第一篇：微生物菌種純度檢測(cè)技術(shù)規(guī)程

微生物菌種純度檢測(cè)技術(shù)規(guī)程范圍

本規(guī)程規(guī)定了古菌、細(xì)菌、真菌、病毒（種）純度檢測(cè)的程序和方法。

本規(guī)程適用于從事微生物菌種資源保藏及研究的機(jī)構(gòu)、大學(xué)、企業(yè)、個(gè)人等。術(shù)語、定義

下列術(shù)語和定義適用于本規(guī)程

2.1

純度檢測(cè) purity check

指通過適當(dāng)?shù)姆椒z測(cè)菌種是否為純培養(yǎng)物。

2.2

純培養(yǎng)pure culture

由單個(gè)細(xì)胞的后代組成的培養(yǎng)物，即單細(xì)胞培養(yǎng)物或無性繁殖系。通常是由挑取單個(gè)菌落或利用單胞分離技術(shù)，移種繁殖獲得。菌種的純度檢測(cè)

3.1 古菌和細(xì)菌的純度檢測(cè)

3.1.1 菌落形態(tài)

在特定的培養(yǎng)基上，將待檢測(cè)培養(yǎng)物稀釋涂布或平板劃線，適宜培養(yǎng)后，同一平板上的單菌落的大小、形狀、顏色、質(zhì)地、光澤等是否相似；對(duì)于兩種或以上形態(tài)的出發(fā)菌株，應(yīng)再分別挑取單菌落劃線或稀釋涂布培養(yǎng)，檢測(cè)是否重復(fù)出現(xiàn)相同特征。

3.1.2 細(xì)胞形態(tài)

對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的培養(yǎng)物革蘭氏染色反應(yīng)應(yīng)呈現(xiàn)一致性；細(xì)胞形狀、大小、莢膜等特征應(yīng)相似

3.1.3 芽孢大小、位置、形狀

宜檢測(cè)樣品是否形成芽孢，對(duì)形成芽孢的菌種，其芽孢大小、位置、形狀應(yīng)相似。

3.2 放線菌菌種純度檢測(cè)

3.2.1 菌落形態(tài)

在特定的培養(yǎng)基上，將待檢測(cè)培養(yǎng)物稀釋涂布或平板劃線,挑取單菌落，適宜培養(yǎng)后，在同一平板上單菌落形狀、大小、表面狀況、質(zhì)地、光澤、顏色等應(yīng)相似。如懷疑為細(xì)菌污染，則30℃液體培養(yǎng)24小時(shí)，培養(yǎng)液不應(yīng)渾濁，如渾濁則視為細(xì)菌污染。

3.2.2 培養(yǎng)特征

分別接種三種以上培養(yǎng)基，在三種以上培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征應(yīng)想同，包括氣生菌絲、基內(nèi)菌絲、可溶性色素的顏色等。

3.2.3 孢子絲及孢囊

在特定的培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度及培養(yǎng)時(shí)間等條件下，孢子著生方式、孢子絲形態(tài)及其顏色或孢囊著生位置（氣絲或基絲）、孢囊的形狀，大小應(yīng)呈現(xiàn)出一致性。

3.3 酵母菌種純度檢測(cè)

3.3.1 菌落形態(tài)

應(yīng)對(duì)菌落形態(tài)相似性進(jìn)行檢測(cè)。在特定的培養(yǎng)基上，通過對(duì)待檢測(cè)菌株進(jìn)行稀釋或劃線涂布平板獲取單菌落，一定的培養(yǎng)條件下，比較同一平板內(nèi)，菌落的大小、形狀、顏色、隆起、表面狀況、質(zhì)地、光澤等應(yīng)一致。

3.3.2 個(gè)體形態(tài)

應(yīng)對(duì)檢測(cè)樣品的個(gè)體形態(tài)進(jìn)行檢測(cè)。在指定的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件下，細(xì)胞形狀、大小及細(xì)胞的增殖方式應(yīng)一致。

3.3.3 繁殖方式

酵母繁殖的方式應(yīng)一致，如是芽殖，出芽的方位、數(shù)量應(yīng)一致。

3.4 絲狀真菌菌種純度檢測(cè)

3.4.1 菌落特征

菌落的形態(tài)等表觀特征應(yīng)一致。

3.4.2 菌絲特征

在特定的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下，菌絲分隔、菌絲形態(tài)等應(yīng)一致。

3.4.3 其他主要顯微特征應(yīng)一致

3.4.4 檢測(cè)是否有細(xì)菌污染

3.4.5 對(duì)于外觀上不能確定菌種純度的，利用單胞分離技術(shù)獲得純培養(yǎng)物進(jìn)行對(duì)比，其菌絲、孢子等特征應(yīng)與原始菌株的描述一致。

3.5 病毒的純度檢測(cè)

3.5.1 純粹檢查

應(yīng)將待檢病毒液直接接種含硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基（T.G）、酪蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基（G.A）、葡萄糖蛋白胨湯。通過一定溫度時(shí)間培養(yǎng)后，檢查結(jié)果應(yīng)無細(xì)菌生長(zhǎng)為純粹。

3.5.2 支原體檢查

檢測(cè)由禽胚組織或其細(xì)胞所培養(yǎng)的病毒應(yīng)用改良Frey氏培養(yǎng)基。檢測(cè)其它培養(yǎng)方法所得病毒應(yīng)用支原體培養(yǎng)基。任何一次瓊脂平板上出現(xiàn)支原體菌落，判為陽性。陽性對(duì)照中至少有一個(gè)平板長(zhǎng)菌落，而陰性對(duì)照中無菌落生長(zhǎng)，則檢驗(yàn)有效。

3.5.3 外源病毒檢查

病毒類制品在毒種選育和生產(chǎn)過程中，經(jīng)常使用動(dòng)物或細(xì)胞基質(zhì)培養(yǎng)，因此，有可能造成外源因子（特別是外源病毒因子）的污染。為了保證制品質(zhì)量，需要對(duì)毒種和細(xì)胞進(jìn)行外源因子檢測(cè)。

3.5.3.1 病毒種子批外源因子檢查

對(duì)病毒主種子批或工作種子批，應(yīng)抽取足夠檢測(cè)試驗(yàn)需要量的供試品進(jìn)行病毒外源因子檢測(cè)。在試驗(yàn)前應(yīng)用特異性抗體（血清）中和本病毒（或單克隆抗體），所用的抗體免疫源應(yīng)采用與生產(chǎn)疫苗（或制品）不同種而且無外源因子污染的細(xì)胞（或動(dòng)物）制品。如果病毒曾在禽類組織或細(xì)胞中繁殖過，則抗體不能用禽類來制備。若用雞胚，應(yīng)來自SPF雞群。以下方法可以選擇一種或多種進(jìn)行。

3.5.3.1.1 動(dòng)物試驗(yàn)法

3.5.3.1.1.1 小鼠試驗(yàn)法

取15－20g小鼠至少10只，用經(jīng)抗血清中和后的病毒懸液，每只腦內(nèi)接種0.03ml，同時(shí)腹腔接種0.5ml。至少觀察21天。在觀察期內(nèi)至少有80％最初接種的小鼠存活，試驗(yàn)才有效。如果沒有小鼠出現(xiàn)病毒感染，為符合要求。解剖所用在試驗(yàn)24小時(shí)后死亡或有患病體征的小鼠，直接觀察期病理改變，并將有病變的相應(yīng)的組織懸液通過腦內(nèi)和顱腔接種另外至少5只15－20g小鼠，并觀察21天，如果沒有小鼠出現(xiàn)病毒感染，則符合要求。

3.5.3.1.1.2 乳鼠試驗(yàn)法

取出生后24小時(shí)內(nèi)的乳鼠至少10只，用經(jīng)抗血清中和后的病毒懸液，腦內(nèi)接種0.01ml，同時(shí)腹腔接種至少0.1ml。每天觀察，至少14天。在觀察內(nèi)至少有80％最初接種的乳鼠存活，試驗(yàn)才有效。如果沒有小鼠出現(xiàn)病毒感染，為符合要求。解剖所有在試驗(yàn)24小時(shí)后死亡或有患病體征的乳鼠，直接肉眼觀察其病理改變，并取有病變的相應(yīng)的組織和腦、脾制備成懸液通過腦內(nèi)和腹腔接種另外至少5只出生后24小時(shí)內(nèi)乳鼠，并每天觀察至接種第14天，如果沒有小鼠出現(xiàn)病毒感染，則符合要求。

3.5.3.1.2 細(xì)胞培養(yǎng)法

3.5.3.1.2.1 非血吸附檢查

用經(jīng)抗血清中和后的病毒懸液，接種于生產(chǎn)用的同種的細(xì)胞。細(xì)胞至少接種6瓶，每瓶病毒懸液接種量不少于培養(yǎng)液總量的25％。于36±1℃培養(yǎng)，觀察14天，必要時(shí)可更換細(xì)胞培養(yǎng)液，未見細(xì)胞病變（CPE）為陰性，符合要求。

3.5.3.1.2.2 血吸附病毒檢查

上述接種病毒的各個(gè)細(xì)胞于第6－8天后和第14天，取出2瓶進(jìn)行血吸附病毒檢查。用0.2％－0.5%雞和豚鼠紅細(xì)胞混合菌懸液覆蓋于細(xì)胞表面，分別置于2－8℃，20－25℃，30分鐘后顯微鏡下觀察，未見血球吸附現(xiàn)象為陰性，符合要求。

3.5.3.1.3 雞胚檢查法

在禽類組織或細(xì)胞中繁殖過的病毒種子需用雞胚檢查禽類病毒的污染。選用9－11日和5－7日齡兩組SPF雞胚，每組至少5只，分別于尿囊腔和卵黃囊接種經(jīng)抗體血清中和后的病毒懸液，每胚0.5ml。孵育7日后，取尿囊液用豚鼠和雞血細(xì)胞混合懸液做血球凝集試驗(yàn)應(yīng)為陰性。被接種的雞胚至少80％存活7天，試驗(yàn)有效。

3.5.3.2 生產(chǎn)用細(xì)胞外源因子檢查

3.5.3.2.1 細(xì)胞直接觀察

每批生產(chǎn)用細(xì)胞應(yīng)留取5％（或不少于500ml）,細(xì)胞懸液不接種病毒，作為對(duì)照細(xì)胞加入與疫苗生產(chǎn)相同的細(xì)胞維持液，置于與疫苗生產(chǎn)相同的條件下培養(yǎng)，觀察14天，在顯微鏡下觀察是否有細(xì)胞病變（CPE）出現(xiàn)，無細(xì)胞病變（CPE）出現(xiàn)者為陰性，符合要求。在觀察期末至少有80％的對(duì)照細(xì)胞培養(yǎng)物存活，試驗(yàn)有效。

3.5.3.2.2 血清吸附病毒檢查

對(duì)生產(chǎn)用細(xì)胞外源因子檢查的（1）項(xiàng)細(xì)胞培養(yǎng)物在觀察期末取至少25％的細(xì)胞培養(yǎng)瓶進(jìn)行血吸附病毒檢查。（方法同病毒種子批外源因子檢查的血吸附病毒檢查）

參考文獻(xiàn)

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第二篇：氫氧化鈉檢測(cè) 氫氧化鈉純度檢測(cè)

氫氧化鈉檢測(cè) 氫氧化鈉純度檢測(cè)

一：氫氧化鈉檢測(cè)概述（003）

科標(biāo)無機(jī)檢測(cè)中心提供氫氧化鈉檢測(cè)、氫氧化鈉純度檢測(cè)、氫氧化鈉成分檢測(cè)、氫氧化鈉含量檢測(cè)等相關(guān)分析、檢測(cè)服務(wù)。氫氧化鈉，俗稱燒堿、火堿、片堿、苛性鈉（香港亦稱“哥士的”），為一種具有高腐蝕性的強(qiáng)堿，一般為片狀或顆粒形態(tài)，易溶于水并形成堿性溶液，另有潮解性，易吸取空氣中的水蒸氣。用途很廣，如制造肥皂、紙漿、人造絲，整理棉織品，精煉石油，提煉煤焦油產(chǎn)物等。制法有電解法和化學(xué)法兩種。

二：氫氧化鈉的主要用途

氫氧化鈉用途極廣。用于制祁雖溶液、造紙漿、肥皂、染料、人造絲、制鋁、石油精制、棉織品整理、煤焦油產(chǎn)物的提純，以及食品加工、木材加工及機(jī)械工業(yè)等方面。

使用氫氧化鈉最多的部門是化學(xué)藥品的制造，其次是造紙、煉鋁、煉鎢、人造絲、人造棉和肥皂制造業(yè)。另外，在生產(chǎn)染料、塑料、藥劑及有機(jī)中間體，舊橡膠的再生，制金屬鈉、水的電解以及無機(jī)鹽生產(chǎn)中，制取硼砂、鉻鹽、錳酸鹽、磷酸鹽等，也要使用大量的燒堿。三：主要檢測(cè)產(chǎn)品

碳酸鈣、無水高氯酸鋰、工業(yè)過硫酸鹽產(chǎn)品、工業(yè)氯化鈣、工業(yè)用高純氫氧化鈉、化纖用氫氧化鈉、工業(yè)硼化物、工業(yè)硼酸、工業(yè)用氫氧化鈉、工業(yè)碳酸鈉、工業(yè)用合成鹽酸、工業(yè)硝酸 濃硝酸、工業(yè)硫酸、工業(yè)氫氧化鎂、工業(yè)氫氧化鈣、副產(chǎn)鹽酸、工業(yè)碳酸氫鈉、工業(yè)高錳酸鉀、工業(yè)氯化鈣等。碳酸鈣、無水高氯酸鋰、工業(yè)過硫酸鹽產(chǎn)品、工業(yè)氯化鈣、工業(yè)用高純氫氧化鈉、化纖用氫氧化鈉、工業(yè)硼化物、工業(yè)硼酸、工業(yè)用氫氧化鈉、工業(yè)碳酸鈉、工業(yè)用合成鹽酸、工業(yè)硝酸 濃硝酸、工業(yè)硫酸、工業(yè)氫氧化鎂、工業(yè)氫氧化鈣、副產(chǎn)鹽酸、工業(yè)碳酸氫鈉、工業(yè)高錳酸鉀、工業(yè)氯化鈣等。

四：主要檢測(cè)項(xiàng)目

化合物含量、單質(zhì)含量、水分、氯化物、重金屬含量、灼燒殘?jiān)?、PH值、不溶物含量、水溶物含量、密度、白度、吸油量、活化度測(cè)定、酸堿度、篩余物含量、粒度、堆積密度、松散度、105℃揮發(fā)物等。

第三篇：NY_T 528-2002_食用菌菌種生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程

NY/T 528-2002 食用菌菌種生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程

基本信息

【英文名稱】Technical inspection of pure culture making of edible fungi 【標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)】被代替 【全文語種】中文簡(jiǎn)體 【發(fā)布日期】2002/8/27 【實(shí)施日期】2002/12/1 【修訂日期】2002/8/27 【中國標(biāo)準(zhǔn)分類號(hào)】暫無 【國際標(biāo)準(zhǔn)分類號(hào)】暫無

關(guān)聯(lián)標(biāo)準(zhǔn)

【代替標(biāo)準(zhǔn)】暫無 【被代替標(biāo)準(zhǔn)】暫無

【引用標(biāo)準(zhǔn)】GB 4789.28-1994,GB 9687-1988,GB 9688-1988

適用范圍&文摘

暫無

第四篇：微生物實(shí)驗(yàn)菌種保藏方案

一、石蠟油低溫保藏法

本方法的原理是在長(zhǎng)好的斜面菌上覆蓋滅菌的液體石蠟，達(dá)到菌體與空氣隔絕，使菌處于生長(zhǎng)和代謝停止?fàn)顟B(tài)，同時(shí)石蠟油還防止水分蒸發(fā)，在低溫下達(dá)到較長(zhǎng)期的保藏菌種的目的。保藏溫度要求在-4～4℃下。液體石蠟法適用于不產(chǎn)孢子的菌種。具體操作是：菌種為斜面培養(yǎng)菌種，斜面不宜過長(zhǎng)；選擇純凈優(yōu)質(zhì)石蠟油，置三角燒瓶中經(jīng)過121℃高壓蒸汽滅菌1～2h，將其放烘箱中(160℃左右)干熱處理，去除滅菌時(shí)滲入的水分，待石蠟油變得清澈透明后冷卻即可加入斜面，斜面上不能出現(xiàn)氣泡，液蠟添加量以高出斜面頂部約1cm為宜。

二、甘油管冷凍保藏法

1．試驗(yàn)方法介紹本法也是利用微生物在甘油中生長(zhǎng)和代謝受到抑制的原理達(dá)到保藏目的。其方法是，將80%的甘油高壓蒸汽滅菌待用。將培養(yǎng)好的斜面菌種用無菌水制成高濃度的菌懸液(108～1010/ml)。取1ml滅菌甘油放入與甘油充分混勻，使甘油濃度約為10%-30%，于-70℃下凍存。-20℃保存時(shí)間較短?；虿捎皿w積比為8：2的甘油－生理鹽水，加入新鮮培養(yǎng)的菌體肉湯，混合均勻后至-20℃冰箱保存。

2．效果該法適用于一般細(xì)菌的保存，同時(shí)也適用于鏈球菌、弧菌、真菌等需特殊方法保存的菌種，適用范圍廣，操作簡(jiǎn)便，效果好，無變異現(xiàn)象發(fā)生。甘油－生理鹽水保存液保存菌種優(yōu)于甘油原液，其原因可能是加入生理鹽水適當(dāng)降低了甘油的高滲作用，且有肉湯培養(yǎng)物適量增加保存液的營(yíng)養(yǎng)成分，從而更好地保護(hù)了待保存的菌株。

三、真空冷凍干燥法

1．試驗(yàn)原理

真空冷凍干燥保藏法是兼具低溫、干燥、除氧三方面菌種保藏的主要因素，除不宜于絲狀真菌的菌絲體外，對(duì)病毒、細(xì)菌、放線菌、酵母及絲狀菌孢子等各類微生物都適用，不宜用凍干法保存的微生物不到2%。冷凍干燥法是在低溫下快速將細(xì)胞凍結(jié)，然后在真空條件下干燥，使微生物的生長(zhǎng)和酶活動(dòng)停止。為了防止在冷凍和水分升華過程中對(duì)細(xì)胞的損害，要采用保護(hù)劑來制備細(xì)胞懸液，使菌在凍結(jié)和脫水過程中起到保護(hù)作用的溶質(zhì)，通過氫鍵和離子鍵對(duì)水和細(xì)胞所產(chǎn)生的親和力來穩(wěn)定細(xì)胞成分的構(gòu)型。即是使樣品中的水分在冰凍狀態(tài)下，抽真空減壓，使凍結(jié)的冰直接升華為水蒸氣，使樣品達(dá)到干燥。干燥后的微生物在真空下封裝，與空氣隔絕，達(dá)到長(zhǎng)期保藏的目的。

2．試驗(yàn)步驟

1）安瓿管準(zhǔn)備選取規(guī)格約直徑為8mm，高100mm的中性玻璃安瓿管，先用2%鹽酸浸泡8～10h，再經(jīng)自來水沖洗多次，用蒸餾水涮洗2～3次，烘干；在每管內(nèi)放入打好菌號(hào)及日期的標(biāo)簽，字面朝向管壁，管口塞好棉塞，滅菌備用。

2）保護(hù)劑的選擇及制備冷凍干燥保藏法使用的保護(hù)劑種類很多，效果不盡相同，通常采用高分子化合物與低分子化合物混合使用效果更好。在配制時(shí)注意比例、濃度、pH和滅菌方法。一些對(duì)熱敏感的保護(hù)劑如血清等用過濾除菌，牛奶、葡萄糖及乳糖等要控制滅菌溫度。一般情況下，多數(shù)菌種可以用脫脂乳糖等要控制滅菌溫度。一般情況下，多數(shù)菌種可以用脫乳為保護(hù)劑。

3）菌種準(zhǔn)備及分裝菌種要求為生長(zhǎng)良好的純種，菌齡以處于穩(wěn)定期為好，孢子是新鮮的。每支長(zhǎng)好的斜面加2～3ml保護(hù)劑，用接種環(huán)將菌苔輕輕刮起(注意勿刮起培養(yǎng)基)，制成菌懸液。如用液體培養(yǎng)的菌種，則需經(jīng)離心收集和用滅菌生理鹽水洗滌細(xì)胞，收集的菌體用保護(hù)劑懸浮制成菌懸液。懸液中菌數(shù)要求達(dá)到108～1010cfu/ml為宜。懸液制備完成盡快分裝和凍結(jié)。分裝安瓿時(shí)可用滅菌的長(zhǎng)滴入安瓿管底部，裝量可依據(jù)冷凍干燥機(jī)效能而定。

4）預(yù)凍分裝好的安瓿管需要進(jìn)行預(yù)凍，即放在-30～-40℃下凍結(jié)20～60min，也可以用干冰和無水乙醇凍5～10min。

5）冷凍干燥經(jīng)預(yù)凍的安瓿放入干燥箱中開始抽真空干燥。此時(shí)干燥箱溫度控制在-30℃以下，并盡快使真度達(dá)到66Pa以下。此后可還漸升溫以加速水分升華，但升溫不宜過快，以

免引起樣品融化。干燥時(shí)間視凍干機(jī)效率、樣品裝量及性質(zhì)等而定，以樣品最終水分含量達(dá)到1%～3%為準(zhǔn)。具體操作時(shí)是根據(jù)凍干樣品呈酥塊工松散片狀；真空度接近空載時(shí)最高真空；樣品溫度與管外溫度接近。

干燥完畢將安瓿管在真空下用火焰燒熔密封，并用高頻真空檢測(cè)真空度。

6）保藏及凍干管的啟用密封好的凍干管在4℃或-18℃下保藏。當(dāng)需用凍干菌種時(shí)，取出安瓿管用酒精表面消毒，用小砂輪在無菌條件下打開，或?qū)碴稠敳吭诰凭珶艋鹧嫔献茻?，迅速滴上冷的無菌水，使管破裂，然后用鑷子等輕輕敲碎管口，加入0.3～0.5ml液體培養(yǎng)基溶解凍干菌塊成為懸液，用無菌滴管或接種環(huán)移至斜面或液體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

7）影響菌株生長(zhǎng)因素

①菌的質(zhì)量：保藏的菌種應(yīng)培養(yǎng)在營(yíng)養(yǎng)豐富的最適條件下，使之進(jìn)入穩(wěn)定期，稍老一些的菌體對(duì)環(huán)境抵抗力強(qiáng)。另處，作為冷凍干燥的菌懸液細(xì)胞濃度要高不同的菌對(duì)冷凍干燥的耐受程度不同，如果保存的菌液細(xì)胞濃度不高，就會(huì)使以后傳種造成困難，保存期也會(huì)受到影響。

②保護(hù)劑：不同種類的保護(hù)劑對(duì)不同微生物的作用是不同的，如個(gè)別菌種在脫脂乳作保護(hù)劑的情況下死亡率高達(dá)99.99%，而采用葡聚糖等混和保護(hù)劑時(shí)死亡率大大減少。一般情況下，那些容易保存的菌種對(duì)保護(hù)劑的要求不很嚴(yán)格，而不易保存的菌種對(duì)保護(hù)劑的要求卻很苛刻。因此，選擇好的保護(hù)劑是冷凍干燥保存菌種的關(guān)鍵因素。

③干燥速度：實(shí)驗(yàn)表明，慢速干燥比快速干燥存活率高，如青霉菌6h干燥存活率為67.3%，而3h為59%。

④空氣的影響：冷凍干燥后空氣對(duì)細(xì)菌細(xì)胞影響較大，可導(dǎo)致細(xì)胞損傷進(jìn)而死亡，故在凍干后應(yīng)立即在真空下融封，才有利于長(zhǎng)期保存。

⑤溫度的影響在干燥和真空狀況下溫度的影響遠(yuǎn)沒有上述幾項(xiàng)因素重要，因此可以在室溫下保存，但許多微生物在4℃保存的存活率要比在室溫下高1倍。⑥含水量的影響：水分含量過高對(duì)菌存活不利，完全脫水也不利于保存，一般把干燥后的細(xì)胞含水量控制在3%以下(1%～3%)。⑦復(fù)蘇培養(yǎng)：打開安瓿管后加入無菌水使 凍干菌融化，融化速度慢比快速融化的成活率要高。

菌種能否適宜于凍干保存，需經(jīng)過實(shí)驗(yàn)來證明，一般是在保存1個(gè)月進(jìn)行復(fù)蘇培養(yǎng)，如果菌的成活率高于10%，即認(rèn)為可用凍干保存法保存，以后6個(gè)月、2年、5年、10年再進(jìn)行檢查存活情況，以確定保存期的上限。

凍干保藏的效果因微生物種類而異，一般是細(xì)菌＞放線菌＞真菌＞藻類，而菌絲體不宜用此法保存。

3．試驗(yàn)效果冷凍干燥保存的菌種存活時(shí)間長(zhǎng)、效果好，一般菌種可保存5年以上，有的可保藏15年以上不發(fā)生變異。還具有體積小、不易污染、便于運(yùn)輸?shù)葍?yōu)點(diǎn)，是一種用得最為廣泛的菌種保藏方法。

4．試驗(yàn)儀器及試劑冷凍干燥備有不同型號(hào)和類型，但都由四個(gè)部分組成：干燥箱、蒸汽捕集器、真空泵、冷凍系統(tǒng)。干燥箱可控制溫度范圍為-40～40℃。

四、液氮超低溫保存

1．試驗(yàn)原理本方法是近年推廣使用的一種菌種保存法。大多數(shù)微生物如病毒、噬菌體，立克氏體，各種細(xì)菌、放細(xì)菌、支原體，各種絲狀菌、酵母、藻類和原蟲，特別是一些無法用凍干保存的微生物，都可用此法長(zhǎng)期保存。工業(yè)微生物高產(chǎn)菌種也逐步采用此法保存。液氮保存的原理是微生物在-130℃以下溫度時(shí)，它的新陳代謝作用停止，化學(xué)反應(yīng)也消失，而液氮溫度可達(dá)-196℃，在這種情況下可以長(zhǎng)期保存。

2．試驗(yàn)步驟

1)安瓿管準(zhǔn)備一般要求用95%料或GG17的玻管制作，以能承受巨大的溫差變化而不破損，大小根據(jù)需要而定。用印同在管壁上書寫菌號(hào)，160℃烘干，加棉塞滅菌備用。

2)菌種準(zhǔn)備在最適培養(yǎng)基斜面上培養(yǎng)得到健壯菌種，制成懸浮液，如為不產(chǎn)孢子的真菌，則采用斜面或液體振蕩培養(yǎng)，制成菌絲片段。將菌懸淮分裝至滅菌安瓿管中，每管0.2～0.5ml，然后用火焰將安瓿熔封。

3)凍結(jié)將熔封后的安瓿管入大慢速凍結(jié)器上，以每分鐘下降1℃的速度冷凍，當(dāng)安瓿管溫度下降至-35℃時(shí)，即可把安瓿管移入液氮內(nèi)作長(zhǎng)期保藏。

4)菌種的復(fù)蘇培養(yǎng)直至全部溶化為止，當(dāng)溶化后即開啟安瓿移至培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)，扣作時(shí)應(yīng)特別注意安全，防止爆炸或凍傷，不宜戴線手套，要戴皮手套操作

3．試驗(yàn)儀器及試劑

1）保護(hù)劑與冷凍干燥保存一樣，液氮保存菌種也需要有保護(hù)物質(zhì)，可以用10%的甘油，使用方便、效果好，但有些菌對(duì)甘油敏感，效果不佳，可選用其他保護(hù)劑，常用的有5%～10%(V/V)二甲基亞砜；20%二甲亞砜加1%蛋白陳；吐溫80及0.4mmol聚乙烯氮戊環(huán)等，糖類也可作為一種保護(hù)劑，但濃度適當(dāng)加以控制。

2）液氮罐

第五篇：微生物菌種、毒株的管理規(guī)定2013版

微生物菌種、毒株的管理規(guī)定

為加強(qiáng)可感染人類的高致病性病原微生物菌種、毒株的管理，保障人體健康和公共衛(wèi)生安全特制定本規(guī)定。

一、菌種、毒株的保藏和管理嚴(yán)格按《中華人民共和國傳染病防治法》、《病原微生物實(shí)驗(yàn)室生物安全管理?xiàng)l例》、《可感染人類的高致病性病原微生物菌種、毒株管理規(guī)定》等法律、行政法規(guī)的規(guī)定執(zhí)行。

二、設(shè)立《微生物實(shí)驗(yàn)室菌種登記表》，其內(nèi)容包括：菌種編號(hào)、菌種名稱、菌種來源、保存日期、數(shù)量、保存條件、存放位置、保管人。

三、嚴(yán)格的登記制度、建立詳細(xì)的總賬及分類賬。

四、根據(jù)菌種的特性選擇適宜的保存方式。采用雙人管理。

五、根據(jù)菌種情況，定期檢測(cè)菌種品質(zhì)，發(fā)現(xiàn)菌種變異或退化時(shí)應(yīng)及時(shí)報(bào)告，并查明原因。

六、菌種的發(fā)放需要雙保管人員同時(shí)在場(chǎng)的情況下才能進(jìn)行。每次使用標(biāo)準(zhǔn)菌株都應(yīng)做好使用記錄，包括標(biāo)準(zhǔn)品的名稱、編號(hào)、使用時(shí)間等。

七、購買的標(biāo)準(zhǔn)菌株初次復(fù)蘇使用時(shí)，應(yīng)批量保存在菌種管中，-20℃以下保存。

八、新的標(biāo)準(zhǔn)菌株復(fù)蘇后，傳代最多不超過3次，如超過3次將不再作為標(biāo)準(zhǔn)菌株使用。

九、標(biāo)準(zhǔn)菌株保存管一經(jīng)解凍使用后，不得再次凍存。

十、菌種必須裝在密封的專用容器內(nèi)高壓滅菌銷毀，并做好銷毀記錄。

十一、菌種、毒株失竊要及時(shí)報(bào)告處理，并有相應(yīng)的應(yīng)急預(yù)案。

微生物實(shí)驗(yàn)室菌種、毒株管理者：