第一篇：實驗3 環(huán)境微生物的檢測

實驗三 環(huán)境微生物的檢測

一、實驗?zāi)康?/p>

1.了解周圍環(huán)境中微生物的分布情況。2.懂得無菌操作在微生物實驗中的重要性。3.了解四大類微生物的菌落特征。

二、實驗原理

在我們周圍的環(huán)境中存在著種類繁多的、數(shù)量龐大的微生物。土壤、江河湖海、塵埃、空氣、各種物體的表面以及人和動物體的口腔、呼吸道、消化道等都存在著各種微生物。由于它們體積微小，人們用肉眼無法觀察到它們個體的存在。但是只要稍加留意，我們就可以在發(fā)霉的面包、朽木上看到某些微生物群體。這些現(xiàn)象表明，自然界只要有微生物可以利用的物質(zhì)和環(huán)境條件，微生物就可以在其上生長繁殖。據(jù)此，我們在實驗室里就可以用培養(yǎng)基來培養(yǎng)微生物。

培養(yǎng)基是用人工配制的、適合微生物生長繁殖和產(chǎn)生代謝產(chǎn)物用的混合養(yǎng)料。其中含有微生物所需要的六大營養(yǎng)要素：碳源、氮源、無機鹽、生長因子、氣體和水分。此外，根據(jù)不同的微生物的要求，在配制培養(yǎng)基時還需用酸液或堿液調(diào)節(jié)至適宜的pH。配制好的培養(yǎng)基必須進行滅菌。所謂滅菌是指采用各類的物理或化學(xué)因素，使物體內(nèi)外的所有微生物喪失其生長繁殖能力的措施。經(jīng)過滅菌后的物體是無菌的。消毒是與滅菌完全不同的概念，它是指用較溫和的物理因素殺死物體表面和內(nèi)部病原微生物的一種常用的衛(wèi)生措施。

滅菌的方法較多，廣泛使用的是高溫滅菌，其中最常用的是高壓蒸汽滅菌法。此法是把待滅菌的物品放在一個可密閉的加壓蒸汽滅菌鍋中進行的。在1.05kg/cm2的蒸汽壓力下，溫度可達121℃。一般只要維持15~20min，就可殺死一切微生物的營養(yǎng)體和它們的各種孢子。

微生物的接種技術(shù)是生物科學(xué)研究中的一項最基本操作技術(shù)。為了確保純種不被雜菌污染，在整個接種過程中，必須進行嚴(yán)格的無菌操作。在實驗過程中必須牢固樹立無菌概念，經(jīng)常保持實驗臺及周圍環(huán)境的清潔，嚴(yán)格無菌操作，避免雜菌的污染，這是保證實驗成功的必要條件。如將微生物接種到適合其生長的固體培養(yǎng)基表面，在適宜的溫度下(一般細菌37℃：霉菌等28℃)，培養(yǎng)一段時間(一般24~48h)后，少量分散的菌體或孢子就可生長繁殖成肉眼可見的細胞群體，此即菌落。如平板上的菌落是由單個細胞(或單個孢子)生長繁殖而成的，就是一個純種細胞群或克??；若培養(yǎng)后大量菌落聚集在一起形成的為菌苔。不同種的微生物可形成大小、形態(tài)各異的菌落，根據(jù)微生物菌落形態(tài)的不同，可初步鑒別出四大類微生物：細菌、放線菌、酵母菌和霉菌。

細菌的菌落呈圓形、較小而薄、透明或不透明、質(zhì)地“細膩”，有的具有色澤，有的邊緣不整齊，有的表面濕潤、光滑，有的表面干燥有褶皺。此外，細菌常因分解含氮化合物而產(chǎn)生臭味。

酵母菌的菌落通常比細菌菌落大，圓形、厚、不透明、色素單一，多為乳白，少數(shù)為橙或紅色。酵母菌因普遍能發(fā)酵含碳有機物產(chǎn)醇，故菌落多伴有酒香味。

防線菌菌落小而致密，或堅硬、或呈粉狀。不少放線菌還產(chǎn)生特殊的土腥味。

霉菌菌落大而疏松、或大而緊密。氣生菌絲會發(fā)育形成一定形狀、構(gòu)造和色澤的子實器官，所以菌落表面往往有肉眼可見的構(gòu)造和顏色。

三、實驗材料

人體表和空氣中的微生物。

四、實驗器材與試劑

1.器材

恒溫培養(yǎng)箱、無菌平皿、電爐、酒精燈、火柴、無菌棉簽和記號筆。2.試劑

牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基、酵母膏葡萄糖培養(yǎng)基(簡稱YPD)、高氏一號培養(yǎng)基和查氏培養(yǎng)基。

五、實驗操作

I.融化培養(yǎng)基

將裝有無菌培養(yǎng)基的三角瓶置水浴中煮沸，待培養(yǎng)基融化后取出，當(dāng)冷至50~60℃左右時，進行下一步。II、倒平板

有持皿法和疊皿法，操作要點如下： 1.持皿法

(1)將無菌培養(yǎng)皿疊放在酒精燈左側(cè)，以便拿取。(2)點燃酒精燈。

(3)酒精燈旁，左手握三角瓶底部，傾斜三角瓶，右手旋松棉塞，用右手小指與小尾魚際(即小指邊緣)夾住棉塞并將其拔出(切勿將棉塞放在桌上)，隨之將瓶口在火焰上過一下(不可灼燒，以防爆裂)，以殺死可能沾在瓶口的雜菌。然后將三角瓶從左手換至右手(用拇指、食指和中指拿住三角瓶的底部)。操作中瓶口應(yīng)保持在火焰2~3cm，瓶口始終向著火焰，以防空氣中微生物的污染。左手拿起一套平皿，用無名指和小指托住皿底，用中指和拇指夾住皿蓋，食指于皿蓋上為支點，在火焰旁，打開皿蓋，讓三角瓶伸入，隨后倒入培養(yǎng)基。一般倒入15ml左右培養(yǎng)基即可鋪滿整個皿底。蓋上皿蓋，置水平位置待凝。然后將三角瓶移至左手，瓶口在次過火并塞緊瓶蓋。2.疊皿法

此法適于在超干凈臺上操作，基本步驟同持皿法。不同之處是左手不必持皿，而是將瓶皿疊放在酒精燈的左側(cè)并靠近火焰。按上述方法用右手拿三角瓶，左手打開最上面的皿蓋，倒入培養(yǎng)基，蓋上皿蓋后即移至水平位置待凝。再依次倒下面的平皿。操作中瓶口始終向著火焰，以防空氣中微生物的污染。

III、貼標(biāo)簽

待培養(yǎng)基完全凝固后，在皿底帖上標(biāo)簽，注明檢測類型，組別及日期(也可用記號筆書寫在皿底)IV、檢測方法

環(huán)境中微生物種類多樣，檢測方法也各異，先選幾種列舉如下： 1.空氣 檢測實驗室空氣中的微生物時，只要打開無菌平板的皿蓋，讓其暴露在空氣中一段時間(5~10min)然后將皿蓋蓋上即可。

2.桌面 檢測實驗臺桌面微生物是，可用一根無菌棉簽，先在無菌平板的

圖4-1 含菌棉簽平板劃線示意圖

左：開啟皿蓋法

右：劃線示意圖

一個區(qū)域內(nèi)濕潤和試劃幾下，然后用其擦抹桌面等物體表面，在以此棉簽在平板的另一區(qū)域作來回劃線接種(如圖4-1)。本操作應(yīng)以無菌操作要求進行，即在火焰旁用左手拿起平板，用中指 無名指和小指托住皿底部，用食指和大拇指夾住皿蓋并開成一縫，右手持棉簽在培養(yǎng)基表面劃線接種，無菌棉簽濕潤和試劑區(qū)可作為無菌對照。

3.頭發(fā) 移去放在桌面上的無菌平板的皿蓋，是頭發(fā)部位位于平板的上方，并用手指撥動頭發(fā)數(shù)次，在蓋上皿蓋即可。

4.手指 可用未洗的手指先在無菌平板的培養(yǎng)基一側(cè)(約一半的面積)作劃線接種，并在皿底作好標(biāo)記。然后用肥皂、流水洗手，用洗凈的手指于平板培養(yǎng)基的另一側(cè)作同樣的劃線接種，蓋好皿蓋。待培養(yǎng)后比較兩雜菌生長的情況。

5.口腔 打開無菌平板培養(yǎng)基的皿蓋，使口對著平板培養(yǎng)基的表面，以咳嗽或打噴嚏的方式接種，然后蓋上皿蓋。

V、培養(yǎng)

將以上各種檢測平板倒置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，至下周實驗時觀察并計數(shù)各平板上的菌落數(shù)。

VI、觀察

注意觀察不同類型菌落的大小、外形和顏色等特征，將觀察結(jié)果記錄在實驗報告上。

VII、清洗

觀察記錄完畢后，將含菌平板放在沸水中煮30min以上，殺死培養(yǎng)基表面生長的各種微生物，然后清洗并晾干培養(yǎng)皿。

六、思考題

1.通過本實驗后，談?wù)勀銓ξ⑸锏姆植家约皵?shù)量的認(rèn)識。2.本實驗中那些步驟屬無菌操作？為什么？ 3.如何描述菌落的形態(tài)特征？

第二篇：環(huán)境微生物實驗教案

實驗一顯微鏡使用與細菌染色法

一、實驗?zāi)康?/p>

1．學(xué)習(xí)掌握顯微鏡的結(jié)構(gòu)、功能和使用方法。2．學(xué)習(xí)掌握細菌簡單染色和革蘭氏染色方法。

二、顯微鏡的結(jié)構(gòu)與功能 1．顯微鏡的結(jié)構(gòu)

顯微鏡有機械裝置和光學(xué)系統(tǒng)兩大部分組成。機械裝置主要作用是使光學(xué)系統(tǒng)，緊固在一個光軸直線上，而且可精確地調(diào)節(jié)各光學(xué)系統(tǒng)部件之間的距離，使顯微鏡產(chǎn)

生清晰的物象。其組成包括：①鏡座和鏡臂；②鏡筒；③物鏡轉(zhuǎn)換器；④載物臺；⑤調(diào)焦裝置（粗調(diào)節(jié)器和細調(diào)節(jié)器）。光學(xué)系統(tǒng)使顯微鏡最主要地部分，起分辨和放大目的物地作用。其組成包括：①目鏡；②物鏡；③集光器；④反光鏡；⑤光源（自然光源和電光源）。

光學(xué)顯微鏡基本結(jié)構(gòu)：

1.照明燈(Lamp)2.聚光器(Condenser)3.載物臺和切片夾(Mechanical stage and specimenretainer)4.推進器(Mechanicalstage adjustment knob)5.物鏡(Objectives)6.粗細螺旋(Course andfine focus knob)7.目鏡(Oculars)8.照相機等接口(Connection to camera, etc.)2．顯微鏡的成像原理

標(biāo)本得到足夠的照明由標(biāo)本反射或折射出的光線經(jīng)物鏡進入使光軸與水平面傾 斜45 度的棱鏡，在目鏡的焦平面上，即在目鏡的視場光闌處，成放大的側(cè)光實像，該實像在經(jīng)目鏡的接目透鏡放大成虛像，所以人們看到的實虛像。3．分辨力與數(shù)值孔徑

顯微鏡的光學(xué)技術(shù)參數(shù)包括：數(shù)值孔徑、分辨率、放大率、焦深、視場寬度、覆 蓋差、工作距離等等。這些參數(shù)并不都是越高越好，它們之間是相互聯(lián)系又相互制約的，在使用時，應(yīng)根據(jù)鏡檢的目的和實際情況來協(xié)調(diào)參數(shù)間的關(guān)系，但應(yīng)以保證分辨率為準(zhǔn)。1． 數(shù)值孔徑

數(shù)值孔徑（又稱開口率numerical aperture 簡寫NA）是物鏡和聚光鏡的主要技術(shù)參數(shù)，是判斷兩者（尤其對物鏡而言）性能高低的重要標(biāo)志。其數(shù)值的大小，分別標(biāo)刻在物鏡和聚光鏡的外殼上。數(shù)值孔徑是光線投射到物鏡上的最大開口角度一半的正弦，乘上標(biāo)本與物鏡間介質(zhì)的折射率的乘積。用公式表示如下：NA=nsinu/2 成正比，與焦點的距離成反比。顯微鏡觀察時，若想增大NA 值，孔徑角是無法增大的，唯一的辦法是增大介質(zhì)的折射率n 值?；谶@一原理，就產(chǎn)生了水浸物鏡和油浸物鏡，因介質(zhì)的折射率n 值大于1，NA 值就能大于1。2． 分辨率

顯微鏡的分辨率是指能被顯微鏡清晰區(qū)分的兩個物點的最小間距。其計算公式 是σ = λ/NA 式中σ 為最小分辨距離；λ 為光線的波長；NA 為物鏡的數(shù)值孔徑。可見物鏡的分辨率是由物鏡的NA 值與照明光源的波長兩個因素決定。NA 值越大，照明光線波長越短，則σ 值越小，分辨率就越高。要提高分辨率，即減小σ 值，可采取以下措施

（1）降低波長λ 值，使用短波長光源。（2）增大介質(zhì)n 值以提高NA 值（NA=nsinu/2）。（3）增大孔徑角u 值以提高NA 值。（4）增加明暗反差。3． 放大率和有效放大率

由于經(jīng)過物鏡和目鏡的兩次放大，所以顯微鏡總的放大率應(yīng)該是物鏡放大率和目 鏡放大率的乘積。顯然，和放大鏡相比，顯微鏡可以具有高得多的放大率，并且通過調(diào)換不同放大率的物鏡和目鏡，能夠方便地改變顯微鏡的放大率。放大率也是顯微鏡的重要參數(shù)，但也不能盲目相信放大率越高越好。顯微鏡放大倍率的極限即有效放大倍率。分辨率和放大倍率是兩個不同的但又互有聯(lián)系的概念。當(dāng)選用的物鏡數(shù)值孔徑不夠大，即分辨率不夠高時，顯微鏡不能分清物體的微細結(jié)構(gòu)，此時即使過度地增大放大倍率，得到的也只能是一個輪廓雖大但細節(jié)不清的圖像，稱為無效放大倍率。反之如果分辨率已滿足要求而放大倍率不足，則顯微鏡雖已具備分辨的能力，但因圖像太小而仍然不能被人眼清晰視見。所以為了充分發(fā)揮顯微鏡的分辨能力，應(yīng)使數(shù)值孔徑與顯微鏡總放大倍率合理匹配。4．鏡頭的識別

低倍、高倍和油鏡接物鏡的識別方法，可直接讀它上面刻的倍數(shù)，簡便方法是低 倍鏡較短，高倍鏡較長，油鏡更長且上面刻有黑圈。使用時一定要識別清楚，不可認(rèn)錯，否則在轉(zhuǎn)換物鏡時會碰壓鏡頭，損壞物鏡的危險。放大倍數(shù)越高的接物鏡它的焦距越小，工作距離也越小，因此油鏡觀察時鏡頭和玻片極為接近，使用時應(yīng)該注意。

三、實驗方法

1．用枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）作簡單染色： 涂片→干燥→固定→染色→鏡檢

（1）涂片：在玻片中央滴一滴蒸餾水，然后取菌少許，洗入蒸餾水滴中，做成薄薄一層。

（2）干燥：細菌涂片一般應(yīng)讓他自然風(fēng)干。有時為使它干得快些，可以把涂片小心在酒精燈火焰上微微加熱烘干。

（3）固定：細菌涂片常用火焰固定法。即將涂片不快不慢地在火焰上通過2-3 次，菌體受熱固著于玻片上。

（4）染色：細菌簡單染色常用石炭酸復(fù)紅或草酸銨結(jié)晶紫為染色劑。在已固定的涂片上加一大滴石炭酸復(fù)紅染色液，使蓋住整個涂抹面，靜置染色1 分鐘。（5）水洗：染色完畢用自來水把玻片上的染色液沖洗干凈。

（6）鏡檢：將染色片晾干，或用吸水紙把多余的水吸去晾干，再用顯微鏡觀察。2．用大腸桿菌(E.coli)和金色葡萄球菌(staphylococcua aureus)作革蘭氏染色: 染色方法的要點及原理：先用結(jié)晶紫染色，再加碘液固定，酒精處理后用番紅復(fù) 染。革蘭氏陽性菌呈紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色。

染色的具體步驟：涂片→固定→初染→媒染→脫色→復(fù)染→鏡檢（1）取菌按常法涂片、干燥、固定。（2）草酸銨結(jié)晶紫染色1 分鐘。（3）充分水洗后加碘液處理1 分鐘。

（4）水洗后酒精脫色15-20 秒。（用酒精連續(xù)滴洗，至不溶出顏色為止）。（5）水洗后加番紅染色1 分鐘。

（6）充分水洗，吸去余水后晾干，鏡檢。

四、作業(yè)

1．畫出你在油鏡下觀察到的細菌形態(tài)并注明放大倍數(shù)？ 2．在染色中，固定一步起何作用？酒精脫色一步為何是關(guān)鍵？ 3．用油鏡觀察應(yīng)注意哪些問題？滴加香柏油起什么作用？ 4．油鏡使用完后應(yīng)如何處理？

實驗二放線菌與霉菌形態(tài)觀察

一、實驗?zāi)康?/p>

1．學(xué)習(xí)掌握插片法和水浸片法觀察放線菌和霉菌的方法。2．學(xué)習(xí)掌握低倍鏡和高倍鏡觀察絲狀菌體的技能。

二、實驗內(nèi)容

1．用插片法觀察繪圖放線菌的形態(tài)并注意“三絲”分化。將滅菌的蓋玻片斜插在涂布放線菌孢子的培養(yǎng)基的平板上，一半露在外面，恒溫培養(yǎng)后在培養(yǎng)基表面和蓋玻片上部都有放線菌生長，小心取出蓋玻片，放在干凈的載玻片上，在顯微鏡下直接觀察。

2．用水浸片法觀察：青霉（Penicillium.sp）、曲霉（Aspergillus.sp）的形態(tài)和分生孢子。根霉（Rhigopus.sp）的假根和孢囊孢子。梨頭霉（Absidia.sp）的接合孢子，木霉（Trichederma.sp）的形態(tài)，注意分枝形態(tài)。

霉菌菌絲一般可從培養(yǎng)體上直接調(diào)取，作成水浸片。具體方法：在清潔載玻片中央，加蒸餾水一滴，用解針挑取少量菌絲放入水滴中，這時兩手各持針一支，將菌絲分開，不使纏結(jié)成團。挑開菌絲后，輕輕加上蓋玻片，注意不要產(chǎn)生氣泡，先用低倍鏡后用高倍鏡觀察。

三、作業(yè)

1．繪圖、記錄南昌鏈霉菌、青霉、木霉、曲霉和根霉的形態(tài)。2．繪圖、記錄梨頭霉的接合孢子形態(tài)。3．用水浸片法觀察絲狀真菌應(yīng)注意哪些事項？

實驗三污水環(huán)境細菌運動性與原生動物、藻類的形態(tài)觀察

一、實驗?zāi)康?/p>

1．學(xué)習(xí)掌握用懸滴法觀察細菌運動性的方法和技術(shù)。2．學(xué)習(xí)掌握用水浸片法觀察原生動物和藻類的形態(tài)。

二、實驗內(nèi)容

1．用懸滴法觀察污水中細菌的運動性，注意運動方向。2．用水浸片法觀察原生動物的形態(tài)、運動性并注意分類。（1）鞭毛蟲類（Flagellata）：綠眼蟲、波豆蟲（2）肉足蟲類（Sarcoclina）：變形蟲、太陽蟲

（3）纖毛蟲（Ciliata）：草蟲、腎形蟲、鐘蟲、豆形蟲、漫游蟲等 3．用水浸片法觀察藻類的形態(tài)、種類并注意分類。（1）綠藻：空球藻屬（Fudoria）珊藻屬（Scendesmus）鼓藻屬（Cosmarium）小球藻屬（Chlorella）盤星藻屬（Pediastrum）

（2）裸藻：眼蟲藻屬（Euglena）（3）硅藻：舟形藻屬（Navicula）直鏈藻屬（Melosira）平板藻屬（Tabellaria）

三、作業(yè)

1．繪圖記錄細菌的運動方向，懸滴法觀察應(yīng)注意哪些事項？ 2．繪圖記錄原生動物、藻類的形態(tài)、種類和名稱。

實驗四 微生物的大小測定與數(shù)量的測定

一、實驗?zāi)康?/p>

1．學(xué)習(xí)了解測微尺的結(jié)構(gòu)，掌握測定微生物大小的方法。2．觀察酵母菌的形態(tài)，掌握鑒別死活酵母菌的方法。

3．學(xué)習(xí)了解血球計數(shù)板的結(jié)構(gòu)，掌握微生物數(shù)量測定的方法。

二、實驗內(nèi)容

1．在低倍鏡和高倍鏡下求出目鏡測微尺的校正值。（1）目鏡測微尺和鏡臺測微尺

目鏡測微尺是一塊圓形玻片，在玻片的中央刻有一小尺，它是在5 毫米內(nèi)作50 等分刻制的，每一等份為0.1 毫米。另一規(guī)格是5 毫米作100 等分，每等分為0.05 毫米。鏡臺測微尺是刻在載玻片中央的小尺，它是在1 毫米內(nèi)作100 等分刻成的，每等分10 微米。

（2）目鏡測微尺校正的方法

將鏡臺測微尺上面的透鏡片取下，把目鏡測微尺放在光闌上，刻度朝下。把鏡臺 測微尺置于載物臺上，用低倍物鏡檢視，使測微尺位于視野中央。注意區(qū)分視野內(nèi)兩把尺哪個是目鏡測微尺，哪個是鏡臺測微尺。利用推進器或轉(zhuǎn)動目鏡使兩尺的第一條線（0 線）互相重合，然后找出另一條重合線。如重合線較多選取距0 線最遠的重合線。記下兩條重合線之間兩尺的刻度，依公式算出目鏡測微尺的校正值。目鏡測微尺校正值（每刻度微米數(shù)）= 兩重疊刻度間鏡臺測微尺格數(shù)×10 兩重疊刻度間目鏡測微尺格數(shù)

2．用美蘭水浸片法觀察釀酒酵母（saccharomyces cerevisiac）的形態(tài)，注意出芽繁殖

和死活酵母菌的染色形態(tài)，并測量大小。3．用血球板計算黑曲霉孢子的數(shù)量。（1）血球計數(shù)板

利用血球計數(shù)板在顯微鏡下直接計數(shù)是一種常見的微生物計總數(shù)的方法。因為計 數(shù)板載片和蓋片間的容積一定，所以可以根據(jù)顯微鏡下觀察到的微生物數(shù)目來計算單位體積內(nèi)微生物總數(shù)。血球計數(shù)板是一只特制載玻片。載片上有兩個方格網(wǎng)，每一方 格網(wǎng)共分九個大方格，其中間的一個大方格用來做微生物計數(shù)，所以又稱為計數(shù)室。計數(shù)室的刻度一般有兩種，一種是每個大方格分成16 個中方格，每中方格又分成25個小方格。另一種是一個大方格分25 個中方格，每個中方格又分成16 個小方格，不論哪一種，一個大方格，都等分成（25×16 或16×25）400 個小方格。因為每個大方格邊長為1 毫米，載片與蓋片間距離為0.1 毫米，所以每個計數(shù)室（1 個大方格）體積為0.1 立方毫米。測出每個中方格菌數(shù)，就可以算出一個大方格的菌數(shù)，由此推算出1 毫升菌液內(nèi)所含的菌數(shù)。一個大方格是16 個中方格時，應(yīng)當(dāng)數(shù)4 角4 個中方格（即100 個小方格）的菌數(shù)，一個大方格是25 個中方格時，除取4 角4 個中方格外，還要數(shù)中央一個中方格（即為80 個小方格）的菌數(shù)。計算公式如下： 16×25 計數(shù)板：

總菌數(shù)/ml= ×400×10000×稀釋倍數(shù)=每個小方格內(nèi)菌數(shù)×4×106×稀釋倍數(shù) 25×16 計數(shù)板：

總菌數(shù)/ml= ×400×10000×稀釋倍數(shù)=每小方格內(nèi)菌數(shù)×4×106×稀釋倍數(shù)（2）血球計數(shù)板計數(shù)方法

①視待測菌懸液濃度，加無菌水適當(dāng)稀釋，以每小格的菌數(shù)可數(shù)為度。②取潔凈的血球計數(shù)板一塊，在計數(shù)區(qū)上蓋上一塊蓋玻片。

③將黑曲霉孢子懸液搖勻，用滴管吸取少許，從計數(shù)板中間平臺兩側(cè)的溝槽內(nèi)沿蓋玻片的下邊緣摘入一小滴（不宜過多），讓菌懸液利用液體的表面張力充滿計數(shù)區(qū)，勿使氣泡產(chǎn)生，并用吸水紙吸去溝槽中流出的多余菌懸液。也可以將菌懸液直接滴加在計數(shù)區(qū)上，不要使計數(shù)區(qū)兩邊平臺沾上菌懸液，以免加蓋蓋玻片后，造成計數(shù)區(qū)深度的升高。然后加蓋蓋玻片（勿使產(chǎn)生氣泡）。

④靜置片刻，將血球計數(shù)板置載物臺上夾穩(wěn)，先在低倍鏡下找到計數(shù)區(qū)后，再轉(zhuǎn)換高倍鏡觀察并計數(shù)。由于生活細胞的折光率和水的折光率相近，觀察時應(yīng)減弱光照的強度。

⑤計數(shù)時若計數(shù)區(qū)是由16 個大方格組成，按對角線方位，數(shù)左上、左下、右上、右下的4 個大方格（即100 小格）的菌數(shù)。如果是25 個大方格組成的計數(shù)區(qū)，除數(shù)上述四個大方格外，還需數(shù)中央l 個大方格的菌數(shù)（即80 個小格）。如菌體位于大方格的雙線上，計數(shù)時則數(shù)上線不數(shù)下線，數(shù)左線不數(shù)右線，以減少誤差。

⑥測數(shù)完畢，取下蓋玻片，用水將血球計數(shù)板沖洗干凈，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免損壞網(wǎng)格刻度。洗凈后自行晾干或用吹風(fēng)機吹干，放入盒內(nèi)保存。

三、作業(yè)

1．測量酵母菌的大?。ǜ弑剁R）： 菌名 寬（目鏡格數(shù)）長（目鏡格數(shù)）平均

2．在不改變目鏡和目尺，而改變物鏡來測定同一酵母菌時，其結(jié)果是否相同，為什么？

3．根據(jù)你的操作，用血球計數(shù)板計數(shù)的誤差主要來自哪些方面？應(yīng)如何盡量減少誤差，力求準(zhǔn)確？

實驗五 培養(yǎng)基的制備與滅菌

一、實驗?zāi)康?/p>

1．學(xué)習(xí)掌握培養(yǎng)基的制備原理與方法。2．學(xué)習(xí)掌握玻璃器皿的包扎與滅菌方法。

3．學(xué)習(xí)掌握高壓蒸汽滅菌，干熱滅菌的原理與方法。

二、實驗內(nèi)容 1．玻璃器皿的包扎

（1）每4-5 人為一組包扎：直徑9 厘米培養(yǎng)皿3 包，每包6 皿，1ml 吸管2 支，5ml吸管2 支，玻璃刮鏟3 支。

（2）每一小組制備18×180mm 試管無菌水5 支，每支4.5ml 自來水，250ml 三角瓶帶玻璃珠無菌水1 瓶，裝自來水45ml，以上塞好棉塞包扎后待滅菌。2．培養(yǎng)基制備

（1）培養(yǎng)基是人工按一定比例配制的供微生物生長繁殖和合成代謝產(chǎn)物所需要的營養(yǎng)物質(zhì)的混合物。培養(yǎng)基的原材料可分為碳源、氮源、無機鹽、生長因素和水。根據(jù)微生物的種類和實驗?zāi)康牟煌?，培養(yǎng)基也有不同的種類和配制方法。（2）制備流程：稱量→溶解→蒸煮→調(diào)pH→分裝→包扎→滅菌（3）高氏一號培養(yǎng)基配方

可溶性淀粉 20g K2HPO4 0.5g KNO3 1g MgSO4.7H2O 0.5g NaCl 0.5g FeSO4 10mg 瓊脂 20g 蒸餾水 1000ml PH 值 7.2—7.4（4）每小組制備高氏培養(yǎng)基250ml，分裝15*150mm 試管8-10 支，余液分裝250ml 三角瓶2 瓶，塞棉塞包扎待滅菌。（5）關(guān)鍵步驟及注意事項 ①要嚴(yán)格按配方配制。②調(diào)pH 不要過頭。

③干熱滅菌要注意物品不要堆放過緊，注意溫度的時間控制，70oC 以下放物、取物。

④高壓滅菌要注意物品不要過多，加熱后排除冷空氣，到時降壓回零取物。3．消毒（disinfection）與滅菌（sterilization）消毒：用化學(xué)或物理的方法殺死微生物的營養(yǎng)體。滅菌：用物理或化學(xué)的方法殺滅物體上一切微生物。

（1）干熱滅菌法：把待滅菌的物品均勻地放入烘箱中，升溫至160oC，恒溫1 小時即可。此法適用于玻璃皿、金屬用具等的滅菌。

（2）高壓蒸汽滅菌法（一般121oC，30min，適用培養(yǎng)基）：把待滅菌的物品放在一個可密閉的加壓蒸汽滅菌鍋中進行的，以大量蒸汽使其中壓力升高。由于蒸汽壓的上升，水的沸點也隨之提高。在蒸汽壓達到1.055 公斤/厘米2 時，加壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)的溫度可達到121oC。在這種情況下，微生物（包括芽孢）在15-20 分鐘便會被殺死，而達到滅菌目的。如滅菌的對象是砂土、石蠟油等面積大、含菌多、傳熱差的物品，則應(yīng)適當(dāng)延長滅菌時間。

（3）間歇滅菌法：待滅菌的物品放在滅菌器或蒸籠里，每天蒸煮1 次，每次煮沸1h，連續(xù)3d 重復(fù)進行。在每兩次蒸煮之間，將物品（指培養(yǎng)基）放在37oC 恒溫條件下培養(yǎng)過夜，這樣可以使每次蒸煮后未殺死殘留的芽孢萌發(fā)成營養(yǎng)體，以便下次蒸煮時殺滅。

（4）巴氏滅菌法：有些食物會因高溫破壞營養(yǎng)成分或影響質(zhì)量，如牛奶、醬油、啤酒等，所以只能用較低的溫度來殺死其中的病原微生物，這樣既保持食物的營養(yǎng)和風(fēng)味，又進行了消毒，保證了食品衛(wèi)生。該法一般在62oC，30 分鐘既可達到消毒目的。此法為法國微生物學(xué)家巴斯德首創(chuàng)，故名為巴氏消毒法。4．棉塞的制作

三、作業(yè)

1．高氏一號培養(yǎng)基屬于何種性質(zhì)培養(yǎng)基？有沉淀嗎？為什么？

2．高壓蒸汽滅菌的過程中，應(yīng)注意哪些事項，最關(guān)鍵的因素是什么？為什么？

實驗六 環(huán)境微生物的分離與生理鑒定實驗

一、實驗?zāi)康?/p>

1．學(xué)習(xí)掌握平板稀釋法分離環(huán)境微生物的技術(shù)。2．學(xué)習(xí)掌握微生物生理生化鑒別的基本方法。3．學(xué)習(xí)掌握無菌操作技術(shù)。

二、實驗內(nèi)容 1．土壤微生物的分離

分離微生物是，一般是根據(jù)該微生物對營養(yǎng)、pH、氧氣等要求的不同，供給 它們適宜的生活條件，或加入某種抑制劑造成只利于該菌種生長，不利于其他菌 種生長的環(huán)境，從而淘汰不需要的菌種。分離方法用稀釋平板分離法，其最終目 的是要在培養(yǎng)基上出現(xiàn)欲分離微生物的單個菌落，同時還可以測定分離的微生物 的數(shù)量。

（1）方法：將土樣隨機稱取10g，加入至裝有90 ml 無菌水帶玻璃珠的三角 瓶中，旋轉(zhuǎn)震蕩30min，作逐級分離，逐級稀釋見下圖，用無菌吸管吸取不同稀 釋度菌懸液0.1ml 涂布平板。（2）稀釋度選擇：

①牛肉膏培養(yǎng)基：10 皿(稀釋度10﹣4,10﹣5,10﹣6,三個重復(fù),一個備用)； ②高氏一號培養(yǎng)基：10 皿(稀釋度10﹣3,10﹣4,10﹣5,三個重復(fù)，一個備用)； ③真菌培養(yǎng)基：10 皿(稀釋度10﹣3,10﹣4,10﹣5,三個重復(fù),一個備用)；

2．用大腸桿菌和枯草芽孢桿菌分別接種糖發(fā)酵培養(yǎng)基、石蕊牛乳培養(yǎng)基、蛋白 胨培養(yǎng)基和淀粉培養(yǎng)基作生理鑒別實驗。（1）糖發(fā)酵試驗

各種細菌由于具有不同的酶系統(tǒng)，致使它們能利用不同的底物，或雖然可 以利用相同的底物，卻產(chǎn)生不同的代謝產(chǎn)物，因此可以利用各種生理生化反應(yīng) 來鑒別細菌。糖發(fā)酵是最常用的生化反應(yīng)，存在于大多數(shù)細菌中。不同的細菌 在糖的分解能力上存在很大的差異。有些細菌能分解某種糖并產(chǎn)生酸性物質(zhì)(如 乳酸、丙酸、醋酸等)和氣體(如二氧化碳、氫、甲烷等)，而有些細菌只產(chǎn)生酸 不產(chǎn)生氣體。例如大腸桿菌分解乳糖和葡萄糖產(chǎn)酸并產(chǎn)氣，普通變形桿菌分解 葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，但不能分解乳糖。酸的產(chǎn)生可利用指示劑來判斷。在培養(yǎng)基 中加入溴甲酚紫(pH5．2 為黃色，pH6．8 為紫色)，當(dāng)發(fā)酵產(chǎn)酸時，使培養(yǎng)基由 紫色變?yōu)辄S色。氣體的產(chǎn)生可由發(fā)酵試管中倒置的德漢氏小管中有無氣泡的出 現(xiàn)來驗證。（2）石蕊牛乳試驗

牛乳中通常含有蔗糖、乳糖、蛋白質(zhì)、酪素等成分。微生物對牛乳的利用主 要是指乳糖及酪蛋白的分解利用。牛乳中常加入石蕊作酸堿指示劑和氧化還原指 示劑。微生物對牛乳的利用可分三種情況：①酸凝固作用：微生物發(fā)酵乳糖后產(chǎn) 生許多酸，使石蕊變紅，同時酸度很高時，可使牛乳凝固。②凝乳酶凝固作用： 某些微生物能分泌凝乳酶，使牛乳中的酪蛋白凝固，這種凝固作用在中性環(huán)境中 發(fā)生，通常這類微生物還具有水解蛋白質(zhì)的能力，從而會產(chǎn)生一些堿性物質(zhì)，是 石蕊變藍。③胨化作用：酪蛋白被水解變得清亮而透明，胨化作用可以在酸性或 堿性條件下進行，并且一般石蕊色素還原脫色。（3）產(chǎn)氨和產(chǎn)硫化氫試驗

某些微生物具有脫氨酶，能使氨基酸在各種作用下脫去氨基而生成氨，氨的 產(chǎn)生可用紅色石蕊試紙夾懸于培養(yǎng)試管的棉塞下檢驗，培養(yǎng)后試紙變藍，即判為 產(chǎn)氨。

某些微生物能分解培養(yǎng)基中的含硫氨基酸生成硫化氫?？捎么姿徙U試紙，接 種試驗菌于培養(yǎng)液中，立即將試紙懸夾于棉塞下，紙條下端與液面接近，但不可 接觸。如試紙變黑為正反應(yīng)即產(chǎn)硫化氫。（4）淀粉水解試驗

某些微生物具有淀粉酶，可以使淀粉水解為麥芽糖或葡萄糖，而另一些微生 物則沒有這種特性。將試驗菌在淀粉水解培養(yǎng)基的平板上劃“+”接種。培養(yǎng)后打開皿蓋，滴加碘液于培養(yǎng)基，輕輕旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿，使碘液鋪滿整個平板。因培養(yǎng)基內(nèi)含淀粉，遇碘立即變蘭，但如果供試菌能分解淀粉，則菌落周圍淀粉已被水解，此時遇碘不變色，因而菌落外圍出現(xiàn)無色透明圈。

三、培養(yǎng)基的配制 1．牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基 牛肉膏 3g 蛋白胨 5g NaCl 0.5g 瓊脂 20g 蒸餾水 1000ml PH 值 7.2—7.4 2．高氏一號培養(yǎng)基 可溶性淀粉 20g K2HPO4 0.5g KNO3 1g MgSO4.7H2O 0.5g NaCl 0.5g FeSO4 10mg 瓊脂 20g 蒸餾水 1000ml PH 值 7.2—7.4 使用時加1%重鉻酸鉀溶液0.5ml/250ml 培養(yǎng)基。3．馬丁培養(yǎng)基 葡萄糖 10g 蛋白胨 5g KH2PO4 1g 瓊脂 20g MgSO4.7H2O 0.5g 自然PH 值

蒸餾水 1000ml 煮溶后加1%孟加拉紅3.3ml,攪勻。（8 磅即112℃滅 菌30min）4．糖發(fā)酵培養(yǎng)基 牛肉膏 3g 蛋白胨 5g 葡萄糖 5 g 水 1000 ml PH 值 7.2-7.4 加溴甲酚紫1.6%的酒精溶液1ml（8 磅即112℃滅菌30min）

溴甲酚紫1.6%酒精溶液的配制：稱溴甲酚紫1.6g 溶于50ml 酒精（95%），再加 入蒸餾水50ml，用濾紙過濾后用三角瓶裝，放冰箱備用。5．石蕊牛乳培養(yǎng)基

牛奶（1000g）→煮沸→離心（4500 轉(zhuǎn)/分鐘，5 分鐘）→去脂→調(diào)PH 值 7.2→加入石蕊液使牛奶成蘭色→分裝15×150ml 試管→8 磅滅菌20 分鐘。石蕊液配制：稱2.5g 石蕊，加50ml 蒸餾水研磨，研磨石蕊時，先加少許蒸餾水 研磨，研磨過程中慢慢滴加蒸餾水，研磨到無顆粒為止，再進行抽濾。6.淀粉水解培養(yǎng)基 蛋白胨 10g NaCl 5g 牛肉膏 5 g 可溶性淀粉 5g 瓊脂 20g 蒸餾水 1000 ml PH 值 7.2 7．產(chǎn)硫化氫培養(yǎng)基 蛋白胨 20g NaCl 5g 牛肉膏 2.5 g 檸檬酸鐵銨 0.5g 硫代硫酸鈉 0.5g 蒸餾水 1000 ml

三、作業(yè)

1．平板稀釋分離環(huán)境微生物應(yīng)注意哪些事項？ 2．生理鑒別試驗的原理與反應(yīng)有哪些？

實驗七 環(huán)境微生物分離與生理鑒定結(jié)果檢查

一、實驗?zāi)康?/p>

1．學(xué)習(xí)掌握四大類微生物菌落形態(tài)的識別。

2．學(xué)習(xí)掌握環(huán)境微生物生理鑒定結(jié)果分析的原理與方法。3．學(xué)習(xí)掌握微生物純化培養(yǎng)接種的無菌操作技術(shù)。

二、實驗內(nèi)容

1．四大類微生物菌落形態(tài)識別

（1）細菌：菌落表面光滑或粗糙，邊緣整齊或不規(guī)則，奶油狀。

（2）放線菌：菌落表面呈絨狀，粉狀或絨毛狀，有些產(chǎn)色素，有同心環(huán)，不易 調(diào)起。

（3）酵母菌：菌落大而厚，濕潤粘稠，易調(diào)起，多數(shù)呈乳白色，少數(shù)紅色。（4）霉菌：菌落大而疏松，呈絨毛狀、絮狀或蜘網(wǎng)狀，有色素，比細菌大數(shù)倍 到幾十倍。

2．土壤中細菌、放線菌、霉菌分離的結(jié)果統(tǒng)計 3．生理生化鑒定結(jié)果檢查 項目 E.coli B.subtilis CK 備注 糖發(fā)酵 產(chǎn)酸 產(chǎn)氣 產(chǎn)酸 產(chǎn)氣 石蕊牛乳 凝固 液化 凝固 液化 蛋白胨 產(chǎn)NH3 產(chǎn)H2S 產(chǎn)NH3 產(chǎn)H2S 產(chǎn)淀粉酶

4．菌落純培養(yǎng)斜面接種

將分離到的放線菌單菌落，通過無菌操作技術(shù)移接到斜面培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)5-7 天。

實驗八 水中總大腸菌群的測定－多管發(fā)酵法

一、實驗?zāi)康?/p>

結(jié)合水凈化工程中的細菌檢驗，掌握水環(huán)境監(jiān)測中和給水水質(zhì)檢驗中大腸桿菌群 數(shù)的測定方法，同時通過大腸桿菌群的測定，了解大腸桿菌群的生化特性。

二、原理

總大腸菌群可用多管發(fā)酵法或濾膜法檢驗。多管發(fā)酵法的原理是根據(jù)大腸菌群細 菌能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣以及具備革蘭氏染色陰性，無芽孢，呈桿狀等有關(guān)特性，通過初發(fā)酵試驗、平板分離和復(fù)發(fā)酵試驗等三個步驟進行實驗求得水樣中的總大腸菌群數(shù)。試驗結(jié)果以最可能數(shù)（most probable number），簡稱MPN 表示。

三、儀器

高壓蒸氣滅菌器；恒溫培養(yǎng)箱；冰箱；生物顯微鏡；載玻片；酒精燈；鎳鉻絲接 種棒；培養(yǎng)皿（直徑100mm）；試管（18×180mm）；吸管（1、5、10mL）；燒杯；錐形瓶；采樣瓶等等。

四、培養(yǎng)基的制備：

1.乳糖蛋白胨培養(yǎng)液：將10g 蛋白胨、3g 牛肉膏、5g 乳糖和5g 氯化鈉加熱溶解于1000mL 蒸餾水中，調(diào)節(jié)溶液pH 為7.2—7.4，再加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1mL，充分混勻，分裝于試管中，于115℃高壓滅菌器中滅菌20min，貯存于冷暗處備用。

2.三倍濃縮乳糖蛋白陳培養(yǎng)液：按上述乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的制備方法配制。除蒸 餾水外，各組分用量增加至三倍。3.品紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基

（1）貯備培養(yǎng)基的制備：于2000mL 燒杯中，先將20—30g 瓊脂加到900mL 蒸 餾水中，加熱溶解，然后加入3.5g 磷酸氫二鉀及10g 蛋白胨，混勻，使其溶解，再用蒸餾水補充到1000mL，調(diào)節(jié)溶液pH 至7.2—7.4。趁熱用脫脂棉或絨布過濾，再加10g 乳糖，混勻，定量分裝于250 或500mL 錐形瓶內(nèi)，置于高壓滅菌器中，在115℃滅菌20min，貯存于冷暗處備用。

（2）平皿培養(yǎng)基的制備：將上法制備的貯備培養(yǎng)基加熱融化。根據(jù)錐形瓶內(nèi)培 養(yǎng)基的容量，用滅菌吸管按比例吸取一定量的5%堿性品紅乙醇溶液（1000mL 培養(yǎng)基約加20mL5%堿性品紅乙醇溶液），置于滅菌試管中；再按比例稱取無水亞硫酸鈉（1000mL 培養(yǎng)基約加5g 無水亞硫酸鈉），置于另一滅菌空試管內(nèi)，加滅菌水少許使其溶解，再置于沸水浴中煮沸10min（滅菌）。用滅菌吸管吸取已滅菌的亞硫酸鈉溶液，滴加于堿性品紅乙醇溶液內(nèi)至深紅色再退至淡紅色為止（不宜加多）。將此混合液全部加入已融化的貯備培養(yǎng)基內(nèi)，并充分混勻（防止產(chǎn)生氣泡）。立即將此培養(yǎng)基適量（約15mL）傾入已滅菌的平皿內(nèi)，待冷卻凝固后，置于冰箱內(nèi)備用，但保存時間不宜超過兩周。如培養(yǎng)基已由淡紅色變成深紅色，則不能再用。

五、測定水源水總大腸菌群實驗步驟

1、初發(fā)酵試驗

于各裝有5mL 三倍濃縮乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的5 個試管中（內(nèi)有倒管），分別加入 10mL 水樣；于各裝有10mL 乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的5 個試管中（內(nèi)有倒管），分別加入1mL 水樣；再于各裝有10mL 乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的5 個試管中（內(nèi)有倒管），分別加入1mL1： 10 稀釋的水樣。共計15 管，三個稀釋度。將各管充分混勻，置于37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h。（2）平板分離：上述各發(fā)酵管經(jīng)培養(yǎng)24h 后，將產(chǎn)酸、產(chǎn)氣及只產(chǎn)酸的發(fā)酵管分別接種于品紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基上，置于37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h，挑選符合下列特征的菌落。

2、平板分離

品紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基上：紫紅色，具有金屬光澤的菌落；深紅色，不帶或略帶金 屬光澤的菌落；淡紅色，中心色較深的菌落。取有上述特征的群落進行革蘭氏染色：

①用已培養(yǎng)18—24h 的培養(yǎng)物涂片，涂層要薄。②將涂片在火焰上加溫固定，待冷卻后滴加結(jié)晶紫溶液，1min 后用水洗去。③滴加助染劑，1min 后用水洗去。④滴加脫色劑，搖動玻片，直至無紫色脫落為止（約20—30s），用水洗去。⑤滴加復(fù)染劑，1min 后用水洗去，晾干、鏡檢，呈紫色者為革蘭氏陽性菌，呈紅色者為陰性菌。

3、復(fù)發(fā)酵試驗

上述涂片鏡檢的菌落如為革蘭氏陰性無芽孢的桿菌，則挑選該菌落的另一部分接 種于裝有普通濃度乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的試管中（內(nèi)有倒管），每管可接種分離自同一初發(fā)酵管（瓶）的最典型菌落1—3 個，然后置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)24h，有產(chǎn)酸、產(chǎn)氣者（不論倒管內(nèi)氣體多少皆作為產(chǎn)氣論），即證實有大腸菌群存在。根據(jù)證實總大腸菌群存在的陽性管數(shù)，查后附表1“最可能數(shù)（MPN）表”，即求得每100mL 水樣中存在的總大腸菌群數(shù)。我國目前系以1L 為報告單位，故MPN 值再乘以10，即為1L 水樣中的總大腸菌群數(shù)。

例如，某水樣接種10mL 的5 管均為陽性；接種1mL 的5 管中有2 管為陽性； 接種1：10 的水樣1mL 的5 管均為陰性。從最可能數(shù)（MPN）表中查檢驗結(jié)果5-2-0，得知100mL 水樣中的總大腸菌群數(shù)為49 個，故1L 水樣中的總大腸菌群數(shù)為 49×10=490 個。對污染嚴(yán)重的地表水和廢水，初發(fā)酵試驗的接種水樣應(yīng)作1：

10、1：100、1：1000 或更高倍數(shù)的稀釋，檢驗步驟同“水源水”檢驗方法。如果接種的水樣量不是10mL、1mL 和0.1mL，而是較低或較高的三個濃度的水 樣量，也可查表求得MPN 指數(shù)，再經(jīng)下面公式換算成每100mL 的MPN 值。

六、思考題

1、你認(rèn)為要得到正確的革蘭氏染色結(jié)果必須注意哪些操作?關(guān)鍵在哪一步?為什么?

2、大腸菌群測定利用了它的哪些生化特性？

表1 最可能數(shù)(MPN)表

（接種5 份10mL 水樣、5 份1mL 水樣、5 份0.1mL 水樣時，不同陽性及陰 性情況下100mL 水樣中細菌數(shù)的最可能數(shù)和95%可信限值）

實驗九

空氣微生物檢測（平皿落菌法）

實驗?zāi)康暮驮恚河脿I養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)細菌；用查氏瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)霉菌；用高氏淀粉瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)放線菌。通過實驗了解空氣中微生物的分布，學(xué)習(xí)習(xí)近平皿落菌法檢測空氣微生物。

實驗器材：高壓蒸汽消毒鍋，恒溫培養(yǎng)箱，超凈工作臺，玻璃皿，營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，查氏瓊脂培養(yǎng)基，高氏淀粉瓊脂培養(yǎng)基。方法與步驟： 一．培養(yǎng)基制備

1．營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：牛肉膏1.5g，蛋白胨5g，NaCl 2.5g，瓊脂10g，加水至500ml，加熱、攪拌至瓊脂溶解，調(diào)pH7.2~7.4，121℃蒸汽滅菌20分鐘。

2．查氏瓊脂培養(yǎng)基：NaNO3 1g，KCl 0.25g，K2HPO4 0.5g，MgSO4 0.25g，F(xiàn)eSO4 0.005g，瓊脂10g，蔗糖15g，加水500ml，加熱、攪拌至瓊脂溶解，115℃蒸汽滅菌20分鐘。

3.高氏淀粉瓊脂培養(yǎng)基：可溶性淀粉10g先用少量冷水調(diào)成糊狀，在火上加熱，然后加水及KNO30.5g，K2HPO4 0.25g NaCl 0.25g，MgSO4 0.25g，F(xiàn)eSO4 0.25g，瓊脂10g，加熱溶化，調(diào)pH7.0~ 7.2，補足水至500ml，121℃滅菌20分鐘。二.每組15個平皿滅菌將營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、查氏瓊脂培養(yǎng)基、高氏淀粉瓊脂培養(yǎng)基，三種培養(yǎng)基各倒5個平板，冷凝。

2.在一定面積房間或室外，按4角和中央5點，每種培養(yǎng)基每點放一個平板，打開蓋，室內(nèi)放置10分鐘，室外放置3分鐘后蓋蓋，營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基在37℃培養(yǎng)24h，查氏和高氏培養(yǎng)基在28℃培養(yǎng)48h。

3.培養(yǎng)結(jié)束，觀察各種微生物的菌落形態(tài)，將微生物種類、菌落數(shù)和計算結(jié)果記錄于下表：

三．計算：空氣微生物數(shù)(個/m3)=5個皿平均菌落數(shù)×50000÷平皿底面積（cm2）÷暴露時間（min）

四．衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)：我國還無統(tǒng)一的空氣衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)，室內(nèi)一般以500～1000/m3作為參考指標(biāo)。

地點

采樣時間

細菌菌落

霉菌菌落

放線菌菌落

計算結(jié)果（個/m3）

細菌數(shù)量

霉菌數(shù)量

放線菌數(shù)量

實驗九 菌種保藏

一、實驗?zāi)康?/p>

1.學(xué)習(xí)并掌握菌種保藏的基本原理。2.掌握常用的幾種不同的菌種保藏方法。

二、實驗原理

微生物個體微小、代謝旺盛、生長繁殖快，如果保存不妥容易發(fā)生變異和雜菌污染，甚至導(dǎo)致細胞死亡等現(xiàn)象。因此，保存好菌種是非常必要和重要的。常用的菌種保藏方法包括傳代培養(yǎng)法、載體法、懸液法、冷凍法和真空干燥法

三、試劑與器材

1.材料大腸桿菌、青霉菌、放線菌

2.試劑液體石蠟、甘油、五氧化二磷、95％乙醇、10％鹽酸、無水氯化鈣、食鹽、干冰

3.器材無菌吸管、無菌滴管、無菌培養(yǎng)皿；安額管、凍干管、40目與100目篩子、油紙、濾紙條(0.5X1.2cm)、干燥器、真泵器、真空泵、真空壓力表、噴燈、L形五通管、冰箱、低溫冰箱(—30℃)、超低溫冰箱和液氮罐等。

四、實驗內(nèi)容

1.斜面保藏法 2.液體石蠟法 3.穿刺保藏法 4.砂土管保藏法

5.冷凍真空干燥保存法

五、關(guān)鍵步驟及注意事項

1.清楚各種保藏方法的優(yōu)缺點，針對不同要求選擇適宜的保藏方法。2.熔封安瓶時防止封閉不嚴(yán)。3.液氮凍存操作應(yīng)防止凍傷。

六、思考題

根據(jù)你自己的實驗。談?wù)?--2種菌種保藏方法的利弊?

第三篇：微生物,真菌實驗（范文模版）

青 島 農(nóng) 業(yè) 大 學(xué)

獸醫(yī)微生物學(xué)課程論文

題 目：姓 名：學(xué) 院：專 業(yè)：班 級：學(xué) 號：指導(dǎo)教師：

病原真菌的分離鑒定

動物科技學(xué)院 動物醫(yī)學(xué)

2014年月 13 日

病原真菌的分離鑒定

動醫(yī)1205

李春成20121450 摘要：制作固體培養(yǎng)基，將A、B、D三種真菌接種到培養(yǎng)基和蓋玻片上進行3-5d的培養(yǎng)（溫度為28℃，觀察真菌在固體培養(yǎng)基上的生長表現(xiàn)，在顯微鏡下觀察小培養(yǎng)中的真菌形態(tài)，用美藍染色液染酵母菌，進一步觀察其形態(tài)。關(guān)鍵詞：真菌；分離；形態(tài)；接種 引言：

真菌在自然界分布廣、數(shù)量大、種類多。有些真菌可引起人和畜禽疾病，有些霉菌還產(chǎn)生毒素，直接或間接的危害人類和動物健康。了解真菌的培養(yǎng)方法，認(rèn)識其形態(tài)十分重要。

真菌中的酵母菌是單細胞微生物，細胞核和細胞質(zhì)有明顯的分化，個體直徑比真菌大10倍左右，多為圓形或卵圓形。酵母菌無性繁殖主要是出芽生殖，在特殊的情況下能形成假菌絲，有性繁殖是通過結(jié)合產(chǎn)生子囊孢子。用美藍染色液制成水浸片，不僅可以觀察其外形，還可以區(qū)分死活細胞。

霉菌的營養(yǎng)體是分支的絲狀體，分為基內(nèi)菌絲和氣生菌絲，氣生菌絲又分化出繁殖菌絲，不同霉菌的繁殖菌絲可以形成不同的孢子。

霉菌的菌絲較大，細胞易收縮變形，且孢子容易飛散，所以指標(biāo)本是常用乳酸石炭酸棉藍染色液。此染色液制成霉菌標(biāo)本片的特點是：細胞不變形，具有殺菌防腐作用，且不易干燥，能保持較長的時間，溶液本身呈藍色，有一定的染色效果。

利用培養(yǎng)在玻璃紙上的霉菌作為觀察材料，可以得到清晰、完整、保持自然狀態(tài)的霉菌形態(tài)。

制作霉菌封閉標(biāo)本，一般用石炭酸棉染色液封片，其中含有甘油，不易干燥，石炭酸有防腐作用，棉藍有一定的染色作用，便于觀察。1材料和方法 1.1材料

待鑒定的三種真菌A、B、D

1.1.1培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基 1.1.2儀器

懸液、載玻片、蓋玻片、無菌培養(yǎng)皿、濕盒，1mL無菌注射器、生理鹽水、酒精燈等 1.2方法

1.2.1劃線分離：將接種環(huán)經(jīng)火焰滅菌冷卻后，取待測的真菌，按照細菌的平板劃線分離法進行平板劃線，即用接種環(huán)從待測培養(yǎng)基上蘸取菌種在平板上劃1/5-1/4，劃畢灼燒滅菌接種環(huán)，待冷卻后，于第二段處再做劃線，且從第一段處引線，劃畢，灼燒滅菌接種環(huán)。冷卻后，于第三段再做劃線，且從第二段處引線，劃畢，灼燒滅菌接種環(huán)。冷卻后，于第四段再做劃線，且從第三段處引線，劃畢，灼燒滅菌接種環(huán)。

1.2.2小培養(yǎng)：用注射器吸取液體培養(yǎng)基于載玻片上，將接種環(huán)在火焰下滅菌，挑取待檢菌放于液體培養(yǎng)基上，待液體培養(yǎng)基將要凝固，但仍有部分呈液體狀時，蓋上蓋玻片，標(biāo)記好菌種。

1.2.3酵母菌水浸片的制備：先取干凈的載玻片滴上生理鹽水1-2滴，將接種環(huán)在火焰下滅菌，挑取酵母菌少許，均勻涂在液滴中，再將美藍染色液滴于載玻片上，染色2-3min后加蓋玻片。（注意切勿產(chǎn)生氣泡）然后低倍鏡和高倍鏡觀察其細胞形態(tài)、芽殖方式。2.結(jié)果與分析 2.1觀察三個培養(yǎng)基：A菌在固體培養(yǎng)基上菌落呈油脂狀，表面光滑、濕潤、粘稠，顏色呈黃色。B菌在固體培養(yǎng)基上菌落為氈狀，顏色是綠色，具有典型的放射狀皺紋。D菌在固體培養(yǎng)基上菌落密集，最初呈白色，孢子呈黑色。

2.2實驗現(xiàn)象

2.2.1小培養(yǎng)形態(tài)鑒定現(xiàn)象

前三圖均在40X下觀察）

A菌體呈圓形、卵形或橢圓形，內(nèi)有細胞核、液泡和顆粒體物質(zhì)。光鏡下可見細胞質(zhì)所在范圍及細胞壁的影子，高倍鏡中可現(xiàn)細胞核。B菌菌絲呈無色，有分隔，其分生孢子梗經(jīng)過多次分支，產(chǎn)生幾輪對稱或不對稱的小梗，形如掃帚，稱為掃帚體。D菌菌絲無隔，有匍匐菌絲和假根，假根著生處有直立向上孢子囊梗，其頂端彭大成孢子囊，孢子囊底部有半球形囊軸。

2.2.2美蘭染色現(xiàn)象

顯微鏡下看到的是單細胞, 不形成菌落的真菌，無色細胞為活酵母菌細胞，藍色細胞為已死的酵母菌細胞。

3.討論

本次試驗做的還可以，試驗結(jié)果都能看到，現(xiàn)象比較明顯，不過，顯微鏡聚焦不是很好，看的不是很清楚，現(xiàn)象也不太明顯，在做小培養(yǎng)時充分發(fā)揮了團隊合作精神，使得試驗做的很快（因為做小培養(yǎng)時，液體培養(yǎng)基溫度不那么高了，凝固時間很快），做美蘭染色時，也很注意沒有弄進氣泡，不影響觀察。4.結(jié)果

經(jīng)以上試驗可得出，A為酵母菌；B為青霉菌；D為根霉菌。

4.參考文獻

獸醫(yī)微生物實驗教程

胡貴學(xué)

2006

第四篇：微生物實驗教案

《微生物學(xué)》實驗教學(xué)教案[實驗項目] 實驗一 微生物學(xué)試驗常用玻璃儀器洗滌及干熱滅菌 [教學(xué)時數(shù)]

3學(xué)時 [實驗?zāi)康呐c要求]

1．認(rèn)識微生物實驗所需要的各種器皿，了解常用工具和儀器的名稱、用途。2．掌握對玻璃器皿的清洗、包扎方法與干熱滅菌的操作過程。[實驗原理]

微生物學(xué)實驗要求較高的無菌狀態(tài)，因此，實驗所用的器皿，大多數(shù)要進行消毒、滅菌從而用以培養(yǎng)微生物，所以對其質(zhì)量、規(guī)格、洗滌和包扎方法均有一定要求。

清潔的玻璃器皿是實驗得到正確結(jié)果的先決條件，包扎方法要能保證防止污染雜菌。

干熱滅菌的原理，空的玻璃器皿一般用干熱滅菌。干熱滅菌是利用高溫使微生物細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)凝固變性而達到滅菌的目的。細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)凝固性與其本身的含水量有關(guān)，在菌體受熱時，當(dāng)環(huán)境和細胞內(nèi)含水量越大，則蛋白質(zhì)凝固就越快，反之含水量越少，凝固緩慢。與濕熱滅菌相比，干熱滅菌所需溫度要高（160～170℃），時間要長（1～2h），但干熱滅菌溫度不能超過180℃，否則，包器皿的紙或棉塞就會燒焦，甚至引起燃燒。[實驗材料與設(shè)備]

1．培養(yǎng)皿、大試管、三角瓶6只、燒杯（500ml）2只、燒杯（1000ml）1只、小試管6只、吸管（0.2ml 2支，0.5ml 2支，1ml 2支，5ml 2支）共8支。2．去污粉、肥皂、清洗劑、毛刷。3．棉花、扎繩、包扎紙。[實驗步驟]

（一）學(xué)習(xí)下列常用儀器的種類、規(guī)格和應(yīng)用范圍 1.培養(yǎng)皿

由一底一蓋組成一套，常用的培養(yǎng)皿皿底直徑90 mm，高15mm,皿底皿蓋均為玻璃制成。制成平板，可用于分離、純化、鑒定菌種、活菌計數(shù)以及測定抗生素、噬菌體的效價等。2.試管

(1)大試管(約18mm×180mm): 可裝倒平板用的培養(yǎng)基，可作制備斜面用（需要大量菌體時用），裝液體培養(yǎng)基用于微生物的振蕩培養(yǎng)。

(2)中試管[(13～15)mm×(100～150)mm]: 裝液體培養(yǎng)基培養(yǎng)細菌或做斜面用，用于細菌、霉菌、病毒等的稀釋和血清學(xué)試驗。

(3)小試管[(10～12)mm×100mm]:一般用于糖發(fā)酵或血清學(xué)試驗，和其它需要節(jié)省材料的試驗。3.三角瓶 規(guī)格有100mL、250mL、500mL和1000 mL用來裝無菌水、培養(yǎng)基和振蕩培養(yǎng)微生物等。4.燒杯

規(guī)格有50mL、100mL、250mL、500mL和1000mL 用來配制培養(yǎng)基與各種溶液等。5.吸管 規(guī)格有0.1mL、1mL、2mL、5mL、10mL用來量取轉(zhuǎn)移各種溶液等。6.量筒 規(guī)格有50mL、100mL、250mL、500mL。

（二）學(xué)習(xí)玻璃器皿的洗滌方法 1.新玻璃器皿的洗滌

在2%的鹽酸溶液中浸泡數(shù)小時，用自來水沖洗干凈。2.舊玻璃器皿的洗滌

（1）試管、培養(yǎng)皿、三角瓶：洗衣粉和去污粉洗刷，自來水沖洗 A 裝有固體培養(yǎng)基：刮掉，洗滌

B 帶菌的器皿：2%來蘇爾或0.25%新潔爾滅消毒液中浸泡24小時或煮沸0.5小時，然后洗滌 C 帶病原菌培養(yǎng)物的器皿：先高壓蒸汽滅菌，倒去培養(yǎng)物（2）玻璃吸管：吸管尖端與裝在水龍頭上的橡皮管連接，反復(fù)沖洗

A 吸過血液、血清、糖溶液或染料溶液等的玻璃吸管：立即投入盛有自來水的容器中浸泡，實驗后集中沖洗。B 塞有棉花的吸管：用水將棉花沖出，然后沖洗

C 吸過含有微生物培養(yǎng)物的吸管：2%來蘇爾或0.25%新潔爾滅消毒液中浸泡24小時然后洗 D 吸管內(nèi)壁有油垢：洗滌液中浸泡數(shù)小時，再沖洗

(三)學(xué)習(xí)各種器皿的包扎

1.培養(yǎng)皿的包扎：牛皮紙或舊報紙包緊，一般以5～8套培養(yǎng)皿包成1包 2.吸管的包扎：

在上端約0.5cm處，塞入一小段1.5 cm長的棉花（勿用脫脂棉），目的是避免將外界或嘴中雜菌吹入管內(nèi)，或不慎將菌液吸出管外。用4～5 cm寬的長紙條卷起來3.試管和三角瓶等的包扎：用橡皮塞和牛皮紙。(四)干熱滅菌 1．裝入待滅菌物品

將包好的待滅菌物品（培養(yǎng)皿、吸管等）放入電烘箱內(nèi)，關(guān)好箱門。物品不要擺太擠，以免妨礙空氣流通；不要接觸電烘箱內(nèi)壁的鐵板，以防包裝紙烤焦起火。

2．升溫 接通電源，撥動開關(guān)，打開電烘箱排氣孔，讓溫度逐漸上升。當(dāng)溫度升至100℃時，關(guān)閉排氣孔。3．恒溫 當(dāng)溫度升達到160～170℃時，恒溫調(diào)節(jié)器會自動控制調(diào)節(jié)溫度，保持此溫度2h。干熱火菌過程。嚴(yán)防恒溫調(diào)節(jié)的自動控制失靈而造成安全事故。

4．降溫 切斷電源、自然降溫。

5．開箱取物 待電烘箱內(nèi)溫度降到70℃以下后，打開箱門，取出滅菌物品。[指導(dǎo)與訓(xùn)練方案]

1.通過本次實驗?zāi)阏J(rèn)識了微生物學(xué)實驗常用的哪些器皿？ 2.簡述玻璃器皿洗滌的基本要求。3.簡述干熱滅菌的操作步驟。[實驗項目]

實驗二 培養(yǎng)基的制備與滅菌 [教學(xué)時數(shù)]

4學(xué)時[實驗?zāi)康呐c要求]1．了解培養(yǎng)基的配制原理；掌握配制培養(yǎng)基的一般方法和步驟。2．了解常見滅菌、清毒基本原理及方法；掌握干熱天菌、高壓蒸汽滅菌及過濾除菌的操作方法。[實驗原理]

培養(yǎng)基是人工按一定比例配制的供微生物生長繁殖和合成代謝產(chǎn)物所需要的營養(yǎng)物質(zhì)的混合物。培養(yǎng)基的原材料可分為碳源、氮源、無機鹽、生長因素和水。根據(jù)微生物的種類和實驗?zāi)康牟煌?，培養(yǎng)基也有不同的種類和配制 方法。

從培養(yǎng)基的組成成分可分為: 1.合成培養(yǎng)基：由各種純化學(xué)物質(zhì)按一定比例配制而成。

2.半合成培養(yǎng)基：一部分純化學(xué)物質(zhì)和一部分天然物質(zhì)配制而成。3.天然培養(yǎng)基：利用天然來源的有機物配制而成。

從培養(yǎng)基的物理狀態(tài)可分為: 1.液體培養(yǎng)基：不加凝固劑的液體狀態(tài)培養(yǎng)基。2.固體培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基中加入2%左右的凝固劑的固體狀

態(tài)的培養(yǎng)基或農(nóng)副產(chǎn)品培養(yǎng)基。3.半固體培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基中加入0.2—0.5%凝固劑而成的半固體狀培養(yǎng)基。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基是一種應(yīng)用最廣泛和最普通的細菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基。察氏一號培養(yǎng)基是一種應(yīng)用最廣泛和最普通的霉菌培養(yǎng)基。

高壓蒸汽滅菌方法主要是通過升溫使蛋白質(zhì)變性從而達到殺死微生物的效果。當(dāng)蒸汽壓達到1.055kg/cm2時，鍋內(nèi)溫度可達到121℃，一般維持20min,即可殺死一切微生物的營養(yǎng)體或芽孢，而達到滅菌目的。[實驗材料與設(shè)備]

1.器材 試管、三角瓶、燒杯、量筒、玻璃棒、培養(yǎng)基、分裝器、天平、牛角匙、高壓蒸汽滅菌鍋、pH度紙、棉花、牛皮紙、記號筆、麻繩、紗布、吸管、培養(yǎng)皿、電烘箱、注射器、微孔濾膜過濾器、鑷子等。2.試劑 牛肉膏、蛋白胨、NaCl、瓊脂 [實驗步驟] 1.稱量→溶化→調(diào)pH→過濾→分裝→加塞→包扎→滅菌→無菌檢查 2.干熱滅菌：裝入待滅菌物品→升溫→恒溫→降溫→開箱取物

3.高壓蒸汽滅菌：加水→裝物品→加蓋→加熱→排冷空氣→加壓→恒壓→降壓回零→排汽→取物→無菌檢查 4.過濾除菌：組裝滅菌→連接→壓濾→無菌檢查→清洗滅菌 關(guān)鍵步驟及注意事項1.要嚴(yán)格按配方配制。2.調(diào)pH不要過頭。

3.干熱滅菌要注意物品不要堆放過緊，注意溫度的時間控制，70oC以下放物、取物。4.高壓滅菌要注意物品不要過多，加熱后排除冷空氣，到時降壓回零取物。

5.過濾除菌要注意各部件滅菌，壓濾時，壓力要適當(dāng)，不可太猛太快，濾膜要注意清洗保存。[指導(dǎo)與訓(xùn)練方案]

1.培養(yǎng)基配好后，為什么必須立即滅菌?如何檢查滅菌后的培養(yǎng)基是無菌的? 2.在配制培養(yǎng)基的操作過程中應(yīng)注意些什么問題?為什么? 3.培養(yǎng)微生物的培養(yǎng)基應(yīng)具備哪些條件?為什么? 4.培養(yǎng)基的配制原則是什么? [實驗項目]

實驗三 環(huán)境和人體微生物的檢測及無菌操作技術(shù)[教學(xué)時數(shù)]3學(xué)時 [實驗?zāi)康呐c要求]

1.通過檢測環(huán)境和人體中微生物的存在，體會微生物分布的廣泛性。

2.學(xué)習(xí)無菌操作的技術(shù)，掌握利用稀釋涂布平板法從土壤中分離微生物的方法。[實驗原理] 自然環(huán)境中和人及動物的體表、體內(nèi)都存在大量的微生物，它們一遇到適合的條件就會大量繁殖。當(dāng)把取自不同來源的含菌樣品接種于含有生長發(fā)育需要的各種營養(yǎng)成分的固體培養(yǎng)基時，就會形成肉眼可見的微生物集體群落-菌落。每種微生物菌落都有其獨有的特點，如大小、顏色、表面干燥或濕潤、隆起或扁平、粗糙或光滑、邊緣整齊或不整齊等。因此，可以通過平板培養(yǎng)來檢測不同環(huán)境下微生物的數(shù)量、種類和特點。[實驗材料與設(shè)備] 1.恒溫培養(yǎng)箱、磁力攪拌器、移液槍

2.培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、察氏一號培養(yǎng)基；地面以下5-10cm的土壤； 3.酒精燈、無菌棉棒、無菌生理鹽水、涂布棒、記號筆、培養(yǎng)皿、吸管、試管、三角瓶 [實驗步驟] 1.無菌操作技術(shù) 在酒精燈火焰旁操作，將融化并冷卻至不燙手的滅菌固體培養(yǎng)基倒入無菌的培養(yǎng)皿，倒量為容積的1/3~1/2或者覆蓋皿底5毫米左右，然后平放到桌面待其凝固即為無菌平板。

2.土樣的稀釋分離

制備土樣懸濁液：稱取土樣1g，迅速倒入盛有99ml無菌水和玻璃球的三角瓶中，置入磁力棒，攪拌10-15min，使土樣充分打散，即成10-2的土壤懸濁液。稀釋：用無菌移液管吸10-2的土壤懸液0.5mL，放入4.5mL無菌水中即為10-3稀釋液，如此重復(fù)，可依次制成10-3～10-6的稀釋液。(注意：操作時每一個稀釋度換用一支移液管，每次吸入土液后，要將移液管插入液面，吹吸3次，每次吸上的液面要高于前一次，以減少稀釋中的誤差。)3.環(huán)境及人體各部位取菌樣 4.標(biāo)記、培養(yǎng)

標(biāo)記： A-Ⅰ-1-10-5姓名

按培養(yǎng)基類別：細菌培養(yǎng)基--A，霉菌培養(yǎng)基--B 按3個大組：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、按4個中組：1-4 按樣品類別：10-

5、10-

6、口腔--a、鼻腔--b、頭發(fā)--c、空氣--d按個人標(biāo)記：姓名

培養(yǎng)：將接種的平板分別放入細菌和霉菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。霉菌保持25-27℃，3-5天；細菌35-37℃，1-2天。

[指導(dǎo)與訓(xùn)練方案]

1、無菌倒平板時注意的事項有哪些？

2、平板接種后為什么要倒置培養(yǎng)？

3、通過本次試驗?zāi)銓W(xué)到了什么？有什么體會？ [實驗項目]

實驗六 細菌的單染色與革蘭氏染色 [教學(xué)時數(shù)] 3學(xué)時

[實驗?zāi)康呐c要求]

1.學(xué)習(xí)對細菌的涂片、染色和無菌操作技術(shù)。

2.了解染色原理、學(xué)習(xí)并掌握單染色和革蘭氏染色技術(shù)。[實驗原理] 細菌的細胞小而透明，在普通的光學(xué)顯微鏡下不易識別，染色后，菌體與背景形成明顯的色差，從而能更清楚地觀察到其形態(tài)和結(jié)構(gòu)。

微生物學(xué)中常用的是單染色法和革蘭氏染色法。染色部位分芽孢、鞭毛、莢膜染色

其機理主要是由于兩類細菌的細胞壁成分和結(jié)構(gòu)不同。G+菌，肽聚糖多，脂質(zhì)少，酒精不易進入； G-菌，肽聚糖少，脂質(zhì)多，酒精易進入 [實驗材料與設(shè)備] 1.菌種：E.coli（大腸桿菌）、B.subtilis（枯草芽孢桿菌）、玉米細菌等

2.試劑：石炭酸復(fù)紅染色液、革蘭氏染色液(草酸銨結(jié)晶紫、碘液、95%乙醇、沙黃染色液）3.其他：顯微鏡、載玻片、生理鹽水、酒精燈、接種環(huán)、吸水紙、擦鏡紙等 [實驗步驟]

一、單染色法： 滴無菌水→ 涂片→自然干燥→ 固定→染色→水洗→干燥→鏡檢（高倍鏡、油鏡）

二、革蘭氏（Gram）染色法

1.涂片

2.初染：在做好的涂面上滴加草酸銨結(jié)晶紫染液，染1-1.5分鐘，傾去染液，流水沖洗至無紫色。3.媒染：先用新配的路哥氏碘液沖去殘水，而后用其覆蓋涂面14.脫色：除去殘水后，滴加

95%酒精進行脫色約

分鐘，后水洗。

秒，后立即用流水沖洗。

5.復(fù)染：滴加番紅染色液，染1-1.5分鐘，水洗后用吸水紙吸干。6.鏡檢：觀察染色結(jié)果并繪圖。[指導(dǎo)與訓(xùn)練方案]

1.革蘭氏染色過程中大腸桿菌、枯草桿菌、玉米細菌、金黃葡萄球菌等分別被染成什么色，分別為革蘭氏反應(yīng)的什么菌 ？

2.涂片用的玻璃片為什么不得有油污？為什么涂片要求菌膜要均勻、??？ 3.革蘭氏染色的原理 4.染色注意事項有哪些？ [實驗項目]

實驗七 微生物的顯微鏡計數(shù)、大小測量和酵母菌的死活鑒別 [教學(xué)時數(shù)] 5學(xué)時

[實驗?zāi)康呐c要求]

1.學(xué)習(xí)并掌握利用顯微鏡直接計數(shù)的基本方法。2.了解并掌握酵母菌的死活鑒別染色的原理和技術(shù) [實驗原理] 1.兩種常用計數(shù)方法，即直接計數(shù)法（血球計數(shù)板計數(shù)法）和間接計數(shù)法（平板菌落計數(shù)法）。本實驗是利用血球計數(shù)板進行直接計數(shù)。

2.利用血球計數(shù)板，在顯微鏡下進行計數(shù)，由于計數(shù)室的容積是一定的，所以可以根據(jù)在顯微鏡下觀察到的微生物數(shù)目來換算成單位體積內(nèi)的微生物總數(shù)目。由于此法計得的是活菌體和死菌體的總和，故又稱為總菌計數(shù)法。3.美蘭（氧化型呈藍色，還原型呈無色），活的酵母菌具有將氧化型美蘭還原成還原型的能力，故染色后是透明的，而死的酵母菌則被染成了藍色。

計數(shù)方法：計數(shù)時，通常數(shù)五個（或四個）中方格的總菌數(shù)，然后求得每個中方格的平均值，再乘上25或16，就得出一個大方格中的總菌數(shù)，然后再換算成lml菌液中的總菌數(shù)。設(shè)被選作計數(shù)的中方格中的總菌數(shù)為A，菌液稀釋倍數(shù)為B，如果是25個中方格的計數(shù)板，則1mL菌液中的總菌數(shù)=A/5×25×104×B=50000A·B（個）如果是16個中方格的計數(shù)板，則1mL菌液中的總菌數(shù)=A/4×16×104×B=40000A·B（個）[實驗材料與設(shè)備] 酵母菌懸液（市售的干酵母粉）血球計數(shù)板、蓋玻片、吸水紙顯微鏡、接種環(huán)、分類計數(shù)器 0.1%的美藍染色液 [實驗步驟] 1 制備菌懸液、染色 用吸管吸取菌懸液（1滴）加入試管，用生理鹽水（8滴）進行稀釋，滴加（1滴）美蘭染色液。加菌懸液樣品 將清潔干燥的血球計數(shù)板蓋上蓋玻片，再用毛細滴管將搖勻的菌懸液由蓋玻片邊緣滴一小滴，讓菌液沿縫隙靠毛細滲透作用自動進入計數(shù)室，用吸水紙吸去多余水液（注意一定不要有溢出和產(chǎn)生氣泡）。3 顯微鏡計數(shù) 加樣后靜止1 min，先用低倍鏡然后換成高倍鏡，計數(shù)時，對位于線上酵母菌，一般只數(shù)上方和左邊線上的，當(dāng)酵母菌芽體達到母細胞大小的二分之一時，可記作兩個細胞。計數(shù)一個樣品要從兩個計數(shù)室中計得的值來計算樣品的含菌量。清洗血球計數(shù)板 計數(shù)完畢，將計數(shù)板在水龍頭下沖洗干凈，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用電吹風(fēng)吹干。5.計算 ：利用相應(yīng)公式進行計算（見前面公式或者課本公式），并將實驗結(jié)果填入作業(yè)中的表格內(nèi)。實驗注意事項

1.要正確使用顯微鏡，光線亮度要調(diào)的合適。

2.菌液制備要精準(zhǔn)，稀釋倍數(shù)要合適。如果濃度過大就再稀釋，如果過小再重做。3.計上不計下，計左不計右。出芽計一半

4.濃度稀釋標(biāo)準(zhǔn)：以每小方格內(nèi)含有5-10個酵母細胞為宜，一般稀釋10倍即可。5.計數(shù)室內(nèi)一定不要有溢出和產(chǎn)生氣泡。

6.其他微生物孢子技術(shù)與酵母菌類似，基本操作一樣。7.確保血球計數(shù)板清洗干凈。[指導(dǎo)與訓(xùn)練方案] 1.使用血球計數(shù)板計數(shù)時，應(yīng)注意什么？ 2.將計數(shù)結(jié)果填入表格中。

3.簡單說明酵母菌死活染色的原理。[實驗項目]

實驗八 微生物細胞大小的測定 [教學(xué)時數(shù)] 3學(xué)時

[實驗?zāi)康呐c要求]

1.了解測微尺的構(gòu)造和使用，學(xué)習(xí)并掌握測定微生物細胞大小的方法。[實驗原理] 微生物細胞的大小的測量是在顯微鏡下用目鏡測微尺來進行的，但由于測量的是放大后的圖像，故目鏡測微尺在不同放大倍率下每格實際代表的長度也隨之變化，因此，需用物鏡測微尺來校正在不同放大倍率下目鏡測微尺每格所代表的實際長度。

物鏡測微尺是中央刻有精確刻度的載玻片，一般是將1 mm等分為100格，每格長0．01mm，即10 um，它不直接用于測量細胞大小，而是用于校正目鏡測微尺的每格的相對長度。

[實驗材料與設(shè)備] 酵母菌懸液（市售的干酵母粉）或者制作的霉菌裝片

目鏡測微尺，物鏡測微尺、顯微鏡、載玻片、蓋玻片、吸水紙、0.1%的美藍染色液 [實驗步驟]（—）裝目鏡測微尺

（二）校正目鏡測微尺

1.將物鏡測微尺刻度面朝上放在顯微鏡載物臺上

2.先用低倍鏡觀察，將目鏡測微尺刻度與物鏡測微尺的刻度平行。使兩尺的第一條刻度線相重合，再尋找兩尺的另 10 一條重合的刻度線，分別記錄兩重合線之間物鏡測微尺和目鏡測微尺所占的格數(shù)，由公式計算出目鏡測微尺每格所代表的長度。

3.用同樣的方法換成高倍鏡進行校正，記錄并計算在每種倍率下目鏡測微尺每一格所代表的長度。

（三）酵母細胞大小的測定

制備菌懸液、染色： 用吸管吸取菌懸液（1滴）加入試管，用生理鹽水（8滴）進行稀釋，滴加（1滴）美蘭染色液。

制片： 用吸管吸取1滴上述菌懸液滴加到干凈的載玻片上，蓋上蓋玻片（注意一定不要有溢出和產(chǎn)生氣泡），將多余菌液用吸水紙吸干。

顯微鏡下觀察、測量：在不同倍率下測量菌體的長度和寬度，記錄測定值，并計算出酵母的長、寬值。[指導(dǎo)與訓(xùn)練方案] 1.為什么更換不同放大倍數(shù)的目鏡或物鏡時，必須用鏡臺測微尺重新對目鏡測微尺進行校正? 2.如何校正目鏡測微尺？ ３．如何測定細菌的大??？

[實驗項目1]實驗1 常用玻璃儀器包扎及干熱滅菌；培養(yǎng)基的制備（口述）與高壓蒸汽滅菌（操作-必做）1.1 培養(yǎng)皿、試管、吸管的洗滌包扎及干熱滅菌（操作-必做）1.2 培養(yǎng)基分裝到三角瓶和試管與高壓蒸汽滅菌（操作）[實驗項目2 實驗2 無菌操作技術(shù)，倒平板和接種（操作-必做）1.倒平板，以清水代替；試管接試管；試管接培養(yǎng)皿 [實驗項目3] 實驗3 細菌的革蘭氏染色（操作-必做）1.枯草桿菌 [實驗項目4] 實驗4 微生物的顯微鏡計數(shù)（操作-必做）

酵母菌[實驗項目5]實驗5 微生物細胞大小的測定（操作）會校正和測量酵母菌或真菌菌絲

第五篇：微生物實驗總結(jié)

微生物實驗總結(jié)

姓名:趙葉鋒班級：食品科學(xué)113學(xué)號：2011013522

大三的第二學(xué)期塊結(jié)束了，這個學(xué)期操作了四個微生物實驗，以及一個自主設(shè)計性實驗。通過前階段對四個實驗的操作和認(rèn)知的基礎(chǔ)上，展開第五個實驗的自主設(shè)計。實驗分別是菌落總數(shù)測定，霉菌和酵母的檢查和計數(shù)，乳酸菌的檢驗，微生物藥敏試驗以及探討環(huán)境因素對微生物生長的影響。

這學(xué)期的微生物實驗是在上學(xué)期微生物實驗的基礎(chǔ)上的累積和擴展延伸：以培養(yǎng)基的制備與滅菌，玻璃器皿的洗滌、包扎和滅菌，微生物接種技術(shù)和細菌的革蘭氏染色為技術(shù)基礎(chǔ)進行的，以加強學(xué)生基礎(chǔ)理論知識和基本技能的培養(yǎng)為目的。

下面我來談?wù)勎以趯嶒炛械男牡皿w會。

第一個實驗是菌落總數(shù)測定。讓我重新認(rèn)識了一下這個名詞：菌落形成單位，我現(xiàn)在的理解就是：1ml或者1g待測樣品中菌落的個數(shù)，一定要注意的是單位是CFU/ml或CFU/g。還有就是要掌握好對高壓蒸汽滅菌鍋的操作。實驗之前要充分做好預(yù)習(xí)工作，以便實驗的進行。由于是測定微生物實驗，就要尤其小心其他雜菌的混入影響實驗結(jié)果。因此要做好實驗儀器和各種試劑的滅菌，有培養(yǎng)皿，試管，移液槍頭（裝在盒子中），按要求配置好的瓊脂培養(yǎng)基和生理鹽水，按各自要求用紗布和報紙包扎好，送入高壓蒸汽滅菌鍋進行滅菌。玻璃儀器在包扎前要進行清洗，并烘干，以免水分沾濕報紙。滅完菌后取出物品進入超凈工作臺，超近工作臺的紫外燈在進入20分鐘前開啟，并在進入時關(guān)閉，以免影響人體。要對臺面進行消毒處理，用酒精擦拭?？梢栽诘却傊囵B(yǎng)基冷卻到50攝氏度左右前對待測樣品進行10倍系列稀釋至需要的濃度。要注意的是一定要標(biāo)記好濃度或者按順序排列在試管架上以免弄混，同一個試管里吸取樣品才能用同一個槍頭進行移液。再進行平板接種。待瓊脂培養(yǎng)基冷卻好后，用右手打開紗布并將錐形瓶拿住，將瓶口靠近酒精燈再進行滅菌，左手拿培養(yǎng)皿用大拇指和食指稍微打開培養(yǎng)皿蓋，將瓊脂培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中心內(nèi)，不用倒很多，使瓊脂培養(yǎng)基沒過培養(yǎng)皿表面即可。培養(yǎng)皿一定是平拿在手上的，倒好后輕輕蓋上培養(yǎng)皿蓋，緩慢地平方在超凈工作臺臺面邊緣處，再推至中間。再用移液槍取1ml樣品快速打入培養(yǎng)皿中央，蓋上培養(yǎng)皿蓋，然后用手輕輕搖晃，千外不要太大力。然后貼上標(biāo)簽記號，靜置。如此依次操作下去。靜置一段時間待培養(yǎng)基凝固后倒置放入恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)一段時間再取出進行觀察計數(shù)。

我們組的實驗結(jié)果不甚理想，培養(yǎng)皿中的微生物都是連成一片的，或者是培養(yǎng)皿壁上也都長著，主要是由于待測樣品打入培養(yǎng)皿后，搖晃不均勻或者太大力了，以至于菌液沒分散開來或是跑到培養(yǎng)皿壁上去了。

第五個實驗是自主設(shè)計實驗環(huán)境因素對微生物生長的影響。選取3個環(huán)境因素物理、化學(xué)和生物因素均可進行設(shè)計。根據(jù)前四個實驗的基礎(chǔ)，通過小組探討和交流設(shè)計出實驗方案。并加以驗證。通過自主設(shè)計實驗可以結(jié)合小組的智慧，加強團隊協(xié)作精神和創(chuàng)新思維，通過實驗可以驗證理論，增加感性認(rèn)識，培養(yǎng)獨立工作能力和思考能力，并使具有過硬的專業(yè)技術(shù)水平。

通過這次的實驗，我明白了任何事情丟不是一蹴而就的，而是一個慢慢積累的過程。雖然實驗結(jié)果不是很理想，但是我參與了過程，通過小組討論我們也分析了失敗的原因，找到了解決的方法，避免了下一次失誤。并且從中理解了團隊討論和合作的重要性。以上即是我的全部感想。