹病毒載體 特點(diǎn)

（1）滴度高（2）容量大

（3）增殖細(xì)胞和非增殖細(xì)胞均可感染（4）不整合，但可長(zhǎng)期存在并可穩(wěn)定表達(dá)

脂質(zhì)體載體：是用人造雙層磷脂質(zhì)，包裝DNA 后形成的脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物。

優(yōu)點(diǎn)：（1）無毒無抗原性；（2）目的基因與脂質(zhì)體的包裹使其可以免受核酸酶降解，容量大；（3）可單獨(dú)或聯(lián)合其他載體使用，并可通過靜脈注射使目的基因進(jìn)入特定部位。

缺點(diǎn)：表達(dá)時(shí)間短，不能通過細(xì)胞膜屏障

分子耦聯(lián)載體：由DNA、DNA結(jié)合因子和配體三部分組成。配體與特異的受體結(jié)合，經(jīng)受體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞途徑，將目的基因轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)。

多聚物載體：利用帶正電荷的多聚陽離子與帶負(fù)電荷的DNA相結(jié)合，形成穩(wěn)定的多聚復(fù)合物，使DNA不易被核酸酶降解，并可與細(xì)胞表面帶負(fù)電荷的受體相結(jié)合，而被攝入到細(xì)胞中。

納米微生物優(yōu)點(diǎn)：

(1)納米脂質(zhì)體主要由磷脂以及膽固醇合成，可以通過與細(xì)胞膜的融合或者胞吞作用將目的基因?qū)氚屑?xì)胞；

(2)納米微生物材料具有生物兼容性和可生物降解性，在傳遞過程中無毒，無免疫原性，并且可以通過新陳代謝降解，因此不會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性；

(3)通過調(diào)節(jié)納米材料的降解速度，還可以控制目的基因的釋放速度，延長(zhǎng)其治療效果；

(4)納米基因載體比表面積大，并可在表面偶聯(lián)靶細(xì)胞的配體或抗體，實(shí)現(xiàn)基因治療的主動(dòng)靶向性，大大提高基因傳遞的特異性和加強(qiáng)靶細(xì)胞對(duì)目的基因的攝取。

靶細(xì)胞的選擇原則：

（1）必須較堅(jiān)固，足以耐受處理，并易于由人體分離又便于輸回體內(nèi)；

（2）具有增殖優(yōu)勢(shì)，生命周期長(zhǎng)，能存活幾月至幾年，最后可延續(xù)至病人的整個(gè)生命期；（3）易于受外源遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)化；

（4）在選用反轉(zhuǎn)錄病毒載體時(shí)，目的基因表達(dá)最好具有組織特異性的細(xì)胞。干細(xì)胞:一種具有復(fù)制能力、可以形成各種組織的早期未分化細(xì)胞 進(jìn)行基因治療必須具備下列條件：

（1）選擇適當(dāng)?shù)募膊。?duì)其發(fā)病機(jī)理及相應(yīng)基因的結(jié)構(gòu)功能了解清楚；（2）糾正該病的基因已被克隆，并了解該基因表達(dá)與調(diào)控的機(jī)制與條件；（3）該基因具有適宜的受體細(xì)胞并能在體外有效表達(dá)；

（4）具有安全有效的轉(zhuǎn)移載體和方法，以及可供利用的動(dòng)物模型。

靶向性基因載體的選擇：

1.靶向特異性，并且可被免疫系統(tǒng)識(shí)別。2.高度穩(wěn)定，容易制備，可濃縮和純化。3.安全，無毒性，對(duì)人體以及環(huán)境無危害。4.有利于基因高效轉(zhuǎn)移和長(zhǎng)期表達(dá)。

反義技術(shù)：是指利用人工合成的反義RNA和反義DNA來阻斷基因的轉(zhuǎn)錄或復(fù)制，控制細(xì)胞生長(zhǎng)在中間階段，使編碼蛋白質(zhì)的基因能轉(zhuǎn)錄為mRNA，因而不能翻譯成相應(yīng)的蛋白質(zhì)，以達(dá)治療某一疾病的目的。

RNA干擾（RNA interference，RNAi）是一種由雙鏈RNA誘發(fā)的基因沉默現(xiàn)象。在此過程中，與雙鏈RNA有同源序列的信使RNA（mRNA）被降解，從而抑制該基因的表達(dá)。

小干擾性RNA（siRNA）：長(zhǎng)雙鏈RNA被細(xì)胞內(nèi)的雙鏈RNA特異性核酸酶Dicer切成21-23個(gè)堿基對(duì)的短雙鏈RNA，稱為小干擾性RNA（small interfering RNA，siRNA）。

RISC ：RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RNA-induced silencing complex,)，siRNA與細(xì)胞內(nèi)的某些酶和蛋白質(zhì)形成復(fù)合體，稱為RISC。該復(fù)合體可識(shí)別與siRNA有同源序列的mRNA，并在特異的位點(diǎn)將該mRNA切斷?；蛑委煷嬖诘膯栴}：

1.導(dǎo)入基因的穩(wěn)定高效表達(dá)；選擇合適的轉(zhuǎn)移方法；選擇適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞。2.導(dǎo)入基因的安全性；一方面應(yīng)構(gòu)建相對(duì)安全的反轉(zhuǎn)錄病毒載體；另一方面，應(yīng)尋找更安全的非病毒載體；體細(xì)胞基因治療。

3.基因治療與社會(huì)倫理道德?；蛑委煈?yīng)滿足的條件

1、單基因缺陷疾病

2、僅限體細(xì)胞的基因治療

3、靶細(xì)胞易獲取、培養(yǎng)、及回輸體內(nèi)。

4、治療效果應(yīng)勝過對(duì)病人的危害。

5、表達(dá)水平無需調(diào)控且無副作用。

6、需經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證安全可行。基因治療有待解決的問題

1、難以獲得真正有治療作用的基因。

2、外源基因的表達(dá)難以在體內(nèi)精確調(diào)控。

3、體細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)后，其生物學(xué)特性會(huì)有改變。

4、過多的外源蛋白對(duì)機(jī)體帶來可能的影響。

5、隨機(jī)整合潛在的威脅。

生物分子（Biomolecule）：泛指生物體特有的各類分子，是自然存在于生物體中的分子的總稱，是組成生命的基本單位。

生物大分子：生物體內(nèi)結(jié)構(gòu)具有一定規(guī)律性，由基本結(jié)構(gòu)單位按一定順序和方式連接而形成的多聚體。主要是指蛋白質(zhì)、核酸和糖復(fù)合物，是生命活動(dòng)的物質(zhì)基礎(chǔ)。提?。涸诜蛛x純化之前將經(jīng)過預(yù)處理或破碎的細(xì)胞置于適當(dāng)?shù)娜芤褐校贡环蛛x的生物大分子充分地釋放到溶液中，最大限度分離出來的過程。

根據(jù)作用原理生物分子的分離、純化可分為以下幾種類型：

（1）根據(jù)分子極性大小和溶解度的不同，如溶劑提取技術(shù)、鹽析法、分配層析法、分級(jí)沉淀法等；（2）根據(jù)分子形狀和大小不同，如凝膠過濾層析等；

（3）根據(jù)物質(zhì)吸附性質(zhì)不同，如選擇性吸附與吸附層析法等；

（4）根據(jù)分子帶電性（電離性質(zhì)）的差異，如離子交換層析、電泳、等電聚焦法等。（5）根據(jù)配體特異性，如親和層析。影響提取效果的因素

1.2.3.4.5.6.PH值 鹽濃度 溫度 水解酶 攪拌與氧化 有機(jī)溶劑

鹽溶：蛋白質(zhì)或酶在稀鹽溶液中，溶解質(zhì)隨著鹽濃度升高而增加。

鹽析：蛋白質(zhì)或酶在稀鹽溶液中，溶解質(zhì)隨著鹽濃度升高而增加。但當(dāng)鹽濃度達(dá)到一定數(shù)值時(shí)，其溶解度又以不同程度下降并先后析出。

選擇性沉淀法：生物大分子在物理化學(xué)性質(zhì)等方面的差異，選擇一定的條件使雜蛋白變性沉淀而得到分離提純。超濾：指在一定壓力下，使小分子溶質(zhì)和溶劑穿過一定孔徑的特制的薄膜，而大分子溶質(zhì)不能透過，留在膜的一邊，從而使大分子物質(zhì)得到部分純化。

對(duì)于核酸的純化應(yīng)達(dá)到以下三點(diǎn)要求：

（1）核酸樣品中不存在過高濃度的金屬離子和對(duì)酶有抑制作用的有機(jī)溶劑；

（2）其它生物大分子如蛋白質(zhì)、脂類和多糖分子的污染應(yīng)降至最低程度；（3）排除其它核酸分子的污染，如提取DNA分子時(shí)應(yīng)去除RNA，提取RNA分子時(shí)應(yīng)去除DNA。

保持核酸的完整性

（1）溫度不要過高(0～4℃)；(高溫破壞氫鍵)（2）控制pH值范圍(pH值4-10);(極端酸堿破壞磷酸二酯鍵)（3）保持一定離子強(qiáng)度;

（4）減少物理因素對(duì)核酸的機(jī)械剪切力。

DNA提取，DNA樣品不純，抑制后續(xù)酶解和PCR反應(yīng)。

原因：

1.DNA中含有蛋白、多糖、多酚類雜質(zhì)

2.DNA在溶解前，有酒精殘留，酒精抑制后續(xù)酶解反應(yīng) 3.DNA中殘留有金屬離子 對(duì)策：

1.重新純化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等雜質(zhì)（具體方法見前）2.重新沉淀DNA，讓酒精充分揮發(fā) 3.增加70％乙醇洗滌的次數(shù)（2-3次）

DNA降解

原因：

1.材料不新鮮或反復(fù)凍融

2.未很好抑制內(nèi)源核酸酶的活性

3.提取過程操作過于劇烈，DNA被機(jī)械打斷 4.外源核酸酶污染 5.反復(fù)凍融 對(duì)策：

1.盡量取新鮮材料，低溫保存材料避免反復(fù)凍融

2.液氮研磨或勻漿組織后，應(yīng)在解凍前加入裂解緩沖液

3.在提取內(nèi)源核酸酶含量豐富的材料的DNA時(shí)，可增加裂解液中螯合劑的含量 4.細(xì)胞裂解后的后續(xù)操作應(yīng)盡量輕柔

5.所有試劑用無菌水配制，耗材經(jīng)高溫滅菌 6.將DNA分裝保存于緩沖液中，避免反復(fù)凍融

DNA提取量少

原因： 1.實(shí)驗(yàn)材料不佳或量少 2.破壁或裂解不充分 3.沉淀不完全 4.洗滌時(shí)DNA丟失 對(duì)策：

1.盡量選用新鮮（幼嫩）的材料

2.動(dòng)植物要?jiǎng)驖{研磨充分；G＋菌、酵母裂解前先用生物酶或機(jī)械方式破壁 3.高溫裂解時(shí)，時(shí)間適當(dāng)延長(zhǎng)（對(duì)于動(dòng)物細(xì)胞、細(xì)菌可增加PK的用量）4.低溫沉淀，延長(zhǎng)沉淀時(shí)間 5.加輔助物，促進(jìn)沉淀

6.洗滌時(shí)，最好用槍頭將洗滌液吸出，勿傾倒 蛋白質(zhì)分離純化的總體原則 一是保證靶蛋白結(jié)構(gòu)的完整，防止降解和活性蛋白質(zhì)的變性； 二是盡量滿足研究與診斷對(duì)靶蛋白純度的要求。蛋白分離純化影響因素： 1.緩沖液2.鹽、金屬離子和螯合劑3.還原劑 4.去垢劑5.增溶劑 6.蛋白酶抑制劑7.蛋白質(zhì)的環(huán)境因素：表面效應(yīng)的影響；溫度的影響；保存的方式。

蛋白質(zhì)的純度：指是否含有其他雜蛋白，而不包括鹽、緩沖液離子、SDS等小分子在內(nèi)，及在一定條件下的相對(duì)均一性。

凝膠過濾層析：亦稱凝膠色譜、排阻色譜或分子篩，是利用凝膠把分子大小不同的物質(zhì)分離開的一種方法。

電泳：蛋白質(zhì)在高于或低于其pI的溶液中為帶電的顆粒，在電場(chǎng)中能向正極或負(fù)極移動(dòng)。這種通過蛋白質(zhì)在電場(chǎng)中泳動(dòng)而達(dá)到分離各種蛋白質(zhì)的技術(shù), 稱為電泳。

親和層析：是以蛋白質(zhì)與結(jié)合在介質(zhì)上的配基間的特異親和力為工作基礎(chǔ)的蛋白質(zhì)分離方法。

純化程度：常用某一特定靶蛋白成分的含量（一般用活力單位）與總蛋白量（質(zhì)量單位）之比來表示。蛋白質(zhì)的分離純化方法：

1.以溶解度的差異為依據(jù)的方法：鹽析、分配層析、有機(jī)溶劑沉淀、選擇性沉淀和結(jié)晶等； 2.以分子大小及形狀差異為依據(jù)的方法：差速離心、區(qū)帶離心、超濾、透析和凝膠過濾層析等； 3.以電離性質(zhì)差異為依據(jù)的方法：電泳、離子交換層析等； 4.以生物學(xué)功能專一性為依據(jù)的方法：親和層析。生物小分子提取方法：

1、溶劑提取法

2、水蒸氣蒸餾法

3、升華法

4、超臨界流體萃取法

5、超聲提取法

6、固相萃取法

分離精制的原理主要是根據(jù)： 1.物質(zhì)溶解度差別；

2.物質(zhì)在兩相溶劑中的分配比不同； 3.物質(zhì)的吸附性差別；

4.物質(zhì)分子大小差異等進(jìn)行分離 生物小分子純化方法 液-液萃取法

1、逆流分配法（CCD）

2、液滴逆流色譜法（DCCC）

3、高速逆流色譜法（HSCCC）

4、氣液分配色譜（GC或GLC）沉淀法

1.溶劑沉淀法 2.酸堿沉淀法 3.鹽析法 了解

超臨界流體：(SF)指某種氣體（液體）或氣體（液體）混合物在操作壓力和溫度均高于臨界點(diǎn)時(shí)，使其密度接近液體，而其擴(kuò)散系數(shù)和黏度均接近氣體，是性質(zhì)介于氣體和液體之間的流體。

超臨界流體萃取法（SFE）:利用超臨界流體為溶劑，從固體或液體中萃取出某些有效組分，并進(jìn)行分離的一種技術(shù)。超生提取法：利用超聲波特殊的強(qiáng)縱向振動(dòng)、空化效應(yīng)、高速?zèng)_擊破碎、攪拌及加熱等物理性能，破壞提取物細(xì)胞結(jié)構(gòu)，使溶劑能滲入細(xì)胞內(nèi)部，從而加速有效成分的溶解，提高有效成分的提出率。

固相萃取法：利用固體吸附劑將液體樣品中的目標(biāo)化合物吸附，與樣品的基體和干擾化合物分離，然后再用洗脫液洗脫或加熱解吸附，達(dá)到分離和富集目標(biāo)化合物的目的。PCR特點(diǎn)：

1.靈敏度高 皮克(pg=10-12)量級(jí)擴(kuò)增到微克(ug=10-6)水平；能從100萬個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞；病毒檢測(cè)的靈敏度可達(dá)3個(gè) PFU(空斑形成單位)；細(xì)菌檢測(cè)的最小檢出率為3個(gè)細(xì)菌

2.簡(jiǎn)便、快速

一次性加好反應(yīng)液，2～4 小時(shí)完成擴(kuò)增；擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析 3.對(duì)標(biāo)本的純度要求低

血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等組織的粗提DNA平臺(tái)效應(yīng):DNA的指數(shù)擴(kuò)增并不能無限期地進(jìn)行下去，PCR循環(huán)后期時(shí)由于引物、dNTP消耗、DNA聚合酶活力下降等因素使地?cái)U(kuò)增產(chǎn)物累積趨于飽和，原來以指數(shù)遞增的速率曲線變成平坦的曲線，此現(xiàn)象稱為平臺(tái)效應(yīng)。

引物設(shè)計(jì)基本原則

1.引物長(zhǎng)度，典型的引物為18-24個(gè)核苷酸，在一定范圍內(nèi)引物需要足夠長(zhǎng)，最多不超過50個(gè)核苷酸。

2.PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度在普通PCR以200～500bp為宜；實(shí)時(shí)熒光PCR則為50～150bp。3.引物的均衡性和GC含量，同一堿基連續(xù)出現(xiàn)不應(yīng)超過5個(gè)，G-C含量一般為40-60%。

4.引物溶解溫度（Tm值），引物的Tm值一般控制在55-60度, 盡可能保證上下游引物的Tm值一致,一般不超過2度.聚丙烯酰胺凝膠電泳特點(diǎn)

1.分辨力高，長(zhǎng)度僅相差1bp的DNA分子即可分開； 2.上樣量遠(yuǎn)大于瓊脂糖凝膠； 3.回收的DNA純度高；

4.采用銀染色DNA或RNA，靈敏度高，比瓊脂糖凝膠電泳中EB染色法高2-5倍，而且避免EB易退色的弱點(diǎn)。PCR-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析法（PCR-RFLP）：根據(jù)目的基因序列可查出所包含的酶切位點(diǎn)，用相應(yīng)的限制性核酸內(nèi)切酶消化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，然后進(jìn)行電泳，觀察消化片段的大小是否與序列資料相符，從而確定產(chǎn)物的特異性。單鏈構(gòu)型多態(tài)性分析法（PCR-SSCP）：將PCR 產(chǎn)物雙鏈DNA（dsDNA）變性為單鏈DNA（ssDNA），加樣于變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，由于DNA 分子在凝膠中的電泳遷移率與其分子量和空間結(jié)構(gòu)有關(guān)，而空間結(jié)構(gòu)又與ssDNA序列有關(guān)。因此，電泳結(jié)束后，ssDNA帶位置的差異即可反映出PCR產(chǎn)物序列的差異。PCR常見問題

一、假陽性

1.PCR產(chǎn)物是最主要的污染源。2.陽性對(duì)照的污染。

3.標(biāo)本之間的交叉污染。

4.在采集標(biāo)本時(shí)，其他污染源帶來的污染。5.用帶有污染的試劑。

二、假陰性

1.標(biāo)本處理的原因

（1）處理標(biāo)本時(shí)，靶DNA丟失。

（2）理標(biāo)本時(shí)，雜質(zhì)成分沒有去除干凈，帶入PCR反應(yīng)中抑制了Taq酶活性。（3）標(biāo)本放置不當(dāng)，模板發(fā)生降解（尤其是RNA）

2.PCR試劑問題。

（1）引物設(shè)計(jì)不合理。（2）Taq DNA聚合酶失活。

（3）Mg2+濃度過低或是沒有加。3.PCR擴(kuò)增過程中的問題

（1）PCR擴(kuò)增儀故障。

（2）PCR擴(kuò)增反應(yīng)液沒有加液體石蠟油。

4.PCR產(chǎn)物鑒定中的問題

（1）電泳時(shí)沒有加溴化乙錠。

（2）電泳緩沖液和凝膠使用次數(shù)過多。（3）膠濃度過低，使擴(kuò)增帶跑散。

三、引物二聚體

形成引物二聚體的原因有：

⑴兩個(gè)相同的或不同的引物分子之間有較多的堿基配對(duì)，特別是引物3′端有互補(bǔ)區(qū)。

⑵引物比例太高，可增加模板用量。

⑶退火溫度過低。

⑷熱循環(huán)次數(shù)過多。

四、非特異性PCR產(chǎn)物

（1）引物特異性不高或用量太大，應(yīng)更換引物或降低用量；

（2）TaqDNA聚合酶質(zhì)量不好或用量太大，應(yīng)更換酶或降低酶使用量；（3）Mg2+濃度過高，可適當(dāng)調(diào)整其濃度；（4）退火溫度過低，可提高退火溫度；（5）延伸時(shí)間過長(zhǎng)，可減少延伸時(shí)間；

（6）循環(huán)次數(shù)過多，應(yīng)適當(dāng)增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。

one-step RT-PCR：一步法RT-PCR，在同一體系中加入逆轉(zhuǎn)錄酶、逆轉(zhuǎn)錄引物、Taq DNA聚合酶、PCR引物、dNTP和緩沖液，直接以mRNA為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增。多重PCR（multiplex PCR）：在一個(gè)反應(yīng)體系中加入多對(duì)引物，同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)核酸片段，由于每對(duì)引物擴(kuò)增的片段長(zhǎng)度不同，可用電泳加以鑒別。

重組PCR（recombinant PCR）：將兩個(gè)不相鄰的DNA片段重組在一起的PCR稱為重組PCR。該技術(shù)主要應(yīng)用于DNA片段的任何位置引入點(diǎn)突變、插入、缺失以及兩個(gè)不相鄰片段的連接。

巢式PCR：用兩隊(duì)引物，一對(duì)引物序列在模板的外側(cè)，另一對(duì)引物在模板的內(nèi)側(cè)。第一對(duì)引物做PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物作為第二對(duì)引物退火的模板，再做PCR。經(jīng)過兩次PCR放大，靈敏度得以提高，并大大提高PCR的特異性。錨定PCR（anchored PCR，APCR）：用于擴(kuò)增已知一端序列的目的DNA。

定量PCR:以參照物為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)PCR終產(chǎn)物進(jìn)行分析或?qū)CR過程進(jìn)行監(jiān)測(cè)，從而達(dá)到評(píng)估樣本中靶基因的拷貝數(shù)，稱為定量PCR。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-FQ-PCR）：在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。

Ct值的定義：PCR擴(kuò)增過程中，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)過的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)

熒光定量PCR的臨床應(yīng)用

1.遺傳疾病的早期診斷 2.腫瘤的診斷

3.抗病毒藥物療效的觀察、指導(dǎo) 4.病情評(píng)估和預(yù)后判斷 5.新藥驗(yàn)證 6.輸血源的篩選

7.母嬰傳播的控制與觀察

PCR操作程序標(biāo)準(zhǔn)化

（一）上崗人員培訓(xùn)制度

（二）標(biāo)準(zhǔn)化PCR診斷實(shí)驗(yàn)室

（三）PCR標(biāo)準(zhǔn)化操作程序 1．試劑配制、分裝及保存 2．標(biāo)本的采集與處理

3．基因擴(kuò)增及其實(shí)驗(yàn)條件的選擇 4．?dāng)U增產(chǎn)物檢測(cè) 5．PCR結(jié)果的判讀

（四）污染的預(yù)防及污染源的標(biāo)準(zhǔn)化處理

代謝組(metabolome)是指一個(gè)細(xì)胞、組織或器官中所有代謝物的集合, 包含一系列不同化學(xué)型的分子, 比如肽、碳水化合物、脂類、核酸以及異源物質(zhì)的催化產(chǎn)物等。

代謝組學(xué)(metabonomics／metabolomics)通過考察生物體系（細(xì)胞、組織或生物體）受刺激或擾動(dòng)后（如將某個(gè)特定的基因變異或環(huán)境變化后），其代謝產(chǎn)物的變化或其隨時(shí)間的變化，來研究生物體系的一門科學(xué)。

代謝組學(xué)特點(diǎn)：

1.關(guān)注于內(nèi)源性小分子化合物。

2.對(duì)生物體系中的小分子化合物進(jìn)行定性定量研究

3.內(nèi)源性小分子化合物的上調(diào)和下調(diào)指示了與疾病、毒性、基因修飾或環(huán)境因子的影響。4.內(nèi)源性化合物的特點(diǎn)用來表征疾病和藥物篩選。應(yīng)用： 1.藥物研發(fā) 2.疾病研究 3.植物代謝組學(xué) 4.微生物代謝組學(xué) 5.中藥現(xiàn)代化

毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（CE-MS）：毛細(xì)管電泳是以毛細(xì)管為分離通道、采用高壓直流電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力的的新型液相分離技術(shù)，通過離子化合物的質(zhì)荷比（m/z）不同造成遷移速率不同來實(shí)現(xiàn)分離。適用于普通反相色譜柱不易保留的離子性代謝物的分離分析。

miRNA：miRNA是由21~25個(gè)核苷酸組成的非編碼RNA；它通過與靶基因的3-UTR的配對(duì)，促進(jìn)mRNA的降解或抑制mRNA的翻譯從而抑制其靶基因的表達(dá)；它在生物體生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞增殖、分化、凋亡以及人類各種疾病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。

MicroRNA的起源與生物合成過程

1.miRNA基因被轉(zhuǎn)錄成pri-miRNA(RNA 聚合酶Ⅱ)；

2.pri-miRNA被剪切成具有70-100個(gè)核苷 酸 的pre-miRNA(Drosha,DGCR8)； 3.pre-miRNA從核內(nèi)被轉(zhuǎn)移至胞質(zhì)(Exportin-5, Ran-GTP)；

4.pre-miRNA被剪切成21-25個(gè)核苷酸的雙鏈 RNA雙體(Dicer,TRBP,PACT)； 5.雙鏈RNA雙體中成熟miRNA鏈會(huì)選擇性整合入RISC,并與mRNA互補(bǔ)配對(duì)。

MicroRNA的特征

1.廣泛存在于真核生物中, 是一類內(nèi)源性表達(dá)的非編碼短序列RNA, 本身不具有開放閱讀框(ORF)； 2.成熟的miRNA長(zhǎng)度通常為21～25nt； 3.miRNA在進(jìn)化上具有高度保守性；

4.miRNA表達(dá)具有細(xì)胞和組織特異性，同時(shí)具有時(shí)序性

MicroRNA的調(diào)控機(jī)制

一、mRNA剪切 1.miRNA與靶mRNA幾乎完全互補(bǔ)；

2.切割位點(diǎn)在從5‘端起與miRNA配對(duì)的第10位和11位核苷酸之間 ； 3.由RISC中的內(nèi)切酶催化完成； 4.可催化多個(gè)mRNA分子的降解

二、翻譯抑制

1.miRNA與靶mRNA互補(bǔ)程度較低；

2.翻譯抑制可能發(fā)生在翻譯起始后的某一階段； 3.翻譯順利進(jìn)行但翻譯產(chǎn)物可能被特異性降解

MicroRNA表達(dá)的研究方法

1.miRNA基因芯片技術(shù)

2.PAGE/Northern blotting雜交法 3.原位雜交

4.miRNA實(shí)時(shí)定量PCR

MicroRNA功能研究方法

一、miRNA體外或體內(nèi)水平的過表達(dá)研究 1.構(gòu)建相應(yīng)的表達(dá)載體

2.體外合成miRNA前體分子

二、miRNA表達(dá)抑制研究 3.基因水平抑制miRNA表達(dá)

4.使用反義核酸分子抑制miRNA表達(dá)

miRNA研究的實(shí)驗(yàn)技術(shù)

1.miRNA基因的克隆

2.PAGE/Northern blotting 3.miRNA基因芯片技術(shù) 4.miRNA實(shí)時(shí)定量PCR

miRNA基因克隆的基本步驟

（一）總RNA的提取

關(guān)鍵：盡量不使小RNA丟失

（二）小分子RNA分離純化及富集

變性聚丙烯酰胺凝膠（PAGE）方法是用于小分子RNA分離純化的理想方法。

（三）小分子RNA片段修飾

小分子RNA的修飾包括磷酸化、去磷酸化以及在3‘端和5’端連接上連接子等

（四）克隆及測(cè)序鑒定

含3‘與5’端接頭的小分子RNA，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增后連接至合適的載體，轉(zhuǎn)化克隆，最后用相關(guān)方法鑒定陽性克隆。

（五）PAGE/Northern blotting驗(yàn)證

PAGE/Northern blotting方法是確認(rèn)microRNA 最有效 和常用的方法。

PAGE/Northern blotting基本操作步驟

（一）總RNA的提取

關(guān)鍵：盡量不使小RNA丟失

（二）樣品處理

取適量提取的RNA樣品于上樣緩沖液及去離子甲酰胺中 混勻，55℃孵育30 min，冰浴后準(zhǔn)備PAGE分離。

（三）PAGE分離、轉(zhuǎn)膜及固定

（四）寡核苷酸探針的制備 探針標(biāo)記可選擇放射性核素或非放射性熒光，其中放射 性核素敏感度高，可檢測(cè)較低豐度的microRNA分子

（五）雜交、洗膜、壓片及顯影

（六）如果選用放射性標(biāo)記的探針，在分析結(jié)果后要去除Northern印記膜上的放射性，避免放射性污染。

MicroRNA基因芯片技術(shù)主要應(yīng)用：

（1）尋找和發(fā)現(xiàn)新microRNA基因；

（2）miRNA相關(guān)疾病的診斷和治療，如腫瘤、白血病、糖尿病等；

（3）藥物篩選和藥物開發(fā)等；

MicroRNA基因芯片技術(shù)操作流程

（一）MicroRNA基因芯片的設(shè)計(jì)與制作

（二）RNA提取與純化

（三）RNA樣品的標(biāo)記

（四）芯片雜交及后處理

（五）圖像采集和數(shù)據(jù)分析

（六）驗(yàn)證

MicroRNA實(shí)時(shí)定量PCR主要應(yīng)用：

（1）microRNA的定量檢測(cè)，可精確檢測(cè)出細(xì)胞或組織樣品中特定微量的microRNA表達(dá)水平；

（2）由于該方法可以同時(shí)檢測(cè)microRNA及其前體，因此，可以根據(jù)兩者在不同發(fā)育階段的表達(dá)差異情況來深入了解microRNA的起源和發(fā)生；（3）應(yīng)用于臨床診斷和治療等。

MicroRNA實(shí)時(shí)定量PCR操作步驟

（一）總RNA提取、小分子RNA的分離純化及富集

（二）逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

（三）實(shí)時(shí)定量PCR MicroRNA造成疾病發(fā)生的可能原因：突變、基因表達(dá)失活、低效轉(zhuǎn)錄等原因造成的microRNA表達(dá)下調(diào)；啟動(dòng)子區(qū)域基因擴(kuò)增或突變等原因造成的microRNA表達(dá)上調(diào)等。MicroRNA引發(fā)腫瘤的可能原因：

（1）microRNA與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡密切相關(guān)，而腫瘤則是由細(xì)胞增殖、分化、凋亡功能紊亂而引發(fā)的 ；（2）許多microRNA的基因位于基因組中易發(fā)生斷裂、移位、缺失等變異的區(qū)域 ；（3）與正常組織相比，在惡性腫瘤和腫瘤細(xì)胞株中普遍存在著對(duì)microRNA的表達(dá)失控 MicroRNA引發(fā)糖尿病的可能原因：

（1）MicroRNA參與胰島素的合成分泌調(diào)節(jié)；（2）MicroRNA對(duì)血糖代謝起著直接或間接的調(diào)控作用；（3）MicroRNA與脂質(zhì)代謝密切相關(guān)； 附作業(yè)一

1.斷裂基因: 基因是核酸分子中貯存遺傳信息的遺傳單位，一個(gè)基因不僅僅包括編碼蛋白質(zhì)或 RNA 的核酸序列，還包括保證轉(zhuǎn)錄所必需的調(diào)控序列、位于編碼區(qū) 5 ' 端與 3 ' 端的非編碼序列和內(nèi)含子。真核生物的結(jié)構(gòu)基因，由若干個(gè)編碼區(qū)和非編碼區(qū)互相間隔開但又連續(xù)鑲嵌而成，去除非編碼區(qū)再連接后，可翻譯出由連續(xù)氨基酸組成的完整蛋白質(zhì)，這些基因稱為斷裂基因（split gene）。

2.單核苷酸多態(tài)性：主要是指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。它是人類可遺傳的變異中最常見的一種。占所有已知多態(tài)性的90%以上。SNP在人類基因組中廣泛存在，平均每500～1000個(gè)堿基對(duì)中就有1個(gè)，估計(jì)其總數(shù)可達(dá)300萬個(gè)甚至更多。1.簡(jiǎn)述真核生物基因組的結(jié)構(gòu)與功能特點(diǎn)。答：（1）真核生物細(xì)胞核基因組的結(jié)構(gòu)和功能。

①：真核生物基因組存在大量的重復(fù)序列 a)單拷貝序列（低度重復(fù)序列）b)中度重復(fù)序列 c)高度重復(fù)序列

d)重復(fù)序列的多態(tài)性：主要包括單核苷酸多態(tài)性和串聯(lián)重復(fù)序列多態(tài)性 ②：真核基因組存在多基因家族和假基因

多基因家族：是指由某一祖先基因經(jīng)過重復(fù)和變異所產(chǎn)生的一組基因。

假基因：是指與某些有功能基因結(jié)構(gòu)相似，但不能表達(dá)有功能基因產(chǎn)物的某些基因。（2）真核生物細(xì)胞器基因組的結(jié)構(gòu)和功能

真核生物有兩類細(xì)胞器能攜帶遺傳物質(zhì)：線粒體和葉綠體

大多數(shù)細(xì)胞器基因組是環(huán)狀DNA，某些低等真核生物（如草履蟲、衣滴蟲和幾種酵母）的線粒體DNA是線狀分子。線粒體基因組的大小差異比較大，從1萬至數(shù)百萬bp不等。高等動(dòng)物線粒體基因組具有獨(dú)特的特點(diǎn)：母系遺傳；線粒體DNA損傷后不易修復(fù)，突變率高，可能與衰老及某些疾病有關(guān)；遺傳密碼與通用遺傳密碼存在差別。2.試述雙向凝膠電泳技術(shù)的基本原理。

答：蛋白質(zhì)組研究的發(fā)展以雙向電泳技術(shù)（2-DE）作為核心。原理簡(jiǎn)明：是利用蛋白質(zhì)的帶點(diǎn)性和分子量大小的差異，通過兩次凝膠電泳達(dá)到分離蛋白質(zhì)的技術(shù)。第一向電泳是依據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不同，通過等電聚焦電泳（isoelec-tricfocusing，IEF）將不同凈電荷的蛋白質(zhì)在PH梯度介質(zhì)中外加電場(chǎng)作用形成分離的蛋白質(zhì)區(qū)帶。然后將凝膠包埋在SDS-PAGE凝膠板上端，根據(jù)蛋白質(zhì)分子量的不同，在垂直或水平方向進(jìn)行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），即第二向電泳。在IEF中，蛋白質(zhì)因等電點(diǎn)不同而被分離，在SDS-PAGE中，不同分子量的蛋白質(zhì)相互間被分離開。作業(yè)二

1.分子克隆技術(shù)包括哪些基本步驟？

答：分子克隆技術(shù)的基本步驟大致包括：①目的基因的獲?。虎谳d體的選擇；③目的基因與載體連接；④重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞；⑤重組體的篩選等；即分、切、接、轉(zhuǎn)、篩等過程。2.目的基因和載體連接主要有哪些方法？

答: 目的基因與載體構(gòu)建成重組體的方法主要有：1).粘性末端DNA分子的連接2).平末端連接法3).通過同聚尾連接。

3.簡(jiǎn)述分子克隆中常用的工具酶及其作用。

在分子克隆技術(shù)中，常用的工具酶主要有：1.限制性核酸內(nèi)切酶，它是一類能識(shí)別和切割雙鏈DNA特定核苷酸序列的核酸水解酶；2.DNA聚合酶Ⅰ，它具有3種酶活性：1)5'→3'聚合酶活性；2)3'→5'核酸外切酶活性；3)5'→3'核酸外切酶活性；3.反轉(zhuǎn)錄酶，其功能主要有：1)逆轉(zhuǎn)錄作用2)核酸酶H的水解作用3)依賴DNA的DNA聚合酶作用；4.DNA連接酶，它在DNA重組中的主要功能是催化兩個(gè)互補(bǔ)粘性末端或平末端雙鏈DNA分子的5'磷酸基團(tuán)與3’羥基形成磷酸二酯鍵，將具有相同粘性末端或平末端的兩條雙鏈DNA片段連接起來，實(shí)現(xiàn)DNA的體外重組；5.堿性磷酸酶，它的作用是催化去除DNA、RNA或dNTP上的5'-磷酸基團(tuán)；6.末端脫氧核糖核苷酰轉(zhuǎn)移酶，其功能主要有：1)在載體或目的基因 3'末端加上互補(bǔ)的同質(zhì)多聚尾，形成人工粘性末端，便于DNA重組連接。2)用于DNA 3'末端的同位素探針標(biāo)記；7.核酸酶S1，其作用是除去雙鏈DNA的粘性末端以產(chǎn)生平末端、除去cDNA合成時(shí)形成的發(fā)夾結(jié)構(gòu)以及分析RNA的莖環(huán)結(jié)構(gòu)和DNA-RNA分子的雜交情況等。4.舉例說明載體應(yīng)具備的基本要素。

答: 載體應(yīng)具備以下特征：1)能自我復(fù)制并具有較高的拷貝數(shù)，并有適宜的分子量，一般應(yīng)< 10 kb；2)帶有遺傳篩選標(biāo)記；3)有適當(dāng)?shù)南拗泼盖形稽c(diǎn)，便于外源基因的插入和篩選。5.簡(jiǎn)述雙抗生素篩選和藍(lán)白斑篩選的原理。

答：1.雙抗生素篩選的原理是：因大多數(shù)質(zhì)粒載體帶有抗生素抗性標(biāo)記的特征（如Ampr、Tetr等），當(dāng)帶有完整抗性基因的載體轉(zhuǎn)化無抗性細(xì)菌后，被轉(zhuǎn)化的陽性菌獲得抗生素抗性基因而存活并形成噬菌斑，未轉(zhuǎn)化菌不能存活，但應(yīng)排除未重組的空載體。2.藍(lán)白斑篩選的原理：某些質(zhì)粒載體帶有大腸桿菌乳糖操縱子的lacZ基因，該基因含一段編碼β-半乳糖苷酶氨基末端145個(gè)氨基酸α-肽的DNA片段，IPTG可誘導(dǎo)此片段合成，此片段能與宿主細(xì)胞所編碼的缺陷型β-半乳糖苷酶實(shí)現(xiàn)基因內(nèi)α-互補(bǔ)，形成完整的β-半乳糖苷酶。該酶能催化指示劑底物X-gal 形成藍(lán)色菌落。當(dāng)外源基因插入lacZ基因中MCS，lacα-肽基因閱讀框架被破壞，細(xì)菌內(nèi)將無β-半乳糖苷酶活性，結(jié)果重組克隆呈白色菌落。6.有哪些常用的探針標(biāo)記物？

答：常用的探針標(biāo)記物有：1.放射性同位素標(biāo)記，常用標(biāo)記探針的同位素有 32P、3H、35S、131I、125I 等。2.非放射性標(biāo)記，常用的非放射標(biāo)記物有辣根過氧化物酶（HRP)、熒光素、生物素、光敏生物素、地高辛(DIG)等。

7.如何進(jìn)行探針的標(biāo)記？

答：1.放射性同位素標(biāo)記探針的的方法有缺口平移法、隨機(jī)引物法、末端標(biāo)記法和反轉(zhuǎn)錄標(biāo)記法等。2.非放射性標(biāo)記核酸探針的方法分為化學(xué)修飾標(biāo)記法和酶促反應(yīng)標(biāo)記法兩大類： ① 化學(xué)修飾標(biāo)記法是利用標(biāo)記物分子上的活性基團(tuán)與探針分子上的某些基團(tuán)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，將標(biāo)記物直接或間接結(jié)合到探針分子上?；瘜W(xué)標(biāo)記法具有方法簡(jiǎn)單、成本低、標(biāo)記方法較通用，也是目前較為常用的標(biāo)記方法； ② 酶促反應(yīng)標(biāo)記法是將標(biāo)記物預(yù)先標(biāo)記在單核苷酸分子上，然后利用酶促反應(yīng)將標(biāo)記的核苷酸分子摻人到核酸探針分子中。這種標(biāo)記法具有靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，但其標(biāo)記過程較復(fù)雜、成本較高。

8.影響核酸分子雜交的因素有那些？如何進(jìn)行雜交條件的優(yōu)化？ 答：影響核酸分子雜交的因素有: 雜交方法的選擇、探針的選擇、探針的濃度、溫度、雜交液的成分、反應(yīng)時(shí)間等。核酸分子雜交實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化有：

1.探針的選擇：針對(duì)不同的雜交實(shí)驗(yàn)，選擇不同的核酸探針，在大多數(shù)情況下，可以選擇克隆的 DNA 或 cDNA 雙鏈探針。但在檢測(cè)靶序列上的單個(gè)堿基改變時(shí)應(yīng)選用寡核苷酸探針，在檢測(cè)單鏈靶序列時(shí)應(yīng)選用與其互補(bǔ)的 DNA 單鏈探針或 RNA 探針。

2.探針的標(biāo)記方法，選擇什么標(biāo)記方法視靈敏度和顯示方法等實(shí)驗(yàn)要求和條件而定。

3.探針的濃度：隨探針濃度增加，雜交率也增加，在較窄的范圍內(nèi)，隨探針濃度增加，敏感性增加。4.雜交最適溫度，在實(shí)驗(yàn)前必須首先確定雜交溫度。5.雜交反應(yīng)時(shí)間，一般雜交反應(yīng)要進(jìn)行 20 h 左右。

6.洗膜溫度，雜交后的最終洗膜溫度一般應(yīng)低于 Tm 值 5~ 12 ℃ 進(jìn)行。

7.雜交液的優(yōu)化,通常用于 DNA 雜交的標(biāo)準(zhǔn)雜交液為 5×SSC, 1.0%casein , 0.1% 十二烷基肌氨酸，0.02% 十二烷基硫酸鈉。但除了以上成分外，必要的時(shí)候可以加一些雜交促進(jìn)劑。常用的有硫酸葡聚糖，它能促進(jìn) DNA 鏈之間的締合。作業(yè)三

一、名解

1.生物大分子：指的是作為生物體內(nèi)主要活性成分的各種分子量達(dá)到上萬或更多的有機(jī)分子。常見的生物大分子包括蛋白質(zhì)、核酸、脂類、糖類。

2.酚抽提法：最初于1976年由Stafford及其同事提出，通過改良，以含EDTA、SDS及無DNA酶的RNA酶裂解緩沖液破碎細(xì)胞，經(jīng)蛋白酶K處理后，用pH8.0的Tris飽和酚抽提DNA，重復(fù)抽提至一定純度后，根據(jù)不同需要進(jìn)行透析或沉淀處理獲得所需的DNA樣品。

3.凝膠過濾層析：凝膠過濾層析也稱分子排阻層析或分子篩層析，利用凝膠分子篩對(duì)大小、形狀不同的分子進(jìn)行層析分離，是根據(jù)分子大小分離蛋白質(zhì)混合物最有效的方法之一。

4.巢式PCR ：巢式PCR是一種變異的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，使用兩對(duì)（而非一對(duì)）PCR引物擴(kuò)增完整的片段。第一對(duì)PCR引物擴(kuò)增片段和普通PCR相似。第二對(duì)引物稱為巢式引物（因?yàn)樗麄冊(cè)诘谝淮蜳CR擴(kuò)增片段的內(nèi)部）結(jié)合在第一次PCR產(chǎn)物內(nèi)部，使得第二次PCR擴(kuò)增片段短于第一次擴(kuò)增。巢式PCR的好處在于，如果第一次擴(kuò)增產(chǎn)生了錯(cuò)誤片斷，則第二次能在錯(cuò)誤片段上進(jìn)行引物配對(duì)并擴(kuò)增的概率極低。因此，巢式PCR的擴(kuò)增非常特異。5.Real-time PCR：實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。

6.變性：模板DNA經(jīng)加熱至94℃左右5min 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備。

7.復(fù)性 ：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合。

8.退火：溫度突然降至37-58℃時(shí)，變性的DNA單鏈在堿基互補(bǔ)的基礎(chǔ)上重新形成氫鍵開始復(fù)性。一般退火溫度比引物Tm值約低5℃。

1.根據(jù)作用原理生物分子的分離純化有那幾類？

答：根據(jù)作用原理生物分子的分離純化可分為：（1）根據(jù)分子極性大小和溶解度的不同，如溶劑提取技術(shù)、鹽析法、分配層析法、分級(jí)沉淀法等；（2）根據(jù)分子形狀和大小不同，如凝膠過濾層析等；（3）根據(jù)物質(zhì)吸附性質(zhì)不同，如選擇性吸附與吸附層析法等；（4）根據(jù)分子帶電性（電離性質(zhì)）的差異，如離子交換層析、電泳、等電聚焦法等。（5）根據(jù)配體特異性，如親和層析。2.什么原因易引起DNA降解，該如何解決？

答：引起DNA降解的原因有：1）材料不新鮮或反復(fù)凍融2）未很好抑制內(nèi)源核酸酶的活性3）提取過程操作過于劇烈，DNA被機(jī)械打斷4）外源核酸酶污染5）反復(fù)凍融。

相應(yīng)的解決方法有：1）盡量取新鮮材料，低溫保存材料避免反復(fù)凍融；液氮研磨或勻漿組織后，應(yīng)在解凍前加入裂解緩沖液2）在提取內(nèi)源核酸酶含量豐富的材料的DNA時(shí)，可增加裂解液中螯合劑的含量3）細(xì)胞裂解后的后續(xù)操作應(yīng)盡量輕柔4）所有試劑用無菌水配制，耗材經(jīng)高溫滅菌5）將DNA分裝保存于緩沖液中，避免反復(fù)凍融。3.簡(jiǎn)述PCR技術(shù)的基本原理及其反應(yīng)體系的一般組成？

答：PCR技術(shù)的基本原理是DNA的半保留復(fù)制，是在模板DNA、引物和四種dNTP存在的條件下，依賴于DNA聚合酶的酶促反應(yīng)。在反應(yīng)中混合下列物質(zhì)：模板DNA、四種dNTP（包括dATP、dTTP、dGTP、dCTP）、引物

1、引物

2、TaqDNA聚合酶、緩沖液及Mg2+（MgCl2），然后經(jīng)下列過程大量擴(kuò)增靶DNA?；镜姆磻?yīng)分變性、退火、延伸等三步完成。

4.試分析PCR出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的原因及解決方法？ 答：（1）引物特異性不高，引物用量過多，應(yīng)調(diào)換引物或降低引物用量。（2）TaqDNA聚合酶質(zhì)量不好或用量偏高，應(yīng)降低酶量或使用質(zhì)量較好的酶。（3）Mg2+濃度過高，可適當(dāng)調(diào)節(jié)Mg2+濃度。（4）退火溫度過低，退火及延伸時(shí)間偏長(zhǎng)，可提高退火溫度，減少退火及延伸時(shí)間，或者采用二溫循環(huán)PCR進(jìn)行擴(kuò)增。（5）熱循環(huán)次數(shù)過多，適當(dāng)增加模板用量，減少循環(huán)次數(shù)。作業(yè)四

一、名解 1.代謝組學(xué)：通過考察生物體系（細(xì)胞、組織或生物體）受刺激或擾動(dòng)后（如將某個(gè)特定的基因變異或環(huán)境變化后），其代謝產(chǎn)物的變化或其隨時(shí)間的變化，來研究生物體系的一門科學(xué)。其研究對(duì)象大都是相對(duì)分子質(zhì)量1000以內(nèi)的小分子物質(zhì)。

2.毛細(xì)管電泳：毛細(xì)管電泳是以毛細(xì)管為分離通道、采用高壓直流電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力的的新型液相分離技術(shù)，通過離子化合物的質(zhì)荷比（m/z）不同造成遷移速率不同來實(shí)現(xiàn)分離。

3.NMR：基于具有自旋性質(zhì)的原子核在核外磁場(chǎng)的作用下，吸收射頻輻射而產(chǎn)生的能級(jí)躍遷譜學(xué)，主要用于反映化合物結(jié)構(gòu)中的H和C原子的位置信息。

4.gene therapy：基因治療將某種遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到患者細(xì)胞內(nèi)，使其在體內(nèi)發(fā)揮作用，最終達(dá)到治療疾病的目的。5.stem cell：干細(xì)胞將某種遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到患者細(xì)胞內(nèi)，使其在體內(nèi)發(fā)揮作用，最終達(dá)到治療疾病的目的。

6.CRISPR/Cas system：（clustered regularly interspaced short palindromic repeats associated(Cas)）Cas系統(tǒng)廣泛存在于細(xì)菌及古生菌中, 是機(jī)體長(zhǎng)期進(jìn)化形成的RNA指導(dǎo)的降解入侵病毒或噬菌體DNA的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)?；诩?xì)菌的這種免疫功能，人們把Ⅱ型CRISPR-Cas系統(tǒng)改造成一種全新的人工核酸內(nèi)切酶，從而使該系統(tǒng)能夠?qū)Π谢蜻M(jìn)行修飾。

二、問答 1.簡(jiǎn)述代謝組學(xué)特點(diǎn)？

答：1.關(guān)注于內(nèi)源性小分子化合物。

2.對(duì)生物體系中的小分子化合物進(jìn)行定性定量研究

3.內(nèi)源性小分子化合物的上調(diào)和下調(diào)指示了與疾病、毒性、基因修飾或環(huán)境因子的影響。4.內(nèi)源性化合物的特點(diǎn)用來表征疾病和藥物篩選。2.簡(jiǎn)述MicroRNA的生物合成過程？

答：1.miRNA基因被轉(zhuǎn)錄成pri-miRNA(RNA 聚合酶Ⅱ)；

2.pri-miRNA被剪切成具有70-100個(gè)核苷 酸 的pre-miRNA(Drosha,DGCR8)； 3.pre-miRNA從核內(nèi)被轉(zhuǎn)移至胞質(zhì)(Exportin-5, Ran-GTP)；

4.pre-miRNA被剪切成21-25個(gè)核苷酸的雙鏈 RNA雙體(Dicer,TRBP,PACT)； 5.雙鏈RNA雙體中成熟miRNA鏈會(huì)選擇性整合入RISC,并與mRNA互補(bǔ)配對(duì)。3.簡(jiǎn)述miRNA功能研究方法？

答：1.miRNA體外或體內(nèi)水平的過表達(dá)研究 1.1 構(gòu)建相應(yīng)的表達(dá)載體 1.2 體外合成miRNA前體分子 2.miRNA表達(dá)抑制研究

2.1 基因水平抑制miRNA表達(dá)

2.2 使用反義核酸分子抑制miRNA表達(dá) 4.MicroRNA引發(fā)腫瘤的可能原因？ 答：（1）microRNA與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡密切相關(guān)，而腫瘤則是由細(xì)胞增殖、分化、凋亡功能紊亂而引發(fā)的 ；

（2）許多microRNA的基因位于基因組中易發(fā)生斷裂、移位、缺失等變異的區(qū)域 ；

（3）與正常組織相比，在惡性腫瘤和腫瘤細(xì)胞株中普遍存在著對(duì)microRNA的表達(dá)失控 5.簡(jiǎn)述基因治療的必備條件。

答：1）分子缺陷清楚2）可以得到相應(yīng)基因的克隆3)病理生理機(jī)制已知 4)有利的風(fēng)險(xiǎn)-利益比 5)治療基因可以被調(diào)控 6)合適的靶細(xì)胞 7)有效安全 8)相關(guān)法規(guī)健全。6.簡(jiǎn)述骨髓干細(xì)胞的特性。

答：1）具有可移植性和自我更新能力，在體內(nèi)永不耗竭，只需單次治療；2）具有多能性，可分化為粒、紅、淋巴和血小板等各種血細(xì)胞，且在分化過程中保持基因組的相對(duì)穩(wěn)定，使目的基因隨細(xì)胞的分化成熟而相對(duì)擴(kuò)增，病人可終身受益；3）外源基因表達(dá)產(chǎn)物可通過血液循環(huán)遍布全身； 4）造血干/祖細(xì)胞的功能活性可在體內(nèi)外進(jìn)行分析；5）取材于自體骨髓或臍帶血，易于獲取也便于植回并存活，臨床已有成熟技術(shù)。7.簡(jiǎn)述基因治療有待解決的問題。

答：1)難以獲得真正有治療作用的基因 2)外源基因的表達(dá)難以在體內(nèi)精確調(diào)控 3)體細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)后，其生物學(xué)特性會(huì)有改變 4)過多的外源蛋白對(duì)機(jī)體帶來可能的影響 5)隨機(jī)整合潛在的威脅。

第三篇：分子生物學(xué)課程教學(xué)改革初探

分子生物學(xué)課程教學(xué)改革初探

摘要：文章總結(jié)了在十余年分子生物學(xué)教學(xué)過程中，不斷開展的對(duì)教師自身綜合素質(zhì)和能力、教學(xué)內(nèi)容、教學(xué)方法和教學(xué)手段的改革探索，旨在提高分子生物學(xué)的教學(xué)效果。實(shí)踐證實(shí)，新的教學(xué)模式，在傳授學(xué)生專業(yè)知識(shí)的同時(shí)，激發(fā)了學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣，改進(jìn)了學(xué)生的學(xué)習(xí)方法，也逐步提高了學(xué)生的自主學(xué)習(xí)能力，從而滿足了社會(huì)對(duì)高素質(zhì)創(chuàng)新型生物人才的需求。

關(guān)鍵詞：分子生物學(xué)；課程教學(xué)；改革研究；創(chuàng)新生物學(xué)人才

中圖分類號(hào)：G642.0 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1674-9324（2016）26-0128-03

前言：

分子生物學(xué)的目標(biāo)是在分子水平上闡明細(xì)胞活動(dòng)的規(guī)律，從而揭示生命的本質(zhì)[1]。雖然它在生物類專業(yè)課程體系中充當(dāng)著重要角色，對(duì)生命科學(xué)的發(fā)展起著至關(guān)重要的作用，但是分子生物學(xué)的教學(xué)卻因?yàn)檎n程內(nèi)容多，學(xué)科交叉廣，理解難度高，信息量大，知識(shí)更新快而使教學(xué)效果差強(qiáng)人意，集中表現(xiàn)為教師授課難和學(xué)生學(xué)習(xí)難。這種現(xiàn)狀不但困擾著老師和同學(xué)，也與大學(xué)培養(yǎng)高素質(zhì)創(chuàng)新型人才的目標(biāo)不相適應(yīng)。如何克服分子生物學(xué)課堂教學(xué)的“瓶頸”？本人在從事十多年的分子生物學(xué)教學(xué)過程中，努力研究和探索多種形式的教學(xué)改革，力求提升教學(xué)效果和教學(xué)質(zhì)量。

一、教學(xué)內(nèi)容的合理組織

分子生物學(xué)的教學(xué)除了選用好的教材，制定完善的教學(xué)大綱，如何組織教學(xué)內(nèi)容是教學(xué)的一個(gè)非常重要環(huán)節(jié)[2]。教學(xué)內(nèi)容呈現(xiàn)給學(xué)生的應(yīng)該是完整、清晰的、有層次、條理的知識(shí)。我們?cè)诮M織教學(xué)的過程中，首先從提高自身學(xué)科素養(yǎng)著手。“一本教材書，數(shù)種參考書”，除分子生物學(xué)國(guó)內(nèi)、國(guó)外各類版本外，與分子生物學(xué)相互交叉和滲透的其他學(xué)科，如細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)、遺傳學(xué)，我們也都進(jìn)行了系統(tǒng)的學(xué)習(xí)和強(qiáng)化，不斷夯實(shí)專業(yè)知識(shí)、拓展專業(yè)領(lǐng)域，基本構(gòu)建了分子生物學(xué)完整的知識(shí)體系，具備了對(duì)教材處理的前提。既避免了教學(xué)中各學(xué)科的重復(fù)，也進(jìn)一步凝練了知識(shí)。此外，我們還通過網(wǎng)絡(luò)教學(xué)平臺(tái)向全國(guó)優(yōu)秀教師學(xué)習(xí)，在不斷的探索中總結(jié)出了教學(xué)內(nèi)容合理組織的一些思路。

1.思維導(dǎo)學(xué)模式。在DNA復(fù)制教學(xué)環(huán)節(jié)，知識(shí)點(diǎn)多，并且較分散，很容易在教學(xué)中造成學(xué)習(xí)困難和知識(shí)混淆的現(xiàn)象，針對(duì)這章教學(xué)的特點(diǎn)，我們采用了思維導(dǎo)學(xué)模式，收到了非常好的教學(xué)效果。

2.重點(diǎn)、難點(diǎn)解讀。本科教學(xué)形式多樣化，也更提倡學(xué)生的自主學(xué)習(xí)，但并不是淡化了教師的教學(xué)，反而對(duì)教師提出了更高的要求[3]。教師必須圍繞每堂課的教學(xué)目的，合理組織和引導(dǎo)學(xué)生理解并掌握教學(xué)的重點(diǎn)和難點(diǎn)內(nèi)容。

比如在講解染色體端粒末端修復(fù)機(jī)制中，教師首先要從教材的知識(shí)結(jié)構(gòu)中梳理出重點(diǎn)。染色體端粒末端修復(fù)機(jī)制的知識(shí)點(diǎn)包括：（1）引物切除造成的遺傳信息缺失；（2）端粒末端的特點(diǎn)；（3）體細(xì)胞和性細(xì)胞末端修復(fù)機(jī)制的不同；（4）DNA結(jié)構(gòu)的變化；（5）端粒酶的修復(fù)機(jī)制。梳理知識(shí)點(diǎn)后，總結(jié)教學(xué)重點(diǎn)：一是引物切除后損傷修復(fù)在體細(xì)胞和性細(xì)胞中的不同；二是四鏈DNA結(jié)構(gòu)；三是端粒酶的修復(fù)機(jī)制。其中端粒酶修復(fù)機(jī)制的講授是學(xué)生學(xué)習(xí)的難點(diǎn)。難點(diǎn)集中在端粒酶的性質(zhì)和修復(fù)發(fā)生的過程。

經(jīng)過對(duì)教學(xué)內(nèi)容中重點(diǎn)和難點(diǎn)的準(zhǔn)確把握和合理組織，教師才能在課堂教學(xué)中突出重點(diǎn)、突破難點(diǎn)，讓學(xué)生的課堂學(xué)習(xí)無障礙。

二、教學(xué)方法和手段的改進(jìn)

教學(xué)方法的推陳出新，是教學(xué)改革的重要內(nèi)容[4]。為發(fā)揮學(xué)生作為教學(xué)主體的能動(dòng)性，我們根據(jù)具體的教學(xué)內(nèi)容設(shè)置了啟發(fā)式、聯(lián)想式、探究式等多種教學(xué)方法[5]，讓學(xué)生參與到教學(xué)過程中，不僅活躍了課堂氣氛，而且在分享知識(shí)的同時(shí)，更注重教會(huì)學(xué)生靈活掌握學(xué)習(xí)的方法。

1.啟發(fā)式教學(xué)。啟發(fā)的目的在于舉一反三，觸類旁通。針對(duì)每一次的課堂教學(xué)，設(shè)計(jì)一些拋磚引玉的問題，供學(xué)生思考與討論，這成為了分子生物學(xué)理論教學(xué)的重要組成部分。如進(jìn)行到真核生物基因表達(dá)調(diào)控學(xué)習(xí)環(huán)節(jié)，提出甲基化修飾的生物學(xué)意義，這個(gè)問題覆蓋范圍廣，涉及到了DNA復(fù)制的調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)和DNA甲基化修飾對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控，以及Epigenetic（表觀遺傳學(xué)）方面的知識(shí)。通過提出問題―討論分析―不斷啟發(fā)―再討論分析―歸納總結(jié)―解決問題這一系列的互動(dòng)教學(xué)活動(dòng)，充分調(diào)動(dòng)了學(xué)生課堂學(xué)習(xí)的主動(dòng)性和積極性，在不斷的討論分析中通過展示不同的思維、發(fā)表各自的觀點(diǎn)，不但有利于促進(jìn)學(xué)生在學(xué)習(xí)中發(fā)現(xiàn)問題、解決問題，而且有利于學(xué)生通過對(duì)基礎(chǔ)知識(shí)的消化、理解來達(dá)到理論的升華、拓展[4]。

2.聯(lián)想式教學(xué)。分子生物學(xué)是在生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和遺傳學(xué)的基礎(chǔ)上發(fā)展而來[6]，因此知識(shí)相互交叉、相互滲透。在授課的過程中，教師一方面要避免重復(fù)，一方面要通過聯(lián)想知識(shí)點(diǎn)適時(shí)培養(yǎng)學(xué)生的發(fā)散性思維，提高學(xué)生對(duì)知識(shí)的遷移能力和整合能力。如在講解化學(xué)修飾對(duì)基因的表達(dá)調(diào)控時(shí)，將細(xì)胞生物學(xué)中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有機(jī)結(jié)合，使學(xué)生了解基因表達(dá)調(diào)控對(duì)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用機(jī)制。

3.探究式教學(xué)。在分子生物學(xué)教學(xué)中，每一個(gè)理論知識(shí)的背后都是科學(xué)研究的重大突破。如確定遺傳物質(zhì)是DNA的兩大經(jīng)典實(shí)驗(yàn)，我們以探究的形式呈現(xiàn)教學(xué)內(nèi)容，從實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，到結(jié)果顯示，再經(jīng)過討論分析并得出結(jié)論，以課題研究的角度，研究人員的身份引導(dǎo)學(xué)生進(jìn)入學(xué)習(xí)角色，將學(xué)科概念、理論產(chǎn)生的起因和過程展示給學(xué)生，啟發(fā)學(xué)生努力探索，走近科學(xué)，讓學(xué)生從中領(lǐng)悟知識(shí)形成的探究性和科學(xué)性，逐漸培養(yǎng)具有創(chuàng)新意識(shí)和能力的高素質(zhì)研究型人才。

4.多媒體多樣化教學(xué)。分子生物學(xué)的教學(xué)內(nèi)容具有微觀性、復(fù)雜性、抽象性和動(dòng)態(tài)性。傳統(tǒng)的教學(xué)手段無法滿足教學(xué)的需求，而多媒體技術(shù)則具有聲像俱佳、動(dòng)靜皆宜的特點(diǎn)[7]，是傳統(tǒng)教學(xué)無法比擬的。多年來我們不斷補(bǔ)充和完善教學(xué)手段，逐漸形成了獨(dú)具特色的多媒體教學(xué)課件。

多媒體圖像處理清晰直觀，文字表述簡(jiǎn)潔明了、主題突出。課件中的圖像來源于國(guó)內(nèi)外的網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)平臺(tái)。如講述DNA半保留復(fù)制機(jī)理時(shí)[8]，首先將DNA可能存在的幾種復(fù)制方式用圖像展現(xiàn)，并利用Meselson和Stahl設(shè)計(jì)的DNA復(fù)制同位素示蹤實(shí)驗(yàn)和密度梯度離心實(shí)驗(yàn)來進(jìn)行結(jié)果驗(yàn)證，引導(dǎo)學(xué)生明確掌握DNA半保留復(fù)制特點(diǎn)，并結(jié)合文字，通過圖文并茂的多媒體課件，將教學(xué)內(nèi)容中的背景知識(shí)、基本概念、基本理論，以及靜態(tài)、抽象的微觀知識(shí)清晰講解。

多媒體課件動(dòng)靜結(jié)合、聲像互動(dòng)。對(duì)于生命過程中動(dòng)態(tài)的知識(shí)點(diǎn)，比如DNA的復(fù)制、RNA的轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)的翻譯過程，可以將這些復(fù)雜的生命過程利用多媒體手段做成動(dòng)畫并配以文字和聲像，形象直觀地展現(xiàn)給學(xué)生，既加深了學(xué)生對(duì)知識(shí)的理解，也提高了其學(xué)習(xí)效率。

三、知識(shí)領(lǐng)域的拓展

分子生物學(xué)的教學(xué)內(nèi)容除包含基礎(chǔ)理論知識(shí)外，還有大量理論應(yīng)用的研究方法部分。我們?cè)诮虒W(xué)中不僅僅將知識(shí)局限在教材中，利用課堂教學(xué)不斷引導(dǎo)學(xué)生去了解本學(xué)科相關(guān)領(lǐng)域內(nèi)的研究熱點(diǎn)、最新進(jìn)展、發(fā)展趨勢(shì)[8]，以及生物技術(shù)在生產(chǎn)實(shí)踐中的廣泛應(yīng)用。

1.專題講座與專題討論。專題講座是教師根據(jù)教學(xué)內(nèi)容，自己組織參考資料對(duì)教學(xué)內(nèi)容的延伸與拓展。比如在講授“SNP技術(shù)”時(shí)，先從遺傳標(biāo)記分析的發(fā)展著手，把一代、二代的標(biāo)記分析做知識(shí)性的回顧，再將納入教材的第三代標(biāo)記分析“SNP”做詳細(xì)的講解，引導(dǎo)大家理解什么是單核苷酸多態(tài)性，核苷酸多態(tài)性研究的生物學(xué)意義以及在醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)、畜牧等多種領(lǐng)域的發(fā)展與應(yīng)用。通過這種方式激發(fā)了學(xué)生的學(xué)習(xí)熱情和求知欲，也使教師不斷地進(jìn)行知識(shí)的更新，及時(shí)了解本學(xué)科當(dāng)前發(fā)展的趨勢(shì)、研究的熱點(diǎn)以及爭(zhēng)論的問題。

專題討論則是以學(xué)生為主體，根據(jù)課程教學(xué)內(nèi)容，組織學(xué)生就某一個(gè)專題自行查閱、組織文獻(xiàn)資料，并在課堂上展開討論[9]。比如在講授基因重組的教學(xué)內(nèi)容時(shí)，設(shè)計(jì)“轉(zhuǎn)基因的利與弊”供學(xué)生討論。引導(dǎo)學(xué)生思考基因工程藥物和轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物對(duì)社會(huì)產(chǎn)生的巨大影響，讓知識(shí)離開課本走進(jìn)生活，從而喚起學(xué)生學(xué)習(xí)的興趣和探索未知領(lǐng)域的欲望。這不僅使學(xué)生更加深入、系統(tǒng)地理解所學(xué)知識(shí)，并且培養(yǎng)了學(xué)生靈活運(yùn)用知識(shí)的能力[10]。

2.生物信息技術(shù)與數(shù)據(jù)庫(kù)。生物信息技術(shù)已經(jīng)發(fā)展成為分子生物學(xué)研究方法中不可分割的一部分，比如在“PCR技術(shù)”的專題講座中，不僅要對(duì)實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹⒃?、操作以及?yīng)用進(jìn)行講解，還要特別對(duì)引物設(shè)計(jì)的生物信息技術(shù)進(jìn)行補(bǔ)充，介紹學(xué)生對(duì)一些常規(guī)的生物信息技術(shù)軟件Primer6.0、DNAman、Olig6.0、DNAStar、Cluster等有一個(gè)基本的認(rèn)知度。

在整個(gè)分子生物學(xué)的教學(xué)中，學(xué)生需要自行查閱和組織各種文獻(xiàn)資料，因此，必須特別強(qiáng)調(diào)互聯(lián)網(wǎng)資源運(yùn)用的重要性。教師通過介紹中國(guó)知網(wǎng)、維普、清華同方、NCBI等幾個(gè)常用資源庫(kù)，使學(xué)生了解如何利用資源庫(kù)進(jìn)行查詢，對(duì)互聯(lián)網(wǎng)資源的熟練應(yīng)用使學(xué)生的知識(shí)體系得以完善，學(xué)生通過自身的努力來提高信息收集和辨別的能力，培養(yǎng)了學(xué)生的自學(xué)能力。

四、教學(xué)改革中應(yīng)該注意的問題

1.教師的專業(yè)修養(yǎng)與教學(xué)基本功。教師在教學(xué)中具有雙重身份，既是一名導(dǎo)演，又是一名演員。作為導(dǎo)演，首先需要有最新的教學(xué)理念，整個(gè)教學(xué)過程中適時(shí)設(shè)問、適時(shí)討論、適時(shí)啟發(fā)。其次要有較強(qiáng)的課堂組織能力，根據(jù)學(xué)生的學(xué)習(xí)情況，把握課堂節(jié)奏，調(diào)動(dòng)學(xué)生課堂學(xué)習(xí)激情，使教學(xué)有的放矢。否則會(huì)在教學(xué)中出現(xiàn)“啟而不發(fā)”和論證條理不清的現(xiàn)象；作為演員，還要有良好的課程駕馭能力，通過教師扎實(shí)的專業(yè)知識(shí)、廣泛的認(rèn)知領(lǐng)域、全面的知識(shí)結(jié)構(gòu)，呈現(xiàn)給學(xué)生的是一個(gè)豐盛的知識(shí)大餐，而不是一鍋夾生飯。因此作為教師，必須從理論水平、科研水平、思維水平這3個(gè)方面提高教師自身的專業(yè)素質(zhì)，此外，還要掌握適合自己的各項(xiàng)教學(xué)技能。

2.多媒體教學(xué)的合理應(yīng)用。多媒體教學(xué)只是一種提高教學(xué)效果的輔助手段，是為教師的教學(xué)和學(xué)生的學(xué)習(xí)服務(wù)的，只有運(yùn)用合理才可能達(dá)到好的效果。因此盡量避免在多媒體教學(xué)課件上出現(xiàn)過多的文字，否則多媒體成了教學(xué)活動(dòng)中的主體，老師由照本宣科轉(zhuǎn)變?yōu)榘缪莘庞硢T和播音員的角色。學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣不高，教學(xué)效果也就適得其反。多媒體和傳統(tǒng)教學(xué)只有合理地結(jié)合，取長(zhǎng)補(bǔ)短，才能在課堂教學(xué)中體現(xiàn)出其真正的價(jià)值。

總之，教學(xué)改革的目標(biāo)是幫助學(xué)生建立學(xué)科知識(shí)體系，培養(yǎng)學(xué)生良好的科學(xué)素養(yǎng)，提升學(xué)生后繼學(xué)習(xí)的能力。正如葉圣陶先生所說：“教師的教學(xué)，不在于給學(xué)生搬去可以致富的金子。而在于給學(xué)生點(diǎn)金的指頭。”目前，我們關(guān)于分子生物學(xué)課堂教學(xué)改革還處于不斷探索和實(shí)踐階段，除了需要不斷地提高教師自身的學(xué)科修養(yǎng)和科研素質(zhì)外，也以“夯實(shí)基礎(chǔ)、拓展知識(shí)、增強(qiáng)能力、提高素質(zhì)”[8]作為教學(xué)的目的和人才培養(yǎng)目標(biāo)，努力在今后把教學(xué)工作開展得更加有生有色，為社會(huì)培養(yǎng)更多高素質(zhì)創(chuàng)新型人才。

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第四篇：分子生物學(xué)課程教學(xué)大綱

《分子生物學(xué)》課程教學(xué)大綱（理論學(xué)時(shí)：16學(xué)時(shí)）

使用教材： 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)

（供8年制及7年制臨床醫(yī)學(xué)等專業(yè)用）

分子生物學(xué)是一門從分子水平研究生命現(xiàn)象、生命的本質(zhì)、生命活動(dòng)及其規(guī)律的科學(xué)。醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)是分子生物學(xué)的一個(gè)重要分支，是從分子水平研究人體在正常及疾病狀態(tài)下生命活動(dòng)及其規(guī)律的一門科學(xué)。它主要研究人體生物大分子和大分子體系的結(jié)構(gòu)、功能、相互作用及其同疾病發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系。作為一門課程，醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)涵蓋了醫(yī)學(xué)各專業(yè)學(xué)生必須學(xué)習(xí)的分子生物學(xué)基礎(chǔ)知識(shí)，以及分子生物學(xué)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中形成的專門研究領(lǐng)域及相關(guān)知識(shí)。

醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)既要較系統(tǒng)地了解分子生物學(xué)的基礎(chǔ)理論知識(shí)和技術(shù)理論知識(shí)，同時(shí)也要了解分子生物學(xué)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用和相關(guān)研究進(jìn)展。

本書共二十三章，包括5個(gè)方面內(nèi)容。第二章至第十章介紹分子生物學(xué)基本知識(shí)，主要介紹基因和基因組的基本概念和基本特點(diǎn)，基因組核酸復(fù)制與損傷修復(fù)、基因表達(dá)和功能蛋白形成與降解、基因表達(dá)調(diào)控、細(xì)胞間通訊與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的基本概念和基本理論，細(xì)胞增殖與凋亡的相關(guān)分子生物學(xué)機(jī)制。第十一章至第十三章介紹基因操作的基本知識(shí)，包括基因分析、基因功能研究和基因克隆與表達(dá)的相關(guān)基本知識(shí)和研究策略。第十四章至第十八章介紹疾病分子生物學(xué)機(jī)制，介紹了基因和基因組、細(xì)胞間通訊和信號(hào)與人類健康和疾病之間關(guān)系。第十九章至第二十一章介紹分子生物學(xué)理論與技術(shù)在醫(yī)學(xué)中應(yīng)用，包括基因診斷和基因治療概念與相關(guān)研究。最后兩章介紹分子生物學(xué)新興研究領(lǐng)域、生物信息學(xué)在基因和蛋白質(zhì)研究中的應(yīng)用。

本大綱正是從上述目的出發(fā)，在要求學(xué)生掌握分子生物學(xué)基本知識(shí)與基本技術(shù)，同時(shí)了解分子生物學(xué)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用與相關(guān)研究。使學(xué)生們?cè)诜肿铀缴涎芯咳梭w在正常及疾病狀態(tài)下生命活動(dòng)及其規(guī)律，為從事臨床醫(yī)學(xué)打下深厚的基礎(chǔ)。

緒 論

一、目的要求

了解分子生物學(xué)的定義、研究對(duì)象和研究?jī)?nèi)容；分子生物學(xué)發(fā)展簡(jiǎn)史；生物遺傳物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)；現(xiàn)代分子生物學(xué)的建立和深入發(fā)展；分子生物學(xué)與相關(guān)學(xué)科的關(guān)系；分子生物學(xué)在醫(yī)學(xué)和生物學(xué)中的應(yīng)用。

二、主要內(nèi)容

分子生物學(xué)則是從分子水平研究生命現(xiàn)象及其規(guī)律的一門新興學(xué)科。它以核酸和蛋白質(zhì)等生物大分子的結(jié)構(gòu)與功能為研究對(duì)象

（一）、分子生物學(xué)的研究?jī)?nèi)容

分子生物學(xué)主要研究生物大分子的結(jié)構(gòu)、功能、生物大分子之間的相互作用及其與疾病發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系。

研究?jī)?nèi)容主要包括以下三個(gè)方面。1.核酸分子生物學(xué) 2.蛋白質(zhì)分子生物學(xué) 3.細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

（二）、分子生物學(xué)發(fā)展簡(jiǎn)史

1、生物遺傳物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)

2、現(xiàn)代分子生物學(xué)的建立

3、現(xiàn)代分子生物學(xué)的深入發(fā)展

（三）、分子生物學(xué)與相關(guān)學(xué)科的關(guān)系

由于生命本質(zhì)的高度一致性，分子生物學(xué)已經(jīng)對(duì)生物學(xué)和醫(yī)學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域產(chǎn)生了全面而深刻的影響，并逐步形成了一系列的分子學(xué)科。可以使用同一套理論、同一套技術(shù)，來解釋和研究不同的病理、生理現(xiàn)象，甚至治療不同的疾病。

1、分子生物學(xué)與生物化學(xué)

2、細(xì)胞生物學(xué)與分子生物學(xué)

3、分子生物學(xué)與遺傳學(xué)

4、分子生物學(xué)與生物技術(shù)

（四）、分子生物學(xué)與醫(yī)學(xué)未來

分子生物學(xué)的發(fā)展和滲透從根本上改變了醫(yī)學(xué)（包括臨床和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)）各個(gè)學(xué)科的格局, 使醫(yī)學(xué)各學(xué)科進(jìn)入了一個(gè)更高的水平——分子水平。

1、分子生物學(xué)在醫(yī)學(xué)和生物學(xué)中的應(yīng)用

2、分子生物學(xué)與基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)

3、分子生物學(xué)和病理學(xué)

4、分子生物學(xué)和疾病診斷

5、分子生物學(xué)和疾病治療

基因治療技術(shù)的發(fā)展與整個(gè)醫(yī)學(xué)科學(xué)的發(fā)展以及許多分子生物學(xué)新理論、新技術(shù)、新方法的應(yīng)用密切相關(guān)。

所謂基因治療，就是用正常基因置換致病基因以糾正患者基因結(jié)構(gòu)和功能異常的一種疾病治療的方法。

狹義的基因治療是指目的基因?qū)氚屑?xì)胞后與宿主細(xì)胞內(nèi)的基因發(fā)生整合、成為宿主基因組的一部分，目的基因的表達(dá)產(chǎn)物起治療疾病的作用。廣義的基因治療則包括通過基因轉(zhuǎn)移技術(shù)，使目的基因得到表達(dá)，封閉、剪切致病基因的mRNA，或自殺基因產(chǎn)物催化藥物前體轉(zhuǎn)化為細(xì)胞毒性物質(zhì)，殺死腫瘤細(xì)胞，從而達(dá)到治療疾病的目的。

三、學(xué)時(shí)安排 1學(xué)時(shí)

第二章 基因與基因組

一、目的要求：

（一）掌握：基因的概念及結(jié)構(gòu)特點(diǎn)；中心法則；基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)序列；多順反子，單順反子；真核基因與原核基因的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。基因組的概念；病毒、細(xì)菌及真核生物基因組的結(jié)構(gòu)特征。

（二）熟悉：基因突變的意義，基因組變異的生理和病理學(xué)意義。

（三）了解：基因的命名法，基因組學(xué)；人類基因組計(jì)劃。

二、主要內(nèi)容

基因是負(fù)責(zé)編碼RNA或一條多肽鏈的DNA片段，包括編碼序列、編碼序列外的側(cè)翼序列及插入序列。編碼RNA或蛋白質(zhì)的DNA序列稱為結(jié)構(gòu)基因。原核生物的結(jié)構(gòu)基因是連續(xù)的，其RNA合成后不需要經(jīng)過剪接加工。而大多數(shù)真核生物基因在編碼區(qū)內(nèi)有非編碼的插入序列?；蛑泻信c轉(zhuǎn)錄有關(guān)調(diào)控序列。真核生物基因中調(diào)控序列一般稱為順式作用元件。

大多數(shù)生物的遺傳信息都是以特定的核苷酸排列順序貯存在DNA分 子中。但在一些病毒中，RNA作為遺傳物質(zhì)。多數(shù)生物信息按照從DNA到RNA再到蛋白質(zhì)的方向流。但是對(duì)RNA病毒是以RNA為模板，合成單鏈DNA，然后再合成雙鏈DNA。

mRNA將DNA中信息傳遞給蛋白質(zhì)。在mRNA編碼區(qū)內(nèi)每三個(gè)連續(xù)核苷酸，對(duì)應(yīng)多肽鏈一個(gè)氨基酸，指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成。原核生物mRNA稱多順反子mRNA，而真核生物mRNA稱單順反子mRNA。

基因突變?cè)谶M(jìn)化上具有重要意義，它是形成生物多樣性主要因素之一。同時(shí)基因突變可以改變遺傳信息，導(dǎo)致疾病。導(dǎo)致基因突變因素有自發(fā)、物理、化學(xué)因素等，基因突變可直接影響蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致疾病或?qū)膊∫赘小?/p>

基因命名的基本原則是簡(jiǎn)明、獨(dú)特、能夠表達(dá)基因的特征或功能?；蚍?hào)的命名也應(yīng)遵循獨(dú)特、簡(jiǎn)短、僅含有大寫拉丁字母或大寫字母和阿拉伯?dāng)?shù)字、不應(yīng)含有標(biāo)點(diǎn)符號(hào)的基本原則。

1．重點(diǎn)內(nèi)容：基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)序列；多順反子，單順反子；基因組的概念；病毒、細(xì)菌及真核生物基因組的結(jié)構(gòu)特征。

2．難點(diǎn)內(nèi)容：基因的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，真核生物基因組的結(jié)構(gòu)特征。

三、學(xué)時(shí)安排

5學(xué)時(shí)

第三章 基因表達(dá)與基因表達(dá)調(diào)控

一、目的要求：

（一）掌握：遺傳信息表達(dá)，轉(zhuǎn)錄，翻譯，有意義鏈，轉(zhuǎn)錄模板鏈，開放閱讀框，遺傳密碼等基本概念?；虮磉_(dá)，管家基因，組成性基因表達(dá)，誘導(dǎo)表達(dá)，阻遏表達(dá)，協(xié)調(diào)表達(dá)，表達(dá)調(diào)控，反式作用因子，表達(dá)組織特異性等基本概念；乳糖操縱子的結(jié)構(gòu)及其調(diào)節(jié)機(jī)制。

（二）熟悉：原核生物RNA和蛋白質(zhì)的生物合成基本過程，真核生物RNA和蛋白質(zhì)合成特點(diǎn)；真核生物基因表達(dá)調(diào)控的各個(gè)水平，DNA水平調(diào)控的不同方式，反式作用因子的主要特點(diǎn)和調(diào)節(jié)方式，轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的不同環(huán)節(jié)，翻譯水平和翻譯后水平調(diào)控的基本環(huán)節(jié)

（三）、了解：了解轉(zhuǎn)錄和翻譯后的加工。反式作用因子結(jié)構(gòu)域模式和反式作用因子的作用方式，基因表達(dá)的組織特異性和時(shí)相性。

二、主要內(nèi)容

原核生物基因表達(dá)調(diào)控主要是在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平。轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控涉及啟動(dòng)子、S因子、阻遏蛋白、正調(diào)控蛋白等多種因素，翻譯水平的調(diào)控則涉及SD序列、mRNA的穩(wěn)定性及翻譯產(chǎn)物的調(diào)控。

真核生物基因表達(dá)調(diào)控環(huán)節(jié)較多，在DNA水平可通過染色體丟失、基因擴(kuò)增、基因重排、DNA甲基化以及染色質(zhì)結(jié)構(gòu)改變影響基因表達(dá)；在轉(zhuǎn)錄水平則主要通過反式作用因子的作用調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子與TATA盒的結(jié)合、RNA聚合酶與轉(zhuǎn)錄因子-DNA復(fù)合物的結(jié)合以及轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成；在轉(zhuǎn)錄后水平主要通過RNA修飾、剪接及mRNA運(yùn)輸?shù)目刂苼碛绊懟虮磉_(dá)；影響翻譯水平的因素有影響翻譯起始的陰遏蛋白、5`AUG、5` 端非編碼區(qū)的長(zhǎng)度等，另外還存在小分子反義RNA對(duì)翻譯調(diào)控。翻譯后蛋白質(zhì)修飾和定位也是表達(dá)調(diào)控的重要環(huán)節(jié)。

同時(shí)近年提出的有關(guān)基因表達(dá)的統(tǒng)一理論慚被認(rèn)識(shí)。從而形成一個(gè)完整的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

1、重點(diǎn)內(nèi)容：

原核生物轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控機(jī)制；真核生物轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控機(jī)制；真核生物轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控機(jī)制。

2、難點(diǎn)內(nèi)容：

原核生物轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控機(jī)制。

三、學(xué)時(shí)安排

4學(xué)時(shí)

第四章 基因分析的基本策略

一、目的要求

（一）掌握：Southern 雜交和PCR等技術(shù)原理及在分析基因拷貝數(shù)的應(yīng)用；Northern blot和RT-PCR技術(shù)原理及在基因轉(zhuǎn)錄水平變化分析中的應(yīng)用；

（二）熟悉：Western blot 原理及在特定基因產(chǎn)物-蛋白質(zhì)分析中的應(yīng)用。

（三）了解：DNA序列測(cè)定的原理及其主要應(yīng)用；RNA酶保護(hù)試驗(yàn)原理及應(yīng)用；原位雜交技術(shù)；DNA微陣列技術(shù)原理； 流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用；免疫 組化方法的應(yīng)用。

二、主要內(nèi)容

基因分析是一種策略性很強(qiáng)的工作，有許多技術(shù)可以用于基因分析，正確選擇實(shí)驗(yàn)技術(shù)方法和基因分析切入點(diǎn)是進(jìn)行基因分析首先要考慮的問題。根據(jù)信息中心法則，DNA是遺傳信息的攜帶者，RNA是基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，蛋白質(zhì)是結(jié)構(gòu)基因的最終產(chǎn)物，因此，分析基因可從DNA、RNA、蛋白質(zhì)水平上進(jìn)行。同時(shí)研究者善于將各種技術(shù)有機(jī)結(jié)合起來，根據(jù)研究目的篩選適當(dāng)技術(shù)方法，也可先制定研究策略，再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)技術(shù)路線設(shè)計(jì)。

1、重點(diǎn)內(nèi)容：Southern 雜交和PCR等技術(shù)原理及應(yīng)用；Northern blot和RT-PCR技術(shù)原理及應(yīng)用Western blot 原理及應(yīng)用。

2、難點(diǎn)內(nèi)容：RNA酶保護(hù)試驗(yàn)原理及應(yīng)用。

三、學(xué)時(shí)安排

3學(xué)時(shí)

第五章基因功能分析的基本策略

一、目的要求

（一）掌握：轉(zhuǎn)基因模型研究基因的功能原理、基因敲除技術(shù)原理、利用基因沉默技術(shù)對(duì)基因功能進(jìn)行分析的原理

（二）了解；三種實(shí)驗(yàn)技術(shù)的操作過程及注意事項(xiàng)

二、主要內(nèi)容

基因功能分析可以在DNA、RNA和蛋白質(zhì)水平上采用不同的技術(shù)和模 型來實(shí)現(xiàn)。模式生物是研究基因功能不可缺少的工具，轉(zhuǎn)基因小鼠和基因敲除技術(shù)是目前研究特定基因功能最常用的動(dòng)物模型，轉(zhuǎn)染細(xì)胞是利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)建立的細(xì)胞模型。RNA干涉技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)在RNA水平上暫時(shí)關(guān)閉特定基因的方法。各種方法都具有各自的特點(diǎn)及局限性，研究者可根據(jù)不同目的篩選最合適方法與模型，實(shí)現(xiàn)對(duì)特定基因功能的研究目的。

1、重點(diǎn)內(nèi)容：轉(zhuǎn)基因技術(shù)、基因敲除技術(shù)及RNA干涉技術(shù)原理

2、難點(diǎn)內(nèi)容：轉(zhuǎn)基因技術(shù)、基因敲除技術(shù)及RNA干涉技術(shù)各自優(yōu)點(diǎn)及局限性

三、學(xué)時(shí)安排

3學(xué)時(shí)

第六章 基因工程與體外表達(dá)

一、目的要求：

（一）、掌握：常用克隆載體；基因克隆的基本過程；外源基因在大腸桿菌和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的原理和方法。

（二）、熟悉：限制性核酸內(nèi)切酶和其他常用工具酶的概念和特點(diǎn)；定點(diǎn)誘變技術(shù)原理。

（三）、了解：昆蟲表達(dá)系統(tǒng)；酵母表達(dá)系統(tǒng)。

二、主要內(nèi)容：

基因工程指在體外對(duì)DNA分子按照既定的目的與方案進(jìn)行剪切和重新連接，或?qū)NA中某個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行人工替換或刪除，改造基因結(jié)構(gòu)，然 后利用轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、感染等方法將重組DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞，使DNA片段得到擴(kuò)增。DNA的體外剪切和重新連接是在限制性核酸內(nèi)切酶、邊接酶以及其他修飾酶的參與下進(jìn)行的。不同目的的克隆基因需要不同的載體，常用的載體有質(zhì)粒、噬菌體和粘性質(zhì)粒等。載體可與外源DNA在體外連接，構(gòu)成重組DNA分子，導(dǎo)入相應(yīng)的宿主細(xì)胞，能在宿主細(xì)胞中自行復(fù)制與表達(dá)。

克隆的基因可進(jìn)一步用于表達(dá)有關(guān)基因的產(chǎn)物，進(jìn)行DNA序列分析，基因治療，研究基因表達(dá)的調(diào)節(jié)因子以及基因的功能等。還可通過寡核苷酸介導(dǎo)法、含U模板法、PCR介導(dǎo)的定點(diǎn)誘變法等技術(shù)，定向改變克隆基因的序列結(jié)構(gòu)，從而改造相應(yīng)蛋白的結(jié)構(gòu)。

基因工程在得到重組體后，通常利用大腸桿菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲、酵母等表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行克隆基因的體外表達(dá)。

1、重點(diǎn)內(nèi)容：基因克隆的基本操作過程。

2、難點(diǎn)內(nèi)容：α－互補(bǔ)篩選；陽性轉(zhuǎn)染細(xì)胞的篩選；定點(diǎn)誘變技術(shù)原理。

三、學(xué)時(shí)安排：

6學(xué)時(shí)

第七章 基因診斷(自學(xué))

一、目的要求：

（一）掌握：基因診斷的基本概念；掌握基因診斷中常用的分子生物學(xué)技術(shù)——核酸分子雜交、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）、單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP）檢測(cè)、限制性酶酶譜分析、DNA序列測(cè)定、DNA 芯片技術(shù)；

（二）熟悉基因診斷的基本方法；

（三）了解遺傳病、感染性疾病以及腫瘤的基因診斷的策略；了解基因診斷在法醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用。

二、主要內(nèi)容：

基因診斷已成為臨床實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)的一個(gè)重要組成部分。PCR擴(kuò)增和分子雜交是現(xiàn)代基因診斷技術(shù)的基本方法，基因診斷的基本操作流程是：樣本抽提、樣本擴(kuò)增、分子雜交和信號(hào)檢測(cè)。遺傳病的基因診斷主要是針對(duì)DNA分子的遺傳分析技術(shù)，其基本方法學(xué)包括連鎖分析和直接診斷。用作連鎖分析的遺傳標(biāo)志物主要有RFLP、STR、SNP。用于遺傳分析的代表性直接診斷技術(shù)有：用于DNA制圖的Southern印跡法、用于檢測(cè)點(diǎn)突變的ASO分子雜交法以及用于識(shí)別STR序列的PCR直接擴(kuò)增法等。同時(shí)基因診斷技術(shù)已經(jīng)成為現(xiàn)代法醫(yī)學(xué)的重要內(nèi)容。

1、重點(diǎn)內(nèi)容：各種檢測(cè)方法原理

2、難點(diǎn)內(nèi)容：各自優(yōu)點(diǎn)及缺點(diǎn)

三、學(xué)時(shí)安排

3學(xué)時(shí)

第八章 基因治療(自學(xué))

一、目的要求：

（一）掌握：基因治療、基因標(biāo)記、基因置換、基因添加、基因干預(yù)、反義RNA、核酶等基本概念；

（二）熟悉：基因轉(zhuǎn)移技術(shù)，逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺相關(guān)病毒載體的特點(diǎn)；熟悉腫瘤基因治療思路，理解抑癌基因治療原理、實(shí)驗(yàn)研究和臨床試驗(yàn)及腫瘤的免疫基因治療；理解反義RNA在基因治療中的意義和應(yīng)用；

（三）了解：了解其它基因轉(zhuǎn)移方法；了解核酶及三鏈DNA在基因治療中的意義和基本原理；了解基因治療的前景與問題。

二、主要內(nèi)容

基因治療是指以改變?nèi)祟愡z傳物質(zhì)為基礎(chǔ)的生物醫(yī)學(xué)學(xué)治療，即通過一定方式將人正?；蛞吧突蚧蛴兄委熥饔玫腄NA順序?qū)肴梭w靶細(xì)胞，以矯正或轉(zhuǎn)換致病基因的治療方法。目前開展基因治療方案采取的策略包括：用正常基因置換染色體上致病基因，將正?；蜣D(zhuǎn)移至患者的宿主細(xì)胞，使治療基因代替致病基因表達(dá)正常蛋白質(zhì)而發(fā)揮作用；向患者體內(nèi)或腫瘤細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入腫瘤抑制基因，以抑制其表達(dá)；也可用反義RNA、SiRNA、核酶、肽核酸抑制或封閉有害基因mRNA表達(dá)；也可將抗體、細(xì)胞因子等基因?qū)肽[瘤細(xì)胞以激活體內(nèi)免疫細(xì)胞活力，增強(qiáng)患者免疫力。

治療基因?qū)塍w內(nèi)方法有非病毒方法與病毒方法，非病毒方法包括直接注射法、電穿孔法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)法，其方法安全性好但效率低。與病毒方法各具有不同優(yōu)缺點(diǎn)。

1、重點(diǎn)內(nèi)容：基因治療概念、基因治療策略方法、2、難點(diǎn)內(nèi)容：治療基因?qū)塍w內(nèi)方法，各自優(yōu)缺點(diǎn)、病毒載體結(jié)構(gòu)特點(diǎn)；核酶及三鏈DNA在基因治療的原理

三、學(xué)時(shí)安排

3學(xué)時(shí)

第九章 基因組學(xué)與醫(yī)學(xué)(自學(xué))

一、目的求：

（一）掌握：基因組學(xué)、人類基因組計(jì)劃、基因病和SNP的概念；結(jié)構(gòu)基因組學(xué)、功能基因組學(xué)的概念及研究?jī)?nèi)容。

（二）熟悉：比較基因組學(xué)的概念；疾病相關(guān)基因的鑒定策略。

（三）了解：基因組學(xué)與醫(yī)學(xué)的關(guān)系。

二、主要內(nèi)容

人類基因組計(jì)劃的研究目標(biāo)是闡明構(gòu)成人類基因組的全部DNA的結(jié)構(gòu)；闡明基因的編碼方式和分布特點(diǎn)；理解基因及其調(diào)控序列之間的相互關(guān)系；理解DNA全部序列所蘊(yùn)藏的意義。該計(jì)劃包括為遺傳圖譜、物理圖譜、序列圖譜、轉(zhuǎn)錄圖譜分析。

功能基因組學(xué)是研究基因組中所有基因功能的學(xué)科。功能基因組學(xué)是從基因整體水平對(duì)基因的活動(dòng)規(guī)律進(jìn)行探討，其研究?jī)?nèi)容主要包括基因組的表達(dá)、蛋白質(zhì)產(chǎn)物的功能、基因組多樣性的研究、基因組功能注釋。

1、重點(diǎn)內(nèi)容：人類基因組計(jì)劃、功能基因組學(xué)的研究?jī)?nèi)容。

2、難點(diǎn)內(nèi)容：功能基因組學(xué)的研究?jī)?nèi)容。

三、學(xué)時(shí)安排 2學(xué)時(shí)

四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及學(xué)時(shí)安排

1大腸桿菌質(zhì)粒DNA的提取 3學(xué)時(shí) 2瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 3學(xué)時(shí) 3 DNA純度、濃度和分子量的測(cè)定 4學(xué)時(shí) 4大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備與轉(zhuǎn)化 4學(xué)時(shí) 5動(dòng)植物基因組DNA的提取與純化 4學(xué)時(shí)

第五篇：《分子生物學(xué)與基因工程》課程論文

植物基因工程研究進(jìn)展

摘要：自1983年美國(guó)人首先成功地獲得抗卡那霉素的煙草再生植株開始，人類就開始了植物基因工程的研究。至今已在逾200種植物中成功地獲得了轉(zhuǎn)基因植株,并有近1000例轉(zhuǎn)基因植物獲準(zhǔn)進(jìn)行田間試驗(yàn),更有十余種轉(zhuǎn)基因植物(如轉(zhuǎn)基因棉花.大豆)已進(jìn)入商業(yè)化種植.轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品已進(jìn)入人們?nèi)粘Ｉ睢Ｖ参锘蚬こ痰膽?yīng)用已進(jìn)入蓬勃發(fā)展階段。下面是我從植物基因工程改善生物質(zhì)能利用的研究進(jìn)展做一說明。

關(guān)鍵詞：木質(zhì)纖維素 細(xì)胞壁 水解酶

近幾年來全世界對(duì)能源的需求量急劇增加加速了對(duì)有限的不可再生礦物質(zhì) 能源的消耗資源的利用也增加了CO2及粉塵的排放,造成環(huán)境破壞和全球氣候變 化[1]可再生的清潔的生物質(zhì)能成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)。其中的燃料乙醇工業(yè),近年來在世界范圍內(nèi)得到了廣泛的發(fā)展,我國(guó)也大力支持發(fā)酵乙醇用作能源[2]。目前,絕大部分乙醇來源于玉米淀粉發(fā)酵生產(chǎn)。但是由于淀粉本身又作為食品和飼料,產(chǎn)量有限,成本較高,阻礙了乙醇工業(yè)的發(fā)展。于是,人們把注意力轉(zhuǎn)移到谷物秸稈等廉價(jià) 的含有大量 的木質(zhì) 纖維素 的生物質(zhì) 材料上希望 能夠被 充分利用 [3]。但由于木質(zhì)纖維素本身難以分解,許多研究利用 基 因工程 方法 改善植物,使自生產(chǎn)生的多糖資源更利于降解,用于發(fā)酵產(chǎn)乙醇。1.木質(zhì)纖維素發(fā)酵生產(chǎn)乙醇發(fā)展現(xiàn)狀

在中國(guó),大約每年會(huì)產(chǎn)生10t億農(nóng)林業(yè)廢棄物這些資源用于造紙、紡織或者直接作為燃料這些占到很少一部分。絕大部分被廢棄了木質(zhì)纖維素是光合作用的基本產(chǎn)物 , 也是生物圈產(chǎn)生的最充足的可再 生生物資源被認(rèn)為是地球上最豐富的生物高分子聚合[4]。

大部分的高等植物細(xì)胞壁由膠聯(lián)多糖、糖蛋白和木質(zhì)素組成雙 子 葉植物 , 如擬南芥等,細(xì)胞壁多糖主要有三種:纖維素半、纖維素和果膠質(zhì),包埋在非 纖 維多糖基質(zhì)(半纖維素和果膠)中的纖維素網(wǎng)絡(luò),與木質(zhì)素和結(jié)構(gòu)蛋白共同構(gòu)成植物細(xì)胞壁的聚合液晶結(jié)構(gòu)[5]天然狀態(tài)下由于木質(zhì)素的保護(hù)作用,阻礙了水解 纖維素酶與纖維素的接觸并發(fā)揮作用,成為影響纖維素水解的重要因素 [3, 4]。YangB等人發(fā)酵降解實(shí)驗(yàn)證明,雖然半纖維素對(duì)纖維素。也有一定保護(hù)作用 , 但木質(zhì)素的去除對(duì)于纖維素有效降解是最關(guān)鍵的[6]。一般對(duì)木質(zhì)纖維素材料 的利用,首先要進(jìn)行粉碎,然后預(yù)處理(酸堿處理等),最后 添 加 微 生物 來源 的纖維素復(fù)合水解酶類,使之與處理過的木質(zhì)纖維充分接觸,將其降解為單糖 , 從而用于乙醇發(fā)酵?，F(xiàn)在雖然前期的粉碎和預(yù)處理工藝研究取得了很大進(jìn)展但成本仍然較高，而且后期發(fā)酵分解處理。要添加來源于微生物的纖維素水解復(fù)合酶,價(jià)格仍十分昂貴[7]。這些因素導(dǎo)致目前用木質(zhì)纖維素作為這些因素 導(dǎo)致 目前用木質(zhì)纖維素作為原料發(fā)酵產(chǎn)乙醇,成本較高發(fā)展緩慢因此,現(xiàn)在對(duì)木質(zhì)纖維素進(jìn)行高效降解使用,仍然是個(gè)很大的難題。2.植物基因工程與植物木質(zhì)纖維素利用

近年來隨著生物技術(shù)的不斷進(jìn)步,人們開始嘗試?yán)弥参锘蚬こ谭椒▉?解決植物木質(zhì)纖維素有效利用問題研究主要集中在改善植物細(xì)胞壁木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)和含量比例等方面,使植物多糖資源利于降解使用，或者利用植物作為生物反應(yīng)器,在植物內(nèi)表達(dá)微生物來源的強(qiáng)活性纖維素降解酶,使植物自身表達(dá)高活性纖維素水解 酶類等研究。2.1 改善植物細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)與組成

過去幾十年的研究,改善木質(zhì)素含量及細(xì)胞壁已成為可能。利用基 因工程方法,控制植物內(nèi)木質(zhì)素合成相關(guān)基因的表達(dá),可以改變木質(zhì)素結(jié)構(gòu)和含量木質(zhì)素對(duì)纖維素形成的保護(hù)作用是導(dǎo)致 纖維素資源利用 的主要障礙,降低木質(zhì)素含量或改變其結(jié)構(gòu),將利于纖維素 的分解[8]。雖然植物體木質(zhì)素的合成過程還不是十分清楚,但近幾年的研究,已使大量降低木質(zhì)素含量成為可能。

在玉米和苜蓿的研究中發(fā)現(xiàn),木質(zhì)素合成單體之一的芥子醇, 其前體的甲基化合成酶基因COMT(caffeate/5-hydroxyferulate O-methyltransferase),如果被抑制表達(dá),芥子單體含量會(huì)明顯減少,可導(dǎo)致木質(zhì)素含量降低 [9, 10]但是在楊樹中抑制這種酶的表達(dá)卻不能夠改善材質(zhì),木質(zhì)素含量反而增加[11]。Li L等人在楊樹中研究發(fā)現(xiàn),通過反義表達(dá)4CL基因(4-coumarate-CoA ligase)時(shí),木質(zhì)素含量了減少了約40%,并且導(dǎo)致10%的纖維素含量的增加，如果正義表達(dá)控制木質(zhì)素組成單體紫丁香基丙 烷(syringyl)和愈瘡木基丙烷(guaiacyl)比率的CAld5H基因(Coniferaldehyde 5-hydroxylase),可導(dǎo)致紫丁香基丙烷的量明顯增 高,但木質(zhì)素含量沒有變化[12]。當(dāng)兩基因同時(shí)轉(zhuǎn)化時(shí),木質(zhì)素含量減少可達(dá)53%,紫丁香基丙烷含量進(jìn)一步增加,而纖維素含量能夠增加30%。Cano-Delgado A等人研究擬南芥CESA3突變體發(fā)現(xiàn),纖維素合成酶受損時(shí),導(dǎo)致了木質(zhì)素大量合成[13]這表明在植物木質(zhì)部細(xì)胞中可能存在一種調(diào)控機(jī)制,當(dāng)木質(zhì)素含量減少時(shí),為了維持支撐作用,纖維素含量會(huì)相應(yīng)增加。Chabannes M等人在煙草中研究發(fā)現(xiàn),同時(shí)抑制CCR(Cinnamoyl CoA reductase)和 CAD(Cinnamyl alcohol dehydrogenase)的表達(dá),可大量減少木質(zhì)素含量,但非預(yù)期 的還引起了細(xì)胞壁多糖酚類物質(zhì)及可溶性酚類物質(zhì)含量的變化[14]等人在番茄中抑制表達(dá)木質(zhì)素合成相關(guān)的CCR基因,導(dǎo)致木質(zhì)素含量降低,同時(shí)與木質(zhì)素形成具有共同前體的酚類復(fù)合物增加[15]。Boudet AM等人通過抑制楊樹木質(zhì)素合成酶基因CCR,可導(dǎo)致植物細(xì)胞壁纖維 素成分更容易被纖維素分解菌Clostridium產(chǎn)糖量達(dá)到原來的2倍[16]這表明,降低木質(zhì)素等物質(zhì)含量后,非常利于纖維資源的利用。Li Y等人研究發(fā)現(xiàn),過氧化酶影響了木質(zhì)化過程[17]。Blee KA等人在煙草中反義抑制過氧化酶FBP1(French bean cationic peroxidase)同系物表達(dá),在不影響植物生長(zhǎng)發(fā)育的情況下,使木質(zhì)素含量降低了40%~50% [18]。通過基因工程方法,改變木質(zhì)素結(jié)構(gòu)與含量的方法改善植物細(xì)胞壁結(jié)構(gòu),利于作為能源植物,具有重要的研究?jī)r(jià)值。

2.2 植物體內(nèi)表達(dá)木質(zhì)纖維素水解酶

過去幾十年的發(fā)展,植物已成功的作為重組蛋白表達(dá)的生物反應(yīng)器,它相對(duì)于微生物和動(dòng)物表達(dá)的優(yōu)勢(shì)是具有較低的成本已在多種植物里面進(jìn)行了異源重組蛋白的表達(dá)研究(如疫苗和工業(yè)用酶等),蛋白表達(dá)量高且保持了很好的生物學(xué)活性[19]。近幾年,人們開始在植物體內(nèi)進(jìn)行微生物來源的研究,希望這些植物作為生物反應(yīng)器,大量表達(dá)并在細(xì)胞內(nèi)積累纖維素酶。收獲的植物,經(jīng)過粉碎和預(yù)處理(酸堿處理等)后,在分解過程中能利用自身表達(dá)的酶,不添加加來源于微生物的酶,就可以將纖維素充分分解為單糖, 進(jìn)一步用于生產(chǎn)乙醇,降低生產(chǎn)成本(Sticklen M,2006)[20]?？紤]到細(xì)胞質(zhì)表達(dá)對(duì)植物生長(zhǎng)影響較大,一般采用定向胞外或細(xì)胞器積累表達(dá)（如定向質(zhì)外體葉綠體溶酶體等）Ziegler MT等人在擬南芥中,定向質(zhì)外體,積累表達(dá)了來源于Acidothermus cellulolyticus的耐熱內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖酶(Endo-1,4-β-glucanase),表達(dá)量約達(dá)到葉子總可溶性蛋白的26%,并且保持了很好的活性[21]，同樣是在擬南芥中,Hyunjong B等人定向葉綠體和過氧化酶體,積累表達(dá)來源于Trichoderma reesei的木聚糖酶(Xylase),達(dá)到了總可溶性蛋白的4.6%,明顯 高于細(xì)胞質(zhì)表達(dá)和單一細(xì)胞器定向表達(dá)[22]在煙草中Dai Z等人定向葉綠體,積累表達(dá)了A.cellulolyticu 的耐熱內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖酶,達(dá)到總可溶性蛋白的1.35%[23]。Dai Z等人采用同樣的酶,比較了定向不同細(xì)胞器積累表達(dá)的差異,發(fā)現(xiàn)定向質(zhì)外體表達(dá)蛋 白量最高,且保持了較好的活性[24]。在其它的植物中,也進(jìn)行了相關(guān)的研究, Xue GP等人在大麥的胚乳中,特異表達(dá)來源于Neocallimastix patriciarum 的內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖酶,約達(dá)到了總種子蛋白的1.5%[25]。Oraby H 等人在水稻中,定向質(zhì)外體積累表達(dá)了A.cellulolyticu耐熱內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖酶,達(dá)到了葉子總可溶性蛋白的 4.9%。

目前的研究集中于將植物作為生物反應(yīng)器,盡可能多的表達(dá)并積累纖維素酶,用于后期的處理。在發(fā)酵分解過程可以利用植物自身表達(dá)的異源纖維素水解酶,節(jié)省了額外添加酶的量。表達(dá) 的大都是內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖酶或木聚糖酶,為了預(yù)處理后還 能保持較好活性,多采用穩(wěn)定性強(qiáng)的耐高溫酶。由于纖維素有效降解需要復(fù)合水解酶,并且木質(zhì)素對(duì)其具有很強(qiáng)的保護(hù)作用,這些植物不會(huì)發(fā)生自身降解。3.前景與展望

利用不斷發(fā)展的植物基因工程技術(shù),在能源植物研究方面已經(jīng)取得了不錯(cuò)的研究進(jìn)展。但是,目前要實(shí)現(xiàn)廉價(jià)充分的利用纖維資源,還有一定的困難。通過對(duì)植物細(xì)胞壁合成 代謝研究的不斷深入,應(yīng)該能夠獲得對(duì)自身生長(zhǎng)發(fā)育不影響的低木質(zhì)素植物細(xì)胞壁木質(zhì)素結(jié)構(gòu)及含量改善纖維素含量增加,利于降解發(fā)酵產(chǎn)乙醇。還希望最終能夠獲得一種能源植物,這種植物通過自身表達(dá)異源的高活性木質(zhì)纖維水解復(fù)合酶,酶的表達(dá)受到誘導(dǎo)調(diào)控,收獲前誘導(dǎo)表達(dá),收獲后送往生物能源發(fā)酵工廠。這期間,木質(zhì)纖維素多糖在植物體內(nèi)也可進(jìn)行持續(xù)降解,在發(fā)酵工廠只需添加一些簡(jiǎn)單的輔助分解酶就可以徹底降解掉,使木質(zhì)纖維資源產(chǎn)乙醇變得十分簡(jiǎn)單 參 考 文 獻(xiàn): 1.Dorian JP, Franssen HT, Simbeck DR.Energy Policy, 2006, 34 : 1984~1991.2.Yang B, Lu Y.J Chem Technol Biotechnol, 2007, 82 : 6~10.3.Himmel ME, et al.Science, 2007, 315 : 804~807.4.Ding SY, Himmel ME.J Agric Food Chem, 2006, 54(3): 597~606.5.Cosgrove DJ.Nat Rev Mol Cell Biol 2005 6 11 850~861.6.Yang B Wyman CE.Biotechnol Bioeng 2004 86 1 88~95.7.Kabel MA, et al.Biotechnol Bioeng, 2005, 93 : 56~63.8.Ragauskas AJ, et al.Science, 2006, 311 :484~489.9.Piquemal J et al.Plant Physiol 2002 130 4 1675~1685.10.Guo D et al.Transgenic Res 2001 10 5 457~464.11.Pilate G et al.Nat Biotechnol 2002 20 6 607~612.12.Li L et al.Proc Natl Acad Sci USA 2003 100 8 4939~4944.13.Cano Delgado A, et al.Plant J, 2003, 34(3): 351~362.14.Chabannes M et al.Plant J 2001 28 3 257~270.15.van der Rest B et al.J Exp Bot 2006 57 6 1399~1411.16.Boudet AM Kajita S Grima Pettenati J et al.Trends Plant Sci2003 8 12 576~581.17.Li Y et al.J Plant Res 2003 116 3 175~182.18.Blee KA, et al.Phytochemistry, 2003, 64(1): 163~176.19.Streatfield SJ.Plant Biotechnol J 2007 5 1 2~15.20.Sticklen M.Curr Opin Biotechnol 2006 17 3 315~319.21.Ziegler MT, Thomas SR, Danna KJ.Mol Breed, 2000, 6 : 37~46.22.Hyunjong B, Lee DS, Hwang I.J Exp Bot, 2006, 57 : 161~169.23.Dai Z, Hooker BS, Anderson DB, et al.Transgenic Res, 2000, 9(1):43~54.24.Dai Z, et al.Transgenic Res, 2005, 14(5): 627~643.25.Xue GP et al.Plant Cell Rep 2003 21 11 1088~1094.