第一篇：PCR注意事項總結(jié)

PCR注意事項

PCR產(chǎn)物的電泳檢測時間

一般為48h以內(nèi)，有些最好于當日電泳檢測，大于48h后帶型不規(guī)則甚致消失。

假陰性，不出現(xiàn)擴增條帶

PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有①模板核酸的制備，②引物的質(zhì)量與特異性，③酶的質(zhì)量及，④PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應(yīng)針對上述環(huán)節(jié)進行分析研究。

模板：①模板中含有雜蛋白質(zhì)，②模板中含有Taq酶抑制劑，③模板中蛋白質(zhì)沒有消 化除凈，特別是染色體中的組蛋白，④在提取制備模板時丟失過多，或吸入酚。⑤模 板核酸變性不徹底。在酶和引物質(zhì)量好時，不出現(xiàn)擴增帶，極有可能是標本的消化處 理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應(yīng) 固定不宜隨意更改。

酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而 導(dǎo)致假陰性。需注意的是有時忘加Taq酶或溴乙錠。

引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是PCR失敗或擴增條帶不 理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質(zhì)量有問題，兩條引物一條濃度 高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴增，對策為：①選定一個好的引物合成單 位。②引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時做PCR有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃度。③引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。④引物設(shè)計不合理，如引物長度不夠，引物之間形成二聚體等。

Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對PCR擴增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴增的特 異性，濃度過低則影響PCR擴增產(chǎn)量甚至使PCR擴增失敗而不出擴增條帶。

反應(yīng)體積的改變：通常進行PCR擴增采用的體積為20ul、30ul、50ul?；?00ul，應(yīng)用多 大體積進行PCR擴增，是根據(jù)科研和臨床檢測不同目的而設(shè)定，在做小體積如20ul 后，再做大體積時，一定要模索條件，否則容易失敗。

物理原因：變性對PCR擴增來說相當重要，如變性溫度低，變性時間短，極有可能出現(xiàn)假陰性;退火溫度過低，可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率退火溫度過高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴增效率。有時還有必要用標準的溫度計，檢測一下擴增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。

靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某 段缺失使引物與模板失去互補序列，其PCR擴增是不會成功的。

假陽性

出現(xiàn)的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致，有時其條帶更整齊，亮度更高。

引物設(shè)計不合適：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進行PCR擴增時，擴增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽性。需重新設(shè)計引物。

靶序列或擴增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個基因組或大片段的交叉污染，導(dǎo)致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決：操作時應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或濺出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及樣進槍頭等均應(yīng)一次性使用。必要時，在加標本前，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性?？苫ハ嗥唇?，與引物互補后，可擴增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽性的產(chǎn)生，可用巢式PCR方法來減輕或消除。

出現(xiàn)非特異性擴增帶

PCR擴增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計的大小不一致，或大或小，或者同時出現(xiàn)特異性擴增帶 與非特異性擴增帶。非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不完全互補、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環(huán)次數(shù) 過多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶 則不出現(xiàn)，酶量過多有時也會出現(xiàn)非特異性擴增。其對策有：必要時重新設(shè)計引 物。減低酶量或調(diào)換另一來源的酶。降低引物量，適當增加模板量，減少循環(huán)次 數(shù)。適當提高退火溫度或采用二溫度點法(93℃變性，65℃左右退火與延伸)。

出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶

PCR擴增有時出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量 差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引起。其對策有：減少酶量，或調(diào)換另一來源的酶。②減少dNTP的濃度。適當降低Mg2+濃 度。增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。

克隆PCR產(chǎn)物1)克隆PCR產(chǎn)物的最優(yōu)條件是什么？

最佳插入片段：載體比需實驗確定。1：1（插入片段：載體）常為最佳比，摩爾數(shù)比1：8或8：1也行。應(yīng)測定比值范圍。連接用5ul 2X連接液, 50ng質(zhì)粒DNA,1Weiss單位的T4連接酶，插入片段共10ul。室溫保溫1小時，或4℃過夜。在這2種溫度下，缺T-凸出端的載體會自連，產(chǎn)生藍斑。室溫保溫1小時能滿足大多數(shù)克隆要求，為提高連接效率，需4℃過夜。

2)PCR產(chǎn)物是否需要用凝膠純化？

如凝膠分析擴增產(chǎn)物只有一條帶，不需要用凝膠純化。如可見其他雜帶，可能是積累了大量引物的二聚體。少量的引物二聚體的摩爾數(shù)也很高，這會產(chǎn)生高比例的帶有引物二聚體的克隆，而非目的插入片段。為此需在克隆前做凝膠純化。

3)如果沒有回收到目的片段，還需要作什么對照實驗？ A）涂布未轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細胞。

如有菌落，表明氨芐失效，或污染上帶有氨芐抗型的質(zhì)粒，或產(chǎn)生氨芐抗型的菌落。B）轉(zhuǎn)化完整質(zhì)粒，計算菌落生長數(shù)，測定轉(zhuǎn)化效率。

例如，將1ug/ul質(zhì)粒1:100稀釋,1ul用于100ul感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化。用SOC稀釋到1000ul后，用100ul鋪板。培養(yǎng)過夜，產(chǎn)生1000個菌落。轉(zhuǎn)化率為： 產(chǎn)生菌落的總數(shù)/鋪板DNA的總量。

鋪板DNA的總量是轉(zhuǎn)化反應(yīng)所用的量除以稀釋倍數(shù)。具體而言轉(zhuǎn)化用10ng DNA，用SOC稀釋到1000u后含10 ng DNA，用1/10鋪板，共用1 ng DNA。轉(zhuǎn)化率為： 1000克隆X10（3次方）ng /鋪板1 ng DNA ug=10（6次方）cfu/ ug 轉(zhuǎn)化pGEM-T應(yīng)用10（8次方）cfu/ ug感受態(tài)細胞 如沒有菌落或少有菌落，感受態(tài)細胞的轉(zhuǎn)化率太低。

C）如用pGEM-T正對照，或PCR產(chǎn)物，產(chǎn)生>20-40藍斑（用指定步驟10（8次方）cfu/ ug感受態(tài)細胞），表明載體失去T。可能是連接酶污染了核酸酶。T4 DNA連接酶（M1801，M1804，M1794）質(zhì)量標準好無核酸酶污染，不應(yīng)用其它來源的T4 DNA連接酶替換。D）用pGEM-T或pGEM-T Easy載體，連接pGEM-T正對照，轉(zhuǎn)化高頻率感受態(tài)細胞（10（8次方）cfu/ug）,按照指定的實驗步驟，可得100個菌落，其中60%應(yīng)為白斑，如產(chǎn)生>20-40藍斑, 沒有菌落或少有菌落，連接有問題。

4)對照實驗結(jié)果好，卻沒有回收到目的片段，實驗出了什么問題？

A）連接用室溫保溫1小時，能滿足大多數(shù)克隆，為提高效率，需4℃過夜。B）插入片段帶有污染，使3`-T缺失，或抑制連接，抑制轉(zhuǎn)化。為此，將插入片段和pGEM-T正對照混合，再連接。如降低了對照的菌落數(shù)，插入片段需純化，或重新制備。如產(chǎn)生大量的藍斑，插入片段污染有核酸酶，使pGEM-T或pGEM-T Easy載體3`-T缺失。

C）插入片段不適于連接。用凝膠純化的插入片段，因受UV過度照射，時有發(fā)生。UV過度照射會產(chǎn)生嘧啶二聚體，不利于連接，DNA必需重新純化。D）帶有修復(fù)功能的耐熱DNA聚合酶的擴增產(chǎn)物末端無A，后者是pGEM-T或pGEM-T Easy載體克隆所需。加Taq DNA聚合酶和核苷酸可在末端加A。詳情查pGEM-T pGEM-T Easy載體技術(shù)資料（TM042）。

E）高度重復(fù)序列可能會不穩(wěn)定，在擴增中產(chǎn)生缺失和重排，如發(fā)現(xiàn)插入片段高頻率地產(chǎn)生缺失和重排，需用重組缺陷大腸桿菌菌株，如SURE細胞

PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件 標準的PCR反應(yīng)體系：

10×擴增緩沖液

10ul

4種dNTP混合物

各200umol/L

引物

各10～100pmol

模板DNA

0.1～2ug

Taq DNA聚合酶

2.5u

Mg2+

1.5mmol/L

加雙或三蒸水至

100ul

PCR反應(yīng)五要素： 參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+

引物： 引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設(shè)計互補的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增。設(shè)計引物應(yīng)遵循以下原則：

①引物長度： 15-30bp，常用為20bp左右。

②引物擴增跨度： 以200-500bp為宜，特定條件下可擴增長至10kb的片段。

③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC最好隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補，特別是3'端的互補，否則會形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴增條帶。

⑤引物3'端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個堿基，應(yīng)嚴格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導(dǎo)致PCR失敗。

⑥引物中有或能加上合適的酶切位點，被擴增的靶序列最好有適宜的酶切位點，這對酶切分析或分子克隆很有好處。⑦引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。引物量： 每條引物的濃度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體的機會。

酶及其濃度 目前有兩種Taq DNA聚合酶供應(yīng)，一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶，另一種為大腸菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反應(yīng)約需酶量2.5U(指總反應(yīng)體積為100ul時)，濃度過高可引起非特異性擴增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少。

dNTP的質(zhì)量與濃度 dNTP的質(zhì)量與濃度和PCR擴增效率有密切關(guān)系，dNTP粉呈顆粒狀，如保存不當易變性失去生物學活性。dNTP溶液呈酸性，使用時應(yīng)配成高濃度后，以1M NaOH或1M Tris。HCL的緩沖液將其PH調(diào)節(jié)到7.0～7.5，小量分裝，-20℃冰凍保存。多次凍融會使dNTP降解。在PCR反應(yīng)中，dNTP應(yīng)為50～200umol/L，尤其是注意4種dNTP的濃度要相等(等摩爾配制)，如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(偏高或偏低)，就會引起錯配。濃度過低又會降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。dNTP能與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度降低。

模板(靶基因)核酸 模板核酸的量與純化程度，是PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，傳統(tǒng)的DNA純化方法通常采用SDS和蛋白酶K來消化處理標本。SDS的主要功能是： 溶解細胞膜上的脂類與蛋白質(zhì)，因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜，并解離細胞中的核蛋白，SDS 還能與蛋白質(zhì)結(jié)合而沉淀； 蛋白酶K能水解消化蛋白質(zhì)，特別是與DNA結(jié)合的組蛋白，再用有機溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質(zhì)和其它細胞組份，用乙醇或異丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作為模板用于PCR反應(yīng)。一般臨床檢測標本，可采用快速簡便的方法溶解細胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質(zhì)使靶基因游離，直接用于PCR擴增。RNA模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。

Mg2+濃度 Mg2+對PCR擴增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響，在一般的PCR反應(yīng)中，各種dNTP濃度為200umol/L時，Mg2+濃度為1.5～2.0mmol/L為宜。Mg2+濃度過高，反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異擴增，濃度過低會降低Taq DNA聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少。

PCR反應(yīng)條件的選擇

PCR反應(yīng)條件為溫度、時間和循環(huán)次數(shù)。

溫度與時間的設(shè)置： 基于PCR原理三步驟而設(shè)置變性-退火-延伸三個溫度點。在標準反應(yīng)中采用三溫度點法，雙鏈DNA在90～95℃變性，再迅速冷卻至40 ～60℃，引物退火并結(jié)合到靶序列上，然后快速升溫至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。對于較短靶基因(長度為100～300bp時)可采用二溫度點法，除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一，一般采用94℃變性，65℃左右退火與延伸(此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性)。

①變性溫度與時間：變性溫度低，解鏈不完全是導(dǎo)致PCR失敗的最主要原因。一般情況下，93℃～94℃min足以使模板DNA變性，若低于93℃則需延長時間，但溫度不能過高，因為高溫環(huán)境對酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或PCR產(chǎn)物完全變性，就會導(dǎo)致PCR失敗。

②退火(復(fù)性)溫度與時間：退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素。變性后溫度快速冷卻至40℃～60℃，可使引物和模板發(fā)生結(jié)合。由于模板DNA 比引物復(fù)雜得多，引物和模板之間的碰撞結(jié)合機會遠遠高于模板互補鏈之間的碰撞。退火溫度與時間，取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長度。對于20個核苷酸，G+C含量約50%的引物，55℃為選擇最適退火溫度的起點較為理想。引物的復(fù)性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度：

Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)＋2(A+T)

復(fù)性溫度=Tm值-(5～10℃)

在Tm值允許范圍內(nèi)，選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合，提高PCR反應(yīng)的特異性。復(fù)性時間一般為30～60sec，足以使引物與模板之間完全結(jié)合。

③延伸溫度與時間：Taq DNA聚合酶的生物學活性：

70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子

70℃ 60核苷酸/S/酶分子

55℃ 24核苷酸/S/酶分子

高于90℃時，DNA合成幾乎不能進行。

PCR反應(yīng)的延伸溫度一般選擇在70～75℃之間，常用溫度為72℃，過高的延伸溫度不利于引物和模板的結(jié)合。PCR延伸反應(yīng)的時間，可根據(jù)待擴增片段的長度而定，一般1Kb以內(nèi)的DNA片段，延伸時間1min是足夠 的。3～4kb的靶序列需3～4min；擴增10Kb需延伸至15min。延伸進間過長會導(dǎo)致非特異性擴增帶的出現(xiàn)。對低濃度模板的擴增，延伸時間要稍長些

第二篇：PCR實驗室報批細節(jié)、注意事項、常見問題問答

報 批 細 節(jié)

1、技術(shù)檔案：

技術(shù)人員簡歷表、培訓(xùn)檔案、要求有實質(zhì)性文件如每人的學歷證書、上崗證、科研成果（課題）、技術(shù)文章、獲獎證書等的復(fù)印件

2、儀器檔案：

實驗室所有儀器的購買、使用、校正、放置地點、出廠編號、說明書復(fù)印件等

實驗室所有儀器維護校正記錄如：加樣器、溫度計、溫濕度計需出具計量局校正報告文件（可每種只校正一套作為標準）。

擴增儀需有儀器廠家專業(yè)技術(shù)人員維護校正報告，和校正后的參數(shù)。加樣器的出廠編號、使用時間、校正記錄。

5700維護后驗證記錄—用同一公司或校準試劑或用自制質(zhì)控血清并記錄數(shù)值

3、其他細節(jié): 垃圾處理：按生物污染性制品，交醫(yī)院統(tǒng)一處理。儀器簡單操作流程

標記筆、槍頭盒等一些小物品都要標明分區(qū)。儀器的申請、采購、使用、驗證程序

樣本采集（針對臨床醫(yī)護人員）、運輸、收集程序 樣品的唯一編號原則—應(yīng)區(qū)分開不同天、不同種類的標本

標本的保存程序—包括處理前、剛處理后、報告發(fā)放后的原始標本（原則上至少保留一周）應(yīng)有專人負責。

檢測結(jié)果的保存、備份記錄、質(zhì)控記錄保存，除電腦記錄外應(yīng)有相應(yīng)的手抄記錄（類似于基因日檢測統(tǒng)計表類型的）。

抱怨記錄—應(yīng)有時間、事件（項目）、接待人、處理方法、處理結(jié)果、處理人簽字確認

注 意 事 項

1、回答任何問題都應(yīng)與自己寫的SOP文件相一致.“寫你所做的,做你所寫的”.2、SOP文件不能寫的太虛,無法做到的東西不要寫,比如公司版的SOP文件里的加樣器的校準一般實驗室就做不到.模棱兩可也不要寫,比如“消毒時間一到兩小時”不能這樣寫,多少就是多少.3、處理標本要在生物安全柜內(nèi),而加樣則在柜外.4、各區(qū)門口要貼有各區(qū)的工作制度,限入標志.還要準備兩個登記本,一個來記錄紫外消毒,一個來記錄工作人員出入.區(qū)內(nèi)還要有一個工作記錄本,用來記錄各區(qū)每天的工作內(nèi)容,便于監(jiān)測每天的工作全過程.5、每把槍的用途要清楚,不能弄亂.比如稀釋陽模的槍和處理標本的槍不可混用.6、普通離心機處理分泌物標本時應(yīng)在離心后靜置20分鐘才能開蓋.(許斌這樣認為)

7、所有儀器、設(shè)備都要有檔案卡.8、所有的清潔消毒要在實驗結(jié)束后馬上進行,尤其是儀器、設(shè)備.像擴增儀，每天都要清潔，做完的反應(yīng)管決對不能留在樣品槽內(nèi)。

9、各區(qū)的拖把、抹布不得混用,標記清楚.10、生物防護意識要強,手套要隨時更換.生物防護安全的保證要從三個方面:制度、硬件、意識。

11、爆管如何處理:立即停止實驗,水浴里的水要倒掉,沖洗.所有可能污染的地方要用消毒液擦洗,紫外照射,通風排風.12、各區(qū)應(yīng)有日常工作核查表,做為每天工作記錄的補充.13、各區(qū)要有泡有消毒液的生物污物桶,用來處理生物垃圾.14、驗收組帶來的標本要按平時對待臨床標本一樣處理,要有接收記錄,結(jié)果登記等.15、拒絕電話或代領(lǐng)等非正常方式發(fā)放報告單.16、存放標本的冰箱要上鎖,鑰匙及電腦資料的密碼要由本科室人員專人保管.17、報告單上要注明試劑的檢測下限,不能寫成參考范圍.除了有操作者,還要有核校者,且兩者姓名除了電子打印還要用手簽.定量結(jié)果不能有陰陽性提示,只能報數(shù)值.18、SOP文件中PE5700的溫濕度要求應(yīng)該為溫度15－30℃、濕度為< 80％。

19、SOP中

醫(yī)院申報實驗室注意事項

專家組參觀實驗室回答的問題

1，“你們的冰箱的鐵鏈我可以從底下抽上來，實驗室能做好保密性嗎？

可以的，你們能做到就行，注意保密！

2，實驗室需要配置冷凍離心機，生物安全柜，如果做HCV時,注意重新添置新實驗室。

3，生物防護中是否有銳器的防護注意事項？ 4，實驗室的溫濕度計的放置位置？ 最好放在實驗室內(nèi)。

5，實驗室中如何做好離心管抑制物的檢測？ 而非爆管、裂管的檢測！

6，在做HCV時規(guī)定從抽血化驗到送達實驗室要幾個小時要有明規(guī)定！3小時左右！

7，溶血標本有何具體的判斷標準？脂血呢？

實驗室末次會議的提問

1，你們單位（達安）試劑，當我們新鮮標本做HBV時，提取中40微升+40微升提取液處理，待放置過夜后，第二天加樣時，有的標本特難取樣，有何處理辦法？ 2，實驗室中垃圾你們?nèi)绾翁幚淼模?/p>

3，實驗室中陰性標準檢測后變成陽性你怎么辦？（我們實驗室一共有三管陰性陰性對照，第一個陰性檢測管是試劑什么都不加，直接上機，第二個陰性檢測管是試劑中加入在實驗開始時打開蓋的1.5離心管帶有蒸餾水的，第三個陰性檢測管是與實驗一起提取的陰性血清。）4，實驗中如果陽性質(zhì)控，陽性梯度，標本呈陰性請分別解釋？ 5，實驗室必須配置生物安全柜，高速離心機！

臨床基因擴增檢驗實驗室技術(shù)驗收現(xiàn)場問卷

（口試和/或筆試）

一.現(xiàn)有一個患者向你提出：“我在你們醫(yī)院檢測HBV DNA為陽性，但在另一家醫(yī)院檢測為陰性，你們醫(yī)院是怎么做的檢測？”，此時，你怎么辦？

（該題主要是考實驗室人員是否知道并遵守所制定的抱怨處理程序）

二．現(xiàn)有一個臨床大夫拿著幾張HBV DNA定量PCR檢驗報告單找到PCR實驗室，說：“你們的PCR結(jié)果到底準不準，我這個病人剛開始檢測，HBV DNA是57×10拷貝數(shù)/ml，用了拉米呋啶治療后二周，再檢測結(jié)果為3×107拷貝數(shù)/ml，降了不少，但再過二周檢測，又變成了6×107拷貝數(shù)/ml，升高不少，這到底是怎么回事？”，如果這個大夫剛好問的是你，你怎么辦？并如何解釋其提出的問題？

(該題除了考實驗室人員是否知道并遵守所制定的抱怨處理程序外，還要求其對特定PCR檢驗的批間變異有充分的認識)

回答思路：

這兩題分別對應(yīng)患者和臨床醫(yī)生提出的抱怨?？键c為你是否按照所制定的程序來處理：無論是患者還是醫(yī)生提出抱怨，我們都應(yīng)該“按照”程序先記錄抱怨人姓名、抱怨內(nèi)容等，然后等問題解決后記錄處理結(jié)果等，最后記錄反饋意見等。

注意：一般問題中出現(xiàn)“此時，你怎么辦？”，其考核的重點均為“形式”而非“內(nèi)容”。所以題目中無論病人抱怨的是服務(wù)態(tài)度不好還是結(jié)果報告不準，醫(yī)生抱怨的是檢測結(jié)果和臨床診斷不符還是報告發(fā)放不及時，回答的方向都應(yīng)該是：“我們接待他們后，先在登記表上記錄抱怨的什么什么相關(guān)信息，做相應(yīng)處理，解決后記錄處理結(jié)果，最后填反饋表，歸檔總結(jié)，跟著以后改進等等等等”。對各種具體問題的處理就按照實際情況來回答就行。

如果題目中出現(xiàn)要你具體“解釋某某提出的問題”時，這時是具體考察某一“內(nèi)容細節(jié)”了。第二題中看你對PCR檢驗的批間變異有否充分的認識：一般PCR檢測試劑盒存在著一定的批間甚至批內(nèi)差異，而且PCR檢測前處理也存在著一定的誤差，分析軟件相關(guān)參數(shù)的選擇也會使定量結(jié)果發(fā)生變動，這是方法學造成的不可避免的事實。同一操作人、同一儀器、同一批號試劑、同一份標本同時做多份平行管，得到的結(jié)果都會不盡相同。所以我們都會允許結(jié)果存在一定范圍的偏差，一般為一個數(shù)量級的拷貝數(shù)。5×107、3×107和6×107均在允許的誤差范圍內(nèi)，排除了各種影響因素后，出現(xiàn)這種情況很正常，這說明了該病人用藥效果不佳。若定量結(jié)果有1～2個數(shù)量級甚至更大的變化才能反映用藥療效。

三．現(xiàn)有一人打電話到科室，說：“我孩子在你們醫(yī)院做了一項丙肝的PCR檢測，名字叫XXX，請你告訴我檢測結(jié)果好嗎？”。如果是你剛好接了這個電話，你會怎樣去做？

（該題考的是實驗室人員在患者要求以電子郵件、電話、傳真等方式傳遞報告時，是否能按相應(yīng)的程序去做）

回答思路： 也是考形式?！皩τ谶@種非正常的報告發(fā)放形式，我們按照程序，是這樣這樣處理的。”因為各個醫(yī)院實際情況不同，所以無論你怎樣處理，只要程序中體現(xiàn)了對患者結(jié)果的保密原則，具體細節(jié)不會太要求。

在程序中按以下幾個方式寫都是可以的：

1、我們均不以任何非正常形式發(fā)放報告。（最干脆！就是有點不近人情，不過對我們來說省事）

2、實在有特殊情況，可以電話查結(jié)果，其它發(fā)放形式不行。但必須確認身份，包括核對其所查詢的患者姓名、性別、年齡、檢測項目、送檢醫(yī)生、送檢日期、病區(qū)床號等情況，并提供患者ID號。

3、可以通過電話、圖文傳真、電子郵件等形式傳送結(jié)果，和上面一樣，需要核實身份。（最寬松了，不過麻煩了很多）

要注意的是：這些情況均應(yīng)明確告知查詢者，這幾種非正常形式發(fā)放的報告均僅為臨床提供參考，實驗的最終結(jié)果以正式檢測報告單為準。特殊情況報告發(fā)放后需詳細登記，簽署報告人姓名，實驗室負責人簽字。

“報告的正確發(fā)放”為考核重點，一般可能還會引申出“你們是如何發(fā)放檢測結(jié)果報告？”之類的問題，按照程序中寫的實際情況回答就行的了。只要遵循保密原則就OK。

最簡單的無非把事情都推給醫(yī)院：說門診患者報告單送至服務(wù)臺門診報告發(fā)放處，由那里的醫(yī)生確認身份后發(fā)放。（具體她們是怎么確認、確不確認這已經(jīng)不關(guān)我們的事了）。

若寫病人到科室領(lǐng)報告也行，只是“我們怎么確認病人身份”要在程序中體現(xiàn)：詢問相關(guān)信息、根據(jù)收費單或病歷唯一條形碼（若醫(yī)院采用計算機網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)）確認等等。

四．現(xiàn)有你科室同事，拿了一份血清標本給你，說：“這是我一個熟人的標本，他要做HCV RNA檢測，剛好他還做生化和免疫檢測，我從生化標本分了一些出來，給你做HCV RNA。”你覺得這樣行嗎？為什么？

（該題主要是考實驗室人員對有關(guān)標本的收集程序是否清楚并遵守）

回答思路：

問到了“為什么？”表示具體考到細節(jié)了。按照我們的收集程序，做PCR尤其是RNA項目需要獨立取血，不能從其它檢測的標本中分出一些來做。而且對RNA標本的采集、保存、運輸都有嚴格的要求。

一般驗收組會對這類問題加以引申。問你每天標本在哪兒采集？采血的人員有否經(jīng)過專門培訓(xùn)？采集的標本如何保存？

還可以順便問你結(jié)果發(fā)放后的標本如何保存、保存在哪兒？保存多久？甚至要你把這多久多久前的標本拿出來給他們看。

五．某一天，你在做HBV DNA熒光定量PCR檢測（方法的定量測定范圍為103～107拷貝數(shù)/ml）中，發(fā)現(xiàn)有1份標本的測定Ct值超出方法的測定上限，此時你怎么辦？對于沒有特異擴增曲線的標本你又怎么報告結(jié)果？

回答思路： 此為具體問題：題目已經(jīng)假設(shè)了方法的定量測定范圍為103～107拷貝數(shù)/ml，我們就按照這個假設(shè)來考慮。先看是否為特異擴增的曲線（即看曲線是否為標準的S形曲線），若為標準S形曲線表示的確為陽性標本，Ct值超出檢測上限，表示未知標本HBV DNA濃度過大，不在檢測線性范圍內(nèi)，應(yīng)該進行濃度梯度稀釋（1/

10、1/100、1/1000??），重做實驗，看哪個梯度處于線性范圍內(nèi)，得到原始濃度乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)即得。

若不是特異擴增的曲線（也就是常見的那種前面翹、與閾值線有交點的陰性曲線，計算機不會具體分析，見有交點就給Ct值，而且Ct值還很小，小于測定上限的Cycle數(shù)），按陰性報。

六．在PCR檢測的核酸提取離心中，如發(fā)現(xiàn)有一管離心管出現(xiàn)破裂，此時你怎么辦？

（該題是考實驗室人員對于其制定的實驗室及儀器設(shè)備消毒清潔程序是否知道并遵守）

回答思路：

按照離心機的消毒清潔程序：必須先停止實驗，將破裂管密封放入生物垃圾 桶，再用75%酒精擦拭離心室消毒，用移動紫外燈照射30～60分鐘后才能開始實驗。

可以引申出：離心管破裂，可能質(zhì)量有問題，為防止以后同類事情的發(fā)生，按照耗材質(zhì)檢程序進行離心管質(zhì)檢實驗，若不合格停止使用，重新購買并進行質(zhì)檢，合格的耗材才能使用。

七．有一個PCR實驗室的熒光定量PCR儀如ABI 7000因某種原因搬動到了另一個實驗臺面，實驗室只是將儀器外表面擦了擦，即用于常規(guī)擴增檢測工作，你覺得該實驗室做得對嗎？為什么？

（該題是考實驗室人員對于其制定的PCR儀校準程序是否知道并遵守）

回答思路：

考核實驗室人員對于其制定的PCR儀校準程序是否知道并遵守。儀器移動應(yīng)該按照程序進行校準后才能重新用于常規(guī)擴增檢測工作，以保證實驗結(jié)果。

7000型核酸擴增熒光檢測儀為復(fù)雜精密儀器，其校準工作需由專業(yè)工程師 進行。實驗室聯(lián)系儀器廠家派技術(shù)人員來校準儀器。

平時就算不搬動儀器，實驗室也應(yīng)與儀器廠家達成協(xié)議，定期校準儀器。八．有一位實驗室工作人員在做PCR實驗中，一開始將化驗單帶至標本處理區(qū)，核酸提取完成后，進入了擴增區(qū)，但將化驗單忘在了標本處理區(qū)，此時，他應(yīng)該怎樣做？

（該題是考實驗室人員對于其制定的實驗室單一流向工作程序是否知道并遵守）

回答思路：

很簡單，按照單一流向原則，該實驗員不能直接回2區(qū)拿單，要么請其他當日未進過擴增實驗室的人員幫拿，要么嚴格按要求淋浴、換衣服后再次進入2區(qū)拿化驗單。

第三篇：PCR實驗室

簡介

Pcr實驗室又叫基因擴增實驗室。PCR是聚合酶鏈式反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction)的簡稱。是一種分子生物學技術(shù)，用于放大特定的DNA片段，可看作生物體外的特殊DNA復(fù)制。通過DNA基因追蹤系統(tǒng)，能迅速掌握患者體內(nèi)的病毒含量，其精確度高達納米級別，精確檢測乙肝病毒在患者體內(nèi)存在的數(shù)量、是否復(fù)制、是否傳染、傳染性有多強、是否必要服藥、肝功能有否異常改變能及時判斷病人最適合使用哪類抗病毒藥物、判斷藥物療效如何、給臨床治療提供了可靠的檢驗依據(jù)

條件

1、必須擁有標準的的PCR熒光實驗室;實時熒光定量PCR技術(shù)于1996年由美國Applied Biosystems公司推出 由于該技術(shù)不僅實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它 有特異性更強、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點，目前已得到廣 泛應(yīng)用。本文試就其定量原理、方法及參照問題作一介紹

2、檢測設(shè)備必須符合標準PCR熒光實驗室設(shè)置要求;熒光定量PCR儀+實時熒光定量試劑+通用電腦+自動分析軟件，構(gòu)成PCR-DNA/RNA實時熒光定量檢測系統(tǒng)。

3、必須通過國家臨床檢驗中心的驗收和認證;

4、檢測人員必須通過國家臨檢中心業(yè)務(wù)培訓(xùn)并取得合格證書;PCR實驗室內(nèi)工作人員必須參加由國家衛(wèi)生部或各省臨床檢驗中心舉辦的臨床基因擴增培訓(xùn)班，并持證上崗。PCR實驗室通過驗收，實驗室至少必須應(yīng)有兩個以上持有“臨床基因檢測上崗證”。PCR實驗室必須建立嚴格的實驗室管理制度、建立標準化操作程序（SOP）、建立系列質(zhì)量管理文件等，確保實驗室日常運行符合國家衛(wèi)生部的要求，確保檢測結(jié)果準確、確保實驗室衛(wèi)生安全，確保實驗室長期穩(wěn)定運行

5、必須在無菌無塵環(huán)境下進行操作

功能

能夠?qū)颊卟∏檫M行科學、準確、實時的掌控，并結(jié)合抗HBV與T細胞免疫來打破免疫耐受，阻斷肝病病毒復(fù)制的療法、有效的分解肝炎病毒，解決了乙肝病毒易變異、耐藥，病毒復(fù)制模板難以治療，人體免疫耐受狀態(tài)不易打破等醫(yī)學難題，能迅速消除臨床癥狀，而且有效抑制乙肝病毒復(fù)制，明顯加快e抗原、抗體的血清轉(zhuǎn)換速度，殺滅血液及肝細胞內(nèi)的病毒，為防止再感染提供了長期保護，有效阻斷和逆轉(zhuǎn)肝纖維化、肝硬化進程。

建立方法

1、建立樣品準備區(qū)

這個區(qū)域?qū)ｉT用作樣品的準備，在制備和操作用于核酸提取的試劑時應(yīng)該采取預(yù)防措施：⑴PCR產(chǎn)物和帶有要擴增序列的DNA克隆不能在這個房間操作。⑵組織培養(yǎng)物、組織標本和血清樣品都帶進樣品準備間處理，以根據(jù)應(yīng)用的需要提取DNA或RNA。⑶用于樣品處理的工具不能被用作普通分子克隆的工具，也不能用作操作靶序列。⑷DNA樣品應(yīng)該用有專門的防護或正壓活塞式移液管操作，以防止在吸取樣品時有氣溶膠遺留。⑸大體積樣品應(yīng)該用單獨包裝的無菌一次性移液管吸取。⑹管子打開前都要簡短離心以減少氣溶膠的產(chǎn)生，而且管子不能用力崩開，這樣會產(chǎn)生氣溶膠。⑺任何時候都應(yīng)該穿實驗服和帶手套，手套要經(jīng)常更換，尤其在抽提過程中每一步之間都要更換。實驗服要專門用于樣品準備間，經(jīng)常清洗。

2、樣品準備和RNA-PCR RNA-PCR的額外步驟需要額外的樣品操作，這樣增加了樣品之間污染的機會。為了避免這一問題，反轉(zhuǎn)錄一步可以在樣品準備區(qū)進行。在RNA-PCR中應(yīng)用UNG以防止污染的方法也有報道。

3、建立前PCR區(qū)。

該去專門用于準備各種反應(yīng)，這個區(qū)域必須保持干凈，而且沒有來自克隆和樣品準備的污染。前PCR區(qū)必須要有試劑和準備，特別是專門用于前PCR區(qū)的正壓活塞式移液管。

4、PCR實驗室試劑的操作。

⑴所用的所有溶液都應(yīng)該沒有核酸和（或）核酸酶（DNase和RNase）污染。⑵所有PCR試劑中使用的水都應(yīng)該是高質(zhì)量的－新鮮蒸餾的去離子水，用0.22μm過濾的，并且是高壓滅菌。⑶在20℃到25℃貯存的試劑建議加點像疊氮鈉一類的抗微生物劑，在擴增試劑或樣品制備試劑中加入0.025%的疊氮鈉不抑制擴增反應(yīng)。⑷所用試劑都應(yīng)該以大體積配制，實驗一下看試劑是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量進行貯存。⑸所有試劑和樣品準備過程中都要使用一次性滅菌的瓶子和管子。⑹新配制的試劑在用于準備新的標本之前應(yīng)該加以檢驗。⑺樣品準備和前PCR區(qū)所使用的移液管在不使用時都應(yīng)該小心保存。

5、在前PCR區(qū)建立PCR混合物。

⑴可以把即刻可用的“主混合物”溶液配好、分裝并保存在-20℃或4℃，在實驗室只涉及到擴增一種或少數(shù)幾種特異序列時這樣做很有用。⑵如果你的實驗室使用多套引物，以致于配制包括所有試劑的單一反應(yīng)混合物不夠經(jīng)濟，可以考慮分裝保存夠一天的PCR成分。⑶作為一個規(guī)則，應(yīng)該保存一套陰性、弱陽性和強陽性對照樣品來分析樣品配制和PCR前過程的效率和潔凈程度。而且，你也希望通過使用一個已知的弱陽性樣品來驗證你的樣品緩沖液以證明里面不含擴增抑制物。⑷陰性樣品要與每組樣品同時做，以分析是否存在樣品與樣品之間的污染以及是否存在PCR產(chǎn)物的污染，陰性對照應(yīng)該包括核酸以外的所有試劑。⑸當做陽性對照時，有兩個理由決定了應(yīng)該使用最少數(shù)量的核酸。⑹由于必須有對照反應(yīng)，對照模板的特點應(yīng)該予以考慮。

6、控制污染的方法。

已設(shè)計出很有力的酶學方法用來消除一種形式的污染—使用UNG，這一技術(shù)能有效地消除由PCR產(chǎn)物引起的污染。另一種控制污染的方法是使用紫外線，這種方法不能完全消除污染問題，但可以將污染降低幾個數(shù)量級。

7、后PCR區(qū)PCR完成以后，需要分析樣品并解釋數(shù)據(jù)，應(yīng)該留出一個專門用于反應(yīng)后處理樣品的地方。后PCR活動中使用的所用試劑、一次性耗材和儀器都必須是專門用于這一目的，決不能把實驗室這一區(qū)域的試劑或儀器用于任何前PCR活動

第四篇：PCR實驗室

高端PCR實驗室控制設(shè)計說明

PCR實驗室即分子生物學實驗室，在醫(yī)療、科研、生物技術(shù)方面得到廣泛的應(yīng)用。因其在不同行業(yè)的應(yīng)用各有區(qū)別，在具體設(shè)計時也有不同之處，就醫(yī)療機構(gòu)的應(yīng)用而言，主要使用三區(qū)或四區(qū)設(shè)計，即試劑準備區(qū)、樣品提取區(qū)、擴增分析區(qū)；此類三區(qū)設(shè)計時候應(yīng)用于類似熒光定量型或同類PCR分析設(shè)備，及擴增與分析過程在設(shè)備內(nèi)一次完成。而四區(qū)設(shè)計在三區(qū)的基礎(chǔ)上講擴增分析區(qū)拆分為擴增區(qū)與分析區(qū)適用于其他類型的pcr設(shè)備及手工處理。

在PCR實驗的設(shè)計上，經(jīng)過多年的經(jīng)驗累積，已經(jīng)在一些關(guān)鍵技術(shù)上達成了共識。因為PCR實驗中所產(chǎn)生的DNA與RNA片段過于微小，以至于可以穿透高效過濾器，所以在實驗室設(shè)計上已經(jīng)不在強制要求設(shè)計高效凈化系統(tǒng)，但是為了提高實驗環(huán)境水平及保護實驗室內(nèi)的敖貴設(shè)備方面，如果在具備條件的情況下可考慮追加高效空氣凈化系統(tǒng)；建議凈化級別萬級。在PCR實驗中所產(chǎn)生的DNA與RNA片段污染是一直以來PCR實驗的重點問題。此類污染主要至上次試驗中所產(chǎn)生的基因片段對下次試驗產(chǎn)生的污染，而且一旦試驗環(huán)境中的污染形成后很難處理。因為消毒等傳統(tǒng)方式對于基因污染沒有很良好的效果。所以在PCR實驗室設(shè)計中一般將整套實驗室設(shè)計為全新風型實驗室，這樣而已通過有效的換氣次數(shù)來達到凈化室內(nèi)污染的作用。而在控制方面也有很多不同之處，因為各單位對PCR實驗的重視程度各有不同，所以在設(shè)計上也有不同，主要的控制設(shè)計有定送定排式壓力控制系統(tǒng)、變送定排式壓力控制系統(tǒng)變送變排式壓力控制系統(tǒng)。在控制設(shè)備方面也有很多區(qū)分如壓力無關(guān)型控制系統(tǒng)、壓力有關(guān)型控制系統(tǒng)。

根據(jù)業(yè)主要求，本PCR實驗室為三區(qū)設(shè)計，各區(qū)可獨立使用，不設(shè)置高效過濾系統(tǒng)等相關(guān)要求，根據(jù)業(yè)主以上要求，我方給出的設(shè)計方案為壓力無關(guān)型變送變排壓力控制系統(tǒng)。本系統(tǒng)的特點是，設(shè)備啟動后可根據(jù)實驗室內(nèi)使用節(jié)點調(diào)節(jié)送風量及排風量來控制各房間狀態(tài)，系統(tǒng)說明見下圖

? 每個房間可分別控制，使用時通過房間開關(guān)輸出啟動信號，當設(shè)備接到啟動信號時設(shè)備運行，運行中根據(jù)管道壓力反饋決定變頻器大小，房間內(nèi)送排風量由壓力無關(guān)型風量調(diào)節(jié)閥控制。? 當有多個房間開啟或關(guān)閉時，設(shè)備更加管道壓力反饋，調(diào)節(jié)設(shè)備變頻器增加或減少送排風量來穩(wěn)定管道壓力。各房間內(nèi)壓力又房間內(nèi)的壓力無關(guān)型定風量閥進行控制。

? 當BSC（生物安全柜，B2全排）開啟時BSC專用供風機組運行，BSC-供風機-排風機連鎖運轉(zhuǎn)。

? 當BSC做變風量調(diào)節(jié)時，根據(jù)房間內(nèi)壓力變化，BSC專用供風機組前安裝的壓力無關(guān)型變風量調(diào)節(jié)閥根據(jù)壓力變化增減送風量，確保房間壓力執(zhí)行在可控范圍內(nèi)。

? 當房間不適用時，房間與緩沖間均關(guān)閉電動密閉閥，確保房間處在密閉狀態(tài)避免布朗運動造成的可能污染風險。

? 房間換氣次數(shù)均按照一定凈化標準設(shè)計，當室內(nèi)污染發(fā)生時，通過一定時間的換氣處理后，污染問題可以基本解決。? 本系統(tǒng)如果業(yè)主需要，可在室內(nèi)送風口末端加裝高效過濾設(shè)備，房間可升級為凈化型實驗室。

? 壓力無關(guān)型風閥簡介：壓力無關(guān)型風閥的特點是不會根據(jù)管道壓力的變化而影響風閥內(nèi)部的送風量，在一定管道壓力區(qū)間內(nèi)能夠自行調(diào)節(jié)閥體阻力，來穩(wěn)定送風量，是高端實驗室必備的關(guān)鍵部件，目前此類閥體技術(shù)均有國外生產(chǎn)廠家控制，目前國內(nèi)主用使用的產(chǎn)品有妥思、文丘里、西門子等品牌。

第五篇：PCR經(jīng)驗總結(jié)

PCR經(jīng)驗總結(jié)

實驗注意事項：

（1）DNA處理最好用硅烷化塑料管以防粘附在管壁上，所有緩沖液吸頭、離心管等用前必須高溫高壓處理，常規(guī)消耗用品用后作一次性處理，避免反復(fù)使用造成污染。

（2）PCR操作應(yīng)戴手套并勤于更換，必要時應(yīng)戴好帽子和口罩，就像做手術(shù)一樣，要有“無菌觀念”。

（3）成套試劑，小量分裝，專一保存，防止它用。配制試劑用新器具，用后作一次性處理。（4）試劑管用前先瞬時離心（10s），使液體沉于管底，減少污染手套與加樣器機會。（5）最后加模板DNA，馬上蓋好，混勻，瞬時離心（10s），使水相與有機相分開。加入模板且忌噴霧污染，所有非即用管都應(yīng)蓋嚴。加模板DNA后應(yīng)更換手套。（6）實驗設(shè)陽性、陰性對照。

還有諸如：移液槍用完要放到最大計量位置，防止久了彈簧失靈；防止RNA酶污染標本；低溫下操作，防降解；試劑有致癌致畸作用，做好個人防護；頭腦中各操作步驟要清楚，不要加錯試劑。

問題及解決方案匯總：

一、假陰性，擴增無條帶

PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有①模板核酸的制備，②引物的質(zhì)量與特異性，③酶的質(zhì)量及活性 ④PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應(yīng)針對上述環(huán)節(jié)進行分析研究。

模板：①模板中含有雜蛋白質(zhì)，②模板中含有酶抑制劑，③模板中蛋白質(zhì)沒有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白，④在提取制備模板時丟失過多，或吸入酚。⑤模板核酸變性不徹底。在酶和引物質(zhì)量好時，不出現(xiàn)擴增帶，極有可能是標本的消化處理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應(yīng)固定不宜隨意更改。

酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導(dǎo)致假陰性。需注意的是有時忘加Taq酶或溴乙錠。

引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是PCR失敗或擴增條帶不理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質(zhì)量有問題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴增，對策為：①選定一個好的引物合成單位。②引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時做PCR有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃度。③引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。④引物設(shè)計不合理，如引物長度不 夠，引物之間形成二聚體等。

Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對PCR擴增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴增的特異性，濃度過低則影響PCR擴增產(chǎn)量甚至使PCR擴增失敗而不出擴增條帶。

反應(yīng)體積的改變：通常進行PCR擴增采用的體積為20ul、30ul、50ul。或100ul，應(yīng)用多大體積進行PCR擴增，是根據(jù)科研和臨床檢測不同目的而設(shè)定，在做小體積如20ul后，再做大體積時，一定要模索條件，否則容易失敗。

物理原因：變性對PCR擴增來說相當重要，如變性溫度低，變性時間短，極有可能出現(xiàn)假陰性;退火溫度過低，可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率退火溫度過高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴增效率。有時還有必要用標準的溫度計，檢測一下擴增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。

靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補序列，其PCR擴增是不會成功的。

二、假陽性

出現(xiàn)的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致，有時其條帶更整齊，亮度更高。

引物設(shè)計不合適：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進行PCR擴增時，擴增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽性。需重新設(shè)計引物。

靶序列或擴增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個基因組或大片段的交叉污染，導(dǎo)致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決：①操作時應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或濺出離心管外。②除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或 器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及樣進槍頭等均應(yīng)一次性使用。③必要時，在加標本前，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性?？苫ハ嗥唇?，與引物互補后，可擴增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽性的產(chǎn)生，可用巢式PCR來減輕或消除。

三、出現(xiàn)非特異擴增帶

PCR擴增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計的大小不一致，或大或小，或者同時出現(xiàn)特異性擴增帶與非特異性擴增帶。非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不完全互補、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環(huán)次數(shù)過多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn)，酶量過多有時也會出現(xiàn)非特異性擴增。其對策有：①必要時重新設(shè)計引物。②減低酶量或調(diào)換另一來源的酶。③降低引物量，適當增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。④適當提高退火溫度或采用兩步法。

四、出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶

PCR擴增有時出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引起。其對策有：①減少酶量，或調(diào)換另一來源的酶。②減少dNTP的濃度。③適當降低Mg2+濃度。④增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。

五、出現(xiàn)大量引物二聚體

1.從引物自身著手，重新設(shè)計引物，這是最根本解決這一問題的辦法； 2.可能模板有問題；

3.模板濃度過小，適當加大模板量；

4.Taq酶，引物，Mg2+濃度可能過高，可降低它們的濃度；

5.取你所要加的上下游引物混合后，在100攝氏度下的沸水中煮5分鐘，然后迅速拿出置于冰上瞬時冷卻，這時再加入反應(yīng)體系當中，引物二聚體就會消失的；

6.所配Mix中加5%的甘油或者5%的DMSO，可以增強特異性；

7.PCR反應(yīng)體系的配制在冰上進行，最后加Taq酶，PCR結(jié)束后，產(chǎn)物勿放置在室溫下過長時間，有人認為室溫下有些Taq酶會將多余的引物合成為二聚體。

8.增加循環(huán)數(shù)；

9.降低退火溫度后有條帶，則應(yīng)逐漸提高溫度，若提高溫度的同時產(chǎn)物量減少，則考慮增加鎂離子濃度（根據(jù)擴增片斷長度而定，片段長則相應(yīng)鎂離子濃度應(yīng)該高一些）；

10.若降低退火溫度，發(fā)現(xiàn)還是只有引物二聚體，而且鎂離子的濃度在20-25mM沒有區(qū)別，則考慮Buffer等試劑沒有完全融解、混勻，導(dǎo)致吸取的試劑濃度不對。11.以上次的PCR產(chǎn)物作模板二次PCR，可以提高引物與模板的特異性，減少引物二聚體，如果兩次時間間隔短的話，可以把原產(chǎn)物稀釋100－1000倍，如果間隔較長可以稀釋50－100倍；

六、高GC與復(fù)雜結(jié)構(gòu)的模板處理

將模板置于95℃水浴鍋中處理10分鐘以上，然后置于冰上瞬時冷卻，可大大降低二級結(jié)構(gòu)對PCR的影響。

七、長片段與短片段拼接失?。ǘc突變）

在做定點突變時，倘若突變位點距離基因的某一側(cè)較近（短片段<200bp）時，通常拼接困難或者難以通過電泳結(jié)果直觀判斷是否拼接成功。此時，可在短片段的上方（突變近5’端）或下方（突變近3’端）選取一條載體通用引物與基因另一條引物PCR（控制產(chǎn)物大小>300bp），然后再做基因拼接。確認大小無誤后，再以此產(chǎn)物為模板，用基因首尾引物PCR即可。

八、Long PCR無條帶

對于>5Kb片段擴增，常規(guī)PCR很難得到較好的條帶，建議①更換更適合于Long PCR的聚合酶；②添加PCR Enhancer調(diào)整體系；③設(shè)計多對引物分段擴增。

PCR增強劑（PCR Enhancer）：

常見的添加劑有：DMSO，甘油，甲酰胺，硫酸銨，甜菜堿，BSA等，它們對PCR反應(yīng)的影響雖然有所不同，但都可提高PCR的擴增效率。

1.DMSO：解除模板DNA局部二級結(jié)構(gòu)，增加引物與模板的特異性結(jié)合，使聚合酶更容易在二級結(jié)構(gòu)處延伸，但是對酶活有抑制作用，且當其濃度大于10％時還會降低保真性。

2.甘油：可降低模板溶解溫度（Tm），提高產(chǎn)量，但是對酶活有抑制作用。3.甲酰胺：促進某些“引物－模板”退火，降低帶有二級結(jié)構(gòu)的DNA的變性溫度。4.硫酸銨：增加反應(yīng)體系的離子強度，改變DNA的變性及退火溫度，調(diào)節(jié)酶活。5.甜菜堿：有利于DNA雙鏈的解開，Polymerase的結(jié)合，提高PCR的效率。