第一篇：jp-微生物檢測實驗教學(xué)指導(dǎo)

《食品微生物檢驗技術(shù)》實驗指導(dǎo) 《食品微生物檢驗技術(shù)》實驗指導(dǎo)

一、課程性質(zhì)和任務(wù)

《食品微生物檢驗學(xué)》是以微生物學(xué)的理論為基礎(chǔ)，對食品的微生物污染及控制措施、以微生物為主的因素引起的食品腐敗變質(zhì)、食品檢驗樣品的采集及處理作了扼要介紹；著重介紹了食品微生物檢驗的指標(biāo)，食物中毒性微生物、常見病原微生物的生物學(xué)特性、致病性及檢驗方法；系統(tǒng)闡述了肉、蛋、乳、水產(chǎn)品及其制品、罐頭食品的微生物學(xué)檢驗方法。通過本課程的學(xué)習(xí)，使學(xué)生掌握食品微生物檢驗的基本原理與方法，注重培養(yǎng)學(xué)生的實際操作能力。

二、教學(xué)的目標(biāo)及要求

通過該課程的學(xué)習(xí)，要求學(xué)生掌握食品微生物檢驗的基本原理與方法，提高微生物檢驗的實際操作能力。為達到上述目標(biāo)，要求學(xué)生一定要自己親自動手獨立實驗，實事求是的完成每一次實驗報告，并做好每次實驗前的預(yù)習(xí)。

三、教學(xué)方式及課程考核辦法

所有實驗在教學(xué)實驗室里由教師指導(dǎo)完成。課程結(jié)束后分筆試和操作考試，操作考試采取一個教師對一個學(xué)生的方式進行?？荚噧?nèi)容由學(xué)生自己抽簽選擇其中一項在規(guī)定時間內(nèi)完成，超過規(guī)定時間扣分。筆試成績和操作成績各占考試成績的60％與40％。

實驗一 食品樣品的采集及處理

一．實驗?zāi)康暮鸵?/p>

學(xué)習(xí)采集樣品，稀釋樣品的方法與步驟。二．實驗原理

樣品是指從某一總體中抽出的一部分，食品采樣是指從較大批量食品中抽取能較好地代表其總體樣品的方法。食品衛(wèi)生監(jiān)督部門或食品企業(yè)自身為了解和判斷食品的營養(yǎng)與衛(wèi)生質(zhì)量，或查明食品在生產(chǎn)過程中的衛(wèi)生狀況，可使用采樣檢驗的方法。根據(jù)抽樣檢驗的結(jié)果，結(jié)合感官檢查，可對食品的營養(yǎng)價值和衛(wèi)生質(zhì)量作出評價，或協(xié)助企業(yè)找出某些生產(chǎn)環(huán)節(jié)中存在的主要衛(wèi)生問題。食品采樣是 2 食品檢測結(jié)果準(zhǔn)確與否的關(guān)鍵，也是營養(yǎng)食品衛(wèi)生專業(yè)人員必須掌握的一項基本技能。

三．需用的儀器或試劑等

培養(yǎng)基、試管、三角瓶、酒精燈、恒溫恒濕培養(yǎng)箱。四．采樣方法步驟

（1）液體、半液體均勻食品： 采樣以一池、一缸、一桶為一個采樣單位，攪拌均勻后采集一份樣品；若采樣單位容量過大，可按高度等距離分上、中、下三層，在四角和中央的不同部位每層各取等量樣品，混合后再采樣；流動液體可定時定量從輸出的管口取樣，混合后再采樣；大包裝食品，如用鋁桶、鐵桶、塑料桶包裝的液體、半液體食品，采樣前需用采樣管插人容器底部，將液體吸出放入透明的玻璃容器內(nèi)作現(xiàn)場感官檢查，然后將液體充分攪拌均勻，用長柄勺或采樣管取樣。

（2）固體散裝食品：大量的散裝固體食品，如糧食、油料種子、豆類、花生等，可采用幾何法、分區(qū)分層法采樣。幾何法即把一堆物品視為一種幾何立體（如立方體、圓錐體、圓柱體等），取樣時首先把整堆物品設(shè)定或想象為若干體積相等的部分，從這些部分中各取出體積相等的樣品混合為初級樣品。對在糧堆、庫房、船艙、車廂里堆積的食品進行采樣，可采用分層采樣法，即分上、中、下三層或等距離多層，在每層中心及四角分別采取等量小樣，混合為初級樣品；對數(shù)量較多的顆?；蚍勰罟腆w食品，需用“四分法”采樣。

（3）不均勻食品： 蔬菜、魚、肉、蛋類等食品應(yīng)根據(jù)檢驗?zāi)康暮鸵?，從同一部位采集小樣，或從具有代表性的各個部位采取小樣，然后經(jīng)過充分混合得到初級樣品。肉類應(yīng)從整體各部位取樣（不包括骨及毛發(fā)）；魚類，大魚從頭、體、尾各部位取樣，小魚可取2～3條；蔬菜，如蔥、菠菜等可取整棵，蓮白、青萊等可從中心剖開成二或四個對稱部分，取其中一個或兩個對稱部分；蛋類，可按一定個數(shù)取樣，也可根據(jù)檢驗?zāi)康膶⒌包S、蛋清分開取樣。五．樣品處理

稀釋樣品。稱取1g樣品，在火焰旁加到有9mL無菌水和少許玻璃珠的三角瓶 3 內(nèi)，振蕩10min，使樣品和水樣充分混合，將菌分散，樣品中的菌樣被稀釋了100倍，樣品懸液的稀釋度為10-2。在火焰處打開無菌吸管的紙?zhí)祝脽o菌吸管吸取樣品懸液1ml，加到一個盛有9ml無菌水的試管內(nèi)，稀釋1000倍制成稀釋度為10-3的檢樣懸液，將此吸管在試管內(nèi)反復(fù)吹洗3次，然后取出，通過火焰，再插入紙?zhí)變?nèi)，以備再用。輕輕搖動試管，使菌液均勻。再用剛才用過的吸管，插入試管內(nèi)，反復(fù)吹洗3次，然后取出1ml菌液，加到另一支9 ml無菌水中，制成稀釋度為10-4的樣品懸液備培養(yǎng)基平板

同法按每級稀釋10倍的次序得到10-

5、10-6的樣品稀釋液，稀釋完后，用最后一支吸管，由最小的稀釋液（10-6）開始吸取0.2ml加到編號為10-6的培養(yǎng)皿，再依次分別從10-

5、10-4試管中各吸取0.2ml稀釋液，加到相應(yīng)編號的培養(yǎng)皿內(nèi)，每次吸取時，吸管都要在稀釋液中反復(fù)吹洗幾次。

實驗二 細菌的革蘭氏染色

1．本次實驗的目的和要求

進一步掌握正確規(guī)范使用顯微鏡的方法和技能。理解簡單染色和革蘭氏染色的原理。掌握革蘭氏染色的方法與規(guī)范操作。鞏固顯微鏡的使用方法和無菌操作技術(shù)。

2．實驗內(nèi)容或原理

革蘭氏染色法是1884年由丹麥病理學(xué)家Christain Gram氏創(chuàng)立的，而后一些學(xué)者在此基礎(chǔ)上作了某些改進。革蘭氏染色法是細菌學(xué)中最重要的鑒別染色法。革蘭氏染色法的基本步驟是：先用初染劑結(jié)晶紫進行染色，再用碘液媒染，然后用乙醇（或丙酮）脫色，最后用復(fù)染劑（如番紅）復(fù)染。經(jīng)此方法染色后，細胞保留初染劑藍紫色的細菌為革蘭氏陽性菌；如果細胞中初染劑被脫色劑洗脫而使細菌染上復(fù)染劑的顏色（紅色），該菌屬于革蘭氏陰性菌。

革蘭氏染色法將細菌分為革蘭氏陽性和革蘭氏陰性，是由這兩類細菌細胞壁的結(jié)構(gòu)和組成不同決定的。實際上，當(dāng)用結(jié)晶紫初染后，象簡單染色法一樣，所有細菌都被染成初染劑的藍紫色。碘作為媒染劑，它能與結(jié)晶紫結(jié)合成結(jié)晶紫一碘的復(fù)合物，從而增強了染料與細菌的結(jié)合力。當(dāng)用脫色劑處理時，兩類細菌的 4 脫色效果是不同的。革蘭氏陽性細菌的細胞壁主要由肽聚糖形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)組成、壁厚、類脂質(zhì)含量低，用乙醇（或丙酮）脫色時細胞壁脫水、使肽聚糖層的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)孔徑縮小，透性降低，從而使結(jié)晶紫-碘的復(fù)合物不易被洗脫而保留在細胞內(nèi)，經(jīng)脫色和復(fù)染后仍保留初染劑的藍紫色。革蘭氏陰性菌則不同，由于其細胞壁肽聚糖層較薄，類脂含量高，所以當(dāng)脫色處理時，類脂質(zhì)被乙醇（或丙酮）溶解，細胞壁透性增大，使結(jié)晶紫-碘的復(fù)合物比較容易被洗脫出來，用復(fù)染劑復(fù)染后，細胞被染上復(fù)染劑的紅色。

3．需用的儀器或試劑等

顯微鏡，擦鏡紙，香柏油，二甲苯，接種環(huán)，酒精燈，石炭酸復(fù)紅染色液，草酸胺結(jié)晶紫染色液，95%乙醇，蕃紅染色液，大腸桿菌，金黃色葡萄球菌。4．實驗步驟(1)制片

取菌種培養(yǎng)物常規(guī)涂片、干燥、固定。要用活躍生長期的幼培養(yǎng)物作革蘭氏染色；以免脫色不完全造成假陽性；火焰固定不宜過熱（以玻片不燙手為宜）。(2)初染

滴加結(jié)晶紫（以剛好將菌膜覆蓋為宜）染色1-2min，水洗。(3)媒染

用碘液沖去殘水，并用碘液覆蓋約1min，水洗。(4)脫色

用濾紙吸去玻片上的殘水，將玻片傾斜，在白色背景下，用滴管流加95%的乙醇脫色，直至流出的乙醇無紫色時，立即水洗。水洗時，不要直接 沖涂面，而應(yīng)使水從載玻片的一端流下。水流不宜急、過大，以免涂片薄膜脫落。

注意：革蘭氏染色結(jié)果是否正確，乙醇脫色是格蘭氏染色操作的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，脫色不足，陰性菌被誤染成陽性菌，脫色過度，陽性菌被誤染成陰性菌，脫色時間一般約20-30s。(5)復(fù)染

用番紅染液復(fù)染約2min，水洗。

5(6)鏡檢

干燥后，用油鏡觀察。

菌體被染成藍紫色是革蘭氏性菌，被染成紅色的為革蘭氏陰性菌。

實驗三 微生物培養(yǎng)基的制備 實驗?zāi)康呐c要求：

(1)學(xué)習(xí)微生物培養(yǎng)基的制備，了解培養(yǎng)基配方中各成分的作用、制備流程及各環(huán)節(jié)的操作技術(shù)與應(yīng)用。

(2)學(xué)習(xí)并掌握培養(yǎng)基的高壓蒸氣滅菌原理、操作關(guān)鍵技術(shù)和滅菌技術(shù)。2 實驗原理

(1)培養(yǎng)基的制備原理

培養(yǎng)基是按照微生物生長發(fā)育的需要，用不同組分的營養(yǎng)物質(zhì)調(diào)制而成的營養(yǎng)基質(zhì)。人工制備培養(yǎng)基的目的，在于給微生物創(chuàng)造一個良好的營養(yǎng)條件。把一定的培養(yǎng)基放入一定的器皿中，就提供了人工繁殖微生物的環(huán)境和場所。它含有滿足微生物生長發(fā)育的水分、碳源、氮源、無機鹽和生長素以及某些特需的微量元素等。此外，培養(yǎng)基還應(yīng)具有適宜的酸堿度(pH值)和一定緩沖能力及一定的氧化還原電位和合適的滲透壓。

固體培養(yǎng)基是在液體培養(yǎng)基中添加凝固劑制成的，常用的凝固劑有瓊脂、明膠和硅酸鈉，其中以瓊脂最為常用，其主要成份為多糖類物質(zhì)，性質(zhì)較穩(wěn)定，一般微生物不能分解，故用凝固劑而不致引起化學(xué)成份變化。瓊脂在95℃的熱水中才開始融化，融化后的瓊脂冷卻到45℃才重新凝固。因此用瓊脂制成的固體培養(yǎng)基在一般微生物的培養(yǎng)溫度范圍內(nèi)(25℃～37℃)不會融化而保持固體狀態(tài)。（2）高壓蒸氣滅菌原理

高壓蒸汽滅菌是將待滅菌的物品放在一個密閉的加壓滅菌鍋內(nèi)，通過加熱，使滅菌鍋隔套間的水沸騰而產(chǎn)生蒸汽。待水蒸汽急劇地將鍋內(nèi)的冷空氣從排氣閥中驅(qū)盡，然后關(guān)閉排氣閥，繼續(xù)加熱，此時由于蒸汽不能溢出，而增加了滅菌器內(nèi)的壓力，從而使沸點增高，得到高于100℃的溫度。導(dǎo)致菌體蛋白質(zhì)凝固變性而達 6 到滅菌的目的。

在同一溫度下，濕熱的殺菌效力比干熱大，其原因有三：一是濕熱中細菌菌體吸收水分，蛋白質(zhì)較易凝固，因蛋白質(zhì)含水量增加，所需凝固溫度降低，二是濕熱的穿透力比干熱大；三是濕熱的蒸汽有潛熱存在，這種潛熱，能迅速提高被滅菌物體的溫度，從而增加滅菌效力。

在使用高壓蒸汽滅菌鍋滅菌時，滅菌鍋內(nèi)冷空氣的排除是否完全極為重要，因為空氣膨脹壓大于水蒸汽的膨脹壓，所以，當(dāng)水蒸汽中含有空氣時，在同一壓力下，含空氣蒸汽的溫度低于飽和蒸汽的溫度。3 實驗器材

瓊脂、10％HCL、10% NaOH、牛肉膏、蛋白胨、試管、量筒、小燒杯、玻璃棒、骨匙、pH試紙、紗布、棉花、報紙、麻繩、標(biāo)簽、培養(yǎng)皿、高壓蒸汽滅菌鍋、烘箱、電爐等。4 實驗步驟

(1)稱量：按照培養(yǎng)基配方，準(zhǔn)確稱取各成份放于燒杯中。

(2)熔化：向上述燒杯中加入所需水量，攪勻，然后加熱使其熔解。如是配制固體培養(yǎng)基，在瓊脂熔化的過程中，需不斷攪拌并控制火力不要使培養(yǎng)基溢出或燒焦，待完全熔解后，補充所失水分。如果配方中含有淀粉，則需要將淀粉用少量冷水調(diào)成糊狀并在火焰上加熱攪拌后加足水份及其他藥品，待完全熔解后，補充水份。

(3)調(diào)PH值：初制備好的培養(yǎng)基往往不能符合所要求的PH值，故需用PH試紙或酸度計校正，用1M HCl調(diào)PH至所需范圍。

(4)過濾：用濾紙或多層紗布過濾，一般無特殊要求的情況下這一步可以省去。(5)分裝：根據(jù)不同的需要，可將制好的培養(yǎng)基分裝入試管內(nèi)或三角瓶內(nèi)，管（瓶）口塞上棉塞，注意不要使培養(yǎng)基沾在管（瓶）口上以免浸濕棉塞，引起污染。

注意：裝入試管中的量不宜超過試管高度的1/5，裝入三角燒瓶中的量以燒瓶總體積的一半為限。在分裝過程中，應(yīng)注意勿使培養(yǎng)基沾污管口或瓶口、以免弄濕棉塞，造成污染。

7(6)高壓滅菌

手提式高壓蒸汽滅菌鍋的使用操作步驟：

a 首先將內(nèi)層滅菌桶取出，再向外層鍋內(nèi)加入適量的水，使水面與三角擱架相平為宜。

b 放回滅菌桶，并裝入待滅菌物品。注意不要裝得太擠，以免防礙蒸汽流通而影響滅菌效果。三角燒瓶與試管口端均不要與桶壁接觸，以免冷凝水淋濕包口的紙而透入棉塞。

c 加蓋，并將蓋上的排氣軟管插入內(nèi)層滅菌桶的排氣槽內(nèi)。再以兩兩對稱的方式同時旋緊相對的兩個螺栓，使螺栓松緊一致，勿使漏氣。

d 同時打開排氣閥，使水沸騰以排除渦內(nèi)的冷空氣。待冷空氣完全排盡后，關(guān)上排氣閥，讓鍋內(nèi)的溫度隨蒸汽壓力增加而逐漸上升。當(dāng)鍋內(nèi)壓力升到所需壓力時，控制電源，維持壓力至所需時間。本實驗用1.05kg/cm2，121.3℃，20分鐘滅菌。

e 滅菌所需時間到后，切斷電源，讓滅菌鍋內(nèi)溫度自然下降，當(dāng)壓力表的壓力降至0時，打開排氣閥，旋松螺栓，打開蓋子，取出滅菌物品。如果壓力未降到0時，打開排氣閥，就會因鍋內(nèi)壓力突然下降，使容器內(nèi)的培養(yǎng)基由于內(nèi)外壓力不平衡而沖出燒瓶口或試管口，造成棉塞沾染培養(yǎng)基而發(fā)生污染。

f 將取出的滅菌培養(yǎng)基放入37℃溫箱培養(yǎng)24小時，經(jīng)檢查若無雜菌生長，即可待用。

實驗四 微生物菌種的分離純化 實驗?zāi)康暮鸵?/p>

學(xué)習(xí)采集樣品，分離純化微生物菌種的方法步驟 2 實驗內(nèi)容或原理

從混雜的微生物群體中獲得只含有某一種微生物的過程稱為微生物的分離純化。欲從含有多種微生物的樣品中直接辯認出，并且取得某種所需微生物的個體，進行純培養(yǎng)，那是困難的。由于微生物可以形成菌落，而每個單一菌落常常是由一種個體繁殖而成，菌落又是可以識別和加以鑒定的。因此將樣品中不同微生物 8 個體在特定的培養(yǎng)基上培養(yǎng)出不同單一菌落，再從選定的某一菌落中取樣，移植到新的培養(yǎng)基中去，就可以達到分離純化的目的。這也就是常用純種分離法的原理。需用的儀器或試劑等

培養(yǎng)基、試管、培養(yǎng)皿、三角瓶、接種環(huán)、酒精燈、恒溫恒濕培養(yǎng)箱。4 實驗步驟(1)采樣，樣品稀釋

稀釋土樣。稱取1g樣品，在火焰旁加到有99mL無菌水和少許玻璃珠的三角瓶內(nèi)，振蕩10min，使土壤和水樣充分混合，將菌分散，土樣中的菌樣被稀釋了100倍，土壤懸液的稀釋度為10-2。在火焰處打開無菌吸管的紙?zhí)?，用無菌吸管吸取土壤懸液1ml，加到一個盛有9ml無菌水的試管內(nèi)，稀釋1000倍制成稀釋度為10-3的土壤懸液，將此吸管在試管內(nèi)反復(fù)吹洗3次，然后取出，通過火焰，再插入紙?zhí)變?nèi)，以備再用。輕輕搖動試管，使菌液均勻。再用剛才用過的吸管，插入試管內(nèi)，反復(fù)吹洗3次，然后取出1ml菌液，加到另一支9 ml無菌水中，制成稀釋度為10-4的土壤懸液備培養(yǎng)基平板

同法按每級稀釋10倍的次序得到10-

5、10-6的土壤稀釋液，稀釋完后，用最后一支吸管，由最小的稀釋液（10-6）開始吸取0.2ml加到編號為10-6的培養(yǎng)皿，再依次分別從10-

5、10-4試管中各吸取0.2ml稀釋液，加到相應(yīng)編號的培養(yǎng)皿內(nèi)，每次吸取時，吸管都要在稀釋液中反復(fù)吹洗幾次。(2)制備培養(yǎng)基平板(3)平板畫線法分離培養(yǎng)

a平板的制作及培養(yǎng)。將已滅菌的牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基水浴融化后冷卻至45℃～50℃（溫度過高，培養(yǎng)皿蓋上凝結(jié)水太多，菌易被沖掉或燙死；溫度過低，培養(yǎng)基凝固不易倒出）。

傾倒培養(yǎng)基應(yīng)在酒精燈火焰附近操作，右手持盛培養(yǎng)基的三角瓶（或試管），左手拿培養(yǎng)皿，并松動三角瓶的棉塞。培養(yǎng)基一次不能用完時，棉塞應(yīng)用左手小指夾持，不可放在桌面上，拔出棉塞后，三角瓶口在火焰上滅菌，然后少許打開 9 培養(yǎng)皿蓋，迅速傾入培養(yǎng)基，迅速將皿蓋蓋妥，平放桌上，輕輕旋轉(zhuǎn)，使培養(yǎng)基與懸液混合均勻，待凝固后，即成平板。將培養(yǎng)皿倒置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)24h，細菌即在所固定的位置長成肉眼可見的菌落。

放線菌的稀釋分離法同前，只不過在制土壤懸液時，于99ml無菌水的三角瓶內(nèi)加入10%的苯酚溶液10滴，以抑制細菌生長，28℃恒溫箱中培養(yǎng)7 d～10d。

b平板劃線分離法

將融化的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基制成平板，待冷凝后，左手持平板，右手持接種針，用接種環(huán)在火焰上滅菌后沾取一環(huán)適宜稀釋度的懸液，在火焰附近用左手拇指、食指掀開皿蓋，使接種環(huán)輕觸培養(yǎng)基，迅速劃線（注意勿將培養(yǎng)基劃破），劃線時，接種環(huán)與培養(yǎng)基表面的夾角為20～30°。

常用的劃線方式有兩種,一種是將平板分成三個區(qū)域，先在第一個區(qū)域內(nèi)劃3～4條平行線，轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿，在火焰上燒掉接種環(huán)上的殘余物后，通過第一次劃線部分，在第二個區(qū)域內(nèi)劃線；第二個區(qū)域中的線和第一個區(qū)域中的線應(yīng)有部分交叉，依法在第三個區(qū)域中劃線。另一種是先以沾有細菌懸液的接種環(huán)在平板的一端抹一下，使該處沾上一些細菌，然后燒掉環(huán)上剩下的細菌，再用燒過冷卻的接種環(huán)，通過剛才涂抹的部分，左右劃線，不能互相接觸。

劃線分離對細菌、酵母菌較為適宜，而霉菌和放線菌的分離多采用稀釋分離法。分離純化工作可反復(fù)進行，直至獲得滿意的單菌落純培養(yǎng)為止。（4）觀察、鏡檢、純培養(yǎng)

實驗五 食品中菌落總數(shù)的測定 實驗?zāi)康暮鸵?/p>

掌握菌落計數(shù)的方法，掌握食品細菌菌落總數(shù)的測定報告方式。2 實驗內(nèi)容或原理

菌落總數(shù)是指食品經(jīng)過處理，在一定條件下培養(yǎng)后，所得1g或1ml檢樣中所含細菌菌落總數(shù)。菌落總數(shù)主要作為判別食品被污染程度的標(biāo)志，也可以應(yīng)用這一方法觀察細菌在食品中繁殖的動態(tài)過程，以便對被檢樣品進行衛(wèi)生學(xué)評價時提供依據(jù)。

菌落總數(shù)并不表示樣品中實際存在的所有細菌總數(shù)，菌落總數(shù)也并不能區(qū)分其中細菌的種類，所以有時被稱為雜菌數(shù)，需氧菌數(shù)等。3 實驗材料與儀器

食品檢樣、牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基、無菌生理鹽水、無菌培養(yǎng)皿、無菌移液管、無菌不銹鋼勺。4 實驗步驟

（1）取樣、稀釋和培養(yǎng)

a 以無菌操作取檢樣25g（或ml），放于225ml滅菌生理鹽水的滅菌玻璃瓶內(nèi)（瓶內(nèi)預(yù)置適量的玻璃珠），經(jīng)充分振要或研磨制成1：10的均勻稀釋液。

b 用1ml滅菌吸管吸取1：10稀釋液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml滅菌生理鹽水的試管內(nèi)，振搖試管混合均勻，制成1：100的稀釋液。

c 另取1ml滅菌吸管，按上項操作順序，制10倍遞增稀釋液，如此每遞增稀釋一次即換用1支10ml吸管。

d 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)要求或?qū)ξ廴厩闆r的估計，選擇2～3個適宜稀釋度，分別在制作10倍遞增稀釋的同時，以吸取該稀釋度的吸管移取1ml稀釋液于滅菌平皿中，每個稀釋度做兩個平皿。

e 稀釋液移入平皿后，將涼至45℃～50℃牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基注入平皿約15ml，并轉(zhuǎn)動平皿，混合均勻。同時將牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基傾入加有1ml稀釋液（不含樣品）的滅菌平皿內(nèi)作空白對照。

f 待培養(yǎng)基凝固后，翻轉(zhuǎn)平板，置37℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)48h，取出計算平板內(nèi)菌落數(shù)目，乘以稀釋倍數(shù)，即得每克（每毫升）樣品所含菌落總數(shù)。(2)菌落計數(shù)方法

作平皿菌落計數(shù)時，可用肉眼觀察，必要時用放大鏡檢查，以防遺漏。在記下各平皿的菌落總數(shù)后，求出同稀釋度的各平皿平均菌落數(shù)。到達規(guī)定培養(yǎng)時間，應(yīng)立即計數(shù)。如果不能立即計數(shù)，應(yīng)將平板放置于0℃～4℃，但不要超過24h。(3)菌落計數(shù)報告方法

a平皿菌落數(shù)的選擇

選取菌落數(shù)在30～300之間的平皿作為菌落總數(shù)測定標(biāo)準(zhǔn)。每一個稀釋度應(yīng)采用兩個平皿平均數(shù)，其中一個平皿有較大片狀菌落生長時，則不宜采用，而應(yīng)以無片狀菌落生長的平皿作為該稀釋度的菌落數(shù)，若片狀菌落不到平皿的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，則可以計算半個平皿后乘以2以代表全皿菌落數(shù)。

b 稀釋度的選擇

① 應(yīng)選取平均菌落數(shù)在30～300之間的稀釋度報告

細菌菌落總數(shù)是指檢樣在培養(yǎng)基上37℃24小時培養(yǎng)所長出的菌落數(shù)。菌落總數(shù)的多少可以說明污染的程度。

② 若有二個稀釋度均在30～300之間時，應(yīng)以二者比值決定，比值 ≤2取平均數(shù)，比值>2則其較小數(shù)字。

③ 若所有稀釋度均>300，則取最高稀釋度的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)。④ 若所有稀釋度均<30，則以最低稀釋度的平均菌落數(shù)乘稀釋倍數(shù)。⑤ 若所有稀釋度均不在30～300之間，有的>300，有的又<30，則應(yīng)以最接近300或30的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)。

c 菌落計數(shù)報告方法

菌落數(shù)在1～100時，按實有數(shù)字報告，如大于100時，則報告前面兩位有效數(shù)字，第三位數(shù)按四舍五入計算，為了縮短數(shù)字后面的零數(shù)，也可以10的指數(shù)表示。

實驗六 食品中大腸菌群的測定

1．實驗?zāi)康暮鸵?/p>

學(xué)習(xí)食品中大腸菌群檢測程序方法，掌握食品中大腸菌群檢測結(jié)果的報告方式。

2．實驗內(nèi)容或原理

大腸菌群系指一群能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽胞桿菌。該菌主要來于人畜糞便，故以此作為糞便污染指標(biāo)來評價食品的衛(wèi)生質(zhì)量，推斷食品中有否污染腸道致病菌的可能。

食品中大腸菌群數(shù)是以100ml(g)檢樣內(nèi)大腸菌群最可能數(shù)(MPN)表示。本實驗學(xué)習(xí)多管發(fā)酵法檢測食品中的大腸菌群。

a 初發(fā)酵試驗

用于初步發(fā)酵試驗的液體培養(yǎng)基含有乳糖、蛋白胨和溴甲酚紫。許多細菌不能發(fā)酵乳糖，而大腸菌群可發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸（有機酸），產(chǎn)氣（CO2+H2）。乳糖起選擇性碳源的作用。溴甲酚紫是pH指示劑（堿性條件：紫蘭色；酸性條件：黃色，變色點pH=6.7），當(dāng)大腸菌群的細菌利用乳糖產(chǎn)酸后，使原來的pH由中性下降成酸性，培養(yǎng)基從紫色變?yōu)辄S色。另外，溴甲酚紫還具有抑制其他細菌生長的作用。

b平板分離

為進一步證明大腸菌群的存在，需進行平板分離，所用培養(yǎng)基為伊紅美藍瓊脂。伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基中含有伊紅與美藍兩種苯胺類染料，可以抑制G+菌和一些難培養(yǎng)的G-菌，而且在低酸度時，兩種染料結(jié)合形成沉淀，起著產(chǎn)酸指示劑的作用。大腸菌群因其強烈發(fā)酵乳糖而產(chǎn)生大量混合酸，使菌體表面帶上正電荷，可染上伊紅染液，伊紅與美藍結(jié)合，菌體被著上深紫色，形成帶核心、具金屬光澤的特征性菌落。

c 復(fù)發(fā)酵試驗

陽性菌落經(jīng)涂片染色鑒別為G-，無芽孢者，再經(jīng)過乳糖發(fā)酵管液體培養(yǎng)進行復(fù)發(fā)酵試驗，經(jīng)24h培養(yǎng)產(chǎn)酸產(chǎn)氣者，可確認為大腸菌群陽性結(jié)果。3 實驗材料與儀器

食品檢樣、乳糖蛋白胨發(fā)酵管、伊紅美藍瓊脂平板、EC 肉湯、磷酸鹽緩沖稀釋液、蛋白胨稀釋液、無菌生理鹽水、革蘭氏染色液、恒溫箱、冰箱、恒溫水浴、天平、顯微鏡、直徑為90mm的平皿、試管、吸管、廣口瓶或三角燒瓶、玻璃珠、載玻片、酒精燈、試管架。4 實驗操作步驟（1）檢樣處理

液態(tài)檢樣可用振搖的方式，使充分均勻混合后，取50ml加入 450ml已滅菌的稀釋液中，即為10倍稀釋檢液。

凝態(tài)及濃稠液態(tài)檢體如布丁、煉乳等,經(jīng)適當(dāng)攪拌均勻后，取50g加入450ml滅菌之稀釋液中，用攪拌均質(zhì)器攪拌(攪拌方法同前)，即為10倍稀釋檢液。（2）檢樣稀釋

以無菌操作將上述處理樣25ml放于有225ml滅菌生理鹽水或其他稀釋液的滅菌玻璃瓶內(nèi)(瓶內(nèi)予置適當(dāng)數(shù)量的玻璃珠)，經(jīng)充分振搖后，制成1:10的均勻稀釋液。

用1ml滅菌吸管吸取1:10稀釋液1ml，注入含有9ml滅菌生理鹽水或其他稀釋液的試管內(nèi)，振搖試管混勻，制成1:100的稀釋液。

另取1ml滅菌吸管，按上條操作依次做10倍遞增稀釋液,每遞增稀釋一次，換用1支1ml滅菌吸管。

根據(jù)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求或?qū)z樣污染情況的估計，選擇三個稀釋度，每個稀釋度，接種3管。（3）初發(fā)酵試驗

將已選擇的稀釋檢液及原液(液體檢樣)充分振搖、混合均勻后,分別吸取1ml接種于已裝有9ml乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi)（內(nèi)倒置小管）。接種量在1ml以上者，用雙倍乳糖膽鹽發(fā)酵管（內(nèi)倒置小管），1ml及1ml以下者，用單倍乳糖膽鹽發(fā)酵管（內(nèi)倒置小管）。每一稀釋度接種3管，置37℃ 溫箱內(nèi)，培養(yǎng)24h，如所有乳糖膽鹽發(fā)酵管都不產(chǎn)氣，則可報告為大腸菌群陰性，如有產(chǎn)氣者，則按下列程序進行。

（4）分離培養(yǎng)

經(jīng)24h培養(yǎng)后，將產(chǎn)氣（倒管頂部有空氣）的發(fā)酵管分別轉(zhuǎn)種在伊紅美藍瓊脂平板上，置37℃ 溫箱內(nèi)，培養(yǎng)24h，然后取出，觀察菌落形態(tài)，并做革蘭氏染色和證實試驗。（5）復(fù)發(fā)酵試驗

在上述平板上，挑取可疑大腸菌群菌落1～2個進行革蘭氏染色，同時接種乳糖發(fā)酵管，置 37℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h，觀察產(chǎn)氣情況。凡乳糖發(fā)酵管產(chǎn)氣、革蘭氏染色為陰性的無芽胞桿菌,即可報告為大腸菌群陽性。

第二篇：表面微生物檢測方法

空氣、食品接觸面微生物檢驗方法、檢驗標(biāo)準(zhǔn) 目的：

檢測生產(chǎn)車間空氣、操作人員手部、與食品有直接接觸面的機械設(shè)備的微生物指標(biāo)，生產(chǎn)區(qū)域環(huán)境當(dāng)中病原微生物的監(jiān)控，達到規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)，以控制食品成品的質(zhì)量。參照標(biāo)準(zhǔn)：

中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)《一次性使用衛(wèi)生用品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》GB15979－1995、《HACCP原理與實施》、中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)《公共場所空氣微生物檢驗方法細菌總數(shù)測定》GB/T 18204.1－2000、中華人民共和國進出口商品檢驗行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN 0169-92/SN 0172-92/ SN 0170-92、出入境檢驗檢疫局二000四年《出入食品微生物檢驗培訓(xùn)教材》中《出入食品生產(chǎn)廠衛(wèi)生細菌檢驗方法》、日本東京冷凍食品檢驗方法。采樣與檢測方法：

3.1空氣的采樣與測試方法 3.1.1樣品采集：(1)取樣頻率：

a)車間轉(zhuǎn)換不同衛(wèi)生要求的產(chǎn)品時，在加工前進行采樣，以便了解車間衛(wèi)生清掃消毒情況。b)全廠統(tǒng)一放長假后，車間生產(chǎn)前，進行采樣。

c)產(chǎn)品檢驗結(jié)果超內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)時，應(yīng)及時對車間進行采樣，如有檢驗不合格點，整改后再進行采樣檢驗。

d)實驗性新產(chǎn)品，按客戶規(guī)定頻率采樣檢驗。e)正常生產(chǎn)狀態(tài)的采樣，每周一次。（2）采樣方法

在動態(tài)下進行，室內(nèi)面積不超過30 m2，在對角線上設(shè)里、中、外三點，里、外點位置距墻1 m；室內(nèi)面積超過30 m2，設(shè)東、西、南、北、中五點，周圍4點距墻1 m。采樣時，將含平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基的平板(直徑9 cm)置采樣點(約桌面高度)，并避開空調(diào)、門窗等空氣流通處，打開平皿蓋，使平板在空氣中暴露5 min。采樣后必須盡快對樣品進行相應(yīng)指標(biāo)的檢測，送檢時間不得超過6h，若樣品保存于0～4℃條件時，送檢時間不得超過24h。3.1.2菌落培養(yǎng)：

（1）在采樣前將準(zhǔn)備好的平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基平板置37℃±1℃培養(yǎng)24 h，取出檢查有無污染，將污染培養(yǎng)基剔除。（2）將已采集樣品的培養(yǎng)基在6 h內(nèi)送實驗室，細菌總數(shù)于37℃±1℃培養(yǎng)48h觀察結(jié)果，計數(shù)平板上細菌菌落數(shù)。（3）菌落計算：

a)記錄平均菌落數(shù)，用“個/皿”來報告結(jié)果。用肉眼直接計數(shù)，標(biāo)記或在菌落計數(shù)器上點計，然后用5～10倍放大鏡檢查，不可遺漏。

b)若培養(yǎng)皿上有2個或2個以上的菌落重疊，可分辨時仍以2 個或2個以上菌落計數(shù)。3.2工作臺（機械器具）表面與工人手表面采樣與測試方法： 3.2.1樣品采集：(1)取樣頻率：

a)車間轉(zhuǎn)換不同衛(wèi)生要求的產(chǎn)品時，在加工前進行擦拭檢驗，以便了解車間衛(wèi)生清掃消毒情況。

b)全廠統(tǒng)一放長假后，車間生產(chǎn)前，進行全面擦拭檢驗。

c)產(chǎn)品檢驗結(jié)果超內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)時，應(yīng)及時對車間可疑處進行擦拭，如有檢驗不合格點，整改后再進行擦拭檢驗。

d)實驗新產(chǎn)品，按客戶規(guī)定擦拭頻率擦拭檢驗。e)對工作表面消毒產(chǎn)生懷疑時，進行擦拭檢驗。f)正常生產(chǎn)狀態(tài)的擦拭，每周一次。（2）采樣方法：

a)工作臺（機械器具）：用浸有滅菌生理鹽水的棉簽在被檢物體表面（取與食品直接接觸或有一定影響的表面）取25cm2 的面積，在其內(nèi)涂抹10次，然后剪去手接觸部分棉棒，將棉簽放入含10mL滅菌生理鹽水的采樣管內(nèi)送檢。

b)工人手：被檢人五指并攏，用浸濕生理鹽水的棉簽在右手指曲面，從指尖到指端來回涂擦10次，然后剪去手接觸部分棉棒，將棉簽放入含10mL滅菌生理鹽水的采樣管內(nèi)送檢。（3）采樣注意事項： 擦拭時棉簽要隨時轉(zhuǎn)動，保證擦拭的準(zhǔn)確性。對每個擦拭點應(yīng)詳細記錄所在分場的具體位置、擦拭時間及所擦拭環(huán)節(jié)的消毒時間 3.2.2 細菌·大腸菌群的檢測培養(yǎng): 樣液稀釋：將放有棉棒的試管充分振搖。此液為1：10稀釋液。如污染嚴重，可十倍遞增稀釋，吸取1ml 1：10樣液加9ml無菌生理鹽水中，混勻，此液為1：100稀釋液。3.2.2.1 細菌總數(shù)：

（1）以無菌操作，選擇1～2個稀釋度各取1ml樣液分別注入到無菌平皿內(nèi)，每個稀釋度做兩個平皿（平行樣），將已融化冷至45℃左右的平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基傾入平皿，每皿約15ml，充分混合。

（2）待瓊脂凝固后，將平皿翻轉(zhuǎn)，置36℃±1℃培養(yǎng)48 h后計數(shù)。（3）結(jié)果報告：報告每25cm2食品接觸面中或每只手的菌落數(shù) 3.2.2.2大腸菌群：（1）平板法: a)以無菌操作，選擇1～2個稀釋度各取1ml樣液分別注入到無菌平皿內(nèi)，每個稀釋度做兩個平皿（平行樣），將已融化冷至45℃左右的去氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基傾入平皿，每皿約15ml，充分混合。待瓊脂凝固后,再覆蓋一層培養(yǎng)基，約3-5 ml。

b)待瓊脂凝固后，將平皿翻轉(zhuǎn)，置36℃±1℃培養(yǎng)24h后計數(shù)。c)結(jié)果計算：以平板上出現(xiàn)紫紅色菌落的個數(shù)乘以稀釋倍數(shù)得出。d)結(jié)果報告：報告每25cm2食品接觸面中或每只手的菌落數(shù)（2）試管法: a)以無菌操作，選擇3個稀釋度各取1ml樣液分別接種到BGLB肉湯培養(yǎng)基中，每個稀釋度接種三管。

b)置BGLB肉湯管于36℃±1℃培養(yǎng)48±2h。記錄所有BGLB肉湯管的產(chǎn)氣管數(shù)。

c)結(jié)果報告：按BGLB肉湯管產(chǎn)氣管數(shù)，查MPN表報告每25cm2食品接觸面中或每只手的大腸菌群值。

3.2.3 金黃色葡萄球菌檢測（1）定性檢測

a)取1ml 稀釋液注入滅菌的平皿內(nèi)，傾注15-20ml的B-P培養(yǎng)基，（或是吸取0.1稀釋液，用L棒涂布于表面干燥的B-P瓊脂平板），放進36±1℃的恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)48±2小時。b)從每個平板上至少挑取1個可疑金黃色葡萄球菌的菌落作血漿凝固酶實驗。

c)結(jié)果報告：B-P瓊脂平板的可疑菌落作血漿凝固酶實驗為陽性，即報告手（工器具）上有金黃色葡萄球菌存在。（2）定量檢測 a)以無菌操作，選擇3個稀釋度各取1ml樣液分別接種到含10﹪氯化鈉胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基中，每個稀釋度接種三管。

b)置肉湯管于36±1℃的恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)48小時。劃線接種于表面干燥的B-P瓊脂平板，置36℃±1℃培養(yǎng)45～48小時。

c)從B-P瓊脂平板上，挑取典型或可疑金黃色葡萄球菌菌落接種肉湯培養(yǎng)基，36℃±1℃培養(yǎng)20～24小時。

d)取肉湯培養(yǎng)物做血漿凝固酶試驗，記錄試驗結(jié)果。

e)報告結(jié)果：根據(jù)凝固酶試驗結(jié)果，查MPN表報告每25 cm2食品接觸面中或每只手的金黃色葡萄球菌值。

3.3工廠環(huán)境中病原體的檢測計劃與方法

檢測計劃：為了保證食品安全，工廠應(yīng)該對生產(chǎn)環(huán)境中的病原微生物進行檢測和評估，檢測項目包括李斯特菌，沙門氏菌等病原體微生物，化驗室應(yīng)該按照一定的計劃對生產(chǎn)場所環(huán)境中的病原體進行檢測，其中包括地面、下水道、排水溝、墻壁、天花板、設(shè)備框架、運輸?shù)闹Ъ埽洳匮b置、速凍機、傳送帶、設(shè)備的螺絲、維修工具等部位。當(dāng)某個點檢測到病員微生物時，應(yīng)該對環(huán)境中的相似點加大檢測頻率；在把所有的預(yù)定點檢測完后，應(yīng)該對環(huán)境中的病原微生物的存在狀況進行全面評估，在下一次環(huán)境檢測循環(huán)過程中加強檢測容易出現(xiàn)病原體的環(huán)境點，達到持續(xù)改進的目的。

檢測頻率: 每月兩次,每次每個區(qū)域至少選取5個檢測點,分別進行檢測。

3.3.1 環(huán)境李斯特菌的檢測方法（3MTM PetrifilmTM 環(huán)境李斯特菌的測試片）3.3.1.1 用涂抹棒，海綿或者其他采樣設(shè)備收集環(huán)境樣本。

3.3.1.2 將收集的樣本添加10毫升滅菌的緩沖蛋白胨水，將樣本與緩沖蛋白胨混合1分鐘，將樣品置于室溫（20-30℃）1小時，最久不超過1.5小時，以修復(fù)損傷的李斯特菌。3.3.1.3 將測試片放在平坦處，掀起上層膜。

3.3.1.4 用移液器垂直滴加3毫升樣品到下層膜中央，將上層膜緩慢蓋下，以免產(chǎn)生氣泡。3.3.1.5 輕輕將塑料壓板放在位于接種區(qū)上層膜上，不要壓，扭轉(zhuǎn)或者滑動壓板。提起壓板等至少十分鐘，以使膠體凝固。

3.3.1.6 將測試片透明面朝上，可疊放至十片，在37℃±1℃培養(yǎng)26-30小時，可以用標(biāo)準(zhǔn)菌落記數(shù)器或者其他光學(xué)放大器判讀，不要記數(shù)圓形輪廓上的菌落，因為他們不受選擇性培養(yǎng)基的影響。

3.3.1.7 對于定性檢測，根據(jù)紫紅色菌落是否存在，結(jié)果記為檢出或者未檢出。3.3.2 環(huán)境中沙門氏菌的檢測方法

3.3.2.1采樣地點: 選取采樣點時因盡量選取微生物容易滋生的地方 冷凍車間

FD車間

東區(qū)初加工

傳遞窗口表面、排水溝、排水溝出口、墻壁、地面

卸料間 墻壁、墻角、地面、天花板、物料車表面

東區(qū)精加工

地面、墻壁、墻角、排水溝、排水溝出口、速動機鏈條、天花板

暫存間

墻壁、地面、天花板、墻角、墻縫

西區(qū)初加工

傳遞窗口表面、地面、墻壁、排水溝、排水溝出口

挑選間

墻壁、地面、天花板、墻角、墊板

西區(qū)精加工

地面、墻壁、墻角、排水溝、排水溝出口、速動機鏈條、天花板

包裝室

墻壁、地面、天花板、金探傳送帶表面、落地料存放處

3.3.2.2 操作步驟

3.3.2.2.1采樣應(yīng)在生產(chǎn)開始后進行，用已浸潤過的棉拭在選定的被測表面旋轉(zhuǎn)涂抹約100cm2的面積，然后將棉拭放回涂抹試管并蓋緊。3.3.2.2.2將樣品帶回實驗室，每5個點混合成一個樣品, 登記編號,按照SN0170-92標(biāo)準(zhǔn)及時檢測，若有陽性結(jié)果出現(xiàn)，應(yīng)逐步對所混合的每個點分別檢測。

物體表面涂抹菌落總數(shù)計算方式：物體表面細菌總數(shù)（cfu/c㎡）=平皿上菌落的平均數(shù)*采樣液稀釋倍數(shù)/采樣面積（cm2）

根椐GB15979－2002《一次性衛(wèi)生用品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》的標(biāo)準(zhǔn),生產(chǎn)環(huán)境衛(wèi)生指標(biāo) 1 裝配與包裝車間空氣中細菌菌落總數(shù)應(yīng)≤2 500 cfu/m3。2 工作臺表面細菌菌落總數(shù)應(yīng)≤20 cfu/cm2。

3.工人手表面細菌菌落總數(shù)應(yīng)≤300 cfu/只手，并不得檢出致病菌。人員和環(huán)境衛(wèi)生檢測方法

一、空氣采樣及檢驗方法

1培養(yǎng)基：普通營養(yǎng)瓊脂平板，按GB4789.28中3.7條配制 2采樣（空氣沉降法）

2.1布點：面積小于30平方米的車間，設(shè)一對角線，在線上取3點，即中心一點，兩端在距墻1米處各取一點；面積大于30平方米的車間，設(shè)東、西、南、北、中5個點，其中東、西、南、北點均距墻1米。

2.2采樣高度：與地面垂直高度80-150厘米。

2.3采樣方法；用直徑為9厘米的普通營養(yǎng)瓊脂平板在采樣點上暴露20分鐘蓋上送檢培養(yǎng)。3培養(yǎng)：于37℃培養(yǎng)24小時。4檢測頻率：每周 空氣質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)：

生車間、熟車間、成品車間：低于100個 半成品庫、成品庫：低于10個

二、設(shè)備的采樣與檢驗方法

根據(jù)生產(chǎn)過程所要求的重點衛(wèi)生部位，實驗室對其進行涂抹采樣，進行細菌總數(shù)檢驗。1采樣方法

1.1涂抹法（適用于表面平坦的設(shè)備和工器具產(chǎn)品接觸面）

取經(jīng)過滅菌的鋁片框（框內(nèi)面積為50平方厘米）放在需檢查的部位上，用無菌棉球蘸上無菌生理鹽水擦拭鋁片中間方框部分，擦完后立即將棉球投入盛有10毫升無菌生理鹽水的試管中，此液每毫升代表5平方厘米。

1.2貼紙法（適用于表面不平坦的設(shè)備和工器具接處面）

將無菌規(guī)格紙（5×5厘米，紙質(zhì)要薄而軟）用無菌生理鹽水泡濕后，于需測部分分別貼上兩張，兩張紙面積共50平方厘米，然后取下放入盛有10毫升無菌生理鹽水的試管中，此液每毫升代表5平方厘米。2檢驗方法

2.1細菌總數(shù)的檢驗

將上述樣液充分振搖，根據(jù)衛(wèi)生情況，相應(yīng)地做10倍遞增稀釋，選擇其中2-3個合適的稀釋度作平皿傾注培養(yǎng)，培養(yǎng)基用普通營養(yǎng)瓊脂，每個稀釋度作2個平皿，每個平皿注入1毫升樣液，于37℃培養(yǎng)24小時后計菌落數(shù)。結(jié)果計算

表面細菌總數(shù)（cfu/cm2）=平皿上菌落的平均數(shù)×樣液稀釋倍數(shù)/30×2 2.2致病菌的檢驗

沙門氏菌，參照GB4789.4進行 金黃色葡球菌，參照GB7918.5進行

4.檢驗合格標(biāo)準(zhǔn)：細菌總數(shù)10－100個∕cm2，5.關(guān)鍵點：細菌總數(shù)≤10個∕cm2 一般區(qū)域：細菌總數(shù)≤100個∕cm2

三、人員手表面細菌污染情況的檢驗

1.采樣方法：用一支蘸有無菌生理鹽水的棉拭子涂擦被檢對象手的全部，反復(fù)兩次，涂擦的時候棉拭子要相應(yīng)地轉(zhuǎn)動，擦完后，將手接觸部分剪去，將棉拭子放入裝有10毫升無菌生理鹽水的試管內(nèi)送檢培養(yǎng)。

2.檢驗方法：同工器具表面細菌總數(shù)檢驗方法。

3.結(jié)果計算：每只手表面的細菌總數(shù)（cfu/只手）=平皿上菌落的平均數(shù)×樣液稀釋倍數(shù)

四、消毒液藥效的微生物學(xué)鑒定法

1采樣對象：正常使用的消毒液，和已知配制好備用的消毒液 2采樣及檢驗方法

在無菌條件下，用無菌吸管吸取1毫升樣液，加入9毫升稀釋液中混勻，對于醇類與酚類消毒劑，稀釋液用普通營養(yǎng)肉湯即可；對于含氯消毒劑、含碘消毒劑，需在肉湯中加入0.1%硫代硫酸鈉，對洗必泰、季銨鹽類消毒劑，需在肉湯中加入3%（W/V）土溫80和0.3%卵磷脂；對醛類消毒劑，需在肉湯中加入0.3%甘氨酸；對于含有表面活性劑的各種復(fù)方消毒劑，需在肉湯中加入（W/V）土溫80，以中和被檢樣液中的殘效作用，將注入了樣液的稀釋液充分搖勻，取1毫升注入平皿，隨之倒入普通營養(yǎng)瓊脂，待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平皿，將平皿于37℃條件下培養(yǎng)24小時后計平板上生長的菌落數(shù)。3結(jié)果分析

平板上有菌生長，表明被檢樣液中有殘存活菌，若每個平板菌落數(shù)在10個以下，仍可用于消毒，若每個平板菌落數(shù)超過10個，說明每毫升被檢樣液含菌量已超過100個，即不宜在用于消毒。

該公式是一個經(jīng)驗公式.它的理論模式依據(jù)是:100CM2的面積上10MIN降落的菌落數(shù), 等于1升空氣中所含的細菌總數(shù).系數(shù)50000基于上述假說和單位換算而來.細菌總數(shù)(CFU/M3)=5/10T*100/A*1000*N=50000*N/AT

5/10T:實際放置了5MIN;

100/A:A單一培養(yǎng)皿面積;

1000:1M3=1000L啊,換算成m3

1、空氣細菌落菌數(shù)單位既然是cfu/m3，那采樣時應(yīng)該還要記錄放置平皿的高度。

2、食品安全管理體系中罐頭行業(yè)有個標(biāo)準(zhǔn)如下：

落下菌數(shù)

空氣污染程度

評價

30以下

清潔

安全

30～50

中等清潔

50～70

低等清潔

應(yīng)加注意

70～100

高度污染

對空氣要進行消毒

100以上

嚴重污染

禁止加工

3、是否可根據(jù)企業(yè)相應(yīng)的加工產(chǎn)品微生物指標(biāo)進行自行制定？

第三篇：微生物檢測課后習(xí)題

緒論：

1.食品的衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容包括那些？感官指標(biāo)、理化指標(biāo)、微生物指標(biāo)

2.對食品進行微生物檢驗具有何意義？是衡量食品衛(wèi)生質(zhì)量的終于指標(biāo)，也是判斷被檢食品是否能食用的科學(xué)依據(jù)；可以判斷食品加工環(huán)境及食品衛(wèi)生的情況，為衛(wèi)生管理工作提供科學(xué)依據(jù)；可以有效地防止人畜共患病的發(fā)生；保證產(chǎn)品質(zhì)量，避免不必要的損失

3.食品微生物檢驗的范圍包括那些？生產(chǎn)環(huán)境的檢驗；原輔料的檢驗；食品加工、儲藏、銷售等環(huán)節(jié)的檢驗；食品的檢驗

4.食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中的微生物指標(biāo)有那些？菌落總數(shù)；大腸菌群；致病菌；霉菌及其毒素；其他指標(biāo) 菌落總數(shù)概念和測定意義

1.什么是菌落總數(shù)？是指食品檢驗經(jīng)過處理，在一定條件下培養(yǎng)后，所得1mL（g）或1cm2面積檢樣中所含菌落的總數(shù)

2.測定食品、飲料等產(chǎn)品的菌落總數(shù)有什么意義？（1）判定食品被細菌污染的程度及衛(wèi)生質(zhì)量（2）預(yù)測食品存用的期限長短（3）了解細菌在食品中的繁殖動態(tài)

3.畫出平板傾注法測定菌落總數(shù)的示意圖：步驟:檢樣—稀釋處理—選擇3個適宜稀釋度—倒平板—培養(yǎng)—菌落計數(shù)—報告結(jié)果

4.在測定菌落總數(shù)時，如何選擇菌落進行計數(shù)？(1)選取菌落數(shù)在30-300之間的平板,若有兩個稀釋度均在30-300之間時,比值小于或等于2取平均數(shù),比值大于2則取稀釋度較低平板菌落數(shù)(2)如均大于300，則取最高稀釋度的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告(3)如均小于30,則以最低稀釋度的平均菌落數(shù)乘稀釋倍數(shù)報告(4)如菌落數(shù)有的大于300,有的又小于30,不再30-300之間,以最接近300或30的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告(5)如所有稀釋度均無菌落生長,則應(yīng)按小于1乘以最低稀釋倍數(shù)報告

5.在菌落總數(shù)的檢驗中，要注意哪些事項？(1)對照平板出現(xiàn)幾個菌落時,要追加對照平板(2)吸管進出瓶子或試管時,吸管口不得觸及瓶口、管口的外圍部分（3）吸管插入試樣液內(nèi)的深度不得小于2.5cm，調(diào)整時要使管尖與容器內(nèi)壁緊貼（4）進行稀釋時，吸管口不得與稀釋液接觸（5）檢驗從開始稀釋到傾注最后一個平皿所用時間不宜超過20min（6）稀釋倍數(shù)越高菌落數(shù)越少，如出現(xiàn)逆反現(xiàn)象，不可作為檢樣計數(shù)報告的依據(jù)。

6.在菌落總數(shù)的檢驗中，如何根據(jù)樣品的特性選擇培養(yǎng)溫度和時間？普通食品37℃48h倒放平板；清涼飲料、調(diào)味品、糕點、酒類：37℃24h；水產(chǎn)品：30℃48h 大腸菌群測定

1.什么是大腸菌群？大腸菌群由那些微生物組成？指一群需氧及兼性厭氧，在37℃能分解乳糖，產(chǎn)酸產(chǎn)氣的革蘭氏染色陰性無芽孢桿菌；組成：大腸埃希氏菌屬、檸檬酸桿菌屬、產(chǎn)氣克雷伯氏菌屬、陰溝腸桿菌

2.測定食品、飲料等產(chǎn)品的大腸菌群數(shù)有什么意義？（1）判斷食品是否受到糞便的污染（2）有利于控制腸道傳染病的發(fā)生和流行（3）有利于控制食品在生產(chǎn)加工、運輸、保存等過程中的衛(wèi)生狀況

3.大腸菌群具有那些生物學(xué)特性？形態(tài)與染色：革蘭氏陰性，無芽孢桿菌，發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣；培養(yǎng)特性：在EMB瓊脂平板上的典型菌落：呈深紫黑色或中心深紫黑色，圓形，稍凸起，邊緣整齊，表面光滑，常有金屬光澤

4.在大腸菌群數(shù)的檢驗中，要注意哪些事項？（1）抑菌劑（2）菌落特征（3）產(chǎn)氣量（4）MPN檢索表

5.在水的大腸菌群數(shù)檢驗中，如何進行水樣的采集？自來水（未含氟）：龍頭火燒滅菌，暢流5-10秒后取樣；地面水源水，江湖河，水庫，水池等浸入水下20cm下取樣，水井50cm下取樣；漂白粉處理的水樣：自來水，游泳池水，應(yīng)在瓶內(nèi)加入0.03g硫代硫酸鈉/500,或2ml1.5%硫代硫酸鈉液/500ml,除氯;運送:2小時內(nèi)送檢.6-10℃<6h立即檢驗;檢驗前將水樣震蕩5-10min 病原性球菌檢測

1.金黃色葡萄球菌可產(chǎn)生哪些毒素和酶?溶血毒素；殺白細胞素；血漿凝固酶；脫氧核糖核酸酶；腸毒素；溶纖維蛋白酶；透明質(zhì)酸酶

2.金黃色葡萄球菌在B-P平板上的菌落特征如何?說明其原理？特征：圓形，光滑凸起，濕潤，成灰色至黑色，邊緣色淡周圍為渾濁帶，在其外層有一透明帶；原理：氯化鋰、甘氨酸：抑制非致病性葡萄球菌的生長；丙酮酸鈉：促進葡萄球菌生長；亞碲酸鉀：抑制G-桿菌生長，可被金黃色葡萄球菌還原為碲鹽呈黑色。

3.金黃色葡萄球菌在血平板上的菌落特征如何?菌落呈金黃色，大而突起，圓形，不透明，表面光滑，周圍有透明溶血圈（β型）

4.確認葡萄球菌為金黃色葡萄球菌的依據(jù)至少應(yīng)該包括那幾個試驗? 5.金黃色葡萄球菌的形態(tài)與染色、培養(yǎng)特征如何？形態(tài)與染色：革蘭氏陽性球形菌，排列呈葡萄狀。無芽孢、鞭毛，大多數(shù)無莢膜，可分解葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣；培養(yǎng)特征：需氧或兼性厭氧，最適生長溫度37℃、PH7.4；對營養(yǎng)要求不高，在普通培養(yǎng)基中生長良好，加少量葡萄糖或血液生長更旺盛；耐鹽性強，在含NaCL7.5-15%培養(yǎng)基中能生長；在肉湯中是渾濁生長，時間過長，有少量沉淀；在普通培養(yǎng)基上生長，可形成圓形凸起，表面光滑，邊緣整齊，不透明，直徑1—2mm的菌落能產(chǎn)生黃色色素；血瓊脂平板：菌落大、產(chǎn)生完全溶血圈；BP平板：灰色到黑色邊緣淡，菌落周圍有一渾濁帶，在其外有一透明帶

食品中溶血性鏈球菌的檢驗

1.鏈球菌的溶血現(xiàn)象有那幾個類型，各類型的溶血特征如何？甲型α-溶血性鏈球菌（菌落周圍有1-2mm寬的草綠色溶血環(huán)，也稱甲型溶血，這類鏈球菌多為條件致病菌。）、乙型β-溶血性鏈球菌（菌落周圍形成一個2-4mm寬、界限分明、完全透明的無色溶血環(huán)，也稱乙型溶血，該菌的致病力強，常引起人類和動物的多種疾病，與人類疾病有關(guān)的血清型90%屬于A族鏈球菌）、丙型γ-鏈球菌（不產(chǎn)生溶血素，菌落周圍無溶血環(huán)，也稱為丙型或不溶血性鏈球菌，該菌無致病性，常存在于乳類和糞便中，偶爾也引起感染。）

2.溶血性鏈球菌在血平板和葡萄糖肉湯中生長有何特征？在血平板上形成灰白色，半透明、表面光滑、有乳光圓形突起的細小菌落，直徑0.5-0.75mm，針尖大小，菌落周圍出現(xiàn)溶血環(huán)；在葡萄糖肉湯中：

3.溶血性鏈球菌能產(chǎn)生什么毒素和酶？溶血毒素、致熱外毒素、透明質(zhì)酸酶、鏈激酶、鏈道酶、殺白細胞素

4.寫出鏈球菌的檢驗程序，并說明鏈激酶的反應(yīng)原理。檢驗程序：固體檢驗—樣品處理—增菌培養(yǎng)—分離培養(yǎng)—純化培養(yǎng)—生化鑒定—報告；原理： 腸道致病菌

1.腸道致病菌具有那些生物性特性？均為革蘭氏陰性桿菌，中等大小，無芽孢，多數(shù)具有周鞭毛能運動；需氧或兼性厭氧，菌落中等大小，表面光滑，液體培養(yǎng)基渾濁生長；腸道致病菌一般不分解乳糖，而非致病菌多能分解乳糖、葡萄糖產(chǎn)酸或產(chǎn)酸產(chǎn)氣；可還原硝酸鹽為亞硝酸鹽

2.腸道致病菌具有那些抗原？又稱為什么？有什么特點？O抗原：也稱菌體抗原，細胞壁脂多糖，耐熱100℃不被破壞

H抗原：也稱鞭毛抗原，鞭毛蛋白，不耐熱，60℃30’可破壞

K抗原:也稱表面抗原(莢膜抗原),多糖,具有阻抑O抗原發(fā)生凝集的現(xiàn)象,加熱60℃30’可消除抑阻作用 菌毛抗原: 3.寫出腸道致病菌檢驗的基本程序？檢樣—處理—增菌培養(yǎng)—分離培養(yǎng)—生化實驗—血清學(xué)鑒定—報告 沙門氏菌

1．典型沙門氏菌的五項生化試驗結(jié)果如何？

2.沙門氏菌的形態(tài)特征，培養(yǎng)特性是什么？形態(tài)特征：革蘭氏染色陰性，無莢膜，無芽孢，多數(shù)有鞭毛，有動力，短小桿菌；培養(yǎng)特性：需氧或兼性厭氧，最適溫37，PH7.2-7.4；對營養(yǎng)要求不高，在普通培養(yǎng)基上生長良好，37，24h能形成菌落中等大小，直徑2-3mm，圓形或卵圓形，表面光滑濕潤，無色半透明，邊緣整齊的菌落；在液體培養(yǎng)基中，呈均勻渾濁性生長，無菌膜。3.沙門氏菌檢驗時為什么要進行前增菌和增菌？

4.沙門氏菌有哪些抗原？各有何特點？O、H抗原如何表示，A-F群沙門氏菌中，代表每群O特異性抗原的獨特因子是什么？O抗原（主要抗原OA~OZ，O51~63，O65~67）、H抗原、表面抗原（K抗原）、菌毛抗原。

5.沙門氏菌哪幾個菌型具有Vi抗原，Vi抗原對O抗原血清連實驗有何影響，對含Vi抗原菌，如何做O抗原血清學(xué)實驗？含有Vi 抗原的沙門氏菌：傷寒沙門氏菌、丙型副傷寒沙門氏菌、都柏林沙門氏菌。Vi抗原位于菌體的最表層，包圍了O抗原，可阻礙O抗原的血清學(xué)凝集試驗。破壞Vi抗原：60℃30秒，100℃5秒，石炭酸處理或人工培養(yǎng)后消失。

6.沙門氏菌在SS平板，TSI培養(yǎng)基上生長的現(xiàn)象如何，說明其原理

7.分離純化后怎樣選用最少的生化試驗方法初步鑒定檢驗菌是否是沙門氏菌屬的細菌

8.如何進行沙門氏菌的血清學(xué)試驗 志賀氏菌 1.志賀氏菌分幾個群各稱為什么？抗原結(jié)構(gòu)如何？K抗原對O抗原試驗有何影響？A群痢疾志賀氏菌、B群福氏志賀氏菌、C群鮑氏志賀氏菌、D群宋內(nèi)氏志賀氏菌；抗原結(jié)構(gòu)：ABCD均是O抗原；A群、C群具有K抗原；影響：K抗原可阻礙O抗原的血清學(xué)凝集實驗，煮沸處理即可。

2.寫出志賀氏菌、沙門氏菌、大腸桿菌在SS、EMB平板上生長的菌落特征？志賀氏菌：無色透明，不發(fā)酵乳糖，中等大小，光滑圓形菌落；沙門氏菌：SS圓形或卵圓形，表面光滑濕潤，無色半透明，邊緣整齊的菌落；大腸桿菌：EMB呈深紫黑色或中心深紫色，圓形，稍凸起，邊緣整齊，表面光滑，常有金屬光澤

3.志賀氏菌在三糖鐵培養(yǎng)基上生長結(jié)果如何？斜面產(chǎn)堿仍為紅色或粉紅色；底層產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，變黃色；不產(chǎn)硫化氫，不出現(xiàn)黑色。

4.在志賀氏菌中，接種三糖尿病鐵培養(yǎng)基和葡萄糖半固體培養(yǎng)基后，那些培養(yǎng)物可認為不屬于本菌生長現(xiàn)象的范圍而可棄去？在TSI表面上呈現(xiàn)蔓延生長的培養(yǎng)物；在18h-24h發(fā)酵乳糖、蔗糖的培養(yǎng)物；不分解葡萄糖，只在半固體培養(yǎng)基表面生長的培養(yǎng)物；產(chǎn)氣的培養(yǎng)物；有動力的培養(yǎng)物；產(chǎn)硫化氫的培養(yǎng)物。5.如何用生化反應(yīng)來區(qū)分志賀氏菌各群？用4中志賀氏菌多價血清檢查，如果呈現(xiàn)凝集，則用A1，A2、B群多價和D群血清分別試驗；如是B群，則喲個群和型因子血清分別檢查；4中志賀氏菌多價血清不凝集的菌株用鮑氏多價1、2、3分別檢查，并進一步用1-15各型因子血清檢查。如果鮑氏多價血清不凝集，可用痢疾志賀氏菌3-12型多價血清及各型因子血清檢查。

6.寫出沙門氏菌、志賀氏菌的檢驗程序及其所用培養(yǎng)基。沙門氏菌：檢驗—增菌（前增菌）--分離培養(yǎng)—生化實驗初步鑒定—血清學(xué)反映最后鑒定—報告；培養(yǎng)基：BS瓊脂平板和XLD瓊脂平板；志賀氏菌：檢驗—樣品處理—增菌培養(yǎng)—SS、EMB平板分離培養(yǎng)—初步生化鑒定—最后血清學(xué)鑒定—報告。培養(yǎng)基：強選擇性（SS或HE）、弱選擇性（EMB或麥康凱）副溶血性弧菌

1.副溶血性弧菌的形態(tài)與染色有和特點？革蘭氏陰性無芽孢多形態(tài)桿菌，單端鞭毛、兩端濃染。桿狀、棒狀、甚至球狀、絲狀等；需氧或兼性厭氧，生長最好；在2~3%NaCL培養(yǎng)基中生長最好,無鹽或食鹽>10%不能生長;最適溫度36℃,PH7.5-7.8;在專用選擇性平板上,菌落呈圓形凸起,渾濁不透明,表面光滑,較濕潤,邊緣不整齊;血平板:可見溶血環(huán)

2.副溶血性弧菌的生化特性中最有特點的是那個項目，如何利用這個項目，診斷某細菌是否是副溶血性弧菌？

3.副溶血性弧菌在TSI，Nacl蔗糖，嗜鹽選擇性平板上培養(yǎng)特征如何？Nacl蔗糖平板：圓形，半透明或不透明，無粘性，綠藍色；嗜鹽性平板：圓整或不齊，隆起混濁，無粘性，無色，濕潤。鏡檢：兩端濃染 蠟樣芽孢桿菌

1.引起蠟樣芽孢桿菌事物中毒的常見食物有那些？什么條件下可引起蠟樣芽孢桿菌食中毒？乳類、肉類、米飯、淀粉類、甜點心、涼拌蔬菜，水果，色拉 2.蠟樣芽孢桿菌的形態(tài)與染色特性如何？革蘭氏陽性大桿菌，芽孢不突出菌體，菌體兩端較平整，多數(shù)呈鏈狀排列，周身鞭毛，有動力

3.蠟樣芽孢桿菌在普通營養(yǎng)瓊脂和甘露醇卵黃多粘菌瓊脂平板上生長的菌落特征如何？普通：菌落灰白色，不透明，邊緣不整齊，表面粗糙，呈毛玻璃狀或白蠟狀；甘露醇卵黃多粘菌素平板：菌落呈粉紅色，具有白色渾濁環(huán)。血平板：菌落呈淺灰色，不透明，似白色毛玻璃狀，有溶血環(huán)。4.寫出蠟樣芽孢桿菌檢驗的基本程序？檢驗—稀釋處理—平板分離—證實實驗—培養(yǎng)特性觀察—生化實驗—報告結(jié)果 霉菌、酵母菌數(shù)測定

列表說明霉菌、酵母菌數(shù)的測定與菌落總數(shù)的測定有什么不同的地方和相同的地方？

檢驗程序：檢驗—處理—稀釋—平板分離培養(yǎng)—菌落計數(shù)—報告 罐頭類

1.罐頭食品的商業(yè)無菌檢驗中，保溫的目的是什么？目的：觀察是否胖聽或泄漏 2.在罐頭食品的商業(yè)無菌檢驗中，開罐前要做好那些準(zhǔn)備工作？用75%酒精稀球擦試無代號端，并點燃滅菌（胖聽不能燒），然后開罐，但不能傷及卷邊結(jié)構(gòu)。3.如何判斷罐頭為商業(yè)無菌？該批罐頭食品經(jīng)審查生產(chǎn)記錄，屬于正常，抽取樣品經(jīng)保溫試驗未見胖聽或泄漏，保溫后開罐，經(jīng)感官檢查PH測定，涂片鏡檢，或接種培養(yǎng)，確證無M增殖現(xiàn)象。

第四篇：微生物檢測技術(shù)復(fù)習(xí)資料

名詞解釋

1病原微生物：感染人、動植物，導(dǎo)致疾病發(fā)生的有害微生物。

2無菌操作：用于防止微生物進入人體組織或其它無菌范圍的操作技術(shù)稱為無菌操作 3滅菌：用物理和化學(xué)方法殺滅或清除傳播媒介上一切微生物的方法

4菌落總數(shù)：指食品檢樣經(jīng)過處理，在一定條件下培養(yǎng)后所得1g或1mL檢樣中所含細菌菌落的總數(shù)。

5大腸菌群：寄居于人及溫血動物腸道內(nèi)的腸居菌，隨大便排出體外。食品中大腸菌群數(shù)越多，說明食品受糞便污染的程度越大。微生物：一切肉眼看不見或看不清楚的微小生物的總稱。包括病毒、細菌、真菌、原生動物和某些藻類。

7微生物檢測：基于微生物學(xué)的基本理論，利用微生物實驗技術(shù)，根據(jù)各類產(chǎn)品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的要求，研究產(chǎn)品中微生物的種類、性質(zhì)、活動規(guī)律等，用以判斷環(huán)境、產(chǎn)品等衛(wèi)生質(zhì)量的一門應(yīng)用技術(shù)。菌落：將細菌接種在固體培養(yǎng)基上經(jīng)18∽24小時培養(yǎng)，長出肉眼可見的來源于一個細胞的細菌集團。莢膜：在某些細菌細胞外壁外存在著一層松散透明、厚度不定的膠狀物質(zhì)叫莢膜。10消毒：殺滅或清除傳播媒介上病原微生物,使其達到無害化的FF。

填空簡答

1飲用水的微生物檢測

大腸菌群是指示水質(zhì)受糞便污染的指示菌，細菌總數(shù)指示水體受污染物污染的情況。我國GB5749-85《中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn) 生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》中規(guī)定生活飲用水細菌總數(shù)每毫升不得超過100個，大腸菌群每升不得超過3個。培養(yǎng)基的分類（按物理性質(zhì)）：液體、固體、半固體、脫水培養(yǎng)基

3病毒的組成：核酸和蛋白質(zhì)革蘭氏染色：陰紅陽紫 5 細菌特殊結(jié)構(gòu)的功能：

鞭毛：是細菌的運動器官，鞭毛菌在液體環(huán)境下可自由移動，速度迅速，抗原性 1化學(xué)趨向性運動，有助于細菌向營養(yǎng)物質(zhì)處前進，而逃離有害物質(zhì).2.與細菌致病性相關(guān)

3.可用以細菌的鑒定和分類

菌毛：菌毛是在某些細菌表面存在著一種比鞭毛更細、更短而直硬的絲狀物，須用電鏡觀察。特點是：細、短、直、硬、多，菌毛與細菌運動無關(guān)，根據(jù)形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能，可分為普通菌毛和性菌毛兩類。前者與細菌吸附和侵染宿主有關(guān)，后者為中空管子，與傳遞遺傳物質(zhì)有關(guān)。

芽孢：芽孢是細菌的休眠體，對不良環(huán)境有較強的抵抗能力。耐熱性、抗逆性強（抗熱、抗輻射、抗化學(xué)物質(zhì)和抗靜水壓等能力）

莢膜：①抗吞噬作用②黏附作用③抗有害物質(zhì)的損傷作用④抗干燥作用⑤當(dāng)缺乏營養(yǎng)時，莢膜可被利用作碳源和能源，有的莢膜還可作氮源。肺炎雙球菌：光滑型(簡稱S型)產(chǎn)生莢膜，有毒；粗糙型(簡稱R型)不產(chǎn)生莢膜，無毒。7 芽孢：抗逆性強

8瘋牛病

牛海綿狀腦?。˙ovine spongiform encephalopathy, BSE），又稱瘋牛病，是一種侵犯牛中樞神經(jīng)系統(tǒng)的慢性的致命性疾病，由一種非常規(guī)的病毒——朊病毒（Prion）引起的一種亞

急性海綿狀腦病，這類病還包括綿羊的搔癢病、人的克-雅氏?。–reutzfeldt-Jakob Syndrome , CJD）（又稱早老癡呆癥）、庫魯病以及最近發(fā)現(xiàn)的致死性家庭性失眠癥等等。

朊病毒是一類非正常的病毒，它不含有通常病毒所含有的核酸，而是一種不含核酸僅有蛋白質(zhì)的蛋白感染因子。

朊病毒屬于亞病毒，亞病毒包括：類、擬、朊病毒三類。人類三大流行病原：線蟲（原生、無脊椎動物動物）分類：包括自由生活線蟲（海洋、淡水和土壤中）和危害植物的病原線蟲人類病原真菌的分類：

1）淺部真菌：侵犯皮膚、毛發(fā)、指甲，為慢性，頑固性，但影響身體較?。?/p>

2）深部真菌：可侵犯全身內(nèi)臟，嚴重的可引起死亡。

3）此外，有些真菌寄生于糧食、飼料、食品中，能產(chǎn)生毒素引起中毒性真菌病。12原核微生物常見類群

1）真細菌：細菌、放線菌、藍細菌、支原體、立克次氏體和衣原體

2）古生菌 13真菌類群

鞭毛菌亞門、接合菌亞門、子囊菌亞門、擔(dān)子菌亞門、半知菌亞門細菌的基本形態(tài)

細菌的種類雖然很多，但其基本形態(tài)只有三種：球菌（葡萄球菌、雙球菌、鏈球菌、四聯(lián)球菌、八疊球菌）、桿菌、螺旋菌（弧菌和螺菌）。15 病毒的分類

1）按感染的對象分

動物病毒、植物病毒、細菌病毒、昆蟲病毒及真菌病毒，另外尚有亞病毒——類病毒(Viroids)擬病毒(Virusoid)和朊病毒(Prion)。

2）按遺傳物質(zhì)分類分

DNA病毒和RNA病毒兩大類

（噬菌體寄生于細菌中病毒的總稱。）高壓蒸汽滅菌指標(biāo)： 0.10MPa，121℃，20min左右純種分離的技術(shù)方法

1）固體培養(yǎng)基純種分離技術(shù):① 稀釋倒平板法；② 涂布平板法 ③平板劃線分離法；④稀釋搖管法——厭氧微生物的分離

2）液體培養(yǎng)基純種分離技術(shù)——稀釋法（不可靠）

3）單細胞（孢子）分離——顯微分離

4）選擇培養(yǎng): ① 選擇平板培養(yǎng)② 富集培養(yǎng)

問答題

1、微生物有益方面

1）微生物與糧食增產(chǎn)

固氮、解磷、解鉀、生長激素、分解大分子碳源等促生產(chǎn)功能，抗病蟲害。

2）微生物與能源供應(yīng)

產(chǎn)乙醇、產(chǎn)甲烷、分解長鏈烴或脂肪酸為短鏈燃料，微生物電池、微生物采油。

3）微生物與資源開發(fā)

發(fā)酵產(chǎn)乙醇、丙酮、水楊酸等化工產(chǎn)品。

4）微生物與環(huán)境保護

微生物修復(fù):重金屬、降解塑膠廢品、凈化污水、監(jiān)測環(huán)境污染等。

5）微生物與人類健康

生物制品：菌苗、疫苗、類毒素等；

代謝產(chǎn)物：胰島素、白細胞介素、干擾素、鏈激酶及青霉素等抗生素。

2、微生物有害方面

1）人類疾病

1347年，鼠疫造成歐洲約2500萬人死亡。

2）動植物疾病，降低食物產(chǎn)量及品質(zhì)

1843-1847年，歐洲馬鈴薯晚疫病，餓死100萬人，164萬逃往北美。

3）污染水源、加工食品、醫(yī)藥

完達山刺五加致死事件、太湖藍藻污染等。

4）破壞人類生活用品

家具、化妝品等損害、污染

3樣品采集的原則

1）根據(jù)檢驗?zāi)康?、樣品特點、批量、檢驗方法、微生物的危害程度等確定采樣方案。

2）采樣、保存、運輸、接收過程應(yīng)遵循無菌操作程序，采取必要的措施保持樣品的原有狀態(tài)，防止樣品中原有微生物的種類、數(shù)量變化(避免采樣引入新的污染或者對微生物的殺滅因子)。

3)采樣要講究方法、有代表性，不同的樣品有不同的要求，特別是某些特殊樣品。

4)注意采樣時間和種類：一般原則是根據(jù)不同疾病的特點和臨床表現(xiàn)，確定采樣時間和標(biāo)本種類。

5)注意生物安全：采樣中避免造成人員感染、標(biāo)本和環(huán)境的污染。采用防護裝備，注意安全操作和安全包裝樣品。

6)樣品的包裝、密封標(biāo)志要明確，以備查詢。（用于衛(wèi)生質(zhì)量評價的樣品，應(yīng)標(biāo)明樣品名稱、編號、采樣時間、采樣量、采樣者、檢測項目等。）

利用某一特定微生物特有的基因序列，設(shè)計特異性引物進行PCR擴增。若有條帶，則說明待測樣品中含有目的菌，且目的菌的含量與條帶的亮度呈正相關(guān)；若無條帶，則說明待測樣品中無目的菌。微生物檢驗的任務(wù)

1）研究各類產(chǎn)品的樣品采集、運送、保存以及預(yù)處理方法，提高檢出率。

2）根據(jù)各類產(chǎn)品的衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求，選擇適合不同產(chǎn)品、針對不同檢測目標(biāo)的最佳檢測方法，探討影響產(chǎn)品衛(wèi)生質(zhì)量的有關(guān)微生物的檢測、鑒定程序以及相關(guān)質(zhì)量控制措施；利用微生物檢驗技術(shù)，正確進行各類樣品的檢驗。

3）正確進行影響產(chǎn)品衛(wèi)生質(zhì)量的有關(guān)微生物的快速檢測方法、自動化儀器的使用，并認真進行檢驗結(jié)果的分析和試驗方法的評價。

4）及時對檢驗結(jié)果進行統(tǒng)計、分析、處理，并及時準(zhǔn)確地進行結(jié)果報告。

5）對影響產(chǎn)品衛(wèi)生質(zhì)量及人類健康的相關(guān)環(huán)境的微生物進行調(diào)查、分析與質(zhì)量控制。微生物的特點：個體小、比表面大；分布廣、種類多；代謝強、繁殖快；易變異、抗性強 7 科赫法則:①分離、純化單菌落;②分別接種寄主;③從致病寄主分離出相應(yīng)菌株 8 微生物檢測的意義

1）衡量動植物性產(chǎn)品衛(wèi)生質(zhì)量的重要指標(biāo)，也是判定被檢產(chǎn)品能否食用的科學(xué)依據(jù)。

2）可以判斷產(chǎn)品加工環(huán)境衛(wèi)生狀況，對產(chǎn)品被微生物污染的程度作出正確的評價，為各項

衛(wèi)生管理工作提供科學(xué)依據(jù)，提供傳染病和人類、動物和食物中毒的防治措施。

3）“預(yù)防為主”：可以有效地防止或者減少食物中毒、人畜共患病的發(fā)生，保障人民的身

體健康。

4）對提高產(chǎn)品質(zhì)量、避免經(jīng)濟損失、保證出口等方面具有政治上和經(jīng)濟上的重要意義。*微生物檢測與植物檢疫

植物檢疫目的：發(fā)現(xiàn)、檢出和鑒定有害微生物、昆蟲、雜草等，作為出證或檢疫處理的依據(jù)。外來有害生物爆發(fā)的因素：天敵、環(huán)境、寄主、潛在危害的認識（人為因素）。

關(guān)系：植物檢疫的一部分，主要負責(zé)檢測引起植物病害的微生物，防治病原物的進入或流出，保證農(nóng)林園藝業(yè)安全。

設(shè)計題

病原微生物采集、分離、鑒定方案

第五篇：微生物實驗室檢測規(guī)范

一、實驗室管理制度

1．實驗室應(yīng)制定儀器配備管理、使用制度，藥品管理、使用制度，玻璃器皿管理，使用制度，并根據(jù)安全制度和環(huán)境條件的要求，本室工作人員應(yīng)嚴格掌握，認真執(zhí)行。

2．進入實驗室必須穿工作服，進入無菌室換無菌衣、帽、鞋，戴好口罩，非實驗室人員不得進入實驗室，嚴格執(zhí)行安全操作規(guī)程。

3．實驗室內(nèi)物品擺放整齊，試劑定期檢查并有明晰標(biāo)簽，儀器定期檢查、保養(yǎng)、檢修, 嚴禁在冰箱內(nèi)存放和加工私人食品。

4．各種器材應(yīng)建立請領(lǐng)消耗記錄，貴重儀器有使用記錄，破損遺失應(yīng)填寫報告；藥品、器材、菌種不經(jīng)批準(zhǔn)不得擅自外借和轉(zhuǎn)讓，更不得私自拿出，應(yīng)嚴格執(zhí)行《菌種保管制度》。

5．禁止在實驗室內(nèi)吸煙、進餐、會客、喧嘩，實驗室內(nèi)不得帶入私人物品，離開實驗室前認真檢查水、電、暖氣、門窗，對于有毒、有害、易燃、污染、腐蝕的物品和廢棄物品應(yīng)按有關(guān)要求執(zhí)行。

6．科、室負責(zé)人督促本制度嚴格執(zhí)行，根據(jù)情況給于獎懲，出現(xiàn)問題立即報告，造成病原擴散等責(zé)任事故者，應(yīng)視情節(jié)直至追究法律責(zé)任。

二、儀器配備、管理使用制度

1．食品微生物實驗室應(yīng)具備下列儀器：培養(yǎng)箱、高壓鍋、普通冰箱、低溫冰箱、厭氧培養(yǎng)設(shè)備、顯微鏡、離心機、超凈臺、振蕩器、普通天平、千分之一天平、烤箱、冷凍干燥設(shè)備、勻質(zhì)器、恒溫水浴箱、菌落計數(shù)器、生化培養(yǎng)箱，電位 pH計、高速離心機。

2．實驗室所使用的儀器、容器應(yīng)符合標(biāo)準(zhǔn)要求，保證準(zhǔn)確可靠，凡計量器具須經(jīng)計量部門檢定合格方能使用。

3．實驗室儀器安放合理，貴重儀器有專人保管，建立儀器檔案，并備有操作方法，保養(yǎng)、維修、說明書及使用登記本，做到經(jīng)常維護、保養(yǎng)和檢查，精密儀器不得隨意移動，若有損壞需要修理時，不得私自拆動、應(yīng)寫出報告、通知管理人員，經(jīng)科室負責(zé)人同意填報修理申請、送儀器維修部門。

4．各種儀器（冰箱、溫箱除外），使用完畢后要立即切斷電源，旋鈕復(fù)原歸位，待仔細檢查后，方可離去。

5．一切儀器設(shè)備未經(jīng)設(shè)備管理人員同意，不得外借，使用后按登記本的內(nèi)容進行登記。

6．儀器設(shè)備應(yīng)保持清潔，一般應(yīng)有儀器套罩。

7．使用儀器時，應(yīng)嚴格按操作規(guī)程進行，對違反操作規(guī)程的因管理不善致使儀器械損壞，要追究當(dāng)事者責(zé)任。

三、藥品管理、使用制度

1．依據(jù)本室檢測任務(wù)，制定各種藥品試劑采購計劃，寫清品名、單位、數(shù)量、純度、包裝規(guī)格，出廠日期等，領(lǐng)回后建立帳目，專人管理，每半年做出消耗表，并清點剩余藥品。

2．藥品試劑陳列整齊，放置有序、避光、防潮、通風(fēng)干燥，瓶簽完整，劇毒藥品加鎖存放、易燃、揮發(fā)、腐蝕品種單獨貯存。

3．領(lǐng)用藥品試劑，需填寫請領(lǐng)單、由使用人和室負責(zé)人簽字，任何人無權(quán)私自出借或饋送藥品試劑，本單位科、室間或外單位互借時需經(jīng)科室負責(zé)人簽字。

4．稱取藥品試劑應(yīng)按操作規(guī)范進行，用后蓋好，必要時可封口或黑紙包裹，不使用過期或變質(zhì)藥品。

四、玻璃器皿管理、使用制度

1．根據(jù)測試項目的要求，申報玻璃儀器的采購計劃、詳細注明規(guī)格、產(chǎn)地、數(shù)量、要求，硬質(zhì)中性玻璃儀器應(yīng)經(jīng)計量驗證合格。

2．大型器皿建立帳目，每年清查一次，一般低值易耗器皿損壞后隨時填寫損耗登記清單。

3．玻璃器皿使用前應(yīng)除去污垢，并用清潔液或2%稀鹽酸溶液浸泡24 h后，用清水沖洗干凈備用。

4．器皿使用后隨時清洗，染菌后應(yīng)嚴格高壓滅菌，不得亂棄亂扔。

五、安全制度

1．進入實驗室工作衣、帽、鞋必須穿戴整齊。

2．在進行高壓、干烤、消毒等工作時，工作人員不得擅自離現(xiàn)場，認真觀察溫度、時間，蒸餾易揮發(fā)、易燃液體時，不準(zhǔn)直接加熱，應(yīng)置水浴鍋上進行，試驗過程中如產(chǎn)生毒氣時應(yīng)在避毒柜內(nèi)操作。

3．嚴禁用口直接吸取藥品和菌液，按無菌操作進行，如發(fā)生菌液，病原體濺出容器外時，應(yīng)立即用有效消毒劑進行徹底消毒，安全處理后方有離開現(xiàn)場。

4．工作完畢，兩手用清水肥皂洗凈，必要時可用新潔爾滅、過氧乙酸泡手，然后用水沖洗，工作服應(yīng)經(jīng)常清洗，保持整潔，必要時高壓消毒。

5．實驗完畢，即時清理現(xiàn)場和實驗用具，對染菌帶毒物品，進行消毒滅菌處理。

6．每日下班，尤其節(jié)假日前后認真檢查水、暖氣、電和正在使用的儀器設(shè)備，關(guān)好門窗，方可離去。

六、環(huán)境條件要求

1.實驗室內(nèi)要經(jīng)常保持清潔衛(wèi)生，每天上下班應(yīng)進行清掃整理，桌柜等表面應(yīng)每天用消毒液擦拭，保持無塵，杜絕污染。

2.實驗室應(yīng)井然有序，不得存放實驗室外及個人物品、儀器等，實驗室用品要擺放合理，并有固定位置。

3.隨時保持實驗室衛(wèi)生，不得亂扔紙屑等雜物，測試用過的廢棄物要倒在固定的箱筒內(nèi)，并及時處理。

4.實驗室應(yīng)具有優(yōu)良的采光條件和照明設(shè)備。

5.實驗室工作臺面應(yīng)保持水平和無滲漏，墻壁和地面應(yīng)當(dāng)光滑和容易清洗。

6.實驗室布局要合理，一般實驗室應(yīng)有準(zhǔn)備間和無菌室，無菌室應(yīng)有良好的通風(fēng)條件，如安裝空調(diào)設(shè)備及過濾設(shè)備，無菌室內(nèi)空氣測試應(yīng)基本達到無菌。

7.嚴禁利用實驗室作會議室及其他文娛活動和學(xué)習(xí)場所。